JPH02117692A - ポリペプチドの固相製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はペプチドの同相製造法に関する。

本発明を要約すれば、本発明により下記の工程：（ｉ）
カルボニル−含有重合体をジペプチドと反応させ、イミ
ダゾリジノン環を形成させてジペプチドを該重合体に結
合させること； （ｉ）結合したジペプチドの末端酸基を活性化すること
； （ｉｉｉ）活性化された末端酸基を遊離のアミン基及び
保護されたカルボキシル基を有するペプチド誘導体とカ
ップリングさせること；及び （ｉｉｖ）前工程のカップリグ生成物を加水分解してポ
リペプチドを分離し、同時に始めのカルボニル含有重合
体を再生させること、 から成るポリペプチドの固相製造方法が提供されること
である。

１９６３年にメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）
　（Ｊ。

Ａ＋ｎ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、８°５．２１４９　（ｉ
ｉ９６３））により導入された固相ペプチド合成はペプ
チド化学にブームを起こした。固相合成の主な利点は中
間体が総ての過剰な反応剤及び／又は反応副産物を含ま
ずに得られる容易性にある。反応中間体は事実上不溶性
重合体に結合しており、そのために適当な溶剤で洗浄す
ることにより各種の不純物を除去することができる。高
分子量生成物を溶解する溶剤の選択に関連した問題も又
避けられる。実際上樹脂を良く膨潤させる溶剤を使用す
ることが必要である。更に、中間体の分離の問題が無く
なることによって、工程の自動化が可能となる。

始めはクロロメチル化により予め活性化されたポリスチ
レンが使用された。Ｎ末端を保護されたアミノ酸の末端
炭素は、ベンジルエステルを経由して支持体に結合して
いる。これらのエステル結合はペプチド合成の間ずっと
安定である。フェニルアンル、ヒドラジル、アンルスル
ホニル、ベンズヒドリル及びアミノメチル基等のような
他の官能基が引き続き使用された（バラニー［Ｂａｒａ
ｎｙ］　Ｇ。

、メリフィールドＲ，Ｂ、、ペプチドにおける固相ペプ
チド合成［５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　
５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　１ｎＴｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ］
　（グロス［Ｇｒｏｓｓ］　Ｅ、、マイエンホーフｙ　
−［Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒｌ　Ｊ、ｉ）第２巻、アカデ
ミツク・プレス［Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ］、ニ
ューヨーク、１９７９．３頁）。しかしアミノ酸の取込
みの速度は合成が進むに従って減少することが認められ
た。シェパード（Ｓｈｅｐｐａｒｄ）はこの反応性の低
下はポリスチレンマトリックスと結合したペプチドの間
の物理化学的な非相溶性によることを示した（シェパー
ドＲ，Ｃ，、ペプチド　１９７１（ネスヴアドバ［Ｎｅ
５ｖａｄｂａ］　Ｈ，編）１１１頁、ノース・ホランド
［ＮｏｒＬｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄｌ出版、アムステルダム
（ｉｉ９７３））。実際に重合体支持体は親水性のペプ
チド鎖と非相溶性である疎水的性質を有している。

この問題を解決するために、ポリアクリルアミド（アサ
−トン［Ａｔｈｅｒｔｏｎ］　Ｅ、、シェパードＲ，Ｃ
，、ペプチド＋９７４　（ウォルマン［Ｗｏ、１ｍａｎ
ｌ　Ｙ、編）ウィリー［Ｗｉｌｅｙ］　、ニューヨーク
ｌ９７５．１２３頁）及びポリアクリロイルピロリジン
（スミス［Ｓｍ１ＬｈｌＣＷ６、スタール［５Ｌａｈｌ
ｌＧ、Ｌ、、ウオルタ−［ＷａｌｔｅｒｌＲ６、ｌｎＬ
、　Ｊ、　Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　　
１３　％ｌ　Ｏ９（ｉｉ９７９））のような極性重合体
支持体が提案された。これらの重合体は必要な機械的強
度、及びポリスチレンよりもペプチドに近い構造を有し
ており、これらの樹脂の官能化（ｆｕｎｃＬｉｏｎａｌ
ｉｚａｔｉｏｎ）が重合の際に行われる。ポリアクリロ
イルピロリジンの結合の度合（０，７ｍｅ、ｑ　／ｇ）
はポリアクリルアミドを用いて得られる値（０，３５ｍ
ｅＱ／ｇ）よりも僅かに大きく、ポリスチレン（０゜１
ないし０．３ｍｅｑ／ｇ）の場合と充分に競合する。更
に、これらの二つの新規な種類の樹脂はポリスチレンよ
りも大きい膨潤能力を有している。

実際、ポリスチレン樹脂の場合はメタノールのような極
性の強い溶剤中で膨潤は最少であり、塩素化溶剤中で強
く増大する（ライ−ランド［Ｗｉｅ１２ｎｄ］Ｔ１、ヒ
ル［Ｂｉｒｒ］　Ｃ，、、フロール［Ｆｌｏｒｌ　Ｆ、
、Ｌｉｅｂｉｇｓ　Ａｎｎ、　Ｃｈｅｍ、７２７．１３
０　（ｉｉ９６９））　　；一方ポリアクリロイルピロ
リジンの場合は、この膨潤の度合は大部分の溶剤中で大
である（スタール［５ｔａｈｌｌＧ、Ｌ、、ウォルタ−
［Ｗａｌｔｅｒｌ　Ｒ，、スミス［Ｓｍ１ｔｈｌＣ，Ｗ
、、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　　ｌ　Ｏｌ
　％　５３８３（ｉｉ９７，９））。

本発明はポリペプチドの固相製造法の改良された方法を
提供する。

本発明によれば、ポリペプチドは下記の工程：（ｉｉ）
カルボニル−含有重合体をジペプチドと反応させ、イミ
ダゾリジノン環を形成させてジペプチドを該重合体に結
合させること； （ロ）液状ジペプチドの末端酸基を活性化すること； （田）活性化された末端酸基を遊離のアミン基及び保護
されたカルボキシル基を有するペプチド誘導体とカンブ
リングさせること；及び （ｉｉｖ）前工程のカップリグ生成物を加水分解してポ
リペプチドを分離し、同時に始めのカルボニル−含有重
合体を再生させること、 からなる方法によって製造される。

本発明において使用されるカルボニル−含有重合体はフ
ランス特許発明明細書ＦＲ−Ａ第２，５１９．９７３号
に記載された方法で都合良く製造することができる。

これらのカルボニル−含有重合体はペプチド鎖と相溶性
がある親水性の性質を有し、且つ容易に使用できる完全
に満足すべき機械的性質を有している。更に、それらは
入手が容易である。ペプチド合成に使用される種々の溶
剤、並びに水中におけるそれらの膨潤度はポリアクリロ
イルピロリジンの膨潤度と同等である。最後に、それら
は容量が高い（Ｃｐｃ＝ｏ　−４＋＋＋ｅ　ｑ　、／ｇ
）ために、既往技術で記載された重合体よりも著しく高
い結合度合を有することが可能である。ペプチドの固定
はイミダゾリジノンを経由して行われるので、予め又は
重合の間に支持体を活性化することは不必要である。こ
れらの支持体のペプチドとの結合及び重合体支持体から
の脱離には、温和な条件を要するのみである。更に支持
体は脱離の際に自動的に再生される。

更に、予期しないことであったが、ケト基は支持体に結
合したイミダゾリジノンのアミン基の塩基性に影響を及
ぼすことが観察された。−例を挙ければ、ポリアクリロ
イルピペリドン上に形成されたイミダゾリジノンの有す
るｐＫａは３程度であるが、ポリアクリロイルンクロヘ
キサノン上に生成されたものは５程度のｐＫａを有する
。この大きなｐＫａの差異によって追加的に保護基を導
入することなく、ペプチド合成の二つの方策（ｓｔｒａ
Ｌｅｇｙ）を実行することができる。即ち５より小さく
ないｐＫａを有するイミダゾリジノンをもたらすカルボ
ニル−含有重合体を選択することにより、ＣからＮ末端
に向かって進行するペプチド合成を遂行することが可能
であり、その際アミン基は充分カップリング反応を受は
入れる程度に求核性である。この場合の出発点はα−ア
ミノアミドの支持体への結合である。

これと対照的に、３より大きくないｐＫａを有するイミ
ダゾリジノンをもたらすカルボニル−含有重合体は、Ｎ
からＣ末端に向かって進行するペプチド合成を構成する
ことを可能とする。実際、この場合には、ジペプチドか
ら誘導されたイミダゾリジノンのアミン基はカップリン
グ剤と反応しない程度に充分小さい求核特性を有し、そ
のためこれらのイミダゾリジノンは完全にアミン基の保
護基として作用する。従ってこの種の合成は保護基を追
加してアミン基を保護することを必要とせずに実行する
ことが可能であり、それにより合成の実施か著しく簡単
化される。

更に、両方の場合において、最終的なペプチドの脱離に
より重合体を自動的に再生することができる。

本発明の方法の一つの態様によれば、始めのカルボニル
−含有重合体はピペリドン単位を含有する重合体、特に
有利にはＮ、Ｎ″−ビスアクリロイルビペラ・ンンで架
橋されｊニポリアクリロイルピペリドン樹脂から成る。

２０％のＮ、Ｎ″−ビスアクリロイルピペラジンで架橋
された時に、この樹脂は約４ｍｅｑ、／ｇの容量、満足
すべき機械的強度及び又相当程度の膨潤度、例えば水中
で４．０３、メタノール中で２．９８．ジクロロメタン
中で２゜７６及びジメチルホルムアミド中で２．５８の
溶剤残留度（ｓｏｌｖｅｎｔ　ｒｅｔｅｒ＋ｔｉｏ口）
Ｓｋを有している。

本発明の別な態様によれば、始めのカルボニル含有重合
体と反応するジペプチドは下記式：％式％ 但し　Ｒ及びＲ１は相互に独立に、天然又は改質アミノ
酸の側鎖を示し； Ｒ′は水素原子或いは又Ｒを示し、及びＲ″１は水素原
子或いは又Ｒ３を示す、に対応する。

特に、各残基Ｒ及びＲ，は１ないし１２の炭素原子、及
び随時−つ又は多数の硫黄のような異種原子を含む線状
又は分校状炭化水素鎖全示すことができ、該残基Ｒ及び
Ｒ，は−度又は数度、好適には鎖の末端において、ヒド
ロキシ、アミノ、カルボニル、フェニル、ヒドロキシフ
ェニル、カルボキシアミド、インドリル、イミナジル、
及びグアニジルのような基で置換されており、或いは又
Ｒ及びＲ１は、α−位の窒素原子と共に、窒素のような
異種原子を少なくとも一つ含む飽和複素環式基を形成し
、該複素環式基自体が例えばヒドロキシ基で置換されて
いることも可能である。

本発明の他の有利な態様に従えば、重合体に結合してい
るイミダゾリジノン環の末端酸基の活性化は、Ｎ−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｅ）の存在下にジシ
クロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）との反応により
得られる。

変法として、この活性化は又カーチウス（Ｃｕｒｔｉｕ
ｓ）　Ｔ、（Ｂｅｒ、　ｄｔｓｃｈ、ｃｈｅｍ、　Ｇｅ
ｓ、　１９０２．３５．３２２６）により記載された周
知のペプチド・カップリング技術に相当するアジド法に
より得ることもできる。

カップリング工程（ｉｉ）の際に使用される遊離のアミ
ン基及び保護カルボキシル基を有するペプチド誘導体は
、アミノ酸エステル又はポリペプチドエステルから成る
ことが有利である。

下記の実施例は本発明の方法によるトリペプチドの製造
を記載する。

実施例　１ Ｌ−Ｖａ　ｌ　−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｌ−Ｐｈ　ｅＯＭｅの固
相製ａ）Ｌ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙのボリアクリロイルビ
２０％のＮ、Ｎ’−ビスアクリロイルピペラジンで架橋
された８、９ｇの６０−１１５メツシユのポリアクリロ
イルピペリドン樹脂、Ｃｐｃ＝ｏ＝　４　ｒａｅｑ、／
ｇ；を恒温反応器中に導入する。

次いで２２峠のメタノール中に可溶化された５゜７ミリ
モル（ｉｉ９）のし−バリルグリシンを添加する。混合
物を撹拌しながら８０℃に３時間保持する。次いで濾過
により樹脂を分離し、数回メタノールで、次いで順次Ｈ
＊Ｏ，ｌ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｌ　、　Ｈ２Ｏ、ＣＨ，ＯＨ
及びＣＨ，Ｃ１２で洗浄する。次いで樹脂を減圧下（ｉ
ｉ０””ｍｍＨｇ　）で乾燥する。ヒドロキンラミン試
験により測定された容量は約３ｍｅ　Ｑ　、／９である
。結合の度合は乾燥樹脂１ｇ当たり０．６ミリモルであ
る。

１））Ｌ−ＰｈｅＯＭｅのカップリング１５ｍＱの無水
ＣＨ，ＣＩ！で希釈された１４．３ミリモル（ｉｉ，８
＋＋＋Ｑ）のＮ−エチルモルホリンを１３．８ミリモル
（２，９９）のＬ　−Ｐ　ｈ　ｅ　ＯＭ　ｅ　・ＨＣＩ
に添加する。Ｎ−エチルモルホリン塩酸塩を濾過により
分離し、その後濾液を上記で製造さｎｆ：Ｖａ　Ｉ　−
Ｇ　Ｉ　ｙ−ピペリドン樹脂に添加する。

１３．８ミリモル（ｉｉ，８９）のＨＯＢ　を及び１３
゜８ミリモル（２，８９）のＤＣＣを添加する。

混合物を室温で２４時間撹拌し、次いで濾過により樹脂
を分離し、減圧下で乾燥する前に順次ＣＨ。

ＣＩ　２、ＣＨ，ＯＨ及びＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する。

Ｃ）加水分解 二つのカラム、緩８７液貯留器及びポンプから成る閉回
路組立物を製造する。

６０°Ｃに恒温調整された第一のカラムに、Ｌ−Ｖａｌ
−Ｇｌｙ−Ｌ−ＰｈｅＯＭｅ−ピペリドン樹脂を入れ、
恒温調整されていない第二のカラムにデュオライト（Ｄ
ｕｏｌｉｔｅ）■（ＣＦ２０４）スルホン樹脂を導入す
る。５０　：　５０水／メタノ一ル混合物で加水分解す
ることによりトリペプチドエステルを遊離し、次いでス
ルホン樹脂に結合させる。６０時間後、スルホン樹脂カ
ラムを取り外し、ＩＮの水酸化アンモニウム溶液で溶離
することにより粗製のトリペプチドを回収する。溶液を
蒸発及び凍結乾燥後、残渣を５ＮＨＣＩのメタノール溶
液中で一夜撹拌する。無水エーテルを添加すると、１．
１１６９の、３ミリモルに相当するＬＶａｌ−Ｇｌｙ−
Ｌ−ＰｈｅＯＭｅ−ＨＣｌが沈澱する。ｍ、ｐ、−７０
°Ｃ（分解）Ｅａｌ　Ｗ＝＋４５．１’　　（ｃ　＝　
ｌ、ＤＭＦ）。

相製造 ａ）Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニンの固定化：Ｌ−Ｖａｔ
−Ｇｌｙを固定化する上記の技術を用いて、３７ｍＱの
メタノール中の６．２４ミリモル（ｉｉｇ）のＬ−Ａ　
Ｉ　ａ−Ｌ−Ａ　ｌ　ａを用いて出発し、６０°Ｃで２
０時間撹拌後、乾燥樹脂ｌｏｇ上に７７０ｍｇのジペプ
チドを固定化する。結合の度合は乾燥樹脂１ｇ当たり０
．５ミリモルである。

ｂ）Ｌ−アラニンベンジルエステルのカップリング Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅをＬ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ樹脂にカップ
リングさせる方法を使用して、無水ＣＨ。

ＣＩ、及び無水ＤＭＦ中の１２．５ミリモル（２゜６９
６ｇ）のＬ−Ａｌａ−ＯＢｚ−ＨＣｌ、１３゜５ミリモ
ル（ｉｉ，９＋＋＋＋２）のＮＥｔ３．１２．５ミリモ
ル（２，５７５ｇ）のＤＣＣ及び１２．５ミリモル（ｉ
ｉ，６８８９）のＨＯＢｔを用いてカップリングを行い
、室温で７２時間撹拌状態を保つ。

Ｃ）加水分解 加水分解に７０°Ｃの蒸留水を使用し、トリペプチドＬ
−Ｖａ　Ｉ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅを遊離するの
に用いた技術により加水分解を行う。

４日後、スルホン樹脂カラムを取り外し、ｌＮの水酸化
アンモニウムで溶離することにより粗製のトリペプチド
を回収する。溶離液ＣＨ，ＯＨ／３４％ＮＨＩ　（９５
：　５）を使用すると、ＴＬＣにより痕跡量のジペプチ
ドＬ−Ａ　ｌ　ａ−Ｌ−Ａ　Ｉ　ａか検出される。アン
モニア溶液を減圧下で蒸発及び凍結乾燥後、溶離液とし
てＣＨ，ＯＨ／３４％ＮＨ３（９５：　５）を使用し、
シリカゲル上でクロマトグラフィーにより残留するジペ
プチドを除去する。次いで溶離液としてＨ２Ｏ（ｉｉ：
１０００　　ＴＦＡ）を用い、ｌ攬Ｑ／分の流速で、２
゛ｌＯｎｍでのＵＶ検出を使用して、ＲＰ１８（メルク
・リクロソープ［Ｍｅｒｃｋ　Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂｌ
）カラム上で生成物をＨＰＬＣにより分析する。蒸留水
０．５ｉ中番：粗製生成物１３．６ｍｇの濃度の場合、
保持時間はり、Ｌ、Ｌエピマーに対しては２．７６分で
、Ｌ、Ｄ、Ｌエピマーに対しては６．７７分である。エ
ピマー化の度合は１％の程度である。

本発明の主なる特徴及び態様は以下の通りである。

１、下記の工程： （ｉｉ）カルボニル−含有重合体をジペプチドと反応さ
せ、イミダゾリジノン環を形成させてジペプチドを該重
合体に結合させること； （ｉｉ）結合したジペプチドの末端酸基を活性化するこ
と； （ｉｊ）活性化された末端酸基を遊離のアミン基及び保
護されたカルボキシル基を有するペプチド誘導体とカン
プリングさせること；及び （ｉｉｖ）前工程のカップリグ生成物を加水分解してポ
リペプチドを分離し、同時に始めのカルボニル含有重合
体を再生させること、 からなるポリペプチドの固相製造方法。

２、前記の始めのカルボニル−含有重合体がピペリドン
単位を含む重合体である、上記ｌに記載の方法。

３、前記のピペリドン単位を含む重合体が、Ｎ。

Ｎ″−ヒスアクリロイルピペラジンで架橋されていても
よいポリアクリロイルピペリドン樹脂である、上記２に
記載の方法。

４、始めのカルボニル−含有重合体と反応するジペプチ
ドが下記式： ％式％ 但し　Ｒ及びＲ１は相互に独立に、天然又は改質アミノ
酸の側鎖を示し； Ｒ′は水素原子或いは又Ｒを示し、及びＲ′１は水素原
子或いは又Ｒ，を示す、に対応する、上記ｌないし３の
いずれかに記載の方法。

５　各残基Ｒ及びＲ１は、一つ又は多数の硫黄のような
異種原子を有し又は有しない、ｌないし１２の炭素原子
を含む線状又は分枝状炭化水素鎖を示し、該残基Ｒ及び
Ｒ，は置換されていないか又は−度又は数度、好適には
鎖の末端において、ヒドロキシ、アミン、カルボニル、
フェニル、ヒドロキンフェニル、カルボキシアミド、イ
ンドリル、イミナジル、及びグアニジルのような基で置
換されており、或いは又Ｒ及びＲ，は、α−位の窒素原
子と共に、窒素のような異種原子を少なくとも一つ含む
飽和複素環式基を形成し、該複素環式基自体が置換され
ていないか又は例えばヒドロキシ基で置換されている、
上記４に記載の方法。

６、隣接する窒素に結ばしていてもよいＲ及びＲ１が天
然に生じるアミノ酸の側鎖を示し、そしてＲ′及びＲ１
′の両者が水素である、上記４に記載の方法。

７、始めのカルボニル−含有重合体と反応する該ペプチ
ドが； Ｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ 又は Ｌ−Ａ　　ｌ　　ａ−Ｌ−Ａ　　ｌ　　ａである、上記
ｌないし６のいずれかに記載の方法。

８、結合したジペプチドの末端酸基が、Ｎ−ヒトミキン
ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の存在下にジノクロヘ
キシルカルボジイミド（ＤＣＣ）との反応により活性化
される、上記ｌないし７のいずれかに記載の方法。

９、結合したジペプチドの末端酸基がアジド化により活
性化される、上記１ないし７のいずれかに記載の方法。

１０　　カンブリング工程（ｉｉ）で使用される遊離の
アミノ酸及び保護されたカルボキシル基を有するペプチ
ド誘導体がアミノ酸エステル又はポリペプチドエステル
である、上記１ないし９のいずれかに記載の方法。

１１、該エステル７５ＣＬ−Ｐｈｅメチルエステル又は
Ｌ−Ａ　ｌ　ａベンジルエステルである、上記ｌＯに記
載の方法。

１２、加水分解が水性アルコール媒体中で６０°Ｃ程度
の温度に加熱することによる、上記ｌないしＩＩに記載
の方法。

１３、ポリペプチドがエステルの形で得られる、上記１
２に記載の方法。

１４、得られるポリペプチドエステルがスルホン樹脂に
結合している、上記１３に記載の方法。

１５　スルホン樹脂に結合したポリペプチドエステルか
次いで水酸化アンモニウム溶液で溶離され、ポリペプチ
ドを生じる、上記１４に記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程： （ｉ）カルボニル含有重合体をジペプチドと反応させて
   イミダゾリジノン環の形成によりジペプチドを該重合体
   に結合させ； （ｉｉ）結合したジペプチドの末端酸基を活性化させ； （ｉｉｉ）活性化された末端酸基を遊離のアミン基及び
   保護されたカルボキシル基を有するペプチド誘導体とカ
   ップリングさせ；及び （ｉｖ）前工程のカップリグ生成物を加水分解してポリ
   ペプチドを分離しそして同時に始めのカルボニル含有重
   合体を再生させる、 ことを特徴とするポリペプチドの固相製造法。