JPH0213648B2 - - Google Patents
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- JPH0213648B2 JPH0213648B2 JP59116324A JP11632484A JPH0213648B2 JP H0213648 B2 JPH0213648 B2 JP H0213648B2 JP 59116324 A JP59116324 A JP 59116324A JP 11632484 A JP11632484 A JP 11632484A JP H0213648 B2 JPH0213648 B2 JP H0213648B2
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- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Pyridine Compounds (AREA)
- Indole Compounds (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はクロマトグラフイーによる鏡像体分離
用物質およびその製造方法に関し、分離目的のた
めに、オロソムコイド(orosomucoid)、その誘
導体(derivatives)、またはフラグメント(frag
−ments)を使用するものである。
用物質およびその製造方法に関し、分離目的のた
めに、オロソムコイド(orosomucoid)、その誘
導体(derivatives)、またはフラグメント(frag
−ments)を使用するものである。
キラル(chiral)な、すなわち不斉炭素原子を
含む分子からなる薬剤においては、その治療効果
はある種の鏡像異性体(enantiomer:以下単に
鏡像体という)ないし光学異性体(optical
isomer)に依存していることが立証されている。
臨床的に用いられる薬剤が、等量の二つの鏡像体
からなるラセミ化合物(racemate)、または複数
の鏡像体のうちの一つのみが臨床的に所望の効果
を有している鏡像体混合物からなる場合は、“不
活性”体が相応の治療効果を有せず副作用をもた
らすことがある。従つて、“活性”の鏡像体のみ
を利用することがこの種の薬剤の治療効果を増進
させることになる。
含む分子からなる薬剤においては、その治療効果
はある種の鏡像異性体(enantiomer:以下単に
鏡像体という)ないし光学異性体(optical
isomer)に依存していることが立証されている。
臨床的に用いられる薬剤が、等量の二つの鏡像体
からなるラセミ化合物(racemate)、または複数
の鏡像体のうちの一つのみが臨床的に所望の効果
を有している鏡像体混合物からなる場合は、“不
活性”体が相応の治療効果を有せず副作用をもた
らすことがある。従つて、“活性”の鏡像体のみ
を利用することがこの種の薬剤の治療効果を増進
させることになる。
上述のような特性の薬剤の開発と製造におい
て、分析的および調製的規模で鏡像体の分離を可
能にする技術が要求されている。薬剤の発展は副
作用を最少にするためにより選択的な治療に向け
られており、現在登録されている薬剤のほとんど
のものは厳格に立体的に規定されている。すなわ
ち、これらの薬剤は所望の薬理学的効果を有する
鏡像体のみを含んでいる。
て、分析的および調製的規模で鏡像体の分離を可
能にする技術が要求されている。薬剤の発展は副
作用を最少にするためにより選択的な治療に向け
られており、現在登録されている薬剤のほとんど
のものは厳格に立体的に規定されている。すなわ
ち、これらの薬剤は所望の薬理学的効果を有する
鏡像体のみを含んでいる。
このような状況下において、この種の薬剤の製
造および調合における工程を検査するための分離
方法に対する要求が増大している。さらに血漿や
尿のような体液中の鏡像体の含有量を測定する方
法に対する要求も増加している。この測定は、一
つの鏡像体のみが投与された場合に治療上の利点
が得られるかどうかを評価するために鏡像体の薬
動力学的特徴付け(pharamcokinetic character
−ization)に使用することができる。
造および調合における工程を検査するための分離
方法に対する要求が増大している。さらに血漿や
尿のような体液中の鏡像体の含有量を測定する方
法に対する要求も増加している。この測定は、一
つの鏡像体のみが投与された場合に治療上の利点
が得られるかどうかを評価するために鏡像体の薬
動力学的特徴付け(pharamcokinetic character
−ization)に使用することができる。
現在、液体クロマトグラフイーによつてラセミ
化合物の薬剤の鏡像体を直接分離する可能性は制
限されている。公知の方法の大半はラセミアミノ
酸(racemic amino acids)の分離を行なうもの
である。鏡像体を分離する三つの異なる方法が知
られている。
化合物の薬剤の鏡像体を直接分離する可能性は制
限されている。公知の方法の大半はラセミアミノ
酸(racemic amino acids)の分離を行なうもの
である。鏡像体を分離する三つの異なる方法が知
られている。
最も古い方法は間接的方法であり、セラミ物質
と他の物質の純粋な鏡像体との反応に基づいてい
る。この反応によりいわゆるジアステレオマー誘
導体(diastereomeric derivatives)が形成さ
れ、このジアステレオマー(diastereomers)は
非キラルカラム(non−chiral column)で分離
できる。
と他の物質の純粋な鏡像体との反応に基づいてい
る。この反応によりいわゆるジアステレオマー誘
導体(diastereomeric derivatives)が形成さ
れ、このジアステレオマー(diastereomers)は
非キラルカラム(non−chiral column)で分離
できる。
しかし、この方法は時間がかかり、しかも使用
したキラル試薬(chiral reagent)のラセミ化の
ために、あるいは鏡像体がキラル試薬と種々の割
合で反応するために、例えば薬剤物質の光学的純
度の測定に重大な誤差を生じることがある。
したキラル試薬(chiral reagent)のラセミ化の
ために、あるいは鏡像体がキラル試薬と種々の割
合で反応するために、例えば薬剤物質の光学的純
度の測定に重大な誤差を生じることがある。
鏡像体の分離には、キラルな静止相も使用され
ている。この相はキラルな構造の化合物を固定相
上に不動化ないし固定することによつて形成され
る。しかし、これらの相の大半は異なる種類の化
学物質に対する使用可能性に対して重大な制限が
ある。その上、これらの相の多くのものについて
それを使用することができるためには被検物質が
誘導体の形で存在することが必要である。このこ
とはこの方法の調製的使用が限定されていること
を意味する。
ている。この相はキラルな構造の化合物を固定相
上に不動化ないし固定することによつて形成され
る。しかし、これらの相の大半は異なる種類の化
学物質に対する使用可能性に対して重大な制限が
ある。その上、これらの相の多くのものについて
それを使用することができるためには被検物質が
誘導体の形で存在することが必要である。このこ
とはこの方法の調製的使用が限定されていること
を意味する。
特にアミノ酸の鏡像体はキラル錯化剤(chiral
complexing agent)を液体クロマトグラフイー
による分離系中の移動相に加えることによつても
分離できる。しかし、この錯化剤を移動相に加え
る方法は、調製目的の使用には適さない。さらに
この方法はキラル錯化剤を多量に必要とするため
に、経済的観点から不利である。
complexing agent)を液体クロマトグラフイー
による分離系中の移動相に加えることによつても
分離できる。しかし、この錯化剤を移動相に加え
る方法は、調製目的の使用には適さない。さらに
この方法はキラル錯化剤を多量に必要とするため
に、経済的観点から不利である。
本発明の目的は、従来技術の欠点を除き誘導体
を前もつて作ることなく、種々の異なる種類の物
質(アミン、酸、および非陽子移行性化合物
(non−protolytic compounds))に対して適用で
きる鏡像体の直接分離方法を提供することにあ
る。
を前もつて作ることなく、種々の異なる種類の物
質(アミン、酸、および非陽子移行性化合物
(non−protolytic compounds))に対して適用で
きる鏡像体の直接分離方法を提供することにあ
る。
以下図面を参照して実施例を説明する。
第1図〜第3図は、それぞれジソピラミド(di
−sopyramide)、臭化メペンゾレート
(mepenzolate bromide)およびRAC 109の化学
構造式と、これらの薬剤の鏡像体の分離クロマト
グラムを示す。
−sopyramide)、臭化メペンゾレート
(mepenzolate bromide)およびRAC 109の化学
構造式と、これらの薬剤の鏡像体の分離クロマト
グラムを示す。
第4図は種々のラセミ化合物の鏡像体のキヤパ
シテイーフアクター(capacity factors)を移動
相における2−プロパノール(2−propanol)
の量の関数として示す。
シテイーフアクター(capacity factors)を移動
相における2−プロパノール(2−propanol)
の量の関数として示す。
第5図は異なる鏡像体の分離係数
(separationfactor)を移動相中における2−プ
ロパノールの関数として示す。
(separationfactor)を移動相中における2−プ
ロパノールの関数として示す。
本発明によれば、オロソムコイドと呼ばれるα1
−酸性タンパク質(α1−acid glycoproten)を保
持体(キヤリヤー)ないし固定相に不動化ないし
固定し、この固定したタンパク質を分離カラムに
充填して鏡像体の直接分離のためのキラル相とし
て使用する。
−酸性タンパク質(α1−acid glycoproten)を保
持体(キヤリヤー)ないし固定相に不動化ないし
固定し、この固定したタンパク質を分離カラムに
充填して鏡像体の直接分離のためのキラル相とし
て使用する。
オロソムコイドはペプチド鎖(peptide chain)
と炭水化物(carbohydrate)部分とからなる。
その分子は五つの炭水化物部分を含む。この炭水
化物部分はこの分子の質量の45%を構成してい
る。炭水化物鎖の中の未満の糖(terminal
sugar)はシアル酸(i.a.sialic acid)からなり、
このシアル酸は酸性官能基(acidic function)
とアルコール性水酸基(alcoholic hydroxyl
groups)とからなる。
と炭水化物(carbohydrate)部分とからなる。
その分子は五つの炭水化物部分を含む。この炭水
化物部分はこの分子の質量の45%を構成してい
る。炭水化物鎖の中の未満の糖(terminal
sugar)はシアル酸(i.a.sialic acid)からなり、
このシアル酸は酸性官能基(acidic function)
とアルコール性水酸基(alcoholic hydroxyl
groups)とからなる。
本発明の一実施例によれば、オロソムコイドは
共有結合によつて例えばシリカの微粒子からなる
固定相に結合される。すなわち、まず固定相を反
応性エポキシド基(reactive epoxide groups)
を含む3−グリシドオキシプロピルトリメトキシ
シラン(3−glycidoxyporpyl−
trimethoxysilane)と反応させる。そしてこのエ
ポキシドで活性化された固定相をPH8.5の緩衝液
中でオロソムコイドと反応させる。このオロソム
コイドが固定された固定相をカラムに充填し、こ
のカラムに高圧ポンプのようなポンプによつて移
動相を流通させる。
共有結合によつて例えばシリカの微粒子からなる
固定相に結合される。すなわち、まず固定相を反
応性エポキシド基(reactive epoxide groups)
を含む3−グリシドオキシプロピルトリメトキシ
シラン(3−glycidoxyporpyl−
trimethoxysilane)と反応させる。そしてこのエ
ポキシドで活性化された固定相をPH8.5の緩衝液
中でオロソムコイドと反応させる。このオロソム
コイドが固定された固定相をカラムに充填し、こ
のカラムに高圧ポンプのようなポンプによつて移
動相を流通させる。
本発明の他の実施例によれば、オロソムコイド
のアルコール性水酸基のメタ過沃素酸塩(meta
−periodate salts)のような酸化剤によつて酸
化させてアルデヒド基とする。この酸化反応にお
いて酸化剤とタンパク質のモル比は120対1であ
る。酸化反応後、過剰のメタ過沃素酸塩はグリセ
ロールを加えて除去する。そして反応混合物をゲ
ルろ過し、グリセロールとメタ過沃素酸塩との反
応生成物質および余分のグリセロールを除去す
る。
のアルコール性水酸基のメタ過沃素酸塩(meta
−periodate salts)のような酸化剤によつて酸
化させてアルデヒド基とする。この酸化反応にお
いて酸化剤とタンパク質のモル比は120対1であ
る。酸化反応後、過剰のメタ過沃素酸塩はグリセ
ロールを加えて除去する。そして反応混合物をゲ
ルろ過し、グリセロールとメタ過沃素酸塩との反
応生成物質および余分のグリセロールを除去す
る。
それから酸化されたオロソムコイド誘導体を例
えば正に帯電した多孔性のシリカ微粒子のような
固定相に吸着させる。この吸着処理はタンパク質
分子のシアル酸および他の酸性官能基が固定相の
正電荷によつて帯電され吸引されるようなPH値に
おいて行なわれる。それから反応混合物のPHを高
める。その結果として、ペプチド鎖中のアミノ基
が帯電されない形に変換され、これと同時にこれ
らのアミノ基と隣接分子の炭水化物部分のアルデ
ヒド基との間に架橋反応が開始される。分子は互
いに結合して大きい連続した鎖となり、大きなタ
ンパク質凝集体が固定相の細孔に固着される。
えば正に帯電した多孔性のシリカ微粒子のような
固定相に吸着させる。この吸着処理はタンパク質
分子のシアル酸および他の酸性官能基が固定相の
正電荷によつて帯電され吸引されるようなPH値に
おいて行なわれる。それから反応混合物のPHを高
める。その結果として、ペプチド鎖中のアミノ基
が帯電されない形に変換され、これと同時にこれ
らのアミノ基と隣接分子の炭水化物部分のアルデ
ヒド基との間に架橋反応が開始される。分子は互
いに結合して大きい連続した鎖となり、大きなタ
ンパク質凝集体が固定相の細孔に固着される。
アルデヒドと第一アミノ基の反応によつてシツ
フ塩基(Schiff bases)が形成される。このシツ
フ塩基は水素化硼素ナトリウム(sodium
borohyd−ride)または他の還元剤の添加によつ
て還元される。
フ塩基(Schiff bases)が形成される。このシツ
フ塩基は水素化硼素ナトリウム(sodium
borohyd−ride)または他の還元剤の添加によつ
て還元される。
上述の固定方法は他の方法に比べて大きい利点
がある。すなわち、タンパク質が固定相に共有結
合される本発明の第1実施例に比べると、固定相
のグラム当り5〜10倍の量のタンパク質を固定す
ることができる。この多量のタンパク質は、多量
の低分子量のラセミ物質を多量のタンパク質を含
む固定相のカラムに吸着させることができる。
がある。すなわち、タンパク質が固定相に共有結
合される本発明の第1実施例に比べると、固定相
のグラム当り5〜10倍の量のタンパク質を固定す
ることができる。この多量のタンパク質は、多量
の低分子量のラセミ物質を多量のタンパク質を含
む固定相のカラムに吸着させることができる。
オロソムコイドを固定した固定相は公知のスチ
ールカラムに充填し、これにポンプ、ほとんどの
場合高圧ポンプによつて移動相を流通させる。
ールカラムに充填し、これにポンプ、ほとんどの
場合高圧ポンプによつて移動相を流通させる。
本発明により、吸着および架橋反応によつて固
定相に固定されるオロソムコイド誘導体の他の例
としては次のものがある。
定相に固定されるオロソムコイド誘導体の他の例
としては次のものがある。
1 天然(native)α1−酸性糖タンパク質のジス
ルフイド結合(S−S結合)の還元によつて得
られる誘導体。
ルフイド結合(S−S結合)の還元によつて得
られる誘導体。
2 メチルカプトエタノール、ヨードアセトアミ
ドおよび(または)8M尿素を使用する天然α1 -
酸性糖タンパク質の還元および(または)アル
キル化によつて得られる誘導体。
ドおよび(または)8M尿素を使用する天然α1 -
酸性糖タンパク質の還元および(または)アル
キル化によつて得られる誘導体。
3 天然α1 -酸性糖タンパク質のリシンのξ−ア
ミノ基の変性によつて得られる誘導体。
ミノ基の変性によつて得られる誘導体。
4 硫酸ジメチルおよび水酸化ナトリウムを使用
する天然α1 -酸性糖タンパク質(およびシアル
酸を欠くその減成物質)のメチル化によつて得
られる誘導体。
する天然α1 -酸性糖タンパク質(およびシアル
酸を欠くその減成物質)のメチル化によつて得
られる誘導体。
5 天然α1−酸性糖タンパク質のアセチル化によ
つて得られる誘導体。
つて得られる誘導体。
6 天然α1 -酸性糖タンパク質のニトロ化によつ
て得られる誘導体。
て得られる誘導体。
7 エステル化されたオロソムコイドをテトラヒ
ドロフラン中LiBH4で還元することによつて得
られる誘導体。
ドロフラン中LiBH4で還元することによつて得
られる誘導体。
また、共有結合によつて固定相に固定できるオ
ロソムコイドのフラグメントの例としては次のも
のがある。
ロソムコイドのフラグメントの例としては次のも
のがある。
1 天然α1 -酸性糖タンパク質を臭化シアンで分
断(cleavage)し、還元、カルボキシメチル
化およびセフアデツクス(Sephadex)G−100
によるろ別によつて得られる次のフラグメン
ト: (a) カルボキシル末満フラグメント(残留物
(residue)112−181)からなる臭化シアンフ
ラグメント。
断(cleavage)し、還元、カルボキシメチル
化およびセフアデツクス(Sephadex)G−100
によるろ別によつて得られる次のフラグメン
ト: (a) カルボキシル末満フラグメント(残留物
(residue)112−181)からなる臭化シアンフ
ラグメント。
(b) 残留物112−156からなる臭化シアンフラグ
メント。
メント。
(c) 残留物157−181からなる臭化シアンフラグ
メント。
メント。
2 天然α1 -酸性糖タンパク質をノイラミニダー
ゼ(neuraminidase)で処理した後に得られる
ガラクトース末端を有するasialo−α1−酸性糖
タンパク質(フラグメント)(MW:40200)。
ゼ(neuraminidase)で処理した後に得られる
ガラクトース末端を有するasialo−α1−酸性糖
タンパク質(フラグメント)(MW:40200)。
3 天然α1 -酸性糖タンパク質をノイラミニダー
ゼおよびガラクトシダーゼ(galactosidase)
で処理した後に得られるN−アセチル−グリコ
サミン末端を有するasialo−agalacto−α1−酸
性糖タンパク質(フラグメント)(MW:
38000)。
ゼおよびガラクトシダーゼ(galactosidase)
で処理した後に得られるN−アセチル−グリコ
サミン末端を有するasialo−agalacto−α1−酸
性糖タンパク質(フラグメント)(MW:
38000)。
4 ノイラミニダーゼで処理したα1−酸性糖タン
パク質を過沃素酸塩(periodate)で酸化させ
た後に得られる酸化asialo−α1−酸性糖タンパ
ク質(フラグメント)。
パク質を過沃素酸塩(periodate)で酸化させ
た後に得られる酸化asialo−α1−酸性糖タンパ
ク質(フラグメント)。
5 ノイラミニダーゼおよびガラクトシダーゼで
処理したα1−酸性糖タンパク質を過沃素酸塩で
酸化させた後に得られる酸化asialo−agalacto
−α−酸性糖タンパク質(フラグメント)。
処理したα1−酸性糖タンパク質を過沃素酸塩で
酸化させた後に得られる酸化asialo−agalacto
−α−酸性糖タンパク質(フラグメント)。
6 ノイラミン酸の100%およびガラクトース残
留の80%を酵素処理(ノイラミニダーゼおよび
デイツプロコツクスニユーモニエ
(diplococcusnuemoniae)のB−ガラクトシダ
ーゼの連続作用)によつて除いたα1−酸性糖タ
ンパク質の誘導体(フラグメント)。
留の80%を酵素処理(ノイラミニダーゼおよび
デイツプロコツクスニユーモニエ
(diplococcusnuemoniae)のB−ガラクトシダ
ーゼの連続作用)によつて除いたα1−酸性糖タ
ンパク質の誘導体(フラグメント)。
さらに、吸着架橋によつて固定相に固定できる
オロソムコイドフラグメントの例としては次のも
のがある。
オロソムコイドフラグメントの例としては次のも
のがある。
1 天然α1 -酸性糖タンパク質をヒドラジンで処
理した後に得られるα1−酸性糖タンパク質フラ
グメント。
理した後に得られるα1−酸性糖タンパク質フラ
グメント。
2 天然オロソムコイドをタンパク質分解酵素
(トリプシンおよびペプシン)によつて処理す
ることによつて得られるグリコペプチドフラグ
メント(分子量2600〜3200)。
(トリプシンおよびペプシン)によつて処理す
ることによつて得られるグリコペプチドフラグ
メント(分子量2600〜3200)。
3 天然α1 -酸性糖タンパク質を酵素(ストレプ
トマイセスグリセウスプロテアーゼ(strepto
−myces griseus protease)で処理すること
によつて得られる糖ペプチドフラグメント(炭
化水物−アミノ酸複合体)(最小分子量約
2800)。
トマイセスグリセウスプロテアーゼ(strepto
−myces griseus protease)で処理すること
によつて得られる糖ペプチドフラグメント(炭
化水物−アミノ酸複合体)(最小分子量約
2800)。
4 ヒロリドンカルボキシルペプチダーゼ
(pyrrolidonecarboxylpeptidase)による天然
α1−酸性糖タンパク質の切断によつて得られる
α1 -酸性糖タンパク質フラグメント。
(pyrrolidonecarboxylpeptidase)による天然
α1−酸性糖タンパク質の切断によつて得られる
α1 -酸性糖タンパク質フラグメント。
5 天然α1 -酸性糖タンパク質の臭化シアンによ
る切断後、還元、カルボキシメチル化、2%炭
酸化水素アンモニウム中セフアデツクスG−
100によるろ別によつて得られる臭化シアンフ
ラグメント(アミノ末端111残留物質からな
り、5個の炭水化物ユニツトがフラグメントに
結合している)。
る切断後、還元、カルボキシメチル化、2%炭
酸化水素アンモニウム中セフアデツクスG−
100によるろ別によつて得られる臭化シアンフ
ラグメント(アミノ末端111残留物質からな
り、5個の炭水化物ユニツトがフラグメントに
結合している)。
本発明による物質は、従来カラムクロマトグラ
フイーで直接分離ができなかつた鏡像体の分離を
可能にする。ラセミ薬剤としては次のものを例示
することができる。
フイーで直接分離ができなかつた鏡像体の分離を
可能にする。ラセミ薬剤としては次のものを例示
することができる。
ジソピラミド、臭化メペンゾレート、メピヴア
カイン(mepivacaine)、ブピヴアカイン)
(bupiva−caine)、プロピオマジン
(propiomazine)、オキシフエンシクリミン
(oxyphencyclimine)など。
カイン(mepivacaine)、ブピヴアカイン)
(bupiva−caine)、プロピオマジン
(propiomazine)、オキシフエンシクリミン
(oxyphencyclimine)など。
第1図は抗不整脈薬であるジソピラミドの鏡像
体の分離を示すクロマトグラムである。この分離
は前述の第2実施例によつて形成されたキラル固
定相を充填した長さ100mm直径3.0mmのカラムを用
いて行なわれた。このカラムに8%(V/V)2
−プロパノールを含むPH7.23のリン酸塩緩衝液を
0.5ml/分の流速で流した溶離を行なつた。
体の分離を示すクロマトグラムである。この分離
は前述の第2実施例によつて形成されたキラル固
定相を充填した長さ100mm直径3.0mmのカラムを用
いて行なわれた。このカラムに8%(V/V)2
−プロパノールを含むPH7.23のリン酸塩緩衝液を
0.5ml/分の流速で流した溶離を行なつた。
第2図第3図は臭化メペンゾレートとRAC109
の鏡像体の分離クロマトグラムを示す。第2図第
3図で使用した分離カラムは第1図で使用したも
のと同じである。このカラムを用いて2%2−プ
ロパノールと0.98mMジメチルオクチルアミン
(di−methyloctylamine)とを含むPH7.15のリン
酸塩緩衝液、および8%2−プロパノールを含む
PH7.20のリン酸塩緩衝液で溶離した。
の鏡像体の分離クロマトグラムを示す。第2図第
3図で使用した分離カラムは第1図で使用したも
のと同じである。このカラムを用いて2%2−プ
ロパノールと0.98mMジメチルオクチルアミン
(di−methyloctylamine)とを含むPH7.15のリン
酸塩緩衝液、および8%2−プロパノールを含む
PH7.20のリン酸塩緩衝液で溶離した。
本発明による分離用物質の利点は、その利用範
囲が広いことである。すなわち、この物質は非常
に異なる特性の物質(アミン、アミド、エステ
ル)に対して鏡像体選択性(enantioselectivity)
を示す。その理由は、オロソムコイドが多くのキ
ラル位置(chiral site)を有しているからである
と思われる。すなわち、オロソムコイドは分子量
が約40000の大きい分子であり、この点小さい分
子の鏡像体を固定したキラル相に比べて有利であ
る。
囲が広いことである。すなわち、この物質は非常
に異なる特性の物質(アミン、アミド、エステ
ル)に対して鏡像体選択性(enantioselectivity)
を示す。その理由は、オロソムコイドが多くのキ
ラル位置(chiral site)を有しているからである
と思われる。すなわち、オロソムコイドは分子量
が約40000の大きい分子であり、この点小さい分
子の鏡像体を固定したキラル相に比べて有利であ
る。
本発明の物質を充填した分離カラムでは、水を
ベースとする種々のPHの移動相により溶離を行な
うのが好ましい。血液の生理的なPH約7.4に一致
する6〜8のPH範囲内で使用するのが有利である
ことが判明した。移動目のPHを単に調整すること
によつて、あるいは第4図第5図に示すように移
動相に低濃度のアルコールを添加することによつ
て、保持時間、キヤパシテイーフアクターおよび
分離選択性(separation selectivity)を制御す
ることができる。
ベースとする種々のPHの移動相により溶離を行な
うのが好ましい。血液の生理的なPH約7.4に一致
する6〜8のPH範囲内で使用するのが有利である
ことが判明した。移動目のPHを単に調整すること
によつて、あるいは第4図第5図に示すように移
動相に低濃度のアルコールを添加することによつ
て、保持時間、キヤパシテイーフアクターおよび
分離選択性(separation selectivity)を制御す
ることができる。
第4図は種々の薬剤の鏡像体の保持時間に比例
するキヤパシテイフアクターk′が、移動相である
2−プロパノールの量に対していかに変化するか
を示す。第4図において、aはS−ブピヴアカイ
ン、bはR−ブピヴアカイン、cはS−メピヴア
カイン、dは(R)−メピヴアカイン、eは臭化
メピンゾレート、fは臭化メペンゾレートを
示す。ここに、、は純粋な鏡像体が入手でき
ない場合の鏡像体を表す。すなわち、は最初に
溶離される鏡像体、すなわち、最低のキヤパシテ
イーフアクターの鏡像体を示し、は最後に溶離
される鏡像体、すなわち、最高のキヤパシテイー
フアクターの鏡像体を示す。
するキヤパシテイフアクターk′が、移動相である
2−プロパノールの量に対していかに変化するか
を示す。第4図において、aはS−ブピヴアカイ
ン、bはR−ブピヴアカイン、cはS−メピヴア
カイン、dは(R)−メピヴアカイン、eは臭化
メピンゾレート、fは臭化メペンゾレートを
示す。ここに、、は純粋な鏡像体が入手でき
ない場合の鏡像体を表す。すなわち、は最初に
溶離される鏡像体、すなわち、最低のキヤパシテ
イーフアクターの鏡像体を示し、は最後に溶離
される鏡像体、すなわち、最高のキヤパシテイー
フアクターの鏡像体を示す。
第5図は種々の物質について分離係数αを移動
相のPHの関数として示す。第5図において、aは
ジソピラミド、bはRAC109、cはブピヴア
カイン、dは臭化メペンゾレート、eはメピヴア
カインを示す。分離係数αは、最高のキヤパシテ
イーフアクターを最低のキヤパシテイーフアクタ
ーで除したものとして定義される。
相のPHの関数として示す。第5図において、aは
ジソピラミド、bはRAC109、cはブピヴア
カイン、dは臭化メペンゾレート、eはメピヴア
カインを示す。分離係数αは、最高のキヤパシテ
イーフアクターを最低のキヤパシテイーフアクタ
ーで除したものとして定義される。
光学異性体以外の物質も本発明の物質によつて
分離できることはもちろんである。
分離できることはもちろんである。
次に実施例を示す。
実施例 1
表面にエポキシ基を含むシリカの微粒子からな
る固定相に人のオロソムコイドを共有給合によつ
て固定した。
る固定相に人のオロソムコイドを共有給合によつ
て固定した。
すなわち、0.2Mの塩化ナトリウムと100mgの人
のオロソムコイドを含むPH8.5の0.1Mホウ酸塩緩
衝液4ml中に1gのシリカ微粒子を懸濁させた。
オロソムコイドは48時間後に微粒子を結合するの
で、これをPH8.5の0.1Mホウ酸塩緩衝液で洗浄し
た。このオロソムコイドを含む固定相0.5gを100
×3.0mmのステンレススチール管に充填してカラ
ムを作成した。
のオロソムコイドを含むPH8.5の0.1Mホウ酸塩緩
衝液4ml中に1gのシリカ微粒子を懸濁させた。
オロソムコイドは48時間後に微粒子を結合するの
で、これをPH8.5の0.1Mホウ酸塩緩衝液で洗浄し
た。このオロソムコイドを含む固定相0.5gを100
×3.0mmのステンレススチール管に充填してカラ
ムを作成した。
抗不整脈剤であるジソピラミドの鏡像体を分離
するために、このカラムに対して8%2−プロパ
ノールの水溶液PH7.2を移動相として使用したと
ころ、(R)−ジソピラミドが(S)−ジソピラミ
ドよりも前に溶離した。
するために、このカラムに対して8%2−プロパ
ノールの水溶液PH7.2を移動相として使用したと
ころ、(R)−ジソピラミドが(S)−ジソピラミ
ドよりも前に溶離した。
実施例 2
人のオロソムコイドを臭化シアンで分断し、還
元、カルボキシメチル化し、セフアデツクスG−
100でゲルろ過して得たオロソムコイドフラグメ
ント300mgをPH5.0のアセテート緩衝液50ml中に溶
解させた。この溶液にシリカ微粒子1gを入れ室
温で1時間撹拌して、オロソムコイドフラグメン
トをシリカ微粒子上に吸着させた。このタンパク
質を含む固定相0.9gを100×4.0mmのステンレス
スチール管に充填してカラムを作成した。
元、カルボキシメチル化し、セフアデツクスG−
100でゲルろ過して得たオロソムコイドフラグメ
ント300mgをPH5.0のアセテート緩衝液50ml中に溶
解させた。この溶液にシリカ微粒子1gを入れ室
温で1時間撹拌して、オロソムコイドフラグメン
トをシリカ微粒子上に吸着させた。このタンパク
質を含む固定相0.9gを100×4.0mmのステンレス
スチール管に充填してカラムを作成した。
実施例 3
PH7.0の0.02Mリン酸緩衝液中に溶解した牛の
オロソムコイド20μMを含む溶液を調製した。こ
のタンパク質溶液と、水に混和しない他の液とで
液−液2相系を形成した。連続液−液抽出プロセ
ス(向流クロマトグラフイ)を行なうために、こ
の二つの混和しない溶液をテフロンチユーブで作
つた連続コイル中に入れ、このコイルを遊星運動
させた。2相のうちの一つは低速遠心分離によつ
てコイル中に静止した。ラセミ化合物をこの系の
中に注入し、二つの相間に分配した。
オロソムコイド20μMを含む溶液を調製した。こ
のタンパク質溶液と、水に混和しない他の液とで
液−液2相系を形成した。連続液−液抽出プロセ
ス(向流クロマトグラフイ)を行なうために、こ
の二つの混和しない溶液をテフロンチユーブで作
つた連続コイル中に入れ、このコイルを遊星運動
させた。2相のうちの一つは低速遠心分離によつ
てコイル中に静止した。ラセミ化合物をこの系の
中に注入し、二つの相間に分配した。
実施例 4
人のオロソムコイド300mgを低温(+4℃)の
PH5のアセテート緩衝液10ml中に溶解させた。こ
のタンパク質溶液にタンパク質1モル当り120モ
ルのメタ過沃素酸塩を加え、光を遮断して+4℃
で1時間反応させた。それから、この反応混合物
にメタ過沃素酸塩1モル当り18〜20モルのグリセ
ロールを添加して室温で10分間反応させた。
PH5のアセテート緩衝液10ml中に溶解させた。こ
のタンパク質溶液にタンパク質1モル当り120モ
ルのメタ過沃素酸塩を加え、光を遮断して+4℃
で1時間反応させた。それから、この反応混合物
にメタ過沃素酸塩1モル当り18〜20モルのグリセ
ロールを添加して室温で10分間反応させた。
この反応混合物を、0.01Mアセテート緩衝液PH
5を用いてセフアデツクス(SEPHADEX、商標
名)G−25を充填したカラムに注入して酸化され
たタンパク質を分離収集し、これをPH5で正の基
を含む表面を有するシリカ微粒子上に吸着させ
た。正の基は第1、第2、第3または第4アンモ
ニウム基である。この吸着はバツチ操作で行なう
こともできるし、あるいはまた、酸化されたタン
パク質を正電荷の固定相が充填されたカラムにポ
ンプで流通させて行なうこともできる。
5を用いてセフアデツクス(SEPHADEX、商標
名)G−25を充填したカラムに注入して酸化され
たタンパク質を分離収集し、これをPH5で正の基
を含む表面を有するシリカ微粒子上に吸着させ
た。正の基は第1、第2、第3または第4アンモ
ニウム基である。この吸着はバツチ操作で行なう
こともできるし、あるいはまた、酸化されたタン
パク質を正電荷の固定相が充填されたカラムにポ
ンプで流通させて行なうこともできる。
吸着後、固定相のPHを変えた。このPH変化は、
タンパク質が吸着された固定相が充填されたカラ
ムに0.03M硼酸塩緩衝液PH9.2をポンプで流通さ
せて行なつてもよいし、あるいはまた、吸着をバ
ツチ操作で行なつた場合は、このPHの変化をろ過
漏斗で行なつてもよい。固定相はPH9.2で15〜17
時間反応させた。
タンパク質が吸着された固定相が充填されたカラ
ムに0.03M硼酸塩緩衝液PH9.2をポンプで流通さ
せて行なつてもよいし、あるいはまた、吸着をバ
ツチ操作で行なつた場合は、このPHの変化をろ過
漏斗で行なつてもよい。固定相はPH9.2で15〜17
時間反応させた。
それから、この固定相を0.1M硼酸塩緩衝液PH
8.5に懸濁させ、過剰の水素化硼酸ナトリウムに
よつて室温で1時間処理して還元した。この固定
相を水素ガスの発生が停止するまで、PH7.0の
0.02Mリン酸塩緩衝液で洗浄した。
8.5に懸濁させ、過剰の水素化硼酸ナトリウムに
よつて室温で1時間処理して還元した。この固定
相を水素ガスの発生が停止するまで、PH7.0の
0.02Mリン酸塩緩衝液で洗浄した。
実施例 5
牛のオロソムコイド300mgを低温(+4℃)の
PH5のアセテート緩衝液10ml中に溶解させた。こ
のタンパク質溶液にタンパク質1モル当り120モ
ルのメタ過沃素酸塩を加え、光を遮断し+4℃で
1時間反応させた。この反応混合物にメタ過沃素
酸塩1モル当り18〜20モルのグリセロールを添加
して室温で10分間反応させた。
PH5のアセテート緩衝液10ml中に溶解させた。こ
のタンパク質溶液にタンパク質1モル当り120モ
ルのメタ過沃素酸塩を加え、光を遮断し+4℃で
1時間反応させた。この反応混合物にメタ過沃素
酸塩1モル当り18〜20モルのグリセロールを添加
して室温で10分間反応させた。
この反応混合物を、PH5の0.01Mアセテート緩
衝液を用いてセフアデツクス(SEPHADEX、商
標名)G−25を充填したカラムに注入して、酸化
されたタンパク質を分離収集し、これをPH5で正
の基を含む表面を有するシリカ微粒子上に吸着さ
せた。正の基は第1、第2、第3または第4アン
モニウム基である。吸着はバツチ操作で行なうこ
ともできるし、あるいはまた、酸化されたタンパ
ク質を正電荷の固定相が充填されたカラムにポン
プで流通させて行なうこともできる。
衝液を用いてセフアデツクス(SEPHADEX、商
標名)G−25を充填したカラムに注入して、酸化
されたタンパク質を分離収集し、これをPH5で正
の基を含む表面を有するシリカ微粒子上に吸着さ
せた。正の基は第1、第2、第3または第4アン
モニウム基である。吸着はバツチ操作で行なうこ
ともできるし、あるいはまた、酸化されたタンパ
ク質を正電荷の固定相が充填されたカラムにポン
プで流通させて行なうこともできる。
吸着後、固定相のPHを変えた。このPH変化はタ
ンパク質が吸着された固定相が充填されたカラム
に0.03M硼酸塩緩衝液PH9.2をポンプで流通させ
て行なつてもよいし、あるいはまた、吸着をバツ
チ操作で行なつた場合は、このPHの変化をろ過漏
斗で行なつてもよい。固定相はPH9.2で15〜17時
間反応させた。
ンパク質が吸着された固定相が充填されたカラム
に0.03M硼酸塩緩衝液PH9.2をポンプで流通させ
て行なつてもよいし、あるいはまた、吸着をバツ
チ操作で行なつた場合は、このPHの変化をろ過漏
斗で行なつてもよい。固定相はPH9.2で15〜17時
間反応させた。
それから、この固定相を0.1M硼酸塩緩衝液PH
8.5に懸濁させ、過剰の水素化硼酸ナトリウムに
よつて室温で1時間処理して還元した。この固定
相を水素ガスの発生が停止するまで、PH7.0の
0.02Mリン酸塩緩衝液で洗浄した。
8.5に懸濁させ、過剰の水素化硼酸ナトリウムに
よつて室温で1時間処理して還元した。この固定
相を水素ガスの発生が停止するまで、PH7.0の
0.02Mリン酸塩緩衝液で洗浄した。
第1図第2図第3図はそれぞれ異なる薬剤の化
学構造およびその鏡像体の分離クロマトグラムを
示す図、第4図は種々のラセミ薬剤物質の鏡像体
のキヤパシテイーフアクターを移動相における2
−プロパノールの量の関数として示すグラフ、第
5図は種々の薬剤の鏡像体の分離係数を移動相に
おける2−プロパノールの量の関数として示すグ
ラフである。
学構造およびその鏡像体の分離クロマトグラムを
示す図、第4図は種々のラセミ薬剤物質の鏡像体
のキヤパシテイーフアクターを移動相における2
−プロパノールの量の関数として示すグラフ、第
5図は種々の薬剤の鏡像体の分離係数を移動相に
おける2−プロパノールの量の関数として示すグ
ラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 固定相に不動化されたオロソムコイド、その
誘導体またはフラグメントからなることを特徴と
するクロマトグラフイーによる鏡像体分離用物
質。 2 少なくとも一つの相が液相である多相システ
ムの一つまたはそれ以上の液に溶解させたオロソ
ムコイド、その誘導体またはフラグメントからな
ることを特徴とするクロマトグラフイーによる鏡
像体分離用物質。 3 エポキシドで活性化された固定相をオロソム
コイド、その誘導体またはフラグメントと反応さ
せることを特徴とするクロマトグラフイーによる
鏡像体分離用物質の製造方法。 4 オロソムコイド、その誘導体またはフラグメ
ントを酸化剤によつて酸化させ、酸化したオロソ
ムコイド、酸化した誘導体または酸化したフラグ
メントを固定相に吸着させ、酸化したオロソムコ
イド、酸化した誘導体、または酸化したフラグメ
ントの分子をPH調整によつて架橋させることを特
徴とするクロマトグラフイーによる鏡像体分離用
物質の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE8303221-9 | 1983-06-08 | ||
SE8303221A SE445649B (sv) | 1983-06-08 | 1983-06-08 | Anvendning av en fast berare med immobiliserad orosomucoid for separation, forfarande for framstellning av separationsmaterial, separationsanordning samt separationsmaterial |
SE8307023-5 | 1983-12-19 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6041619A JPS6041619A (ja) | 1985-03-05 |
JPH0213648B2 true JPH0213648B2 (ja) | 1990-04-04 |
Family
ID=20351491
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59116324A Granted JPS6041619A (ja) | 1983-06-08 | 1984-06-05 | 分離用物質およびその製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6041619A (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0428400Y2 (ja) * | 1985-03-25 | 1992-07-09 | ||
JP3121072B2 (ja) * | 1991-10-09 | 2000-12-25 | エーザイ株式会社 | コンアルブミンが結合した光学異性体分離剤 |
JP6267009B2 (ja) * | 2013-08-29 | 2018-01-24 | 株式会社ダイセル | 光学異性体用分離剤 |
EP3109232A4 (en) * | 2014-02-17 | 2017-06-28 | LTT Bio-Pharma Co., Ltd. | Optically active form of mepenzolate, and ameliorating agent for chronic obstructive pulmonary disease which contains same as active ingredient |
-
1984
- 1984-06-05 JP JP59116324A patent/JPS6041619A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6041619A (ja) | 1985-03-05 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |