JPH02109999A - 核酸マルチマーおよびそれを用いた増幅核酸ハイブリダイゼーション分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、核酸化学および生化学分析の分野に関する。

さらに詳細には、新規な核酸マルチマーおよび核酸ハイ
ブリダイゼーション分析に関する。

（従来の技術） 核酸ハイブリダイゼーシヨンは、現在一般に遺伝子的研
究と生物医学的研究と臨床診断用薬で用いられている。

基本的な核酸ハイブリダイグー９９フ分析においては１
分析物である一本鎖核酸（ＯＮ＾またはＲＮ＾）を標識
された核酸プローブにハイブリダイズし、その結果生ず
る標識された二本鎖を検出する。放射性の標識物と非放
射性の標識物の両方が用いられている。

二本鎖を容易に分離させて外来性物質から検出するため
、および、／または検出されルシグナルを増殖させるた
め、この基本的な方法の改変が行われている。

本出願人が出Ｓｔ、ている係属中のヨーロッパ特許出願
公開第０２２５８０７号は０分析物の核酸を標識プロー
ブのセットおよび捕捉プローブのセットにハイブリダイ
ズする。液体相核酸ハイブリダイゼーション分析を開示
する。プローブ−分析物複合体は、捕捉プローブのセッ
トに相補的な、固相に支持された捕捉プローブと、ハイ
ブリダイゼーシヨンにより結合する。これにより８分析
物の核酸は固相複合体として溶液から除去されうる０分
析物を固相複合体の形態にすることによって１分析の次
の分離段階が容易になる。標識プローブのセットは、固
相／分析物複合体にハイプリダイゼーシ９ンによって結
合する標識プローブに相補的である。

ＰＣＴ出願８４１０３５２０およびヨーロッパ特許出願
１２４２２１は、以下のようなりＮＡハイブリダイゼー
シ岬ン分析を開示する： （１）分析物は酵素標識オリゴヌクレオチドに相補性の
あるディルを有する。−重鎖ｎＮ＾プローブにアニール
される。

（２）その結果生ずるディルをもつ二本鎖を酵素標識オ
リゴヌクレオチドにハイブリダイズする。Ｒｒ＋ｚ。

旧ｏ　ｒ、ｈ　ｅ−の１′旧ｏ−Ｒｒｉｄｇｅ”標識化
システムは、前記′２つの特許出願に記載されたシステ
ムと近似であるように思われる。′旧ｏ−Ｒｒ％ｄｇｅ
”システムは。

ＤＮＡプローブに改変されていない３゛−ポリＴテイル
を付加するため、ターミナルデオキシヌクレオチドトラ
ンスフェラーゼを使用している。ポリＴテイルを有する
プローブを、標的とするＩＩＮＡ配列にハイブリダイズ
し１次いでビオチン修飾ポリＡにハイブリダイズする。

ヨーロッパ特許出願２０４５１０は以下のようなりＮＡ
ハイブリダイゼーション分析を開示する。すなわち、ｎ
Ｎ＾をポリＴティルのような、ディルを有するプローブ
と接触させるが、そのディルとはプローブのディルにハ
イブリダイズし、複数の標識鎖と結合できる１例えばポ
リＡ配列のような配列を有する増幅鎖である。これら従
来のハイブリダイイー９１フ分析の主要な問題は、それ
らの分析物に、十分な特異性および／または極めて低い
レベルの分析物の検出に有効なシグナルがないことであ
る。本発明の主要な目的は、シグナルの高再現性ゲイン
と、高再現性Ｓ／Ｎ比と、低い非特異的な、それ自体再
現性のある結合を提供し、かつ低濃度で普遍的なシグナ
ル部分および分析物と結合し、安定な複合体を形成しう
る核酸ハイブリダイゼーシヨンに用いられる増幅物を提
供することにある。

他の面は、肝炎Ｂ型ウィルス（ＨＲＶ）　、μ工２−ｒ
ｒｈｏｅａｅ　、　Ｎ、　　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのペ
ニシリンおよびテトラサイクリン耐性ならびにＣｈｌａ
ｍ　ｄｉａ　ｔｒａｃ、ｈｏｓ＋ａＬｉｓのハイブリダ
イゼーション分析を向上させることにある。

（発明の要旨） 本発明の一面は。

（ａ）対象となる第１の一本鎖ヌクレオチド配列に特異
的に結合しうる少なくとも１つの第１の一本鎖オリゴヌ
クレオチド単位；および （ハ）対象となる第２の一本鎖ヌクレオチド配列に特異
的に結合しうる多数の第２の一本鎖オリゴヌクレオチド
単位； を包含する核酸マルチマーにある。

本発明の他の一面は、（１）上記マルチマーを第１のオ
リゴヌクレオチドの単位で分析物である一本鎖核酸分析
物または分析物に結合したオリゴヌクレオ千ドにハイブ
リダイズシフ、かつ、（２）次いで種々の一本鎖標識オ
リゴヌクレオチドを、第２の種゛々のオリゴヌクレオチ
ド単位によってマルチマーにハイブリダイズする核酸ハ
イプリダイゼーシッン分析にある。

本発明のさらに他の一面は、　（ａ）ＨＲＶ染色体の１
部分に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の部分お
よび（ｂ）核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に
相補的なヌクレオチド配列を有する第２の部分を含む肝
炎Ｂ型ウィルス（ＨＲＶ）の液体相サンドイツ粁ハイブ
リダイゼーシ岬ン分析において増幅プローブとして有用
な合成オリゴヌクレオチドにある。

本発明のさらに他の一面は、　（ａ）　）ＩＲＶ染色体
の１部分に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の部
分および（ｂ）固相に結合するオリゴヌクレオチドに相
補的なヌクレオチド配列を有する第２の部分を含むＨＲ
Ｖの液相サンドイツチハイブリダイゼーション分析にお
いて捕捉プローブとｌ、て有用な合成オリゴヌクレオチ
ドにある。

本発明のさらに他の一面は、　（ａ）Ｎ　　■並■ｈｏ
ｅａｅピリンＩ）ＮＡの１部分に相補的なヌクレオチド
配列を有する第１の部分および（ｂ）核酸マルチマーの
オリゴヌクレオチド単位に相補的なヌクレオチド配列を
有する第２の部分を含むＮ、　　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ
−の液相サンドイツチハイプリダイゼーシ責ン分析にお
いて増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチド
にある。

本発明のさらに他の一面は、　（ａ）Ｎ、　　釘ｍカニ
初旦凹−ピリンＯＮへの１部分に相補的なヌクレオチド
配列を有する第１の部分および、（ｂ）固相に結合する
オリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を有す
る第２の部分を含有するＬ　１狙り工初旦鮎−の液相サ
ンドイツチハイブリダイゼーシ四ン分析において捕捉プ
ローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドにある。

本発明のさらに他の一面は、（ａ）第１３図に示したＮ
、　　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ染色体クローンの１部分に
相補的なヌクレオチド配列を有する第１の部分および（
ｂ）ｍ酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補的
なヌクレオチド配列を有する第２の部分を含む】−１す
ｏｒｒｈ旦シ猥−の液相サンドイツチハイブリダイゼー
シラン分析において増幅プローブとして有用な合成オリ
ゴヌクレオチドにある。

本発明のさらに他の一面は、（ａ）第１３図に示したＮ
Ｌｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ染色体クローンの１部分に相補
的なヌクレオチド配列を有する第１の部分およびΦ）固
相に結合するオリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチ
ド配列を有する第２の部分を含むＬｏｎｏｒｒｈｏｅ／
Ｉｅの液相サンドイツチハイプリダイゼーシ）ン分析に
おいて捕捉プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチ
ドにある。

本発明のさらに他の一面ハ、　Ｎ、　　釘猥ｙ工回旦凹
−ロＮＡを検出するための口Ｎ＾プローブであり、該プ
ローブは第１３図で示したＮＬ　］晩但工馳旦ザー染色
体クローンのどちらかの鎖の全部あるいは一部に相補的
なヌクレオチド配列を有する。

本発明のさらに他の一面はベーターラクタマーゼ↑ｌ’
！Ｍ−１遺伝子を有する７、３ｋｂのＮ、ξ匹二軽弘り
科のプラスミドのサンドイッチハイブリダイゼーシヲン
分析において増幅プローブとして有用な合成オリゴヌク
レオチドにあり、該遺伝子は（ａ）　該プラスミドすた
は該遺伝子の１部分に相補的なヌクレオチド配列を有す
る第１の部分および（ｂ）核酸マルチマーのオリゴヌク
レオチド単位に相補的なヌクレオチド配列を有する第２
の部分を含む。

本発明のさらに他の一面は、ベーターラクタマーゼＴＥ
Ｍ−１遺伝子を有する？、　３ｋｂのＮＬ　幻狙五工初
μ猥−科のプラスミドのサンドイッチハイプリダイゼー
シ日ン分析において捕捉プローブとして有用な合成オリ
ゴヌクレオチドにあって、該遺伝子は（ａ）　１１Ｆプ
ラスミドまたは該遺伝子の１部分に相補的なヌクレオチ
ド配列を有する第１の部分および（ｂ）固相に結合する
オリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を有す
る第２の部分を含む。

本発明のさらに他の一面は、　（ａ）ｔｅｔＭ遺伝子の
断片に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の部分お
よび（ｂ）固相に結合したオリゴヌクレオチドに相補的
なヌクレオチド配列を有する第２の部分を含む、テトラ
サイクリン耐性生物中のｔｅ　ＬＭ遺伝子のサンドイッ
チハイブリダイゼーション分析において捕捉プローブと
して有用な合成オリゴヌクレオチドにある。

本発明のさらに他の一面は、　（ａ）ｔｅｔＭ遺伝子の
断片に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の部分お
よび、■）核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に
相補的なヌクレオチド配列を有する第２の部分を含むテ
トラサイクリン耐性生物中のｔｅ　ｔＭ遺伝子のサンド
イッチハイブリダイゼーション分析において増幅プロー
ブとし、て有用な合成オリゴヌクレオチドである。

本発明のさらに他の一面は、　（ａ）Ｃｈｌａｍ＋ｙｄ
ｉａ　ｐＣ旧、２プラスミドの１部分に相補的なヌクレ
オチド配列を有する第１の部分および（ｂ）核酸マルチ
マーのオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌクレオチド
配列を有する第２の部分を含むＣｈｌａｍ　ｄｉａ　ｔ
ｒａｒ、ｈｏ＊ａｔｉｓの液相サンドイッチハイブリダ
イゼーション分析において増幅プローブとして有用な合
成オリゴヌクレオチドにある。

本発明のさらに他の一面は、　（ａ）Ｃｈｌａｓ＋ｙｄ
ｉａ　ｐＣ旧、２プラスミドの１部分に相補的なヌクレ
オチド配列を有する第１の部分および（ｂ）固相に結合
したオリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を
有する第２の部分を含有するＣｈｌａｓ＋　ｄｉａ　ｔ
ｒａｃｈｏｍａｔｉＳの液相サンドイッチハイブリダイ
ゼーション分析において捕捉プローブとして有用な合成
オリゴヌクレオチドにある。

本発明のさらに他の一面は、ハイブリダイゼーション条
件下で２分析物と（ａ）　（ｉ　）　ＩＩＲＶ染色体の
１部分に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の部分
および核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補
的なヌクレオチド配列を有する第２の部分を含む過剰量
の増幅プローブオリゴヌクレオチドならびに（ｉｉ　）
　ＨＲＶ染色体の１部分に相補的なヌクレオチド配列を
有する第１の部分および固相に結合したオリゴヌクレオ
チドに相補的なヌクレオチド配列を有する第２の部分を
含む過剰量の捕捉プローブオリゴヌクレオチドとを接触
させ；伽】ハイブリダイゼーション条件下で工程（ａ）
の生成物と固相に結合したオリゴヌクレオチドとを接触
させ、（ｃ）次いで固相に結合していない物質を分離し
、、　（ｄ）ハイブリダイゼーシぢン条件下で工程（ｃ
）の液体相複合体生成物と（１）増幅プローブオリゴヌ
クレオチドの第２の部分に相補的な、少なくとも１つの
オリゴヌクレオチド単位および（ｉｉ）標識オリゴヌク
レオチドに相補的な第２の種々のオリゴヌクレオチド単
位を含む核酸マルチマーを接触させ、（ｅ）結合してい
ないマルチマーを除去し；（ｆ）ハイブリダイゼーショ
ン条件下で、（ｅ）工程の固相複合体生成物とを接触さ
せ；（ｂ）結合していない標識オリゴヌクレオチドを除
去し、カ）工程（縛の面相複合体生成物における標識物
の存在を検出することを包含する５分析物中のＨＲＶ　
Ｉ）ＮＡを検出するための液相のサンドイッチＩＮＮ＾
ハイブリダイゼーションにある。

本発明のさらに他の一面は、ハイブリダイゼーション条
件下で分析物と（ａ）　（ｉ　）第１３図で示したＮ、
　　ｎｎｏｒｒｈｏｅａｅ））”ツムクローンの１部分
に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の部分および
核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌ
クレオチド配列を有する第２の部分を含む過剰量の増幅
プローブオリゴヌクレオチドならびに（ｉｉ）第１３図
で示したＮエ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムクローンの
１部分に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の部分
および固相に結合したオリゴヌクレオチドに相補的なヌ
クレオチド配列を有する第２の部分を含有する過剰量の
捕捉プローブオリゴヌクレオチドとを接触さ廿；（ｂ）
ハイブリダイゼーション条件下で工程（ａ）の生成物と
固相に結合し７たオリゴヌクレオチドとを接触させ；（
ｃ）次いで固相に結合していない物質を分離し、　；　
（ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で工程（ｃ）の固
相複合体生成物と。

（１）増幅プローブオリゴヌクレオチドの第２の部分に
相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位およ
び（ｉｉ　）標識オリゴヌクレオチドに相補的な第２の
種々のオリゴヌクレオチド単位を含む核酸マルチマーと
を接触させ、（ｅ）結合していないマルチマーを除去し
；（ｆ）ハイブリダイゼーション条件下で工程（ｅ）の
固相複合体生成物上標識オリゴヌクレオチドとを接触さ
せ；（ｂ）結合していない標識オリゴヌクレオチドを除
去し；　（ｈ）工程（ｂ）の固相複合体生成物における
標識物の存在を検出することを包含する分析物中のＮ、
　　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　Ｉ）ＮＡを検出するための
液相サンドイツチロＮＡハイブリダイゼーションにある
。

本発明のさらに他の一面は、ハイブリダイゼーション条
件下で分析物と、第１３図に示されるμ工ｏｎｏｒｒｈ
ｏｅａｅゲノムクローンのいずれかの一本鎖の全部又は
部分に相補的なＤＮＡプローブとを接触させ、　ｒｌＮ
ＡｌＮ−ブを含む二本鎖の存在を検出することを包含す
る９分析物中のＮ、翻りμ伽■ａｅ　ｒｌＮＡを検出す
るためのＯＮ＾ハイブリダイゼーシ岬ン分析にある。

本発明のさらに他の一面は、ハイブリダイゼーション条
件下で分析物と（ａ）　（ｉ　）　Ｃｈｌａｓｓｙｄｉ
ａ　ｐＣ肛２プラスミドの１部分に相補的なヌクレオチ
ド配列を存する第１の部分および核酸マルチマーのオリ
ゴヌクレオチド単位に相補的なヌクレオチド配列を有す
る第２の部分を含む過剰量の増幅プローブオリゴヌクレ
オチドならびに（ｉｉ　）　Ｃｈｌａｍｙｄ＋ａ　ｐＣ
旧、２プラスミドの１部分に相補的なヌクレオチド配列
を有する第１の部分および固相に結合したオリゴヌクレ
オチドに相補的なヌクレオチド配列を有する第２の部分
を含む過剰量の捕捉プローブオリ゛ゴヌクレオチドとを
接触させ、（ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で工程
（ａ）の生成物と固相に結合したオリゴヌクレオチドと
を接触さ一１！、（ｃ）次いで固相に結合していない物
質を分離し、（ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で、
工程（ｃ）の固相複合体生成物と（ｉ）増幅プローブオ
リゴヌクレオチドの第２の部分に相補的な少なくとも１
つのオリゴヌクレオチド単位および（ｉｉ　）標識オリ
ゴヌクレオチドに相補的な第２の種々のオリゴヌクレオ
チド単位を含む核酸マルチマーとを接触させ；（ｅ）結
合していないマルチマーを除去し；（ｆ）ハイブリダイ
ゼーション条件下で工程（ｅ）の固相複合体生成物と標
識オリゴヌクレオチドとを接触させ；（ｂ）結合り、て
いない標識オリゴヌクレオチドを除去り、　：　（ｈ）
工程（局の固相複合体生成物における標識物の存在を検
出することを包含する１分析物中のＣｈｌａａ＋　ｄｉ
ａ　ｔｒとｃｈｏｍａｔｉｓ　ＤＮＡを検出する液相サ
ンドイッチＤＮＡハイブリダイゼーシクンにある。

本発明のさらに他の一面は、（ａ）ハイブリダイゼーシ
ョン条件下で分析物と、（ｉ）第１の核酸配列または第
２の核酸配列のうち一つに相補的な第１の部分および核
酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補的な第２
の部分を含む過剰量の増幅プローブオリゴヌクレオチド
ならびに（ｉｉ　）第１の核酸配列または第２の核酸配
列のうちの他の一方に相補的な第１の部分および固相に
結合したオリゴヌクレオチドに相補的な第２の部分を含
む過剰量の捕捉プローブオリゴヌクレオチドと接触させ
；（ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で工程（ａ）の
生成物と固相に結合したオリゴヌクレオチドとを接触さ
せ；（ｃ）次いで、固相の結合していない物質を（ｄ）
ハイブリダイゼーション条件下で工程（ｃ）の固相複合
体生成物と、（ｉ）増幅プローブオリゴヌクレオチドの
第２の部分に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオ
チドおよび（ｉｉ　）標識オリゴヌクレオチドに相補的
な第２の種々のオリゴヌクレオチド単位を含む核酸マル
チマーとを接触させ；（ｅ）結合していないマルチマー
を除去し；（ｆ）ハイブリダイゼーション条件下で工程
（ｅ）の固相複合体生成物と、標識オリゴヌクレオチド
とを接触させ；（ｂ）結合していない標識オリゴヌクレ
オチドを除去し、動）工程（ｂ）の固相複合体生成物に
おける標識物の存在を検出することを包含する。核酸の
１部分および第１の核酸配列を含むが、第２の核酸配列
を含まない核酸の他の１部分を含む試料中に。

第２の核酸配列を含む核酸の前者の１部分の１部である
第１の核酸配列を検出するための液相サンドイッチｌ）
Ｎ＾ハイブリダイゼーシゴンにある。

本発明のさらに他の一面は、（ａ）ハイブリダイゼーシ
ョン条件下で分析物と、　　（ｉ　）　７．３　ｋ−の
Ｎ−ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅプラスミドまたはベーターラ
クタマーゼ↑Ｉ！Ｍ−１’遺伝子の１部分に相補的なヌ
クレオチド配列を有する第１の部分および核酸マルチマ
ーのオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌクレオチド配
列を持つ第２の部分を含む過剰量の増幅プローブオリゴ
ヌクレオチドならびに（ｉｉ）上記プラスミドオたは上
記遺伝子の１部分に相補的なヌクレオチド配列を有する
第１の部分および固相に結合するオリゴヌクレオチドに
相補的なヌクレオチド配列を有する第２の部分を含む過
剰量の捕捉プローブオリゴヌクレオチドとを接触させ；
（ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で工程（ａ）の生
成物と固相に結合したオリゴヌクレオチドとを接触させ
；（ｃ）次いで固相に結合していない物質を分離し：（
ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で工程（ｃ）の固相
複合体生成物と（ｉ）増幅プローブオリゴヌクレオチド
の第２の部分に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレ
オチド単位および（ｉｉ）標識オリゴヌクレオチドに相
補的な第２の種々のオリゴヌクレオチド単位を含む核酸
マルチマーとを接触させ；（ｅ）結合していないマルチ
マーを除去し；（ｆ）ハイブリドーマ条件下で工程（ｅ
）の固相複合体生成物と、標識オリゴヌクレオチドとを
接触させ；（２）結合していない標識オリゴヌクレオチ
ドを除去し；カ）工程（ｇ）の固相複合体生成物におけ
る標識物の存在を検出することを包含する。

本発明のさらに他の１面は（ａ）ハイブリダイゼーショ
ン条件下で分析物とｔｅｔＭ遺伝子部分に相補的なヌク
レオチド配列を有する第１の部分および核酸マルチマー
のオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌクレオチド配列
を有する第２の部分を含む過剰量の増幅プローブオリゴ
ヌクレオチドならびに（ｉｉ）上記ｔｅ　ＬＭ遺伝子の
他の部分に相補的なヌクレオチド配列を有する第１の部
分および固相に結合するオリゴヌクレオチドに相補的な
ヌクレオチド配列を有する第２の部分を含む過剰量の捕
捉プローブオリゴヌクレオチドとを接触させ；（ｂ）ハ
イブリダイゼーション条件下で工程（ａ）の生成物と。

固相に結合するオリゴヌクレオチドとを接触させ；（ｃ
）次いで固相に結合していない物質を分離り、　ｉ　（
ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で工程（ｃ）の固相
複合体生成物と、（ｉ）増幅プローブオリゴヌクレオ千
ドの第２の部分に相補的な少なくとも１つのオリゴヌク
レオチド単位および（ｉｉ）標識オリゴヌクレオチドに
相補的な第２の種々のオリゴヌクレオチド単位を含む核
酸マルチマーとを接触させ；（ｅ）結合していないマル
チマーを除去し；（ｆ）ハイブリダイゼーション条件下
で工程（ｅ）の固相複合体生成物と、標識オリゴヌクレ
オチドとを接触させ；（８）結合していない標識オリゴ
ヌクレオチドを除去し；（ｈ）工程（樽の固相複合体生
成物における標識物の存在を検出するような分析物中の
テトラサイクリン耐性生物のＯＮ八を含有し、ていると
推測されるＬｅ　ＬＭ遺伝子を検出するための液相サン
ドイッチＤＮＡハイプリダイゼーシゴンである。

（以下余白） 本発明の核酸マルチマーは、（ａ）目的の第１の一本鎖
核酸配列と特異的に結合し得る少なくとも１つの第１の
一重鎖オリゴヌクレオチド単位と、串）目的の第２の一
本鎖核酸配列と特異的に結合し得る多数の第２の一重鎖
オリゴヌクレオチド単位と。

を含有する。

本発明の核酸ハイブリダイゼーション分析法は以下の工
程を包含する：（ａ）特許請求の範囲第９項に記載のマ
ルチマーを、固相に結合した一本鎖核酸分析物と、ある
いは該分析物に結合した一重鎖オリゴヌクレオチドと、
第１のオリゴヌクレオチド単位を介してハイブリダイズ
させる工程；（ｂ）結合していないマルチマーを除去す
る工程；（ｃ）標識された一重鎖オリゴヌクレオチドを
、第２のオリゴヌクレオチド単位を介して、該マルチマ
ーとハイブリダイズさせる工程；（ｄ）結合していない
標識されたオリゴヌクレオチドを除去する工程；および
（ｅ）該マルチマーに結合した標識の存在を検出する工
程。

第２の核酸配列を含む核酸セグメントと、第１の核酸配
列を含むが、該第２の核酸配列は含まない別の核酸セグ
メントとを含有する試料中の、該第２の核酸配列を含む
該核酸セグメントの一部である該第１の核酸配列を検出
するための本発明の溶液サンドイッチ核酸ハイブリダイ
ゼーション分析法は以下の工程を包含する：（ａ）分析
物を、ハイブリダイゼーション条件下で、（ｉ）該第１
の核酸配列または該第２の核酸配列の一方に相補的な第
１のセグメントと、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチ
ド単位に相補的な第２のセグメントとを含有する増幅プ
ローブオリゴヌクレオチド、および（ｉｉ　）該第１の
核酸配列または該第２の核酸配列の他方に相補的な第１
のセグメントと、固相に結合したオリゴヌクレオチドに
相補的な第２のセグメントとを含有する捕捉プローブオ
リゴヌクレオチドの過剰量と接触させる工程：（ｂ）ハ
イブリダイゼーション条件下で、工程（ａ）の産物を、
該固相に結合した該オリゴヌクレオチドと接触させる工
程；（ｃ）その後、該固相に結合していない物質を分離
する工程；（ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で。

工程（ｃ）の固相複合体産物を、（ｉ）該増幅プローブ
オリゴヌクレオチドの該第２のセグメントに相補的な少
なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位および（ｉｉ　
）標識されたオリゴヌクレオチドに相補的な多数の第２
のオリゴヌクレオチド単位を有する該核酸マルチマーと
接触させる工程；（ｅ）結合していないマルチマーを除
去する工程；（ｆ）ハイブリダイゼーション条件下で、
工程（ｅ）の固相複合体産物を、該標識されたオリゴヌ
クレオチドと接触させる工程；（６）結合していない標
識されたオリゴヌクレオチドを除去する工程；および（
ｈ）工程の固相複合体産物中における標識の存在を検出
する工程。

免疫化学的な分析物に対する本発明の免疫分析法は以下
の工程を包含する：（ａ）該分析物にリガンドを、特異
的に、かつ直接的にまたは間接的に結合させる工程であ
って、該リガンドが特許請求の範囲第１項に記載のマル
チマーの第１のオリゴヌクレオチド単位に相補的な一本
鎖オリゴヌクレオチドを有する。工程；Φ）結合してい
ないリガンドを除去する工程；（ｃ）特許請求の範囲第
１項記載のマルチマーを８亥リガンドにハイブリダイズ
させる工程；（ｄ）標識されたオリゴヌクレオチドを、
結合したマルチマーの第２のオリゴヌクレオチド単位に
ハイブリダイズさせる工程；（ｅ）結合していない標識
されたオリゴヌクレオチドを除去する工程；および（ｆ
）該結合したマルチマーに結合した標識の存在を検出す
る工程。

Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）　ＤＮＡのサンドイッチハ
イブリダイゼーション分析法における増幅プローブとし
て有用な本発明の合成オリゴヌクレオチドは。

（ａ）該ＨＢＶゲノムの保存領域のセグメントに相補的
なヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと。

（ｂ）核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補
的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメントと、を
含有する合成ヌクレオチド。

Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）　ＤＮＡのサンドイッチハ
イブリダイゼーション分析法における捕捉プローブとし
て有用な本発明の合成オリゴヌクレオチドは。

（ａ）該ＨＢＶゲノムの保存領域のセグメントに相補的
なヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと。

（ｂ）固相に結合したオリゴヌクレオチドに相補的なヌ
クレオチド配列を有する第２のセグメントと。

を含有する。

Ｌ　翻μｔｒｒｈｏｅμしのサンドイッチハイブリダイ
ゼーション分析法における増幅プローブとして有用な本
発明の合成オリゴヌクレオチドは（ａ）Ｎ、　　１ｎｏ
ｒｒｈｏｅａｅのビリン口ＮＡのセグメントに相補的な
ヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと。

（ｂ）核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補
的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメントと、を
含有する。

Ｎ、　　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのサンドイッチハイブリ
ダイゼーション分析法における捕捉プローブとして有用
な本発明の合成オリゴヌクレオチドは、　（ａ）Ｎ。

ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのピリンＤＮＡのセグメントに相
補的なヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと。

Ｃｂ）固相に結合したオリゴヌクレオチドに相補的なヌ
クレオチド配列を有する第２のセグメントと。

を含有する。

Ｎ、　　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの溶液相サンドイッチハ
イブリダイゼーション分析法における増幅プローブとし
て有用な本発明の合成オリゴヌクレオチドは。

（ａ）第１３図に示されるＬ　］胆五工勧旦胡−のゲノ
ムクローンのセグメントに相補的なヌクレオチド配列を
有する第１のセグメントと、（ｂ）核酸マルチマーのオ
リゴヌクレオチド単位に相補的なヌクレオチド配列を有
する第２のセグメントと、を含有する。

Ｌ　釘頃五工初旦凹−の溶液相サンドイッチハイブリダ
イゼーション分析法における捕捉プローブとして有用な
本発明の合成オリゴヌクレオチドは。

（ａ）　第１３図に示されるＬ　釘徂幻工Ｉ旦胡−のゲ
ノムクローンのセグメントに相補的なヌクレオチド配列
を有する第１のセグメントと、（ｂ）固相に結合したオ
リゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を有する
第２のセグメントと、を含有する。

β−ラクタマーゼＴｆ！Ｍ−１遺伝子を有するＮ、紐赳
ｒｒｈｏｅａｅの７．３　ｋｂプラスミドまたは該遺伝
子のサンドイッチハイブリダイゼーション分析法におけ
る増幅プローブとして有用な本発明の合成オリゴヌクレ
オチドであっは、（ａ）該プラスミドまたは該遺伝子の
セグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する第１の
セグメントと、＠核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド
単位に相補的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメ
ントと、を含有する。

β−ラクタマーゼＴＥＭ−１遺伝子を有するＬ　ｕｎｏ
ｒｒｈｏｅａｅ科の７．３　ｋｂプラスミドまたは該遺
伝子のサンドイッチハイブリダイゼーション分析法にお
ける捕捉プローブとして有用な本発明の合成オリゴヌク
レオチドは、（ａ）該プラスミドまたは該遺伝子のセグ
メントに相補的なヌクレオチド配列を有する第１のセグ
メントと、Φ）固相に結合したオリゴヌクレオチドに相
補的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメントと、
を含有する。

テトラサイクリン耐性生物におけるｔｅ　ｔＭ遺伝子の
サンドイッチハイブリダイゼーション分析法における捕
捉プローブとして有用な本発明の合成オリゴヌクレオチ
ドは、（ａ）該ｔｅ　ｔＭ遺伝子のセグメントに相補的
なヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、（ｂ
）固相に結合したオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌ
クレオチド配列を有する第２のセグメントと、を含有す
る。

テトラサイクリン耐性生物におけるｔｅｔＭ遺伝子のサ
ンドイッチハイブリダイゼーション分析法における増幅
プローブとして有用な本発明の合成オリゴヌクレオチド
は、（ａ）該ｔｅ　ＬＭ遺伝子のセグメントに相補的な
ヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、（ｂ）
核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌ
クレオチド配列を有する第２のセグメントと、を含有す
る。

助力り対ロエ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのサンドイッチ
ハイブリダイゼーション分析法における増幅プローブと
して有用な本発明の合成オリゴヌクレオチドでは、（ａ
）該舅１μす垂ｂ−ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのｐＣ肛２
プラスミドのセグメントに相補的なヌクレオチド配列を
有する第１のセグメントと、（ｂ）核酸マルチマーのオ
リゴヌクレオチド単位に相補的なヌクレオチド配列を有
する第２のセグメントと、を含有する。

助１埼がｊエ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのサンドイッチ
ハイブリダイゼーション分析法における捕捉プローブと
して有用な本発明の合成オリゴヌクレオチドは。

（ａ）該勇１μす貞ワ−ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのｐＣ
）ｌＬ２プラスミドのセグメントに相補的なヌクレオチ
ド配列を有する第１のセグメントと、（ｂ）固相に結合
したオリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を
有する第２のセグメントと、を含有する合成ヌクレオチ
ド。

Ｎ、　　５４通匹工肋旦胡−のＤＮＡを検出するための
本発明のＤＮＡプローブは、第１３図に示される該Ｎ、
　　Ｂ３ｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムクローンのいずれ
かの鎖の全体または一部に相補的なヌクレオチド配列を
有する。　ＤＮＡプローブ。

分析物中におけるＮ、　　数朋μ伽狙ａｅのピリンＤＮ
Ａを検出するための本発明の溶液サンドインチＤＮＡハ
イブリダイゼーション分析法は、以下の工程を包含する
：（ａ）該分析物を、ハイブリダイゼーション条件下で
、　　（ｉ　）　Ｎ、　　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのビリ
ンＤＮＡのセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有
する第１のセグメントと、核酸マルチマーのオリゴヌク
レオチド単位に相補的なヌクレオチド配列を有する第２
のセグメントとを含有する増幅プローブオリゴヌクレオ
チド、および（ｉｉ）Ｎ、　　■餞ｒｒｈｏｅａｅのピ
リン口Ｎ＾のセグメントに相補的なヌクレオチド配列を
有する第１のセグメントと、固相に結合したオリゴヌク
レオチドに相補的なヌクレオチド配列を有する第２のセ
グメントとを含有する捕捉プローブオリゴヌクレオチド
の過剰量と接触させる工程；（ｂ）ハイブリダイゼーシ
ョン条件下で、工程（ａ）の産物を、該固相に結合した
該オリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｃ）その後
、該固相に結合しない物質を分離する工程；（ｄ）ハイ
ブリダイゼーション条件下で、工程（ｃ）の固相複合体
産物を、（ｉ）該増幅プローブオリゴヌクレオチドの該
第２のセグメントに相補的な少なくとも１つのオリゴヌ
クレオチド単位、および（ｉｉ）標識されたオリゴヌク
レオチドに相補的な多数の第２のオリゴヌクレオチド単
位を含有する該核酸マルチマーと接触させる工程；（ｅ
）結合していないマルチマーを除去する工程；（ｆ）ハ
イブリダイゼーション条件下で、工程（ｅ）の固相複合
体産物を、該標識されたオリゴヌクレオチドと接触させ
る工程；（６）結合していない標識されたオリゴヌクレ
オチドを除去する工程；および（ハ）工程（６）の固相
複合体産物中における標識の存在を検出する工程。

分析物中におけるＮ、　　Ｂμｚｒｒｈｏｅ封のピリン
ＤＮＡを検出するための本発明の溶液サンドイッチＤＮ
Ａハイブリダイゼーション分析法は、以下の工程を包含
する：（ａ）該分析物を、ハイブリダイゼーション条件
下で、（ｉ）第１３図に示されるＮ、　　討匹■ｈｏｅ
ａｅのゲノムクローンのセグメントに相補的なヌクレオ
チド配列を有する第１のセグメントと。

核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌ
クレオチド配列を有する第２のセグメントとを含有する
増幅プローブオリゴヌクレオチド。

および（ｉｉ　）第１３図に示されるＮ、　　ｏｎｏｒ
ｒｈｏｅａｅのゲノムクローンのセグメントに相補的な
ヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、固相に
結合したオリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配
列を有する第２のセグメントとを含有する捕捉プローブ
オリゴヌクレオチドの過剰量と接触させる工程；（ｂ）
ハイブリダイゼーション条件下で。

工程（ａ）の産物を、該固相に結合した該オリゴヌクレ
オチドと接触させる工程；（ｃ）その後、該固相に結合
しない物質を分離する工程；（ｄ）ハイブリダイゼーシ
ョン条件下で、工程（ｃ）の固相複合体産物を。

（ｉ）該増幅プローブオリゴヌクレオチドの該第２のセ
グメントに相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチ
ド単位、および（ｉｉ　）標識されたオリゴヌクレオチ
ドに相補的な多数の第２のオリゴヌクレオチド単位を含
有する該核酸マルチマーと接触させる工程；（ｅ）結合
していないマルチマーを除去する工程；（ｆ）ハイブリ
ダイゼーション条件下で、工程（ｅ）の固相複合体産物
を、該標識されたオリゴヌクレオチドと接触させる工程
；（ｂ）結合していない標識されたオリゴヌクレオチド
を除去する工程；および（ハ）工程（９）の固相複合体
産物中における標識の存在を検出する工程。

分析物中におけるβ−ラクタマーゼＴｌｌ！Ｍ−１遺伝
子を有するＬ　］狙狸工崩旦リす科の７．３ｋｂプラス
ミドまたは該遺伝子を検出するための本発明の溶液サン
ドイッチＤＮＡハイブリダイゼーション分析法は、以下
の工程を包含する＝（ａ）該分析物を、ハイブリダイゼ
ーション条件下で、（ｉ）該プラスミドまたは該遺伝子
のセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する第１
のセグメントと、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド
単位に相補的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメ
ントとを含有する増幅プローブオリゴヌクレオチド、お
よび（ｉｉ）該プラスミドまたは該遺伝子の別のセグメ
ントに相補的なヌクレオチド配列を有する第１のセグメ
ントと、固相に結合したオリゴヌクレオチドに相補的な
ヌクレオチド配列を有する第２のセグメントとを含有す
る捕捉プローブオリゴヌクレオチドの過剰量と接触させ
る工程；（ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程
（ａ）の産物を、該固相に結合した該オリゴヌクレオチ
ドと接触させる工程；（ｃ）その後、該固相に結合しな
い物質を分離する工程；（ｄ）ハイブリダイゼーション
条件下で、工程（ｃ）の固相複合体産物を、（ｉ）該増
幅プローブオリゴヌクレオチドの該第２のセグメントに
相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位。

および（ｉｉ）標識されたオリゴヌクレオチドに相補的
な多数の第２のオリゴヌクレオチド単位を含有する該核
酸マルチマーと接触させる工程；（ｅ）結合していない
マルチマーを除去する工程；（ｆ）ハイブリダイゼーシ
ョン条件下で、工程（ｅ）の固相複合体産物を、該□標
識されたオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（２）
結合していない標識されたオリゴヌクレオチドを除去す
る工程；および（ｂ）工程（２）の固相複合体産物中に
おける標識の存在を検出する工程。

分析物中におけるＢ型肝炎ウィルス（ＩＩＢＶ）のＤＮ
Ａを検出するための本発明溶液サンドインチＤＮＡハイ
ブリダイイーシッフ分析法は、以下の工程を包含する：
（ａ）該分析物を、ハイブリダイゼーション条件下で、
（１）該ＨＢＶゲノムの保存領域のセグメントに相補的
なヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、核酸
マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌクレ
オチド配列を有する第２のセグメントとを含有する増幅
プローブオリゴヌクレオチド、および（ｉｉ　）　ＪＩ
ＩＢＶゲノムの保存領域の別のセグメントに相補的なヌ
クレオチド配列を有する第１のセグメントと、固相に結
合したオリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列
を有する第２のセグメントとを含有する捕捉プローブオ
リゴヌクレオチドの過剰量と接触させる工程；（ｂ）ハ
イブリダイゼーション条件下で、工程（ａ）の産物を、
該固相に結合した該オリゴヌクレオチドと接触させる工
程；（ｃ）その後、該固相に結合しない物質を分離する
工程；（ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（
ｃ）の固相複合体産物を、（該増幅プローブオリゴヌク
レオチドの該第２のセグメントに相補的な少なくとも１
つのオリゴヌクレオチド単位、および（ｉｉ）標識され
たオリゴヌクレオチドに相補的な多数の第２のオリゴヌ
クレオチド単位を含有する該核酸マルチマーと接触させ
る工程；（ｅ）結合していないマルチマーを除去する工
程；（ｆ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｅ
）の固相複合体産物を、該標識されたオリゴヌクレオチ
ドと接触させる工程；（２）結合していないｉ） 標識されたオリゴヌクレオチドを除去する工程；および
（ハ）工程（２）の固相複合体産物中における標識の存
在を検出する工程。

分析物中におけるハ圏肛虹虹　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ
のＤＮＡを検出するための本発明溶液サンドインチＤＮ
Ａハイブリダイイーシッフ分析法は、以下の工程を包含
する：　（ａ）該分析物を、ハイブリダイゼーション条
件下で、　　（ｉ　）　以ｕｌす亘袖−ｔｒａｃｈｏｍ
ａｔｉｓのｐＣＨＬ２プラスミドのセグメントに相補的
なヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、核酸
マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌクレ
オチド配列を有する第２のセグメントとを含有する増幅
プローブオリゴヌクレオチド、および（ｉｉ　）　Ｃｈ
ｌａ−ａ＋　ｄ＋ａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのｐｃｌｌ
Ｌ２プラスミドの別のセグメントに相補的なヌクレオチ
ド配列を有する第１のセグメントと、固相に結合したオ
リゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含有す
る第２のセグメントとを有する捕捉プローブオリゴヌク
レオチドの過剰量と接触させる工程；（ｂ）ハイブリダ
イゼーション条件下で、工程（ａ）の産物を、該固相に
結合した該オリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｃ
）その後、該固相に結合しない物質を分離する工程；（
４ハイブリダイゼ一シヨン条件下で、工程（ｃ）の固相
複合体産物を、（ｉ）該増幅プローブオリゴヌクレオチ
ドの該第２のセグメントに相補的な少なくとも１つのオ
リゴヌクレオチド単位、および（ｉｉ）標識されたオリ
ゴヌクレオチドに相補的な多数の第２のオリゴヌクレオ
チド単位を含有する該核酸マルチマーと接触させる工程
；（ｅ）結合していないマルチマーを除去する工程；（
ｆ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｅ）の固
相複合体産物を、該標識されたオリゴヌクレオチドと接
触させる工程；（ｇ）結合していない標識されたオリゴ
ヌクレオチドを除去する工程；および（ｂ）工程（ｇ）
の固相複合体産物中における標識の存在を検出する工程
。

テトラサイクリン耐性生物のＤＮＡを含むと思われるｔ
ｅ　ｔＭ遺伝子ＤＮＡを検出するための本発明の溶液サ
ンドイッチ［）Ｎ＾ハイブリダイゼーション分析法は、
以下の工程を包含する＝（ａ）該分析物を、ハイブリダ
イゼーション条件下で、（ｉ）該ｔｅ　ｔＭ遺伝子のセ
グメントに相補的なヌクレオチド配列を有する第１のセ
グメントと、核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位
に相補的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメント
とを含有する増幅プローブオリゴヌクレオチド、および
（ｉｉ）該ｔｅ　ｔＭ遺伝子の別のセグメントに相補的
なヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、固相
に結合したオリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド
配列を有する第２のセグメントとを含有する捕捉プロー
ブオリゴヌクレオチドの過剰量と接触させる工程；（ｂ
）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ａ）の産物
を、該固相に結合した該オリゴヌクレオチドと接触させ
る工程；（ｃ）その後、該固相に結合しない物質を分離
する工程；（ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で、工
程（ｃ）の固相複合体産物を、（ｉ　）　該増幅プロー
ブオリゴヌクレオチドの該第２のセグメントに相補的な
少なくとも１つのオリゴヌクレオチド単位、および（ｉ
ｉ　）標識されたオリゴヌクレオチドに相補的な多数の
第２のオリゴヌクレオチド単位を含有する該核酸マルチ
マーと接触させる工程；（ｅ）結合していないマルチマ
ーを除去する工程；（ｆ）ハイブリダイゼーション条件
下で。

工程（ｅ）の固相複合体産物を、該標識されたオリゴヌ
クレオチドと接触させる工程；（２）結合していない標
識されたオリゴヌクレオチドを除去する工程；およびＱ
ｌ）工程（６）の固相複合体産物中における標識の存在
を検出する工程。

分析物中におけるＮ、　　（ｖμ工ｈｏ且リすのＤＮＡ
を検出するための本発明のＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン分析法は、該分析物を、ハイブリダイゼーション条件
下で、第１３図に示されるＮ、　　１狙μ工ｈｏ旦凹−
のゲノムクローンのいずれかの鎖の全体または一部に相
補的なりＮＡプローブと接触させる工程と。

該ＤＮＡプローブを含む二本鎖の存在を検出する工程と
、を包含する。

ＣＰＡ１″東白） ■　　　　る、−めの 本発明の核酸マルチマーは同一の一重鎖オリゴヌクレオ
チド単位または異なる一重鎖オリゴヌクレオチド単位の
繰り返しからなる直鎖状のまたは分状のポリマーである
。少なくとも該単位のうちの１つは、対象となる第１の
一重鎖ヌクレオチド配列、典型的には分析物または分析
物に結合Ｕ７たオリゴヌクレオチドに特異的に結合しう
るような配列、長さ、および組成を有する。そのような
特異性と安定性を得るために、この単位は９通常。

長さ１５〜３０ヌクレオチドであり、　ＧＣ含量は４０
〜６０χである。このような単位の他に、このマルチマ
ーは対象となる第２の一重鎖ヌクレオチド、典型的には
標識されたオリゴヌクレオチドまたは他のマルチマーと
特異的かつ安定にハイブリダイゼーションしうる１種々
の単位を含む、これらの単位も通常長さ１５〜３０ヌク
レオチドであり、　ＧＣＣ含量４０〜６０χである。あ
るマルチマーを他のマルチマーとハイブリダイゼーショ
ンさせることを意図する時、第１および第２のオリゴヌ
クレオチド単位は、異種のものである。（異なるもので
ある）。

マルチマー中のオリゴヌクレオチド単位の合計数は、一
般的に３〜５０であり、さらに一般的に１０〜２０であ
る。

対象となるヌクレオチド配列にハイブリダイゼーション
する単位が標識したオリゴヌクレオチドにハイブリダイ
ゼーションする単位とは異なるマルチマー中で、後者の
単位の前者の単位に対する比は一般的に２：１ないし３
０：１．さらに一般的には５：１ないし２０：１であっ
て、好ましくは１０：１ないし１５：１である。

マルチマーのオリゴヌクレオチド単位は、　ＲＮＡ。

ｒｌＮＡ修飾された核酸またはそれらの組合せより構築
されうるちのである。

マルチマーのオリゴヌクレオチド単位は、ホスホジエス
テル結合を通してまたは、核酸、アミノ酸、炭化水素ま
たはポリオール架橋等の挿入剤を通して、または核酸あ
るいは修飾した核酸鎖を架橋することのできる他の架橋
剤を通して、相互に直接共有的に結合しうる。結合の部
位は単位の末端（通常の３°−５′方向でまたはランダ
ムな方向で）および／または１つ以上の鎖中の内部ヌク
レオチドである。直鎖状のマルチマー中で８個々の単位
は、末端どうしで連結し、直鎖状のポリマーを形成して
いる。分肢マルチマーの一形態では３つ以上のオリゴヌ
クレオチド単位が起点から広がり２分肢構造を形成して
いる。起点は、少なくとも３つの単位が共有的に結合し
うる。他のオリゴヌクレオチド単位または多機能分子で
ありうる。

他の形態では、１個以上のペンダントオリゴヌクレオチ
ド単位を有するオリゴヌクレオチド単位の骨格がある。

これらの後者の形態のマルチマーは構造的に「フォーク
状」または「＜シ状」またはフす−クとくしの両方を組
み合わせたような形状である。ペンダント単位は通常、
オリゴヌクレオチドが複合化するかまたは結合しうる適
当な官能基をもつ修飾された核酸または他の有機部分に
通常由来する。マルチマーは、全体的に直鎖状か。

全体的に分肢しているかまたは直鎖状部分と分肢した部
分の組み合わせでありうる。好ましくは。

マルチマーの中には少なくとも２つの分肢点があり、さ
らに好ましくは、少なくとも３つ、好ましくは５〜１０
個ある。マルチマーは、１つ以上の二本鎖配列の断片を
含みうる。

ヱ及±ヱニ立会底 マルチマーは、　（もし直鎖状ならば）クローニングま
たは酵素的構築、または化学的な架橋法。

または直接的な化学合成または、それらの組み合わせに
よって、調製しうる。クローニングによって調製した直
鎖状のマルチマーの場合、完全なマルチマーまたは、そ
の断片をコードＵ７ている核酸配列は、従来のクローニ
ングの手法により、−末鎖または二本鎖の形状につ（ら
れうる。二本鎖の形状につくられた時は、マルチマー／
断片は結局変性され・て、−末鎖マルチマー／断片を提
供する。

マルチマーは１Ｍ１３のような従来の一本鎖ファージベ
クター有用いて一本鎖の形状でクローン化されうる。断
片は、酵素的にまたは化学的に連結されてマルチマーを
形成しうる。酵素的に構築された時１個々の単位は場合
によって、　Ｔ４　ＤＮＡｔたはＲＮＡ　リガーゼのよ
うな連結酵素で連結される。化学的な架橋により、調製
されたとき個々の単位は。

連結部位を提供する官能基を持つように誘導されるか、
またはオリゴヌクレオチドを合成した後に連結部位を提
供するように誘導された。１個以上の核酸有用いて合成
しうる。科学的架橋の好ましい手法は、ここでは文献に
よって援用される１９８６年１２月２３０に出願された
９本出願人により係属出願中の米国特許出願第９４５．
８７６号に記載されているようにＮ４のところを修飾し
７たシトシン塩基をヌクレオチドに組み込むことである
。

直接的な化学合成で調製された時は、誘導された核酸、
または官能基が封鎖されている同等の多機能分子を含む
オリゴヌクレオチドは、従来のオリゴヌクレオチド合成
法により１作られる。官能基の封鎖を外１．て、オリゴ
ヌクレオチド単位を。

保護をはずした部位より合成する。

マルチマーの分肢点を作り出すのに用いられる分子の遺
伝子構造は以下のとおりである。

ここでＰは有機部分、好ましくは核酸であり　Ｒ１は固
相より合成核酸を除去せず、かつ環外窒素またはリン酸
保護基をとり除かない状況下で除去されうる水酸基の保
護基であり、Ｘは、保護されたホスホラミダイトまたは
ホスホネイトまたはリン酸基のような、核酸合成を容易
にする含リン基であり、Ｖはアミノ、水酸、スルヒドリ
ルまたは保護されたリン酸のような求核基由来の基であ
り。

ＲｔはＲ１または「に影響を与えることなく除去され。

水素と置換されうる封鎖基または保護基である。

２つに分岐し７たまたは“フォーク状′°の分肢を作り
出すために用いられる分子中では　Ｒ”とＲ２は同じも
のであるが、他方“くし状”の分肢を作りだすのに用い
られる分子中ではＨ２は　Ｒ１の除保護化試薬の存在下
で安定な封鎖基である。第３図では。

“くし状”の分肢または“フォーク状°°の分肢または
それらの組み合わせを有するマルチマーを合成するのに
用いられる手法を図式的に説明するものである。

第３図の部分Ａは、自動ホスホアミダイト法（Ｗａｒｎ
ｅｒら」旦（１９８４）３　：４（ｈ）のような直鎖状
オヌクレオチドを調製するための、従来のオリゴヌクレ
オチド合成法を図示するものである。黒のブロックは面
支持体を表し７ており、Ｎは適当な保護基を有する従来
のヌクレオチド誘導体である。ヌクレオチドおよびＰ−
Ｎ−ｏＲｌ　（Ｒ’は下記Ｐ、と同等である）を表して
いる。

部分Ｒは、＜シ状のマルチマーを作るための手法を示し
ている。下記化合物 Ｐ−Ｎ−ＯＲ。

Ｒ。

所望の大きさと配列のオリゴマー単位は１合成され支持
体上に残される。

１つ以上のＮ４を修飾したシトシン塩基は、その際上記
の自動化手法によって鎖中へ組み込まれる。

好まり、　＜は修飾された塩基は以下の構造式を存する
。

は、以下の式（２）の修飾された塩基を表している。

ここで、Ｚは−０−１と−ＮＨ−，と−Ｓ−、と、ｐｏ
、＝と。

−ＱＣ−０−，のような求核試薬であり　Ｒ１は一般に
塩基安定性かつ酸感受性のジメトキシトリチル（ｎＭＴ
）またはピキシルのような封鎖基または保護基であり　
ｐｔは５水素またはメチルで　Ｒ３はのようなＲ１に影
響を与えることなく除去され水素と置換されうる封鎖基
または保護基であり　Ｒ５は。

化学合成（例えば、ホスホジエステル、ホスホトリエス
テル等）の間オリゴヌクレオチド鎖の５′の位置に核酸
を付加しうるホスホラミダイトまたは他のリン誘導体で
あり　Ｒ６はメチルか水素、■。

ＲｒｇたはＦであり、Ｘは、１〜８の整数である。

１個以上の修飾された塩基が組みこまれると、好まり、
　＜は鎖中で中間塩基が間に置かれ、最も好ましくは、
　−ＴＴ−ダイマーが間に置かれる。添加しまたオリゴ
ヌクレオチド単位は骨格に組み込すれ。

その後添加した修飾された塩基等も骨格に組み込まれる
。

Ｎ４−求核基は、その後脱保護化され（Ｒ３が除去され
る）添加したオリゴヌクレオチド単位は。

そこから自動化手法によりつくられる。鎖の末端の残っ
たＲ１基を除去し９分肢した「＜シ状」のマルチマーは
支持体より開裂される。

第３図のＣ部分は、“フォーク状゛′のマルチマーを作
るための一喰的な手法を図示するものであＣＨ３０−Ｃ
）ｔ２−ＣＨ２−０−ＣＨ２−。

る。所望の大きさと配列のオリゴマー単位を、再度従来
技術により合成して、支持体上に残す。封鎖したホスホ
アミダイトのような、封鎖した二作用を有する含リン官
能基（ｃ部分ではｘｐと表す）次いで自動化手法で鎖中
組みこむ、好ましい二作用を有する含リン官能基は次の
封鎖したホスホアミダイトである。

ここでＲは上記水酸保護基、　ｉＰｒはイソプロピル。

Ｒ１はメチルまたはベーターシアノエチルである。

最も好市しいＰはｌ）Ｍ↑で「はベーターシアノエチル
である。

また、　Ｒ１＝Ｒ２（例えばｒｌＭＴ　）　テあるＮ４
が修飾されたシトシン塩基有用いうる。

次いで２つの保護基を除去し７．添加したオリゴヌクレ
オチド単位がその部分より、自動化手法により作り出さ
れる。残ったＲ１基を除去し７．２またに分かれたマル
チマーを支持体より開裂する。

ｎ部分と６部分は２つ以上に分肢したマルチマーまたは
「クシ状」のマルチマーはそれらの組み合わせが、酵素
的または化学的にスプライシングＬ７て作られる手法を
図示している。一般に２また状および／または「＜シ状
」のマルチマーは上記のように調製され支持体から除去
される。次いで。

上記の酵素的すたは化学的な、結合手法有用いて。

溶液中で結合する。

Ｆ部分は、複合「＜シ状」マルチマーを合成するための
手法を示している。この手法は、８部分で示した手法の
改変であり、独立した側鎖中への修飾された塩基の組み
込みとそこから２次オリゴヌクレオチド側鎖をつくり出
すことを包含している。

マルチマーの構造を分析するために、また所定の断片（
標識されたオリゴヌクレオチドに結合し７ているマルチ
マーの部分のような）を放出するための手段として、適
当な開裂しうるリンカ−分子を所定の部位でマルチマー
に組み込むことができる。マルチマーの合成および精製
に続いて、マルチマーのヌクレオチド構造の付加的な分
解がない状態でこれらのリンカ−を特異的に開裂するこ
とができる。リンカ−分子の好まし、い形態は、標準ホ
スホアミダイト化学的プロトコルによってリンカ−がい
かなるＤＮＡ断片にも組み込まれるよう。

１．２−ジオール基（過ヨウ素酸で選択的に切断されう
る）および保護された水酸基または、ホスホアミダイト
誘導体の水酸基（過ヨウ素酸で選択的に切断しうる）１
．２−ジオール基を含むようにされた。このようなリン
カ−の好ましい実施態様は以下に示す化合物である。

ここにおいてｎＭＴおよびｉＰｒは先に定義した通りで
ある。ＤＮＡ断片への取こみ、および完全な脱保護化後
は、リンカ−を含む断片は以下に示すような構造をもつ
。

（以下余白） ここにおいてｒｌＮＡ　ＩおよびＤＮＡｔは、同一かま
たは異なっているＤＮＡの副断片を表している。この断
片と過ヨウ素酸ナトリウムとの反応により断片は開裂さ
れ、以下に示す断片となる。

（以下余白） あるいは、１．２−ジオール基は、ヒドロキシルアミン
感受性結合または塩基感受性スルホン結合、またはチオ
ール感受性のジスフィト結合を含むリンカ−基と置換さ
れうる。このようなリンカ−基は、他の物にタンパク質
を結合させるのに用いられる。従来の交差連結試薬由来
のものでありうる。同様にｆ）Ｍ↑基以外保護基も使用
しうる。

（以下余白） ハイ　暑　イゼーシ　ン 核酸パイプリダイゼーション分析において１本発明のマ
ルチマーは１分析物である核酸または。

該分析物に結合する一本鎖オリゴヌクレオチドに結合す
る。このマルチマーは、標識したオリゴヌクレオチドと
結合させるために利用し得る比較的多量のオリゴヌクレ
オチド単位を含有するので。

従来の方法に比較するとより多くの標識を有するより多
くの基が、その分析物に結合し得る。標識した基の多く
は１分析物を検出し得る闇値が減少し、ある場合におい
ては、サブアトモル（１０−”モル）のレベルにまで減
少する。

マルチマーは、既知の核酸ハイブリダイゼーションの型
のどのようなものにでも実質的に使用され得る。例えば
１分析物が固相に直接的に結合する方法、または、サン
ドイッチハイブリダイゼーション法（分析物がオリゴヌ
クレオチドに結合し。

次に、それが固相に結合する）が用いられ得る。

特に、　１９８５年１２月１１日に出願された係属中の
特許出願筒８０７．６２４号に開示された溶液相のザン
ドイッチハイブリダイゼーシせン分析法が有用である。

溶液相サンドイッチハイブリダイゼーション法析におけ
る捕捉工程では、増感方法が次のように用いられる０分
析物である一本鎖核酸を、過剰の１本鎖核酸プローブ２
種（またはプローブのセット）有用いたハイブリダイゼ
ーション条件下でインキ１ベートする。そのプローブは
、（１）分析物に相補的な第１の結合配列、および固相
に結合する１本鎖オリゴヌクレオチドに相補的である第
２の結合配列を持つ捕捉プローブ、および（２）分析物
に相補的である第１の結合配列、および増幅マルチマー
のオリゴヌクレオチド単位に相補的である第２の結合配
列を有する増幅プローブ、である。

増幅プローブを使うことにより、マルチマーは。

“普遍的な”試薬となるように設計され得、そして、異
なるマルチマーを各々の分析物に対して。

作成する必要がない、得られた生産物は、２つのプロー
ブの３成分の核酸複合体であり、その第１結合配列によ
り分析物にハイブリダイズする。

プローブの第２の結合配列は、それらが分析物に相補的
でないため、１本鎖テールのままである。

各種の、複数のプローブが用いられ得る。

次に、この複合体を１本鎖オリゴヌクレオチドが結合し
た固相ヘハイブリダイゼーション条件下で加える。この
１本鎖オリゴヌクレオチドは、捕捉プローブの第２の結
合配列に相補的である。得られた生成物は、固相に結合
したオリゴヌクレオチドと捕獲プローブの第２の結合配
列とによって形成される。２本鎖を介して固相に結合し
た複合体を含有する。次に、複合体が結合した固相を、
結合していない物質から分離する。

マルチマーを、その複合体の増幅プローブの利用し得る
第２の結合配列にマルチマーがハイブリダイズできるよ
うなハイブリダイゼーション条件下で、固相−分析物−
プローブ複合体に加える。

次に、得られた固相混合物を、未結合のマルチマーから
洗浄によって分離する。次に、標識されたオリゴヌクレ
オチドを、そのマルチマーの相補的なオリゴヌクレオチ
ド単位にそれがハイブリダイズできるような条件下で加
える。次に、得られた固相標識核酸複合体を、洗浄して
未結合の標識したオリゴヌクレオチドを除去し、それに
よって過剰の標識オリゴヌクレオチドから分離し７．測
定する。

分析において、１種を越えるマルチマーを使用すること
により、増幅度を高くすることができる。

そのような場合には、第１のマルチマーを増幅プローブ
および第２のマルチマーに結合するよう設計し、そＬ７
て第２のマルチマーを第１のマルチマーおよび標識オリ
ゴヌクレオチドに結合するように設計する。どのような
数のマルチマーも、このような方法によって直列に結合
し、さらに大きな増幅が達成され得る。

分析物である核酸は１種々の起源由来であり得る０例え
ば生物由来の流体または固体８食物、環境物質などであ
り得、そして種々の手段（例えば。

プロティナーゼに／５ｒ）Ｓ、カオトロピック塩など）
によってハイブリダイゼーション分析のために下準備さ
れる。さらに１分析物である核酸の平均的なサイズを、
酵素的、物理的または化学的手段（例えば、制限酵素、
音波破砕、化学分解（例えば金属イオンを使用する）な
ど）によって減少させることは有利であり得る。断片は
、　０．ｌｋｈ程度に小さくあり得１通常、少なくとも
約０．５ｋｈ、そして。

ｌｋｈまたはそれ以上であり得る。分析物は８分析に供
するため一本鎖の形で供給される。配列が天然に一本鎖
の形で存在する場合には、変性を必要としない、しかし
、配列が、２本鎖の形で存在する場合には、その配列を
変性する。変性は、アルカリ、一般的に約０．０５から
０．２Ｍの水酸化物、ホルムアミド、塩、熱またはそれ
らの組合せのような種々の手法により行われ得る。

分析物の配列に相補的な捕捉プローブおよび増幅プロー
ブの第１の結合配列は、それぞれ、少なくとも１５ヌク
レオチド（ｎｔ）、通常、少なくとも２５ＩＬＬであり
、そして約５ｋｂを越えず１通常、約１ｋｈを越えず、
好ましくは約１００ｕｔを越えない。それらは、典型的
には約３０ｕｔである。それらは９通常。

分析物の異なった配列に結合するように選択される。第
１の結合配列は１種々の状況を考慮して選択され得る。

その分析物の性質に依存して、共通配列、多型性、特別
な表現型または遺伝型、特別な株などに関係する配列に
興味がもたれ得る。

増幅物と捕捉プローブの第一結合配列の適当な選抜によ
って、それらは、特定の遺伝子または異なった核酸分子
の部分として存在する他の配列を包含する特定の核酸分
子を同定し得る。ある配列を含む他の分子から目的とす
る核酸分子を識別するために、プローブの１つを与えら
れた配列と相補的に作成する一方、他のプローブを、そ
の分子の別の配列に相補的であるように作成する。ここ
で、他の配列はその分子に独特である　（つまり。

その与えられた配列を含む他の分子中には存在し７ない
）。このような手法は、後述の実施例中に記載されてい
るＴＭＴ−ＩＮＨ分析により例示されている。

捕捉プローブと増幅プローブの第２結合配列とを、固相
に結合したオリゴヌクレオチドとマルチマーのオリゴヌ
クレオチド単位とをそれぞれに相補的であるように選択
Ｌ／、そして試料／分析物中の内因性の配列と対抗しな
いように選択する。第２結合配列は、第１の結合配列に
隣接することがあり、あるいは中間の非相補的配列によ
りそこから間隔を置くこともあり得る。プローブは、必
要に応じて他の非相補的な配列を含有し得る。これらの
非相補的配列により結合配列の結合を妨げたり、あるい
は、非特異的結合を起こしてはならない。

捕捉プローブおよび増幅プローブはオリゴヌクレオチド
合成法才たはクローニングにより、好ましくは前者によ
って調製され得る。

結合配列は、ホモ−重鎖を供給する完全な相補性を有す
る必要がないことが理解される。多くの場合において、
ヘテロ−重鎖は、約ｌＯχより少ない塩基が適合しない
ような場合に、５またはそれ以上のヌクレオチドの環状
構造を無視すれば、十分である。従って、ここにおいて
使用される“相補的な”という用語は、安定な二重鎖構
造を供給するのに充分な相補性の程度を意味する。

分析に使用される固相は、微粒子状またはあらゆる種々
の容器の固体壁表面であり得る。例えば。

遠心分離管、カラム、マイクロタイタープレトのウェル
、濾紙、チ１−ブなとであり得る０粒子が使用される場
合には、それらは、好ましくは、約０．４から２００ミ
クロン、通常、約０．８から４．０ミクロンの範囲のサ
イズである。その粒子はラテックスまたはガラスのよう
な都合のよい材料のいずれであってもよい。マイクロタ
イタープレートは好適な固体表面である。捕捉プローブ
の第２結合配列に相補性のあるオリゴヌクレオチドは、
既存の手法により官能基を介して固相表面に安定に結合
され得る。

捕捉プローブの第２の結合配列および固相に結合したオ
リゴヌクレオチドは、適当なりガンドリセブターの対に
置き換えられ得ることが理解される。上記リガンドリセ
プターの対は、捕捉プローブの第１の結合配列に結合し
て、固相と安定な結合を形成する。そのような対の例と
しては、ビオチン／アビジン、チロキシン／チロキシン
結合グロブリン、抗原／抗体、炭水化物／レクチンなど
がある。

その標識されたオリゴヌクレオチドは、マルチマーの第
２のオリゴヌクレオチド単位に相補的な配列を有する。

その標識されたオリゴヌクレオチドは、ｌまたはそれ以
上の分子（標識）を含み。

その標識は、直接的にもしくは間接的に検出し得るシグ
ナルを与える。その標識は相補配列の個々の構成単位に
結合され得、あるいは複数の標識を存する終結構成単位
として、または終結尾部として存在し得る。その配列に
結合する標識を与えるための様々な方法が文献で報告さ
れている。例えば１次の文献を参照されたい：　１．Ｂ
ａｒｙらＰｒｏｃ　ＮａｔｌＡｃｏｄ　Ｓｃｉ　１１Ｓ
Ａ（１９８３）８０：４０４５；　ＲｅｎｚおよびＫｕ
ｒｚ＋Ｎｕｃｌ　Ａｒ、１ｄｓＲｅｓ　（１９８４）　
１２：３４３５；旧ｃｈａｒｒｌｓｏｎおよびＧｕｎｐ
ｏｒｔ、　　Ｎｕｃｌ　Ａｒ、ｉｄｓ　Ｒｅｓ　（１９
８３）　１１：６１６７；Ｓｍ１ｔｈ　ら、　Ｎｕｃｌ
　＾ｃ、ｊｄｓ　Ｒｅ５（１９８５）１３：２３９９；
　ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ、　Ａｎａｌ旧ｏｃ
ｈｅｍ（１９８４）　１３８：２６７゜その標識は、共
有結合的に、あるいは非共有結合的にその相補配列に結
合され得る。使用され得る標識は、放射性核種、蛍光剤
、化学発光剤、染色剤。

酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、酵素サブユ
ニット金属イオンなどを包含する。特殊な標識の例とし
ては、フルオレセイン、ローダミン、テキサス　レッド
、フィコエリスリン、ウンベリフェロン、ルミノール、
　ＮＡｎＰＨ、α−β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビ
のペルオキシダーゼなどが包含される。

標識されたオリゴヌクレオチドは２本出願人による係属
中の特許出願第９４５．８７６号に記載されているよう
な、化学合成によって都合よく調製され得る。都合のよ
い官能基を有する終結基を与えることによって、様々な
標識がその官能基を介して結合され得る。従って、その
配列との二重鎖形成に有害な影響を与えないように、様
々な標識が結合され得、カルボキシ、チオール、アミン
、ヒドラゾン、もしくは他の官能基を与えることができ
る。すでに指摘されたように、その標識配列に相補的な
配列に結合した複数の標識を有する分子を使用すること
ができる。あるいは、その標識配列に結合したりガント
を使用し、そして、標識された分析物複合体を与えるべ
く、リガンドに結合するために標識された受容体を使用
し得る。

分析物の予期されたモル数に対する捕捉プローブおよび
増幅プローブの比率は、各々、少なくとも化学量論的な
量であり、そして好ましくは過剰！である。この比は、
好ましくは、少なくとも約１．５：　１であり、より好
ましくは、少なくとも２：１である。通常、２：１から
１０，０００：　１の範囲である。それぞれのプローブ
の濃度は、一般的に。

約１０−９から１０−”Ｈの範囲であり、核酸試料濃度
は。

１０−”から１０−　’　”Ｍで様々である。その分析
のハイブリダイゼーシヨンの工程は一般に、約１０分間
から２時間の間に起こり、しばしば約１時間で完了する
。ハイブリダイゼーシヨンは、ゆるやかな上昇した温度
で行われ、一般には、約２０°Ｃから８０℃の範囲内で
あり、さらに通常は、約３５°Ｃから７０″Ｃであり、
特に６５°Ｃで行われ得る。

ハイブリダイゼーション反応は１通常、水性溶液中で、
特に緩衝作用のある水性溶液中で行われ。

その水性溶液は様々な添加剤を含有し得る。使用され得
る添加剤としては、低濃度の洗浄剤（０，１から１％ま
で）、塩（例えば、クエン酸ナトリウム；０．０１７か
ら０．１７０Ｍまで）、フィコール、ポリビニルピロリ
ジン、キャリヤ核酸、キャリヤタンパクなどがある。非
水溶性溶媒が、上記水性溶液に加えられ得、それには、
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコ
ールおよびホルムアミドがある。これらの他の溶媒は、
２から５０％の範囲の量で存在する。

ハイブリダイゼーション溶液の厳しさ（ストリンジエン
シー）は、温度、塩濃度、溶媒系などによって制御され
得る。従って、目的とする配列の長さおよび性質に依存
して、その厳しさは変化する。

その分析の分離の工程で用いられる方法は、固相の性質
・に依存して変化する０粒子である場合には、遠心分離
または濾過によりその粒子が分離され、上澄液を捨てる
かまたは上澄液が単離される。

その粒子が分析される場合には、その粒子は完全に洗浄
される０通常は、１回から５回、適当な緩衝媒質（例え
ば、　ｓｎｓのような洗浄剤を含むＰＲ３）が用いられ
る。その分離手段が壁もしくは支持体であるときには、
その上澄液は単離されるか捨てられ、そして、その壁は
粒子の場合に指示された同様の方法で、洗浄される。

その標識の性質に依存して、その標識の存在の検出には
様々な手法が用いられ得る。蛍光剤については、多数の
様々なフルオロメーターが利用され得る。化学発光剤に
ついては、ルミノメータ−あるいはフィルムが利用され
得る。酵素有用いることにより、蛍光性の９発光性の、
あるいは着色した生産物が得られ得、それらは、蛍光定
量的に。

発光定量的に１分光光度的にあるいは、視覚的に測定さ
れ得る。免疫分析に用いられてきた様々な標識と免疫分
析に適用できる技術が９本分析法で使用され得る。

「ドツト・プロット」分析のように、核酸分析物が直接
固相に結合されるハイブリダイゼーション分析では、そ
のマルチマーは結合分析物に直接ハイブリダイズされる
。これらの例では、そのマルチマーの第１のオリゴヌク
レオチド単位が分析物の配列に相補性があり、第２のオ
リゴヌクレオチド単位は標識さたオリゴヌクレオチドに
相補性がある。結合していないマルチマーは固相から除
去され、そして１次に、標識されたオリゴヌクレオチド
は結合した分析物−マルチマー複合体にハイブリダイズ
される。過剰に標識されたオリゴヌクレオチドは除去さ
れ、標識された結合複合体が測定される。

そのマルチマーは、直接１間接およびサンドイッチ免疫
分析法のような他の分析法でも使用され得る。これらの
場合には、標識された抗体の役割を果たす試薬、または
直接的あるいは間接的に分析物に結合した他のリガンド
は、マルチマーの第１のオリゴヌクレオチドに相補性が
あり標識よりもむしろそれに結合するオリゴヌクレオチ
ドを有する。例えば、抗原分析物についてサンドインチ
免疫分析法を行なう場合には、その分析物試料は。

抗原に対する第１の抗体が結合される固相とともにイン
キュベートされる。結合していない試料は固相から除去
されその抗原に対する第２の抗体くそのマルチマーの単
位に相補性のあるオリゴヌクレオチドが結合する）は、
結合複合体と反応し。

３つの成分によって構成される複合体が形成される。過
剰の第２の抗体を除去した後、そのマルチマーは、第２
の抗体に結合したオリゴヌクレオチドを介して、その複
合体にハイブリダイズされる。

過剰なマルチマーは除去され、標識されたオリゴヌクレ
オチドがそのマルチマーの他のオリゴヌクレオチド単位
にハイブリダイズされる。過剰の標識されたオリゴヌク
レオチドが除去された後、その複合体が測定される。

本発明の増幅された核酸のハイブリダイゼーション分析
法を行なうためのキットは２次の試薬を包装された組合
せの中に含む：マルチマー複合体に標識されたオリゴヌ
クレオチド；分析物に結合し得る固相；必要に応じて捕
捉プローブ（その分析方式が５分析物が中間体オリゴヌ
クレオチドまたは他のりガントを介して固相に結合され
る場合）；および増幅プローブ（その分析方式が、マル
チマーが直接２分析物にハイブリダイズしない場合）。

これらの試薬は、典型的には、キット中で別々の容器の
中に入っている。そのキットはまた。その分析物を変性
させるための変性試薬、ハイブリダイゼーシ岬ン緩衝液
、洗浄溶液、酵素基質、陰性および陽性のコントロール
、およびその分析を行なうための指示書を包含し得る。

本発明の次の実施例は２本発明を例示するためのもので
あり１本発明を限定するものではない。

（以下余白） （実施例） ■、　　　　マルチマーの 増幅プローブ（後述の３．Ｆ参照）に相補的な１８景体
の直鎖状マルチマーを、第１図に示すスキームに従って
調製した。

２種の１８量体である１、１．Ａ−１およびＬＬＡ−２
を、　Ｗａｒｎｅｒら、　ｒｌＮＡ（１９８４）　３　
：４ｏｔに記載された自動ホスホルアミダイト法有用い
て合成した。精製は、　５ａｎｃｈｅｚＰｅｓｃａｄｏ
ｒおよびｌ１ｒｄｅａ、　　ｒｌＮＡ（１９８４）　　
３　：３３９に従って行った。１．１．Ａ−２の５”末
端のリン酸化は９本出願による係属中のヨーロッパ特許
出願第８８３０７３５８．７の実施例１に記載された化
学的リン酸化法で行った。その文献はここに参考文献と
して編入されている。１，１．Ａ−１および１，１．＾
−２の塩基配列は次のとおりである。

５’　−ＣＧＴＧＴＣＡＧＧＣＡＴＡＧＧＡＣＣ１，１
，Ａ−ＩＴＣＣＧＴＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＧ−ｐ−
５’　　　１．１．Ａ−２直鎖状１，１．＾−２マルチ
マーは、　Ｔ４　ＤＮ＾リガーゼ有用いて調製した。そ
のような連結産物は二本鎖である。−本マルチマーは変
性条件下でゲルから精製して得た。

１０（Ｌ　０００ｐｓｅｏ＋の各断片を１．５ａ＋Ｑの
チューブに入れ、減圧下で乾固した。乾燥したｒｌＮＡ
　（配列）に次の溶液を加えた。

１００／７１．　ＫＲＴＳ　５衝液” １００１ｚ　ｌ　　１０　＋ｍＭ　ｒｌＴＴ１００＃　
　１．　１０　　ｓ＋Ｍ　　ＡＴＰ５０μ１．　　Ｈ，
０ ５０ｔｔ　１．ＬＭ　ＮａＣｌ ３００μｍ、３０％ＰＩ’！Ｇ。

＊　ＩＯＸ（５０ｍＭ　Ｔｒ＋ｓ　ＨＣＩ、　ｐＨ７，
６＋’　１０ａ＋Ｍ　ＭｇＣ１ｇ。

１ｍｇ／−スペルミジン） このチ１−ブをポルテックスにかけ９次に、５５℃にて
３０分間加熱した。チｉ−ブを室温にまで冷却し１次の
溶液を加えた。

６．７１１　ｅ　Ｔ４　ｎＮ＾リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｒｎ
ｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ１５　ＩＩ／　ｔｉ　１．
　） １８．８／ｚ　１．５Ｘリガーゼ希釈緩衝液（Ｎｌ’！
Ｎ）？４．５／７１．　Ｈ，０ 再びチューブをポルテックスにかけ９次に室温で一晩イ
ンキユベートした。反応混合液をｎ−ブタノールで抽出
し７て１００μｒの容量とし、３×ストツプミツクス（
２５％グリセロール、　０．０５％ブロモフェノールブ
ルー、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、　２５ｍＭ　
ＥＩＩＴＡ）を１００ＩＩｉ加え、　ｉｏｏ　’ｃにて
５分間加熱し、サンプルを変性させた。この溶液２０１
１ｅを７％変性ポリアクリルアミドゲル（１０ｃｗＸ１
０（Ｍ　Ｘ　ｌ　、５　ｍｍ）のウェルにのせる。この
ゲルにおいて、ブロモフェノールブルーが底から０．５
　ｃｙａのところにくるまでＩＯＶ／ｃｍの電圧をかけ
て流す。生産物はＯＶ螢光液を含みサランラップにカバ
ーされた薄層クロマトグラフィープレート上にゲルを置
き。

長波長のＩｎランプで照射することにより視覚化される
。生産物はＵＶ照射を吸収シフ、可視形を落とす。

長さのふえたバンドが観察され、そして、オリゴマー単
位が２０を越える生産物は切除された。これらの生産物
はマキサム−ギルバート緩衝液（０，ＩＭ　Ｔｒｉ−Ｈ
Ｃｌ、、　ｐ）１８　＊　０．５Ｍ　ＮａＣｌ、　５ｍ
Ｍ　Ｐ、口↑Ａ）にゲルを浸漬することによりゲルから
溶出する。

２、　　　　　　　　　　のマル　マーのＡ、　　　お
よび　　　のマルチマーの増幅したプローブ（後述の３
．Ｆ参照）に相補的な１８！！体の直鎖および分枝状の
マルチマーを。

第２図ＡおよびＢに示されたスキームに従って調製する
。

そこに示されるように、そのスキームでは、フヱニルジ
イソチオシアネート（旧ＴＣ）とクロスリンクする修飾
塩基を有するオリゴヌクレオチド有用いる。

直鎖状マルチマーを調製するのに用いられるオリゴヌク
レオチドは次の配列を有する。

３’　−ＸＧＣＡＣＡＧＴＣＣＧＴＡＴ（”、ＣＴＧＧ
Ｘ−５’ここでＸは、シチジンのＮ−’−（６−アミノ
カプロイル−２−アミノエチル）誘導体を示す。

分枝したマルチマーを調製するのに用いるオリゴヌクレ
オチドの配列は次の配列を有する：５’　−ＸＴＣＧＴ
ＣＣＴＡＴＧＣＣＴＧＡＣＡＣＧＴＸＴＧＧＴＣＣＴＡ
↑ＧＣＣＴＧＡＣＡＣＧＴＸ↑−３′ここでＸは上記と
同意義を有する。

シチジンＮ’−（６−アミノカプロイル−２−アミノエ
チル）は１本出願人による係属中の特許出第９４５．８
７６号に記載されているように調製した。

オリゴマーは、実施例１に記載のように合成し。

精製した。

各々の断片の０．２（０１１，。）単位のサンプルを、
　０．ＩＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９，３）　０．５　
ＩＩ　１．に溶かした。

これにジメチルホルムアミド中の旧ＴＣ（２ｍｇ　／　
ｍＱ　）９．５７ＩＱを加えた。この溶液をポルテック
スにかけ、暗所にて室温で一晩放置した。３００１ｔｌ
のｎ−プタノールを加えて混合した後、　３００　ＩＩ
　Ｑの水を加えた。混合液をポルテックスにかけ、遠心
分離して層を分離させた。サンプルを、水相が約５０Ｉ
Ｉ　１．に減じられるまで数回抽出した。そして減圧下
で乾固した。次に、ポリマーを１Ｍグリシン（ｐＨ９，
５）１０７ｚ／で２時間にわたって処理し、残存してい
るイソチオシアネート基を修飾し７た。この混合液をセ
ファデックスＧ−２５カラム（ＩｏｚＩＩｌ）にかけ。

水で溶出し、フラクシッンを集め、減圧乾固した。

そして、これを１％ＳｎＳ中にとり、７％ポリアクリル
アミドゲルにロードかけた（垂直の２％アガロースゲル
は調整泳動に使われる）、このゲル有用いて６０−Ａで
泳動し、エチジ５ウムプロミド有用いて染色した。１０
〜２５単位のオリゴマーを含むと考えられるバンドを切
り出し、電気溶出し沈澱させた。

Ｂ、　　し　のおよび　　　のマルチマーのこの節では
、下記の用語はそれぞれ次のような意味を有する：ＤＭ
Ｔ＝ジメトニジトリチル、↑＝ニブオキシチミジン　ｒ
ｌＭＰ　＝ジメチルホルムアミド。

ＲＩＩＭＳ＝　ｔ−ブチルジメチルシリル、Ｃ＝ニブオ
キシシチジン　ＴＩ、Ｃ−４層クロマトグラフィー、　
ｒ１ＭＡＰ＝Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン、　ＴＨ
Ｆ　＝テトラヒドロフラン、　ＤＩＰＲ＾＝ジイソプロ
ピルエチルアミン、　ＩＪＥＶ　＝レブリン酸エステル
、　ＯＣＡ　＝ジクロロ酢酸、・口ＣＣ＝Ｃニジシフヘ
キシルカルボジイミドｃｎｕ　＝ジクロロヘキシル尿素
、　ｔＥＡ　＝　）リエチルアミン、　ＴＭＳ≠トリメ
チルシリル、ｆｉＭＯｃ＝９−フルオレニルメトキシカ
ルボニル。

５−１５−１ｌ〒−ＯＲ（２７，３ｇ、　５０ａｕｇｏ
ｌｅ）およびイミダゾール（１０ｇ　、　１５０ｍｍｏ
ｌｅ）を２００　ｇｆｆｉＤＭＦで共エバボレートした
。残渣を２５０　ｄのｒｌＭＦに溶かし、そして８０Ｍ
Ｓクロリド（７５ａｅｓｏｌｅ）を加えた。反応混合物
を２０℃にて１８時間にわたり撹拌した。メタノール（
５０＋＋＋ｆｆ１）を加え、３０分後に溶媒を減圧下で
除去した。油性残留物を５０−の酢酸エチルに溶かし、
有機相を５％ＮａＨ，ＣＯｔ水溶液（２Ｘ５００ａｊｌ
）および８０％飽和ＮａＣ１水溶液（５００ｍｌ）で抽
出した。そして。

最終的に固形状のＮａ２ＳＯ２上で乾燥させた。溶媒を
減圧下で除去し、　３５ｇ　（５０ｏ＋ｍｏｌｅ　（７
）５°−１）ＭＴ−３’　ＲｒｌＭＳＴ（収率１００％
）を得た。この物質はさらに精製することなく用いられ
た。

トリアゾール（２５，６ｇ　）をＣ１１ＣＮ　４００１
１Ｑに０℃で溶解させた。そしてＰＯＣＩｓ　　（８＊
ｆｆ１）を加え、高速で撹拌した０次に、トリエチルア
ミン（６０１ｄ）を１５分にわたり滴下し、て加えてス
ラリーとし、これをｏ　”ｃにて３０分撹拌した。５’
−ＤＭＴ−３°Ｒｒ１ＭＳ　Ｔ（２５ｍｓｏｌｅＨ調製
物）を１００　ａｄのＣＩ、ＣＮに熔かしたものを上記
で得られたものに、０°Ｃにて滴下しながら撹拌した。

水浴をはずし、２０℃にて１時間撹拌を続けた０反応混
合物を８００　ｊｄｌの酢酸エチルで希釈し、有機相を
５％ＮａＨＣＯｓ（２Ｘ５００　ｒｎＱ）および８０％
飽和ＮａＣ１水溶液（５００ｄ）で抽出した。有機相を
固形のＮａｔＳＯ，上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で
留去した。得られた残渣をトルエン（４００ｍｌ）およ
びＣＩ、ＣＮ　　（４００ｄ）と共エバボレートし、５
°−ｎＭＴ−３’−ＲｆｌＭＳ−５−、＋ｅチＪｔｚ−
４−　　）リアジイルβ−ロー２−ブオキシリボフラノ
シル−２（ＩＩＩ）−ピリミジノンを白色泡状で定量的
に得た。この物質は、さらに精製することなく用いられ
た。

４００　ｘｒＲのＣＩ、ＣＮに溶かした６−アミノヘキ
サノール（ｉｉ，７ｇ　、１００ｍｍｏｌ−ｅ）溶液を
５’−ｒｌＭＴ−３°−ＲｒｌＭＳ−５−メチル−４−
トリアゾイルβ−ｎ−２−デオキシリボフラノシル−２
（ｌ）ｌ）−ピリミジノン（８，７ｇ　、　１２ｍｍｏ
ｌｅ）を１００１ｄｌのＣＩ、ＣＮに溶解させたものに
滴下し、この反応混合物を２０°Ｃにて撹拌した。反応
の進行はＴＩ、Ｃ有用いて３０分ごとにモニターした。

そして出発物質が完全になくなった（通常１〜２時間）
ときに１反応混合物を５００−酢酸エチルで希釈し。

上記のように、５％ＮａＨＣＯ，Ｉ水溶液および８０％
飽和ＮａＣｌ水溶液で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４
上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で除去し、５”−ロＭ
Ｔ−３’　−ＲｒｌＭＳ−５−メチル−Ｎ４−６−ヒド
ロキシへキシルデオキシシチジン７、Ｏｇ　（９，２ｍ
ｍｏｌｅ）　；収率７７％）を得た。この物質はさらに
精製することなく用いた。

１００　ａ＋ｆｆ１ＴＨＰ　ニ溶解させた５’　−１）
ＭＴ−３’−ＲＩＩＭＳ−５−メチル−Ｎ４−６−ヒド
ロヘキジルデオキシシチジン（７ｇ。

９．２　ｍｓ＋ｏｌｅ）溶液を、　１００　ｔｅｌのＴ
Ｈｆｌに溶解させた（ｃＩ、Ｃ０ＣＨｚ（：ＨｚＣＯ）
ｚＯ（５０ｍａ＋ｏｌｅ）に加え、そして、さらに２．
６−ルチジン／ＴＨＦ中ニ６．５％ｒ）ＭＡＰを含む溶
液１０ＩｎＱを加えた。反応混合物を３０分にわたり撹
拌し７た。分析により、出発物質が完全に消費されたこ
とが示された０反応部合物を、上に述べたように、酢酸
エチル７００　ｍで希釈し、５％ＮａＨＣＯｔ水溶液（
３Ｘ５００　ｄ）および８０％飽和ＮａＣｌ水溶液（５
００ｍＱ）で抽出した。固形のＮａ２ＳＯ４で乾燥後、
溶媒を除去し７．残渣をトルエン（２００ｍｆｆ１）お
よびＣＨｆｆＣＮ（２００Ｗｆｆｉ）と共エバボレー）
Ｌ、　１２．３ｇの粗生成物を得た。

この粗製の生成物を、　１００　ｄのＴＩＰに溶かし。

ＴＨＰ中テトラブチルアンモニウムフルオライドの１．
１Ｍ溶液の１０ｍを加えた０反応の進行はＴＩ、Ｃ有用
いてモニターした。それはたいてい３０分で終結するが
、それ以上の場合もあり得る。出発物質が完全に消費さ
れたときに９反応部合物を７００　ｒｘｌのエチルアセ
テートで希釈し、上と同様に、　ＮａＨＣＯｌおよびＮ
ａＣ・１溶媒で抽出した。溶媒を除去すると、８．５ｇ
の粗生成物５’　ＪＩＭＴ−５−メチＪＬ／−Ｎ’　（
０−１ｚ　７’　リ、−ルー６−オキシヘキシル）−２
′デオキシシチジンが得られた。この物質をシリカゲル
クロマトグラフィーにかけた。精製された生成物をＣＢ
、Ｃ１ｔ中４％メタノールで溶出し、　５．０　ｇのや
やかっ色がかった泡状物（（ｉ、７ｇｏｌｅ；収率７３
％）として単離した。

シリカで精製された５’−ＪＩＭＴ−５−メチル＝Ｎ４
（０−シブリニル−６−オキシヘキシル）−２゛−デオ
キシシチジン（７，７ｍ５ｏｌｅ）をＣＩｌ、ＣＮとと
もに２回共エバボレートした。得られた乾燥した粉末を
、アルゴン下でスフラスコに４．９　ａｄｔＤＩＰＲＡ
を含む（４１ｔＣ１ｔ７０　ｍｌｌに溶解させた。０℃
に冷却後、シリンジで１．６５ｓｆｆｉ（８，５ｍ５ｏ
ｌｅ）のＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシ　クロ
ロホスフィンを加え、混合物をＯ′Ｃにて３０分撹拌し
た。４００　ｍＱのエチルアセテートで希釈後、有機相
を８０％飽和ＮａＣ１水溶液４００　ｍＱで４回洗浄シ
７．固形のＮａｚＳＯ，上で乾燥させ、濾過した。溶媒
を減圧下で留去シフ、残渣をトルエンで２回共エバボレ
ートし、オイル状物を得た。このオイルを３０＋＋Ｑの
トリエンに溶かし、　４００　ｔｎｌの冷ヘキサン（−
２０°Ｃ）に滴下し７た。沈澱を速やかに濾過して集め
、減圧下で１８時間乾燥し、ホスホルアミダイト５．４
５　ｇ　（６，０ｍｍｏｌｅ；収率７８％）を得た。

上に述べたようにして調製し７た。　２００　ｍＱのＣ
ｌｌＣｌ。

ニ５’　−ＪＩＭＴ−３−ＲｒｌＭＳ−５−メチル−Ｎ
　’　−６−ヒドロキシへキシルデオキシシチジン（３
４ｇ　、　５０ｍｍｏｌｅ）を溶かした溶液に、　１．
５　ｇのＮ、ｌ１ｌ−ジメチルアミノピリジンと２５ｍ
Ｑのトリエチルアミンとを加えた。この溶液に、ｏ’ｃ
にてｒ１Ｍ↑−ＣＩ（７５＋＋ｕｗｏｌｅ、　２５．５
ｇ　）をＣＩ、ＣＩ。

（１００ａｔ）に溶かした溶液を滴下した。この反応混
合物を１時間撹拌した。分析により、出発物質が完全に
消費されたことが示された。次にト、メタノール５０１
ａｌを加えた。３０分後に１反応液を８００−のエチル
アセテートで希釈し、上記のように５％ＮａＨＣＯ２（
２Ｘ５０Ｑ　ａｆｆｉ）および８０％飽和Ｍａｉｌ水溶
液（５００ｄ）で抽出した。固形状のＮａ２５Ｏ，上で
乾燥した後溶媒を減圧下で留去し、残渣をトルエン（２
００−）およびＣＨｆｆＣｌｌ（２００ｄ）で共エバボ
レートシ、た。

この粗生成物を・２００　ｄＴＨＦに溶かし、　１．１
Ｍ　　テトラブチルアンモニウムフルオライドのＴＩ（
Ｆ溶液２００−を加えた。反応の進行は、　Ｔ１．Ｃ有
用いてモニターＬ、た。これは通常３０分間で終結する
が、それ以上かかる場合もある。出発物質が完全に消費
されたときに１反応液を７００　ｔａｆエチルアセテー
トで希釈し、上記のように、　ＮａＨＣＯ，およびＮａ
Ｃｌ溶液で抽出した。溶媒を除去すると粗生成物、　５
’−ｒ）ＭＴ−５−メチル−Ｎ’（０−ｎＭ↑−６−オ
キシヘキシル）デオキシシチジンが３６ｇ得られた。こ
の物質を、シリカゲルクロマトグラフィーにかけた。精
製した生産物を２〜４％メタノール（ｃｕｔｃｔｚ中）
で溶出し。

３２．７ｇの精製物（３４ａｓａｏｌｅＨ５°−ｎＭＴ
−Ｔ−０）１を基準として、収率６９％）を得た。

シリカで精製した５’−［ＩＭＴ−５−メチル−Ｎ’（
０−［ＩＭＴ−６−オキシヘキシル）−２９−デオキシ
シチジン（３４ｓｎｏｌｅ）をＣＩ、ＣＮとともに２回
共エバボレートした。得られた乾燥粉末をアルゴン下フ
ラスコ内で７．５＊ｊ！のｒｌｌＰｌ’！Ａを含有すル
ＣＨｘＣ１ｔ　１００ｄＬ溶かした。０℃に冷却後、　
１．３１ｍ１　Ｃ３８ｔｓｖａｏ１ｅ＞のＮ、Ｎ−ジイ
ソプロピルアミノメトキシクロロホスフィンをシリンジ
で加え、混合物を０°Ｃにて３０分撹拌した。　８００
　ａｌｌエチルアセテートで希釈後、有機相を８００　
ｌＩｌの８０％飽和ＮａＣ１水溶液で４回洗浄し、固形
のＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過した。溶媒を減圧下で
留去し、残渣をトルエンとともに２回共エバボレートし
、オイル状物を得た。このオイルを８０１ｄ、のトルエ
ンに溶かし、　７００　ｍｌの冷ヘキサン（約−２０℃
）に滴下した。沈澱を速やかに濾過して集め、減圧下で
１８時間にわたり乾燥してホスホアミダイト３１．８ｇ
　（２Ｂ、７■−ａｌｅ；　　収率８４％）を得た。

５’−１１ＭＴ−Ｔ−ＯＲ（１６，４ａｄ、　３０ｓｎ
ｏｌｅ）を乾燥ＣＨｔＣＮ　２００−に溶かし、　ｌ−
（ＴＭＳ）イミダゾール（１４，６ａｊｔ、　１００ｓ
ａｏｌｅ）を加えた。６０分後湾媒を減圧下で留去した
。

油性の残渣を７００　ｍの酢酸エチルに溶かし、有機相
を５％ＮａＨＣＯｓ　（２ｘｓｏｏ　ｇｆｆｉ）および
８０％飽和ＮａＣｌ水溶液（５００ｍｆｆｉ）で抽出し
、最後に、固形のＮａ１ＳＯ４上で乾燥した。溶媒を減
圧下で留去し＋　３０ｍｍａｏｌｅの５′−ＤＭＴ−３
”−ＴＭＳ−Ｔ　　（収率１００％）を得た。この物質
はさらに精製することなく用いた。

トリアゾール（３７，８ｇ　）を、　４５０　ａｄのＣ
Ｉ、ＣＮに０℃で溶かし、急速に撹拌し、なからＰＯＣ
ｌ２（１２１１１ｆｆｉ）を加えた０次に、トリエチル
アミン（９０ｍｆｆｉ）を１５分にわたってスラリーに
滴下し、０°Ｃにて３０分撹拌した。　５’−ｒｌＭＴ
−３’−ＴＭＳ−Ｔ（粗製物３０ｎ＋ｍｏｌｅ）をＣＩ
（、ＣＮ１００　ｄに溶解させた溶液を、上記スラリー
にｏ′ｃにて滴下した。水浴を取り除き、２０℃で１時
間撹拌を続けた０反応混合物を８００　ｙｍＱエチルア
セテートで希釈し、有機相を５％ＮａＨＣ０，３（２ｘ
５００　ｍｌ）および８０％飽和ＮａＣｌ水溶液（５０
０−）で抽出した。

固形のＮＡ、ＳＯ４上で有機相を乾燥した後、溶媒を減
圧下で留去した。得られた残渣をトルエン（４００ｍｆ
ｆ、）およびＣＨｚＣＮ　　（４００ｍｌ＞で共エバボ
レートし。

白色泡状の５’−１１ＭＴ−３’−ＴＭＳ−５−メチル
−４−）Ｉ７７’／’イル−β−ロー２−デオキシリボ
フラノシル−２（ＩＨ）−ピリミジノンを定量的に得た
。この物質はさらに精製することなく用いた。

６−アミノへキサノール（２３ｇ　、　２００ｓ＋ｏ　
ｌｅ）溶液（４００ｄＣＨ，ＣＮ中）　ニ５’−１）Ｍ
Ｔ−３’−ＴＭＳ−５−メチル−４−トリアシイルーβ
−ト２−デオキシリボフラノシル２（ＩＨ）−ピリミジ
ノン（２０ｇ　、　３０ａｅｓｅｏｌｅ）のＣＨ３ＣＮ
溶液１００ａｅｆｆｉを滴下し１反応液を２０°Ｃにて
撹拌した。

反応の進行は、　Ｔ冒、Ｃ有用いて３０分毎にモニター
した。そして、出発物質が完全に消費されたとき（通常
１〜２時間）に９反応混合物を８００　ｒｘＱのエチル
アセテートで希釈し、さらに上記に述べたように、５％
ＮａＨＣＯｓ水溶液および８０％飽和ＮａＣｌ水溶液で
抽出した。Ｎａ１ＳＯ，上で有機相を乾燥させた後。

溶媒を減圧下で留去し、５°−ロＭＴ−３’−↑ＭＳ−
５−メチル４ａ−６−ヒドロキシへキシルデオキシシチ
ジンを２０．３ｇ　（３０ｓｎｏｌｅ）得た。この物質
はさらに精製することなく用いた。

２５０ｍｆｆ１メタ／　−ルニ５’　−ｒｌＭＴ−３’
　−ＴＭＳ−５−メチル−Ｎ’（６−ヒドロキシヘキシ
ル）デオキシシチジンを溶かした溶液に、２５−濃厚な
Ｎ）１，０１１水溶液を加えた。

反応液を閉じた丸底フラスコで１時間撹拌した。

溶媒を減圧下で留去し、ｌＸ２００−エタノール。

１×１００ｍ１トルエンおよびＩ　Ｘ１００　ａｌｃｌ
Ｉ、ＣＮ　トドもに共エバボレートし、　５’−ｒ）Ｍ
Ｔ−５−）　チル−Ｎ’（６−ヒドロキシヘキシル）デ
オキシシチジンを定量的に得た。この物質はさらに精製
するこよなく用いた。この物質を２００　ｍｌのＣＩｌ
、ＣＩ、に溶かし、ピリジン４Ｉｄ、を加え、さらにＣ
ｌ１ｊＣ１！（５０ａｆｔ）に溶かし７たＦＭＯＣ−Ｃ
Ｉ　　（７，８ｇ　、　３０ｍ５ｏｌｅ）を滴下した。

反応混合物を３０分撹拌した。分析により、出発物質が
完全に消費されたことが示された。反応混合物を。

上記したように、　５００　ｄの酢酸エチルで希釈し。

５％ＮａＨＣＯｚ水溶液（３×５０ｏｚＩＱ）オヨび８
０％飽和ＮａＣ１水溶液（５００ｄ）で抽出した。固形
のＮａ１ＳＯ４で乾燥した後、溶媒を留去し、残渣をト
ルエン（２００ｍ＞　＃よびＣ８，ＣＮ（２００ｍｌ＞
で共エバボレートし、粗生成物２３．７　ｇを得た。こ
の粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。

精製産物を４％メタノール（ｃＯ，ＣＩ中）で溶出し、
純粋な５゛−ｒｌＭＴ−５−メチＪｌ、−Ｎ’　（０−
ＦＭＯＣ−６−オキシヘキシル）デオキシシチジン１３
．３　ｇ　（１５，３ｍｍｏｌｅ）を得た。

シリカテ精製した５’−ｒ）ＭＴ−５−メチル−Ｎ’　
（０−ＰＭＯＣ−６−オキシヘキシル）−２”−デオキ
シシチジン（１５，３ｍ　５ｔｏｌｅ）をＣＩ（、ＣＮ
で２回共エバボレートした。得られた乾燥粉末を、アル
ゴン下で＋４−１ｄの旧ＰＥ＾含有ＣＨｔＣ１ｔ６０ｍ
ｆｆｉに溶解させた。０°Ｃに冷却した後。

３．１９ｍｊ！　（１６，５ｍｍｏｌｅ）のＮ、Ｎ−ジ
イソプロピルアミノメトキシ　りロロホスフィンをシリ
ンジで加え。

混合物をＯ″Ｃにて３０分撹拌し７た。４００−の酢酸
エチルで希釈した後、有機相を８０％飽和ＮａＣ１水溶
液４００　ｍｌで４回洗浄し７．固形のＮａ１ＳＯ，で
乾燥し、濾過し７た。溶媒を減圧下で留去し、得られた
残渣を油状となるまでトルエンとともに２回共エバボレ
ートした。この油を５９ｍＱのトルエンに溶かし、４０
９　ｍＱの冷ヘキサン（約−２０°Ｃ）の中に滴下する
。

沈澱を速やかに濾過して集め、１８時間減圧下で乾燥し
、　１２．１５　ｇのホスホアミダイト（ｉｉ，８ｍｓ
＋ｏｌｅ。

収率７７％）を得た。固相合成の間の０−ｐＭＯｃの除
去：ｔ−ブチルアミン／ピリジン（１：　ｌｏｖ／ｖ）
で２０°Ｃにて１時間、０−レブリニル基の除去：ピリ
ジン／氷酢酸（４：　Ｉ　Ｖ／Ｖ）内の０．５Ｍヒドラ
ジンハイドレーロ２０℃にて１５分間。

グリセロール（１０ｍｍｏｌｅ）をピリジンで共エバボ
レートし、乾燥した。得られたオイルを５０−のピリジ
ンニ溶かし、　ＯＭＴ−ＣＩ　（６，８ｇ　、　２０ｖ
ｖ＋ｏｌｅ）を加え１反応混合物を２０℃にて１８時間
撹拌した。メタノール（１０ａ＋ｊりを加えた後、溶媒
をロータリーエバポレーターで除去する。得られたオイ
ルを２５０−酢酸エチルに溶かし、有機相を５％ＮａＨ
ＣＯ，水溶液（２Ｘ２５０　ｄ）　８０％飽和ＮａＣｌ
水溶液（ＩＸ２５０ＩＩｌ）で洗浄し、固形のＮａｔＳ
Ｏｓ上で乾燥させた。溶媒を減圧下で留去し、残渣を１
００　ａｌｌ　トルエンおよび１００　ＩＩＱｃｏ、ｃ
Ｎとともに共エバポレートした。生成物をシリカゲルク
ロマトグラフィーで単離し。

２．５　ｇ　（３，６ｍｍｏｌｅ）の０，０−ビス口に
↑グリセロール（収率３５％）を得た。生成物を、０〜
１％のＭｅＯＨで溶出させた。

ｂｉｓ−ロに↑グリセロール（２，３ｍｍｏｌｅ）をア
ルゴン下で０．８＃ｆｆｉの旧ＰＲ＾含有１０ＩｎＱＣ
ＨｚＣＩｚに溶かし、シリンジでＮ、Ｎ−ジイソプロピ
ルアミノ−２−シアノエトキシ−クロロホスフィン（ｌ
Ｉｄ、）を加えた。３０分後に１反応混合物を２００　
ｔｅｌ酢酸エチルで希釈し。

有機相を８０％飽和ＮａＣ１水溶液２００　ｍｌで洗浄
した。

固形のＮａｔＳＯｓ上で乾燥後、溶媒を減圧下で留去し
。

残渣を１００　ｍｌのトルエン、　１００　ｍｌの乾燥
ＣＩ、ＣＮで共エバボレートし、ビスーｒ１ＭＴグリセ
ロールホスホアミダイト２．１５ｇ　　（２，３ｍｍｏ
ｌｅ、収率１００％）を得た。この生成物を乾燥ＣＩ、
ＣＮと共に小さなバイアルに分注し、溶媒を除去後、ア
ルゴン下、−２０℃で保存した。

０．０−ジベンゾイル酒石酸モノハイドレート（１８，
８ｇ　＋　５０ａ＋ｍｏｌｅ）を２５０　ｌｌｌ１のＣ
Ｉ、ＣＮに溶かし、溶媒を減圧下で留去した。この操作
を繰り返した。得られたオイルを２５０緘のＴＨＦに溶
かし、　５０ｍｆｌ　ＴＨＦに溶かした口ＣＣ（１０，
６ｇ、　５０　ｍｓ＋ｏｌｅ）を加えた。数分後に沈澱
が生じはじめる。２０℃にて１８時間撹拌した後１反応
混合物を濾過し、沈澱をＴＨＰで洗浄し。

た、沈澱を高真空下で乾燥し、　１０．８　ｇ　（５０
ｍｓ＋ｏｌｅ）のｎｃＨＵを得た０合併した濾液に２−
（Ｎ−メチル）アミノエタノール（４，Ｏｄ、　５０ｎ
＋ｓ＋ｏｌｅ）を加え１反応液を２０°Ｃにて１時間撹
拌した。次に５口ＣＣ（１０，６ｇ　。

５０ｍｍｏｌｅＨ↑ＨＰ５０＃ｆｆｉ中）を加えた。少
量の沈澱を生じた。約１時間後、　　２−（Ｎ−メチル
）アミノエタノール（４，０ａｌｌ、　５０ａｕｓｏｌ
ｅ）を加え９反応混合物を２０℃にて１８時間撹拌した
。

形成された沈澱を濾過して取り除きＴＨＦで洗浄した。

乾燥した沈澱物（口ＣＩ１）の重量は、　１０．８ｇで
あった。合併した濾液をエバボレートして油状とした。

シリカのクロマトグラフィーにより８ｇ（１７ｎ＋５ｏ
ｌｅ）の０．０−ジベンゾイル酒石酸ジ（Ｎ−メチル−
２−ヒドロキシエチル）アミド（この産物は６％メタノ
ール／Ｃ１（、Ｃ１，で溶出された）を得た。

ｎＭＡＰ　（０，１１ｇ）およびＴＲ＾（２，４ａ＋１
）を含む、アミド産物（８，６ｅａｍｏｌｅ＞　　（ｃ
ＨｔＣ１ｔ５０ｍＱ中）に、　５０ｒｎＱのＣＩ、ＣＩ
、に溶かし７たｒｌＭＴ−ＣＩ　（８，６ａ＋ａｅｏｌ
ｅ）を滴下して加えた。ｆ）ＭＴ−ＣＩを加えた後１反
応混合物を２０℃にて１時間撹拌した。次に、溶媒をエ
バボレートして留去した。残渣を６００　＃ｆｆｉの酢
酸エチルに溶かし。

を機相を５％ＮａＨＣＯｚ　４００ｓｆｆｉおよび８０
％飽和ＮａＣｌ水溶液４００ｄで洗浄した。有機相を固
形のＮａ２ＳＯ４上で乾燥した。３０分後、　Ｎａ１Ｓ
Ｏ，を濾過し、上澄液を油状となるまで濃縮し、そして
５　トルエンおよびＣＢ、ＣＮで共エバボレートした。

粗製の生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、
ｎ−ブタノール／Ｃ１１２ＣＩ！有用いて溶出させた。

純粋なモノー１１ＭＴ生成物を、２〜３％のｎ−ブタノ
ール／ＣＨｔＣ１，で溶出ｔ、、ｏ、ｏ−ジベイゾイル
酒石酸２−（０−ジメトキシトリチル）ヒドロキシエチ
ル−Ｎ、Ｎ−ジメチル、Ｎ−メチル−２−ヒドロキシエ
チルジアミドを１．５３　ｇ　（２ｍｍｏｌｅ）　得た
。

この物質を、　１１１ＰＩ’！Ａ（３ｍｍｏｌｅ）を含
有する２０緘ＣＨｚＣＩｇに溶かした。１０℃に冷却し
た後、アルゴン下で２．２ｍ５ｏｌｅのメトキシ−Ｎ、
Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフィンを加えた。

１５分後、酢酸エチルを加え、有機相を８０％飽和Ｎａ
ＣＩ水溶液で洗浄し。

固形のＮａ２ＳＯ２上で乾燥した。そして、エバボレー
ト、乾固した。トルエンおよび乾燥ＣＩ、ＣＮで共エバ
ボレートした後、ホスホアミダイト残基を乾燥ＣＩ、Ｃ
Ｎ　１０ｒａｌに溶かした。この溶液を乾燥したーｅａ
ｔｖｉａ１１９個に分注し、減圧下で溶媒を留去した。

スクリ、−Ｌ−キャップドバイアルを閉じ、−２０℃で
保存し７た。

このホスホアミダイトを、標準ＤＮＡ合成技術および装
置有用いて、オリゴヌクレオチドに結合させた。脱保護
の後、生じたリンカ−含有ＤＮＡは。

上記のように、１．２−ジオール部位で切断される。

（以下余白） Ｂ、４．　４　　　で　　した　−のム枝分かれした断
片の合成のため、２０００Ａコントロールボアグラス（
ｃＰＧ）支持体（３０ｍｇ（７，３，ｕａ＋ｏｌｅ）ヌ
クレオチド／ｇ）を使用した。ＣＰＧ支持体を、本出願
人による係属中のヨーロッパ特許出願第８８３０７３５
８．７に記載のように、合成した。自動メチルホスホア
ミダイト結合工程を、上記のように、ＤＮＡ合成に使用
した。但し、分枝したオリゴヌクレオチド断片付加時に
、トルエン中の（ｃ１，ＣＬ、の代わりに）２．５％（
ｖ／ｖ）ＯＣＡ有用いて脱トリチル化した。

ＬＬＡ−２（ＧＡＣＡＣＧＧＧＴＣＣＴＡＴＧＣＣＴ、
上記参照）断片をＣＰＧ上で合成し、自動合成機から除
去し、焼結ガラスろうとの中に置いた。ホスホアミダイ
トの結合は（Ｕｒｄｅａ、　Ｍ、Ｓ、、　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　ｔ！ｎｚ　ｍｏｌ　（１９８７）１４虹２２
−４１）に記載のように手操作で行われた。１００μｍ
ｏｌｅのロＭＴ２−グリセロールホスホアミダイト（２
−シアノエチル形）および２５０　ｐ　ｍｏｌｅテトラ
シルを５°を脱保護化断片に加え、１５分エニンュベー
トした。この過程をくりかえした。２種のＴメチルホス
ホアミダイトを手操作で加え、さらにグリセロールホス
フェートを加えた。次にＣＰＧを自動合成機に戻し、各
ブランチから断片ＧＡＴＧＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＡＣＴ
ＴＴＴを取ってきて合成を行った。標準脱保護化および
精製は上記のように行った。

上記の方法により、断片ＴＴＯＴＴＯＴＴＯＴＴＧＡＣ
ＡＣＧＧＧＴＣＣＴＡＴＧＣＣＴ（０□５’−ＤＭＴ−
Ｎ’−（ＬｅｖＯ（ｃＨｔ）ａ）−５−メチルシチジン
　メチルホスホアミダイトを合成した。

断片を機械から除去し、室温で１時間、８：２（ｖ／ｖ
）ピリジン／濃酢酸中の０．５Ｍヒドラジンモノヒトレ
ートで処理した。ＣＰＧをピリジンで洗い、次にｌ：１
：２（ｖ／ｖ／ｖ）の水／ルチジン／　Ｔ　ＨＦで洗っ
た。次に、支持体を自動合成機にもどし、上式各０を取
って断片の合成を行った。標準脱保護と精製とを上のよ
うにして行った。標識化プローブ（ＬＬＡ−２）が結合
した断片の１コピーは、マルチマー５′末端であり、そ
して断片の３コピーは０残基にあることに注意されたい
。

マルチマー 第３図分析の工程を図式的に示す。

Ａ、　　　　ＨＢＶ　ＤＮＡ プラスミドｐＨＥ６３は、ＥｃｏＲＩで直鎖化したプラ
スミＦｐＢＲ３２５（７）　ＥｃｏＲＩ部位の中ニＨＢ
Ｖゲ）　ム３．２ｋｂを挿入したものである。これを標
準ヒト血清中に希釈し、標準分析物として使用した。分
析物は第３図において１１で示されている。

Ｂ、　　　オ　ゴヌクレオチ　　人　　　３Ｃ２１塩基
オリゴマー、５’　−ＸＣＡＣＣＡＣＴＴＴＣＴＣＣＡ
ＡＡＧＡＡＧ−３゛（ここでＸは上記と同様である）を
実施例１にあるように合成した。０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ’ｒ、ｓ　）中のＮ−ヒドロキシスクシイミ
ジルビオチン有用いてビチオン化した。このビチオン化
された断片（８００ｐｍｏｌｅｓ）の５μｌを１．５　
ｄエッペンドルフチューブ（ＩＸＰＢＳ中に０．２５％
（ｗ／ｖ）のアビジンポリスチレンビーズ（２，８μ）
５００μｌを含む）に加えた。３７℃にて１時間インキ
ュベートした後、ビーズを０．１％ＳＯＳの５００μ４
２，４ＸＳＳＣ有用い、遠心分離により３回洗浄した。

次に、使用時まで、同じ溶液中に保存した。

Ｃ０第１ゴマ−３Ｅ Ｉ８塩基オリゴマー、５′−にＧＧＴＣＣＴＡＧＣＣＴ
ＧＡＣＡＧＥ−３°、（ここで、Ｘは上記と同様である
）を合成し、９５：５　（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミ
ド：　０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ９，３）中でＤ
ＩＴＣを修飾した。ｎ−ブタノールで抽出し、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合させた。

Ｄ、プローブの　　　　３゛Ａ −本鎖オリゴマーの１２セツトが実施例１の方法により
合成された。これらは、それぞれ、（Ｌス丁余幻ン ＨＢＶゲノムの特異的な配列に相補的な３０塩基部分を
変化させてもっており、固相に結合しているオリゴヌク
レオチドに相補的な３゛部分の変化しない２０塩基を有
する。

Ｅ、４　−プローブ　　ｍ −本鎖オリゴマーの３６のセットが実施例Ｉの方法によ
り合成された。これらのおのおのは、　ＨＢＶのゲノム
の特異的な配列に相補的な３０塩基の長さの部分を変化
させたものと、多量体（第３図Ｄ）に相補的な変化しな
い２０塩基の長さの３゛部分とからなる。

捕捉プローブおよび増幅プローブの両者は、　ＨＢＶウ
ェルの変化しない二本鎖領域について設計された。

Ｆ、旦二Ｘ分扼汰 分析物の１０μｌのサンプルを、　　１．５１１１エツ
ベンドルフチユーブに入れ、　１２．５μｌのプロティ
ナーゼに／ＳＤＳ　　（Ｇａｅｎｅ　（１９８７）６１
：２５４）で３７℃にて３０分処理した。各サンプルに
、４８のＨＢＶオリゴヌクレオチドプローブ（１２の捕
捉プローブおよび３６の増幅プローブ）のそれぞれを５
０ｆｍｏｌｅの割合で含有するＩ　Ｍ　ＮａＯＨ５μ２
を加え、チューブを１００℃にて１０分間加熱した。サ
ンプルを水中に５分間置き、　１０秒遠心する。そして
０．３８Ｍ酢酸、　１２．３ＸＳＳＣ（最終濃度４ＸＳ
ＳＣ）で中和した。プローブと分析物をアニールするた
め、１時間にわたり５５℃で処理した。続いて、捕捉ビ
ーズを２５μｌ加え。

溶液を５５℃にて１５分間放置した。洗浄用緩衝液（０
，１％ＳＯ３，４Ｘ５ＤＳ　）　５００μ！加えて、ポ
ルテックスし、１分間遠心分離し、上澄をすてるという
方法で２回洗浄を行なった。それぞれのチューブに０Ｍ
緩衝液（０，１，％ＳＤＳ、　　４　Ｘ５ＳＣ、ｌ　ｍ
ｇ／　ｍｌ超音波処理したサケの精子のＤＮＡ、１■／
ｄポリ−Ａ、１０■／ｄＢｓＡ）に５ＯｆＩＩｌｏｌｅ
のマルチマー（第３図Ｆ）を含有する液を２０μｌ加え
た。ポルテックスにかけた後、チューブを５５℃にて１
５分間放置し、上記と同様２回洗浄した。標識は、タイ
プＥのプローブを２５０ｆｍｏｌｅの割合で１１Ｍ中に
含有する溶液２０μｌを３７℃にて１時間処理した。上
記と同様に３回洗浄した後、ビーズはキムワイプで完全
に水気を切り、適当な基質を処理し９次のように測定し
た。プロティナーゼＫ　／ＳＤＳ溶液の添加から情報の
読み出しまでの分析の全時間は化学蛍光法で３時間５０
分であった。

ＨＲＰ検知のための化学発光増強法はＭａｔｔｈｅｗｓ
らがＡｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９８５）　１５１
：２０５−２０９に報告した方法有用いた。ビーズを化
学発光基質溶液（バラヒドロキシケイヒ酸およびルミノ
ールＨ５μｌに入れ３次に、　　ｔｍＭ　１ｌｚｏｚが
５ｕｌ含有する８Ｘ５０Ｍｍエバーグリーンポリプロピ
レンチューブに移した。

３０分後、チューブをターナ−ＴＤ−２０ｅルミノメー
タ−（遅滞ｌＯ秒、積分２０秒、平滑さ２０秒）で測定
する。出力は９反応の間に生産された光の完全な積分値
として与えられる。

それぞれのチューブに、新たなオルトフェニレンジアミ
ン溶液（ＯＰＤ　　Ｈ５ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
　　；５０ｍＭクエン酸ナトリウムの５ｄに５０■を溶
かし、３０％１１□０□を３μ！含有する（ｐＨ５，１
）　）の１００μｉを加えた。３７℃にて２０分後、　
　４　Ｎ　１１！Ｓ０４５０μ２を加えて９反応を停止
させた。次に、ビーズを遠心分離によってペレット状と
した。上澄はマイクロタイターデイツシュのウェルに移
した。次に、デイツシュはＢｉｏｔｅｋ　ＢＬ３１０プ
レート　リーダーを４９０ｎｍにセットして測定した。

より長いインキュベーションを行なってもＳ／Ｎ比は改
善されなかった。

Ｇ、マイクロ　イ　−　−′　　シュ マイクロタイターデイツシュ分析を行った。

マイクロタイターデイツシュは次のようにして準備した
０次のような２種のマイクロタイターデイツシュを準備
した：（１）サンプル及び陰性のコントロールの分析を
行なうためのＮウェル、および（２）サンプルおよび陽
性コントロールからのプローブ−分析物複合体を捕捉す
るためのＳウェル。

Ｎウェルは次のようにして調製した：ＨＭ緩衝液３００
＃ｆ！をイムロンＩＩＲｅｍｏｖ−ａ−ｈｅｌｌｓ　（
Ｄｙｎａｔｅｃ　Ｉｎｃ、）に加えた。ウェルの一列を
カバーし、室温で１時間放置した。吸引により、　８Ｍ
緩衝液を除去し、ウェルを４００ｕｌのＩＸＰＢＳで３
回洗った。該−列区画をプラスチックのラップでおおい
、使用するまで４℃で保存した。あるいは、ウェルを以
下のように、ポリフェニルアラニルリジンで、そして次
にｌＩ？ｌ緩衝液でコートした。

Ｓウェルは９次のように、イムロン■の区画で調製した
。それぞれのウェルに、ポリフェニルアラニルリジン（
Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｃ、）の水溶液（
。

２００μｇ／ｄ）を２００μ！入れた。おおわれた区画
を３０分から２時間室温で放置し２次に、上記と同様に
して洗浄した。上記３Ｂのオリゴヌクレオチドの１００
Ｄｚｉ。（６０１！０ＩＸＰＢｓ中）のサンプルを、　
１０■のエチレングリコールビス（スクシイミジルスク
シネート）　　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉ
ｎｃ、）を含有する１４０　ｕ　ｌ　ＤＭＦで処理した
。混合物をポルテックスにかけ、室温にて暗所でインキ
ュベーションした。１５分後、溶液を、あらかじめＩＸ
ＰＢｓ３０ａｅで平衡化したセファデックスＧ−２５カ
ラム（ＰＤ−１０、ファルマシア）に通した。カラムの
ボイドボリュームをＩＸＰＢｓで最終量か３５１Ｒ１，
となるように希釈した。それぞれのウェルに、捕捉プロ
ーブ溶液５０μｌを加えた。プラスチックのラップでお
おった後、ウェルを室温にて暗所で３０分から一晩放置
した。ウェルをＩＸＰＢＳで洗いＨ緩衝液でおおい、上
記のように保存した。

（以下余白） 標識オリゴヌクレオチドは１次のように、アルカリホス
ファターゼ（ＡＰ）で誘導体とした。ウシ小腸ＡＰ　（
緩衝液中３■、イムノアッセイグレード。

Ｒｈｏｅｒ＋ｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、　Ｃｅ
ｎｔｒ＋ｃｏｎ３０マイクロコンセントレータ−内にセ
ットした。０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ９，５）を
約２　ｍ加え、装置は最終容量が４０７１ｆｆｉとなる
まで３５００ｒｐ−で回転した。次に、アルキルアミノ
オリゴヌクレオチド（第３ｃ節中）を旧ＴＣで活性化し
、ブタノールで抽出し、　ＨＲＰプローブについて記載
されたように、タンパクト結合すセタ。ＰＡＧＲ，溶出
（０，１Ｍ　）　リフ、、　ｐｌ＋７−５＋０゜ＩＭ　
ＮａＣｌ、　１０ａ＋Ｍ　ＭｇＣｌ、　０．１ｍＭ　Ｚ
ｕＣｌｚ）、およびＩＩＲＰ複合体について記載された
濃度を採用した。最終産物を４°Ｃで保存し７た。

２回分析を行うため、それぞれのサンプル２０１ｔｌ。

を２つのＮウェルに入れ、プロティナーゼに／ＳＤＳ溶
液２ＦＨｔ１．で処理した。ウェルをＩ、１ｎｂｌｏ−
Ｔｉ　ｔｅｒｔｅｋマイクロタイタープレートシーラー
でおおった。

これをゆるやかに振とうし、水浴中で６５°Ｃにて３０
分インキヱベートした。捕捉および増幅プローブをＩＭ
のＮ／ＩＯＨにセットし、それぞれのウェルに１０１ｔ
ｌ。

ずつ加えた。シール後、サンプルを上記のように６５℃
〜７２℃で１０〜３０分インキ１ベートした。溶液を、
　０．３８Ｍ酢酸（または０．７６Ｍ　３−　（Ｎモル
フオリノコプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）　、遊離の
Ｍ）２６／７ｆｆｉ、　１２．３ＸＳＳＣテ中和し９次
に、６５°Ｃにてさらににて１〜２時間セットした。各
ウェルを０，１％５ｔ）Ｓ、　０．ｌＸ５ＳＣで吸引に
より２回洗浄した。増幅マルチマーの１Ｍ緩衝液溶液を
加え、サンプルをシールし７水浴で５５°Ｃにて１５分
から１時間保った。上記増幅マルチマーにおいて、ｌＩ
旦凹工ｒｈｏμ猥工、ペニシＩＪ：／耐性Ｌｗμ工ｈｏ
ｅａｅ工、テトラサイクリン耐性Ｎ、　ｏｎｏｒｒｈｏ
ｅａｅおよびＣｈｌａｓｙｄｉａテストには。

５部位クシ構造（第２．８節５）を採用した。上のよう
に洗浄し、　１Ｍ緩衝液中の酵素ラベルしたプローブ２
０Ｂｌを加えた。　ＨＲＰプローブのインキュベートは
４２°Ｃにて１５分行い、アルカリホスファターゼプロ
ーブを５５°Ｃにて１５分おいて使用した。上記と同様
に洗浄した後、適当な検知試薬を加えた。

ＨＲＰについては、増幅ルミノール試薬（３Ｆ参照）を
上記と同様に用いた。

静の検出については、酵素トリガーされたジオキセタン
（Ｓｃｈａａｐら（１９８７）　Ｔｅｔ、Ｉ、ｅｔｔ、
２８：１１５９−１１６２およびＨＰ＾公開第０２５４
０５１号）　　（１，ｕｍｉｇｅｎ　Ｉｎｃ。

より入手）有用いた。検知手順は次のとおりである。標
識工程においては、　ＡＰプローブを含む２０ｔｔ１．
ＭＨ緩衝液を各ウェルに加え、ウェルを５５°Ｃにて１
５分間インキ１ベートした。上澄を捨て、ウェルを０．
ｌＸ５ＳＣ−０，１％５ｒ）Ｓ　３８０　／７１．で２
回洗浄した。ウェルを０．Ｉ　Ｘ５ＳＣ３８０／７１．
で２回洗浄し、残ったＳＯ５を除去した。ＣＴＡＲ緩衝
液中の３．３　Ｘｌ０−’Ｍジオキセタン２０１１１．
を各ウェルに加えた。試薬が底に沈み、ゆるやかに渦ま
いて底に平坦に分布するように、ウェルを軽くたたいた
。ウェルをマイクロタイタープレートシーラーでおおい
、３７℃で１時間インキ１ベートした。次に、ウェルを
ルミノメータ−で測定した。

Ｍす礼 Ａ、′　　　　の−ス 上記の分析を、実施例１−２へのマルチマー有用い、既
知量の標準ＨＲＶ　ＩＩＮ＾分析物を含有するサンプル
について行った。比較を目的として、３ピー標識化ＤＮ
Ａ　）を行った。比較分析のゲインを１として表１に示
す。ゲインとは、増幅分析で得られたシグナルと増幅し
ない３ピ一ス分析で得たシグナルとの比である。

これらの分析の結果を下表に示す。Ｓ／Ｎ−シグナル対
バックグラウンド比。

（以下余白） Ｒ１ＨＲＶ　　ＤＮＡ　　　　＋（７）晋真正ＨＲＶ　
ＤＮＡ試料を次のようにしてｒ１１１ｔＪ２１．た。

７：ｙｚｉｋらＲｕｒ　Ｊ　Ｃｈｅｓｅ旧ｃｒｏｈｉｏ
ｌ　（１９８６）　、、ｉ：３３０−３３５のタンパク
−ＤＮＡ複合体抽出法有用いて、４９個のＨＲＶ表面抗
原陽性試料中におけるＨＲＶ　ＤＮＡの存在に関するド
ツトプロットスクリーニングを行った。ｍ４図は　ｓｔ
ｐニックトランスレーシヲンしたｐ旺６３をプローブと
して用いた。４９個の試料からなる組に存在する６個の
ｒｌＮＡ陽性血清の分析を表す、各試料をプロットし、
プールされた正常ヒト血清中で、直接に（１０°）、１
０倍希釈で（１０’）　。

および１００倍希釈で（１０”）　、プローブにより２
度ずつ調べた。ｐ旺６３の試料を、プールされた正常ヒ
ト血清中または緩衝液（１０Ｘ　５ＳＣ）中で２度ずつ
プロットした。希釈液および真正プラスミドを含有する
これらの血清有用いて、５回の独立したプロッティング
実験を行い、計算範囲を決定した。

これらの試料は２本発明のサンドイッチハイブリダイゼ
ーシヲン分析の評価に用いた。

第６図は、上記のＨＲＶ　ＤＮＡ陽性試料有用いて。

ビーズ捕捉分析法における化学発光読み取り方式により
得られた結果を表す、４ｆ１ｇのｐＨＲ６３試料の分析
結果も示す。各試料に対して、２つの陰影をつけた値が
与えられる。陰影をつけたバーは、各試料より得られた
絶対シグナル（Ｓ）を表１．．　３個の試料からなる２
組（合計６個の試料）の平均として表されている。白抜
きのバーは、Ｃ型捕捉プローブを含有し７ないビーズ有
用いて、同一血清中で行われた同数の対照試料を表す。

この対照試料はプロッティング分析方式ではあり得ない
が、非特異的結合才たは偽陽性シグナルを与えうる各試
料画分のノイズ（Ｎ）を決定するために用いた。

各試料の特異的シグナルは、上で定義したＳおよびＮの
比として表すことができる。Ｓ／Ｎ比が１の場合、特異
的結合が全く存在しないことを示す。

陽性試料を示す最小のＳ／Ｎ比は、以下に考察する。

０．２ｐｇとｓｐｇとの間のＨＩＩＶ　ＤＮＡを含有す
る血清のＳ／Ｎ比は、３．９から４９スでに及んでいる
。プールされた正常ヒト血清中における血清４８２５お
よび血清３６５７の２倍希釈液および４倍希釈液につい
て行った分析では、各試料の絶対シグナルがほとんど一
次関数的に減少する結果となり、これは。

この方法の推定される特異的特徴を実証している。

異なるロフトのビーズおよび試薬有用い、すべての試料
について、極めて高い再現性がみられた。

試料は化学発光基質溶液を添加してわずか３０秒後に測
定したが、４５分までは同じ結果が得られた。

また、シグナルを長い間積分しても、Ｓ／Ｎ比は向上し
なかった。使用した血清は濁ったものから外観は清澄な
ものまであった。これらの血清は冷凍保存し、何度も凍
結および解凍を行った。ハイブリダイゼーシヲン分析を
行う前に、試料を清澄化することはしなかった。溶液ハ
イブリダイゼーションまたはビーズ捕捉の時間を増加さ
せても（１８時間まで）、Ｓ／Ｎ比の有意な向上は見ら
れなかった。

第７図は、サブピコグラムのＨＲＶ　ｒｌＮＡ試料の分
析を、既知の陰性血清およびプールされた血清中におけ
る多量の異種核酸の場合と比較したものである。用いた
陽性血清（上部のパネル；血清３６５７の１から１０倍
希釈液）の最低Ｓ値は、陰性血清（００９２）または非
ＨＲＶ　ＤＮＡ　（ＩＩＩＶ）の最高Ｓ値よりもわずか
に高いが、　ｐｇレベル以下で真陽性と偽陽性とを区別
する明確な境界は、絶対Ｓ値だけに基づいて得ることは
不可能である。Ｌ、かじ、これらの同一試料（下部パネ
ル）について、Ｓ／Ｎ比を比較すれば、　Ｓ／Ｎ−２，
５という境界値により明確な区別を行い得る。１．７よ
りも高い値を有する陰性試料は存在り、なかったが＋　
　０．２ｐｇの陽性試料の最小値はＳ／Ｎ＝４．３であ
った。これは明らかに、各試料に非特異的な結合対照物
有用いた場合の値を示している。

第８図では、ルミノール−ｐ−ヒドロキシ桂皮酸（相対
発光物質、Ｒ１，として与えられる）、および０−フェ
ニレンジアミン（ｏｐｎ）による検出有用い、　ＩＩＲ
Ｖ　ＤＮＡ陽性血清および陰性血清について行った分析
の比較を表すものである。この方法は感度で比較したが
、化学発光法は若干の理由で奸才しい。第１に、ビーズ
方式有用いた場合、最良の比色分析結果は、エッベルド
ルフ千１−ブ中でＯｅ口反応を行い、ビーズから散乱す
るとバックグラウンドノイズの顕著な源となりうるので
５溶液をマイクロタイター皿に移し、　■、ＩＳＡ測定
器で測定することにより得られた。これに対し、ビーズ
はルミノメータによる化学発光量の読み取りを妨げなか
った。第２に、化学発光法は、かなり迅速に実施できた
。ｏｐｎを添加した後、検出するまで３０分間待機して
いたのに対し、化学発光反応は９基質を添加して３０秒
後に直ちに測定することができた。

最後に、Ｒ１，およびｏｐｎ有用いた場合、Ｓ／Ｎ比は
１．５から２倍上昇し７た。

Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　ピリン配列ＲｅｒｇＳｔ
ｒｏｍ、Ｓ、　　ら。

ＰＮＡＳ　ｌｌ５Ａ　（１９８６）　８３：　３８９０
−３８９４　ニ基づイア、　１２個の増幅ｆｌＮＡｌＮ
−ブおよび３個の捕捉プローブ＠　、　Ｗａｒｎｅｒら
（前出）により記述されている自動ホスホアミダイト法
により合成した。精製は。

５ａｎｒ、ｈｅｚ−ＰｅｓｃａｄｏｒおよびＵｒｄｅａ
　（前出）に従って行った。これらプローブの５“部分
は、ピリン配列の部分に相補的であり、以下の通りであ
った：ＧＣＰ−１．１．＾２Ｃ−１ ＋’、ＣＰ−１．ＬＡ２ｃｍ２ ６ＣＰ−１，１，Ａ２Ｃ−３ ＧＣＰ−１，１，＾２Ｃ−５ ＧＣＰ−１，１，＾２Ｃ−６ ＧＣＰ−１、ＬＡ２Ｃ−７ ＧＣＰ−１，１，４２Ｃ−９ ＧＣＰ−１，１，Ａ２１’ニー１０ ０ＣＰ−Ｌｌ、Ａ２Ｃ−１１ ＧＣＰ−１，１，Ａ２０ｍ１３ ＧＣＰ−１，１，Ａ２Ｃ−１４ ＧＣＰ−１，１，Ａ２Ｃ−１５ ＡＴＡＣＴＴＡＴＧＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＣ（：Ｇ＾＾
＾ＴＧＧＧ＾ＧＣＴＣＧＡＣＴＡ（’、ＴＡＡＣＡＣＴ
ＡＧＣＧＡＴＡＧＣＡＧ（：ＣＡＡＡＣＣＧＣＡＡＴＣ
ＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＧＡＴＧＧ↑ＧＧＡＡ＾八
ＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＧＴＴＴＴＴＡＧＴＣＧＧＣＡＧ
ＣＴＣＡＴＡＡＴＧへＡＣＴＴＡＡＧＧＣＣＧＴＴＴＡ
ＣＣＧＧＴＴＴＧＴＴＧＴＧＡＡＧＡＣＧＧ（’：ｌ’
：ＧＣＡＣＣＧＴＡＧＧＧＧＡＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴ
ＧＣＣＩ’；ＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＣＧＡＡＡ
ＧＴＴＣＧＣＣＧＣＡＴＴＴＧＴ↑八ＣＴＡＡＴＧＴＴ
ＧＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＧＴＣＣ
へＣＡＣＴＡＴＧＣＧＣＧＴＧＩ’；ＣＴＧ（：ＴＧ（
：ＴＧＴＧＧＣ＾八ＣＧＧＣＴへＴＴＴＣＴＧＣＣＧＴ
ＴＴＣＴＴＴＡＧＣＴｌ’、ＴＧＧＴＴＣＧＴＣＧ　Ｇ
　ＣＡ　（’、↑↑ＧＧＡＣＧＧＣＧＣＴＡＴＴＣ［：
ＧＴＡＧＡＣＴ各増幅プローブの３゛部分は、上記２．
への直線状マルチマーに相補的になるように構築した。

各捕捉プローブの３゛部分は、上記３．Ｒの固相オリゴ
ヌクレオチド複合体のオリゴヌクレオチド配列に相補的
になるように構築した。

Ｎ、　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株、　Ｎ、ｎ＋ｅｎｉｎ　
１Ｈｄｉｔｉｓ株、およびＮｅ１ｓｓｅｒ＋ａの数種の
非病原性の共生株から単離された分析物ＤＮＡを、上記
３．Ｇに記述されている分析方式に従って、し［赳匹匝
ｅａｅ増幅プローブおよび捕捉プローブ有用いて試験し
た。これらの結果は以下の表に示す。

（以下余白） 捕１じシ辷二１ ＧＣＰ−ＸＴＩ−４ ＧＣＰ−ＸＴＩ−８ ＧＣＰ−ＸＴＩ−１２ ＧＡＴＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧＣＧＣＧＴＴＣ＾＾ＡＧＧ
ＣＴＴＣＧＧＡＧＧＣＴＧＴＡＧＴＴＴＣＣＧＴＴＴＡ
ＴＡＣＡＡＴＴＴＣＴＧ（：ＣＡＡＧＣ（：ＡＴＴＴＴ
ＡＣＣＡＡＧＡＣＧＣＣＴＧＴＣＧＧＮｅｌｓｓｅｒｉ
ａ種の分析シグナル応答試料　　　　　　　　　　　　
　Ｓ／Ｎ　”表に示した結果から明らかなように、　ム
紐並−ｒｒｈｏｅａｅおよびＬμ匹国１月叫工膓株から
のＯＮ＾だけが、これらの試験で陽性の（バックグラウ
ンドを越える）シグナルを示した。この分析は迅速であ
り（９６個の試料に対し約４時間）、そして３２Ｐに基
づくドツトプロット法と同様の感度を有する。

Ｎ＝ｗ赳■植匣（の１００個を越える臨床用単離物から
のＤＮＡを試験し、すべて検出された。

分子分析によると、焦」旦すエｒｈｏμじ工に見られる
ペニシリン耐性は、主として、３〜７Ｍｄａｌの非接合
プラスミドにおけるＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ遺伝子
の存在によるものである。（このプラスミドは、　Ｈ，
ｄｕｃｒｅｖｉ、　　ａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、お
よび場合によっては、　ＩＩ、　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ
に見られるプラスミドに対する相同性を有する。）従っ
て、ペニシリン耐性を決定することを目的として、プロ
ーブを調製し／Ｉ　Ｎ、　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　　（
または、相同性を有するプラスミドを持つ他の上記細菌
）におけるＴＥＭ−１ＤＮＡを検出した。ＴＩ！Ｍ−１
遺伝子を有する？、３ｋｂの届−ｎｏｒｒｈｎｅａｅプ
ラスミドは、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒＣ１ｏｎｉｎ　　：　　Ａ　　１．ａｈｏｒａｔｏｒ
　　Ｍａｎｕａｌ　　、Ｃｏ１ｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｈｏｒ　１．ａｈｏｒａｔｏｒｙ　（１９Ｂ２）に記
載されているように得た。このプラスミドをＲ，ｃｏｌ
ｉ　ＨＲＩＯＩに形質転換し、精製した。このプラスミ
ドをＲａｍＨＴで処理り、、　２３９０ｈｐ　現υ■断
片を精製し、そして部分的に配列決定した。１８１１ｈ
ｐのすべてを配列決定したところ、これはＴＥＭ−１の
構造遺伝子の８０％およびｐＨＰ＾３００ＤＮＡニ関連
スるし肚匡国肚堕関連子スミドからの１１８ｔｈｐの隣
接配列に対応していた。配列決定された部分は第９図に
示す。

増幅プローブおよび捕捉プローブを上述の方法により合
成し、そして精製した。増幅プローブの５°部分はコー
ド領域の配列に相補的であるのに対し、捕捉プローブの
５”部分はｐＨＰＡ３００の配列に相補的である。これ
らプローブの配列は第１０図に示す。

（以下余白） 増幅プローブおよび捕捉プローブは、　ＨＢＶプローブ
およびＮ、　　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対して用いた方
法と同様の方法有用いて調製した。両プローブの組はＴ
ＢＭ−１遺伝子に対するものである。これらプローブの
配列は第９図に示す。

上記３．Ｇの分析方式有用いて２種々の細菌からの粗細
胞溶解物を分析した。これら試験結果は以下に示す。ｒ
Ｔｌｌ’Ｍ−Ｉ　Ｊという名称は、　Ｔｆ！Ｍ−１遺伝
子だけに対するプローブ有用いた試験を表しており、　
　ｒＴＥＭ−ＩＮＪという名称は、それぞれＴＥＭ−１
遺伝子およびｐＨＰ＾３００配列に対するプローブ有用
いた試験を表している。

上述の試験および追加試験に基づいて、　Ｔ［！Ｍ−１
分析およびＴＥＭ−ＩＮＨＮ８分析細を以下に定義する
：（以下余白） 表２ ペニシリン耐性細菌のスクリーニング 動〃」虫佳Ｕ ＋ｎｆｌｕｅｎｚａｅ’ 違力空徂旦り山上■ Ｓｈｉ　ｅｌｌａ　ｓｏｎｎｅｉ Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＴＥＭ−１分析で陽性のペニシリン耐性生物：ベニシリ
ナーゼを生産する。　Ｎｅ１ｓａｅｒｉａ　　ｏｎｏｒ
ｒｈｏｅａｅ（ＰＰＮＧ）、　Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａ
ｅ、　４ｎｆｌｕｅｎｚａｅ主、」ヱ１リ−，Ｓ、５ｏ
ｎｎｅｉ、　Ｅ、　ｃｏ目。

ＴＥＭ−ＩＮＨＮ８分析性のペニシリン耐性生物：ＰＰ
ＮＨ，Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ、　Ｈ，ａｒａｉｎｆ
ｌｕｅｎｚａｅム」匹皿旦− ＴＥＭ−ＩＮ１分析で陰性のペニシリン耐性生物：Ｈ，
１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ、　４．　Ｓ、　５ｏｎｎｅｉ、
　Ｅ、　ｃｏｌｉ。

Ｂ、　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ非ＴＥＭ−１β−ラクタ
マーゼ。

ＴＥＭ−ＩＮＩＩ分析で陰性のペニシリン感受性生物：
このように、このＴＥＭ−１分析は、医師がペニシリン
耐性の感染菌を同定すること、および治療用の適当な抗
生物質を選択して治療の失敗を防止することを可能にす
る有力な臨床手段である。

増幅プローブおよび捕捉プローブの組は、　ＩＩＢＶプ
ローブおよびＴＥＭ−１プローブを調製するために用い
た方法と同じ方法有用いて調製し、そしてＣｈｌａ−ａ
＋ｙｄｉａのｐＣＨＬ２プラスミドにパイプリダイズす
るように設計した（ＰａｌｍｅｒおよびＰａｌｋｏｗ（
１９８６）Ｐｌａｓｍｉｄ１６：５２−６２）。この組
の各プローブは５０ｍｅｒである。

最初の３０個のヌクレオチド（５゛から３”方向）は。

ρＣＩＩＬ２配列に相補的であり、最後の２０個のヌク
レオチドは、　ＴＥＭ−１分析およびＴＥＭ−ＩＮＨＮ
８分析いた増幅配列および捕捉配列である。これらプロ
ーブに対するｐｃｌＩＬ２配列は以下に示す。

プ旦二１坐各務 噌ｊし］七ニズ ｐＣＨＬ２．ＣＬＬＡ２Ｃ−２ ｐＣ）ｌＬ２．ｃ　ＬＬＡ２Ｃ−３ ｐｃｔｌＬ２．ｃ　ＬＬＡ２Ｃ−４ ｐＣＨＬ２．ＣＬＬＡ２Ｃ−６ ｐＣ箸ＩＬ２．ｃ　ＬＬＡ２Ｃ〜７ ｐＣ肛２．ＣＬＬＡ２Ｃ−８ ｐｃｌＩＬ２．ｃ　ＬＬＡ２Ｃ−１０ ｐＣＨＬ２．ＣＬＬＡ２Ｃ−１１ 酊凰（３゛から５゛方向） ＣＴＡＣＴＡＡＡＣＴＣＧＣＡＣＡＣＡＴＣＧＣＧＡＣ
ＴＴＣＴＴＡＡＣＴｅＡＴＴＡＡＡＧＴ＾＾ＡＡＧＧＣ
ＧＡＧＣＡＡＡＴＴ八ＡＴＧＴＴＡＣＴＴＴＴＡＧＧＴ
ＡＡＣＧＣＡＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＣＡＣＧＡＴＡＴＣ
ＧＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡへＣＧＣＧＡＴＣ
ＴＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＴＡＴＡＡＧ
ＧＴＣＡＧＴＣＴＴＴＡＡＣＣＴＣＡＣＧＡＣＣＧＡＧ
ＣＡＴＡＴ＾ＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＡＣＧＧＡＡＧＧＧ
ＴＴＧＴＣＣＴＡＴＧＣＴＡＴＡＡＣＴＡＣＴＡＴＴＴ
ＣＣＴＣＡＡＴＡＧＡＡＴＣＧＡｐｃＨＬ２．ｃ　ＬＬ
Ａ２Ｃ−１２ ｐｃｌＩＬ２．ｃ　ＬＬＡ２Ｃ−１４ ρＣＨＬ２．ＣＬＬＡ２Ｃ−１５ ｐＣＨＬ２．ＣＬｌ、Ａ２Ｇ−１６ ｐＣＨＬ２．ＣＬＬＡ２Ｃ−１８ ｐｃＩＩＬ２．ｃ　ＬＬＡ２Ｃ−１９ 捕ルシ辷−ズ ｐｃＨＬ２．ｃＸＴｌ−１ ｐｃＨＬ２．ｃＸＴｌ−５ ｐｃＩＩＬ２．ｃＸＴｌ−９ ｐｃＩＩＬ２．ＣＸＴｌ−１３ ｐｃｌｌＬ２．ｃＸＴｌ−１７ ＣＣＡＴＴＡＡＡＧＣＡＣＴＡＡＴＡＴＣＧＴＣＧＡＴ
ＣＣＧＧＴＴＡＴＴＴＡＧＡＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＴ
ＴＧＴＣＧＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＧＡＴＡＧＡＧＡＴ
ＣＴＴＴＡＣＴＣＧＣＧＴＣＣＡＴＡＡＣＡＡＣＴＣＧ
ＣＣＴＡＡＴＡＡＣＧＡＴＴＡＡＡＴＴＧＴＡＧＡＴＴ
ＴＣＴＴＣＴＴＡＡＴＡＡＧＧＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴ
ＣＣＴＣＴＴＴＧＴＣＡＡＴＣＴＣＴＴＡＧＴＧＴＡＡ
ＡＡＡＴＡＴＴＣＧＡＡＴＣＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴ
ＡＴＧＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＴＣＧＣＡ
ＴＡＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＧＡＡＴＴＴＴＣＴＧＣＴＣ
ＧＴＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＴＣＴＴＡＧＴＴＴＡＴＣＣ
ＣＴＴＴＴＧＡＣＧＡＡＡＴＣＧＡＴＡＴＣＴＧＴＡＣ
ＴＡＴＡＧＡＣＣＡＣＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴＴＴＣＴＣ
ＣＣＣＴＡＢ、量　量　Ｓおよび 分析は、血液型亜型Ｌ８の単離された血小板（ＨＢ）に
ついて行なった。標準試料におけるＥＢの濃度は。

スライド上に１ｘｐａｓによる希釈液を塗布し、そして
５ｙｖａ　Ｍｉｃｒｏｔｒａｋ免疫蛍光キット有用いて
染色することにより測定した。顕微鏡で調べることによ
り、６つの任意の領域を計測し、　　１ＩＩｔ１！あた
りの全ＥＢを算出した。

他セジＡ堕に対する試料調製方法は、　ＨＢＶまたはＮ
ｅ１ｓｓｅｒｉａに対する方法とは異なったもの有用い
た。

２つの方法のうち一方有用いた？　１２．５μｌの（１
）リゾチーム（５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ）リス、
　ｐＨ８，ｏ。

１０＋ｗＭ　ＥＤＴＡ中ニ４［／ａｔ）、または（２）
　ｌ　Ｘ　ＰＨ３中の１０ｍＭ　ＤＴＴを、　１０μ２
の試料を含む各ウェルに加えた。６５℃にて３０分間イ
ンキエベートした後、１．２μｌの１０％ＳＯ３を加え
た。次いで、上述のように分析を行なった。捕捉段階の
前に、１０μ２のウマ血清を、ＮウェルおよびＳウェル
に加えた。また。

増幅段階および標識段階では、水の代りにウマ血清をＨ
ＭＩＩ街液中で用いた。アルカリボスフ１ターゼ／リン
酸ジオキセクン系を上述のように分析に用いた。結果は
以下の通りであった： （以下余白） 皿　　　　　　　２ノーＬと ３　Ｘ　１０’　　　　　　２２．６７＋／−１，６３
６ＸＩＯ’　　　　　　　５．３９＋／−０，１２３Ｘ
ＩＯ’　　　　　　　２．０７＋／−０，１１１，５ｘ
　１０’　　　　　　１．６３＋／−０，０３００，５
７÷／−０，０６ 本発明の分析は１種々の分析物を同時に多重分析するの
に適用し得る。ある方式では、新しい分析物に対して、
標識および標識プローブ配列、増幅マルチマー、そして
標識されたプローブの配列を変更することにより、同一
固相上の同一試料における２つの異なる分析物を検出す
ることが可能である。あるいは１分析物に特異的な捕捉
プローブを合成し、そしてメンブレン片上の異なる位置
に特異的な相補性のある捕捉プローブを付着させること
により、いくつかの異なる分析を同一標識有用いて同時
に行うことが可能である。

（以下余白） Ｎ、　　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのｔｅｔＭ’　　　　に
　　　　ン１６ｚ１ｇ／ａｌを越える旧Ｃ（最少阻害濃
度）値を示す高レベルのテトラサイクリンに耐性の１ｏ
ｎｏｒｒｈｏｅａｅ株は２４．５Ｍｄの接合型プラスミ
ド中にＬｅ　ＬＭ決定要因を取得したことがわかってい
る。

（＾ｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ＋ｅｖ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｈ％
ｏｌｏｇｙ　（１９８４）３８：１１１−１３３および
ａｎｄ　Ａｎｔｉ＋ｍ１ｃｒｏｈｅ　ＡｇｅｎｔＳＣｈ
ｅｍｏｔｈｅｒ。

（１９８６）　Ｖｏｌ　３０：６６４−６７０）、従っ
て、ある分析が開発されも１凹ｙ工恒徂肚−におけるｔ
ｅｔＭ決定要因を検出し７て臨床用試料におけるｔｅ　
ＬＭが仲介しているテトラサイクリン耐性を直接診断す
ることが可能となった。その検定は膨大な数の試料から
のｔｅｔＭの検出を可能にし７．その日のうちに結果を
与え、そして１５Ｘ１０’もの少数の細胞を検出するこ
とが可能である。

ＧＣ肉汁または脱脂乳中に懸濁した１ｏ／７ｒのテトラ
サイクリン耐性ＮＬ　ｖ胆卑工沖旦すエ（ＴＲＮＧ）細
胞を、澄んだイムロン■ウェル（グイナテック）中”？
！　１２．５　／７１．　（１）溶解溶液（１０ｓ＋Ｍ
　　）　’Ｊ　ス−ＨＣｌ、　１５０ｓＨＮａＣ１，１
１）＋＋Ｍ　ＲＤＴＡ、１χＳＯ３，ｐＨ８，０中の２
ｍｇ７ｄｌのプロティナーゼＫ）と混合し、６５°Ｃで
２０分間培養した。　増幅および捕捉プローブのセット
をＨＲＶおよびＴＩ’１Ｍ−１プローブを調製するため
に用いたものと同じ方策有用いて調製し、そしてｔｅｔ
Ｍ構造遺伝子にハイブリダイズするように設計した。プ
ローブの配列はＮｎｅｌｅｉｃ　Ａｃ％ｄｓ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　（１９８６）１４ニア０４７−７０５８．に
記述されているストレプトコツカル接合型シャトルトラ
ンスボゾンＴｎ１５４５からのｔｅｔＭ　　遺伝子配列
に基づいて行われた。　ｔｅｔＭ遺伝子の配列を捕捉プ
ローブ（＾）および増幅プローブ（Ｒ）の配列と共に第
１２図に示している。各々のプローブは、　（第１２図
に示したように）　ｔｅｔＭ遺伝子に相補的である最初
の３０ヌクレオチド（５”から３′へ）および捕捉プロ
ーブに対してＣＴＴＣＴＴＴＧＧ＾ＧＡＡＡＧＴＧＧＴ
Ｇおよび増幅プローブに対してＴＴＡＧＧＣＡＴＡＧＧ
ＡＣ（’：ＣＧＴＧＴＣである後の２０ヌクレオチド（
３°末端に伸びている）をもつ５０ｓ＋ｅｒである。

テスト手順は上述の３．Ｇのマイクロタイターディジ１
検定に僚でいる。各々０．２ｐＩｅの捕捉および標識プ
ローブを含んだ５　／７１．のｌ　Ｍ　ＮａＯＨを加え
。

そして、その混合物を６５℃で２０分間培養した。１３
１ｔＱ（Ｄ中和溶液（２Ｍ　ＭＯＰＳ、１２．３　Ｘ５
ＳＣ（Ｉ　Ｘ５ＳＣ＝０．１５　）Ｉ　ＮａＣ１，１５
＋ｗＭクエン酸ナトリウム））を加え、その混合物を６
５°Ｃで１５分間培養した。各々のウェルに１０／１１
．の加熱不活性ウマ血清を加え。

その溶液を混合し、あらかじめ捕捉プローブに相補的な
合成オリゴヌクレオチドで覆われたイムロンｌホワイト
ウェルに移した。そのウェルを６５℃で２時間培養した
後、その混合物をウェルから除き、捨てた。ウェルを０
．１χｓｏｓ、　ｏ、ｌ　Ｘ　ＳＳＣで２回洗浄した。

４０１ｔ１．の増幅マルチマー溶液（上述３、Ｇを参照
）を加え、ウェルを５５°Ｃで１５分間培養した。ウェ
ルを上述のように２回洗浄し、４０１ｔｌ。

のアルカリホスファターゼ標識したオリゴヌクレオチド
プローブ（上述３．Ｇを参照）を加えた。ウールを更に
５５℃で１５分間培養し、上述のように２回洗浄り、、
　０．Ｉ　Ｘ５ＳＣで２回洗浄した。検出をジオキセタ
ン化学発光基質（上述の３．Ｇを参照）有用いて行った
０発光をマイクロタ記録−デイフシ１記録発光計（グイ
ナテック）有用いることによりまたは３７°Ｃで１０分
間暗いチャンバー内でポラロイド５フインスタンド黒白
フイルムでウェルをさらすことにより記録し７た。ノイ
ズ比率（Ｓ／Ｎ）に対するシグナルは、緩衝液だけを含
んだウェルにより放射される光のカウントにより分けら
れたー試料を含んだウェルにより放射される光と定義す
る。

Ｓ／Ｎ　　比率が−≧、３であったとき、試料を陽性と
みなした。

比較のためにテトラサイクリン感受性（↑Ｃ“）株およ
びｔｅｔＭをもっこ七がわかっているコメンサル株もま
たテストした。下の表がそのテストの結果を表している
。

ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（Ｔｃ　） ｕｃｏｓａ ｍｕｃｏｓａ／ｐｅｒｆｌａｖａ ｐｅｒｆｌａｖａ／５ｉｃｃａ ｄｅｎｉｔｒｌｆｉｃａｎｓ コ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０表
に示したように、全ての１３２　ＴＲＮＧ株をｔｅｔＭ
ハイプリダイゼーシッン検定有用いてテストした。これ
らの株の全ては発光針またはインスタントフィルズで記
録したときは陽性を示した。Ｎ、ｎｕ＋ｒ、ｏｓａ　ｒ
のようなｔｅ　ＬＭをもつことが知られているコメンサ
ル株もまたこの検定で陽性であった。他方では。

テストした４５のＴｃ”株の内で陽性値を示したものは
なかった。

この検定をあらゆるｔｅｔＭ仲介のテトラサイクリン耐
性生物を検出することに用いることができる。

ｔｅｔＭ遺伝子および２４，５Ｍｄのプラスミドの両方
と結合する捕捉および増幅プローブを適当な取り合わせ
で設計することにより（上述のＴＥＭ−ＩＮＨ検定での
ように）２反応性をＴＲＮＧに限定することができる。

上述のＴＥＭ−１テストと共にｔｅｔＭテストを利用す
ることはＴＥＭ−１またはｔｅ　ＬＭ仲介の耐性が予期
される抗生物質耐性微生物をスクリーニングするために
要する時間を相当に減少させる。これらの手法は適当な
抗生物質の存在下での初期培養を２次培養する必要を除
去するものである。これらの検定は最小限の試料調製を
必要とし、　ｆ！１．ｕｓＡ法に似た非常に単純な操作
を包含する。Ｎ、　　ｖ郵ｙ工初旦ａｅ＝検定と組合せ
て、Ｎ、紐二匹眩ｅａｅおよび抗生物質耐性特性の検出
を数時間で行うことができる。

マイクロタイターウェルを含有する検定の全ての構成要
素は捕捉および増幅プローブを除いて一般的である（分
析物には依存しない。）結果として。

感染物質、および抗生物質耐性物に対する試料の同時分
析を同じく時間わく内で、そして同じ操作で、平行し７
て行うことができる。

により同定した。　５ＳＪＫＩのこのＤＮＡ配列を第１
３図に示す。

この配列を入手可能なりＮＡライブラリーに対して調べ
た。この配列は以前に報告されていなかった。この５Ｓ
ＪＫＩ配列に、基づいて、捕獲および増幅プローブを上
述の区分４のように合成した。配列の５゛部分を第１４
図に示す。

ａ配列の３゛部分は上述の↑ＥＭ−１検定で記述したそ
れらと同じであった（第１１図参照）。５１部分および
３゛部分の両方を第１４図に示す。上述の３゜Ｇの検定
型を粗細胞溶解物および異なる細菌からのゲノムＯＮ＾
を検定するために用いた。ｒｌＮＡ試料有用いたテスト
の結果を下に表にする。

Ｃ以下金白） Ｎ、　　Ｕ副と工初旦鮎−に対する高度な特異性をもつ
５ＳＪＫＩ　と名づけた新しいゲノム配列をＮ、　　［
肚■−ｈｏｅａｅ　　［ｌＮ＾およびＮ、メニンギチデ
ィスＤＮＡに対するゲノムクローンをスクリーニングし
、そして後者とではなく前者と反応した配列を選択する
ことＢｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｅａｒｒｈａｌｌｉ
ｓＮｅＬｓｓｅｒＬａ　　５Ｌｃｃａ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　　５ｕｂｆｌａｖａＮｅｉｓｓｅ
ｒｉａ　ｒｎｕｃｏ！ＩａＮｅｉｓｓｅｒｉａ　　ｌａ
ｃｔａｍｉｃａＮｅｉｓｓｅｒｉａ　　ｆｌａｖｅｓｃ
ｅｎｓＮｅｉｓｓｅｒｉａ　　ｃｉｎｅｒｅａ　　（＃
３コロ８３）１．１２ １．０日 １．０２ １．９４ １．０９ ２．２１ ２）　Ｙり夢し・ト鵠と七−１，１ヒ斗１ｂａ、Ｓ／Ｎ
＜３の試料を陰性と定義した。全ての陰性試料を１０ｔ
ｚｇのゲノムＯＮ＾有用いてテストした。

ｈ、Ｓ／Ｎ＞３の試料を陽性と定義１−、た。全ての陽
性試料を１１００ｔｔのゲノムｎＮ＾有用いてテストし
た。

Ｎ、１１ｇ３二ｈｏｅａｅに対する５ＳＪＫＩ配列の特
異性のために、完全な配列またはそれの断片に基づいた
プローブを他のロＮ＾ハイブリダイゼーシラン検定に用
いることができることが理解される。それゆえに、一般
に５ＳＪＫＩ配列に基づいたＤＮＡプローブは本発明の
範囲内であるということを意味する。

そのようなプローブは用いる特定のハイブリダイゼーシ
ョン検定型により、直接にまたは間接に標識することが
できる。

異種の核酸および試料構成要素の存在から観測された低
レベルの干渉のため、ここで提示した本発明方法は最小
限の試料調製で粗物質中の種々の生物の検出に有用であ
る。修飾されていない合成オリゴヌクレオチドである液
相ハイブリダイゼーションプローブを除けば、全ての検
定構成は一般的である（分析物配列は独立）；従って新
しい検定は新しいオリゴヌクレオチドのセットを必要と
する。原則として、提示した分析系の化学発光型は十分
に鋭敏であり、４時間以内に５ｔｔｇの哺乳動物ＩＮＮ
＾における単一の遺伝子検出を可能にする。

本発明を実施するための核酸化学、生化学検定。

および、それに関する分野の当業者には自明な上述の様
式の修飾は特許請求の範囲内にあることはいうまでもな
い。

（以下余白） （発明の要約） 本発明は、生化学的分析法における増幅物として有用な
直鎖状または分枝状のオリゴヌクレオチドマルチマーを
提供する。該増幅物は、（１）目的の一重鎖オリゴヌク
レオチド配列に相補的な少なくとも１つの第１の一重鎖
オリゴヌクレオチド単位と、（２）標識された一重鎖オ
リゴヌクレオチドに相補的な多数の第２の一重鎖オリゴ
ヌクレオチド単位とを有する。マルチマーを使用した増
幅サンドインチ核酸ハイブリダイゼーション法および免
疫分析法が例示されている。

４、゛　の　　なｉ゛口 第１図は、実施例１に記載されている直鎖状の核酸マル
チマーの酵素的調製の過程を図式的に表したものである
。

第２図Ａおよび第２図Ｂは、実施例２に記載されている
線形および分枝した核酸マルチマーの化学的調製の過程
を図式的に表したものである。

第３図（Ａ−Ｆ部分）では「＜シ状」および／または分
肢構造を有するマルチマーを作る際に用いる手法を説明
している。

第４図は実施例３に記載されているサンドイッチハイブ
リダイゼーション分析を図式的に表したものである。

第５図は、実施例に記載されているドツトプロットスク
リーニング試験の結果を示すオートラジオグラムである
。

第６〜８図は、実施例に記載されている真正のＨＢＶ　
ＤＮＡ標本の検査の結果を描写している棒グラフである
。

第９図は、ベータ〜ラクタマーゼＴＥＭ−１遺伝子を有
する７、３　ｋｂのＮ、　　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅプラ
スミドの１部分のコード鎖のＤＮＡ配列を示している。

第１０図は、実施例の第５節に記載されているＴｌ！Ｍ
ＩＮＨ分析に用いられる。捕捉および増幅プローブの部
分的なヌクレオチド配列を示す。

第１１図は、実施例の第５節に記載されているＴＢＭ−
１分析に用いられる捕捉および増幅プローブの部分的ヌ
クレオチド配列を示す。

第１２図は、実施例の第７節に記載されているｔｅ　ｔ
Ｍ分析に用いられる捕捉および増幅プローブの部分的ヌ
クレオチド配列（５゛末端）を示す。

第１３図は、実施例の第８節で述べている。Ｌｏｎｏｒ
ｒｈｏｅａｅのゲノム配列５ＳＪＫＩのＤＮＡ配列であ
る。

第１４図は、実施例の第８節に記載されているＬｏｎｏ
ｒｒｈｏｅａｅの分析に用いられる捕捉および増幅プロ
ーブの部分的ヌクレオチドを示す。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）目的の第１の一本鎖核酸配列と特異的に結合
   し得る少なくとも１つの第１の一本鎖オリゴヌクレオチ
   ド単位と、 （ｂ）目的の第２の一本鎖核酸配列と特異的に結合し得
   る多数の第２の一本鎖オリゴヌクレオチド単位と、 を含有する核酸マルチマー。 ２、前記第１のオリゴヌクレオチド単位が前記第２のオ
   リゴヌクレオチド単位とは異なる配列を有し、前記第２
   のオリゴヌクレオチド単位の数が前記第１のオリゴヌク
   レオチドヌクレオチド単位の数の少なくとも約２倍であ
   る、特許請求の範囲第１項に記載の核酸マルチマー。 ３、前記第１のオリゴヌクレオチド単位のヌクレオチド
   配列が前記第２のヌクレオチド単位のヌクレオチド配列
   と同一であり、両単位の合計数が少なくとも約３である
   、特許請求の範囲第１項に記載の核酸マルチマー。 ４、前記マルチマーが分枝状構造を有する、特許請求の
   範囲第１項、第２項または第３項に記載の核酸マルチマ
   ー。 ５、前記マルチマーのオリゴヌクレオチド単位の少なく
   とも一部が、次の式（１）で表される化合物から誘導さ
   れた多官能部分を介して結合している、特許請求の範囲
   第１項、第２項、第３項または第４項に記載の核酸マル
   チマー： ▲数式、化学式、表等があります▼（１） ここで、Ｒは有機部分、好ましくは核酸であり；Ｒ＾１
   は合成核酸が固相から遊離せず、かつ環外窒素が脱離し
   ないような条件下で脱離し得るヒドロキシル保護基、ま
   たはリン酸保護基であり；Ｘは核酸合成を促進するリン
   含有基であり；Ｙは求核基から誘導される基であり；そ
   して、Ｒ＾２はＲ＾１、またはＲ＾１に影響を及ぼすこ
   となく、脱離して水素と置換し得る阻害基または保護基
   である。 ６、前記マルチマーのオリゴヌクレオチド単位の少なく
   とも一部が、次の式（２）で表される化合物から誘導さ
   れた多官能部分を介して結合している、特許請求の範囲
   第１項、第２項、第３項または第４項に記載の核酸マル
   チマー： ▲数式、化学式、表等があります▼（２） ここで、Ｚは求核基であり；Ｒ＾１は一般に塩基に対し
   て安定であり、かつ酸に対して感受性を有する保護基で
   あり；Ｒ＾２は水素またはメチルであり；Ｒ＾３はＲ＾
   １に影響を及ぼすことなく、脱離して水素と置換し得る
   保護基であり；Ｒ＾５は化学合成の間にオリゴヌクレオ
   チドの５′部分にヌクレオチドを追加し得るリン誘導体
   であり；Ｒ＾６はメチル、 水素、Ｉ、Ｂｒ、またはＦであり；そして、Ｘは１〜８
   の範囲の整数である。 ７、目的の前記第１の一本鎖ヌクレオチド配列が核酸分
   析物である、特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、
   第４項、第５項または第６項に記載の核酸マルチマー。 ８、目的の前記第１の一本鎖ヌクレオチド配列が核酸分
   析物に結合しているオリゴヌクレオチドである、特許請
   求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項また
   は第６項に記載の核酸マルチマー。 ９、目的の前記第２の一本鎖ヌクレオチド配列が標識さ
   れた一本鎖オリゴヌクレオチド配列である、特許請求の
   範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項
   、第７項または第８項に記載の核酸マルチマー。 １０、前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチド単位の各々
   に、化学的に開裂可能なリンカーが存在する、特許請求
   の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６
   項、第７項または第８項に記載の核酸マルチマー。 １１、以下の工程を包含する核酸ハイブリダイゼーショ
   ン分析法： （ａ）特許請求の範囲第９項に記載のマルチマーを、固
   相に結合した一本鎖核酸分析物と、あるいは該分析物に
   結合した一本鎖オリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌ
   クレオチド単位を介してハイブリダイズさせる工程； （ｂ）結合していないマルチマーを除去する工程； （ｃ）標識された一本鎖オリゴヌクレオチドを、第２の
   オリゴヌクレオチド単位を介して、該マルチマーとハイ
   ブリダイズさせる工程； （ｄ）結合していない標識されたオリゴヌクレオチドを
   除去する工程；および （ｅ）該マルチマーに結合した標識の存在を検出する工
   程。 １２、第２の核酸配列を含む核酸セグメントと、第１の
   核酸配列を含むが、該第２の核酸配列は含まない別の核
   酸セグメントとを含有する試料中の、該第２の核酸配列
   を含む該核酸セグメントの一部である該第１の核酸配列
   を検出するための溶液サンドイッチ核酸ハイブリダイゼ
   ーション分析法であって、該分析法は以下の工程を包含
   する： （ａ）分析物を、ハイブリダイゼーション条件下で、（
   ｉ）該第１の核酸配列または該第２の核酸配列の一方に
   相補的な第１のセグメントと、核酸マルチマーのオリゴ
   ヌクレオチド単位に相補的な第２のセグメントとを含有
   する増幅プローブオリゴヌクレオチド、および（ｉｉ）
   該第１の核酸配列または該第２の核酸配列の他方に相補
   的な第１のセグメントと、固相に結合したオリゴヌクレ
   オチドに相補的な第２のセグメントとを含有する捕捉プ
   ローブオリゴヌクレオチドの過剰量と接触させる工程； （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ａ）の
   産物を、該固相に結合した該オリゴヌクレオチドと接触
   させる工程； （ｃ）その後、該固相に結合していない物質を分離する
   工程； （ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｃ）の
   固相複合体産物を、（ｉ）該増幅プローブオリゴヌクレ
   オチドの該第２のセグメントに相補的な少なくとも１つ
   のオリゴヌクレオチド単位および（ｉｉ）標識されたオ
   リゴヌクレオチドに相補的な多数の第２のオリゴヌクレ
   オチド単位を有する該核酸マルチマーと接触させる工程
   ； （ｅ）結合していないマルチマーを除去する工程； （ｆ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｅ）の
   固相複合体産物を、該標識されたオリゴヌクレオチドと
   接触させる工程； （ｇ）結合していない標識されたオリゴヌクレオチドを
   除去する工程；および （ｈ）工程の固相複合体産物中における標識の存在を検
   出する工程。 １３、免疫化学的な分析物に対する免疫分析法であって
   、該免疫分析法は以下の工程を包含する： （ａ）該分析物にリガンドを、特異的に、かつ直接的に
   または間接的に結合させる工程であって、該リガンドが
   特許請求の範囲第１項に記載のマルチマーの第１のオリ
   ゴヌクレオチド単位に相補的な一本領オリゴヌクレオチ
   ドを有する、工程； （ｂ）結合していないリガンドを除去する工程； （ｃ）特許請求の範囲第１項記載のマルチマーを該リガ
   ンドにハイブリダイズさせる工程； （ｄ）標識されたオリゴヌクレオチドを、結合したマル
   チマーの第２のオリゴヌクレオチド単位にハイブリダイ
   ズさせる工程； （ｅ）結合していない標識されたオリゴヌクレオチドを
   除去する工程；および （ｆ）該結合したマルチマーに結合した標識の存在を検
   出する工程。 １４、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＲＶ）ＤＮＡのサンドイッ
   チハイブリダイゼーション分析法における増幅プローブ
   として有用な合成オリゴヌクレオチドであって、 （ａ）該ＨＲＶゲノムの保存領域のセグメントに相補的
   なヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、 （ｂ）核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補
   的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメントと、 を含有する合成ヌクレオチド。 １５、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＲＶ）ＤＮＡのサンドイッ
   チハイブリダイゼーション分析法における捕捉プローブ
   として有用な合成オリゴヌクレオチドであって、 （ａ）該ＨＲＶゲノムの保存領域のセグメントに相補的
   なヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、 （ｂ）固相に結合したオリゴヌクレオチドに相補的なヌ
   クレオチド配列を有する第２のセグメントと、 を含有する合成ヌクレオチド。 １６、￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥のサンドイ
   ッチハイブリダイゼーション分析法における増幅プロー
   ブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、 （ａ）￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥のピリンＤ
   ＮＡのセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する
   第１のセグメントと、 （ｂ）核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補
   的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメントと、 を含有する合成ヌクレオチド。 １７、￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥のサンドイ
   ッチハイブリダイゼーション分析法における捕捉プロー
   ブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって、 （ａ）￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥のピリンＤ
   ＮＡのセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する
   第１のセグメントと、 （ｂ）固相に結合したオリゴヌクレオチドに相補的なヌ
   クレオチド配列を有する第２のセグメントと、 を含有する合成ヌクレオチド。 １８、￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥の溶液相サ
   ンドイッチハイブリダイゼーション分析法における増幅
   プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって
   、 （ａ）第１３図に示される￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏ
   ｅａｅ￥のゲノムクローンのセグメントに相補的なヌク
   レオチド配列を有する第１のセグメントと、 （ｂ）核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補
   的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメントと、 を含有する合成ヌクレオチド。 １９、￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥の溶液相サ
   ンドイッチハイブリダイゼーション分析法における捕捉
   プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドであって
   、 （ａ）第１３図に示される￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏ
   ｅａｅ￥のゲノムクローンのセグメントに相補的なヌク
   レオチド配列を有する第１のセグメントと、 （ｂ）固相に結合したオリゴヌクレオチドに相補的なヌ
   クレオチド配列を有する第２のセグメントと、 を含有する合成ヌクレオチド。 ２０、β−ラクタマーゼＴＥＭ−１遺伝子を有する￥Ｎ
   ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥の７．３ｋｂプラスミ
   ドまたは該遺伝子のサンドイッチハイブリダイゼーショ
   ン分析法における増幅プローブとして有用な合成オリゴ
   ヌクレオチドであって、 （ａ）該プラスミドまたは該遺伝子のセグメントに相補
   的なヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、 （ｂ）核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補
   的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメントと、 を含有する合成ヌクレオチド。 ２１、β−ラクタマーゼＴＥＭ−１遺伝子を有する￥Ｎ
   ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥科の７．３ｋｂプラス
   ミドまたは該遺伝子のサンドイッチハイブリダイゼーシ
   ョン分析法における捕捉プローブとして有用な合成オリ
   ゴヌクレオチドであって、 （ａ）該プラスミドまたは該遺伝子のセグメントに相補
   的なヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、 （ｂ）固相に結合したオリゴヌクレオチドに相補的なヌ
   クレオチド配列を有する第２のセグメントと、 を含有する合成ヌクレオチド。 ２２、テトラサイクリン耐性生物におけるｔｅｔＭ遺伝
   子のサンドイッチハイブリダイゼーション分析法におけ
   る捕捉プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドで
   あって、 （ａ）該ｔｅｔＭ遺伝子のセグメントに相補的なヌクレ
   オチド配列を有する第１のセグメントと、 （ｂ）固相に結合したオリゴヌクレオチド単位に相補的
   なヌクレオチド配列を有する第２のセグメントと、 を含有する合成ヌクレオチド。 ２３、テトラサイクリン耐性生物におけるｔｅｔＭ遺伝
   子のサンドイッチハイブリダイゼーション分析法におけ
   る増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドで
   あって、 （ａ）該ｔｅｔＭ遺伝子のセグメントに相補的なヌクレ
   オチド配列を有する第１のセグメントと、 （ｂ）核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補
   的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメントと、 を含有する合成ヌクレオチド。 ２４、￥Ｃｈｌａｍｙｄｉａ￥￥ｔｒａｃｈｏｍａｔｉ
   ｓ￥のサンドイッチハイブリダイゼーション分析法にお
   ける増幅プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチド
   であって、 （ａ）該￥Ｃｈｌａｍｙｄｉａ￥￥ｔｒａｃｈｏｍａｔ
   ｉｓ￥のｐＣＨＬ２プラスミドのセグメントに相補的な
   ヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、 （ｂ）核酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補
   的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメントと、 を含有する合成ヌクレオチド。 ２５、￥Ｃｈｌａｍｙｄｉａ￥￥ｔｒａｃｈｏｍａｔｉ
   ｓ￥のサンドイッチハイブリダイゼーション分析法にお
   ける捕捉プローブとして有用な合成オリゴヌクレオチド
   であって、 （ａ）該￥Ｃｈｌａｍｙｄｉａ￥￥ｔｒａｃｈｏｍａｔ
   ｉｓ￥のｐＣＨＬ２プラスミドのセグメントに相補的な
   ヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、 （ｂ）固相に結合したオリゴヌクレオチドに相補的なヌ
   クレオチド配列を有する第２のセグメントと、 を含有する合成ヌクレオチド。 ２６、￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥のＤＮＡを
   検出するためのＤＮＡプローブであって、 第１３図に示される該￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ
   ｅ￥のゲノムクローンのいずれかの鎖の全体または一部
   に相補的なヌクレオチド配列を有する、ＤＮＡプローブ
   。 ２７、分析物中における￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅ
   ａｅ￥のピリンＤＮＡを検出するための溶液サンドイッ
   チＤＮＡハイブリダイゼーション分析法であって、該分
   析法は以下の工程を包含する： （ａ）該分析物を、ハイブリダイゼーション条件下で、
   （ｉ）￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥のピリンＤ
   ＮＡのセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する
   第１のセグメントと、核酸マルチマーのオリゴヌクレオ
   チド単位に相補的なヌクレオチド配列を有する第２のセ
   グメントとを含有する増幅プローブオリゴヌクレオチド
   、および（ｉｉ）￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥
   のピリンＤＮＡのセグメントに相補的なヌクレオチド配
   列を有する第１のセグメントと、固相に結合したオリゴ
   ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を有する第２
   のセグメントとを含有する捕捉プローブオリゴヌクレオ
   チドの過剰量と接触させる工程； （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ａ）の
   産物を、該固相に結合した該オリゴヌクレオチドと接触
   させる工程； （ｃ）その後、該固相に結合しない物質を分離する工程
   ； （ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｃ）の
   固相複合体産物を、（ｉ）該増幅プローブオリゴヌクレ
   オチドの該第２のセグメントに相補的な少なくとも１つ
   のオリゴヌクレオチド単位、および（ｉｉ）標識された
   オリゴヌクレオチドに相補的な多数の第２のオリゴヌク
   レオチド単位を含有する該核酸マルチマーと接触させる
   工程； （ｅ）結合していないマルチマーを除去する工程；（ｆ
   ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｅ）の固相
   複合体産物を、該標識されたオリゴヌクレオチドと接触
   させる工程； （ｇ）結合していない標識されたオリゴヌクレオチドを
   除去する工程；および （ｈ）工程（ｇ）の固相複合体産物中における標識の存
   在を検出する工程。 ２８、分析物中における￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅ
   ａｅ￥のピリンＤＮＡを検出するための溶液サンドイッ
   チＤＮＡハイブリダイゼーション分析法であって、該分
   析法は以下の工程を包含する： （ａ）該分析物を、ハイブリダイゼーション条件下で、
   （ｉ）第１３図に示される￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏ
   ｅａｅ￥のゲノムクローンのセグメントに相補的なヌク
   レオチド配列を有する第１のセグメントと、核酸マルチ
   マーのオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌクレオチド
   配列を有する第２のセグメントとを含有する増幅プロー
   ブオリゴヌクレオチド、および（ｉｉ）第１３図に示さ
   れる￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥のゲノムクロ
   ーンのセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する
   第１のセグメントと、固相に結合したオリゴヌクレオチ
   ドに相補的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメン
   トとを含有する捕捉プローブオリゴヌクレオチドの過剰
   量と接触させる工程； （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ａ）の
   産物を、該固相に結合した該オリゴヌクレオチドと接触
   させる工程； （ｃ）その後、該固相に結合しない物質を分離する工程
   ； （ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｃ）の
   固相複合体産物を、（ｉ）該増幅プローブオリゴヌクレ
   オチドの該第２のセグメントに相補的な少なくとも１つ
   のオリゴヌクレオチド単位、および（ｉｉ）標識された
   オリゴヌクレオチドに相補的な多数の第２のオリゴヌク
   レオチド単位を含有する該核酸マルチマーと接触させる
   工程； （ｅ）結合していないマルチマーを除去する工程； （ｆ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｅ）の
   固相複合体産物を、該標識されたオリゴヌクレオチドと
   接触させる工程； （ｇ）結合していない標識されたオリゴヌクレオチドを
   除去する工程；および （ｈ）工程（ｇ）の固相複合体産物中における標識の存
   在を検出する工程。 ２９、分析物中におけるβ−ラクタマーゼＴＥＭ−１遺
   伝子を有する￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥科の
   ７．３ｋｂプラスミドまたは該遺伝子を検出するための
   溶液サンドイッチＤＮＡハイブリダイゼーション分析法
   であって、該分析法は以下の工程を包含する： （ａ）該分析物を、ハイブリダイゼーション条件下で、
   （ｉ）該プラスミドまたは該遺伝子のセグメントに相補
   的なヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、核
   酸マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌク
   レオチド配列を有する第２のセグメントとを含有する増
   幅プローブオリゴヌクレオチド、および（ｉｉ）該プラ
   スミドまたは該遺伝子の別のセグメントに相補的なヌク
   レオチド配列を有する第１のセグメントと、固相に結合
   したオリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を
   有する第２のセグメントとを含有する捕捉プローブオリ
   ゴヌクレオチドの過剰量と接触させる工程； （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ａ）の
   産物を、該固相に結合した該オリゴヌクレオチドと接触
   させる工程； （ｃ）その後、該固相に結合しない物質を分離する工程
   ； （ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｃ）の
   固相複合体産物を、（ｉ）該増幅プローブオリゴヌクレ
   オチドの該第２のセグメントに相補的な少なくとも１つ
   のオリゴヌクレオチド単位、および（ｉｉ）標識された
   オリゴヌクレオチドに相補的な多数の第２のオリゴヌク
   レオチド単位を含有する該核酸マルチマーと接触させる
   工程； （ｅ）結合していないマルチマーを除去する工程； （ｆ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｅ）の
   固相複合体産物を、該標識されたオリゴヌクレオチドと
   接触させる工程； （ｇ）結合していない標識されたオリゴヌクレオチドを
   除去する工程；および （ｈ）工程（ｇ）の固相複合体産物中における標識の存
   在を検出する工程。 ３０、分析物中におけるＢ型肝炎ウィルス（ＨＲＶ）の
   ＤＮＡを検出するための溶液サンドイッチＤＮＡハイブ
   リダイゼーション分析法であって、該分析法は以下の工
   程を包含する： （ａ）該分析物を、ハイブリダイゼーション条件下で、
   （ｉ）該ＨＲＶゲノムの保存領域のセグメントに相補的
   なヌクレオチド配列を有する第１のセグメントと、核酸
   マルチマーのオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌクレ
   オチド配列を有する第２のセグメントとを含有する増幅
   プローブオリゴヌクレオチド、および（ｉｉ）該ＨＲＶ
   ゲノムの保存領域の別のセグメントに相補的なヌクレオ
   チド配列を有する第１のセグメントと、固相に結合した
   オリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を有す
   る第２のセグメントとを含有する捕捉プローブオリゴヌ
   クレオチドの過剰量と接触させる工程； （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ａ）の
   産物を、該固相に結合した該オリゴヌクレオチドと接触
   させる工程； （ｃ）その後、該固相に結合しない物質を分離する工程
   ； （ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｃ）の
   固相複合体産物を、（ｉ）該増幅プローブオリゴヌクレ
   オチドの該第２のセグメントに相補的な少なくとも１つ
   のオリゴヌクレオチド単位、および（ｉｉ）標識された
   オリゴヌクレオチドに相補的な多数の第２のオリゴヌク
   レオチド単位を含有する該核酸マルチマーと接触させる
   工程； （ｅ）結合していないマルチマーを除去する工程； （ｆ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｅ）の
   固相複合体産物を、該標識されたオリゴヌクレオチドと
   接触させる工程； （ｇ）結合していない標識されたオリゴヌクレオチドを
   除去する工程；および （ｈ）工程（ｇ）の固相複合体産物中における標識の存
   在を検出する工程。 ３１、分析物中における￥Ｃｈｌａｍｙｄｉａ￥￥ｔｒ
   ａｃｈｏｍａｔｉｓ￥のＤＮＡを検出するための溶液サ
   ンドイッチＤＮＡハイブリダイゼーション分析法であっ
   て、該分析法は以下の工程を包含する： （ａ）該分析物を、ハイブリダイゼーション条件下で、
   （ｉ）￥Ｃｈｌａｍｙｄｉａ￥￥ｔｒａｃｈｏｍａｔｉ
   ｓ￥のｐＣＨＬ２プラスミドのセグメントに相補的なヌ
   クレオチド配列を有する第１のセグメントと、核酸マル
   チマーのオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌクレオチ
   ド配列を有する第２のセグメントとを含有する増幅プロ
   ーブオリゴヌクレオチド、および（ｉｉ）￥Ｃｈｌａ−
   ￥￥ｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ￥のｐＣＨＬ２
   プラスミドの別のセグメントに相補的なヌクレオチド配
   列を有する第１のセグメントと、固相に結合したオリゴ
   ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含有する第
   ２のセグメントとを有する捕捉プローブオリゴヌクレオ
   チド過剰量と接触させる工程； （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ａ）の
   産物を、該固相に結合した該オリゴヌクレオチドと接触
   させる工程； （ｃ）その後、該固相に結合しない物質を分離する工程
   ； （ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｃ）の
   固相複合体産物を、（ｉ）該増幅プローブオリゴヌクレ
   オチドの該第２のセグメントに相補的な少なくとも１つ
   のオリゴヌクレオチド単位、および（ｉｉ）標識された
   オリゴヌクレオチドに相補的な多数の第２のオリゴヌク
   レオチド単位を含有する該核酸マルチマーと接触させる
   工程； （ｅ）結合していないマルチマーを除去する工程； （ｆ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｅ）の
   固相複合体産物を、該標識されたオリゴヌクレオチドと
   接触させる工程； （ｇ）結合していない標識されたオリゴヌクレオチドを
   除去する工程；および （ｈ）工程（ｇ）の固相複合体産物中における標識の存
   在を検出する工程。 ３２、テトラサイクリン耐性生物のＤＮＡを含むと思わ
   れるｔｅｔＭ遺伝子ＤＮＡを検出するための溶液サンド
   イッチＤＮＡハイブリダイゼーション分析法であって、
   該分析法は以下の工程を包含する： （ａ）該分析物を、ハイブリダイゼーション条件下で、
   （ｉ）該ｔｅｔＭ遺伝子のセグメントに相補的なヌクレ
   オチド配列を有する第１のセグメントと、核酸マルチマ
   ーのオリゴヌクレオチド単位に相補的なヌクレオチド配
   列を有する第２のセグメントとを含有する増幅プローブ
   オリゴヌクレオチド、および（ｉｉ）該ｔｅｔＭ遺伝子
   の別のセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する
   第１のセグメントと、固相に結合したオリゴヌクレオチ
   ドに相補的なヌクレオチド配列を有する第２のセグメン
   トとを含有する捕捉プローブオリゴヌクレオチドの過剰
   量と接触させる工程； （ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ａ）の
   産物を、該固相に結合した該オリゴヌクレオチドと接触
   させる工程； （ｃ）その後、該固相に結合しない物質を分離する工程
   ； （ｄ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｃ）の
   固相複合体産物を、（ｉ）該増幅プローブオリゴヌクレ
   オチドの該第２のセグメントに相補的な少なくとも１つ
   のオリゴヌクレオチド単位、および（ｉｉ）標識された
   オリゴヌクレオチドに相補的な多数の第２のオリゴヌク
   レオチド単位を含有する該核酸マルチマーと接触させる
   工程； （ｅ）結合していないマルチマーを除去する工程； （ｆ）ハイブリダイゼーション条件下で、工程（ｅ）の
   固相複合体産物を、該標識されたオリゴヌクレオチドと
   接触させる工程； （ｇ）結合していない標識されたオリゴヌクレオチドを
   除去する工程；および （ｈ）工程（ｇ）の固相複合体産物中における標識の存
   在を検出する工程。 ３３、分析物中における￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅ
   ａｅ￥のＤＮＡを検出するためのＤＮＡハイブリダイゼ
   ーション分析法であって、 該分析物を、ハイブリダイゼーション条件下で、第１３
   図に示される￥Ｎ．￥￥ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ￥のゲ
   ノムクローンのいずれかの鎖の全体または一部に相補的
   なＤＮＡプローブと接触させる工程と、 該ＤＮＡプローブを含む二本鎖の存在を検出する工程と
   、 を包含する分析法。