JPH01225480A

JPH01225480A - 好アルカリ性メタン生成細菌

Info

Publication number: JPH01225480A
Application number: JP63053294A
Authority: JP
Inventors: Naoki Nakatsugawa; 直樹中津川; Koki Horikoshi; 弘毅掘越
Original assignee: Research Development Corp of Japan
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1988-03-07
Filing date: 1988-03-07
Publication date: 1989-09-08
Also published as: JPH052308B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は好アルカリ性のメタン生成細菌に関し、さらに
詳しくは約８．１〜約８．７に生育至適ｐＨ範囲を有す
るメタノサルシナ・アルカリフィルムに関する。

〔従来の技術〕

従来、サクノサルシナ属のメタン生成細菌としては以下
の５種が知られている。メタノサルシナ・パルケリ〔マ
イクロバイオロジカル嘩レビュー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｖｏｌ、４７．　ｐ　
　’１６０〜２９６．１９７９）；フェムス・マイクロ
バイオロジー−レター（ＦＢＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ　Ｌｅｔｌｅｒｓ）Ｖｏｌ、１６．ｐ２１Ｔ　〜
２２３．１９８３）：メタ／サルシナ・アセチイボラン
ス〔アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイ
クロバイオロジー　　（Ａｐｐｌｉｅｄ　　ａｎｄ　　
［！ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ）Ｖｏｌ、　４７．　　ｋ５．　ｐ９７１〜９７
８．　１９８４：］　　；メタノサルシナ・バキニオラ
タＣマイクロバイオロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
、　Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｒ）　Ｖｏｌ、　４８゜ｐ２７９〜２
８５．１９７９）；メタノサルシナ・サーモフィラ〔イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティッ
ク・バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ）　Ｖｏｌ、３５．　　ｋ４．　　ｐ
　５２２〜５２３　。

１９８５〕　；メタノサルシナ・マツエイ〔カレント・
マイクロバイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ）Ｖｏｌ、３．　　ｐ３２１〜３２６．１
９８０）しかし、これらは何れも好アルカリ性ではなく
生育至適のｐＨ条件７．５以下であり、ｐＨ７，５〜８
．０以上の範囲に生育至適条件を有するメタノサルシナ
はこれまで見出されていなかった。

一方、従来の好アルカリ性メタン生成細菌としてはメタ
ノバクテリウム属に属する２種の細菌が知られている。

メタノバクテリウム・アルカリフィルム〔インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテ
リウムジ−（Ｉｎｔｅｒ−ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ）。

Ｖｏｌ、３６．Ｎ（Ｌ３．　ｐ　３８０〜３８２．１９
８６）；メタノバクテリウム・サーモアルカリフィルム
〔アーチブス・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｒｃｈ
ｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、　Ｖｏ
ｌ、１４２．　ｐ　２１１〜２１７．１９８５：１しかし、これらの好アルカリ性メタン生成菌は何れもメ
タノバクテリウム属の桿菌であり、基質として水素と炭
酸ガスのみを資化するものである。

これまで、メタノバクテリウム属以外の、あるいは形態
が桿菌以外の好アルカリ性メタン生成菌および水素と炭
酸ガス以外の基質を資化可能な好アルカリ性メタン生成
菌はこれまで見出されていなかった。

〔発明が解決しようとする課題〕

そこで本発明者らは、上記のメタノサルシナ属のメタン
生成菌よりも高いｐｌ（範囲にその生育至適条件を有す
る好アルカリ性のメタノサルシナを見出すべく研究を重
ねるとともに上記のメタノバクテリウム属以外の好アル
カリ性メタン生成菌、あるいは形態が桿菌以外の好アル
カリ性メタン生成菌および水素と炭酸ガス以外の基質を
資化可能な好アルカリ性メタン生成菌を見出すべく研究
を重ねた。

〔課題を解決するための手段〕

その結果、本発明者らは約８．１〜約８．７の生育至適
ｐＨ範囲を有する好アルカリ性メタン生成菌であるメタ
ノサルシナ・アルカリフィルムを見出し本発明を完成し
た。

本発明はメタノサルシナ・アルカリフィルムＮＹ−７２
８は、微工研菌寄第９９２０号として昭和６３年３月４
日に寄託されている。以下開園を入手するための手段（
スクリーニング法等）について説明する。

（１）スクリーニング本発明においては、特願昭６１−１９１５４１号及び実
願昭６１−１２５０８６号に記載の嫌気性菌分離法に基
いて、メタン生成細菌のスクリーニングを行った。具体
的には、まず特殊環境の土壌（強アルカリ、高塩濃度等
）を探索し、目的とする特殊環境条件の土壌を採取する
。次に特願昭６１−１９１５４１号に示すものを基本と
した前処理用の希釈液を用いて、迅やかに採取した微生
物に必要な嫌気条件、低酸化還元電位条件等を実現する
。次いで、サンプリングした土壌の諸条件（ｐＨ、塩濃
度等）を考慮して、希釈溶液を調整し、当該土壌を迅速
に該希釈溶液に懸濁させる。得られた懸濁液は、実願昭
６１−１２５０８６号に示す容器を用いて個性嫌気性菌
であるメタン生成菌が死滅しないように維持するととも
に、対象とする特殊環境メタン生成細菌が死滅しないよ
うに維持する形で移送する。移送したサンプルは分離培
養用サンプルとして供した。

また、スクリーニング源とする土壌については国内外の
特殊環境土壌について広く探索を行なった。

（２）分離培養分離培養用の培地としては、本発明者らが独自に開発し
た分離培地を用いた。用いた分離培地の組成を第１表に
示す。また同組成中に示した微量元素溶液とビタミン溶
液の組成は、それぞれ第２表、第３表に示す。第２表に
示す微量元素溶液については、当該微生物の微量元素要
求性が不明確であることから、同溶液中の微量元素の種
類、量を強化した独自の組成のものを用いた。

培地中の基質としては、第１表に示す通りギ酸ナトリウ
ム、酢酸ナトリウム、メタノール、メチルアミンをそれ
ぞれ独立して０．５〜１．０％の濃度とした。培養開始
時の培地のｐＨの調製には重炭酸ナトリウムを用いた。

また、メタン生成細菌は古細菌であり、細胞壁にペプチ
ドグリカンを持たないのでペプチドグリカン合成阻害剤
に感受性がなく、またリボゾームは？Ｏ３型にもかかわ
らず原核細胞型の７Ｏ３’Ｊボゾーム系をもつ細菌に有
効なタンパク合成阻害剤にも感受性がない。そこで、分
離培養の際には非メタン生成細菌の生育のみを抑える抗
生物質を培地中に加えることを基本とし、目的とするメ
タン生成細菌のより効率的な分離を実施した。具体的に
は第１表に示すように細胞壁のペプチドグリカン合成阻
害剤であるバンコマイシン、原核細胞型の７Ｏ３ＩＪボ
ゾーム系を有する細菌に有効なタンパク合成阻害剤であ
るカナマイシン等を使用した。

培養時の気相については、Ｈａ　／ｃｏ□混合ガス（８
０／　２０）、Ｎ２．／ＣＯ２混合ガス（８０／２０）
、Ｎ２ガスの３種類のガスを脱酸素処理をした上で用い
た。液体培地、寒天培地の何れの培地による培養時にお
いても、同ガスを２気圧陽圧の形で培養容器内に充てん
して、加圧培養を行なった。また、静置培養および暗所
に右ける培養を基本とした。

また分離培養時の他の条件としてｐＨ６，５〜１０、　
Ｏ、温度１０〜６０℃の各範囲で広く特殊環境メタン生
成細菌の探索を実施した。

（３）目的微生物の確認目的とする特殊環境メタン生成細菌の確認は、以下のよ
うに実施した。ｐＨ１基質等の条件を変化させ、さらに
古細菌であるメタン生成細菌のみを分離するために前述
の細胞壁のペプチドグリカン合成阻害剤、原核細胞型の
７　ＯＳ　ＩＪボゾーム系を有する細菌に有効なタンパ
ク合成阻害剤の抗生物質を加えた培地を用いて、所望の
培養温度で前述の分離培養法にしたがい培養は開始する
。この方法により分離培養を行ない、微生物の生育が認
められるとすれば、培地の条件等から判断すれば、以下
のものが予想される。

■　目的とするメタン生成細菌 ■　メタン生成細菌以外の抗生物質耐性の偏性嫌気性菌 ■　メタン生成細菌以外の個性嫌気性あるいは耐嫌気条
件の古細菌これらのうちから目的とするメタン生成菌のみを識別す
る方法として次の２法を基本とした。まず、第１に、培
養容器内のヘッドスペースのガスをガスクロマトグラフ
等で分析し、メタンガスの生成を確認する。メタンガス
を生成する微生物がメタン生成細菌である。次に、生育
した微生物を螢光顕微鏡で検鏡する。メタン生成細菌は
、同細菌に固有のファクターＦ４２゜を有し、長波長紫
外線を当てると、同ファクター由来の青緑色の螢光を発
するので、螢光顕微鏡での検鏡時にはこの螢光の有無で
メタン生成細菌か非メタン生成細菌かが確認される。（
非メタン生成細菌でも螢光を発するものがあるが、この
場合には黄白色、青白色等なのでメタン生成細菌固有の
螢光とは区別できる。）以上の方法を用いて、稀釈法、寒天平板法等で純化をく
り返し、目的とするメタン生成細菌のみを単離する。

第　１　表　培地組成（培地１β当り）第　１　表（続
き）注−１）基質については何れかひとつのみを使用性−２
）ｐ）Ｉ調製は重炭酸ナトリウム使用性−３）同表は精
製水を用いて、培地１１を調製する際の各組成の含有量
を示す第２表　微量元素溶液組成（溶液１β当り〉注−１）同
表は精製水を用いて溶液１１を調製する際の各組成の含
有量を示す。

第３表　ビタミン溶液組成注−１）同表は精製水を用いて溶液ｌＩ！を調製する際
の各組成の含有量を示す。

（４）目的とする微生物の取得本発明者らは、前述の方法により、広（国内外の特殊環
境土壌を対象に目的とするメタン生成細菌の分離を試み
た。その結果、日本の東北地方の湖沼底泥から多数の好
アルカリ性のメタン生成細菌を分離した。

これらのメタン生成細菌を培養し検討した。その結果、
これらの中で生育至適ｐＨが最も高い値の好アルカリ性
メタン生成細菌ＮＹ−７２８株を単離した。

ＮＹ−７２８は少なくとも約７．１から約９．２の広範
囲のｐＨで生育し、生育至適ｐＨ条件を約８．１〜８．
７に有し、メタンガス生成活性も良好であることから好
アルカリ性であることが確認された。

本発明のメタン生成菌ＮＹ−７２８は上記の通り、好ア
ルカリ性であり、さらに生育至適温度は約３４〜４２℃
であり、少なくとも約１５〜４５℃の広範囲でメタン生
成活性が確認された。

ＮＹ−７２８は個々の細胞は直径１．７〜２．７ミクロ
ンの球形であり、形態としてはサルシナ状である。開園
は、胞子形成をしないダラム染色陽性の個性嫌気性菌で
あり、また一般細菌と異なり、細胞壁のペプチドグリカ
ン合成阻害剤の抗生物質等に感受性を示さない古細菌で
あることが確認され、古細菌の膜脂質の特徴でもあるエ
ーテル結合も確言忍された。

ＮＹ−７２８は培養温度３７℃においては、基質として
水素と二酸化炭素、酢酸、メタノール、メチルアミンを
資化可能であり、メタンガス生成活性も良好であること
が確認された。

また資化可能なこれらの基質の中でメタノールを用いて
培養する場合、世代時間の最大値は約４時間であり、性
基質を用いて培養する場合に比べて極めて速い増殖速度
を示すことが確認された。

実施例１取得した微生物（ＮＹ−７２８）を培地のｐＨを変化さ
せて培養した場合の結果を第１図に示す。

第１図は、第１表に示した培地組成において、基質を０
．８％メタノールとし、ｐＨを６．５〜１０．０の範囲
で変化させた各培地を用いて、ＮＹ−７２８を３７℃、
５日間培養した結果である。

第１図の横軸は培地中のｐＨ，縦軸はメタンガス生成量
（ｍ　ｍｏｌｅ）を示す。同図からＮＹ−７２８は少な
くともｐＨ７，１〜９．３の範囲で生育し、ｐＨ８，１
〜８．７に生育の至適条件を有することが理解される。

実施例２取得した微生物（ＮＹ−７２８）を培養温度を変化させ
て培養した結果を第２図に示す。第２図は、第１表に示
した培地組成において基質を０．８％メタノールとした
培地を用いて、ＮＹ−７２８を１５〜６０℃で２０日間
培養した結果である。

第２図の横軸は培養温度、縦軸はメタンガス生成量（ｍ
　ｍｏｌｅ）　を示す。同図からＮＹ−７２８は少なく
とも約１５〜４５℃の広範囲で生育し、約３４〜４２℃
付近に生育至適条件を有することが理解される。

実施例３取得した微生物（ＮＹ−７２８）を、第１表に示す培地
を用い、基質としてギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、
メタノール、トリメチルアミンのいずれか１つを用いて
行った培養の結果を第３図に示す。尚、基質濃度は０．
８％とし、培養気相はＮ、（２気圧陽圧）とした。Ｈ２
／Ｃ［］２を基質として用いる場合は培地中に上記基質
を用いる代わりに培養気相を８２／ｃＬ（２気圧陽圧）
として培養を行った。尚、培地ｐＨは８．３とし、培養
温度３７℃とした。

実施例４取得した微生物（ＮＹ−７２８）を第１表に示す培地を
用い、基質として０．８％メタノールを用いて培養時の
メタンガス生成量から世代時間を求めた。その結果４時
間であった。

本発明の好アルカリ性メタン生成細菌が公知のメタン生
成細菌と別異の新規なものであることを示すために、公
知菌と本発明のＮＹ−７２８の基質資化性、形態、ダラ
ム染色、世代時間、至適温度、至適ｐＨをまとめて第４
表に示す。

まずＮＹ−７２８は以下の点からメタノサルシナ属に属
する新規メタン生成細菌であることがわかる。

■　本発明によるメタン生成細菌ＮＹ−７２８は、その
形態、基質の資化性からメタノサルシナ属に属するもの
であることは明らかであるがメタノサルシナ属の公知菌
に比べて、高いｐｌ範囲に生育至適条件を有する好アル
カリ性である。

■　公知菌の中には１５〜２０℃程度の低温条件でもメ
タンガス生成活性を示す好アルカリ性メタン生成細菌は
見出されていなかったが、本発明によるメタン生成細菌
ＮＹ−７２８は１５〜２０℃の条件においてもメタンガ
ス生成活性を有し、耐低温性である。

■　公知の好アルカリ性のメタン生成細菌としては桿菌
のみが知られており、サルシナ状の菌は見出されていな
かったが、本発明によるメタン生成細菌ＮＹ−７２８は
サルシナ状である。

■　公知の好アルカリ性のメタン生成細菌としては水素
以外あ基質資化能力を有するものは見出されていなかっ
たが、本発明によるメタン生成細菌ＮＹ−７２８は基質
として水素と炭酸ガス、酢酸、メタノール及びメチルア
ミンを資化可能である。

第４表に記した文献は以下の通りである。

〔発明の効果〕

メタン生成細菌はバイオマス有効利用、バイオガス生産
等の目的で広く用いられているメタン発酵（バイオ・メ
タネーション）の中核となる微生物として利用されてい
る。本発明による新規メタン生成細菌は、好アルカリ性
、耐低温性の諸性質を有することから、本発明によるメ
タン生成細菌を用いることで従来のメタン発酵技術を飛
躍的に向上させることができる。具体的には従来、ｐＨ
中性付近、３７℃の中温等の条件がメタン発酵の一般法
であったが、本発明によるメタン生成細菌を用いること
で、アルカリ、低温の条件でもメタン発酵が可能となり
、メタン発酵に供するバイオマス廃棄物の対象も広くな
り、メタン発酵の応用分野が広がるとともに、高効率な
メタン発酵法が実現できる。例えば、従来のメタン発酵
法は中性付近で行なわれており、そのため使用される基
質のｐＨが高い場合には、中和のため多量のｐＨ調製剤
を投入する必要がある。このような従来法の問題点につ
いては、本発明のメタン生成細菌を利用することによっ
て解決できる。さらには、本発明によるメタン生成細菌
を好アルカリ性、耐低温性等の好あるいは耐特殊環境性
を支配する遺伝子の供給源として遺伝子工学的手法によ
る育種に使用することにより、実際の高効率なメタン発
酵あるいは高効率な他の有用物質の生産が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図はそれぞれＮＹ−７２８を用いた場合のメタ
ンガス生成量とｐＨ１温度及び基質との関係を示す。第１図゛［第２図ゴ培養日数（℃）。第３図培　養　日　数　（日）受託番号変更届３．１７平成元年　　月　　日１、事件の表示　　昭和６３年特許願第５３２９４号２
、発明の名称　　　好アルカリ性メタン生成細菌３、補
正をする者事件との関係　　出願人名称　　新技術開発事業団外２名４、代理人

Claims

【特許請求の範囲】

（１）約８．１〜８．７に生育至適ｐＨ範囲を有するメ
タノサルシナ・アルカリフィルム。
（２）微工研菌寄第９９２０号である請求項（１）記載
のメタノサルシナ・アルカリフィルム。