JPH01500350A - 組換え肺胞界面活性タンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換え肺胞界面活性タンパク 関連出願に対する相互参照 本出願は、米国特許出願第００８，４５３号（１９８７年６月２９日出願）の一 部継続出願である。この米国特許出願第００８．４５３号は、米国特許出願第８ ５７．７１５号（１９８６年４月３０日出願）の一部継続出願である。また、こ の米国特許出願第８５７．７１５号は。 米国特許出願第８０８．８４３号（１９８５年１２月１３日出願）の一部継続出 願である。そして、この米国特許出願第８０８．８４３号は。 米国特許出願第６８０，３５８号（１９８４年１２月１１日出願）の一部継続出 願である。 技術分野 本発明は９組換えタンパク生産の分野に関する。さらに詳しくは、ある呼吸病の 管理に有用な１種々の型の肺胞界面活性タンパク（ＡＳＰ　）の生産に関する。 背景技術 ヒトの肺は、多数の小胞または肺胞から構成されており。 そこで血液と肺の気室との間でガスが交換される。健常人では、この交換は、■ 型肺胞細胞のミクロソーム膜で合成される界面活性複合体を含むタンパクの存在 により仲介される。 この複合体が充分なレベルで存在しないと、肺は正常に機能し得ない−一すなわ ち、肺胞は呼気の間に収縮し１次いで吸気により再膨張し得ない、従って、この 複合体を合成し得ないことを治療しないと、死または重症の身体障害をもたらす 。 不充分な界面活性複合体レベルに関して最もよく報告されている例は、未熟児お よび難産で生まれた乳児の場合であり。 呼吸困難症候群（ＲＤＳ）として広く知られている。この症候群の広く公表され ている型は、ビアリン膜症または特発性ＲＤＳと呼ばれている。ＲＤＳは、現在 １会衆国および他の先進諸国における乳児の死亡率および罹患率の主因であり９ 診断と治療に多くの努力が向けられている。現在の治療は２機械的（圧力）換気 に関心が寄せられているが、この方法は、せいぜい他に害をもたらす一時しのぎ の処置である。この処置は。 しばしば肺の障害および他の副作用をもたらし、気管支肺の形成異常２間質性気 腫および気胸などを併発する。知能発達の遅れもまた。この処置を行った結果と して生じる（Ｈａｌｌｓ＋ａｎ。 Ｈｌら、　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｃ１１ｎｉｃｓ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒ ｉｃａ（１９８２）２９：ｔ０５７−１０７５）　。 界面活性体を置換することによって、この症候群を治療しようという試みは限ら れている。この方法は、一般に投与が１回だけで良く、そして障害を減じる可能 性があるので９選択される。例えば、　Ｆｕｊｉｗａｒａら、　Ｌａｎｃｅｔ（ １９８０）上：５５−は、ウシの肺に由来するタンパク除去界面活性標品を用い た；この標品は有効であるが免疫原性である。Ｈａｌｌｍａｎ、　Ｍ、ら、　Ｐ ｅｄｉａｔｒｉｃｓ（１９８３）　７１　：　４７３−４８２は、ヒトの羊水か ら単離した界面活性体を用いて少数の乳児を治療し、ある程度の成功を収めた。 Ｃｌｅｍｅｎｔｓの米国特許第４，３１２，８６０号には２人工の界面活性体が 開示されている。この界面活性体は、タンパクを含まず。 データは示されていないが、このアプローチに有用であると記載されている。簡 単に言えば、界面活性体置換は、臨床的には広く用いられていない。 好ましい界面活性体置換物は、肺の界面活性複合体自体である。この複合体は、 アポタンパク：主要量で存在する２つのリン脂質（ジパルミトイルホスホコリン （ＤＰＰＣ）およびホスファチジル−グリセロール（ＰＧ））　：極く微量で存 在するいくつかの脂質成分；およびカルシウムイオンから構成されている。この アポタンパクは２分子量が３２，０００ダルトン程度のタンパクと約１０．００ ０ダルトン程度の非常に疎水性のタンパクとを含む（Ｋｉｎｇ、　Ｒ，Ｊ、ら、 　Ａｍ　Ｊ　Ｐｈ　５ｉｏｔ　（１９７３）２２４　ニア８Ｂ−７９５）　。 ３２、０００ダルトンのタンパクは、Ｓａｔが形成されており、ヒドロキシプロ リンを含む。 界面活性体の置換による治療があまり進展しない主な理由は、この複合体のタン パク部分が入手しにくいことである。 置換治療は、脂質成分のみを使用する試みに関心が寄せられており、このような 治療の効果がアポタンパクの添加により著しく改善され得ることは明らかである （Ｈａｌｌｍａｎ、　Ｍ、ら。 Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｃ１１ｎｉｃｓ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａ　（ １９８２）（前出））。しかしながら、現在、これらタンパクのいくつかは、正 常な成人の肺および羊水のみから得られる。有効な単離方法を用いてもなお、充 分な量を供給し得ない、従って、単独で、あるい的な量のアポタンパクの生産す る有効な方法が望まれる。 ＰＣＴ特許出願ＷＯ３６１０３４０８，すなわち本出願の前出願は。 約３２ｋｄ（７）　ヒトＡＳＰタンパクの組換え生産２種々のイヌＡＳＰタンパ クをコードするＤＮＡ配列の検索、および約１０ｋｄの分子量を有するヒトＡＳ Ｐタンパクグループの１つの代表的なものの検索について述べている。現在では 明らかに、”ＩＯＫ”グループの有効な生産が、充分な治療に用いるのに要求さ れている。 発明の開示 本発明は、肺界面活性複合体のアポタンパク部分の付加的成分を、その特徴を最 適にする量および条件下で得る方法を提供する。この複合体の残りの成分、すな わちジパルミトイルホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールは 、カルシウムイオンと共に、　ＷＯ３６１０３４０８（前出）に述べられている ＡＳＰグループのある成分のように、すでに容易に入手し得る。他の型のアポタ ンパクが必要量得られれば、治療に使用し得る複合体の形態を最適にする研究が 可能になり。 そして呼吸困難症候群の常法的な置換治療の可能性が開かれる。 従って、ある局面では２本発明は組換えによって生産されたＩＯＫグループの哺 乳類肺胞界面活性タンパク（ＡＳＰ）に関する。分子量が比較的大きく、比較的 水溶性であるような約３２ｋｄのタンパク（３２Ｋ　ＡＳＰ）は、上述のように 開示されている。 分子量が小さく、疎水性であるような約５〜２０ｋｄのタンパク（ＩＯＫ　ＡＳ Ｐ）がここに記載されている。両グループのタンパクは、カルシウムイオンの存 在下でリン脂質と複合体を形成する際に９表面張力の低下した膜の形成を促進す る。しかしながら、インビボの研究によると、　ＩＯＫグループおよびその個々 の成分は、肺を膨張させ、そして維持する際に、　３２Ｋ　ＡＳＰより劇的に有 効であり、　ＩＯＫタンパクと３２にタンパクとの組合せは相乗的である。本発 明は、さらに、他の哺乳類ＡＳＰタンパクをコードするＤＮＡ配列；これらのタ ンパクの生産に適した発現ベクター；これらのベクターで形質転換される組換え 宿主細胞；そして組換えＡＳＰおよびそれらの前駆体を生産する方法に関する。 他の局面では５本発明は、ヒトＡＳＰを含む薬学的組成物およびそれらを用いて ＲＤＳを治療する方法に関する。 さらに他の局面では２本発明は、　３２Ｋ　ＡＳＰタンパクを単離するための改 良された方法およびウシＩＯＫ型を精製するための改良された方法に関する。 図面の簡単な説明 第１図は、Ｍ復するｃＤＮＡクローンから得られたｃＤＮＡであって、イヌの１ ８ｋｄ　ＡＳＰタンパクをコードするｃＤＮＡに対して決定されたＤＮＡ配列（ 推定されるアミノ酸配列と共に）を表し。 同定された重複するｐＤｌｏに−１およびｐＤｌｏに−４のクローンを示す。 第２図は、ヒト１８ｋｄ　ＡＳＰタンパクをコードする”ｃＤＮＡ　１３″のｃ ＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列を表す。 第３図は、ヒト１８ｋｄタンパクをコードするゲノムＤＮＡのエキソン部分のＤ ＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列を表す。 第４図は、ヒト５　ｋｄ／８ｋｄタンパクをコードするｃＤＮＡを単離するのに 用いるオリゴヌクレオチドプローブの配列を表す。 第５図は、ヒト５ｋｄタンパクをコードする“ｃＤＮＡ　ｆｉ１８”のＤＮＡ配 列および推定されるアミノ酸配列を表す。 第６図は、ヒト５ｋｄタンパクをコードする類似のｃＤＮＡ″雲１９”を表す。 第７図ａおよび第７図すは、ヒト１８ｋｄタンパクをコードするベクターを感染 させたＣＨＯ細胞で産生される３ＳＳ標識タンパクのエンドＦ酵素処理を行った 場合と行われない場合の５ＯＳＰＡＧＥの結果である。 第８図は、３５Ｓメチオニンで標識したヒト１８ｋｄタンパクの発現ベクターで 形質転換した細菌から得られたＳＯＳゲルを表す。 第９図は、第８図に対応する細菌抽出物のウェスタンプロットを表す。 第１０図は２種々のＡＳＰタンパクがリン脂質による表面張力の低下を増大させ る能力をインビトロで測定した結果を表す。 第１１図は、さらにヒト１８ｋｄタンパおよび５ｋｄタンパクがリン脂質による 表面張力の低下を増大させる能力をインビトロで測定した結果を表す。 第１２図は、　３２ｋｄタンパクの添加を行った場合と行わない場合のイヌタン パクに対する第１１図に対応する結果を表す。 第１３図は、イヌ５Ｐ−５ｃＤＮＡクローンの核酸配列を表す。 第１４図は、ヒト肺のλｇｔｌｏライブラリーから得られた２つのｃＤＮＡクロ ーンによってコードされるアミノ酸配列と、　ＷＯ３６／、　０３４０Ｂにおい てｇＨＳ−１５と記載されたゲノムクローンによってコードされるアミノ酸配列 との比較を表す。他の研究者により回収された２つのｃＤＮＡによってコードさ れる配列も示す。 第１５図は、細菌における界面活性タンパクの発現に用いた合成ｔｒｐプロモー ターの核酸配列を表す。 本主所皇実施唱六 Ａ、定義 ここで用いられているように、“肺胞界面活性タンパク（ＡＳＰ）”とは、肺界 面活性複合体に関連し、以下に特定するＡＳＰ活性を有するアポタンパクを意味 する。調べた全ての種のＡＳＰは、ここで“３２Ｋ　ＡＳＰ”と名付けた比較的 高分子量（３２ｈｄ程度）の１種またはそれ以上の成分と、ここで“ＩＯＫ　Ａ ＳＰ”と名付けた比較的低分子量（５〜２０ｋｄ程度）の極めて疎水性の１種ま たはそれ以上の成分とを含むようである。　（Ｋｉｎｇ、　Ｒ，Ｊ、ら。 Ｊ　Ａ　Ｉ　Ｐｈ　５ｉｏｌ　（１９７７）　４２；４８３−４９１：Ｐｈ１ｚ ａｃｋｅｒｌｅｙ、　Ｐｊ、Ｒ，。 Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ　Ｊ　（１９７９）１８３ニア３１−７３６　、　）全ての種 の３２にタンパクは、各種における１種またはそれ以上の非常に類似した原型の アミノ酸配列に由来するようである。“この”　３２にタンパクは、明らかに配 列がわずかに異なる複数の遺伝子によってコードされている。ヒト３２に配列の ３つの変種がここに示されている。しかしながら、ある条件下で見い出された明 らかに分子量が異なる複数の成分は。 糖鎖形成のパターンの変化によるものである。前出願、　ＷＯ３６１０３４０８ には、高い相同性を示すヒトおよびイヌの３２Ｋ　ＡＳＰタンパクの全アミノ酸 配列が開示されている。高い分子量を有し、比較的親水性であるこの一組のタン パクは、前記前出願の主題であり、そして別の哺乳類種に由来する３２にＡＳＰ が。 イヌおよびヒトのこの配列と高い相同性を示すことが期待される。しかしながら 、特に、ヒトタンパクのさらに２つの変種をここに開示する。 低分子量の“ＩＯＫ”タンパクは、比較的疎水性であり５分子量の異なる数種の タンパクの混合物であるようである。ヒトおよびイヌの両タンパクは、　１８ｋ ｄ、８ｋｄ、および５ｋｄの非還元分子量を示す、　８ｋｄタンパクおよび５ｋ ｄタンパクは、Ｎ−末端配列が同一であり、おそらく同一のメツセージに由来す るが、Ｃ−末端のプロセッシングに違いがあるらしい、他方。 １８ｋｄタンパクは、還元条件下で１０ｋｄの分子量を示すが、明らかに異なる アミノ酸配列を有する。しかしながら、ここで取り扱っている補乳類種の１８ｋ ｄ、８ｋｄ、および５ｋｄのタンパクは、全てインビボで同等に機能するようで ある０本発明は。 ここで主にこのＩＯＫグループを取り扱う。前出Ｈ，ｈｏｓ６１０３４０８では 、　１８ｋｄイヌタンパクに対する全ｃＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配 列と、対応するヒトタンパクの部分的なりＮＡ配列とを開示した。８ｋｄ１５ｋ ｄイヌタンパクに対しては、短いＮ−末端アミノ酸配列のみが開示された；現在 では、ヒトタンパクに対する適当なｃＤＮＡが回収されており１代表的な両方の ＩＯＫタンパクの完全な配列は。この技術の一部をなしている。１０に混合物は 、単に２つのＤＮＡ配列の生産物なので、翻訳後のプロセッシングの変化が多数 の分子量をもたらし得るが、　５Ｐ−１８および５Ｐ−５という名称を、これら ２つの型のタンパクと遺伝子とに採用した。 ここでの第１図は、　ｗｏ８６１０３４０８の第２図に対応し２位置１で示すロ イシンで始まり１位置１８３のフェニルアラニンで終わる。成熟イヌ５Ｐ−１８ タンパクの全ｃＤＮＡ配列を表す。、ヒ）　５Ｐ−１８タンパクの対応する配列 を第２図および第３図に示す。以下に示すように、これら配列はアミノ酸配列が 極くわずか異なっている。成熟タンパクの始まりは、第２図の位置２０１のフェ ニルアラニン残基であり２位置３８１のロイシンで終わる。 従って、このｃＤＮＡは、ヒトの１８１アミノ酸タンパクをコードすると推定さ れる。しかしながら、ヒトおよびイヌの両タンパクは、カルボキシ末端配列の一 部分の欠失により、さらに短い配列にプロセッシングされると考えられる。ヒト タンパクでは、このプロセッシングは１分泌されたタンパクが第２図において位 置２８６で示されるアルギニンで終わるように起こると考えられる。このような プロセッシングによって、単離された成熟タンパクの還元電気泳動ゲルで見られ るような約１０にの分子量を有するタンパクが生じる。 ２つの類似した型のヒト５Ｐ−５タンパクに対するｃＤＮＡ配列および推定され るアミノ酸配列を第５図および第６図に示す。 また、成熟タンパクの推定Ｎ−末端で始まるｃＤＮＡは、１７３アミノ酸または １７４アミノ酸をコードするが、Ｃ−末端のプロセッシングの変化の結果、５ｋ ｄまたは８ｋｄの単離タンパクをもたらす。 要約すると、低分子量タンパクの１０にグループは、ここで５Ｐ１８およびＳＦ ３と名付けた２つの異なる種をコードするＤＮＡに由来するようである。５ｐｉ ｓがコードされる種は、これらの種が非還元条件下で約１８ｋｄのタンパクとし て移動する成熟タンパクをコードするので、このように名付けられる；明らかに 、このタンパクは小さな約１０ｋｄの七ツマ一単位の２量体である。このモノマ ー単位は、コードされたタンパクのカルボキシ末端における切断を含む翻訳後の プロセッシングにより形成されるが、さもなければこのタンパクは、さらに以下 で説明するように□、１８１アミノ酸を含む、同様に、ＳＦ３は推定分子量が約 １９ｋｄのタンパクをコードする。しかしながら、また、この分子量のタンパク は、抽出物中には見られず５コードされるアミノ酸配列は、明らかに得られた５ ｋｄタンパクおよび８ｋｄタンパクにプロセッシングされる。 本発明の組換えＡＳＰタンパクは、ここで示されるアミノ酸配列に対応するアミ ノ酸配列を有する。しかしながら、活性を損なうことなく、わずかな修飾を行い 得ることは理解される。例えば、第１４図は、この３２にタンパクの５つの変種 を表す、さらに、全体の一次構造の一部のみが必要とされ得る。 例えば１本発明のヒト５Ｐ１８組換えタンパクは、第２図に示されたアミノ酸配 列と実質的に類似した。アミノ酸配列を有するが、活性を損なわずにこの配列を 少し修飾したものもまた。 ５Ｐ１８ヒトＡＳＰの定義内に含まれ、そして以下で詳しく述べるように、請求 の範囲に記載されたタンパクの定義内に含まれる。さらにこの定義内に含まれる ものには、活性を保持した第２図の完全な配列の断片であって、特に翻訳後のプ ロセッシングにより生じる断片がある。 全てのタンパクの場合のように、このＡＳＰタンパクは、その調製方法、あるい は溶液中ではその環境に依存して、中性の形、あるいは塩基塩または酸付加塩の 形で存在し得る。従って、一般にタンパク、そして特にいかなるＡＳＰも、遊離 のアミノ基を含む酸付加塩、あるいは遊離のカルボキシル基で形成された塩基塩 の形で見い出され得ることはよく知られている。実際、薬学的に許容される塩に は、このタンパクの機能性を高め得る。適当な薬学的に許容される酸付加塩には 。 例えば塩酸または硫酸のような無機酸、あるいは酢酸またはグリコール酸のよう な有機酸から形成されたものが含まれる。 薬学的に許容される塩基には、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムのような 水酸化アルカリ、あるいはピペリジン。 グルコサミン、トリメチルアミン、コリン、またはカフェインのような有機塩基 が含まれる。さらに、このタンパクは。 脂質や糖のような他の生物試料との組合せ；あるいはアミノ基のアセチル化、ヒ ドロキシル側鎖のリン酸化、またはスルフヒドリル基の酸化のような側鎖の修飾 ；またはコードされる一次配列の他の修飾により修飾され得る。実際、天然型で は、　ＡＳＰタンパクは糖鎖が形成されており、そしてコードされているプロリ ン残基のいくつかはヒドロキシプロリンに変換されている。このタンパクはまた 。リン脂質、特にＤＰＰＣおよびＰＧと結合して見い出される。ここでＡＳＰタ ンパクの型の定義に含まれるものには、Ｉ！鎖影形成型よび糖鎖非形成型。 ヒドロキシル化型および非ヒドロキシル化型、アポタンパク単独、あるいは脂質 との結合型がある。簡単に言えば９この定義は、血液と肺の気室との間のガス交 換を促進し、そして肺胞を再膨張させる能力を保持した天然の配列と実質的に類 似したアミノ酸配列を有するいかなる組成物をも含む。 −次アミノ酸配列のわずかな修飾は、特に例証されている配列のいずれと比べて も、実質的に同等な活性または増大した活性を有するタンパクをもたらし得るこ とが、さらに理解される。これらの修飾は２部位特異的変異によって計画的に行 うか、あるいはＡＳＰ生産生物である宿主の変異によるように、偶発的に行い得 る。これら修飾のすべては、ＡＳＰ活性が保持される限り包含される。 タンパクに対する“ＡＳＰ活性”は、単独、または他のタンパクとの組合せのい ずれかで脂質と結合させた場合に、　）１０１）６ｒｔｓｏｎ。 Ｂ、ＩＡｙ、（１９８０）　１兆８５７−６８および以下に記述するインビボ分 析において活性を示す能力として定義される。この分析では。 試験すべき試料を、帝王切開により未熟児で生まれたウサギ胎児または子ヒツジ に、気管内挿入管によって投与する。（これらの“早産児”は、自己のＡＳＰを 欠いており２人工呼吸器によって維持される。）肺の収縮、血中の気体、および 人工呼吸器内の圧力を測定することによって活性の指標を得る。 活性の予備的な評価は、インビトロ分析９例えばＫｉｎｇ、　Ｒ，Ｊ。 ら、　Ａｍ　Ｊ　Ｐｈ　５ｉｏｌ（１９７２）　２２３ニア１５−７２６．また は以下に例証されるＨａｗｇｏｏｄらの方法によって行い得る。後者の方法は、 このタンパクをリン脂質小胞の標品と混合した場合の空気−水界面における表面 張力を簡単に測定することを利用している。 ここで述べるＩＯＫおよび３０Ｋ　ＡＳＰタンパクは、単独でも、あるいは組合 せてもＡＳＰ活性を示す。ｌＯＫタンパクは、３２にグループと共奏的に作用す る場合にのみＡＳＰ活性を示すと以前は考えられていたが９本発明者らは、１０ にタンパク単独でも顕著なＡＳＰ活性を示し、また３２にタンパクを加えるとＩ ＯＫタンパクの活性が相乗的に高められることを、ここで示している。 “作動可能に連結した”とは、これらの成分がその通常の機能を達成し得るよう に配置された近接状態を意味する。従って、コード配列に作動可能に連結した制 御配列は、このコード配列の発現に効果的であり得る。 “制御配列”とは、所望のコード配列に適切に結合した場合に、このような配列 に適合する宿主内でその発現を効果的に行い得る１つのＤＮＡ配列または複数の ＤＮＡ配列を意味する。 二のような制御配列は２原核宿主および真核宿主の両方におけるプロモーター； 原核生物におけるリボゾーム結合部位配列；および真核生物における終始シグナ ルを包含する０発現を行う際に必要なあるいは助けとなる他の因子は、引き続き 同定され得る。ここで用いられるように、“制御配列”とは。 単に用いた特定の宿主内で発現を行うのに必要であり得るいかなるＤＮＡ配列を も意味する。 “細胞”または“組換え宿主細胞”、あるいは“宿主細胞”は１文脈から明らか なように、しばしば互換的に用いられる。 これらの用語は、直接の対象細胞、およびもちろん子孫をも包含する。必ずしも 全ての子孫が、変異または環境の違いにより、親細胞と完全に同一でないことは 理解される。しかしながら、このように変化した子孫も、上述の用語を用いる場 合には包含される。 （以下余白） Ｂ、二１影シロじ述 以下に示される。　ＡＳＰをコードするＤＮＡ配列を得るための方法Ｊ′！、単 に例証することを目的としており、用いられ得る方法のうちの代表的なものであ る。しかしながら、当該分野で知られているように、他の方法も用いられ得る。 Ｂ、ｔ、′　人の 肺の肺胞表面は、多くの技術により、そして多くのグループによって広範囲にわ たって研究されている。肺胞の膜は。 Ｉ型および■型の肺胞細胞から構成され、このうち■型細胞は表面の約３％を構 成しているようである。■型紺胞は、基底膜を被覆しているライニング流体層へ 物質の外分泌を行っている。この物質は、ライニングの流体と、含まれる容積の 気相との間の表面張力を減少させる。流体層は、肺胞の毛細血管の血漿に由来す る水、および■型紺胞の界面活性分泌物から構成されている。 ■型細胞は、それ自身が、細胞１個あたり６０〜１１００ｐのタンパク、および 約１ｐｇの脂質のリンを含んでいる。■型細胞におけるＤＰＰＣとＰＧとのリン の比率は約８：１である。アポタンパク成分の研究は、様々な種に由来する柿渋 浄液に基づいており、前述したような２分子量が約１０〜２０ｋｄと３２ｋｄで ある２つの主要なタンパク型を含有することが示されている（Ｋｉｋｋａｗａ。 Ｙ、ら、Ｉα１１ｙ１１■μ匹ｉ部小胆（１９８３）弧：　１２２−１３９）　 。 アポタンパクがリン脂質成分に結合しているか（Ｋｉｎｇ、　Ｒ，Ｊ。 ら、　Ａｍ　Ｒｅｖ　Ｒｅｓ　ｉｒ　Ｄｉｓ　（１９７４）　１１０　：　２７ ３）　、あるいは結合していないか（Ｓｈｅｌｌｙ、　Ｓ、Ａ、ら、　Ｊ　Ｌｉ 　ｉｄ　Ｒｅｓ　（１９７５）　１６　：２２４）は、明らかではない。 イヌの肺の洗浄液から得られ、ゲル電気泳動によって分離される高分子量のタン パクは３分子量が２９，０００．３２，０００．および３６，０００ダルトンで ある３つの主要な成分から構成されることが示されている。　３２．０００ダル トンのタンパクを用いて。 以下に示すような配列データを得た；しかしながら、これらのタンパクの３つ全 ては、同一のＮ−末端配列を有しており。 明らかに糖鎖形成の程度だけが相違している。　３６ｋｄおよび３２ｋｄのバン ドを、糖側鎖を除去するエンドグリコシダーゼＦで分解すると、　２９ｋｄ成分 と同じように移動する生成物が得られる。　２９ｋｄ成分の移動度は、この処理 によって影響されない。 ３２ｋｄ画分が凝集して二量体および二量体を形成することも示されている。 より小さな分子量を有するタンパクが、かろうじて抽出されるが、これらもまた 、混合物であるようである（Ｐｈｉｚａｃｋｅｒｌｅｙら、前出；以下の記述） 、イヌおよびヒトのタンパクについては、コードＤＮＡに関して、およびウシの 洗浄液に関して研究され、そしてタンパクレベルで研究されており、より低分子 量のタンパク混合物は、ここでＳＰ−１８および５Ｐ−５と名付けられる２つの タイプのアミノ酸配列を含むようである。　５Ｐ−１８配列は、約１８ｋｄの分 子量の一次配列（約１８０アミノ酸）に対応するｃＤＮＡによってコードされて いる。しかしながら、二の生産物は、インビボにおいて、より短いタンパクヘプ ロセッシングされるようである。５Ｐ−５ＤＮＡは、約１７３アミノ酸の成熟タ ンパクをコードしている。このタンパクもまた。約５ｋｄおよび８ｋｄの実質的 により小さなタンパクへ明らかにプロセッシングされる。上述のプロセッシング は、生産されたタンパクのＣ−末端からの配列欠失を包含しているようである。 イヌおよびヒトのＡＳＰ　３２にタンパクの全コード配列は、−〇８６１０３４ ０８に記述されているように、クローン化され、そして発現されている。ここで は、ヒトおよびイヌに由来する低分子量のいくつかのタンパクをコードするＤＮ Ａ配列も得られ。 そして発現されている。ヒト３２にタンパクの別の型のものも開示されている。 イヌの肺のｃＤＮＡライブラリーは、　１８ｋｄ　（非還元ゲル上で）イヌタン パクのＮ−末端アミノ酸配列に対応するよう設計した２つの合成オリゴマー混合 物をプローブとして用いて調べ。 両方のプローブにハイブリダイズするクローンを回収し、配列を決定した；これ によって第１図に示した情報を得た。これらのクローンの１つであって、イヌＡ ＳＰコード配列を含むものを用いて、成人の肺から単離したｍＲＮＡよりバクテ リオファージλｇｔｌｏで作成したｃＤＮＡライブラリーを調べ、ヒト５Ｐ−１ ８を得た；次いで、このヒト５ｐ−ｉｓを用いてヒトのゲノムライブラリーを調 べた。　ｃＤＮＡおよびゲノムクローンによってコードされるヒト５Ｐ−１８に 対する完全な配列が開示されている。 次いで、５ｋｄイヌタンパクのＮ−末端アミノ酸配列に対応するように設計した プローブを用いてλｇｔｌｏ肺ライブシライブラリ−−５ｃＤＮＡを得た。この 配列の変種も開示されている。 Ｂ、３．　Ａ針■光里 ヒトおよびイヌの他のＡＳＰタンパクをコードする核酸配列が、現在入手し得る ので、これらを様々な系で発現させ得る。 原核生物系を用いる場合には、適当な制御配列と共に、イントロンを有さない配 列を用いるべきである。上記のいずれのＡＳＰタンパクに対するｃＤＮＡクロー ンも、適当な制限酵素で切り出し、このような発現のための原核生物ベクターに 連結し得る。ＡＳＰゲノムＤＮＡの原核生物における発現には１部位特異的変異 処理によって、あるいはｃＤＮＡの対応する部分を回収し、イントロンを含むゲ ノム配列と置換することによって。 イントロンを除去するようにＤＮＡを修飾する必要がある０次いで、イントロン を含まないコードＤＮＡは、原核生物における発現用ベクターに連結する。いく つかの例証的な発現系を以下に記述する。 以下に例示するように、　ＡＳＰをコードする配列も、イントロンをプロセッシ ングし得る発現系（通常、＃乳類宿主細胞培養物）において直接使用することが できる。このような発現を行うためには、ゲノム配列を、適当な哺乳類細胞中で これら配列の発現を調節する制御可能な哺乳類プロモーターの下流に漣結し得る 。 組換え生産物に加えて、５ｋｄタンパクのような充分短い本発明のタンパクは、 タンパク合成法によって調製し得る。 Ｂ、４．交２バえ二皿双 ＡＳＰタンパクは、成熟タンパクまたは融合タンパクとして生産するか、あるい は分泌するためにこの配列をプロセッシングし得る細胞内で、シグナル配列と共 に生産し得る。タンパクの分泌が行えれば、精製が容易になるので有利である； 従って、適当なプロセッシングを行い得る細胞内で１本来のシグナル配列に対す るコドンを含むヒトＡＳＰ遺伝子を発現させることが好ましい。培養された哺乳 類細胞は、シグナル配列を含む外来の哺乳類タンパクを切断し、プロセンシング し。 そして培地中へ分泌し得ることが示されている（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ。 Ｆ、ら、　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８４）　４　：　１６６）　。 培地へ分泌された場合、　ＡＳＰタンパクは標準的なタンパク精製法を用いて回 収される。培地には２比較的少数のタンパクしか分泌されず、従って分泌された タンパクの主要なものは、すでにＡＳＰであるため、精製方法は簡単化される。 しかしながら、この手順はより面倒ではあるが、融合型または成熟型のタンパク を細胞内生産している細胞の音波処理物または溶解物からこのタンパクを精製す ることは、当該分野で公知の方法である。 Ｂ、５．３２Ｋ　ンバクの　れた　り ここで開示されているのは、自然に、または組み換えによつて生産された３２に タンパクを精製するのに特に有利な方法である。この方法は、−次配列のある領 域がレクチンの糖結合部分に類似していることを利用している。 従って７本発明のある局面は、　３２Ｋ　ＡＳＰタンパクを精製する方法である 。該方法は、このようなタンパクを含む混合物を、親和性の要因となる部分が糖 （特に、マンノースまたは糖結合したタンパク）であるアフィニティークロマト グラフィーに供することを包含する。以下に例証するように２例えば１マンノー スそれ自体が直接結合した適当な担体（例えば。 アガロースまたはセファロース、あるいは他の一般的に用いられるクロマトグラ フィー用の固体担体）、もしくはマンノースヲ高いレベルで含む糖タンパクを用 い得る。マンノースが最も好ましいが、他の機能的な親和性パートナ−である糖 には、フコースおよびＮ−アセチルグルコサミンが含まれる。 特定の親和性基に対するクロマトグラフィー担体の設計に関する変法は、当業者 によく知られており、有用な吸着剤として糖を与えるもの全てが適している。 結合は、低濃度のカルシウムイオン存在下で有効に起こり。 そして溶出は９例えばＥＤＴＡを用いてカルシウムイオンを除去することによっ て有効に行われる。しかしながら、溶出は。 ＡＳＰへの結合に関してアフィニティーカラムと競合する溶離溶媒中の物Ｖ（例 えば、１度を増加させたマンノースまたはガラクトース）によっても行い得る。 ジスルフィド結合を還元すると、　ｐＨの高低によって結合を解離するので、還 元剤を供給することによっても溶出を行い得る。　ｐＨが低いと変性を引き起こ し得るが、約ｐＨ１０のホウ酸緩衝液中で溶出を行うのが効果的である。 Ｂ、６．　Ａせ孟性Ω豆捉 表面張力を減少（表面圧力を増加させることと同じ）させることによって機能す るＡＳＰタンパクが、水／気界面に膜を生じさせる能力を評価するインビトロ法 が考案されている。 これらの方法を用いた研究は、単離された自然の３２にイヌＡＳＰに関して行わ れている。　（Ｂｅｎｓｏｎ、　Ｂ、Ｊ、ら、ヒ」Ｌヒ且」蓮と。 （１９８４）　１Ｂ　：　８３−９２　；　Ｈａｇｗｏｏｄ、　Ｓ、ら、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９８５）ｌ　：　１８４−１９０）　。 Ｔａｎａｋａ、　Ｙ、ら、　ＣｈｅＩＩＩＰｈａｒｍ　Ｂｕｌｌ　（１９８３） 　３１　：　４１００−４１０９には、ウシの肺に由来する３５ｋｄタンパクが ＤＰＰＣの表面拡張を増大させたことが開示されている；　５ｕｚｕｋｉ、　Ｙ 、、　Ｊ　Ｌｉ　ｉｄ　Ｒｅ５（１９８２）　２３　：　６２−６９　；　５ｕ ｚｕｋｉ、　Ｙ、ら、　Ｐｒｏ　Ｒｅｓ　Ｒｅｓ　（１９８４）１８　：　９３ −１００では、ブタの肺に由来する１５ｋｄタンパクが、同じ起源の脂質−タン パク複合体の表面拡張を増大させることが示された。 インビボにおける界面活性複合体の機能は２表面張力を減少させるために気／水 界面に膜を形成することなので、インビトロモデルでは、このような表面に脂質 またはりボタンバクを展開することによって生じる膜の形成を増大させるＡＳＰ タンパクの能力は、明らかにその有用性と関係がある。 実施例において述べられるインビボモデルも用い得る。 Ｂ、７．五亙扛よ堕便里 精製されたタンパクは、単独で、および投与に適した薬学的組成物と組み合わせ て、幼児または成人における呼吸困難症候群の治療に用い得る。本発明の組成物 およびタンパク生産物は、肺炎および気管支炎のような関連した呼吸器系疾患の 治療にも有用である。複合体は、約５０％からほぼ１００％（ｗｔ／ｗｔ）の脂 質、および５０％から１％を下回るＡＳＰを含む；好ましくは、　ＡＳＰは、こ の複合体の５％〜２０％である。脂質部分は、好ましくは８０％〜９０％（−ｔ ／賀ｔ）のＤＰＰＣであり、そして残りは、不飽和のホスファチジルコリン、ホ スファチジルグリセロール、トリアジルグリセロール、パルミチン酸２またはこ れらの混合物である。この複合体は、　ＡＳＰの溶液を脂質リポソームの懸濁液 と混合するか、あるいは脂質タンパク溶液を界面活性剤または有機溶媒の存在下 で直接混合することによって再会合させる６次いで、この界面活性剤または溶媒 は、透析によって除去され得る。 この複合体を再構成する際には、柿渋浄液に由来の中性脂質成分を利用すること も、それを適当な量のＡＳＰタンパクに加えることも可能であるが、明らかに合 成脂質の使用が好ましい。第一に、充分に供給する問題があり、これは自明のこ とである。第二にｌ！Ｊｉ製物の純度、および中性脂質を単離した肺に存在し得 る外来タンパク（感染性タンパクを含む）による汚染がないことは９合成調製物 によってのみ保証される。 もちろん２合成酸分を用いた場合には、有効な複合体の再構成は、より困難であ る。 上述したように、以前は、主としてＩＯＫ　ＡＳＰ混合物が３２に混合物の活性 を増大させるのに役立つと考えられていた；しかしながら、現在では１本発明者 らにより、好ましい組成物は、　１０にタンパクのみ、　５Ｐ−５または５Ｐ− １８タンパクのみの複合体；１０におよび３２にの混合物の複合体；あるいは５ Ｐ−１８または５Ｐ−５タンパク、および３２に混合物の複合体を含有すること が確立されている。後者の２つの場合、好ましいタンパクの比率−一すなわち、 ３２に：１０に、　３２Ｋ　：　５Ｐ−１８，または３２に＝ＳＰ−５−−は、 典型的には、３：１〜２００：１の範囲にあり。 好ましくは約１０：１〜５：１である。３２にタンパクは、水溶液中のリン脂質 小胞の水性懸濁液に直接添加し得る。非常に疎水性であるため、　ＩＯＫ混合物 （あるいは、　５Ｐ−５または５Ｐ−１８タンパク）を、クロロホルムのような 有機溶媒中の脂質に添加し、溶媒を蒸発させ、そして水和させることにより小胞 が再形成される。 界面活性複合体を投与するために、３２にタンパクをＩＯＫ型に添加することは 、相乗効果を有するようである−一すなわち、３２に型およびＩＯＫ型タンパク の組み合わせは、１０にタンパクのみに対して必要なタンパク濃度より低い濃度 で所望の活性を有する。従って９本発明の好ましい方法では、投与される界面活 性複合体は、有効量のＩＯＫ混合物、あるいは３２ＫＡＳＰと混合した個々の５ Ｐ−５または５Ｐ−１８タンパクの有効量を含む、特に好ましい組成物は、上記 の比率の３２Ｋ　：　ＩＯＫ型タンパクを、適当量の脂質成分（典型的には、こ の組成物の５０％からほぼ１００％の範囲）と共に含む。 この複合体を含む組成物は、気管を通じた投与に適した組成物（すなわち、一般 的には、液体懸濁液、乾燥粉末“微粒子”、またはエアロゾル）であることが好 ましい。気管を通じた直接の投与に対して、この複合体は適当な賦形剤（例えば 、水９食塩水、デキストロース、またはグリセリンなど）と共に液体中に懸濁す る。この組成物は、　ｐＨ緩衝剤（例えば。 酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムのような非毒性の補助物質を少量含有し 得る。“微粒子”を調製するためには。 この複合体（必要に応じて、上記のように混合される）を凍結乾燥し、乾燥粉末 として回収する。 エアロゾル投与に用いる場合、この複合体は、付加的な界面活性剤および噴射剤 と共に微細に粉砕された形で供給される。投与され得る典型的な界面活性剤は、 脂肪酸およびエステルである。しかしながら、この場合、界面活性複合体の他の 成分（すなわち、　ＤＰＰＣおよびＰＧ）を利用することが好ましい。有用な噴 射剤は、典型的には周囲条件下で気体であり。 加圧下で凝縮する。低級アルカンおよびフッ素化アルカン（例えば、フレオン） が用いられ得る。エアロゾルは適当な弁を装備した容器に詰められ、従って成分 は放出されるまで加圧下で保持され得る。 界面活性複合体は、適当な投薬形態として、気管内挿入管によって、エアロゾル 投与によって、あるいは吸入されるガス中へ懸濁液または微粒子を噴霧化するこ とによって投与される。体重１ｋｇあたり約Ｏ０１■と２００ｍｇとの間、好ま しくは。 ５０〜６０■の量の複合体を１回の用量として投与する。新生児に使用する場合 には、　−１Ｑに１回の投与で充分である。成人の場合には、欠乏状態であるこ とが示されているレベルから回復するのに充分な再構成複合体を投与する（Ｈａ ｌｌｍａｎ、　Ｍ。 ら、　Ｊ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉ　ａｔｉｏｎ　（１９８２）　 ７０　：　６７３−６８２）。 Ｃ，髪！煎星１五 細胞の形質転換、ベクターの構築、　ｍＲＮＡの抽出、　ｃＤＮＡライブラリー の調製などに用いられる技術のほとんどは、当該分野で広〈実施されており、は とんどの当業者は、特定の条件および手順が記述された標準的な資料を熟知して いる。これらの方法は、　ＷＯ３６１０３４０８に詳細に記述されている。 前出願において記述したように１発現は様々な宿主系で達成され得る。このよう な宿主系には、特に、＠乳類系および細菌系、そして酵母を基礎とする系が含ま れる。さらに、当該分野では他の細胞系が利用されるようになってきている。 例えば、タンパクをコードする遺伝子を昆虫細胞内で発現させるのに用いるバキ ュロウィルスベクターである。以下に述べる発現系は２例証的なものであり、当 業者には様々な発現系が用いられ得ることが理解される。 （以下余白） Ｄ、スＪ１外 ０、Ｌ、　のＡＳＰ　ンバクの イヌ、ヒト、およびウシのＡＳＰタンパクを、精製された形放血したイヌから得 たイヌの肺から、肺の界面活性複合体を調製した。洗浄を含めたすべての操作は ４°Ｃで行い、単離した物質は一１５°Ｃで保存した。 肺を脱気し、１回の洗浄あたり５ＲＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　１００＋ｏＭ　 ＮａＣ１゜ｐＨ７，４の緩衝液１１を用いて３回洗浄した。この緩衝液のＣａ″ ２濃度は、５Ｘ１０−’Ｍ以下であった（Ｒａｄｉｏａ＋ｅｔｅｒ　Ｆ２１１２ 　Ｃａ　；Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ　Ａ／Ｓ、　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　Ｄｅｎ ｍａｒｋ）、プールした柿渋浄液を細胞物質を除去するために１５０Ｘｇｍｖで １５分間遠心した（Ｓｏｒｖａｌ　ＲＣ２−Ｂ）　ｅ次いで、上清を１５型ロー ター（Ｂｅｃｋｎ＋ａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　）を用いて２０．ＯＯＯＸｇ ａｖで１５時間遠心（ＢｅｃｋｍａｎＬ３−４０）Ｌ、得られたペレットを１． ６４Ｍ臭化ナトリウムを含有する緩衝液に分散した。１時間平衡化した後、この 懸濁液を。 Ｓ−２８０−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎ５ｔｒｕＩＩ＋ｅｎｔｓ　）を用いて １００．ＯＯＯｘｇｓｖで４時間（Ｂｅｃｋ＋ａａｎ　Ｌ５−５０Ｂ）遠心分離 した。その薄膜を緩衝液で再懸濁し、１００，０００ｘｇａｖで１時間遠心（Ｂ ｅｃｋｍａｎＬ５−５０Ｂ）　した、複合体を含むこのベレットを、２回蒸留し た蒸留水に再懸濁した。 ベレットを１０〜１５■リン脂質／−の濃度で水に再ｇ濁して５０倍容量のｎ− ブタノールに注入しくＳｉｇｒｔｓｔ、　Ｈ，ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ駐並りし旺 り並憇旦（１９７７）　７４　：　１７８−１８４）　、室温で１時間撹拌した 。これを１０．ＯＯＯｘｇｍｖで２０分間遠心（Ｓｏｒｖａｌ　ＲＣ２−Ｂ）し た後、以下に述べるように、　３２Ｋ　ＡＳＰを含有するペレットをさらに精製 するために回収する。上清は単相であり、脂質および低分子量のタンパクを含有 する。脂質を得るために。 上滑を４０°Ｃの真空下にて乾燥させ、脂質を抽出した（Ｆｏｌｃｈ。 Ｊ、ら、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９５７）　２２６　：　４９７−５０ ９）　。 疎水性タンパクを得るために、上清をＲｏｔｏｖａｐにかけてブタノールを除去 し、エタノールの添加に続いてＲｏｔｏｖａｐにかけ、さらに乾燥させた。乾燥 残留物を、　０．１Ｎ　ＨＣＩを含有する再蒸留したクロロホルムに懸濁し、不 溶性物質を遠心分離により除去した。 得られた溶液をＬＨ−２０カラム（Ｐｈａｒｅａｃｔａ）でクロマトグラフし、 クロロホルムで展開した。　（Ｌ）ｌ−２０はセファデックスＧ−５０のヒドロ キシプロピル誘導体である；該ＬＨ−２０は有＠溶媒に対して不活性な疎水性ゲ ルである。）タンパクは排除され；脂ｔ／リン脂質は、内部容積部分から溶出さ れる。 タンパクを、窒素下でクロロホルムを蒸発させることにより排除容積画分から回 収し９次いで、ポリアクリルアミドゲルでサイズ分画した。この分画を非還元条 件下で行ったところ、約ＩＢｋｄ　（ＷＯ８６１０３４０８では１６．５ｋｄと 同定）　、８ｋｄ　（ＷＯ８６１０３４０８では１２ｋｄと同定）、および５　 ｋｄ　（ＷＯ８６１０３４０８では６ｋｄと同定）のバンドが得られた；還元条 件下では、５−１２ｋｄの幅の広い単−バンドが認められた。 非還元性ゲルから得た１８ｋｄ、８ｋｄ、および５ｋｄのバンドをエドマン分解 法によりＮ−末端分析し、以下の配列を得た＝１８ｋｄ　：　？−Ｐｒｏ−１１ ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｒ ｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｍｅ 　ｔ−Ｔ　ｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ　−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ −Ｔｈｒ−？　−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−８ｋｄ　：　Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｈ ｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１ ｅ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ− ５ｋｄ　：　Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅ ｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１ｅ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ− ５〜１２ｋｄのバンドは、　１８ｋｄ、８ｋｄ、および５ｋｄタンパクの混合物 であることも示し、ここでタンパクの”ＩＯＫ″混合物と命名する。 ｗｏ８６１０３４０８　（前出）に述べられているように、精製された３２にア ポタンパクを得るために、上記のｎ−ブタノール抽出で得られた沈澱物を用いた 。 Ｄ、１．ｂ、−４上９工醪ハ彰東岨 ヒトの３２におよび低分子量ＡＳＰを、　ＰＣＴ国際公開第罰８Ｇ１０３４０８ 号公報に記載の方法に従って調製した。 単離された低分子量の疎水性タンパクは、非還元条件下でポリアクリルアミドゲ ル電気泳動を行うと、　１８ｋｄ、８ｋｄ、および５ｋｄに相当するバンドを示 す、還元条件下では、５〜１２ｋｄに相当する幅の広い単一バンドが得られる。 これらのパンＤ、１．ｃ、文之！し閥シλ東除 ５ｋｃ１および１８ｋｄタンパクを含有するウシのＩＯＫ　ＡＳＰを、イヌのＡ ＳＰについて用いたのと同様の方法で、ウシの柿渋浄液から単離した。 切除されたウシの肺を、トリス緩衝食塩水で満たし、この液を吸引により肺から 取り出した。この洗浄液を２００Ｘｇで１０分間遠心して上清を回収し、８〜９ ０００Ｘｇで２０分間遠心した。次いで、「界面活性体」ベレットを界面活性体 の浮遊密度よりも大きな密度を有する０、８Ｍスクロースに懸濁し、約１００． ０００Ｘ　ｇで３時間遠心分離した。浮遊している界面活性体を水に懸濁し、約 ９〜１０，０ＯＯＸ　ｇで２０分間遠沈してスクロースを除去した。 リン脂質に冨む界面活性体を、まず２容量％まで水性の界面活性体を加えた９８ ％ｎ−ブタノールで抽出した。この単一層での抽出は、５ｋｄおよび１８ｋｄの タンパク、および脂質を可溶化すると同時に、その他のタンパクの沈澱を引き起 こす。 このタンパクは９〜１０，０ＯＯｘ　ｇで遠心分離することにより除去した。次 いで、５ｋｄおよび１８ｋｄタンパクから脂質を分離するために、このブタノー ル溶液をＬＨ−２０ゲル透過カラム（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ）でクロマトグラフ を行った。所望のタンパクのピークを、　ＬＨ−６０で再びクロマトグラフを行 い、５ｋｄタンパクから１８ｋｄタンパクを分離した。両方のカラムとも、０． ５％０．ＩＮ　）ＩｃＬを含有するクロロホルム：メタノール（２：１．Ｖ：Ｖ ）で溶出する。 精製した５ｋｄおよび／または１８ｋｄタンパクを単独で、または組み合わせて （１：１）、効果的な界面活性体を得るために合成リン脂質と種々の重量比で混 合した。 Ｄ、２．イヌの１０にＡＳＰタンパクをコードするｃＤＮＡイヌの成体の肺組織 から抽出したメンセンジャーＲＮＡを。 ＷＯ３６／　０３４０８（前出）に記載されているようなｐＢＲ３２２でのＧＣ ティリングを用いたＤＮＡライブラリー調製のために使用した。 ５Ｐ−１８タンパク：コドン選択のための哺乳類コドン選択表を用いて、　１８ ｋｄタンパクのＮ−末端の配列に対応する２つのオリゴマープローブを合成した 。プローブ１１９８は３６塩基からなる配列５’−ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＣＡＧＧ ＣＣＣＴＴＧＧＧＧＡＴＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴ−３’　；プローブ１１９９ は４５塩基からなる配列５’　−ＣＴＴＧＡＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＣＡＣＡＧ ＣＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＧＧＧＡＴＧＧＧ−３’であった。両者はと もに。 リン酸化により３Ｚｐで標識した。 ハイブリダイゼーションのために、フィルターを真空下８０°Ｃで２時間加熱し １次いで０．１％ＳＯＳを含有する大容量の３×ＳＳＣ中で６８°Ｃ，４時間振 盪しながら洗浄した。このフィルターを、６ＸＳＳＣ，５Ｘデンハート（Ｄｅｎ ｈａｒｄｔ’ｓ）　、　２０％ホルムＤＮＡ　１００μｇ／ｒａｆｔで数時間ブ レハイブリダイズさせた。複製フィルターを、　１３ｎｇ／ｄのプローブ１１９ ８または１６ｎｇ／ｄのプローブ１１９９のいずれかを含有する上記の緩衝液中 で、初期温度が６８°Ｃ２その後４２°Ｃで一晩ハイブリダイズさせた。このフ ィルターを、６　Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ、　０．０５％ビロリン酸ナトリウ ム中、室温で１５分間２回洗浄し３次いで同様の緩衝液中、６５°Ｃで５分間洗 浄し、その後乾燥させ、オートラジオグラフィーを行った。 スクリーニングした４０．０００クローンのうち８クローンが両プローブにハイ ブリダイズし、該ハイブリダイズしたクローンの制限分析を行った。組み合わせ ると、全長が１５２０ヌクレオチドになる２つの重複したクローンが配列決定さ れた。結果は第１図に示した。これら２つのクローンを、　ｐｏｌｏに−１およ びｐＤｌｏに−４と命名し、第１図に示す、矢印は、成熟１８ｋｄタンパクの開 始点を示している。 ５Ｐ−５タンパク　コードするｃＤＮＡ　：ヒトの５ｋｄ肺界面活性タンパクの 推定配列に相当するオリゴマーのプローブを合成した。イヌの肺のｃＤＮＡライ ブラリーを上記のように作成し、スクリーニングを行った。単離されたｃＤＮＡ は、約８００ｂｐであった。これはｃＤＮＡの全長ではなかった。というのは、 ノーザン分析ではクローンの全長は約１．１ｋｄであることが示されたからであ る、　ｃＤＮＡクローンは、イヌの５ｋｄまたは８ｋｄ成熟タンパクのＮ−末端 の約３０アミノ酸残基上流から始まっていた。 可能性のある切断部位（Ｇｉｎ−Ｇｉｎ）は、約５ｋｄのタンパクを与える。 Ｄ、３．占−ヒの　ＡＳＰ　ＤＮＡ バタテリオファージ　シャロン２８にクローン化したヒトの’ｙ’　／　ムライ ７”ｙ　’）　（Ｒｉｎｄｓ、　Ｄ、Ｌ、ら、　Ｇｅｎｅ　（１９８０）　１２ 　：　３０１−３ＩＯ）を、バーバード大学のＤｒ、　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ がら入手した。 約１．５　Ｘ　１０’のファージをＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ２Ｏ２で増殖させ、　Ｂｅ ｎｔｏｎ＋−０Ｄ、ら、　５ｃｆｅｎｃｅ　（１９７７）　１９６　：　１８０ −１８２に記述されているように、プラーク溶解産物をニトロセルロースフィル ターに移した。ヒトの３２ｋｄタンパクをコードしているゲノムクローンｇＨＳ −１５の単離、およびこの遺伝子の発現はすでに記述している。 さらに、ヒトの肺由来のｃＤＮＡライブラリーを、　ＧＣティリングまたはλｇ ｔのいずれかにより、前に記述したように調製した。３２ｋｄのヒトＡＳＰタン パクをコードするｃＤＮＡの回収も、　ＷＯ３６１０３４０８に記述した。 ここで第１４図に開示されているのは、ここでλｇｔｌｏにおけるヒト肺のライ ブラリーから得られ、　ｐＨ５１０−５およびｐＨ５−１０−４と命名された。 　ｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列である。これらのタンパク は、　ｗｏ８６１０３４０Ｂに記載の回収されたゲノムクローンによりコードさ れているタンパクとは。 それぞれ１つおよび７つのアミノ酸が異なっている。このゲノムクローンにより コードされているタンパク配列も、第１４図に示す。６ＡおよびＩＡで示される 第１４図の残りの配列は。 他で得られたｃＤＮＡがコードする付加的な変異である。ヒトの３２Ｋ　ＡＳＰ タンパクは、同義遺伝子によりコードされ得ると考えられる。 ５Ｐ−１８Ω且双：公開公報に記載されているように、λｇｔ’ｉ。 中のｃＤＮＡライブラリーを、ニトロセルロースフィルター上で上記Ｉ　Ｘ１０ ’ｃｐｍのイヌのクローンｐ０１０に−１（第１図に示す）を用いて３７°Ｃで １６時間スクリーニングした。これは、４０％ホルムアミド、５　Ｘ５ＳＣ、０ ，０５％ＳＤＳ、５Ｘデンハート、５０μｇ／ｄ酵母ｔｌｌＮＡおよび５０μｓ ／ｄサケ精子のＤＮＡで行った。　（ｐｏｌｏに一４断片、または全長のｐｏｌ ｏに−１およびｐＤｌｏに一４クローンの組み合わせも同様に用いられ得る。） フィルターを、２　Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ中、５０中口５００分間２回洗浄 し、乾燥させ、オートラジオグラフィーを行った。４０．０００個のプラークの うち２個が陽性であり、　ｃＤＮＡ　＃３と命名した１、５ｋｄ挿入断片を有す る１つを配列決定のために選択した。５Ｐ１８タンパクおよびその前駆体に対す る完全なヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を第２図に示す。図に示さ れるように、成熟５Ｐ１８タンパクは、２０１番目のＰｈｅをコードする６１４ 番目のヌクレオチドから始まっている。プロセッシングを受けたタンパクのカル ボキシ末端は、２８６番目のアルニギンであると考えられる。１．５ｋｄの挿入 断片を切り出し、　Ｅｃ’ｏＲＩで切断したＰＵＣ８にサブクローニングし、　 Ｅ、ｃｏｔｉ　Ｋ−１２ＭＣ１０６１株中のｐｈ１８に−３と命名されたこのプ ラスミドを、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎにＡＴＣＣ受託番号６７２７６で寄託した。 ｐｈ１８に−３ｃＤＮＡ挿入断片は、ヒトのゲノムライブラリー（前出）の５Ｐ １８タンパおよびその前駆体をコードする遺伝子をスクリーニングするのに用い た０回収された遺伝子のエキソンをコードする配列を第３図に示す、　Ｐｈｅ− ２０１の成熟アミノ末端は、　３８６６番目のヌクレオチドである；ゲノムヌク レオチド配列の番号付けは、ラムダクローンから配列決定された７３３２ｂｐの 最初の残基から始まっている。 ゲノムおよびｃＤＮＡのコード配列はヌクレオチドが１つ異なっており、その結 果、前駆体のアミノ酸配列の１残基が１つ異なる；すなわち、　ｃＤＮＡのＩ　 ｌｅ−１３１が、ゲノムクローンではＴｈｒ−１３１となっている。このように 、前駆体をコードするゲノムクローンはＮ−結合グリコシル化に対する２つの共 通部位（Ａｓｎ−１２９：Ｔｈｒ−１３１およびＡｓｎ−３３１：５ｅｒ−３１ ３）を有しており。 ｃＤＮＡのコード配列は、後者のグリコジル化部位のみを有している。ゲノム配 列をコードするｃＤＮＡクローンも、ライブラリーに存在すると予想される。 ｆｉ：ＳＰ５タンパクについて、６個のオリゴヌクレオチドからなるヌクレオチ ド混合物をプールした（第４図）。 これらのヌクレオチドは、イヌの８ｋｄおよび５ｋｄタンパクのＮ−末端アミノ 酸配列に対して作られたものである。上記のように調製されたλｇｔｌＯ中のヒ ト肺のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ＳＰ５タンパクをコードする ８個のｃＤＮＡを得た。成熟５Ｐ−５タンパクの推定Ｎ−末端から約１９残基上 流から始まっているｃＤＮＡクローンは、　８２０ｂｐを有していた。これをラ ムダファージ中に挿入してλｈ６に−３と命名し、　Ａａ＋ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ ｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに＾ＴＣＣ受託番号４０２９４で寄 託した。 代表的なｃＤＮ＾クローンである番号１８および１９を、第５図および第６図に 示す、　ｃＤＮＡ　１１８は、１２残基のポリ（Ａ）を含む８２６ｂｐという最 も長い挿入断片を有する；しかしながら、ノザンプロット分析からは、　５Ｐ− ５タンパクをコードするｍＲＮＡは１〜１．１ｋｄの長さである。　ｃＤＮＡ　 １１８および１９は、　ｃＤＮＡ　！１９１００下線を施しである４つのヌクレ オチドが異なり、その結果、２個のアミノ酸が異なる；＃１８のＡｓｎ−１３８ は臂１９ではＴｈｒ−１３８であり、ｓ１８のＡｓｎ−１８６はｌ１１９では５ ｅｔ−１８６である。 ヒトの５ｋｄおよび８ｋｄタンパクには２つのＮ−末端アミノ酸残基が見られ、 これらは第５図および第６図のＰｈｅ−２４とＧｌｙ−２５とに相当する。５ｋ ｄおよび８ｋｄタンパクのカルボキシ末端は、正確には決定されていない；８ｋ ｄタンパクはＧｌｎ−１０８で終わるのに対し、５ｋｄタンパクはＧｌｕ−８０ またはＴｈｒ−６５で紡わると仮定される。 （ｐＢＲ３２２におけるイヌ肺のライブラリーを２本質的に上記のように調製し 、ヒトの８２０ｂｐクローンを用いてスクリーニングを行った。単離されたｃＤ ＮＡ−ｐＤ６に−１１と命名−は約５ｏｏｂｐ（第１３図を参照）であり、　ｃ ＤＮＡの全長ではなかった。クローンは、イヌの成熟５Ｐ−５タンパクのＮ−末 端の上流約３０アミノ酸残基から始まっており、可能性のあるＧｉｎ−Ｇｉｎ切 断部位を有していた。） Ｄ、４．　の　ベタ　−の 種々のＡＳＰをコードする配列の哺乳類細胞内での発現に適し、イントロンを有 するＤＮＡをプロセッシングすることも可能なベクターを構築した。発現は、　 Ｋａｒｉｎ、Ｍ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８２）η暦７９７−８０２に記述さ れているように、メタロチオネイン■（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｊｏｎｅｉｎ　；　 ｈＭＴ　Ｉｆ　）制御配列によって制御する。 中間宿主ベクターであるｐＭＴは、以下のようにプロモーターをｐＵｃ８に連結 することによって得た：ｈＭＴ　ＩＩ遺伝子を有するプラスミド８４Ｈ（Ｍａｒ ｉｎ、　Ｍ、ら（前出））をＢａ１ＨＩで完全に消化し、末端のヌクレオチドを 除去するためにエキソヌクレアーゼＢａ１−３１で処理し１次いで、ｈＭＴＩ［ 遺伝子の−７６５から＋７０のヌクレオチド（＋１のヌクレオチドとは、転写さ れるヌクレオチドの１番目のことである）を含有する８４０ｂｐの断片を遊離さ せるために旧ｎｄｎ［で消化した。 ８４０　ｂｐ断片を単離し、　Ｈｉｎｄ　ｍ　／Ｈｉｎｃ　Ｉｆで消化したｐ　 ＵＣ８に連結しくＶｉｅｉｒａ、　Ｊ、ら、釦些（１９８２）困：２５９−２６ ８）　、この連結した混合物でＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１を形質転換した。ｐ ＭＴの正しい構造は３　ジデオキシヌクレオチド配列決定法により確認した。 さらに、Ｃ−末端制御シグナルを有するｐ？ｌＴの誘導体であるｐＭＴ−Ａｐｏ も調製した。　ｐＭＴ−Ａｐｏはヒト肝臓のタンパクａｐｏＡ　１遺伝子の一部 を有しており（Ｓｈｏｕｌｄｅｒｓ、　Ｃ，Ｃ，ら、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ｓ　Ｒｅｓ　（１９８３）　１１　：　２８２７−２８３７）、　３’末端制御 シグナルを有するａｐｏＡ　Ｉ遺伝子のＰｓｔＩ／Ｐｓｔｌ　２．２ｋｂ断片（ 平滑末端）をｐＭＴポリリンカー領域の５ｌａａ　１部位にクローン化し、ａｐ ｏＡ１遺伝子の大部分をＢａ＋ｎＨＩで消化することによって取り出し、クレノ ーで平滑末端とし、　５ｔｕＩで消化し、そして再結合させた。 得られたベクターはジデオキシ配列分析で確認すると７３゛末端からおよそ５０ ０ｂｐのａｐｏＡＩ遺伝子を有する。 さらに、　ＳＶ４０ウィルスのエンハンサ−を有する発現ベクターを、　Ｆｌｉ ｎｄｌｌｌで切断したＢｉｎｄｌ［［部位に１１００ｂｐのＳＶ４０　ＤＮＡ断 片を挿入することにより構築した。１１００ｂｐのＳＶ４０　ＤＮＡ断片は。 ゲル電気泳動により単離し、　ＨｉｎｄＩ［Ｉ消化し、　ＣＩＰ処理したｐＭＴ に連結した。得られたベクターはｐＭＴ−ＳＶ（９）およびｐＭＴ−ＳＶ　（１ ０）と命名され、ＭＴ−ｎプロモーターが先行し２反対方向でこの断片を含む。 ｐＭＴ−５Ｖ（９）　テは、：ｆ−７ハ７サーは５’ｍＲＮＡ開始部位から約１ ６００ｂｐである；逆方向のＳＶ（１０）では、エンハンサ−は５’　ｍＲＮＡ 開始部位から約９８０ｂｐである。どちらの方向でも作動可能であるが、エンハ ンサ−配列が開始部位に近い方向がより高いレベルの発現を与える。 所望の宿主ベクターｐＭＴＡｐｏｌｏを得るために、　ｐＭＴ−Ａｐｏ（上記） を消化することにより得られた５ｏｏｂｐのａｐｏＡＩ断片を単離し。 この単離体を、　ＥｃｏＲＩ／Ｂａｍ［で消化したｐＭＴ−３Ｖ　（１０）に連 結して、この断片をｐＭＴ−ＳＶ　（１０）へ挿入した。 この宿主ベクターをＢａｍＨＩで消化し、平滑末端とし、　５Ｐ−１８前駆体を コードする１２７５ｂｐのクローンＩ３から得られたｃＤＮＡ配列に連結させた 。このクローン１１３は第２図で平滑末端断片として示す、これは、６６３番目 のヌクレオチドのＢａｍＨＩ部位を避けた形でｃＤＮＡ１１３（第２図）からＥ ｃｏＲＩ／Ｂａｎ＋ＢＩ　（部分）断片を単離し、　ＥｃｏＴＩ／ＢａｍＨＩ　 ｐＵｃ９ヘサブクローニングすることによって行われ、所望の断片は、　Ｅｃｏ ＲＩおよび旧ｎｄＩＩ［で切り出し、クレノーで平滑末端とし９次いでｐＭＴＡ ｐｏｌＯへ挿入した。得られたベクターｐ？１Ｔ（Ｅ）　：　５Ｐ１８−４０に で、以下に述べるようにＣＨＯｌｉｌ胞を形質転換した。 同様の方法で、第５図および第６図の５Ｐ−５クローンの平滑末端としたＥｃｏ ＲＩ挿入断片をＢａｍＨＩで消化したｐＭＴＡｐｏｌｏへ導入し、　ｐＭＴ（Ｅ ）　：　５Ｐ−５ベクターを得て、ＣＨＯ細胞を形質転換した。 （以下余白） Ｄ、５．　での チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）−Ｋｌ細胞を、１０％ウシ胎児血清を 含有するコーン（Ｃｏｏｎ）のＦ１２培地およびＤＭＥ２１培地の１：１の混合 物からなる培地で増殖させた。コンピテント細胞を、対象とするベクターおよび ｐＳＶ２　：　ＮＥＯで同時に形質転換した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ＋Ｐ、ら、　Ｊ 　Ｍｏｌ　Ａ　Ｉ　Ｇｅｎｅｔ（１９８２）上：３２７−３４１）。ｐＳＶ２： ＮＥＯは、ネオマイシン類似物であるＧ４１８に対する耐性を与える機能遺伝子 を有する。典型的な形質転換では。 ｐＳＶ２−ＮＥＯＯ，５μｇおよび発現ベクターＤＮＡ５μｇかそれ以上を１０ ０ｍｍディツシュの細胞に添加した。　Ｗｉｇｌｅｒ＋Ｍ、ら、釦旦（１９７９ ）ｌｆｉニア７７−７８５のプロトコルに従ったリン酸カルシウム−〇Ｎ＾共沈 法を、　ＤＮＡに４時間接触させた後に１５％グリセロールを含有するＰＢＳで の２分間“ショック”を包含する方法とともに用いた。 簡単に述べると、細胞を１７１０にまとめて接種し、−晩培養し、　ＰＢＳで２ 回洗浄し、そして１５分間ＣａＰＯｉ・ＤＮＡ共沈物を含むヘペス（Ｈｅｐｅｓ ）　Ｆｉｔ衝生理食塩水に移し９次いで１０ａｆの培地で培養した。この培地を 吸引で除去し、１５％グリセロールを含有するＰＢＳ中に１．５〜３分間置いた 。ショックを与えた細胞を洗浄し、培養培地で培養した。　ＭＴ−Ｉｆで制御さ れた発現の誘導まで、培地に１０％ＦＢＳを含有するＦ１２／ＤＭＥＭ２１１　 ：　１を含有させる。１日の後、　Ｇ４１８耐性コロニーをプールするために細 胞を１■／ｄのＧ４１８に接触させた。うまく形質転換され。 しかも所望のプラスミドを安定に保持する形質転換体を１次いで、単離クローン 精製のために低密度でプレートした。 形質転換体を、所望のタンパクの生産性について、最初にプールを１次いで複数 ウェルのプレートの単離クローンを分析した。プレート分析のレベルは、ウェル のサイズに多少依存する０例えば、２４ウエルのプレートでの結果を９６ウエル のプレートでの結果と直接には比較できない。プレート分析により充分なレベル でタンパクを産生ずることが認められたクローンは９次いでローラボトル中で行 う生産工程で培養することが可能である。典型的には、スケールアップした場合 には生産レベルがより高くなる。しかし、プレート分析とローラボトルとでは結 果に確かな相関性はない。すなわち、プレート分析では最高の生産を行う培養物 が、スケールアップ後では必ずしも最高ではない。この理由のため、典型的には １００〜２００、またはそれ以上の個々のクローンをプレート上でのスクリーニ ング法で分析し、最も生産したもの５〜１０を生産条件下（回転瓶）で分析する 。 プールした形質転換細胞を複数ウェルのプレートで培養し。 次いで、ＡＳＰの産生を誘導するために、５Ｘ１０−’〜ｌＸｌ０−’の濃度の 亜鉛イオンに接触させる。 １０％ＦＢＳを含有するマツコイ（ＭｃＣｏｙ’　ｓ）の５Ａ培地で培養した個 々の細胞系の半集密的な単層を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）　テ洗浄し、 　１０％ＦＢＳ、　ＩＸＩＱ−４塩化亜鉛、および０．２５ｍＭアスコルビン酸 ナトリウムを含有するマツコイの培地で再び培養した。（アスコルビン酸はプロ リン残基の水酸化を仲介するのに有用である。）その後２４時間誘導した細胞を ＰＢＳで洗浄し、塩化亜鉛およびアスコルビン酸を含有する無血清のマツコイの 培地で再び培養した。１２時間後、馴下培地を集めた。 プールした形質転換細胞を上記ＺｎＣ１□で誘導し　３ＳＳ−メチオニンで標識 した。標識を１２時間行った後、培養培地を上記のように集め、ヒトの５Ｐ−１ ８ＡＳＰに対する抗血清免疫沈降を行った。次いで試料を１５％ゲルのＳＯＳ　 ＰＡＧＥにかけ、第７Ａ図および第７Ｂ図に示す結果を得た。 第７Ａ図において、レーンＭは分子量の標準物質を示しており、レーンＡは形質 転換しなかったＣＨＯ細胞由来の免疫沈降したタンパクを示し、そしてレーンＢ はプールしたｐＭＴ　（Ｅ）　：５Ｐ１８−４０に形質転換体由来の免疫沈降し たタンパクを示す。第７Ｂ図では３プールした形質転換体由来の免疫沈降したタ ンパクをエンドグリコシダーゼＦで１時間分解し、第７Ａ図と同様に電気泳動を 行った。レーンＡは処理なしのコントロールであり、レーンＢは分解した試料で ある。 第７Ａ図に示すように、　４３ｋｄおよび２５ｋｄの前駆体タンパクが形質転換 した細胞により産生される；第７Ａ図に示されるより小さな分子量のタンパクは 、再現性がない。第７Ｂ図の結果は４３ｋｄの前駆体がグリコジル化されている ことを示している。グリコジル化されていない免疫沈降したタンパクのサイズは 、全体サイズである前駆体について予測されたサイズである。 上記の誘導されたもののプールにより産生される非放射性のタンパクを、長さを 決定した前駆体のペプチドの残基３３６〜３５３に対する抗血清を用いてウェス タンプロットを行った。 ２５ｋｄの生産物は、Ｎ−結合したグリコジル化部位を有する。 長さを決定したＰｈｅ　２０１−Ｌｅｕ−３８１の１８１個のアミノ酸配列を示 すと考えられる。 Ｄ、６．付方ばとシｌＬ二 明らかにＣＨＯ細胞において完全な長さの配列から産生された前駆体タンパクの 、インビトロでの切断部位を提供するために、標準的な部位特異性の変異法を用 いて類似ベクターを構築した。このようなある１つの構築体では、　（Ａｓｎと Ｇｌｙとの間で切断される）ヒドロキシルアミンによる切断可能な部位を提供す るために３８１個のアミノ酸の前駆体を修飾し、　Ｇ１＋１−１９９：Ｇｌｎ− ２００およびＡｒｇ−２８６：５ｅｒ−２８７をＡｓｎ：Ｇｌｎに置き換えた。 このように、ヒドロキシルアミンで生じた前駆体の切断は、アミノ末端に付加さ れたｃｌｙ残基およびＡｓｎ残基に換えられた推定のカルボキシ末端のＡｒｇ− ２８６を有する推定成熟型を生じる。 他の構築体では、Ｐｈｅ−２０１および５ｅｒ−２８７をＡｓｐ残基に換える。 酸を用いた切断（ＡｓｐとＰｒｏの間）によって、Ｎ−末端のＰｈｅ−２０１を 欠失し、カルボキシ末端に付加されたＡｐｓ残基を有する５Ｐ−１８タンパクの 成熟型が生じる。 付加的構築体を、Ｇｌｕ残基の後を切断する５ｔａｐｈ　Ｖ８ペプチダーゼを用 いるより温和な酵素的手段で前駆体のインビトロでのプロセッシングを行う、Ｇ ｌｕ−２５１をＡｓｐに変えると、　Ｇｌｕ−１９８およびＧｌｕ−２９１の本 来のＧｌｕ残基が有利である。４３ｋｄの前駆体は、　５ｔａｐｈ　Ｖ８で切断 され、アミノ末端に付加されたＧｌｎ−Ｇｌｎおよびカルボキシ末端にＰｒｏ− Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕを有する推定の成熟５Ｐ−１８タンパクを生じる。付加 された構築体では、　Ｇｌｕ残基を２００番目および／または２８７番目の位置 に置くことが可能である。 Ｄ、７１皿にユｑλ里 ５ｐ−ｉｓタンパクの非グリコジル化型を、メチオニンが先行する残基２０１〜 ３８１に相当する１８１個のアミノ酸前駆体として、または１５残基のβ−ガラ クトシターゼの先行部分を有するヒドロキシルアミンで切断可能な融合タンパク 前駆体として、細菌中で生産し得る。ＡＴＧが先行するｃＤＮＡのアミノ酸２０ １〜３８１をコードする修飾されたｃ　Ｄ’Ｎ　Ａを、　Ｔｒｐ制御ベクターで あるｐＴｒｐ−２３３（ｐＴｒｐ宿主ベクター）のＥｃｏＲ１部位と旧ｎｄＩ！ １部位との間に挿入し、　ｐＴｒｐ−２０を作成する。この構築物は分子量２０ ｋｄのタンパクを産生ずる。ｐＢＧａｌ宿主ベクター中の類似構築体であるｐＢ Ｇａｌ−２０は、ヒドロキシルアミン惑受性Ａｓｎ−Ｇｌｙ　重複を介して１５ 残基のβ−ガラクトシターゼの先行部分と融合した５Ｐ１８　ｃＤＮ　Ａｌ１と おなし配列を有し、　ＭＷ＝２２ｋｄの融合タンパクを産生ずる。この構築の詳 細は以下のり、１１で述べる。 ｐＴｒｐ−２０におよびｐＢＧａｌ−２０にプラスミドを用いて、　Ｅ、ｃｏｌ ｔ　Ｗ３１１０をアンピシリン耐性に形質転換した。ｐＴｒｐ−２０／Ｗ３１１ ０またはｐＢＧａｌ−２０／Ｗ３１１０を旧培地（ＩＸＭ９塩類、０．４％グル コース。 ２　ｍｇ／ｄチアミン、　２００　μｇ／ｄＭｇｓＯ４４Ｈｚｏ、０．５％カザ ミノ酸。 １００　μｓ／ｄｌＡＡ（３−β　インドールアクリレート、シグマ１−１６２ ５）で迅速に増殖培養させ、　Ｔｒｐブロモターを誘導する。 誘導した細胞は、３５Ｓメチオニン（１００ｕＣｉ　／　ｍａｌ　）で１０分間 標識する前に２時間増殖させた。標識は、非放射性の２０％ＴＣＡを細胞１ｄ当 り３５０μ！添加することにより停止させた。　ＴＣＡ沈澱物をアセトンで洗浄 し、　ＳＯ３ＰＡＧＥ試料緩衝液で煮沸することにより再懸濁し、１５％ゲルで ＰＡＧＥを行った。 第８図にこの操作の結果を示す：レーンＭはサイズ標準物質である；レーンＡは ｐＢｇａ　Ｉ宿主ベクター／何３１１０．　レーンＢはＢｇａｌ−２０／Ｗ３１ １０．レーンＣはｐＴｒｐ宿主ベクター八３１へ０．そしてレーンＤはｐＴｒｐ −２０／Ｗ３１１０である。レーンＢおよびＤはそれぞれ、レーンＡおよびＣに は存在しない２２ｋｄおよび２０ｋｄの主な標識タンパクを示す。 誘導した細胞の非放射性抽出物を同様の方法で調製し、　ＰＡＧＥを行い１次い でアミノ酸３３６〜３５３に相当するペプチドに対する抗血清を用いてニトロセ ルロースにウェスタンプロットし９次いでｌ２Ｊ−タンパク八で行った。第９図 において、レーンＡはＢｇａｌ−２０／Ｗ３１１０．レーンＢはｐＴｒｐ宿主ベ クター／Ｗ３１１０゜そしてレーンＣはｐＴｒｐ−２０／Ｗ３１１０である。　 ｐＴｒｐ−２０およびＢｇａｌ−２０は、明らかに推定分子量の免疫特異的タン パクを示す。 前述のような、細菌内における発現のための切断部位を与える修飾された５Ｐ− １８タンパク配列をコードするベクターも。 以下のように調製した。Ｉ）Ｔｒｐ−２０において、　Ａｒｇ−２８６５ｅｔ− ２８７をコードするコドンをＡｓｎ−Ｇｌｙをコードするように換えた；）　ヒ ドロキシルアミン感受性切断部位を導入する。または酸感受性のＡｓｐ−Ｐｒｏ 切断部位をつくるように５ｅｔ−２８７のコドンをＡｓｐのコドンに置換した； または所望のタンパクを切断することなしに５ｔａｐｈ　Ｖ８を用いてＧｌｕ− ２９１で切断するように、　Ｇｌｕ−２５１のコドンをＡｓｐのコドンで置換し た。または、　ｐＴｒｐ−２０およびｐＢｇａｌ−２０の両方において、推定の カルボキシ末端Ａｒｇ−２８６までの３′配列を削除し、停止コドンで置換した 。どちらの構築体も、誘導後に適切な大きさの標識タンパクを産生じなかった。 ｐＴｒｐ−２０の類似物である。　５Ｐ−５“前駆体”のＡＴＧが先行するＧｌ ｙ−２５からカルボキシ末端の１ｉｅ−１９７まで及ぶｃＤＮＡｔ１８（第５図 ）の所望の断片を＊　ＥｃｏＲＩ　／Ｈｉｎｄ　ｍ切断したｐＴｒｐ−２３３に 挿入したｐＴｒｐ−５を作製し、そしてｐＢｇａ　１宿主ベクター中に挿入して ｐＢｇａｌ−５を作製した。ここで、　５Ｐ−５配列はヒドロキシルアミン感受 性Ａｓｎ−Ｇｌｙを通してβ−ガラクトシダーゼの先行部分に融合している。 また、もし推定のＣ−末端が正しいならば、この構築体から予想されるタンパク のＰｈｅ−２４上流のＧｌｕおよびＧｌｕ−６６での。 ５ｔａｐｈ　Ｖ８による切断で成熟５ｋｄのタンパクが生じる。 これらの構築体はＥ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０を形質転換し、前述のように発現さ れた。 Ｄ、８．３Ｋ　ンパクの　＋１ ３２にタンパクは、循環性のマンノース結合タンパクと強いアミノ酸相同性を持 ち、そしてまた、他のレクチンの糖結合ドメインに共通の残基を有する。糖の認 識は、界面活性物質の代謝の制御において、または肺胞の免疫性のような他の機 能において、　３６ｋｄ　ＡＳＰタンパクおよび他の３２にタンパクの重要な性 質であり得ると考えられている。Ｉ！アフィニティークロマトグラフィーを用い てそれらのタンパクを精製するために、該タンパクのマンノース親和性を利用す ることが可能である。クロマトグラフィーでの精製は、マンノース残基を高いυ Ｉ合で有する固定化糖タンパク（例えば、酵母マンナンまたはインベルターゼ） を用いて、もしくはアガロースに結合したマンノースで直接調製したカラムを用 いて行われ得る。 柿渋浄液から単離された３６ｋｄタンパクは、１ｍＭｃａ”の存在下で、固定化 単糖と広い範囲の特異性をもって結合することが見い出された。この好適な実施 態様による精製工程は次のように行われた＊　２．５ｍＭ　ＣａＣＩｚを含む（ 典型的には８〜１６！の）細胞培養液を直接、６０ｍのマンノース−アガロース カラム（セレクチンー１０＋　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に、約２４０ Ｉ１１／ｈｒの速度で、かけた。カラムを５ｍＭ）リス、１＋ｓＭＣａＣ＋□お よび２５ｍＭ　ＮａＣ１を含む溶液（ｐＨ７，５）　（好ましくはカラム体積の １０倍）で洗浄する。結合したタンパクは、カルシウムイオン存在下で２ａ＋Ｍ ＥＤＴＡまたはパブテン垢で溶出することにより、定量的に回収される。好まし い手法は次のとおりである。まず。 １００ｍＭのホウ酸ナトリウムを含むｐＨ１０，０の溶液をカラム体積の２〜３ 倍容量使用して溶出させる。４回これを行った後。 カラムを４Ｍ尿素で洗浄し、　ＰＢＳまたは２％ベンジルアルコールで再平衡化 する。 次の表に述べたデータは、カルシウムイオンの存在下で結合した回収タンパクの 割合（％）を示す、この値は１２〜７回の実験の平均を示している。Ｃａ”の結 合の闇値濃度は、　０．６ｍＭであり、１ｍＭＣａ”で最大の結合が起こった。 Ｂ　ａ　ｔ　＋　、　Ｓｒ　ｔ　ＩおよびＭｎ”はＣａ”の代替となり得る。３ ６ｋｄタンパクは、　ｐｉ（ｓ、。 で糖と結合するのが認められたが、結合活性は、加熱処理またはジスルフィド結 合の減少によって失われた。 Ｆｕｃ　Ｍａｎ　Ｇｌｃ　Ｇａｌ　Ｇａ１ＮＡｃ　Ｇ１．ｃＮＡｃイヌ”　９４ 　８５　６４　４９　２２　８七）”　１００　１００　１００　１００　７　 ２本データは、　Ｃａ”の存在下で結合する回収されたタンパク（チャージ量の ９４±８％）の割合（％）として示されている。その値は、２〜７回の実験の平 均値である。結合のためのＣａ”の闇値濃度は０．６ｍＭであり、１ｎ＋ＭＣａ ”において最大の結合がおこった。 ３２ｋｄタンパクの精製に適切な他のカラムは１次のものを包含する：（１）ジ ビニルスルホンによりマンノースをセファロース６８　（ファルマシア）に結合 させることにより調製されるマンノースーセファロース（例えば、　Ｆｏｒｎｓ ｔｅｄｔ、Ｎ、およびＰｏｒａ　ｔｈ　。 Ｊ、　（１９７５；ＩＦＥＢｓ　Ｌｅｔｔ、５７．１８７〜１９１参照）：（２ ）ＣＮＢｒ法を用いてインベルターゼをセファロース６Ｂに結合させることによ って調製されるインベルターゼ−セファロース（例えばＰｏｒａｔｈ。 Ｊ、　（１９７４）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、３４　１３〜３０参照 ”）　：　（３）ガラクトース−セファロース；および（４）これらの組み合わ せ。周知のように、このようなカラムには＋［と樹脂との種々の組み合わせが包 含され、そして、実質的に完全に不純物を除去した後に使用され得る。 Ｄ、９．−号ハした９五ユ 単離されたＡＳＰ成分が、気相／水相界面における脂質薄膜の形成を増大させる 能力を、　）Ｉａｇｗｏｏｄ、Ｓ、ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９８５ ）２４：１８４〜１９０に記載された方法を用いてインビトロで分析した。簡単 に述べれば、適当な割合で試験すべきタンパクを含有するリン脂質小胞の調製物 を、水性緩衝液、マグネティックスターラーおよびプラチナ製のプレート（上記 緩衝液表面に浮遊し、ストレインゲージに結合させである）を含むテフロン皿の 底に、小容量注意深く加える。ストレインゲージ上で記録した表面張力の変化は 、撹拌を開始したときから時間経過に従って記録される。 １０にタンパクは、該１０にタンパクを含むクロロホルム溶液を、リン脂質のク ロロホル１１：メタノール（２：　Ｉ　Ｖ／Ｖ）に混合することにより、リン脂 質に加えられた。溶媒をエバポレートし、そして固形物を緩衝液中で水和し、小 胞を得た。 ３２にタンパクは、水溶液中に直接加えて、小胞懸濁液とし得る。そして小胞の 凝集による会合は、濁度測定で検出され得る。 Ｈａｇｗｏｏｄらにより報告されているように（前出）、リン脂質がイヌの肺の 界面活性複合体から得たものであり、それがリン脂質小胞に包理されているとき には、３２にイヌＡＳＰは。 リン脂質小胞を凝集させることができ、そして、薄膜の形成を増大させることが できた。本発明のタンパクの活性は＋　ｌ（ａｇｗｏｏｄが述べているように、 凝集および薄膜の形成増大を測定する同様の方法を用いることにより評価される 。 前述のように調製されたイヌの肺由来のリン脂質調製物（３００μｇ）および合 成リン脂質混合物の両者が用いられた。この合成リン脂質は、市販のＤＰＰＣ２ ４０μｇと卵ＰＧ６０μｇとを含んでいた。これは天然の脂質よりもさらにずっ と薄膜を形成しにくい。しかし、試料のリン脂質は、タンパクの活性が最も効果 的に表されるように選択された。 ３２ｋｄタンパクおよびＩＯＫ　ＡＳＰの混合物は、前述のように。 イヌの肺から単離された。３２にタンパク６０μｇを添加することにより、肺か ら得られた「天然の」リン脂質によって薄膜形成を（はぼ、その複合体自身が示 すのと同じレベルにまで）増大させることができる一方１合成脂質を用いた場合 には。 薄膜形成は中程度に増大するだけであった。１０にタンパク１３μｇを単独で添 加した場合に同様の結果が得られた。しかし。 １０に調製物の１３ｄｇを、３２にタンパク６０μｇの添加に先立って。 合成リン脂質小胞と共にインキュベートしたときには、薄膜の形成は、天然の複 合体それ自身によるものに匹敵する速度と量で起きた。これらの結果は第１０図 に示される。 各々のヒトおよびイヌの５ｋｄおよび１８にタンパクに対する結果は、第１１図 および第１２図に示される。第１１図および第１２図においては、３分後の表面 圧力（ｙ軸）対タンパク濃度（Ｘ軸）がプロットされている。第１１図に示すよ うに、達成された最大圧は４０〜４５ｏ＋Ｎ／＋であり、そして、５ｋｄまたは １８ｋｄが約１０μｇで脂質の分離を引き起こす、脂ｔ１００μｇを全ての場合 に用いたので、これは、リン脂質対タンパクが１０＝１の比に相当する。脂質混 合物は、　ＤＰＰＣ：　ＰＧ（７：３）であったが。 ８：２および９：１の比率は、結果に大きな相違を与えなかった。 第１２図に示されるイヌタンパクの場合は、その結果はヒトタンパクにおける結 果と同一である。第１２図にはまた９組換え生産された３２にタンパクを１８ｋ ｄまたは５ｋｄタンパクに添加した場合の実験結果が示されている。タンパク間 の相乗作用は円で囲った点で示される。　３２ｋｄタンパクｌＯμｇが１８ｋｄ タンパクの５μｇおよび７．５　μｇに、そして、５ｋｄタンパクの７．５μｇ および１１ｄｇに添加された。 ウシの１８ｋｄおよび５ｋｄタンパクは、イヌおよびヒトタンパクの場合と同一 の結果を与えた。 （以下余白） ０．１０．　−（詠］自１に主刃’ＩＬ狡インビボにおける試験のための標準界 面活性物質（ＳＡＭ）を次のように調製した。若いウサギ成体の肺を生理食塩水 で洗浄する。健康なウサギに、３ｃｃのベントパルビタールナトリウムで耳の静 脈を介して麻酔をかける。気管を露出させ、チューブのついた３方活栓を気管に 挿入して気道を確保する。 胸を開いて、胸壁を除き、サイズ８の供給管を有するカテーテルを肺動脈に、心 臓側から挿入する。血液循環系を５０ｄの通常生理食塩水でフラッシュさせる一 方で、６０ｄのシリンジを用いて気管のチューブを通じて肺へ通気し、そして４ 次に。 肺を注意深く、気管をつけたまま取り出す、６０ｄの通常生理食塩水を気管のチ ューブを通して肺に注入し１次に、肺を１分間ゆっくりマツサージし、生理食塩 水を回収する。洗浄を４回繰り返し、洗浄物をプールする。洗浄液から細胞の残 骸を、室温で２時間にわたり１１０００Ｘで遠心することにより。 除去する。このベレットを、最終濃度が１０■／ｄリン脂質となるように、　０ ．ＩＮ生理食塩水に２Ｍの塩化カルシウムを加えた溶液中に懸濁する。濃度は、 クロロホルムおよびメタノールで脂質を抽出し、脂質のリンを測定することによ り調整する。バブルテンシトメーター（泡張力計；　ｂｕｂｂｌｅ　ｔｅｎｓｉ ｔｏｍｅｔｅｒ）では、この物質は、迅速な吸着（時定数０．３秒またはそれ以 下）、および表面積が５０％縮小した状態においてＯから３ｗ＋Ｎ／ｍという最 小の表面張力を示す。拡大時の最大張力は３２から３５ｍＮ／ｍであった。 インビボにおける試験に用いた対象物および装置は次のとおりである。健康で、 若く、懐妊期の雌ウサギをミズーリのＷｈｉｔｅ　Ｈａｒｅ　Ｒａｂｂｉｔｏｒ ｙから入手する。２１日または２２日の懐胎期にこの雌ウサギを空輸し、そして 到着時に妊娠しており。 かつ健康であることを確かめる。雌ウサギをウサギ飼育施設（１４９２−Ｓ　） の標準的な大きなウサギ小屋の中で飼育し、使用する前日に再検査する。 ４つの体積変動記録器を、直径２インチで８００インチ長アクリルシリンダー〔 １７２インチアクリルチューブ（内径、０．５インチ）の３インチ長のチムニ− が取り付けられている〕により構成した。このチムニ−には体積変動記録器内外 からの流れの抵抗を小さくするのに充分な量の綿ガーゼが充填される。チャンバ ーに流入するおよびチャンバーから流出する空気の流れは１体積変動記録器の内 部と空隙との間の圧力変化の微分値を測定することにより決定される。（時定数 ＜０．１秒）。導線を、主シリンダーの端から、圧力変換機（Ｖａ］１ｄｙｎｅ ＤＰ４５＋　Ｖａｌｉｄｙｎｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｏｎ＋ｐａｎｙ、 　Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、　ＣＡ）および較正用シリンジに連結する。実験を行 うときには、電気的に積分された流れ（容量）のシグナルは、しばしばシリンジ で較正する。主シリンダーの他方の端は、２インチのゴムストッパーで密閉され る。このストッパーを通じて４〜８インチの２本の金属棒が配置され、かつＥＣ Ｇ導線が３本引き出されている。綿シーツを、２本の金属棒の間に配置し、実験 動物をその上に載置できるようなつり帯を形づくった。バヨネット（Ｂａｙｏｎ ｅｔ）型電極をＥＣＧ導線に取り付ける。気管のアンキオキャスノハブが人工呼 吸装置（Ｍａｒｋ■、　Ｂｉｒｄ　ＲｅｓｐｉｒａｔｏｒＣｏｍｐａｎｙ、　Ｐ ａ１ｍ　Ｓｐｒｉｎｇｓ、　ＣＡ）からのチューブに順番に取り付けられた多岐 管を通した気流に接触できるように、　ａＮアダプターをストッパーを介して配 置する。通気道の外部のデッドスペースは０．０５から０．０７ｄである。通気 道圧力は、　ＡｌｌｔｅｃｈＭＳＤＩＣＥ／　１変換機（＾１ｌｔｅｃｈ、　Ｃ １ｔｙ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、　ＣＡ）の多岐管内で測定する０体積変動記 録器の測定によれば、　０．０１から１−の容量で１分間あたり１０から１００ の振動数において直線が得られる。４つの体積変動記録器を３７°Ｃに加温した １つの湯浴内に据えつける。各動物はそれぞれ自身の通気装置を有する。切り換 え装置は気流、容量９通気道圧力および各ウサギから連続的に送られ、　Ｂｒｕ ｓｈ記録計に記録されるＥＣＧを制御する。通常、３匹の動物を５分毎に１分間 使用しそれぞれを記録する。 採用した方法は次のとおりである。２７日±４時間の懐胎期のウサギの仔を用い た。ｅ１！ウサギに有効量のを髄麻酔を与えた後（ｌａｉ！ポントカイン）、腹 部を開き、子宮を露出させる。 子宮を開く２分前に、それぞれの胎児に１５■／ｋｇベンドパＪレヒクールおよ び０．１■／ｋｇパンクロニウムを腹腔内投与する。 胎児の動きが止まると、麻酔をうけている胎児を速やかに取り出す０体重測定の 後、はぼ同じ体重の３匹の仔を実験用に選択する。明らかな異常を有する仔は研 究対象にはしない。 仔は２２から４０グラムの間（平均±２ＳＤ）でなければならない。 仔が輻射熱で暖かさを保っている間に、気管に１８ゲージのアンギオキャスでカ ニユーレを挿入する。カニユーレを挿入後。 ０．２１ｄの、生理食塩水、　ＳＡＭまたは試料物質（Ｈ２Ｏ浴で３７°Ｃに保 温し、含有物質の混合を均一にするために２５ゲージの針に５回通す）のいずれ かを、３匹の適合した一腹の仔の気管に入れて、流体−流体界面を形成するため に針のハブに肺の流体が現れるまで胸を緩やかに圧搾する。０．４５ｄの空気に より処理を引き続いて行う。 全ての試料物質（生理食塩水またはコントロールのＳＡＭを除く）は、リン脂質 を５０■／ｋｇの割合で含み、動物当りリン脂質１０■／ａｄ！とじて０．２− ずつ投与される。濃度および投与量は、各々の実験において一定である。動物を つり帯の上に置き１人工呼吸装置に接続されているアダプターにＥＣＧ電極を取 り付け、気管切開管を接続する。仔を取り出してから補助的な通気を始めるまで の平均経過時間は１０分であり、最大経過時間は１５分である０通気は０．３５ 秒の吸気時間を用いて４８呼吸／分の頻度での酸素を用いて始める。最初の１分 間では通気設定はすべての動物に対して同じであり、それは、吸気時間０．３５ 秒、吸気圧のピーク４０ｃｍ　Ｈ２Ｏである。最初の１分間の後には吸気圧を６ ．５〜７．５　ｄ／ｋｇの周期的な容量を保持するように調整する。動物の重量 は約３０ｇであり、これは約０１２１ｄの絶対容量に達している。気流１周期的 容量および気道圧力は、３匹の同腹の仔の各々について、５分毎に記録した。 動物に対して３０分間通気を行った。 もし−匹でも空気漏れを生じたり、他の原因で死亡したりした場合には、−組の すべての動物からのデータは採用しない。 ３０分間の通気の後に気管チューブをストップコックで閉鎖し、１０分間肺から ガスを除く。次に、空気が満たされた各々のアンギオキャスを、水平に載置され た測定長５■のプラスチックチューブ（肺の端部に３ｄの空気を含み、そして他 端に染色した水を含む）に接続する。これら３つのプラスチックチューブの流体 −流体端を、染色水を有する単一の貯水槽（その表面はチューブと同じレベルで ある）に多岐管を介して接続する。この貯水槽においては、チューブおよび肺で の圧力の増加に対応して５０ｃｍの水を段階的に上昇させることができる。圧力 が増加または減少すると、肺にガスが入るか３または肺からガスが出て、流体カ ラムを？！換する。そのこと、によりガス容量の変化が測定できる。この装置は Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ。 Ｂ、込■（１９８０）　１５８　：　５７〜６８に記載されている装置に類似す る。圧力をＯから５．１０．１５．２０．２５．３０ＣＩＩ　Ｉ（ｔｏに段階的 に上昇させ、各々のレベルにおいて容量変化を記録する前に。 １分間停止させる。２０ｍｎ＋　）１．０で１分後、圧力は５ｃｉｉＨ，Ｏの減 少量で減少し、再び容量を記録する前に１分間各々の圧力を維持する。各々の容 量の測定は、圧力に応じて補正する。実験中は動物を湯浴中の丁度水面下に配置 することにより、３７°Ｃに保持する。 ＰＩＮＳＩ　コンプライアンス（Ｃ）そして所定の圧力における容量（Ｖｐ）の データを得た。Ｐ、１．は本来の肺容量を維持するのに必要な圧力であり、下方 の数字は、もちろん、効率を意味する。コンプライアンスは、いかに容易に肺が 膨張するかという指標であり、これもまた測定され、そして高い値が望ましい。 Ｖｐはある圧力（水の高さくｃｍ）で示される）での肺の容！　（ｃ′ｌ１１） である。結果は次のとおりである。 ３０分におけるＰＩＮＳについては、結果は表１に示される（ＰＬはリン脂質； ３２にタンパクはＣ）１０細胞で生産されるヒト３２Ｍ　ＡＳＰ、　１０には、 単離された未処理のヒトタンパクである５ｋｄ、８ｋｄそして１８ｋｄタンパク の混合物である）。 ＳＡＭ　１３　１８±４ 生理食塩水（対照）　９　３１±１ ＰＬ単独　４　３２±１ ’　ＰＬ＋３２Ｋ　３　２８±５ ＰＬ＋１０Ｋ　８　１７±２ ＰＬ＋１０Ｋ（２００：１）　８　２０±５＋３２Ｋ　（４：　１） ＰＬ＋１０Ｋ（２００：１）　５　２５±８ＰＬ＋１８ｋｄ　（５０：　１　） 　２１．２２．２０ＰＬ＋　５ｋｄ　（５０：　１　”）　１９表１に示される ように、３２にだけでは最も効果が少ない。 これに対し、１０に混合物または５ｋｄまたは８ｋｄタンパク単独の場合におい ては、ある程度効果的である。しかし、１０に混合物に対する３２にタンパクの 添加は効果を強める。 コンプライアンスについても１表２には同様の結果が示される。 ＳＡＭ　１３　０．４４１　±０．１１３生理食塩水（対照）　９　０．２４３ ±０．０２５ＰＬ単独　４　０．２１９±０．０２８ＰＬ＋３２Ｋ　３　０．２ ４７　±０．０２９ＰＬ＋１０Ｋ　８　０，４６７　±０．０７８ＰＬ＋１０Ｋ 　（２００：　１　）　８　０．４０１　±０．０４１＋３２Ｋ（４：１） ＰＬ＋１０Ｋ　（２００：　１　）　５　０．３２８　±０．１７６ＰＬ＋１８ ｋｄ　（５０：　１　）　０．４　±０．０４５ＰＬ＋　５ｋｄ　（５０：　１ 　）　０．４　±０．０４５ここにおいても、１０に混合物、または１８ｋｄお よび５ｋｄタンパクは良好な活性を示し、そして３２にはかなり低い効果しか示 さず、３２にタンパクの添加はＩＯＫ混合物の活性を非常に増強する。 表３および４はそれぞれＶ、。およびＶＳ　（水の高さ３０１および５ｃｍ）を 示す。 ＳＡＭ　１２　７２±９ 生理食塩水（対照）　４　２３±１１ ＰＬ単独　１２６ ＰＬ　＋　３２Ｋ　３　３８±１５ ＰＬ＋１０Ｋ　７　６５±９ ＰＬ＋１０Ｋ（２００：１）　７　５Ｂ±１１十３２Ｋ　（４：　１　） ＰＬ＋１０に　（２００：１）　２　５５±３３表−土 処理車１　ｈ 」Ｌ ＳＡＭ　１２　５６±９ 生理食塩水（対照）　４　１１±７ ＰＬ単独　２１４ ＰＬ　＋　３２Ｋ　３　２０±７ ＰＬ　＋　ＩＯＫ　７　４８±９ ＰＬ＋１０Ｋ　（２００：　１　）　７　４５±１０＋３２Ｋ　（４：　１） ＰＬ＋１０Ｋ　（２００：　１　）　２　４３±２７これらの結果もまた。上記 表に示すＰＩＮＳおよびコンプライアンスについて得られた結果と同様の傾向を 示す。 対応するウシタンパクで得られた結果も同様である。 Ｄ、１１．皿上５Ｌ叉二 ｐＴｒｐ２３３はｐＫＫ２３３−２から調製される。これはＡｍａｎｎ、　Ｅ、 ら。 江匹（１９８５）並：　１８３−１９０に詳細に記載されており、　ｐＫＸ２３ ３−２のｔａｃプロモーターを第１５図に示すヌクレオチド配列の合成ｔｒｐプ ロモーターで置き換えることにより調製される。最初のプラスミドのＮｄｅ１部 位は、　ＮｄｅｌでｐＫＫ２３３−２を切断しクレノーで平滑末端化し、そして 再連結させることにより除去される。Ｎｄｅ１部位を欠く性成物は１次に、　Ｅ ｃｏＲＩ　とＰｓｔｌで分解され、そして、第１５図の合成ｔｒｐプロモーター のＥｃｏＲＩ　／　Ｐｓ　ｔ　Ｉ分解物に連結され、所望のベクターであるｐＴ ｒｐ２３３が得られる。 ｐＢＧａｌ宿主ベクターを調製するために、　ｐＴｒｐ２３３をＥｃｏＲ１で分 解し、ゲルで精製し、クレノーで平滑末端化した。そのプラスミドを再連結し、 　Ｅ、　ｃｏｌｉ中で増殖させ、　ＥｃｏＲＮ部位を欠いた対応するプラスミド を得た。β−ガラクトシダーゼのアミノ末端をコードし、６つのスレオニン残基 がそれに続く合成オリゴヌクレオチド配列（下記）を、　ＮｄｅＴ　／　Ｈｉｎ ｄ　ＩＩＩで分解した中間体プラスミドに連結し、そして挿入断片（ｐＢＧａｌ 宿主ベクター）を有するプラスミドを、　ＥｃｏＲＩ切断に対する感受性により 同定した： ｐＴｒｐ−２０を構築するために、　５Ｐ−１８ｃＤＮＡ　Ｈの一部および合成 断片をＮｄｅｌ　／ＨｉｎｄＩ［で分解したｐＴｒｐ２３３に連結させた。 上記のｐＵｃ−９に連結された５Ｐ−１８断片をＰｓｔｆ　（ヌクレオチド６９ ４で切断）と旧ｎｔｉｍ（プラスミドポリリンカーでの３′末端後方を切断）と で分解することにより切り出した。次に示す２つのオリゴヌクレオチドを調製し た。そのオリゴヌクレオチドは、アニーリング時にヌクレオチド６９４の上流か らＮ−末端（残基２０１）への残基と、先行するメチオニン（ＡＴＧ）とをコー ドする： ＴＡＴＧＴＴＣＣＣＣＡＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＡＴＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧ ＣＡおよびＧＡＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＴＧＧＧＧＡＡＣＡ これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、上記切り出したｃＤＮＡに結合 させ、そして分解したベクターに挿入してｐＴｒｐ−２０を得た。 ｐＢＧａｌ−２０を構築するために、類似の方法を採用した。その方法では、　 ＥｃｏＲＩ　／旧ｎｄＩＩ［を用いて分解したｐＢＧａｌ宿主ベクター、　Ｐｓ ｔＴ　／　Ｈｉｎｄ　ｍで切り出した５Ｐ−１８ＤＮＡ、および下記の充填用ヌ クレオチドが用いられ、　ｐＢＧａｌ−２０が得られる：Ａ　ＡＴＴＧＡ　Ａ　 ＣＧ　ＧＴＴＴＣＣＣＣＡ　ＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＡ　ＴＴＧＣＴＧＧＣＴ ＣＴＧ　ＣＡおよびＧＡＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＴＧＧＧ ＧＡＡＡＣＣＧＴＴＧ短い型の５Ｐ−１８をコードする遺伝子の発現のためのベ クターを、　ｐＴｒｐ−２０またはｐＢＧａｌ−２０から構築した。ｐＴｒｐ− ９を構築するために、　ｐＴｒｐ−２０をＮｃｏｌ　（ヌクレオチド８４６）と 旧ｎｄＩ［Ｉとで切断し、アニーリングした下記のオリゴヌクレオチドでトーー ｐｄ　１８に−４ ）ＩＩｌｌＴＡｌａ　にｌｕ ＣＴＣＴＧＴα；ＣＣＣＡ　にＧＣＡＣＴ　ＣＣＴＧＣＣＴＧＣ；　ＡＣＣＡＣ ＣＴＣＡ　ＴＣＣＴｒに　ＧＣＣＴＧＴ　ＧＣＣＬｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒ ｏ　にｌｙτｈｒ　Ａｌａムｌａ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　 Ｌｅｕ＾ｌａ　Ｃｙｓ　Ａｌ■ ＴｒＧ　ＣＡに　ＴＧＣＡＧ：Ａ　にＣＣＣＴＡ　ＧＧＧ　ＣＡＴ　ＴＧＣＣｒ Ａ　ＣＡ（：　ＧＡＡ　ＧＴＣＴＧｃ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＧsＣ Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ＾ｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｌ ｅｕ　にＩｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　［Ｉｉｓ@Ｖａｌ ＣＡＣＡＴＣＣＴＴんに、ＡＡに　ＡＴＧ　ＧＣＣＡＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＣＡＴ Ｔ　ＴＴＣＣＡＧ　ＧＡＣＡＣＣＡＴＧ　ＡにＧＨｉｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓ ｎ　Ｌｙｓ　ＫＥＴ＾ｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ＾ｌａ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　 Ａｓｐ　Ｔｈｒ　ＭＥＴ　Ａ窒■ Ｃｒに　ＣＴＣＡＴＧ　ＣＣＣＣＡＧ　ＴＧＣＡＡＣＣＡＡ　ＧＴＧ　ＣＴＴ　 ＧＡＣにＡＣＴＡＣＴｒＣＣＣＣＣＴＧ　にＴＣＬｅｕ　Ｌｅｕ　ＭＥＴ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌ（Ｉ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ｋｓｐ　Ｔ ｙｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅ普@Ｖａｌ ＴＣＴ、ＡＴＧＣＡＣＣＴＧ　ＧＣ；ＣＣＴＧ　ＴＧＣＡＡＡ　ＴＣＣＣＧＧ　 ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＧＡにＣｙｓ　）［ＥＴ　 Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　にｌｙ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌ氏@にｌｕ 」 し ；　ＡＡＧ　ＴｒＣＣｒＧ　（：ＡＧ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＴＧＣＡＡＣＧＴＣＣ ＴＣＣＣＣＴｒＧ　ＡＡＧｔ、　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇ ｌｕ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ４（〕−二） ５（〕−口） ：　ＣＣＡ　ＧＧＧ　ＡＴＧ　ＴＣＡ　ＧＡＣＣＣＣＣＴＧ　ＣＣＣＡＡＡ　Ｃ ＣＴ　ＣＴＧ　ＣＧＧ　ＧＡＣ［Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＭＥＴ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐ ｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐイリゴ１７し オテド １　ＡＴＣＣＣＣ ５”−ＴＡＧ　ＧＧＧ ２　人ＴＣＣＣＣ ５’−ＴＡＧ　ＧＧＧ ３　ＡＴＣＣＣＣ ５’−ＴＡＧ　ＧＧＧ ４　ＡＴＣＣＣＣ ５’−ＴＡＧ　ＧＧＧ Ｓ　ＡＴＣＣＣＣ ５’−ＴＡＧ　ＧＧＧ ６　ＡＴＣＣＣＣ ５’−ＴＡＧ　ＧＧＧ ＭＡＢＥｎｄｏＦ ＦＩＧ、７Ａ　ＦＩＧ、７Ｂ ＡＢＣＤ ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、　８ 時間 ＦＩＧ、　１０ タンパクＣＰＪ） ０Ｌ１　べ一　Ｉ−Ｉ＠Ｉ　＜　曇　浅　ミ（Ｃｒｌ　（５ｃｌ：（５：ｌ　（ Ｊ ＜＜　（ＪＬ）　ｕｑ　ｕ し芸　ｇ　とＸ　い　８８　乏 ＜ト　ＱＯ−〜　ト喀　号　８　淀 国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトＳＰ−１８ＤＮＡとヒトＳＰ−５ＤＮＡとによりコードされるタンパク ，およびそのプロセッシングされた形のタンパクでなる群から選択され，通常そ れと共存するタンパクを含まない肺胞界面活性タンパク（ＡＳＰ）。
2. ２．第２図，第３図，第５図または第６図に示されるＤＮＡ，あるいはそれと実 質的に同等のＤＮＡによりコードされる請求の範囲第１項に記載のタンパク。
3. ３．請求の範囲第１項に記載のタンパクをコードする組換えＤＮＡ配列であって ， 該ＤＮＡは，請求の範囲第１項に記載のタンパクと通常共存するタンパクをコー ドするＤＮＡを含まない。
4. ４．前記配列を適当な組換え宿主細胞内で発現させる際に有効な制御配列に作動 可能なように連結した請求の範囲第３項に記載のＤＮＡ。
5. ５．請求の範囲第３項に記載のＤＮＡまたは請求の範囲第４項に記載の発現系で 形質転換された組換え宿主細胞。
6. ６．請求の範囲第５項に記載の細胞を培養することを包含するＡＳＰの生産方法 。
7. ７．請求の範囲第６項に記載の方法で生産される組換え兵ＡＳＰ。
8. ８．３２ＫＡＳＰタンパクを精製する方法であって，該方法は，該３２Ｋタンパ クを含む混合物を糖アフィニティークロマトグラフィーに供することを包含し， 該クロマトグラフィーは，糖結合担体を用い，（ａ）該３２Ｋタンパクが該糖結 合担体に吸着される条件下で，該混合物を該糖結合担体に接触させ；そして（ｂ ）該タンパクが結合しない条件下で，該３２Ｋタンパクを溶出させることによっ て行われる。
9. ９．前記糖の親和性がマンノース残基によって与えられ，前記３２Ｋタンパクの 担体への結合がカルシウムイオンの存在下で行われ，そして前記３２Ｋタンパク の溶出がカルシウムイオン濃度を低下させる条件下で行われる，請求の範囲第８ 項に記載の方法。
10. １０．請求の範囲第８項に記載の方法で精製されるＡＳＰタンパク。
11. １１．哺乳類の呼吸（ＲＤＳ）を治療する際に有効な薬学的組成物であって， 該組成物は，請求の範囲第１項，第７項，または第１０項に記載のタンパクを， リン脂質調製物と共に，そして必要に応じて薬学的に許容される賦形剤と共に含 有する。
12. １２．哺乳類のＲＤＳを治療する際に有効な薬学的組成物であって，該組成物は ，請求の範囲第１項，第７項，または第１０項に記載のタンパクを，リン脂質調 製物および必要に応じて薬学的に許容される賦形剤を混合した有効量の３２ＫＡ ＳＰタンパクと共に含有する。