JPH01501796A - 脈管疾患の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 脈管疾患の検出 背景 本発明の技術分野はアテローム硬化性病巣のような脈管疾患患の検出方法及び手 段に関し、特に標患された、標的探索する、生物学的活性な分子を使用して異常 な動脈構造成或は組成を検出する方法及び手段ＫＩＳ４ｉする。

アテローム硬化症は動脈、特に大きい動脈壁の厚くなること及び硬化を引き起こ す病気であり、動脈管腔内で形成する突起した線維性ブックの病巣を特徴とする 。ブックは腹部大動脈、冠状動脈或は頚動脈において最も行きわたっており及び 年齢と共に進行して増大する。ブックは、通常、ふくれて管腎になるドーム形状 の不透明なびかびか光る表面を与える。病巣は、代表的には、脂質及び壊死性細 胞砕片の中央コアがコ２−ゲ／縁維性筋性層でおおわれて成る。複雑な病巣は、 また、石灰化沈着を含み及び種々の度合の壊死、血栓症及び潰瘍を示すことにな る。

プラク及び関連した沈積物によって提示される動脈管腔の変形は閉塞した血液流 となり、治療しない場合は、終局的ＫＪ２！血性心臓病、発作成は他の器管の疾 患になる。

現在、冠状アテローム硬化症は依然アメリカ合ポ国において第−位の死因であり 、毎年５０万を越えるアメリカ人の生命をうばっており、癌で死ぬ人のおよそ２ 倍である。

残念なととに１アテローム硬化症及び１４遅した脈管疾患の初期段階は臨床上付 らあられれてとないことが最もしばしばである。脈管閉基或はアテローム硬化性 病巣から生じる種々の身体器官に対するスＦレスをおくらせる或は低減させるラ イフスタイル変化、薬剤治療及びその他の手段が存在するので、脈管系における アテローム硬化症を早期に検出することは、予防介入をそれが最も有効になり得 る時に可能にする点で相当に価値がある。

脈管疾患を評価する慣用のアプローチである動脈造影撮彰法は、動脈内の閉塞を イメージするためにカテーテル法及び放射線不透過性智質を血液流中に注入する ことを含む。この方法は、感染、動脈の穿孔、不整脈、発作、梗塞形成及び死で さえ起こり得る点で、有意の病的状態を含む。動脈造影図は、危険が含まれるた め、代表的には、進んだ或は急性アテローム硬化症疾患を有する個人について保 存される。

脈管疾患を診断する健康な組瞭をそれ程冒さない種々の技法が提案されてきた。

これらの技法はプレチスモグラフイー、サーモグラフィ及び超音波スキャニング を含む。これらの技法のそれ以上のレビューについては、本発明者及び同業者、 リーズ（Ｌ＠ｓｓ　）　及びマイアズ（Ｍｙ・ｒｓ　）著の論文「ノンーインベ イシブダイアグノーシスオブアーテアリアルデイジーズ」、ムｎｎａｌｓ　ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍ＠ｄｉｅ１ｍｓ、２７巻、４７５−５０９頁（１９８２年 ）を参照。該論文を本明細書中に援用する。

本発明者が提案した脈管疾患を診断する別の健康な組織を冒さないアブローは、 低密度のリボたんば（（ＬＤＬ）をラジオアイソドープで標麺し及び該標除化Ｌ ＤＬを患者に投与することを含む。アテローム硬化性ブックは動脈内を循環する 血液からリボたんばくを吸収する傾向にあることから、標識化ＬＤＬをガンマカ メラ或はその他の放射検出器でイメージして脈管系におけるプラクの位置及び程 度に関するｍａを提供することができる。このアプローチに関する詐細について は、１９８５年９月１１日に出願された米国特許出顧第７７５．０９５号「メソ ッドアンドミーンズフオーデテクションオプアーテアリアルリージョンズ」及び １９８４年３月２８日に出願された米国特許出願興５９４．２４４号「インプル ーブドラジオラベルドリボプロテインズアンドメンズ７オーメーキングセイム」 を参照。これらの米国特許ｆｉｌｌ願もまた本明細書中に援用する。

標論化ＬＤＬを使用する不利益の１つは、患者自身の血管が代表的には最も適当 なリボたんばく源であり及びこのことが研究の始まりと終りに２或は５日の遅れ を要することである。このような期間は加減の悪い患者にとって間に合わないの がしばしばである。その上、本発明者及び同業者、リーズ等がジャーナルオプニ ュークリアメデイスン；２４巻、１５４〜１５６頁、１９８３年に報告した通り に、ＩＩ論化Ｉ、ＤＬは急性の、急速に成長するアテローム硬化性病巣をイメー ジする。同論文を本明細薔中に援用する。イメージする種急速ＫＬＤＬを吸収し 得ないそれ程急速に成長しないアテローム硬化性病巣の位置を決定する必要があ る。よって、脈管疾患を検出し、動脈病巣の位置を決定し及び脈管損傷の程度を 定量化することができる一層良好な非侵入性の技法及び試薬の必要が存在する。

発明の要約 無症候性のアテローム硬化症を含む脈管疾患は、接合（ｅｏｎｊｔｌｌｍｔｅ　 ）診断試薬を患者に投与し、次いで患者の脈管系内の接合試薬の位置及び濃度を 検出することによって診断することができる。接合試薬は、標的探索する（　ｔ ａｒｇｅｔ　−ｓ＠ｅｋｉｎｇ　）　、生物学的活性分子を１ｇ分として及び体 外検出することができる標餘手段を他の成分として有する。生物学的に活性な分 子（ＲＡＭ）は、正常壁内に存在しないが、アテローム硬化症病巣中に見出され る或は正常動脈監内の血液に逐ばれる（　ｂｌｃ＋ｏｄ　−ｂｏｒｎ・）試薬に 利用され得ないが、アテローム病巣中の試薬に暴施されるかのいずれかの動［Ｒ の構造要素に対して親和力を有するように辿ぶ。

特に、発明は、放射性核種とアテローム硬化症の血液に暴露される所定の動脈壁 成分に対して親和力を有する種々の抗体或はそれらの断片との接合体（〕／シュ ゲート）を包含する。％に有用なりＡＭを有する接合された試薬を開示する。Ｒ ＡＭはエラスチン及びコンドロイチンスｙ７エー）プロテオグリカン（Ｃ８ＰＧ ）のそれぞれに対し高い親和力を有する。本発明の接合体は個々に或は互いと共 に投与することができる。

適した放射性核種はＣｏ−５７、Ｃｏ−６７、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｒｕ− ９７、Ｔｅ−９９ｍ５　Ｉ！ｌ−１１１、Ｉｎ−１１３ｍ。

ｒ−１２５、Ｔ−１２５、ｌ−１３１、Ｋｇ−１９７、Ａｔｅ−１９８、及びＰ ｂ−２０５を含む。ＲＡＭ及び放射性核種は、直接の標識によって（例えば、酸 性緩衝化反応或は酸化手ＨＫより）或は配位子交換或はキレート化によって結合 させることができる。放射性核種は、ガンマ放射線を検出することができる放射 線検出手段、例えばガンマカメラ等でイメージするのが好ましい。

放射憑映像カメラは、代表的には、転化媒質（高エネ　。

ルギーガンマ線が吸収されて、電子に取って代り、電子は軌道状態に戻る際に光 子を発する）、空間検出室内に配置された光電検出器（発生された光子の位置を 決定するため）、室内で検出される光子を分析し及びイメージを作る回路部品を 用いる。

発明は、また、非放射性標識手段、例えば磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）系に おいて検出することができる磁気コントラスト剤によって実施することができる 。このような系では、強い磁場を用いて患者の体内の原子の核スピンベクトルを 一列にそろえる。次いで、磁場を乱し及び患者のイメージを平衡アラインメント への核の戻りとして読む。本発明において、標的探索性ＲＡＭを反磁性コントラ スト剤、例えばガドリニウム、アバルト、ニッケル、マンガン或はＭＷ会合体結 合させて体外でＭＲＩ系によってイメージする接合診断試薬を形成することがで きる。

次に１発明を所定の好ましい実施態様に関連して説明するが、種々の変更、付加 及び削減を発明の精神或は範囲から逸脱しないでなし得ることは明らかである。

例えば、モノクローナル抗体（或は断片）、並びにポリクローナル抗体（或は断 片）を標識探索性、生物学活性分子として用いることができる。加えて、ヒト抗 体（すなわち、ヒト−ヒト或はヒトー動物ハイブリドーマから得られる）、並び に動物抗体を用いることができる。

その上、種々の抗原性決定因子を用いてアテローム硬化性プラクを識別し得るこ とは明らかである。下記の実施態様はかかる２つの決定因子、エラスチン及びコ ンドロイチンスルフェートプロテオグリカン（ｃｓｐｃ）を詳細に説明するが、 その他の決定因子も、また、ＲＡＭを高めさせ及び接合試薬において用いること ができる標的として用い得ることは明らかである。このような決定因子は、アテ ローム硬化性円滑筋細胞の表面上に存在することが報告された特定のコラーゲン 及び糖たんばく種、例えばＨＬＡ−ＤＢ或は同様のたんばくを含むことかでアテ ローム発生の間に、動脈壁に化学変化が起きることが知られている。典型的には 、エラスチン繊維の断裂、内皮う胞の分裂、線維芽細胞及び円滑筋ｌａ胞の増殖 が観察される。増大したコラーゲン合成及びコラーゲンタイプの分布の変化もま た起きる。新しい毛管内方成長及びコレステロールが大量に蓄積した７オーム細 胞の存在することもまた典型的である。

アテローム硬化症病巣が形成される間に１動脈壁内に存在するエラスチンは酵素 によって分解されるようになる。この断裂されたエラスチンは本来の工２スチン と化学的に異る。加えて、動ＭＷを被覆するプロテオグリカンの組成は著しく変 わり、他のプロテオグリカンの含量は減少し及びコンドロイチンスルフェートプ ロテオグリカンの含量は増大する。これらの２つの化学変化を本発明において活 用する。

発明の好ま゛しい実施態様では、エラスチン及びコンドロイチンスルフェートプ ロテオグリカン（Ｃ８ＰＧ）Ｋ対して抗体を起こさせる。次いでこれらの抗体或 は抗体から派生される断片を用いて接合診断試薬を作り出す。

次に、発明を所定の非制限例に関して説明する。

例１ ヒトエラスチンに対する抗体を使用してラビット大動脈中のバルーン血管形成誘 導化病巣をイメージした。特定の抗体は、ｋンシルパニャ大学のジエイ・ローゼ ンブルーム（Ｊ、　Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ　）博士から得たポリクローナル羊抗 ヒト肺無定形エラスチン抗体であった。かかる抗体は、独立に既知の技法によっ て発生させることができる。

例えば、ヒトエラスチンを局部検体から単離し、フロイン）　（Ｆｒ＠ｕｎｄ　 ）完全アジュバントで乳化し、次いで羊の６数の部位に皮下注射（例えば、１ｏ 〜２０ミｌＪグラム）することができる。１力月の後くい動物を（例えば、同じ 抗原性製剤５ミリグラムで）増強させることができ、その後１週間して動物の血 を取ることができる。プロティンＡ−セファロースアフィニティークロマトグラ フィーカラムの中に通すことによって、全血血清から免疫グロブリンフラクショ ンを回収することができる。

本発明では、抗エラスチン抗体に、マクファーラン（ＭｅＦａｒｌａｎｅ　）が ネイチャー、１８２巻、５５頁（１９５８年）に記載する通りにしてｌ−１２５ （すなわち、ヨウ化ナトリウム）を標識した。過剰のｌ−１２５は、ｐＨ約８の 生理的食塩水に対して透析することができる。■−１２５榎詠抗体を、次いで、 ４週間前に腹部大動脈のバルーンジエンドシリアライゼーション（ｄｉｅｎｄｏ 　−ｔｈ・１ｉａｌｉａｚａｔｉｏｎ　）を受けていた３匹のラビットの各々に 静脈内注射した（１匹当りおよそ３００ミリキユリー）。

２４〜４８時間後に、ラビットを犠牲に供し、動脈を取り出し、標準食塩水で洗 浄し、縦に切り開き、ポリエステルラップでおおった。動脈を次で注意深く高速 Ｘ線フィルムのシート上に置き及びオージオラジオグラフを４週間発生させた。

オージオラジオグラフは、前の損傷によって主成され縁においてイメージ上には つきりしたエラスチンの局在化を示した。この病巣はリボたんばくの蓄檀及びそ の他の病理学的変化を含む多くの重要な点でヒトの動脈硬化症に似ているので、 抗血清が損傷部位に局在化し及びそのイメージングを与え得ることは、本発明が 脈管疾患をイメージするのに実用性のあることを立証する。

例２ 第２の例では、ヒＦコンドロイチンス／Ｌ／７エートプロテオグリカンに対する 抗体（抗−ｃｓｐｃ）を同様にして用いて＼あらかじめバルーンジエンドシリア ライズしてｉいたラビットの腹部大動脈をイメージした。特定の抗体は、ワシン トン大学のエム、ラージ（Ｍ、Ｌａｒｋ　）博士及びティ、ウィツト（Ｔ、　Ｗ ｉｇｈｔ　）　博士から得たモノクローナル抗−〇ＳＰＧ抗体であった。かかる 抗体は独立に既知の技法によって発生させることができる。例えば、活性断片の モノクローナル抗体は、一般に知られている細胞融合技法（ジー、コーラ−（Ｇ 、　Ｋｏｈｌ＠ｒ　）　、シー。

ミルスタイ７　（Ｃ，Ｍｉ１ｓｔ＠ｉｎ　）、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｔ＋ｎｏ １．６５１１〜５１９頁（１９７６年）及びエム、シュルマン（Ｍ、　５ｅｈｔ ＋１ｍａｎ　）等、ネーチャー２７６　２６９〜２７０頁（１９７８年）を参照 ）を適用して抗体を産生ずるハイブリドーマを得ることにより、ハイプリドーマ からモノクローナル抗体を引き出すことによって、（必要に応じて）モノクロー ナル抗体にたんばく分解を行って活性Ｆａｂ断片を得ることによって得ることが できる。

モノクローナル抗体は、禰乳動物のリンパ球（好ましくは、膵臓細胞）を得、リ ンパ球に抗体を産生させ（例えば、哺乳動物を前もって感心のある特定の抗原性 決定因子で免疫にすることによって）、リンパ球を骨台騰（（或は他の不死の） 細胞と融合させて４種細胞を形成し、次いで選択された雑種細胞コロニーをイン ビボ或はインビトロで培養して構造及び反応性が同一の抗体を生じることによっ て作る。

フンドロイチンースルフェー）フロチオグリカンに対するモノクローナル抗体（ 抗−ｃｓｐＧ）の特定の場合、このような抗体は、円滑筋細胞からＣ３ＰＧｔ− 組織培養で単離することによって作ることができる。ｃｓｐａは培地から取り出 し及びイオン交換クロマトグラフィーで精製することができる。マウス或はその 他の動物に、上記のように誘導したｃｓｐｃを７０イ／ドアシユバントに溶解し た溶液（すなわち、アジュバント１ミリリツトルで乳化した媒地１ミリリットル 自りＣ３ＰＧ１〜５ミリグラム）を動物の腹膜腔に注入して誘発させることがで きる。６週間後に、同様の注入薬（アジュバント無し）をブースターとして投与 することができる。

およそ１０日した後に、マウスを殺してＲＨを水モジネートする。上に挙げたコ ーラ−及びミルスタインの手順によって膵臓細胞に！ウス膏蝕腫を交雑させる。

そのようにして産生じたハイブリドーマをスクリーンしてヒ吠動脈フンドロイチ ／スルフェートプロテオグリカンと反応する抗体を産生ずる細胞系統を選ぶ。大 規模の抗体産生けかかる抗−Ｃ８ＰＧ産生細胞系統から檀々の技法によって得る ことができ、このような技法として腹水腫瘍の誘発（すなわち、プリスタンを入 れた後）及びプロティンＡ−セファロースアフイニティクロマトグラフィーによ って腹水液から該抗体をｍｂすることを含む。

本例では、純ＩｇＭ抗体に例１に記載したのと同じ方法によってｌ−１２５を標 識し及び３匹のラビットの各々に同様の方法で注射した。上述した通りにして生 じたオージオラジオグラフは、標識した抗−〇ＳＰＧ抗体が動脈壁の探の損傷さ れた領域をイメージし、健康な動脈壁領域も急速なりエンドシリアライゼーショ ンが起きているそれらの領域もイメージしないことを明瞭に示した。

これより、この抗体は例１で検討した抗−エラスチン抗体によって検出されるも のと異なる脈管疾患の態様をイメージすることができる。

比較のために、３匹のラビットを同様に非特異的ＩＫＧで処理し及び３匹のラビ ットを非特異的ＩｇＭで処理した。

各々の場合において、ｌ−１２５標麩した非特異的免疫グロブリンを注入して４ ８時間後の動物の大動脈の同様のオージオラジオグラフを作った。これらの抗体 の場合、病巣の縁の極めて弱いイメージのみが見られた。イメージは上述した特 異的抗体のいずれかに関して見られたイメージにいささかも似ていなかった。

一般的なハイブリドーマ生成方法のそれ以上の説明については、セレクテッドメ ソッズインセルラーイミュノロジー（マクエル（Ｍｉｓｈｅｌｌ　）及びシイギ （Ｓｈｉｉｇｉ　）Ｎ集、ダブリュ、エッチ、フリーマンアンドカンパニー、１ ９８０年）における、オイ（０１）及びヘルツエンベルブ（Ｈｅｒｚ＠ｎｂｅｒ ｇ　）、「イミュノグロブリンープロデューシングハイブリッドセルラインズ」 及びメンツズインエンジモロジー、１０５＠、４５９〜４６９頁（１９８３年） におけるシアース（Ｓｅ脅ａｒｃ＠）及びアイゼンバース（Ｅｉｓｅｎｂｍｒｔ ｈ　）、「プロダクションオプモノクローナルアンチボディーズ・・・」を参照 。上記文献を本明細書中に援用する。ヒトハイブリド−マ生成技法の説明につい ては、１９８４年５月２９日にロイストン（Ｒｏｙｓｔｏｎ　）等に発行された 米国特許４４５１．５７０号、１９８５年７月１６日にラザルス（Ｌａｚｍｒｎ ＠）等に発行された米国特ＦＦ４５２９，６９４号及びモノクローナルアンチボ ディーズ（プレナムプレス、ニューヨーク１９ｓｏ年）Ｋおけるツ２ウスキ（Ｚ ｍｒａｖ烏に１）等、「フンチニュアスリーブロウリ７アレーテイングヒューマ ンセルラインズシンセサイジングアンチボデイオブプリデイターミングスはシフ イシテイ」を参照。これらの文献もまた本明細書中に援用する。

活性断片は本明細書中に開示するモノクローナル抗体から数多くの技法によって 誘導することができる。例えば、精製したモノクローナル抗体は、緩衝溶液中、 酵素、例えばペプシンで処理し及びＨＰＬＣゲル−過を行うことができる。Ｆａ ｂを含有する適当なフラクションを次いで収集し及びＭ濾過等によって？Ｉ縮す ることができる。活性断片を単離する一般的な技法のそれ以上の説明については 、例えば、カラ（Ｋｈａｙ　）、ＢＡ等、Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍａｄ、。

２３巻、１０１１〜１０１９（１９８２年）を参照。同文献を本明細書中に援用 する。

本発明で用いる抗体及び断面は、上述したマクファーランド技法と異る種々の技 法により、好ましくは放射性標識で様該することができる。例えば、放射性活性 分子を、また、ジエチレントリアミンはンタ酢［（ＤＴＰＡ）或はブロモアセチ ルアミノベンジルエチルアミンジアミンテトラ酸Ｍ（ＢＡＢＥ）の環状無水物と 接合して放射性核種で標識することができる。標識技法のそれ以上の説明につい ては、一般的にナトヴイツチ（Ｉｎ畠ｔｏｗｉｅｂ　）等、サイエンス、２２０ 看、６１３〜３１５頁（１９８３年）及びメアーズ（Ｍ＠ａｒｓ　）等、アナリ チ力ルパイオケミストリー１１４２巻、６８〜７８頁（１９８４年）を参照。

これらの文献を本明細書中に援用する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．脈管系の異常と関連した少なくとも１つの決定因子に対して親和力を有する 標的探索性、生物学活性分子及び生物学活性分子を標識する標識手段を有する接 合された診断試薬。 ２．標識手段が放射性核種である請求の範囲第１項記載の接合試薬。 ３．放射性核種をＣ。−５７、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｒｕ−９ ７、Ｔｅ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１３ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、 Ｉ−１３１、Ｈｇ−１９７、Ａｕ−１９８、及びＰｈ−２０３の群から選ぶ請求 の範囲第２項記載の接合試薬。 ４．標識手段が磁気共鳴イメージング技法によつて検出することができる磁気コ ントラスト剤である請求の範囲第１項記載の接合試薬。 ５．磁気コントラスト剤をガドリニウム、銅、コバルト、ニツケル及びマンガン 複合体の群から選ぶ請求の範囲第４項記載の接合試薬。 ６．標的探索性の、生物学的に活性な分子が抗体或は抗体の断片てある請求の範 囲第１項記載の接合試薬。 ７．抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第６項記載の接合試薬。 ８．抗体がモノクローナル抗体のＦａｂ断片である請求の範囲第７項記載の接合 試薬。 ９．抗体がポリクローナル抗体である請求の範囲第６項記載の接合試薬。 １０、抗体がポリクローナル抗体のＦａｂ断片である請求の範囲第９項記載の接 合試薬。 １１．生物学的に活性な分子が動脈壁の成分に対して親和力を有する請求の範囲 第１項記載の接合試薬。 １２．生物学的に活性な分子がエラスチンに対して親和力を有する請求の範囲第 １１項記載の接合試薬。 １３．生物学的に活性な分子がコンドロイチンスルフエートプロテオグリカンに 対して親和力を有する請求の範囲第１１項記載の接合試薬。 １４．無症候性動脈硬化症を含む脈管系の疾患の検出方法であつて、 Ａ．脈管系の異常に関連した少なくとも１つの抗原性決定因子に対して親和力を 有する標的探索性の、生物学的に活性な分子及び生物学的に活性な分子を標識す る標識手段との接合体を作り、標識手段は生物学的に活性な分子に結合され及び 体外的に検出することができ、Ｂ．接合体を生理的に適合し得るビヒクルの媒介 で検出するのに有効な量で脈管系の中に導入し、Ｃ．脈管壁内の接合体の位置を 、標識手段を検出することができる体外の検出手段によつて検出し、Ｄ．脈管疾 患の１存在及び程度を求めるために接合体濃度の量を１つ或はそれ以上の位置で はかることを含む方法。 １５．接合体を作る工程が、更にエラスチンに対して親和力を有する生物学的に 活性な分子を使用することを含む請求の範囲第１４項記載の方法。 １６．接合体を作る工程が、更にコンドロイチンスルフエートプロテオグリカン に対して親和力を有する生物学的に活性な分子を使用することを含む請求の範囲 第１４項記載の方法。 １７．接合体を作る工程が、更にＣｏ−５７、Ｃｎ−６７、Ｇａ−６７、Ｇａ− ６８、Ｒｕ−９７、Ｔｅ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１３ｍ、Ｉ−１２３ 、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｈｇ−１９７、Ａｕ−１９８及びＰｂ−２０３の群 から選ぶ放射性核種を標識手段として用いることを含む請求の範囲第１４項記載 の方法。 １８．接合体を作る工程が、更に放射性核種を標識手段として用いることを含み 及び脈管壁内の接合体の位置を検出する工程が、更にそれからの放射線を放射線 検出器によつて検出することを含む請求の範囲第１４項記載の方法。 １９．放射線を検出する工種が、更にガンマカメラを使用して接合試薬の標識手 段が発するガンマ放射線のイメージを検出し及び作ることを含む請求の範囲第１ ８項記載の方法。