JPH02128691A - Ｄｎａに対する部位特異的突然変異の導入方法 - Google Patents
Ｄｎａに対する部位特異的突然変異の導入方法Info
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- JPH02128691A JPH02128691A JP28037688A JP28037688A JPH02128691A JP H02128691 A JPH02128691 A JP H02128691A JP 28037688 A JP28037688 A JP 28037688A JP 28037688 A JP28037688 A JP 28037688A JP H02128691 A JPH02128691 A JP H02128691A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、 ＤＮＡに対する部位特異的突然変異の導入
方法に関する。更に詳しくは、合成ＤＮＡ断片を用いた
部位特異的な突然変異の導入方法に関する。
方法に関する。更に詳しくは、合成ＤＮＡ断片を用いた
部位特異的な突然変異の導入方法に関する。
最近、遺伝子工学の分野で、遺伝子の一部を人工の遺伝
子で置き換えて機能の向上を図る、いわゆる“蛋白質工
学″の手法が注目されている。
子で置き換えて機能の向上を図る、いわゆる“蛋白質工
学″の手法が注目されている。
その手法の一つに、約２０ｂ前後（ｂ ： ＤＮＡの長
さを示すベース）の合成ＤＮＡ断片（合成ｏ１ｉｇｏ）
による部位特異的突然変異という手法がある。それの簡
単な原理は、変異を与えたいＤＮＡを１本鎖の鋳型とし
て調製しておき、そこに予め鋳型の配列と１塩基異なっ
た配列に合成しておいた合成ｏ１ｉｇｏを相補させ、完
全２本鎖にした後で菌体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）に戻し、
元のＤＮＡ （野生型）とは異なるＤＮＡ （変異型）
を抽出してくるというものである。
さを示すベース）の合成ＤＮＡ断片（合成ｏ１ｉｇｏ）
による部位特異的突然変異という手法がある。それの簡
単な原理は、変異を与えたいＤＮＡを１本鎖の鋳型とし
て調製しておき、そこに予め鋳型の配列と１塩基異なっ
た配列に合成しておいた合成ｏ１ｉｇｏを相補させ、完
全２本鎖にした後で菌体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）に戻し、
元のＤＮＡ （野生型）とは異なるＤＮＡ （変異型）
を抽出してくるというものである。
この手法では、原理的には野生型と変異型とが１：１、
即ち変異型取得率が５０％となる筈であるが、実際には
アニーリングや修復の不十分さにより、変異型取得率は
１０％にもみたないというのが実情である。
即ち変異型取得率が５０％となる筈であるが、実際には
アニーリングや修復の不十分さにより、変異型取得率は
１０％にもみたないというのが実情である。
そこで、最近ではその変異型取得率を上げるためのキッ
ト、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｓｙｓ−ｔｅＩｍ（アマジャム社）やＭｕｔａ−Ｇｅ
ｎｅ （ＢＩＯ−ＲＡＤ社）などが発売されており、そ
れぞれ効果をＬげているが、いずれも高価なため経済的
な問題を生じている。
ト、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｓｙｓ−ｔｅＩｍ（アマジャム社）やＭｕｔａ−Ｇｅ
ｎｅ （ＢＩＯ−ＲＡＤ社）などが発売されており、そ
れぞれ効果をＬげているが、いずれも高価なため経済的
な問題を生じている。
本発明の目的は、合成ＤＮＡ断片を用いた部位特異的突
然変異の導入方法において、廉価な手段を適用すること
により、変異型取得率を向−卜せしめる方法を提供する
ことにある。
然変異の導入方法において、廉価な手段を適用すること
により、変異型取得率を向−卜せしめる方法を提供する
ことにある。
本発明の他の目的は、アニーリングに与らなかった合成
ＤＮＡ断片を有効に回収し得る部位特異的突然変異の導
入方法を提供することにある。
ＤＮＡ断片を有効に回収し得る部位特異的突然変異の導
入方法を提供することにある。
本発明のこれらの目的は、鋳型ＤＮＡと合成ＤＮＡ断片
とをアニーリングした後、エタノールで処理することに
より達成されることが見出された。
とをアニーリングした後、エタノールで処理することに
より達成されることが見出された。
従って、本発明はＤＮＡに対する部位特異的突然変異の
導入方法に係り１部位特異的突然変異の導入は、１本鎖
の鋳型ＤＮＡに、この配列と１塩基異なった配列の合成
ＤＮＡ断片を相補させ、完全２本鎖にした後で菌体内（
ｉｎ ｖｉｖｏ）に戻し、元のＤＮＡ （野生型）とは
異なるＤＮＡ （変異型）を抽出する部位特異的突然変
異の導入方法において、アニーリング後の混合物にエタ
ノールを加えて約０〜−３０℃に放置し、それを遠心分
離した沈殿物を形質転換することにより行われる。
導入方法に係り１部位特異的突然変異の導入は、１本鎖
の鋳型ＤＮＡに、この配列と１塩基異なった配列の合成
ＤＮＡ断片を相補させ、完全２本鎖にした後で菌体内（
ｉｎ ｖｉｖｏ）に戻し、元のＤＮＡ （野生型）とは
異なるＤＮＡ （変異型）を抽出する部位特異的突然変
異の導入方法において、アニーリング後の混合物にエタ
ノールを加えて約０〜−３０℃に放置し、それを遠心分
離した沈殿物を形質転換することにより行われる。
１本鎖の鋳型ＤＮＡとしては、通常数にｂ程度のものが
用いられ、この配列と１塩基異なった配列の合成ＤＮＡ
断片（合成ｏ１ ｉｇｏ）としては、一般に約１０〜２
５ｂ程度のものが用いられる。
用いられ、この配列と１塩基異なった配列の合成ＤＮＡ
断片（合成ｏ１ ｉｇｏ）としては、一般に約１０〜２
５ｂ程度のものが用いられる。
これらの鋳型ＤＮＡと合成ＤＮＡ断片とのアニーリング
は、一般にＴＥ、 ＴＢＥ、丁ＡＥなどの緩衝液を用い
、約６０〜１００℃で約１〜５分間加熱することにより
行わわる。そして、鋳型１本鎖ＤＮＡと合成ｏ１ｊｇｏ
（１本鎖）を加熱することにより、ＤＮＡはフリーなほ
ぐれた状態となり、そのまま徐冷して行くと、１本鎖Ｄ
ＮＡ同志相補する配列のところで完全な２本鎖を形成さ
せ、即ちハイブリダイゼーションさせる。
は、一般にＴＥ、 ＴＢＥ、丁ＡＥなどの緩衝液を用い
、約６０〜１００℃で約１〜５分間加熱することにより
行わわる。そして、鋳型１本鎖ＤＮＡと合成ｏ１ｊｇｏ
（１本鎖）を加熱することにより、ＤＮＡはフリーなほ
ぐれた状態となり、そのまま徐冷して行くと、１本鎖Ｄ
ＮＡ同志相補する配列のところで完全な２本鎖を形成さ
せ、即ちハイブリダイゼーションさせる。
アニーリング後、混合物にはその容積に対して約２〜５
倍量、好ましくは約２〜２．５倍量のエタノールが添加
され、その後約０＝−３０℃、好ましくは一２０℃で約
０９５〜１時間放置する。この放置により、合成ｏ１ｉ
ｇｏ以外のＩ）ＮＡが沈殿してくるが、この放置時間が
短かすぎると沈殿が不十分となり、逆に長ずざると合成
ｏ１ｉｇｏも沈殿してくる可能性がある。
倍量、好ましくは約２〜２．５倍量のエタノールが添加
され、その後約０＝−３０℃、好ましくは一２０℃で約
０９５〜１時間放置する。この放置により、合成ｏ１ｉ
ｇｏ以外のＩ）ＮＡが沈殿してくるが、この放置時間が
短かすぎると沈殿が不十分となり、逆に長ずざると合成
ｏ１ｉｇｏも沈殿してくる可能性がある。
エタノール処理は、従来からＤＮＡの精製、濃縮などの
際にも用いられており、ＤＮＡを沈殿させることにより
溶液中の塩などとの分離が図られているが、本発明で用
いられる約１０〜２５ｂ程度の合成ｏ１ｉｇｏは沈殿し
難く、従ってアニーリングしたものと遠心分離すること
により分離することができる。即ち、アニーリングした
混合物を遠心分離し、■−澄液ど沈殿とに分けると、合
成ｏ１ｉｇｏは沈殿せずに上澄液中に含まれる。
際にも用いられており、ＤＮＡを沈殿させることにより
溶液中の塩などとの分離が図られているが、本発明で用
いられる約１０〜２５ｂ程度の合成ｏ１ｉｇｏは沈殿し
難く、従ってアニーリングしたものと遠心分離すること
により分離することができる。即ち、アニーリングした
混合物を遠心分離し、■−澄液ど沈殿とに分けると、合
成ｏ１ｉｇｏは沈殿せずに上澄液中に含まれる。
鋳型ＤＮＡは、こうした処理方法では分離することがで
きないが、夾雑物が減ることで、その後の修復などの酵
素反応に好結果をもたらす。また、合成ｏＨｇｏを溶解
させている上澄液については、更に低温にしであるいは
長時間放置して合成ｏ１．ｉｇ。
きないが、夾雑物が減ることで、その後の修復などの酵
素反応に好結果をもたらす。また、合成ｏＨｇｏを溶解
させている上澄液については、更に低温にしであるいは
長時間放置して合成ｏ１．ｉｇ。
を沈殿させ、それを回収し、て再使用することができる
。
。
遠心分離の沈殿物については、それを緩衝液に再溶解さ
せた上、菌体内に戻すこと、即ち常法に従いＤＮＡポリ
メラーゼ、リカーゼによる反応を行った後、大腸菌ＪＡ
２２１に形質転換すること、例えば塩化カルシウムによ
って大腸菌を感受性菌にし、その状態でＤＮＡ溶液を加
えて菌体内に取り込むことなどが行わわ７る。そして、
最後に元のＤＮＡ（野生型）とは異なるＤＮＡ （変異
型）の抽出が、常法に従って行われる。
せた上、菌体内に戻すこと、即ち常法に従いＤＮＡポリ
メラーゼ、リカーゼによる反応を行った後、大腸菌ＪＡ
２２１に形質転換すること、例えば塩化カルシウムによ
って大腸菌を感受性菌にし、その状態でＤＮＡ溶液を加
えて菌体内に取り込むことなどが行わわ７る。そして、
最後に元のＤＮＡ（野生型）とは異なるＤＮＡ （変異
型）の抽出が、常法に従って行われる。
合成ＤＮＡ断片を用いた部位特異的な突然変異の導入方
法において、鋳型ＤＮＡと合成ＤＮＡ断片とをアニーリ
ングさせた後エタノール処理することにより、変異型Ｄ
ＮＡの取得率を約１．５〜・２倍程度に高めることがで
きる。また、アニーリングに与らなかった高価な合成Ｄ
ＮＡ断片の回収もまた、可能となる。
法において、鋳型ＤＮＡと合成ＤＮＡ断片とをアニーリ
ングさせた後エタノール処理することにより、変異型Ｄ
ＮＡの取得率を約１．５〜・２倍程度に高めることがで
きる。また、アニーリングに与らなかった高価な合成Ｄ
ＮＡ断片の回収もまた、可能となる。
次に、実施例について本発明を説明する。
実施例
大腸菌の肚ｕ遺伝子を含むプラスミドを、１本鎖の鋳型
として調製した。これとは別に、ｖＩ型と１塩基だけ配
列の異なる、長さ１８ｂのｏｌｊ４ｏを合成した。この
合成ｏ１ｉｇｏ（合成ＤＮＡ断片）には、新たな制限酵
素Ｍｌｕｌでの切断５ｉｔｅ（−ＡＣＧＣＧＴ−）が含
まれている。
として調製した。これとは別に、ｖＩ型と１塩基だけ配
列の異なる、長さ１８ｂのｏｌｊ４ｏを合成した。この
合成ｏ１ｉｇｏ（合成ＤＮＡ断片）には、新たな制限酵
素Ｍｌｕｌでの切断５ｉｔｅ（−ＡＣＧＣＧＴ−）が含
まれている。
上記鋳型ＤＮＡ （７） ＴＥ綬衝液溶液（ａ度１μｇ
／μＱ）１０μＱ、上記合成ｏ１ｉｇｏのＴＥＢ衝液溶
液溶液度約ＩＰＩ！ｌｏｌ／μＱ ）５ｕ ＱおよびＴ
Ｅ緩衛液（１０ｄ トリスヒドロキシアミノメタン、１
ｍＭ ＥＤＴＡ）２０μａの混合液を、まず７０℃で３
分間、次いで３７℃で３０分間の条件下におき、アニー
リングした後、そこにエタノール８７．５μＱを加え、
−２０℃に１時間放置した。
／μＱ）１０μＱ、上記合成ｏ１ｉｇｏのＴＥＢ衝液溶
液溶液度約ＩＰＩ！ｌｏｌ／μＱ ）５ｕ ＱおよびＴ
Ｅ緩衛液（１０ｄ トリスヒドロキシアミノメタン、１
ｍＭ ＥＤＴＡ）２０μａの混合液を、まず７０℃で３
分間、次いで３７℃で３０分間の条件下におき、アニー
リングした後、そこにエタノール８７．５μＱを加え、
−２０℃に１時間放置した。
その後、 １６０００ｒｐＩ！１．１０分間の遠心分離
を行ない、上澄液と沈殿とに分け、沈殿については緩衝
液に再溶解した後、常法に従いＤＮＡポリメラーゼ、リ
カーゼによる反応を行なった。そして、大腸菌ＪＡ２２
１ニ形質転換し、アンビシＩＪ ン（Ａｐ）を１００１
１ ｇ／Ｔ＠Ｑを含むＬＢ寒天プレート上でコロニーを
形成させた。なお、アンピシリンはプラスミドのマーカ
であり、ＬＢ組成はバクトドリプトン１％、酵母抽出液
０．５％、ＮａＣＱ Ｏ，５％および寒天１．５％をそ
れぞれ含有している。
を行ない、上澄液と沈殿とに分け、沈殿については緩衝
液に再溶解した後、常法に従いＤＮＡポリメラーゼ、リ
カーゼによる反応を行なった。そして、大腸菌ＪＡ２２
１ニ形質転換し、アンビシＩＪ ン（Ａｐ）を１００１
１ ｇ／Ｔ＠Ｑを含むＬＢ寒天プレート上でコロニーを
形成させた。なお、アンピシリンはプラスミドのマーカ
であり、ＬＢ組成はバクトドリプトン１％、酵母抽出液
０．５％、ＮａＣＱ Ｏ，５％および寒天１．５％をそ
れぞれ含有している。
３７℃で１６時間後に３９個のコロニーが認められたの
で、それぞれ常法に従ってプラスミドを抽出し。
で、それぞれ常法に従ってプラスミドを抽出し。
制限酵素ＭｌｕＩで切断した後電気泳動で解析したとこ
ろ、変異型を示したものが６コロニー（取得率１５．４
％）であった、これの２回のくり返し実験では。
ろ、変異型を示したものが６コロニー（取得率１５．４
％）であった、これの２回のくり返し実験では。
４３個中８個（変異型取得率１８６６％）および３３個
中５個（同１５．２％）という結果が得られた。
中５個（同１５．２％）という結果が得られた。
一方、上澄液については、更に一５０℃に２時間放置後
、１６０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離で合成ｏ１ｉ
ｇ。
、１６０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離で合成ｏ１ｉ
ｇ。
の沈殿が認められた。
比較例
実施例において、エタノール処理を行わないものについ
ては、４８個の形成コロニー中変異型を示したものは４
個（取得率８．３％）で、これの２回のくり返し実験で
は、３９個中４個（変異型取得率１０．３％）および５
２個中５個（同９．６％）という結果しか得られなかっ
た。
ては、４８個の形成コロニー中変異型を示したものは４
個（取得率８．３％）で、これの２回のくり返し実験で
は、３９個中４個（変異型取得率１０．３％）および５
２個中５個（同９．６％）という結果しか得られなかっ
た。
Claims (1)
- １、１本鎖の鋳型ＤＮＡに、この配列と１塩基異なった
配列の合成ＤＮＡ断片を相補させ、完全２本鎖にした後
で菌体内（ｉｎｖｉｖｏ）に戻し、元のＤＮＡ（野生型
）とは異なるＤＮＡ（変異型）を抽出する部位特異的突
然変異の導入方法において、アニーリング後の混合物に
エタノールを加えて約０〜−３０℃に放置し、それを遠
心分離した沈殿物を形質転換することを特徴とするＤＮ
Ａに対する部位特異的突然変異の導入方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28037688A JPH02128691A (ja) | 1988-11-08 | 1988-11-08 | Ｄｎａに対する部位特異的突然変異の導入方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28037688A JPH02128691A (ja) | 1988-11-08 | 1988-11-08 | Ｄｎａに対する部位特異的突然変異の導入方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02128691A true JPH02128691A (ja) | 1990-05-17 |
Family
ID=17624154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28037688A Pending JPH02128691A (ja) | 1988-11-08 | 1988-11-08 | Ｄｎａに対する部位特異的突然変異の導入方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02128691A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0468520A2 (en) * | 1990-07-27 | 1992-01-29 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Immunostimulatory remedies containing palindromic DNA sequences |
-
1988
- 1988-11-08 JP JP28037688A patent/JPH02128691A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0468520A2 (en) * | 1990-07-27 | 1992-01-29 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Immunostimulatory remedies containing palindromic DNA sequences |
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