JPH01500928A - 全血液の試料中の分析物のレベルを決定する方法および装置 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 術として内部反射分光法を使用して決定する方法に関する。

内部反射分光法は、よく知られた分析技術であり、そして多数の特許刊行物およ び他の刊行物の主題となってきており、それらの内容を引用によってここに加え る。この分野における草分けの研究は、Ｎ、Ｊ、ハリツク（ｌａｒｒ　１ｃｋ） によって１９６０年代の早期になされ、そして、なかでも、本、Ｉｎｔｅｒｎａ ｌＲｅｆｌｅｃｔｉｏｎ　５ｐｅｃｔｏｒｏｓｃｏｐｙ、ウィリイ（Ｗｉｌｅｙ ）　１９６７年に開示されている。概観はＰ、　Ａ、ウィルクス（Ｍｉｌｋｓ） 、　Ｊｒ、およびトマス・ヒルシュフェルト（Ｔｏｍａｓ　）ｌｉｒｓｃｈｆｅ ｌｄ）の論文：　ＩｎｔｅｒｎａｌＲｅｆｌｅｃｔｉｏｎ　５ｐｅｃｔｏｒｏｓ ｃｏｐｙ、　ＡｐＨｉｅｄ　５ｐｅｃｔｏｒｏｓｃｏｐｙ　Ｒｅｖｉｅｓ。

１　（１）、９９−１３０（１９６７）に記載された。

簡単に述べると、内部反射分光法は、試料の試検に使用する放射を、適当な反射 要素に関して、それが反射要素を通過して出てしまうまう前に、反射要素の内部 表面で１または２回以上完全反射するように、向けることによって実施される。

入射光が屈折率ｎ１の光学的に密の物質から屈折率ｎ２（ｎ＋＞ｎ＊）の光学的 に疎の物質へ、物理的屈折の既知の法則から得られる臨海角θＣを越える入射角 θで入射するとき、全反射が起こる。

反射部位において、入射光の波は疎媒質において狭い境界層中に伝搬する。疎媒 質が吸収性であるとき、伝搬する波［エバレッセント波（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ 　ｗａｖｅ）］はそれが戻る前に減衰する。あるいは、エバレッセント波は疎媒 質中で蛍光、リン光またはルミネセンスの放射を生成することができる。

変更された光、すなわち、それぞれ、反射要素を通過して出る減衰した放射、散 乱した光または蛍光、リン光またはルミネセンスの放射の特性を決定し、そして 疎媒質を特徴づける分析的目的で使用することができる。

境界層中に伝搬する光波は、しばしば、エバレッセント波と呼ばれ、その浸透深 さは入射する波の波長のほんのわずかの部分である。さらに詳しくは、その表面 において電界強度がその値のｅ′″１に低下するために要する距離として定義さ れる浸透深さｄｐｌは、次の式によって与えられる：内部反射分光法を取扱う特 許文献から、次の特許をこの出願に最も関連がある特許として述べることができ る：米国特許（ＵＳ）第３．３０８．７０９号（Ｈａｒｒｉｃｋ）は、特定の形 状の内部反射要素の特性を提案しており、ここで光を反射要は湾曲した表面を有 し、その結果、発生する反射の数およびより希薄な媒質の中に光線が浸透する深 さを調節することが射要素の特性を提案しており、ここで反射した光線は第１表 面におけるある点から対向する表面における反射によって第１表面の同一の点に 再反射され、これはこの要素を微細な試料に関連する使用に適するものとする。

米国特許第３．４３１．４１１号（）Ｉａｒｒｉｃｋ）は、エアロゾールの分析 における内部反射分光法の使用を提案している。

米国特許第３．９３９．３５０号（Ｋｒｏｎ　１ｃｋ）は、イムノアッセイ法に 関連する反射要素の使用を開示している。

度の提供に関する。

米国特許第４．０５０．８９５号（Ｈａｒｄｙ）は、分析物と選択的に結合して 導波管の光透過性質を測定可能に変化させる物質を、その周辺の表面に有する、 導波管を提案している。

米国特許第４．１６９．６７６号（Ｋａｉｓｅｒ）は、血液中の代謝生産物の量 を決定するための内部反射分光法の使用に関する。この特許は、生物学的組織に 対して配置された反射要素（ＡＴＲ−板）を使用する非侵略的方法を特許請求し ているが、また：体から取り出した血液を反射要素の測定表面にわたって流す試 験の実施について簡単に述べている。この特許の開示によれば、決定は赤外線に より実施し、そして血球からの影響あるいは反射要素を全血液の使用に適するよ うにするために必要な反射要素の特別の向きおよび形状のいずれについても述べ ていない。

米国特許第４．３２１．０５７号（Ｂｕｃｋｌｅｓ）は、Ｗｏ　８１００９１２ 号に対応し、縦方向の導波管を含む分析装置を開示している。全血液に関連して 使用するために好ましい実施態様は、大きい分子および血球を排除するバリヤ一 層を有する。

米国特許第４．３６８．０４７号（Ａｎｄｒａｄｅ）および米国特許第４．４４ ７．５４６号（Ｈｉｒｓｈｅｆｅｌｄ）は、イムノアッセイに関連する内部反射 分光法の使用に関する。

するとき、多数回使用の反射要素の光学的に清浄な表面を得るたという問題を取 扱っている。

欧州特許（ＢＰ）　７５３５３号（Ｂａｔｔｅｌ　ｌｅ）は、内部反射分光法を 分析法へ適用することに関し、ここで分析物は特別の反応成分と反応して、反射 要素の表面上に分析物−反応成分の生成物を生成する。

欧州特許１７０３７６号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）は、測定のため反射要素から出る 光の特定の部分のみを利用する、光学的分析法に関する。

カイザー（Ｋａ　１ｓｅｒ）は、生物医学の工学に関するＩＥＥＢ会報（ＩＥＥ ８　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｃｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｉｎｇ）、ｖｏｌ　ＢＭＢ−２６，５９７−６００ページにおいて、クエン酸塩 血液の赤外線分光法を使用する内部反射分光法における光源としてレーザーを使 用することを記載している。赤外線分光法は生物学的試料について使用が制限さ れる。なぜならば、水の分子の妨害が存在し、これは解釈を妨害し、そして制限 された範囲の成分のみをそれらの波長において検出できるだけであるからである 。さらに、クエン酸イオンはカチオン、ことにカルシウムイオンと錯化し、この ことは試料中のそれらのイオンの濃度を決定できないことを意味する。血液を導 波管の上に流すと述べられている。

ゲンドレアウ（Ｇｅｎｄｒｅａｕ）は、アプライド・スペクトロスコピー（Ａｐ ｐｌｉｅｄ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）　（１９８７）３５　、３５３−３５ ７において、減衰全反射の技術とともに赤外線分光法を使用して、全血液から蛋 白質の表面上への吸着を研究することを記載している。赤外線分光法の使用は、 前述の問題および制限を有する。導波管は液体試料で取囲まれているように思わ れる。

を記載しており、ここで試料と接触する導波管の１または２以上の表面において 全反射した光が２以上のパラメーターの同時測定のために分析される。１つの実 施例において、一方の表面は試料中の分析物と特異的に反応する試薬で被覆され 、他方の表面は被覆されず（あるいは試料中の化合物の吸収を妨害する成分で被 覆される）、そしてそれぞれの導波管を伝導した光が比較される。実際には、記 載されるすべての実験は溶血した血液について実施されて所望の測定が得られる であろう。例示されている装置は、導波管として試料キュヴエドイツ国特許第３ ．５３２．５６３号（ＡＶＬ　ＡＧ）は、導波管が試料と接触する被膜を支持す る装置を記載している。被膜中のある成分の蛍光は、試料中の分析物の濃度に依 存する。光は導波管の被膜されない部分における全反射、および導波管および試 料のそれの中間の屈折率を有する被膜中への屈折によって被膜へ伝導されること ができる。放射さえた蛍光輻射は検出手段へ直接伝導される。伝導された励起す る輻射は分析されず、また消失する波の吸収による複写の減衰は検出されない。

血液試料の分析のために現在実施されている光学的方法の以下の説明は、本発明 の背景に関係する。すべてのこのような方法は、光学的に透明な試料を生成する ために種々の準備を利用する。これらの種々の準備のうちで述べるべきものは、 次の通りである部分析装置の中へ血液試料を導入する前に、血液試料を予備処理 して、それを血漿または血清相および血球に分離すること：血球を保持しかつ血 漿相をフィルター層に通過させこフィルター層を有する使捨て要素を使用するこ と；分離手段、例えば、透析、遠心および分析装置における溶血を組込むこと。

臨床的分析において、提供される結果が患者の保護に最大に関連があるようにす るために、手順／分析装置の操作を出来るだけ簡単なかつ迅速にすることは、常 に強く強調される目的である。分析を患者に隣接してかつ中央実験室の外部で実 施できることは１つの利点である。さらに、分析の経済的コストは、現在、主要 な考慮の１つである。

したがって、本発明の目的は全血液について使用するための改良された分析法を 提供することである。

発明の開示 全血液の試料中の分析物のレベルを、分析技術として内部反射分光法を使用しか つ反射要素を前記試料に対して暴露して、決定する本発明による方法は、反射要 素を、試料および重力の場または重なった力の場に関して、前記基の影響下に部 位から除去されるように方向づけ、そして本質的に血球不含の血漿相からなる境 界層が活性反射部位に隣接して設けられた後、決定を実施することを特徴とする 。

本発明による方法は、血液試料を光学的に透明にする必要性を排除する、高度に 有利なかつ実施容易な全血液を分析する光学的方法を提供する。その最も直接的 な実施態様において、重力の場を利用して血球を反射要素の活性反射部位から離 れる方向に引いて、反射要素の活性部位に隣接して血球不合血漿相の境界層を残 す。１または２つ以上の反射部位からの血球の除去は、添加剤、例えば、凝固防 止剤、好ましくはカチオンと複合体を形成しないもの、より好ましくはヘパリン の添加によって促進することができる。

この境界層は非常に短い期間内で確立されるであろう。凝固防止剤としてヘパリ ンを使用する場合、血球の凝集が起こり、重力下に血球の急速な移動が発生しそ して境界層の形成が促進される。ヘパリン添加した血液試料を静置すると、適切 な厚さく約１μｍ）の境界層が数分の１秒以内で形成することをわれわれは発見 した。こうして、本発明の方法によって提供された分離は、いかなる有意な程度 にも、分析に要する時間を延長しない。

血球不含層の形成に重力の場を利用するとき、時間または経済性の観点からこの 手順のコストを増加する分離を達成する追加の手順は不必要である。しかしなが ら、ある目的に対して、重なった力の場、例えば、遠心の場または血球を動かし て血球不合血漿相を達成することのできる任意の他の場に血球を暴露することが 有利であることがある。

反射要素は、任意の適当な形状、例えば、プリズムまたは線維の形状を有するこ とができ、そして適当な光学的性質を有する任意の材料から製造することができ る。ガラス、石英ならびにプラスチック材料を反射要素のために使用できる。

好ましくは、反射要素からなる導波管は非常に薄く作る；１００μｍより小さく 、好ましくは１０〜５０μｍの厚さは有利である。その理由は、反射要素の所定 の長さについて、反射部位の数は厚い反射要素よりも薄い反射要素についてより 多いことにある。薄い反射要素について見られる試料との相互作用の増大は、よ り大きい感度を生ずる。

適切な機械的性質を提供するために、反射要素を支持体上の被膜として形成する ことが有利であることがある。その場合において、支持体は、反射要素と支持体 との間の界面において全反射を生ずる材料から作るか、あるいはその材料からな るべきである。

測定の順序の範囲内で、血球不含層と接触しない反射要素上の反射部位は、標準 の光学的条件の環境、例えば、一定の屈折率および吸収率に暴露すべきである。

本発明による方法は、血液中に存在する多数の種の決定に使用できることが考え られる。述べるべき種の例は、ヘモグロビン、ビリルビン、全蛋白質、グルコー スおよびクレアチニンである。この方法の実施のために適当な波長または波長の 範囲は、検出すべき種のスペクトル的性質から選択する。

紫外線または可視光を使用することは高度に好ましい。なぜなら、赤外線は水分 子によって吸収され、透過した光の分析を複雑とするからである。

グルコースおよび他の代謝物質の決定のため、赤外線範囲からの波長、好ましく は近赤外線範囲から波長は有利であろうと考えられる。ビリルビンおよびヘモグ ロビンの決定のため、可視光または近赤外線範囲から選択した波長は適当である と推定され、そして全蛋白質の決定のため、紫外線範囲からの波長を選択すべき である。この方法はビリルビンの測定においてとくに価値があり、さらになお一 層、好ましくは血漿中のヘモグロビンの測定においてとくに価値がある。この方 法によって、溶血の程度を推定することができる。

直接検出できない分析物は、試料を適当な試薬に対して暴露した後、決定するこ とができ、次いで分析物と試薬との間の反応生成物の生成は本発明の方法に従っ て決、定することができる。試薬は試料に添加することができるか、あるいは反 射要素の血液接触表面に、薄い、好ましくは単分子被膜として固定化することが できる。このような分析物／試薬の例示的例はＨ”／ｐＨ指示薬；０２／レドッ クス指示薬である。

かなりの数の分析物は、分析物特異的酵素反応を、直接にあるいはそれ以上の酵 素反応を介して、減少したニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは減少し たニコチンアミドジヌクレオチドホスフェートの形成または消費と結合すること によって、酵素的に測定することができる。このような反応は、本発明によって 、全血液中で、３４０ｎｍまたは３６６ｎｒｎにおけるエバレッセント波の測定 によって、あるいはエバレッセント波による蛍光の測定によって測定することが できる。このような分析物／酵素の例示的例は次の通りであるニゲルコース／ヘ キソキナーゼ、グルコース−６−ホスフェ−ドブヒドロゲナーゼ：クレート／ウ リカーゼ、キサンチンオキシダーゼ。

他の分析物は、全血液中において、ｏ２またはＨ÷の発生または消費を、直接に あるいは中間の反応を介して、測定することにより、ｐＨ指示薬またはレドック ス色素の変化を観測することにより、本発明によって酵素的に測定することがで きる。このような分析物／酵素の例示的例は次の通りである二アミノ酸／アミノ 酸デカルボキシラーゼ；グルコース／グルコースオキシダーゼ。

さらに、分析物は、全血液中において、本発明の方法によって光学的手段によっ て観測できる、酵素結合または他の非アイソトープ的免疫化学的技術によって測 定することができる。

与えた例のすべての本質的要素は、試薬および反応生成物のいずれも血液試料中 に存在する細胞の要素を損傷しないことであるこに注意すべきである。この方法 は、測定における細胞の含量を含む目的で溶血および細胞溶解を起こす、別の測 定工程と組み合わせて使用できる。

本発明の別の好ましい実施態様において、この方法は、試料を、異なる技術によ って、適当には電気化学的測定電極、例えば、イオン選択的電極、例えば、Ｋ” 、Ｎａ＋またはＣａ＋イオンの選択的電極、ｐＨ電極または酸素電極を使用して 分析する工程を含む。好ましくは、この方法は試料中の溶血の程度を推定するた めに使用し、そしてこうして電極による分析によって得られる価値を補正して、 観測する種の血漿レベルを得ることができる。

また、本発明は、全血液の試料中の分析物のレベルを決定する装置に関し、この 装置は反射要素を含んでなり、反射要素はそれへ伝導される光を受取る入口部分 および反射要素を通過した光のための出口部分を有し、反射要素は１または２以 上の反射部位をもつ試料接触表面を有する活性な前部を装備しており、反射要素 は、この装置の正規の使用において試料に関して、重力の場または重なった力の 場の影響下にある血球が反射要素の活性な前部から除去されるように配置されて いることを特徴とする。

光は反射要素において出口部分と出口部分との間で内部全反射され、そして使用 の際試料により減衰する。出口部分は、例えば、内部全反射する光の減衰を測定 するための検出器への接続に適する。

本発明による装置において、試料と接触しないで位置する反射部位のいずれも標 準の光学的条件の環境に暴露されるべきであることを理解すべきである。

重力の場を利用して血球を反射要素の活性な前部から除去する好ましい実施態様 において、本発明による装置は、さらに、試料入口手段、試料入口手段に接続し た試料キュヴエット手段を含み、反射要素は、その試料接触表面が試料キュヴエ ット手段の土壁を提供するように位置している。

本発明による装置のほかの好ましい実施態様において、光を反射要素へ伝導する 光源手段および反射要素の出口部分から伝導された光を受取る光検出手段が設け られている。

光源手段および光検出手段は、それら自体よく知られた任意の便利な手段である ことができる。それらは、好ましくは、紫外線または可視光を、それぞれ、放射 および検出するために適する。光源は単色光または多色光を放射することができ る。後者の場合において、本発明による方法の実施において使用可能な波長を選 択する手段は、光路中に、反射要素の出口部分より上流にあるいは反射要素の出 口部分より下流に、しかし光検出手段より上流に設けることができる。

適当な光検出手段は、受取った光の強度を反映する電流または電圧の信号を発生 する光電装置である。本発明による装置は、好ましくは、それら自体よく知られ ている適当な信号処理手段および出力手段を含有するか、あるいはそれらに接続 されている。

ある目的に対して、本発明による装置を使捨て単位とじて提供することが適当で あるように思われるであろう。その場合において、光源手段および光検出手段は 、好ましくは、使捨て単位を受容するために適合した装置内に位置し、そして本 発明による装置はそれを外部の光源手段へ光学的に結合する光入口手段、それを 外部の光検出手段へ光学的に結合する光出口手段を含む。

血液の同一試料を多数回分析するために適する装置を作るため、それ以上の測定 手段、例えば、電気化学的測定電極、を装置内に含めることが好ましい。

しかしながら、本発明による装置は、また、試験管などの中に含有される試料の 中に挿入するために適した装置として具体化することができる。

試料容器手段中に収容された全血液の試料中の分析物のレベルを決定する本発明 による装置は、前記装置の実質的な部分を取囲むが、内部の反射要素の試料接触 表面を露出して残すシールド；光を反射要素の中に向けかつそこから遠ざける光 案内手段：前記装置を試料容器手段に取付けて、測定期間の間、装置を試料に関 して静止して維持し、そして重力の場または重なった力の場の影響下にある血球 が反射要素の試料接触表面から除去されるように、反射要素の試料接触表面を方 向づけるための手段を含んでなることを特徴とする。

本発明は、また、カリウム測定手段を含んでんなる、全血液の試料中のカリウム のレベルを決定する分析器に関し、この分析器は前記試料中の溶血のレベルを検 出する手段を含む。

全血液中のカリウムのレベルの測定に関連して、試料はわずかな程度さえの溶血 、すなわち、血液の破壊を行なっていないということが主に重要である。なぜな ら、血球は血漿相よりもかなり高いカリウムレベルを含有し、そえゆえ数パーセ ントのわずかの溶血さえカリウムの決定に重大な誤差を生じうるからである。

こうして、例えば、３％の溶血が正常の細胞数をもつ血液の試料中に起こった場 合、血漿のカリウム濃度は約２モリモル／１だけ増加する。これは正常であると 宣言された、これにより適当な処置を拒否された、生命に危険を及ぼす低カリウ ム血症をもつ患者を生じつるか、あるいは低カリウム血症であると宣言され、こ れによって不適切に処置される、カリウム濃度が正常である患者を生じうる。

これが意味するように、血液試料中の溶血のレベルを検出する手段を備えたカリ ウム分析器によって、医者はカリウム値の臨床的信頼性を評価できるようにさせ る。

血液試料中の溶血のレベルを検出する手段は、反射要素からなることが好ましい 。本発明によるの好ましいカリウム分析器は、試料、入口手段、前記試料入口手 段に接続しそして試料を収容しかつ試料を反射要素へ暴露するための試料キュヴ エット手段を含み、反射要素は試料キュヴエット手段の土壁中に設けられている ことを特徴とする。

これに関して、「試料を収容する」は試料の体積全体またはその一部のみを収容 することを意味することを述べるべきである。

図面の簡単な説明 本発明を、次の説明および添付図面によって、さらに例示する。

第１図は、本発明による方法を実施するための実験装備を図解する。

第２図は、第４図の実験装備によって得られた結果を示すグラフである。

第３図は、溶血のレベルを検出するための反射要素を備えた全血液カリウム分析 器を線図的に示す。

第４図は、試薬を試料に添加するための手段を有する全血液分析器を線図的に示 す。

第５図は、自動化された分析器のキュヴエットの縦断面図である。

第６図は、同様な使捨てキュヴエットの縦断面図である。

第７図は、試験管中に挿入するために適当な装置を示す。

第８図は、第７図の活性な前部を、拡大した縦部分断面図で示す。

本発明の好ましい実施態様 第１図は、本発明による方法の評価において使用する実験装備を線図的に示す。

ブロックの形状の容器手段１は２つの半分の部分１５および１６からなり、そし てそれらの部分は０．１５ｎｕｎの厚さのガラス板３をそれらの間に挾んで有す る。各部分は、商品名ＤＥＬＲＩＮで販売されている黒色のポリオキシメチレン 材料のＩＯＸＩＯＸ３０Ｍ３のブロックから作られている。ガラス板３は、チャ ンス・プロパー・リミミテッド（Ｃｈａｎｃｅ　Ｐｒｏｐｐｅｒ　Ｌｔｄ）、英 国、によって製造された０、　１５［１１１１１の厚さの顕微鏡のガラスカバー スリップである。ガラス板イま、容器手段１の２つの半分の部分１５および１６ の各々に、光学的の透明なシリコーン接着剤によって固定されている。

上半分の部分１５の中央に、長さ約１４ｏｎ、幅約９０および深さ約ＩＭのくぼ み１７が設けられている。下半分の部分１６の中央に、長さ約２０＋ｎ＋ｎ、幅 約４価および深さ約２ｍｍのくぼみ１８が設けられていて、血液試料を収容する ためのキュヴエットを形成している。

上半分の部分１５にくぼみ１７に隣接して、光案内手段７および１１が設けられ ている。光案内手段７および１１は、デュポン社（ｎｕ　Ｐａｎｔ　ｄｅ　Ｎｅ ｍｏｕｒｓ）によって表示Ｃｒｏｆｏｎ　Ｏε−１０４０で販売されている光案 内モノフィラメントである。半分の部分１５中に取付ける前に、シールド材料が 光案内手段７および１１から除去されている。

血液試料は、注射器によってキュヴエット１８のくぼみの中に、下の部分１６中 に設けられた直径１．１ｍｍの毛管の孔（図示せず）を通して導入される。毛管 の孔は第１図の平面に対して垂直に延び、そしてキュヴエット１８の前壁（図示 せず）の中に、キュヴエット１８の右の側壁および底壁に隣接して開く。余分の 試料は毛管の孔１４を通して排出される。

重力の場のために、血球不合血漿相４はキュヴエット１８中にガラス板３に隣接 して形成する。

モノクロメータ−５［Ｈ２Ｏ，ＶＩＳ、ジョビン・イボン（Ｊｏｂｉｎ　Ｙｖｏ ｎ）　、フランス国］によって、２種類の交互する波長５０６ｎｍおよび５４８ ｎｍの光は２０ワツトのハロゲンランプ６から放射される光から抽出される。

モノクロメータ−５から照射される単色光線は、プラスチックの導波管７を通し てガラス板３へ案内され−る。プラスチックの導波管７およびガラス板３の屈折 率および導波管７の縦軸とガラス板３との間の角度は、光が導波管７とガラス板 ３との間の界面をその界面において反射しないで横切るように選択する。ガラス 板から導波管の縦軸への実際の角度は２０°　（反時計回り）である。光がガラ ス板３と血球不合血漿相４との間の界面８に到達すると、光は全反射し、次いで 光はガラス板を横切ってガラス板３と空気との間の上の界面９に至る。界面９に おいて、光は反射し、次いで光はガラス板３横切って界面８に至る、等々。こう して、ガラス板３は反射要素として作用する。ガラス板３をある数の回数横切っ た後、光はガラス板３とプラスチックの導波管１１との間の界面１０へ到達する 。その時点において、光はガラス板３から出て、導波管ＩＩを通して光検出器１ ２　［ＢＰＸ　９０、シーメンス（ＳｉｅｌＩｌｅｎｓ））に伝導される。光検 出器１２の電流信号は、光検出器１２に到達する光の強度に比例し、そしてｐＡ 範囲から電流強度を測定するために適当な検流計１３によって測定する（ＧＶＭ 　３０、Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ　Ａ／Ｓ）。

ガラス板３と血球不合血漿相４との間の界面８上の反射部位において、消失する 波が発生する。血漿相４が光吸収仕種を含有する場合、これらは光検出器１２へ 到達する光の強度を変更するであろう。このことが意味するように、例えば、血 漿相４中の減少したヘモグロビン（）ｌｂ）および／またはオキシヘモグロビン （ＨｂＯｚ）の存在は、光検出器１２の到達する光を減衰させ、光検出器１２に おいて光の強度の測定を適当な波長について実施するとき、血漿相４中の減少し たヘモグロビンおよび／またはオキシヘモグロビンのレベルを反映する。これに 関して、血漿相４中の減少したヘモグロビンおよび／またはオキシヘモグロビン の存在は血液試料中に溶血が起こったことを示すことを、述べるべきである。５ ０６ｎｍおよび５４８ｎｍの前述の波長のいずれもＨｂおよびＨｂＯ２に関して アイソベスティック（１ｓｏｂｅｓｔ　ｉｃ）である、すなわち、これらの波長 のいずれか１つにおけるＨｂおよび１ＩｂＬのモル吸収は同一である（しかし、 他方の波長におけるモル吸収と異なる）。

全血液の試料の溶血の程度と光検出器１２の電流信号との間の相互関係を決定す るために、１系列の測定を第１図の実験装備を使用して実施した。基礎材料とし て、ラジオメーター　（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ）　Ａ／　Ｓ、デンマーク国コペ ンハーゲン、が製作および販売する０３Ｍ２型のオキシメーターで測定して、１ ３．４ｇ％（８，３２ミリモル）のｌ（ｂ＋　ＨｂＯ，を含有するヘパリン添加 血液試料を使用した。

血液試料を２つの部分に分け、それらの一方は一２０℃で凍結することによって 溶血した。溶血しない試料材料および溶血した試料材料を次の比で混合して、前 述の測定順序のための試料を調製した： １００：０．８０：　２０；６０：　４０；２０：　６０；　０　：１００゜上 の６つの試料に測定を完結した後、溶血しない試料の分画を遠心して、純粋な血 漿相の参照標準を得、そして測定をこの参照標準について、また、実施した。

血漿相４によって生じた光の変更は、次のランノ＜−トーベールの法則： ここで■は試料との相互作用後の光の強度であり；Ｉｏは参照標準との相互作用 後の光の強度であり、そしてＣは試料中の分析物（）Ｉｂ＋　ＨｂＯ□）の濃度 である、に従うと仮定すと、ｌｏｇ　Ｉ　／　Ｉ　ｏおよびＣの直線の関係が見 出されるであろう。

直線の関係は、また、 およびＣの間に見出されるであろう。

λ、およびλ２は実際の波長である。

説明した測定の順序において得られた結果を下表１【こ記載表１ 表１に記載する結果を第２図に示し、ここでｌｏｇｌ／Ｉ。

■。λＩ／Ｉ０λ２ は溶血の程度に対してプロットされている。

反射要素の上表面が試料接触表面を構成する装備の有用性を評価するために、実 験を実施した。

その実験において、ガラス板３を有する容器手段１を倒立させて、反射要素が試 料より下になるようにした。試料は溶血しない全血液であった。本発明を用いる 装備において１００％の溶血を表わす信号に対応する信号を光検出手段１２から 得た。これは血球の作用に起因する。こうして、本発明によって提供される反射 要素と全血液試料との間の相対的方向づけの必要性が立証される。

第３図は、全血液の試料を分析するための本発明による分析器２１を線図的に示 す。このサンプリング装置、この場合において、注射器２２から、試料を試料入 口手段２３を通して分析器１に導入する。試料を分析器１の試料導管２４から２ ５として示すポンプによって抜出す。試料が特定の導管２４における測定位置ま たはキュヴエット２６および２７に到達したとき、試料の移送を停止する。キュ ヴエット２６において、試料をカリウム測定電極２８および参照電極２９と接触 させる。キュヴエット２７において、反射要素３０はキュヴエット２７の土壁の 一部を形成し、反射要素３０は、さらに、光源手段３１および光検出手段３２に 、それぞれ、光案内手段３３．３４を介して接続されている。光案内手段３３． ３４は、光案内手段３３．３４と反射要素３０との間の界面３５．３６において 反射が起こらないように、反射要素３０に関して方向づけられている。試料と接 触する反射部位において、光吸収性化合物が反射要素３０の試料接触表面に隣接 する試料境界層中に存在する場合、光強度の変更が起こる。試料と接触しなくな った反射部位は周囲に暴露し、その光学的性質は試料ならびに参照標準について の測定を包含する少なくとも１つの測定順序の間一定にどどまり（「標準の測定 順序」）そして前記反射部位は漂遊光に対して遮断されている。

反射要素３０および付随する光源手段３１および光検出手段３２によって、ヘモ グロビン（）ｌｂ＋Ｈｂ０２）の濃度は適当な波長を利用して決定される。光源 手段３１と反射要素３０との間ならびに反射要素３０と光検出手段３２との間に 、適当な光学的装置、例えば、モノクロメータ−、レンズなどを設置できること を理解すべきである。

電極２８および２９からなる電気化学的測定システムおよび光検出手段手段３２ からの信号は、適当なデータ処理手段３７および出力手段３８へ、Ａ／Ｄ変換手 段３９を経て供給される。手段３７．３８．３９は、本発明の性質の分析器に関 連して、それら自体よく知られており、そして本発明に関連してそれ以上説明し ない。

キュヴエット２７における測定手順の完結後、試料を試料導管２４を経て分析器 ２１の出口４０へ移湛され、そして廃棄物容器４１中に排出される。

技術的によく知られているように、装置１は、問題の１種または２種以上の分析 物について割当てた、目盛窓めまたは参照標準の値について間欠的に校正する。

第４図は、全血液の試料中の分析物のレベルを決定するた。

めの分析器１１１を線図的に示す。注射器１１２から、試料を試料入口手段１１ ３を通して導入し、そしてポンプ手段１１５によって分析器１１１の試料導管１ １４を通して抜出す。

分析物と光吸収性試薬／分析物複合体あるいはそうでなければ光透過率を変更す る複合体を形成する試薬を、試薬の溜１１６から、ポンプ手段１１７によって試 薬導管１１８を通して試料導管１１４の中に送入する。試料／試薬混合物を試料 導管１１４中の特定の測定位置またはキ二ヴエット１１９へさらに移送する。試 料／試薬混合物がキュヴエット１１９に到達すると、反射要素１２９は上の壁の 一部を形成し、この反射要素は関連する波長の光を放射する光源手段１２０およ び光検出手段１２１に、それぞれ、光案内手段１２２．１２３を経て接続されて いる。

キュヴエットおよび付随する光学的装置は、第３図に関連して上に説明したよう に校正される。

構造１１９　、１２０　、１２１　、１２２　、１２３　、１２９および付随す る普通の電気信号処理手段および出力手段（Ａ／Ｄ変換手段１２４：データ処理 手段１２５およびディスプレイ／プリンタ一手段１２６）によって、分析物／試 薬複合体のレベルは決定され、そして試料中に本来存在した分析物のレベルに関 係づけられる。

測定の完結後、試料／試薬混合物を試料導管１１４を経て分析器の出口１２７へ 移送され、そして廃棄物容器１２８中に排出される。

第５図は、自動化分析器において使用しかつ第３図および第４図のキュヴエッ） 　７　、１１９に対応する、全体的に１００で表示するキュヴエットを詳細に示 す。

試料は試料入口１０１を通ってキュヴエット１００の中に入り、そしてキュヴエ ット１００の空間１０２に順応する。光学的の透明な材料から作られた反射要素 １０３は、キュヴエット１００の土壁を提供する。光の入りかつ出るのを促進し 同時に適当な感度を提供するために、反射要素１０３は、拡大した端部分および 薄い試料接触部分をもって示された形状を与えられている。反射要素１０３は、 それより低い屈折率の材料から作られた支持体１０４上に支持されている。反射 要素１０３の厚さは、好ましくは１ｍｍより小さく、好ましくは１００μｍより 小さく、とくに１０〜５０μｍである。光は反射要素１０３に光案内手段１０５ を通して入り、そして光案内手段１０６を通して反射要素１０３から出る。

測定手順の完結後、試料はキュヴエッ）　１００から試料出口１０７を通して排 出される。

第６図は、本発明による装置の他の実施態様を示す。

使捨てキュヴエット単位２００は、永久部分２０１の中に嵌合するように適合さ れている。２つの部分２００および２０１はスナップロック２０２によってイン ターロックされている。試料はキュヴエット単位２０１の空間２０３の中に導入 して、支持体２０５上に支持された上の反射要素２０４に接触するようにする。

永久部分２０１において、光案内手段２０６および２０７が設けられている。光 案内手段２０６は光を外部の光源手段（図示せず）から反射要素２０４の光入口 手段２０８へ案内し、そして光案内手段２０７は光を反射要素２０４の光出口手 段２０９から外部の光検出手段（図示せず）へ案内する。こうして、光入口手段 ２０８および光出口手段２０９は、付属する光源手段および光検出手段を有する 永久部分２０１へ、本発明による装置、すなわち、使捨て単位を光学的結合する 。

第７図は、本発明による方法の実施において有用な他の装置３００を示す。装置 ３００は、反射要素３０１およびその周辺のへりを覆うシールド３０２からなる 活性な前部ならびに装置３０００本体部分３０３を有する細長い部材である。装 置３００の後端において、装置３００を試料容器、例えば、試験管に取付けるた めのカラ一手段３０４が設けられている。カラ一手段３０４の代わりに、他の適 当な手段を使用して、この装置を試料容器へ取付けて、測定順序の間試料に関し て装置３００を静止して維持することができるであろう。最後に、装置３００を 外部の光案内手段および光検出手段に接続するケーブル３０５が示されている。

装置３００は上方に向く方向に保持することができる。

装置３００の前部は、さらに、第８図に示されており、ここで同様な数字は同様 な部分を表示する。示す実施態様いおいて、反射要素３０１は後方に延びていて 、光案内手段３０６および３０７を縦方向に延長している。反射要素３０１およ び光案内手段３０６および３０７は、低い屈折率の支持体３０８上に支持さレテ イる。反射要素のベベルエツジ３０９および３１０は１４反射要素の試料接触部 分から、光を、それぞれ、出入させる。ベベルエツジ３０９および３１０とシー ス３０２との間に、反射要素３０１より低い屈折率の物質３１１＃よび３１２、 例えば、空気が閉じ込められている。

本発明を、その精神または必須の特徴を逸脱しないで、特定の形態で具体化する ことができる。、したがって、本発明の実施態様は、すべての面において、例示 であり、限定的でないと考慮すべきであり、本発明の範囲は、前述の説明ではな くむしろ添付する請求の範囲によって示されており、それゆえ請求の範囲の同等 性の意味および範囲内に入るすべての変化はその中に包含されることを意図する 。

手続補正書（方式） 昭和６３年７２月２２日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８７１００５７３ ２、発明の名称 全血液の試料中の分析物のレベルを決定する方法および装置 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　レイディオミーターアクテイーゼルスカブ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 ヘ ゴ ６、補正の対象 （１１特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 の欄 （２）委任状 （３）明細書の翻訳文 （４）請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 （１）　（２１別紙の通り （３）明細書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（４）請求の範囲の翻訳文の浄 書 （内容に変更なし） ８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５ 第１項の規定による書面　１通 （２）　委任状及びその翻訳文　各１通（３）明細書の翻訳文　１通 （４）請求の範囲の翻訳文　１通 国際調査報告 入ｈ’Ｎ三：（：Ｏτ五三　：ＮＴＥＲＮＡτ：：ＮλＬ　ＳＥλ只０９　λ三 ＰＣＲＴ　：Ｎ：ＮＴＥＲＮＡＴ：ＣＮＡＬ　ＡＰＰＬ：Ｃ，％Ｔ：ＯＮ　Ｎｏ 、　ＰＣτ／ＣＢ　８τ／ＣＣ５７３（ＳＡ　：８２ＥＳ）ＥＰ−Ａ−０１８５ １２６２５１０６／Ｂ６　ＪＰ−Ａ−６１１８４４４２１８１０８／８６

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．全血液の試料中の分析物のレベルを、分析技術として内部反射分光法を使用 しかつ反射要素を前記試料に対して暴露して、決定する方法であって、前記方法 は、前記反射要素を、前記試料および重力の場または重なった力の場に関して、 前記場の影響下にある血球が前記反射要素の１または２以上の反射部位、活性反 射部位から除去されるように方向づけ、そして 本質的に血球不含の血漿相からなる境界層が前記活性反射部位に隣接して設けら れた後、前記決定を実施することを特徴とする前記方法。
2. ２．分析物が可視光を吸収する種であることを特徴とする請求の範囲第１項記載 の方法。
3. ３．分析物がヘモグロビンおよびビリルビンの中から選択されることを特徴とす る請求の範囲第１または２項記載の方法。
4. ４．分析物が紫外線を吸収する種であることを特徴とする請求の範囲第１項記載 の方法。
5. ５．分析物が全蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．分析物が赤外線を吸収する種であることを特徴とする請求の範囲第１項記載 の方法。
7. ７．分析物が代謝物質であることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
8. ８．分析物がグルコースであることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
9. ９．前記試料を前記分析物と反応する因子に暴露し、そしてこのようにして生成 した反応生成物の決定によって前記試料中の分析物のレベルを決定することを特 徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
10. １０．全血液の試料中の分析物のレベルを決定する装置であって、前記装置は反 射要素を含んでなり、前記反射要素は前記反射要素へ伝導される光を受取る入口 部分および前記反射要素を通過した光のための出口部分を有し、前記反射要素は １または２以上の反射部位をもつ試料接触表面を有する活性な前部を装備してお り、前記反射要素は、前記装置の通常の使用において前記試料に関して、重力の 場または重なった力の場の影響下にある血球が前記反射要素の活性な前部から除 去されるように配置されていることを特徴とする前記装置。
11. １１．前記装置が、さらに、試料入口手段、前記試料入口手段に接続した試料キ ュヴェット手段を含み、前記反射要素が、その試料接触表面が前記試料キュヴェ ット手段の上壁を提供するように位置していることを特徴とする請求の範囲第１ ０項記載の装置。
12. １２．前記装置が、さらに、光源手段および光検出手段を含むことを特徴とする 請求の範囲第１０または１１項記載の装置。
13. １３．前記装置が前記装置を外部の光源手段へ光学的に結合する光入口手段、前 記装置を外部の光検出手段へ光学的に結合する光出口手段を含むことを特徴とす る請求の範囲第１０または１１項記載の装置。
14. １４．前記光源手段および光検出手段が紫外線および／または可視光を、それぞ れ、放射および検出することができる請求の範囲第１２または１３項記載の装置 。
15. １５．前記装置が前記試料に対して暴露するための追加の測定手段を含むことを 特徴とする請求の範囲第１０〜１４項のいずれかに記載の装置。
16. １６．前記追加の測定手段が電気化学的測定電極からなることを特徴とする請求 の範囲第１５項記載の同地。
17. １７．試料容器手段中に収容された全血液の試料中の分析物のレベルを決定する 装置であって、前記装置は、前記装置の実質的な部分を取囲むが、内部反射要素 の試料接触表面を露出して残すシールド、 光を前記反射要素の中に向けそしてそこから取り出す光案内手段、 前記装置を試料容器手段に取付けて、測定期間の間、前記装置を前記試料に関し て静止して維持し、そして重力の場または重なった力の場の影響下にある血球が 前記反射要素の前記試料接触表面から除去されるように、前記反射要素の試料接 触表面を方向づけるための手段を含んでなることを特徴とする前記装置。
18. １８．カリウム測定手段を含んでんなる、全血液の試料中のカリウムのレベルを 決定する分析器であって、前記分析器が前記試料中の溶血のレベルを検出する手 段を含むことを特徴とする前記分析器。
19. １９．前記試料中の溶血のレベルを検出する手段が反射要素を含むことを特徴と する請求の範囲第１８項記載の装置。
20. ２０．試料入口手段、前記試料入口手段に接続しそして試料を収容しかつ前記試 料を反射要素へ暴露するための試料キュヴェット手段を含み、前記反射要素が前 記試料キュヴェット手段の上壁中に設けられていることを特徴とする請求の範囲 第１８または１９項記載の装置。