JPH0154995B2 - - Google Patents
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- JPH0154995B2 JPH0154995B2 JP14140580A JP14140580A JPH0154995B2 JP H0154995 B2 JPH0154995 B2 JP H0154995B2 JP 14140580 A JP14140580 A JP 14140580A JP 14140580 A JP14140580 A JP 14140580A JP H0154995 B2 JPH0154995 B2 JP H0154995B2
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【発明の詳細な説明】
本発明は、耐熱性アデニレートキナーゼおよび
その製造方法に関するものであり、さらに詳細に
は、アデノシン−リン酸（AMP）とアデノシン
三リン酸（ATP）とからアデノシン二リン酸
（ADP）を高収率に生成する耐熱性アデニレート
キナーゼおよびその製造方法に関するものであ
る。 近時、酵素反応の特長である反応、基質、光学
の各特異性にすぐれている点あるいは反応条件が
温和である点が注目され、酵素は工業的にも広く
触媒として利用されてきている。しかし、それら
は現在のところデンプンを糖化するアミラーゼ、
Ｎ−アシル−Ｌ−アミノ酸からＬ−アミノ酸を製
造するＬ−アミノ酸アシラーゼ等に見られるよう
に、ほとんどがエネルギー源を必要としない加水
分解酵素に限られている。しかるに、生体内にお
いては、主にATPをエネルギー源として、それ
がADPとオルトリン酸あるいはAMPとピロリン
酸に加水分解する時に放出される化学エネルギー
を利用して、多くの合成酵素により生合成が行な
われている。そこで、酵素の工業的利用を広げる
ためそれらの合成酵素あるいは酸化還元酵素等を
取り出し固定化し、さらにATP等を供給するこ
とにより生体外において、生体内で行なわれてい
ると同様な生合成をめざそうとするまつたく新し
い生産システム、すなわち一般にバイオリアクタ
ーと呼ばれているシステムを創造することが試み
られてきている。そのようなバイオリアクターを
実施するためには、エネルギー源として多量の
ATPが必要であり、かつ使用したATPをADPあ
るいはAMPより再生産することが必要である。
このような目的に沿つて、ADPあるいはAMPを
ATPに再生産する方法としては、次式の反応を
触媒する酵素を利用する方法がある（たとえば、
エンザイム・エンジニアリング、２巻、209頁、
217頁、1974年）。 AMP＋ATPアデニレートキナーゼ ――――――――――→ 2ADP ADP＋アセチルリン酸酢酸キナーゼ ―――――― → ATP＋酢酸 ＋×２より AMP＋２アセチルリン酸→ATP＋２酢酸 すなわち、ATPがADP，AMPのどちらに変
換されても、上記の酵素の組み合せによりATP
の再生産が可能となる。 これらの反応を実際に利用するに当つては、こ
れらの酵素が安定で工業的利用にも十分に耐える
ことが必要である。しかしながら、従来知られて
いるアデニレートキナーゼは酵母や動物の筋肉等
から得られているものであるが、きわめて不安定
な酵素である。また、酢酸キナーゼも、従来よく
知られているエシエリシア・コリ等から得られる
ものはきわめて不安定であるが、最近、特開昭52
−25088号により耐熱性の酢酸キナーゼが好熱菌
バチルス・ステアロサーモフイルスから採取する
ことに成功している。そこで、特開昭52−25088
号に記載の酢酸キナーゼと同様な安定性を有する
アデニレートキナーゼの出現が強く要望されてい
たのである。 本発明者らは、このような観点から、熱に安定
であり長期間活性を失なわない性質を有するアデ
ニレートキナーゼを求めて鋭意研究した結果、バ
チルス属に属する微生物菌体に上記の性質を有す
るアデニレートキナーゼが存在することを見い出
し、しかも、このアデニレートキナーゼは容易に
純粋に精製し得、かつ酵母などに存在するアデニ
レートキナーゼに比較し、驚くほどその安定性に
すぐれた新規酵素であることを見い出し、本発明
を完成した。 すなわち、本発明は、約50℃の緩衝液中で約15
分間処理したのちの活性が処理前の活性の約80％
以上の値を保持している性質を有し、かつ次の理
化学的性質を有する耐熱性アデニレートキナーゼ
及びバチルス属に属する細菌を培養し、その培養
物から約50℃の緩衝液中で約15分間処理したのち
の活性が処理前の活性の約80％以上の値を保持し
ている性質を有し、かつ次の理化学的性質を有す
る耐熱性アデニレートキナーゼを採取することを
特徴とする耐熱性アデニレートキナーゼの製造方
法を要旨とするものである。 (a) 作用及び基質特異性 次の反応を触媒する。 AMP＋ATP2ADP (b) 分子量 ゲルクロマトグラフイーにより測定した値は、
約22000である。 (c) 至適PH 約7.5（温度30℃） (d) 作用適温の範囲 約25℃〜65℃（PH約7.5） 本発明のアデニレートキナーゼは、約50℃の緩
衝液中で約15分間処理することにより、アデニレ
ートキナーゼの残存活性がもとの活性の約80％以
上、好ましくは約90％以上、最適には約100％の
値を保持している性質を有し、特に約57℃の緩衝
液中で約15分間処理したのちの活性が処理前の活
性の約80％以上の値を保持している優秀な性質を
有している（以下これらの性質を耐熱性とい
う。）。緩衝液の濃度およびPHは特に限定されない
が、一般には濃度は5mMないし500mMであり、
PHは７ないし10.5である。特に本発明において
は、50mMリン酸緩衝液（PH7.5）を用いること
が好ましい。 次に本発明のアデニレートキナーゼの理化学的
性質を示す。 (1) 作用及び基質特異性 前記したとおり。 なお、AMP，ATP及びADPに対するミカ
エリス定数（km値）は、おのおの0.02mM，
0.04mM及び0.05mMである。 (2) 至適PH 前記したとおり。 (3) 安定PH範囲 7.0〜10.5（４℃で24時間の処理で殆ど失活が
起こらない）。 (4) 作用適温の範囲 前記したとおりであり、PH約7.5で約25℃よ
り65℃までの温度の上昇とともに活性は増大す
る。通常は、30℃において反応を行わしめる。 (5) 耐熱性 57℃で15分間の加熱に対して99％の活性を保
持し安定である。 (6) 分子量 前記したとおり。 なお、ゲルクロマトグラフイーとしてセフア
デツクスＧ−100を用いた。 (7) 力価の測定法；PH7.2，75mMのイミダゾー
ル−塩酸緩衝液中、1.5mMのAMP，1.2mMの
ATP、1mMの硫酸マグネシウム、135mMの
塩化カリウム、0.4mMのホスホエノールピル
ビン酸0.2mMの還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（NADH），5U／mlのピル
ビン酸キナーゼ、10U／mlのラクテートデヒド
ロゲナーゼを含む混合液を調製し、その混合液
に適当量のアデニレートキナーゼを加えて、
NADHの単位時間あたりの340nmの吸光度の
減少値より力価を測定し、１分間あたり２マイ
クロモルのNADHの340nmにおける吸光度を
減少せしめる酵素活性を１単位とした。 (8) 単一性；精製標品は、アクリルアミドデイス
ク電気泳動法により陽極側に移動し、単一なバ
ンドを与えた。また、SDS電気泳動法によつて
も単一なバンドを与えた。 (9) 元素分析；元素分析値にかえて、アミノ酸組
成をモル％で示す。 アスパラギン酸10.24％、スレオニン酸3.65
％、セリン1.87％、グルタミン酸12.05％、プ
ロリン6.06％、グリシン9.74％、アラニン7.64
％、シスチン（システイン）0.80％、バリン
7.37％、メチオニン2.94％、イソロイシン4.63
％、ロイシン10.55％、チロシン3.28％、フエ
ニルアラニン2.98％、リシン５・86％、ヒスチ
ジン2.52％、アルギニン７，17％、トリプトフ
アン0.65％ (10) 晶構造；現在、まだ結晶化されていないので
測定していない。 本発明のアデニレートキナーゼを製造するには
次のごとき方法を採取することができる。すなわ
ち、バチルス属に属する細菌を培養し、その培養
物から本発明のアデニレートキナーゼを採取する
ことによつて得ることができる。 本発明に使用する細菌は、本発明のアデニレー
トキナーゼを産生しうるバチルス属の細菌であり
そのような細菌であれば、いかなるものでも使用
できる。好ましい細菌としては、たとえば、バチ
ルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus
stearothermophilus）があげられる。ステアロサ
ーモフイルスとしての具体例としては、
ATCC79537954，8005，10149，12980，NCA
1503，UK−788（微工研菌第5141号）などがあ
る。 本発明における細菌を培養するに際して用いら
れる栄養培地において炭素源として、たとえば、
グルコース、シユークロース、フルクトース、殿
粉加水分解物、糖密、亜硫酸パルプ廃液の糖類、
酢酸、乳酸等の有機酸類、さらには使用する細菌
が資化しうるアルコール類、油脂、脂肪酸および
グリセリン等が使用でき、窒素源として、たとえ
ば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸
アンモニウム、アンモニア、アミノ酸、ペプトン
肉エキス、酵母エキス等の無機または有機物が使
用できる。さらに、無機塩類として、たとえばカ
リウム、ナトリウム、リン酸、亜鉛、鉄、マグネ
シウム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト等
の各塩類、必要に応じて微量金属塩、コーン・ス
テイープ・リカー・ビタミン類、核酸等を使用し
てもよく、細菌の一般的栄養培地が使用できる。 これらの培地を用いて、バチルス属に属する細
菌を20℃〜80℃、好ましくは40℃〜70℃、最適に
は60℃で約２〜６時間好気的に培養すればよい。
また、工業的には希釈率を、本発明に使用する細
菌のμmaxの0.9以上に制御して連続培養すること
が好ましい。すなわち、Ｄを本発明に使用する細
菌のμmaxの0.9以上に保つて連続培養して得た菌
体のアデニレートキナーゼ含有量は、回分法で得
られた単位菌体あたりのアデニレートキナーゼの
最大値をしのぎ、かつ菌体の生産性も高まり、特
にＤをμmax付近に保つた場合、菌体中のアデニ
レートキナーゼ含有量は実に回分法の1.3倍に向
上する。一方、Ｄを0.9μmax未満に保つて連続培
養した菌体のアデニレートキナーゼ含有量は回分
法よりも低下する。 本発明における希釈率〔ダイリユウシヨンレイ
ト（dilution rato）、以下Ｄという。〕とは、下
記の式（） Ｄ＝Ｆ／Ｖ （） Ｄ；希釈率（１／Hr） Ｆ；発酵槽に原料液を供給する速度および同時
に発酵槽よりり抜出す速度（／Hr） Ｖ；発酵槽中の液量（） によつて表わされるものである。 本発明におけるμmaxとは、細菌を連続培養す
る際のその連続培養条件における細菌の最大比増
殖速度（１／Hr）をいい、物質環境型連続培養
（ケモスタツト；ハルベルト、エルスワース、テ
リング、ジヤーナル・オブ・ジエネラル・ミクロ
バイオロジー、14巻、８号601〜622頁、1956年）
でＤを高め、菌濃度が定常値を保てなくなつた時
すなわちいわゆるウオツシユ・アウト時に測定さ
れる比増殖速度をいう。本発明における好熱性細
菌を使つてμmaxを求めるには、たとえば２〜30
容発酵槽に栄養培地を1.5〜20仕込み、40〜
75℃、好ましくは48〜61℃、PH4.5〜9.0、好ま
しくはPH6.0〜8.0に保ちながら、この細菌を接種
し、回分培養を行い、菌の生育が始まり、培養液
中の炭素源が0.01重量％以下になつた時、発酵槽
に仕込んだものと同組成の栄養培地を用いて生育
制限因子が炭素源のみである連続培養を開始す
る。こうすることによつて、物質環境型続培養法
（ケモスタツト）が設定できる。連続培養が定常
になつた後、Ｄを段階的に順次高めて行き、発酵
液中の菌濃度と、残存炭素源量とを経時的に測定
し、さらにＤを次第に高め、菌の比増殖速度を超
えた時、定常値を保つていた菌濃度が減少しはじ
め、それに反し炭素源濃度が上昇しはじめ、もは
やこれ以上のＤでは連続培養の定常性が保てなく
なつた時、これをウオツシユ・アウトと言い、こ
の時の比増殖速度がμmaxになる。 このμmaxは使用する栄養培地の種類や培養条
件によつて同一菌株でもさまざまに変化するが、
これらの組合せが変らなければ一定値を示すので
一度測定すれば、長期にわたつて信頼できる数値
となる。 本発明において、通常の前培養および回分培養
で希望の菌濃度まで培養した後、連続培養に移し
Ｄの制限を実施することができる。その時期は培
養期間中の何れの時期でもよいが、望ましくはバ
ツチ培養時の対数増殖末期に連続培養に移し、す
みやかに所定のＤに固定するのが有利である。 次に、本発明の一実施態様をバチルス・ステア
ロサーモフイラス・NCA1503の例をあげて説明
すると、グルコースを炭素源とした栄養源とした
栄養培地を用い最適温度57℃、最適PH6.8、30
容発酵槽（20仕込み）で物質環境型連続培養を
行つて、μmaxを測定したところμmax＝1.1（１／
Hr）であつた。したがつて、Ｄ＝μmaxの連続培
養を行うには、同組成の新しい栄養倍地を１時間
あたり、発酵槽仕込み液量の1.1倍、すなわち前
記式（）より22／Hrの速度で連続的に、定
量ポンプなどを用いて発酵槽中に供給し、同時に
同速度で培養液を抜出せばよい。 次に得られた培養物から、本発明のアデニレー
トキナーゼが採取されるが、培養物、分離生菌体
分離菌体の処理物、粗製酵素、精製酵素等のあら
ゆる段階で採取できる。精製法としては、通常の
酵素精製法を用いることができる。すなわち、遠
心分離等により菌体を得た後、菌体をマントンゴ
ーリン、ダイノミル、フレンチプレス、超音波処
理等により細胞破砕後、遠心分離により細胞片を
除去し、細胞抽出液を得、これに硫酸ストレプト
マイシンまたは硫酸プロタミン処理を行ない、さ
らには硫酸アンモニア沈殿、アセトン沈殿、加熱
処理等を行い、精製するためにDEAE−セルロー
スカラム等のイオン交換クロマトグラフイー、ヒ
ドロキシアパタイトカラム等の吸着クロマトグラ
フイー、セフアデツクスクロマトグラフイー等の
ゲル濾過クロマトグラフイー等のクロマトグラフ
イーを組合わせて行うことができる。このように
して本発明のアデニレートキナーゼを単離、精製
することができる。 本発明のアデニレートキナーゼは、熱に対して
非常に安定であるから、従来のアデニレートキナ
ーゼと比較して、酵素単離後、これを長期間保存
することができる。 このため、バイオリアクターと呼ばれているシ
ステムの実施が可能となる。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 実施例１、比較例１ ポリペプトン0.5ｇ／dl、酵母エキス0.5ｇ／
dl、シユークロース1.0ｇ／dl、硫酸カリウム
0.13ｇ／dlリン酸二ナトウム0.644ｇ／dl、硫酸
マグネシウム0.027ｇ／dl、クエン酸0.032ｇ／
dl、硫酸第一鉄0.0007ｇ／dl、硫酸マンガン
0.015ｇ／dl、PH7.00に調整した培地250を115
℃、10分間加熱殺菌した後、バチルスステアロサ
ーモフイルスNCA1503株をを接種し、60℃で３
時間、内圧0.5Kg／m2Ｇで通気培養した。 培養後水で冷却しながら直ちにデラパル型遠心
分離機で菌体を採取し、700ｇの菌体を得た。得
られた菌体を凍結状態で保存したのち、凍結菌体
300ｇを２倍量の0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）に
懸濁し、フレンチプレスを用いて細胞を十分に破
壊後、遠心分離により細胞片を除去し、アデニレ
ートキナーゼを含む粗抽出液を得た。この粗抽出
液600ml当り１％の硫酸プロタミン溶液300mlを添
加し、十分撹拌した後、生じた沈殿を遠心分離で
除去し、プロタミン上清を得た。この上清に固形
硫酸アンモニウムを徐々に加えて60％飽和（４
℃）とした。生成した沈殿を遠心分離により集め
再び0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）にとかしついで
20倍量の0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）に対して透
析、脱塩した。 あらかじめ、2nMメルカプトエタノール、
2mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含む
20mMリン酸緩衝液（PH7.5）で平衡化した
DEAE−セルロースカラムに上記の粗酵素液を通
じ、塩化カリウムを上記緩衝液に加えた溶液で溶
出せしめると塩化カリウム濃度0.14Mの近くで目
的のアデニレートキナーゼが溶出した。この区分
を集め、濃縮、脱塩後、さらに10mMリン酸緩衝
液（PH7.5）で平衡化したハイドロキシアパタイ
トカラムに、その溶出液を通し、10mMリン酸緩
衝液から250mMリン酸緩衝液の直線勾配の溶出
を行つたところ120mM濃度近くに目的のアデニ
レートキナーゼが溶出した。この活性区分を濃
縮、脱塩後0.1M塩化カリウムを含む50mMトリ
ス・塩酸緩衝液を溶出液に用いたウルトロゲル
ACA34クロマトグラフイーにかけたのちに、さ
らに溶出した活性区分ををあらかじめ2mMメル
カプトエタノール、2mMエチレンジアミン四酢
酸ナトリウムを含む30mMリン酸緩衝液（PHを
7.7）で平衡化したDEAE−セフアデツクスＡ−
50カラムに通じ、塩化カリウムを上記緩衝液に加
えた溶液で溶出した。その結果、塩化カリウム濃
度0.2Mの近くで精製されたアデニレートキナー
ゼが溶出した。 このようにして得たアデニレートキナーゼは、
アクリルアミドデイスク電気泳動で陽極側に移動
し単一なバンドを与え、さらにセフアデツクスＧ
−100クロマトグラフイーにおいても、分子量約
22000のところに単一のピークを与えた。 その収量は約６mgで、酵素１mgあたり約500単
位の力価をしめした。 次にこのようにして得たアデニレートキナーゼ
と比較のため、酵母から得られたアデニレートキ
ナーゼ（比較例１）の安定性を調べた。 その結果を第１図および第２図に示す。なお、
第１図はPH7.5の50mMン酸緩衝液中の各温度で
15分間加熱したときの残存活性を示したもので、
曲線Ａが実施例１、曲線Ｂが比較例１である。第
２図はPH7.5の50mMン酸緩衝液中30℃で保存し
たときの残存活性の経日変化を示したもので、曲
線Ｃが実施例１、曲線Ｄが比較例１である。これ
らの結果からあきらかなように、酵母から得られ
たアデニレートキナーゼは50℃で15分間処理する
ことにより、ほぼ完全にその活性を不可逆的に失
うのに対し、本発明のアデニレートキナーゼは50
℃ではまつたく活性を失なわなかつた。さらに30
℃では、酵母から得られたアデニレートキナーゼ
は10〜20日間でほぼ活性を失うのに対し、本発明
のアデニレートキナーゼは50日経過した時点でも
活性の低下はまつたく認められなかつた。このよ
うに本発明のアデニレートキナーゼが驚くほど熱
に対して安定であり、これを長期間保存すること
ができる性質を有している。この性質は、いまま
でのアデニレートキナーゼにはないものである。 実施例 ２〜５ 使用菌体；バチルス・ステアロサーモフイラス
NCA1503。 栄養培地組成；グルコースを炭素源として他の
組成を次のごとくのものを用いた。 グルコース1.3ｇ、酵母エキス（オリエンタル
酵母社製）1.0ｇ、ペプトン（デイフイコ製）0.5
ｇ，KH2PO40.5ｇ，Na2HPO4・12H2O0.5ｇ，
MgSO47H2O0.1ｇ，ZnSO4・7H2O.01ｇ，
MnSO4・7H2O0.01ｇ，CuSO4・5H2O0.01ｇ，
CoCl2・6H2O0.01ｇ以上のものを水道水１に溶
解した。 前培養；上記組成の栄養培地を100ml容三角フ
ラスコに20ml、500ml容三角フラスコに100mlずつ
分注し、綿栓後121℃、１Kg／cm2、10分間加圧蒸
気殺菌した。冷却後、100ml容三角フラスコにア
メリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンよ
り入手した凍結乾燥菌体を約５ml無菌的に接種し
た。ロータリー・シエイカー（高崎製作所製）を
用いて55℃で一昼夜回転振盪培養（160rpm）し
たところ、菌体の生育が見られ、濁度が高まり
660nmの吸光度（日立製作所製101型分光光度計
で測定、以後OD660nmと称す。）が0.8〜1.0に達
したので、これを次に500ml容三角フラスコに約
５ml接種した。同条件で数時間500ml容三角フラ
スコを回転振盪培養したところ、OD660nmが1.0
程度に達したので回転振盪培養を中止し、これを
前培養物として本培養への接種に用いた。 本培養；30容発酵槽を用い、上記栄養培地を
20張込み殺菌を行つた（121℃、１Kg／cm2，15
分）。培養条件を55±１℃、PH6.5〜7.0（4NNaOH
で調整）、通気量20／分（空気）、撹拌数
900rpmに設定後、前培養物を約１接種しバツ
チ培養を開始した。培養に伴い発泡したので消泡
剤（信越化学KM−70）を少量添加した。 培養開始後約2.5時間でOD660nmが1.2（0.56ｇ
乾燥菌体／）に至り、培養液中のグルコースが
ほぼ消費され、0.01重量％以下になつたので、す
みやかに連続培養を開始した。前もつて測定した
本菌のμmaxが、1.4（１／hr）であつたので、前
記した殺菌済みの栄養培地を28.0／hrの速度で
連続的に供給、同速度で発酵槽より培養液を抜出
すことでμを1.00μmax（実施例２）に設定し、発
酵槽液量の５倍量の栄養培地を用いて連続培養し
て菌体を得た。 次にＤを段階的にμmaxの0.9〔（供給抜出速度
25.2／hr）実施例３〕、0.75〔（21.0／hr）実施
例４〕に変更し、連続培養を行つて菌体を得た。 このようにして得た菌体中のアデニレートキナ
ーゼ含有量を測定して、その結果を表１に示す。
なお、表１に回分培養で得た値（実施例５）も併
記したが、これは連続培養に移行する前の回分培
養時に得た菌体の値である。 【表】 表１の結果からあきらかなように、Ｄが
0.9μmax以上において生産した菌体は、回分法を
しのぐアデニレートキナーゼ含有量を示してい
る。 実施例 ６ 30容発酵槽にグルコース1.3、硫酸アンモ
ニウム1.0ｇ、酵母エキス0.5ｇ、リン酸一カリウ
ム0.5ｇ、リン酸二ナトリウム0.5ｇ、硫酸マグネ
シウム0.1ｇを水道水１に溶解して得た培地を
20張込み、121℃、１Kg／cm2で15分間加圧蒸気
殺菌した。培養条件を57℃、PH6.5〜7.0（4N−
NaOHで調製した。）、通気量20／分（空気）、
撹抛数900rpmに設定した後、これにバチルス・
ステアロサーモフイルスATCC12980株を上記培
地であらかじめ前培養して得た、660nmでの吸光
度が約1.0に達した溶液をを１接種した。まず、
約2.5時間バツチ培養を行い、660nmの吸光度が
1.0に至つたときに、前記組成の殺菌済み栄養培
地を24.0／hrの速度で定量ポンプを用いて連続
的に供給し、同速度で発酵槽より培養液を抜出す
こにより、100の栄養培地を用いて連続培養し
て培養液を得た。培養液を水で冷却しながら直ち
にデラバル型遠心分離機で菌体を採取し400ｇの
菌体を得た。 この菌体を1.5倍量の0.1Mリン酸緩衝液に懸濁
し、ダイノミルを用いて細胞を破砕後、遠心分離
により不溶物を除去し、アデニレートキナーゼを
含む粗抽出液を得た。この粗抽出液400ml当り10
の硫酸ストレプトマイシン溶液200mlを添加後、
生じた沈殿を遠心分離で除去し、ストレプトマイ
シン上清を得た。この上清に硫酸アンモニウム分
割をほどこし、30％飽和４℃から、60％飽和４℃
の間の分画部を得た。この分画部を50mMトリス
一塩酸緩衝液（PH8.0）にとかした後、あらかじ
め上記緩衝液で平衡化したDEAE−セフアデツク
スカラムに通じ、塩化ナトリウムを上記緩衝液に
加えた溶液で溶出せしめると、塩化ナトリウム濃
度0.2Mの近くで、目的とするアデニレートキナ
ーゼが溶出した。この溶出部分を実施例１と同様
な条件下にハイドロキシアパタイトカラムクロマ
トグラフイーを行つたのちセフアデツクスＧ−75
カラムに通じ0.1M塩化ナトリウムを含む30mM
トリス一塩酸緩衝液（PH8.0）で溶出して、実施
例１と同様にアクリルアミドデイスク電気泳動で
単一なバンドを与えるアデニレートキナーゼ標品
を得た。さらに、実施例１と同様にセフアデツク
スＧ−100クロマトグラフイーにおいても、分子
量約22000のところに単一のピークを与えた。 収量は約10mgであつた。その力価は酵素１mgあ
たり約500単位であつた。
その製造方法に関するものであり、さらに詳細に
は、アデノシン−リン酸（AMP）とアデノシン
三リン酸（ATP）とからアデノシン二リン酸
（ADP）を高収率に生成する耐熱性アデニレート
キナーゼおよびその製造方法に関するものであ
る。 近時、酵素反応の特長である反応、基質、光学
の各特異性にすぐれている点あるいは反応条件が
温和である点が注目され、酵素は工業的にも広く
触媒として利用されてきている。しかし、それら
は現在のところデンプンを糖化するアミラーゼ、
Ｎ−アシル−Ｌ−アミノ酸からＬ−アミノ酸を製
造するＬ−アミノ酸アシラーゼ等に見られるよう
に、ほとんどがエネルギー源を必要としない加水
分解酵素に限られている。しかるに、生体内にお
いては、主にATPをエネルギー源として、それ
がADPとオルトリン酸あるいはAMPとピロリン
酸に加水分解する時に放出される化学エネルギー
を利用して、多くの合成酵素により生合成が行な
われている。そこで、酵素の工業的利用を広げる
ためそれらの合成酵素あるいは酸化還元酵素等を
取り出し固定化し、さらにATP等を供給するこ
とにより生体外において、生体内で行なわれてい
ると同様な生合成をめざそうとするまつたく新し
い生産システム、すなわち一般にバイオリアクタ
ーと呼ばれているシステムを創造することが試み
られてきている。そのようなバイオリアクターを
実施するためには、エネルギー源として多量の
ATPが必要であり、かつ使用したATPをADPあ
るいはAMPより再生産することが必要である。
このような目的に沿つて、ADPあるいはAMPを
ATPに再生産する方法としては、次式の反応を
触媒する酵素を利用する方法がある（たとえば、
エンザイム・エンジニアリング、２巻、209頁、
217頁、1974年）。 AMP＋ATPアデニレートキナーゼ ――――――――――→ 2ADP ADP＋アセチルリン酸酢酸キナーゼ ―――――― → ATP＋酢酸 ＋×２より AMP＋２アセチルリン酸→ATP＋２酢酸 すなわち、ATPがADP，AMPのどちらに変
換されても、上記の酵素の組み合せによりATP
の再生産が可能となる。 これらの反応を実際に利用するに当つては、こ
れらの酵素が安定で工業的利用にも十分に耐える
ことが必要である。しかしながら、従来知られて
いるアデニレートキナーゼは酵母や動物の筋肉等
から得られているものであるが、きわめて不安定
な酵素である。また、酢酸キナーゼも、従来よく
知られているエシエリシア・コリ等から得られる
ものはきわめて不安定であるが、最近、特開昭52
−25088号により耐熱性の酢酸キナーゼが好熱菌
バチルス・ステアロサーモフイルスから採取する
ことに成功している。そこで、特開昭52−25088
号に記載の酢酸キナーゼと同様な安定性を有する
アデニレートキナーゼの出現が強く要望されてい
たのである。 本発明者らは、このような観点から、熱に安定
であり長期間活性を失なわない性質を有するアデ
ニレートキナーゼを求めて鋭意研究した結果、バ
チルス属に属する微生物菌体に上記の性質を有す
るアデニレートキナーゼが存在することを見い出
し、しかも、このアデニレートキナーゼは容易に
純粋に精製し得、かつ酵母などに存在するアデニ
レートキナーゼに比較し、驚くほどその安定性に
すぐれた新規酵素であることを見い出し、本発明
を完成した。 すなわち、本発明は、約50℃の緩衝液中で約15
分間処理したのちの活性が処理前の活性の約80％
以上の値を保持している性質を有し、かつ次の理
化学的性質を有する耐熱性アデニレートキナーゼ
及びバチルス属に属する細菌を培養し、その培養
物から約50℃の緩衝液中で約15分間処理したのち
の活性が処理前の活性の約80％以上の値を保持し
ている性質を有し、かつ次の理化学的性質を有す
る耐熱性アデニレートキナーゼを採取することを
特徴とする耐熱性アデニレートキナーゼの製造方
法を要旨とするものである。 (a) 作用及び基質特異性 次の反応を触媒する。 AMP＋ATP2ADP (b) 分子量 ゲルクロマトグラフイーにより測定した値は、
約22000である。 (c) 至適PH 約7.5（温度30℃） (d) 作用適温の範囲 約25℃〜65℃（PH約7.5） 本発明のアデニレートキナーゼは、約50℃の緩
衝液中で約15分間処理することにより、アデニレ
ートキナーゼの残存活性がもとの活性の約80％以
上、好ましくは約90％以上、最適には約100％の
値を保持している性質を有し、特に約57℃の緩衝
液中で約15分間処理したのちの活性が処理前の活
性の約80％以上の値を保持している優秀な性質を
有している（以下これらの性質を耐熱性とい
う。）。緩衝液の濃度およびPHは特に限定されない
が、一般には濃度は5mMないし500mMであり、
PHは７ないし10.5である。特に本発明において
は、50mMリン酸緩衝液（PH7.5）を用いること
が好ましい。 次に本発明のアデニレートキナーゼの理化学的
性質を示す。 (1) 作用及び基質特異性 前記したとおり。 なお、AMP，ATP及びADPに対するミカ
エリス定数（km値）は、おのおの0.02mM，
0.04mM及び0.05mMである。 (2) 至適PH 前記したとおり。 (3) 安定PH範囲 7.0〜10.5（４℃で24時間の処理で殆ど失活が
起こらない）。 (4) 作用適温の範囲 前記したとおりであり、PH約7.5で約25℃よ
り65℃までの温度の上昇とともに活性は増大す
る。通常は、30℃において反応を行わしめる。 (5) 耐熱性 57℃で15分間の加熱に対して99％の活性を保
持し安定である。 (6) 分子量 前記したとおり。 なお、ゲルクロマトグラフイーとしてセフア
デツクスＧ−100を用いた。 (7) 力価の測定法；PH7.2，75mMのイミダゾー
ル−塩酸緩衝液中、1.5mMのAMP，1.2mMの
ATP、1mMの硫酸マグネシウム、135mMの
塩化カリウム、0.4mMのホスホエノールピル
ビン酸0.2mMの還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（NADH），5U／mlのピル
ビン酸キナーゼ、10U／mlのラクテートデヒド
ロゲナーゼを含む混合液を調製し、その混合液
に適当量のアデニレートキナーゼを加えて、
NADHの単位時間あたりの340nmの吸光度の
減少値より力価を測定し、１分間あたり２マイ
クロモルのNADHの340nmにおける吸光度を
減少せしめる酵素活性を１単位とした。 (8) 単一性；精製標品は、アクリルアミドデイス
ク電気泳動法により陽極側に移動し、単一なバ
ンドを与えた。また、SDS電気泳動法によつて
も単一なバンドを与えた。 (9) 元素分析；元素分析値にかえて、アミノ酸組
成をモル％で示す。 アスパラギン酸10.24％、スレオニン酸3.65
％、セリン1.87％、グルタミン酸12.05％、プ
ロリン6.06％、グリシン9.74％、アラニン7.64
％、シスチン（システイン）0.80％、バリン
7.37％、メチオニン2.94％、イソロイシン4.63
％、ロイシン10.55％、チロシン3.28％、フエ
ニルアラニン2.98％、リシン５・86％、ヒスチ
ジン2.52％、アルギニン７，17％、トリプトフ
アン0.65％ (10) 晶構造；現在、まだ結晶化されていないので
測定していない。 本発明のアデニレートキナーゼを製造するには
次のごとき方法を採取することができる。すなわ
ち、バチルス属に属する細菌を培養し、その培養
物から本発明のアデニレートキナーゼを採取する
ことによつて得ることができる。 本発明に使用する細菌は、本発明のアデニレー
トキナーゼを産生しうるバチルス属の細菌であり
そのような細菌であれば、いかなるものでも使用
できる。好ましい細菌としては、たとえば、バチ
ルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus
stearothermophilus）があげられる。ステアロサ
ーモフイルスとしての具体例としては、
ATCC79537954，8005，10149，12980，NCA
1503，UK−788（微工研菌第5141号）などがあ
る。 本発明における細菌を培養するに際して用いら
れる栄養培地において炭素源として、たとえば、
グルコース、シユークロース、フルクトース、殿
粉加水分解物、糖密、亜硫酸パルプ廃液の糖類、
酢酸、乳酸等の有機酸類、さらには使用する細菌
が資化しうるアルコール類、油脂、脂肪酸および
グリセリン等が使用でき、窒素源として、たとえ
ば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸
アンモニウム、アンモニア、アミノ酸、ペプトン
肉エキス、酵母エキス等の無機または有機物が使
用できる。さらに、無機塩類として、たとえばカ
リウム、ナトリウム、リン酸、亜鉛、鉄、マグネ
シウム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト等
の各塩類、必要に応じて微量金属塩、コーン・ス
テイープ・リカー・ビタミン類、核酸等を使用し
てもよく、細菌の一般的栄養培地が使用できる。 これらの培地を用いて、バチルス属に属する細
菌を20℃〜80℃、好ましくは40℃〜70℃、最適に
は60℃で約２〜６時間好気的に培養すればよい。
また、工業的には希釈率を、本発明に使用する細
菌のμmaxの0.9以上に制御して連続培養すること
が好ましい。すなわち、Ｄを本発明に使用する細
菌のμmaxの0.9以上に保つて連続培養して得た菌
体のアデニレートキナーゼ含有量は、回分法で得
られた単位菌体あたりのアデニレートキナーゼの
最大値をしのぎ、かつ菌体の生産性も高まり、特
にＤをμmax付近に保つた場合、菌体中のアデニ
レートキナーゼ含有量は実に回分法の1.3倍に向
上する。一方、Ｄを0.9μmax未満に保つて連続培
養した菌体のアデニレートキナーゼ含有量は回分
法よりも低下する。 本発明における希釈率〔ダイリユウシヨンレイ
ト（dilution rato）、以下Ｄという。〕とは、下
記の式（） Ｄ＝Ｆ／Ｖ （） Ｄ；希釈率（１／Hr） Ｆ；発酵槽に原料液を供給する速度および同時
に発酵槽よりり抜出す速度（／Hr） Ｖ；発酵槽中の液量（） によつて表わされるものである。 本発明におけるμmaxとは、細菌を連続培養す
る際のその連続培養条件における細菌の最大比増
殖速度（１／Hr）をいい、物質環境型連続培養
（ケモスタツト；ハルベルト、エルスワース、テ
リング、ジヤーナル・オブ・ジエネラル・ミクロ
バイオロジー、14巻、８号601〜622頁、1956年）
でＤを高め、菌濃度が定常値を保てなくなつた時
すなわちいわゆるウオツシユ・アウト時に測定さ
れる比増殖速度をいう。本発明における好熱性細
菌を使つてμmaxを求めるには、たとえば２〜30
容発酵槽に栄養培地を1.5〜20仕込み、40〜
75℃、好ましくは48〜61℃、PH4.5〜9.0、好ま
しくはPH6.0〜8.0に保ちながら、この細菌を接種
し、回分培養を行い、菌の生育が始まり、培養液
中の炭素源が0.01重量％以下になつた時、発酵槽
に仕込んだものと同組成の栄養培地を用いて生育
制限因子が炭素源のみである連続培養を開始す
る。こうすることによつて、物質環境型続培養法
（ケモスタツト）が設定できる。連続培養が定常
になつた後、Ｄを段階的に順次高めて行き、発酵
液中の菌濃度と、残存炭素源量とを経時的に測定
し、さらにＤを次第に高め、菌の比増殖速度を超
えた時、定常値を保つていた菌濃度が減少しはじ
め、それに反し炭素源濃度が上昇しはじめ、もは
やこれ以上のＤでは連続培養の定常性が保てなく
なつた時、これをウオツシユ・アウトと言い、こ
の時の比増殖速度がμmaxになる。 このμmaxは使用する栄養培地の種類や培養条
件によつて同一菌株でもさまざまに変化するが、
これらの組合せが変らなければ一定値を示すので
一度測定すれば、長期にわたつて信頼できる数値
となる。 本発明において、通常の前培養および回分培養
で希望の菌濃度まで培養した後、連続培養に移し
Ｄの制限を実施することができる。その時期は培
養期間中の何れの時期でもよいが、望ましくはバ
ツチ培養時の対数増殖末期に連続培養に移し、す
みやかに所定のＤに固定するのが有利である。 次に、本発明の一実施態様をバチルス・ステア
ロサーモフイラス・NCA1503の例をあげて説明
すると、グルコースを炭素源とした栄養源とした
栄養培地を用い最適温度57℃、最適PH6.8、30
容発酵槽（20仕込み）で物質環境型連続培養を
行つて、μmaxを測定したところμmax＝1.1（１／
Hr）であつた。したがつて、Ｄ＝μmaxの連続培
養を行うには、同組成の新しい栄養倍地を１時間
あたり、発酵槽仕込み液量の1.1倍、すなわち前
記式（）より22／Hrの速度で連続的に、定
量ポンプなどを用いて発酵槽中に供給し、同時に
同速度で培養液を抜出せばよい。 次に得られた培養物から、本発明のアデニレー
トキナーゼが採取されるが、培養物、分離生菌体
分離菌体の処理物、粗製酵素、精製酵素等のあら
ゆる段階で採取できる。精製法としては、通常の
酵素精製法を用いることができる。すなわち、遠
心分離等により菌体を得た後、菌体をマントンゴ
ーリン、ダイノミル、フレンチプレス、超音波処
理等により細胞破砕後、遠心分離により細胞片を
除去し、細胞抽出液を得、これに硫酸ストレプト
マイシンまたは硫酸プロタミン処理を行ない、さ
らには硫酸アンモニア沈殿、アセトン沈殿、加熱
処理等を行い、精製するためにDEAE−セルロー
スカラム等のイオン交換クロマトグラフイー、ヒ
ドロキシアパタイトカラム等の吸着クロマトグラ
フイー、セフアデツクスクロマトグラフイー等の
ゲル濾過クロマトグラフイー等のクロマトグラフ
イーを組合わせて行うことができる。このように
して本発明のアデニレートキナーゼを単離、精製
することができる。 本発明のアデニレートキナーゼは、熱に対して
非常に安定であるから、従来のアデニレートキナ
ーゼと比較して、酵素単離後、これを長期間保存
することができる。 このため、バイオリアクターと呼ばれているシ
ステムの実施が可能となる。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 実施例１、比較例１ ポリペプトン0.5ｇ／dl、酵母エキス0.5ｇ／
dl、シユークロース1.0ｇ／dl、硫酸カリウム
0.13ｇ／dlリン酸二ナトウム0.644ｇ／dl、硫酸
マグネシウム0.027ｇ／dl、クエン酸0.032ｇ／
dl、硫酸第一鉄0.0007ｇ／dl、硫酸マンガン
0.015ｇ／dl、PH7.00に調整した培地250を115
℃、10分間加熱殺菌した後、バチルスステアロサ
ーモフイルスNCA1503株をを接種し、60℃で３
時間、内圧0.5Kg／m2Ｇで通気培養した。 培養後水で冷却しながら直ちにデラパル型遠心
分離機で菌体を採取し、700ｇの菌体を得た。得
られた菌体を凍結状態で保存したのち、凍結菌体
300ｇを２倍量の0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）に
懸濁し、フレンチプレスを用いて細胞を十分に破
壊後、遠心分離により細胞片を除去し、アデニレ
ートキナーゼを含む粗抽出液を得た。この粗抽出
液600ml当り１％の硫酸プロタミン溶液300mlを添
加し、十分撹拌した後、生じた沈殿を遠心分離で
除去し、プロタミン上清を得た。この上清に固形
硫酸アンモニウムを徐々に加えて60％飽和（４
℃）とした。生成した沈殿を遠心分離により集め
再び0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）にとかしついで
20倍量の0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）に対して透
析、脱塩した。 あらかじめ、2nMメルカプトエタノール、
2mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含む
20mMリン酸緩衝液（PH7.5）で平衡化した
DEAE−セルロースカラムに上記の粗酵素液を通
じ、塩化カリウムを上記緩衝液に加えた溶液で溶
出せしめると塩化カリウム濃度0.14Mの近くで目
的のアデニレートキナーゼが溶出した。この区分
を集め、濃縮、脱塩後、さらに10mMリン酸緩衝
液（PH7.5）で平衡化したハイドロキシアパタイ
トカラムに、その溶出液を通し、10mMリン酸緩
衝液から250mMリン酸緩衝液の直線勾配の溶出
を行つたところ120mM濃度近くに目的のアデニ
レートキナーゼが溶出した。この活性区分を濃
縮、脱塩後0.1M塩化カリウムを含む50mMトリ
ス・塩酸緩衝液を溶出液に用いたウルトロゲル
ACA34クロマトグラフイーにかけたのちに、さ
らに溶出した活性区分ををあらかじめ2mMメル
カプトエタノール、2mMエチレンジアミン四酢
酸ナトリウムを含む30mMリン酸緩衝液（PHを
7.7）で平衡化したDEAE−セフアデツクスＡ−
50カラムに通じ、塩化カリウムを上記緩衝液に加
えた溶液で溶出した。その結果、塩化カリウム濃
度0.2Mの近くで精製されたアデニレートキナー
ゼが溶出した。 このようにして得たアデニレートキナーゼは、
アクリルアミドデイスク電気泳動で陽極側に移動
し単一なバンドを与え、さらにセフアデツクスＧ
−100クロマトグラフイーにおいても、分子量約
22000のところに単一のピークを与えた。 その収量は約６mgで、酵素１mgあたり約500単
位の力価をしめした。 次にこのようにして得たアデニレートキナーゼ
と比較のため、酵母から得られたアデニレートキ
ナーゼ（比較例１）の安定性を調べた。 その結果を第１図および第２図に示す。なお、
第１図はPH7.5の50mMン酸緩衝液中の各温度で
15分間加熱したときの残存活性を示したもので、
曲線Ａが実施例１、曲線Ｂが比較例１である。第
２図はPH7.5の50mMン酸緩衝液中30℃で保存し
たときの残存活性の経日変化を示したもので、曲
線Ｃが実施例１、曲線Ｄが比較例１である。これ
らの結果からあきらかなように、酵母から得られ
たアデニレートキナーゼは50℃で15分間処理する
ことにより、ほぼ完全にその活性を不可逆的に失
うのに対し、本発明のアデニレートキナーゼは50
℃ではまつたく活性を失なわなかつた。さらに30
℃では、酵母から得られたアデニレートキナーゼ
は10〜20日間でほぼ活性を失うのに対し、本発明
のアデニレートキナーゼは50日経過した時点でも
活性の低下はまつたく認められなかつた。このよ
うに本発明のアデニレートキナーゼが驚くほど熱
に対して安定であり、これを長期間保存すること
ができる性質を有している。この性質は、いまま
でのアデニレートキナーゼにはないものである。 実施例 ２〜５ 使用菌体；バチルス・ステアロサーモフイラス
NCA1503。 栄養培地組成；グルコースを炭素源として他の
組成を次のごとくのものを用いた。 グルコース1.3ｇ、酵母エキス（オリエンタル
酵母社製）1.0ｇ、ペプトン（デイフイコ製）0.5
ｇ，KH2PO40.5ｇ，Na2HPO4・12H2O0.5ｇ，
MgSO47H2O0.1ｇ，ZnSO4・7H2O.01ｇ，
MnSO4・7H2O0.01ｇ，CuSO4・5H2O0.01ｇ，
CoCl2・6H2O0.01ｇ以上のものを水道水１に溶
解した。 前培養；上記組成の栄養培地を100ml容三角フ
ラスコに20ml、500ml容三角フラスコに100mlずつ
分注し、綿栓後121℃、１Kg／cm2、10分間加圧蒸
気殺菌した。冷却後、100ml容三角フラスコにア
メリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンよ
り入手した凍結乾燥菌体を約５ml無菌的に接種し
た。ロータリー・シエイカー（高崎製作所製）を
用いて55℃で一昼夜回転振盪培養（160rpm）し
たところ、菌体の生育が見られ、濁度が高まり
660nmの吸光度（日立製作所製101型分光光度計
で測定、以後OD660nmと称す。）が0.8〜1.0に達
したので、これを次に500ml容三角フラスコに約
５ml接種した。同条件で数時間500ml容三角フラ
スコを回転振盪培養したところ、OD660nmが1.0
程度に達したので回転振盪培養を中止し、これを
前培養物として本培養への接種に用いた。 本培養；30容発酵槽を用い、上記栄養培地を
20張込み殺菌を行つた（121℃、１Kg／cm2，15
分）。培養条件を55±１℃、PH6.5〜7.0（4NNaOH
で調整）、通気量20／分（空気）、撹拌数
900rpmに設定後、前培養物を約１接種しバツ
チ培養を開始した。培養に伴い発泡したので消泡
剤（信越化学KM−70）を少量添加した。 培養開始後約2.5時間でOD660nmが1.2（0.56ｇ
乾燥菌体／）に至り、培養液中のグルコースが
ほぼ消費され、0.01重量％以下になつたので、す
みやかに連続培養を開始した。前もつて測定した
本菌のμmaxが、1.4（１／hr）であつたので、前
記した殺菌済みの栄養培地を28.0／hrの速度で
連続的に供給、同速度で発酵槽より培養液を抜出
すことでμを1.00μmax（実施例２）に設定し、発
酵槽液量の５倍量の栄養培地を用いて連続培養し
て菌体を得た。 次にＤを段階的にμmaxの0.9〔（供給抜出速度
25.2／hr）実施例３〕、0.75〔（21.0／hr）実施
例４〕に変更し、連続培養を行つて菌体を得た。 このようにして得た菌体中のアデニレートキナ
ーゼ含有量を測定して、その結果を表１に示す。
なお、表１に回分培養で得た値（実施例５）も併
記したが、これは連続培養に移行する前の回分培
養時に得た菌体の値である。 【表】 表１の結果からあきらかなように、Ｄが
0.9μmax以上において生産した菌体は、回分法を
しのぐアデニレートキナーゼ含有量を示してい
る。 実施例 ６ 30容発酵槽にグルコース1.3、硫酸アンモ
ニウム1.0ｇ、酵母エキス0.5ｇ、リン酸一カリウ
ム0.5ｇ、リン酸二ナトリウム0.5ｇ、硫酸マグネ
シウム0.1ｇを水道水１に溶解して得た培地を
20張込み、121℃、１Kg／cm2で15分間加圧蒸気
殺菌した。培養条件を57℃、PH6.5〜7.0（4N−
NaOHで調製した。）、通気量20／分（空気）、
撹抛数900rpmに設定した後、これにバチルス・
ステアロサーモフイルスATCC12980株を上記培
地であらかじめ前培養して得た、660nmでの吸光
度が約1.0に達した溶液をを１接種した。まず、
約2.5時間バツチ培養を行い、660nmの吸光度が
1.0に至つたときに、前記組成の殺菌済み栄養培
地を24.0／hrの速度で定量ポンプを用いて連続
的に供給し、同速度で発酵槽より培養液を抜出す
こにより、100の栄養培地を用いて連続培養し
て培養液を得た。培養液を水で冷却しながら直ち
にデラバル型遠心分離機で菌体を採取し400ｇの
菌体を得た。 この菌体を1.5倍量の0.1Mリン酸緩衝液に懸濁
し、ダイノミルを用いて細胞を破砕後、遠心分離
により不溶物を除去し、アデニレートキナーゼを
含む粗抽出液を得た。この粗抽出液400ml当り10
の硫酸ストレプトマイシン溶液200mlを添加後、
生じた沈殿を遠心分離で除去し、ストレプトマイ
シン上清を得た。この上清に硫酸アンモニウム分
割をほどこし、30％飽和４℃から、60％飽和４℃
の間の分画部を得た。この分画部を50mMトリス
一塩酸緩衝液（PH8.0）にとかした後、あらかじ
め上記緩衝液で平衡化したDEAE−セフアデツク
スカラムに通じ、塩化ナトリウムを上記緩衝液に
加えた溶液で溶出せしめると、塩化ナトリウム濃
度0.2Mの近くで、目的とするアデニレートキナ
ーゼが溶出した。この溶出部分を実施例１と同様
な条件下にハイドロキシアパタイトカラムクロマ
トグラフイーを行つたのちセフアデツクスＧ−75
カラムに通じ0.1M塩化ナトリウムを含む30mM
トリス一塩酸緩衝液（PH8.0）で溶出して、実施
例１と同様にアクリルアミドデイスク電気泳動で
単一なバンドを与えるアデニレートキナーゼ標品
を得た。さらに、実施例１と同様にセフアデツク
スＧ−100クロマトグラフイーにおいても、分子
量約22000のところに単一のピークを与えた。 収量は約10mgであつた。その力価は酵素１mgあ
たり約500単位であつた。
第１図は本発明のアデニレートキナーゼ（曲線
Ａ）および酵母から得られたアデニレートキナー
ゼ（曲線Ｂ）の各温度における15分間加熱後の残
存活性を示す図で、第２図は本発明のアデニレー
トキナーゼ（曲線Ｃ）および酵母から得られたア
デニレートキナーゼ（曲線Ｄ）を30℃で放置した
後の残存活性を示す図である。
Ａ）および酵母から得られたアデニレートキナー
ゼ（曲線Ｂ）の各温度における15分間加熱後の残
存活性を示す図で、第２図は本発明のアデニレー
トキナーゼ（曲線Ｃ）および酵母から得られたア
デニレートキナーゼ（曲線Ｄ）を30℃で放置した
後の残存活性を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 約50℃の緩衝液中で約15分間処理したのちの
活性が処理前の活性の約80％以上の値を保持して
いる性質を有し、かつ次の理化学的性質を有する
耐熱性アデニレートキナーゼ。 (a) 作用及び基質特異性 次の反応を触媒する。 AMP＋ATP2ADP (b) 分子量 ゲルクロマトグラフイーにより測定した値は、
約22000である。 (c) 至適PH 約7.5（温度30℃） (d) 作用適温の範囲 約25℃〜65℃（PH約7.5） ２ バチルス属に属する細菌を培養し、その培養
物から約50℃の緩衝液中で約15分間処理したのち
の活性が処理前の活性の約80％以上の値を保持し
ている性質を有し、かつ次の理化学的性質を有す
る耐熱性アデニレートキナーゼを採取することを
特徴とする耐熱性アデニレートキナーゼの製造方
法。 (a) 作用及び基質特異性 次の反応を触媒する。 AMP＋ATP2ADP (b) 分子量 ゲルクロマトグラフイーにより測定した値は、
約22000である。 (c) 至適PH 約7.5（温度30℃） (d) 作用適温の範囲 約25℃〜65℃（PH約7.5）
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14140580A JPS5765181A (en) | 1980-10-09 | 1980-10-09 | Heat-resistant adenylate kinase and its preparation |
| CA000387500A CA1173768A (en) | 1980-10-09 | 1981-10-07 | Adenylate kinase and process for the production thereof |
| US06/309,346 US4584272A (en) | 1980-10-09 | 1981-10-07 | Adenylate kinase and process for the production thereof |
| DK445981A DK165702C (da) | 1980-10-09 | 1981-10-08 | Varmeresistent adenylatkinase og fremgangsmaade til fremstilling heraf, samt stabilt, immobiliseret adenylatkinase-kombinationsprodukt og fremgangsmaade til fremstilling heraf |
| EP81304668A EP0050007B1 (en) | 1980-10-09 | 1981-10-08 | A heat-resistant adenylate kinase, a stable immobilized adenylate kinase composite material, and processes for their production |
| DE8181304668T DE3173725D1 (en) | 1980-10-09 | 1981-10-08 | A heat-resistant adenylate kinase, a stable immobilized adenylate kinase composite material, and processes for their production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14140580A JPS5765181A (en) | 1980-10-09 | 1980-10-09 | Heat-resistant adenylate kinase and its preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5765181A JPS5765181A (en) | 1982-04-20 |
| JPH0154995B2 true JPH0154995B2 (ja) | 1989-11-21 |
Family
ID=15291231
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14140580A Granted JPS5765181A (en) | 1980-10-09 | 1980-10-09 | Heat-resistant adenylate kinase and its preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5765181A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4725249B2 (ja) * | 2005-08-26 | 2011-07-13 | マツダ株式会社 | 自動車の車体構造 |
-
1980
- 1980-10-09 JP JP14140580A patent/JPS5765181A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5765181A (en) | 1982-04-20 |
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