JPH0198474A - 高度好塩性メタン生成細菌 - Google Patents

高度好塩性メタン生成細菌

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JPH0198474A
JPH0198474A JP62255995A JP25599587A JPH0198474A JP H0198474 A JPH0198474 A JP H0198474A JP 62255995 A JP62255995 A JP 62255995A JP 25599587 A JP25599587 A JP 25599587A JP H0198474 A JPH0198474 A JP H0198474A
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弘毅 掘越
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    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215Microorganisms
    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、高度好塩性メタン生成細菌に関し、さらに詳
しくは、塩化ナトリウム濃度約2.5M〜3.0Mに生
育至適範囲を有するハロメタノコッカス・アルカリフィ
ルムに関する。
〔従来の技術〕
従来、好塩性のメタン生成細菌としては例えば塩化す)
 IJウム1〜2Mに至適条件を有するもの〔アプライ
ド アンド エンバイロンメンタルマイクロバイオロジ
ー(八pplied and Environment
alMicrobiology) Vol、 5 Q、
 No、4.  p877〜881゜1985)塩化ナ
トリウム濃度1.2〜1.5Mに至適条件を有するもの
〔マイクロバイオロジー(!Jicrobiology
(U、S、S、R,))Vol、52 、1) 290
〜297,1983)塩化ナトリウム2.1Mに至適条
件を有するもの〔アプライド アンド エンバイロンメ
ンタル マイクロバイオロジー(^pplied an
d Environmental Microbiol
ogy) Vol。
50、Nα1.p140〜143.1985)が知られ
ている。しかるにこれらは何れも好塩性ではあるが、生
育至適条件の塩化ナトリウム濃度が2.1M以下であり
、中度好塩性のメタン生成細菌であった。
〔発明が解決しようとする問題点〕
そこで本発明者らは、上記メタン生成細菌よりさらに高
い塩化す) IJウム濃度に生育至適条件を有するメタ
ン生成細菌を見出すべく研究を重ねた。
〔問題点を解決するための手段〕
その結果、本発明者らは、塩化す) IJウム濃度約2
.5M〜約3.0Mに生育至適範囲を有するハロメタノ
コッカス・アルカリフィルムを見出し、本発明を完成し
た。
本発明のハロメタノコッカス・アルカリフィルムは、生
育至適pH範囲がpH約8.0〜約8.5にあるものN
Y−218[:微工研菌寄第9641号〕とpH約7.
5〜約8.0にあるものNY−844〔微工研菌寄第9
642号〕とに分けることができる。
以下本発明のハロメタノコッカス・アルカリフィルムを
入手するための手段(スクリーニング法等)について説
明する。
(1)スクリーニング 本発明においては、特願昭61−191541及び実願
昭61−125086に記載の嫌気性菌分離法に基いて
、メタン生成細菌のスクリーニングを行った。具体的に
は、まず特殊環境の土壌(強アルカリ、高塩濃度等)を
探索し、目的とする特殊環境条件の土壌を採取する。次
に特願昭61−191541に示すものを基本とした前
処理用の希釈液を用いて、迅やかに採取した微生物に必
要な嫌気条件、低酸化還元電位条件等を実現する。次い
で、サンプリングした土壌の諸条件(p H、塩濃度等
)を考慮して、希釈溶液を調整し、当該土壌を迅速に該
希釈溶液に懸濁させる。
得られた懸濁液は、実願昭61−125086に示す容
器を用いて個性嫌気性菌であるメタン生成菌が死滅しな
いように維持するとともに、対象とする特殊環境メタン
生成細菌が死滅しないように維持する形で移送する。移
送したサンプルは分離培養用サンプルとして供した。
また、スクリーニング源とする土壌については国内外の
特殊環境土壌について広く探索を行なった。
(2)分離培養 分離培養用の培地としては、本発明者らが独自に開発し
た分離培地を用いた。用いた分離培地の組成を第1表に
示す。また同組成中に示した微量元素溶液とビタミン溶
液の組成は、それぞれ第2表、第3表に示す。第2表に
示す微量元素溶液については、当該微生物の微量元素要
求性が不明確であることから、同溶液中の微量元素の種
類、遣を強化した独自の組成のものを用いた。
培地中の基質としては、第1表に示す通りギ酸ナトリウ
ム、酢酸ナトリウム、メタノール、メチルアミンをそれ
ぞれ独立して0.5〜1.0%の濃度とした。培養開始
時の培地のpHの調製には重炭酸ナトリウムを用いた。
また、メタン生成細菌は古細菌であり、細胞壁にペプチ
ドグリカンを持たないのでペプチドグリカン合成阻害剤
に感受性がなく、またリボゾームは?O3型にもかかわ
らす原核細胞型の7OSリボゾーム系をもつ細菌に有効
なタンパク合成阻害剤にも感受性がない。そこで、分離
培養の際には非メタン生成細菌の生育のみを抑える抗生
物質を培地中に加えることを基本とし、目的とするメタ
ン生成細菌のより効率的な分離を実施した。具体的には
第1表に示すように細胞壁のペプチドグリカン合成阻害
剤であるバンコマイシン、原核細胞型の7O3’Jボゾ
ーム系を有する細菌に有効なタンパク合成阻害剤である
カナマイシン等を使用した。
培養時の気相については、N2/CO2混合ガス(80
/20)、N2/CO2混合ガス(80/20)、N2
 ガスの3種類のガスを脱酸素処理をした上で用いた。
液体培地、寒天培地の何れの培地による培養時において
も、同ガスを2気圧陽圧の形で培養容器内に充てんして
、加圧培養を行なった。また、静置培養および暗所にお
ける培養を基本とした。
また分離培養時の他の条件としてp H6,5〜9.0
、温度10〜60℃、塩化ナトリウム濃度1〜4Mの各
範囲で広く特殊環境メタン生成細菌の探索を実施した。
分離培養条件として塩化ナトリウム濃度1〜4Mで分離
培養を行なう際には、当該微生物の各塩濃度における、
マグネシウム、カリウム等の要求性が不明確であること
から、第1表に示す範囲で塩化マグネシウム、塩化カリ
ウムの濃度を変化させて分離培地を調製した。
(3)目的微生物の確認 目的とする特殊環境メタン生成細菌の確りは、以下のよ
うに実施した。pH1塩化ナトリウム濃度、基質等の条
件を変化させ、さらに古細菌であるメタン生成細菌のみ
を分離するために前述の細胞壁のペプチドグリカン合成
阻害剤、原核細胞型の7 OS IJボゾーム系を有す
る細菌に有効なタンパク合成阻害Mの抗生物質を加えた
培地を用いて、所望の培養温度で前述の分離培養法にし
たがい培養を開始する。この方法により分離培養を行な
い、微生物の生育が認められるとすれば、培地の条件等
から判断すれば、以下のものが予想される。
■ 目的とするメタン生成細菌 ■ メタン生成細菌以外の抗生物質耐性の個性嫌気性菌 ■ メタン生成細菌以外の個性嫌気性あるいは耐嫌気条
件の古細菌 これらのうちから目的とするメタン生成菌のみを識別す
る方法として次の2法を基本とした。まず第1に、培養
容器内のヘッドスペースのガスをガスクロマトグラフ等
で分析し、メタンガスの生成を確認する。メタンガスを
生成する微生物がメタン生成細菌である。次に、生育し
た微生物を螢光顕微鏡で検鏡する。メタン生成細菌は、
同細菌に固有のファクターF42゜を有し、長波長紫外
線を当てると、同ファクター由来の青緑色の螢光を発す
るので、螢光顕微鏡での検鏡時にはこの螢光の有無でメ
タン生成細菌か非メタン生成細菌かが確認される。(非
メタン生成細菌でも螢光を発するものがあるが、この場
合には黄白色、青白色等なのでメタン生成細菌固有の螢
光とは区別できる。)以上の方法を用いて、稀釈法、寒
天平板法等で純化をくり返し、目的とするメタン生成細
菌のみを単離する。
第 1 表  培地組成(培地11当り)第 1 表(
続き) 注−1)基質については何れかひとつのみを使用 注−2)pH調製は重炭酸ナトリウム使用性−3)同表
は精製水を用いて、培地11を調製する際の各組成の含
有量を示す 第 2 表 微量元素溶液組成(溶液1!当り)注−1
)同表は精製水を用いて溶液11を調製する際の各組成
の含有量を示す。
第 3 表  ビタミン溶液組成 注−1)同表は精製水を用いて溶液1flを調製する際
の各組成の含有量を示す。
(4)  目的とする微生物の取得 本発明者らは、前述の方法により、広く国内外の特殊環
境土壌を対象に目的とするメタン生成細菌の分離を試み
た。その結果、米国西部地区の高塩環境土壌から多数の
好塩性あるいは好塩性かつ好アルカリ性のメタン生成細
菌を分離した。
これらのメタン生成細菌を培養し検討した。その結果、
生育至適pHの異なる2種類の高度好塩性のメタン生成
細菌を単離した。同微生物はいずれも少なくとも塩化ナ
トリウム濃度約IM〜約4Mめ広範囲で生育し、生育至
適条件を約2,5〜3Mに有し、メタンガス生成活性も
良好であることから高度好塩性であることが確認された
本発明の第1のメタン生成細菌NY−218は、少なく
ともpH7,0〜9.0の広範囲で生育し、pH8,0
〜8.5に生育至適を有し、良好なメタンガス生成活性
を示すことから好アルカリ性でもあることが確認された
。さらに、生育至適温度は35〜37℃で15〜45℃
の培養条件でもメタンガス生成活性が確認された。
NY−218は、直径0.5〜1.5ミクロンの球菌で
あり、胞子形成をしないダラム染色陰性の個性嫌気性細
菌であり、また一般細菌と異なり細胞壁のペプチドグリ
カン合成阻害の抗生物質等に感受性を示さない古細菌で
あることが確認された。
メタン生成細菌NY−218は、培養温度37℃、塩化
ナトリウム濃度2.5〜3M、pH8,0〜8.5の条
件では少なくともメタノールとメチルアミンを資化可能
であった。
本発明者らは、本微生物(NY−218)を昭和62年
10月7日に工技院微工研に寄託し、微工研菌寄第96
41号なる寄託番号が付された。
本発明の第2のメタン生成細菌NY−844は、少なく
ともp H6,5〜8.5の範囲で生育し、pH7,5
〜8.0に生育至適を有し、良好なメタン生成活性を示
す。さらに生育至適温度は35〜37℃であり、15〜
45℃の培養条件でもメタンガス生成活性が確認された
NY−844は、直径0.5〜1.5ミクロンの球菌で
あり、胞子形成をしないダラム染色陰性の偏性嫌気性細
菌であり、また一般細菌と異なり細胞壁のペプチドグリ
カン合成阻害の抗生物質等に感受性を示さない古細菌で
あることが確認された。
メタン生成細菌NY−844は37℃培養、塩化ナトリ
ウム濃度2.5〜3M、p)(7,5〜8.0の条件で
は少なくともメタノールとメチルアミンを資化可能であ
ることが確認された。
本発明者らは本微生物(NY−844)を昭和62年1
0月7日に工技院微工研に寄託し、微工研菌寄第964
2号なる寄託番号が付された。
〔実施例〕
実施例1−1 取得した微生物(NY−218)を培地中の塩化ナトリ
ウム濃度を変化させて培養した場合の結果を第1図に示
す。第1図は、第1表に示した培地組成において基質を
0.8%トリメチルアミンとし、塩化ナトリウム濃度を
1〜4Mの範囲で変化させた各培地を用いて、NY−2
18を37℃で15日間培養した結果である。
第1図の横軸は、培地中の塩化ナトリウム濃度(M)を
示し、縦軸はメタンガス生成量(mmole)を示す。
同図からNY−218は、塩化ナトリウム濃度1〜4M
で生育し、2.5〜3Mに生育の至適条件を有すること
が理解される。
実施例1−2 取得した微生物(NY−218)を培地中のpHを変化
させて培養した場合の結果を第2図に示す。
第2図は、第1表に示した培地組成に右いて、基質を0
.8%トリメチルアミンとし、pHを7.0〜9.0の
範囲で変化させた各培地を用いて、NY−218を37
℃、15日間培養した結果である。
第2図の横軸は培地中のpH1縦軸はメタンガス生成量
(m mole)を示す。同図からNY−218はp 
H7,0〜、9.0で生育し、p H8,0〜8.5に
生育の至適条件を有することが理解される。
実施例1−3 、取得した微生物(NY−218)を培養温度を変化さ
せて培養した結果を第3図に示す。第3図は、第1表に
示した培地組成において基質を0.8%トリメチルアミ
ンとした培地を用いて、NY−218を15〜60℃で
20日間培養した結果である。
第3図の横軸は培養温度、縦軸はメタンガス生成量(m
 mole )を示す。同図からNY−218は15〜
45℃の広範囲で生育し、35〜37℃付近に生育至適
条件を有することが理解される。
実施例1−4 取得した微生物(NY−218)を、第1表に示す培地
を用い、基質としてギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、
メタノール、トリメチルアミンのいずれか1つを用いて
行った培養の結果を第4図に示す。尚、基質濃度は0.
8%とし、培養気相はN2(2気圧陽圧)とした。H2
/ CO,を基質として用いる場合は培地中に上記基質
を用いる代わりに培養気相を82 / C02(2気圧
陽圧)として培養を行った。尚、培地pHは8.2とし
、塩化ナトリウム濃度3M、培養温度37℃とした。
結果はまとめて第4表に示す。
実施例1−5 取得した微生物(NY−218)を第1表に示す培地を
用い、基質として0.8%トリメチルアミンを用いて培
養時のメタンガス生成量から世代時間を求めた。その結
果5〜10時間であった。
実施例2−1 取得した微生物(NY−844)を培地中の塩化ナトリ
ウム濃度を変化させて培養した場合の結果を第5図に示
す。第5図は、第1表に示した培地組成に右いて基質を
0.8%トリメチルアミンとし、塩化ナトリウム濃度を
1〜4Mの範囲で変化させた各培地を用いて、NY−8
44を37℃で15日間培養した結果である。
第5図の横軸は培地中の塩化ナトリウム濃度(M)を示
し、縦軸はメタンガス生成量(m mole)を示す。
同図からNY−844は、塩化ナトリウム濃度1〜4M
で、当該微生物が生育し、2.5〜3Mに生育の至適条
件を有することが理解される。
実施例2−2 取得した微生物(NY−844)を培地のpHを変化さ
せた場合の培養結果を第6図に示す。第6図は、第1表
に示した培地組成において、基質を0.8%トリメチル
アミンとし、pHを7.0〜9.0の範囲で変化させた
各培地を用いて、NY−844を37℃、15日間培養
した結果である。
第6図の横軸は培地のpH1縦軸はメタンガス生成量(
m mole) を示す。同図からNY−844はp 
H6,5〜8.5で生育し、p H7,5〜8.0に生
育の至適条件を有することが理解される。
実施例2−3 取得した微生物(NY−844)を培養温度を変化させ
て培養した結果を第7図に示す。第7図は、第1表に示
した培地組成において、基質を0.8%トリメチルアミ
ンとした培地を用いて、NY−844を15〜60℃で
20日間培養した結果である。
第7図の横軸は培養温度、縦軸はメタンガス生成量(m
 mole) を示す。同図からNY−844は、15
〜45℃の広範囲で生育し、35〜37℃付近に生育至
適条件を有することが理解される。
実施例2−4 取得した微生物(NY−844)を第1表に示す培地を
用いて、基質としてギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、
メタノール、トリメチルアミンのいずれか1つを用いて
行った培養の結果を第8図に示す。尚、基質濃度は0.
8%とし、培養気相はN2(2気圧陽圧)とした。Ha
 / COa を基質として用いる場合は、培地中に上
記基質を用いる代わりに、培養気相を82/C○2(2
気圧陽圧)として培養を行った。又、培地pHは7.8
、塩化ナトリウム濃度3M、培養温度37℃とした。
結果はまとめて第4表に示す。
実施例2−5 取得した微生物(NY−844)を第1表に示す培地を
用い、基質として0.8%トリメチルアミンを用いて培
養時のメタンガス生成量から世代時間を求めた。その結
果5〜10時間であった。
本発明の高度好塩性メタン生成細菌が公知のメタン生成
細菌と別異の新規なものであることを示すために、公知
菌と本発明のNY−218及びNY−844の基質資化
性、形態、ダラム染色、世代時間、至適温度、至適pH
1至適NaCβ濃度をまとめて第4表に示す。
まずNY−218は以下の点からハロメタノコツカス属
に属する新規メタン生成細菌であることがわかる。
■ 本発明によるメタン生成細菌NY−218は、公知
菌より高い塩化ナトリウム濃度に至適条件を有する高度
好塩性である。
■ 公知菌の中には、好アルカリ性と好塩性の両性質を
有するメタン生成細菌はなかったが、本発明によるメタ
ン生成細菌NY−218は高度好塩性かつ好アルカリ性
である。
■ 公知菌の中には15〜20℃程度の低温条件でもメ
タンガス生成活性を示す好塩性あるいは好アルカリ性メ
タン生成細菌は見出されていなかったが、本発明による
メタン生成細菌NY−218は15〜20℃の条件にお
いてもメタンガス生成活性を有し、耐低温性である。
■ 公知の好アルカリ性のメタン生成細菌としては桿菌
のみが知られており、球菌は見出されていなかったが、
本発明によるメタン生成細菌NY−218は球菌である
■ 公知の好アルカリ性のメタン生成細菌としては水素
以外の基質資化能力を有するものは見出されていなかっ
たが、本発明によるメタン生成細菌NY−218は少な
くとも基質としてメタノール及びメチルアミンを資化可
能である。
次にNY−844は以下の点からハロメタンコッカス属
に属する新規なメタン生成細菌であることがわかる。
■ 公知菌の中には、高度好塩性メタン生成細菌は見出
されていなかったが、本発明によるメタン生成細菌NY
−844は公知菌より高い塩化ナトリウム濃度に至適条
件を有する高度好塩性のものである。
■ 公知の好塩性のメタン生成細菌は何れもpH7,0
〜7.5に生育至適条件を有していたが、本発明による
高度好塩性メタン生成細菌NY−844はpH7,5〜
8.0に生育至適条件を有し、既知のものとpH依存性
が異なり、従来のものより高いpH条件でも高活性を維
持する。
■ 公知菌の中には、15〜20℃程度の低温でも良好
なメタンガス生成活性を示す好塩性メタン生成細菌は見
出されていなかったが、本発明によるメタン生成細菌N
Y−844は15〜20℃の条件でも、メタンガス生成
活性を有する耐低温性のものである。
第4表に記した文献は以下の通りである。
■、 アプライド アンド エンバイロンメンタルマイ
クロバイオロジー(Applied and Bnvi
ron−mental !Aicrobiology)
 、Vat、50 、N(L 4、p877〜881.
1985 2、マイクロバイオロジー(U、 S、 S、 R,)
(Micro−biology)Vol、 52、p 
290〜297.19833、 アプライド アンド 
エンバイロンメンタルマイクロバイオロジー(Appl
ied and Environ−mental Mi
crobiology) 、Vol、5 Q、Nα1、
p140〜143.1985 4、 インターナショナル ジャーナル オブ システ
マチック バクテリオロジ−(Internation
alJournal of 5yste+natic 
Bacteriology) 、Vol。
36、Nα3、p380〜382.19865、 アチ
ーブス オブ マイクロバイオロジー(Archive
s of Microbiology) 、Vol、 
142、Nα211〜217.1985 〔発明の効果〕 メタン生成細菌はバイオマス有効利用、バイオガス生産
等の目的で広く用いられているメタン発酵(バイオ・メ
タネーション)の中核となる微生物として利用されてい
る。本発明による新規メタン生成細菌は高度好塩性、好
アルカリ性、耐低温性の諸性質を有することから、本発
明によるメタン生成細菌を用いることで従来のメタン発
酵技術を飛躍的に向上させることができる。具体的には
従来、pH中性付近、37℃の中温、低塩濃度等の条件
がメタン発酵の一般法であったが、本発明によるメタン
生成細菌を用いることで、アルカリ、高塩度、低温の条
件でもメタン発酵が可能となり、メタン発酵に供するバ
イオマス廃棄物の対象も広くなる。また従来のメタン発
酵法は中性付近で行なわれており、そのため実際のバイ
オリアクターの中和の目的で多量のpH調整剤が投入さ
れ、結果としてリアクター内の塩濃度が上昇し、メタン
発酵を阻害することが多々ある。このような従来の問題
点についても好塩性である本発明によるメタン生成細菌
を利用することで解決できる。
さらには、本発明によるメタン生成細菌を好塩性、好ア
ルカリ性、耐低温性等の好あるいは耐特殊環境性を支配
する遺伝子の供給源として遺伝子工学的手法による育種
に使用することにより、実際の高効率なメタン発酵ある
いは高効率な他の有用物質の生産が可能となる。
【図面の簡単な説明】
第1〜4図はそれぞれNY=218を用いた場合のメタ
ンガス生成量とNaCβ濃度、pH,温度及び基質との
関係を示す。 第5〜8図はそれぞれNY−844を用いた場合のメタ
ンガス生成量とNaCβ濃度、pH,温度及び基質との
関係を示す。 NcLCn X度CM〕 温 度 〔°C〕 塔 贅 日 (交  〔日〕 k(l濃度CM) 温度[’C) 塔 餐 日 数 〔日〕 昭和  年  月  日 特許庁長官  吉 1)文 毅  殿 1、事件の表示   昭和62年特許願第255995
号゛2、発明の名称     高度好塩性メタン生成細
菌3、補正をする者 事件との関係  出願人 名称  新技術開発事業団 4、代 ユ い          外2名昭和  年
  月  日 特許庁長官  吉 1)文 毅  殿 ■、事件の表示   昭和62年特許願第255995
号2、発明の名称     高度好塩性メタン生成細菌
3、補正をする者 事件との関係  出願人 名称  新技術開発事業団

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)塩化ナトリウム濃度約2.5M〜約3Mに生育至
    適範囲を有するハロメタノコッカス・アルカリフィルム
  2. (2)約8.0〜約8.5に生育至適pH範囲を有する
    特許請求の範囲第(1)項記載のハロメタノコッカス・
    アルカリフィルム。
  3. (3)ハロメタノコッカス・アルカリフィルムが微工研
    菌寄第9641号のハロメタノコッカス・アルカリフィ
    ルムNY−218である特許請求の範囲第2項記載のハ
    ロメタノコッカス・アルカリフィルム。
  4. (4)約7.5〜約8.0に生育至適pH範囲を有する
    特許請求の範囲第(1)項記載のハロメタノコッカス・
    アルカリフィルム。
  5. (5)ハロメタノコッカス・アルカリフィルムが微工研
    菌寄第9642号のハロメタノコッカス・アルカリフィ
    ルムNY−844である特許請求の範囲第(4)項記載
    のハロメタノコッカス・アルカリフィルム。
JP62255995A 1987-10-09 1987-10-09 高度好塩性メタン生成細菌 Granted JPH0198474A (ja)

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