JPH01321365A - 抗ＨＢｃ抗体イムノアッセイ法 - Google Patents

抗ＨＢｃ抗体イムノアッセイ法

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JPH01321365A
JPH01321365A JP1117182A JP11718289A JPH01321365A JP H01321365 A JPH01321365 A JP H01321365A JP 1117182 A JP1117182 A JP 1117182A JP 11718289 A JP11718289 A JP 11718289A JP H01321365 A JPH01321365 A JP H01321365A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗ＨＢｃ抗体の検出方法、さらに詳しくは、
生物学的試料中の抗ＨＢ、ｃ抗体を検出するためのイム
ノアッセイにおいて、還元剤を添加してアッセイに供す
ることを特徴とする方法に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）Ｂ型
肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）は、Ｂ型肝炎ウィルス粒子
（ＨＢ　Ｖ　）（Ｌばしばデイン粒子と称される）から
の粒子である。ＨＢｃＡｇは潜在的な免疫原であって、
一般にＨＢＶｇ染が除かれた後も何年も持続する強い免
疫応答を示し、慢性ＨＢ　Ｖ感染の患者の血清中にみら
れる。
Ｂ型肝炎コア抗原に対する抗体（抗ＨＢｃ抗体）の検出
は、ＨＢＶ感染の進行をモニターするのに用いられる。
抗ＨＢｃ抗体は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が出
現したすぐ後に血清中にみられ、急性Ｂ型肝炎において
はｌ−ｌＢｓＡｇが消失した後およびＩ−Ｉ　Ｂ　ｓ　
Ａ　ｇに対する検出可能な抗体（抗１−ＩＢｓ抗体）が
出現する前まで持続するであろう。それゆえ、抗ＨＢ　
ｃは、ＨＢｓＡｇおよび抗ＨＢｓ抗体が存在しないとき
に、最近のＢ型肝炎感染および潜在的な感染血液の唯一
の血清学的マーカーであり得る。
約１０年前に、輸血に関連したウィルス感染に関する大
々的な研究により、抗ＨＢｃ抗体陽性の供血者がしばし
ば受血者への他の感染因子の伝達に関係していることが
わかった［ピアス（Ｖｙａｓ）およびパーキンス（Ｐ　
ｅｒｋｉｎｓ）のＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ　。
Ｍｅｄ、、３０６：７４９〜７５０（１９８１）］。最
も注目に値する所見は、供血者からの血液を受面し後に
非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢ）感染症が現れた受血者のう
ち約４０％が、少なくとも１単位の抗ＨＢｅ陽性の血液
の輸血を受けていたということであった。このＮＡＮＢ
と抗ＨＢｃとのつながりの科学的関連性については明ら
かではないが、多くの科学者は、それが疫学的なつなが
りによるものであり、Ｂ型肝炎に暴露された供血者は、
ＮＡＮＢにも暴露されていた可能性が大であると考えて
いる。現在のところＮＡＮＢの特異的マーカーを同定す
ることに成功していないため、また受血者にＮＡＮＢの
頻度がかなりの数にのぼっているため、血液銀行は米国
での血液供給の安全性を高めるために代用の試験に頼っ
てきた。ＮＡＮＢの伝播を低下させるためのそのような
代用試験として、抗ＨＢｃの検出が選択されてきている
。
抗ＨＢｃの検出のためのイムノアッセイは、よく知られ
ている。そのようなアッセイの例としては、Ｃ０ＲＡＢ
ラジオイムノアヅセイおよびＣＯＲＹＺＹＭＥ酵素イム
ノアッセイが挙げられ、両者ともにアボット・ラボラト
リーズ（ノースジカゴ、イリノイ）から市販されている
ものである。
これらのアッセイは競合イムノアッセイであり、それは
ＨＢｃＡｇをコーティングした固相上の限られた数の結
合部位について１、生物学的試料中の抗Ｈｎｃが、検出
可能な標識で標識した一定量の抗１（Ｂ　ｃと競合する
ことによるものである。結合した標識抗ＨＢｃの割合は
、生物学的試料中の抗ＨＢｅの濃度に反比例する。
上記抗ＨＢｃアッセイは、！工程法または２工程法によ
り行うことができる。ｌ工程手順においては、試料と標
識抗ＨＢｃとを一緒に混合し、固相に付着したＨＢｃＡ
ｇについて競合させる。２工程手順においては、まず固
相上のＩ−Ｉ　Ｂ　ｃ　Ａ　ｇを試験試料と反応させ、
ついで第二の工程において標識抗ＨＢｃと反応させる。
いずれの方法においても、固相に結合した標識抗ＨＢｃ
の量を測定し、測定した標識抗体量の減少が、標識抗体
の結合を阻害することのできる抗体陽性試料を示してい
る。
偽陽性は、供血者の血液を抗ＨＢｃについてスクリーニ
ングする上で問題となる。というのは、抗ＨＢｃについ
てのみ陽性であり、他には何の肝炎マーカーら存在しな
いし何ら病歴も徴候もない試料が多量に存在するからで
ある。これらの試料が真性の陽性であることを確認する
簡単な方法はない。このことは、ＮＡＮＢの代用スクリ
ーニングとして抗ＨＢｃ試験を用いるときには特に問題
となる。というのも、該抗ＨＢｃマーカーと該ＮＡＮＢ
疾患との疫学的関連は強くないからである（抗ＨＢｃ陽
性血液の受血者の８５％は、知られた感染を発現するこ
とはない）。従って、ＮＡＮＢに関連する抗ＨＢｃ陽性
試料とそうでない試料、すなわち偽陽性とを区別するこ
とは重要である。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記イムノアッセイ法および抗ＨＢｃの
検出方法の改良法を発明するに至った。
本発明の方法は、幾つかの基準から偽陽性である抗Ｔ−
１Ｂｃ陽性反応の検出を回避させるものである。
本発明の特徴は、２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）
、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトー
ル（ＤＴＥ）、システィンを含むスルフヒドリル化合物
のような還元剤、重亜硫酸塩溶液のような他の還元剤、
特にメタ重亜硫酸塩溶液（ＭＢＳ）または重亜硫酸ナト
リウムをアッセイに用いることにある。
これら還元剤は、幾つかの方法によりイムノアッセイ中
に導入することができる。アッセイを開始するに先立ち
、試料を化学薬品で処理してもよい。
ｌ工程アッセイにおいては、試料、標識試薬、固相およ
び還元剤を同時に、または試料、標識試薬もしくは固相
の希釈液の１つに加える。しかしながら、標識試薬が酵
素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）のような
還元剤感受性の成分を含んでいる場合には、還元剤は酵
素と接触させるべきでなく、２工程アツセイの別の工程
に導入する。その上うな２工程アツセイにおいては、標
識試薬を第二の工程で加える前に試料と固相を一緒にイ
ンキュベートする。還元剤は第一の工程または第二の工
程のいずれで加えてもよいが、固相を加える前に試料に
加えるかまたは試料および固相と同時に加えるのが好ま
しく、第一のインキュベーションで加えるのが最も効果
的である。
驚くべきことに、抗ＨＢｃのアッセイに還元剤を用いる
と偽陽性の試料、とりわけカットオフ値の近くの偽陽性
試料が除かれ、しかもコントロール値または真性の陽性
試料に有為の影響を及ぼすこともない。このことにより
、抗ＨＢｃに対してのみ陽性である、すなイつち他に何
らＨＢＶマーカーも病歴もない試料の数が減少すること
になる。
このように抗ＨＢｃ試験の特異性が増加することにより
、ＮＡＮＢのための血液銀行代用試験の特異性がさらに
増加することになり、廃棄される血液単位の数が減少し
、供血者を追跡臨床評価して彼等の健康状態および供血
者として将来拒絶することを決定するという労を省くこ
とができる。
取り除かれた妨害性の反応性または因子については完全
にはわかっていないか、それはＩｇＧとは異なる物理的
特性を有する巨大分子である。妨害活性は、不均質な因
子、すなわち１より多い分子または複合体により起こさ
れるのかもしれない。
妨害因子の分子量は５００，０００よりも大きく、還元
剤の存在下では極めて不安定であり、ｐＨ４゜５未満で
も不安定である。この妨害因子は、疎水性ゲルとの相互
反応に基づいて疎水性であると考えられており、３０％
（ＮＨ４）ｔｓｏ、中に溶解し５０％で沈澱する。それ
は、ＣＭ（カルボキシメチル）セルロースまたはＤＥＡ
Ｅ（ジエチルアミノエヂル）セルロース上に部分的に保
持されている。
還元剤により取り除かれた妨害因子がＩｇＭであるとは
考えられない。というのは、低しベルＩｇＭ〜抗ＨＢｃ
陽性試料が有為数存在するということはありそうもない
ことであり、妨害因子を含有する多くの試料がＣｏｒｙ
ｚｙｍｅ　Ｍ（アボット・ラボラトリーズ、ノースジカ
ゴ、イリノイより入手可）のようなＩｇＭ捕捉アッセイ
において反応しなかったからである。さらに、妨害因子
はＭＢＳまたはシスティンにより特異に破壊され、他の
還元剤の存在下ではＩｇＭとは異なる程度に不安定であ
るという生化学的証拠がある。たとえば、本発明におけ
る還元剤の濃度および本発明に用いる条件下では［ｇＭ
は完全には破壊されないが、妨害因子はすっかり除かれ
る。また、妨害因子はセファクリルＳ−３００上でＩｇ
Ｍとともに溶出するが、非特異的活性はセファロース６
Ｂ上のクロマトグラフィーにより失われ、一方、低レベ
ルのＩｇＭ−特異的活性は予期されるフラクションで回
復される。妨害因子の不活化が還元剤が存在しなくとも
セファロース６Ｂ上で起こることは、注目に値する。従
って、還元剤のみならずゲル濾過によっても、妨害活性
の原因である複合体または集合体の破壊が起こされるも
のと思われる。
本発明を示すために２群の試料を用いた。第一群（［）
は、Ｂ型肝炎の他のマーカーを有しているかまたはＢ型
肝炎の病歴のある患者から採取したものであるため真性
の陽性とされ、かつその反応性がγグロブリンと関連し
ている抗ＨＢｃ陽性血清から選択した群である。第二群
（ＩＩ）は、Ｂ型肝炎の他のマーカーもＢ型肝炎の病歴
もない供血者から採取し、かつその反応性がγグロブリ
ンと明確に関連付けることができなかった血清試料の群
である。第二群のほとんどの試料は、ｌ工程流ＨＢｃア
ッセイで試験したときには弱い陽性を示したが、２工程
手順で試験したときには一般に一層強い抗ｒ−Ｉ　Ｂ　
ｃ様の反応性を示した。１群の陽性試料は、両方の試験
手順において一般に強い反応性を示した。この群から無
作為に選択した血清を、本研究において■群の陽性試料
の活性レベルに合わ仕るように希釈した。■および■群
の両群とも、還元剤を用いあるいは用いることなく、以
下に詳細に記載する条件により試験した。
つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例１ １群および■群の試料（０，１Ｊ１１２）を陰性コント
ロールおよび陽性コントロールとともに２つずつの反応
ウェル中に入れ、水中の０．３％２−メルカプトエタノ
ール（２−ＭＥ）（Ｉ　ＯμＱ）を２つずつの反応ウェ
ルのそれぞれ一方に加え、他の一方には水（１０μＱ）
を加えた。１′■−標識抗ＨＢｃ（０，１ｍρ）をすべ
てのウェルに加え、ついでＨＢｃＡｇコーティング１／
４インチポリスチレンビーズをすべてのウェルに加えた
。トレイを穏やかに振盪し、室温で一層インキユベート
した。すべてのビーズを蒸留水で３回洗浄し、試験管に
移し、ガンマシンチレーションカウンター中で１分間カ
ウントした。還元剤を用いた場合および用いなかった場
合の両方の試料について、陰性コントロールからの抑制
の度合（％）として下記式に従ってそれぞれの陽性また
は陰性を計算した。
（ｃｐＩＩｌ：放射能数７分） この計算で５０％に等しいかまたは５０％より大きい値
の試料は、試験において陽性と判断した。
試料に還元剤を加えることによる効果を、幾つかの基準
により評価した。
（ａ）還元剤を用いた場合および用いなかった場合の陰
性コントロール値および陽性コントロール値を比較する
。
（ｂ）　１群および■群における各試料の％抑制値を、
還元剤を用いた場合と用いなかった場合で比較する。
（ｃ）還元剤を用いた場合および用いなかった場合の各
群についての％抑制値の頻度をプロットし、各群内での
試料値の分布を還元剤を用いた場合および用いなかった
場合について比較する。
第１図〜第３図の結果は、真性の陽性（１群）について
は、試験の感度および検出能が還元剤の添加によって影
響を受けないことを示している。第１表は、陰性コント
ロールおよび陽性コントロールの絶対値もまた他の還元
剤（ＭＢＳ）により有為の影響を受けないことを示して
いる。これに対して、第４図および第５図に示すように
、■群のたいていの試料は明らかに影響を受け、各試料
は標識抗体を抑制する能力を殆ど失って陰性試料のごと
く挙動している。
寒１表（ｃＯＲＡＢにより試験した場合の１群（真性の
抗１（Ｂｅ）からのＩＯの低い陽性の抑実施例２ １群および■群の試料（０，１ｍ＆）それぞれ２つずつ
を反応ウェル中に実施例１と同様にして入れたが、それ
ぞれに食塩水溶液（０，１婦）も加え、ついで水中の０
．５％ＮａＨＳＯｓ（１０ｕＱ）を２つずつの反応ウェ
ルのそれぞれ一方に加え、他方には水（１０μｉ２）を
加えた（０．５％ＮａＨＳ　Ｏ３の代わりに水中の０，
２％ＮａｚＳｔＯｓを用いてもよい）。
ＨＢ　ｃへｇコーティングビーズを各ウェルに加え、ト
レイを穏やかに振盪し、室温で一層インキユベートした
。ビーズを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（
ＨＲＰ）を結合した抗ＨＢｃ　ＩｇＧ（０、２ｍＱ）と
ともに４０℃で１時間インキュベートした。蒸留水を用
いてビーズを再び３回洗浄し、清浄な反応管に移した。
０．０２％過酸化水素を含有するクエン酸−リン酸バッ
ファー中の。−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）溶液を各
ビーズに３０分かけて加え、Ｈ，ＳＯ，で反応を停止さ
せ、Ａ４９２における吸光度を読み取ることにより、ビ
ーズに結合した抗体−ＨＲＰを検出した。色強度の有為
な減少が、真性または偽性の抗体陽性試料からの反応性
を示すものであり、陽性は下記式に従って計算した。
０．４ＸＮＣＶ＋０．６ＸＰＣＶ−カットオフ値（Ｎ　
ＯＶ　：陰性コントロール平均値、ＰＣＶ：陽性コント
ロール平均値） 吸光度がカットオフ値と等価かまたはそれより小さい試
料は陽性と、吸光度がカットオフ値よりも大きい試料は
陰性とした。さらに、還元剤を用いた場合および用いな
かった場合の両方について、各試料における陰性コント
ロールからの抑制の度合（％）を実施例１の式に従って
計算しくただし、Ｃｐｍの代わりにＡ４９２値を用いた
）、試料に還元剤を加えることによる効果を実施例１記
載の基準に従って評価した。
第６図〜第１０図に示した結果は、実施例１と同様の所
見を示している。すなわち、還元剤は試験の感度には殆
どもしくは全く影響せず（第６図）、Ｉｎ陽性に対して
ではなく■群陽性に対して選択的に影響を及ぼす（第７
図〜第１０図）。各試料における中和の計算値は、ｌ工
程ラジオイムノアッセイより６２工程酵素イムノアツセ
イの方が大きいことがわかった。そのわけは、２工程ア
ツセイのは、！工程手順よりも感度がよい幾つかの希釈
であるからである。
実施例３ 抗ＨＢｃの微細粒子化学発光イムノアッセイを以下のよ
うにして行った。
（Ａ）ＨＢｃＡｇコーティング微細粒子の調製：組換え
ＤＮＡ　Ｂ型肝炎コア抗原（ｒｌ（ＢｃＡｇ）を、２工
程手順によりカルボキシル化ポリスチレンラテックス微
細粒子［セラジエン・ダイアグノスティックス（Ｓ　ｅ
ｒａｇｅｎ　Ｄ　ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、インデイア
ナポリス、インデイアナ、０．１８８μｍ］に結合した
。まず、０．０１５Ｍ　ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ
］エタンスルホン酸）バッファー（ｐＨ４，８）中の１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド（ＥＤＡＣ，４３μ９／次９）を用い、正常ヒ
ト血清（１，０μ１２／ｍ９）の存在下で精製ポリクロ
ーナルヒト抗ＨＢｃ（２，７μ９／Ｒｇラテックス粒子
）を室温で２時間かけて結合した［パンゲス（Ｂ　ａｎ
ｇｓ）の「ユニフォーム・ラテックス・パーティクルズ
（Ｕｎｉｆｏｒｍ　Ｌａｔｅｘ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）
Ｊ、セラツエン・ダイアグノスティックス、１９８４］
。
ついで、抗体をアンダーコーティングした粒子を、０．
９％ＮａＣ１，０，０３％ＥＤＴＡおよび０．０５％ツ
イーン２０を含有する０、１Ｍトリスバッファー（ｐＨ
７，２）中で遠心分離（４０，０００Ｘ９、２０分間）
により３回洗浄し、０．９％ＮａＣ１，０゜０３％ＥＤ
ＴＡおよび０．０３％ウシ血清アルブミンを含有する０
、ＩＭ）リスバッフｙ−（ｐＨ７゜２）中に再懸濁した
。ついで、室温で一夜ゆっくり回転させることにより、
ｒＨＢｃＡｇ（０，２ｇ９／ＩＩｇ）をアンダーコーテ
ィング粒子上に免疫学的に吸着させた。粒子を同様にし
て洗浄し、２５ゲージの針を通して分散さ仕、０．１５
Ｍ　ＮａＣ１，０゜１％ウシ血清アルブミン、０．０１
％ツイーン２０および０．１％アジ化ナトリウムを含有
する０゜０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，２）［微細
粒子希釈剤（Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｄ　１ｌｕ
ｅｎｔ）］中に貯蔵した。
固形分の％を５００ｎｍにおける光分散により決定した
。コーティング粒子は濃縮貯蔵しく一般に５〜１０％固
形分）、各アッセイの前に作業濃度（０６０３６％）ま
で貯蔵バッファー中で希釈した。別のやり方としては、
ＥＤＡＣ法によりｒＨＢｃＡｇを微細粒子に直接結合さ
せることもできる。抗ＨＢｃアンダーコーティング法が
好ましい。
（Ｂ）アクリジニウム標識抗ＨＢｃの調製：活性エステ
ル上のＥＤＡＣカップリング法を用い、アクリジニウム
標識精製抗ＨＢｃ（ヒト）を調製した。簡単に説明する
と、β−アラニンアクリジニウム（１１９）を無水ＤＭ
Ｆ（１００μＱ）中に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド（ＮＨＳ）（５，７５ｍｇ／屑Ｑ１５０μｍ２）
およびＥＤＡＣ（１９，２×ｇ／肩Ｑ１５０μＣＸＮＨ
Ｓ：ＥＤＡＣ＝Ｉ：２、モル比）を連続して添加するこ
とによって活性化した。
暗所、室温にて３０分間反応させた。プロティンＡ精製
ヒト抗ＨＢｃを、ＰＢＳ、０．５％ＣＨＡＰＳ（ｐＨ６
，３）に対して２〜８℃で一夜透析した（３×）。活性
化アクリジニウムを透析抗体（３０：１モル過剰）に加
え、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。同じバッフ
ァーに対する透析の後、調製物を遠心分離にかけ、上清
を同じバッファーで平衡化したベックマンＴＳＫ２５０
ＨＰＬＣカラム上のクロマトグラフィーにかけた。個々
のフラクション（１１１２）を３６９ｎｍおよび２８０
ｎＩ１１でのＵＶ分光分析により分析し、アクリジニウ
ムの取り込み（一般に３＝１）を決定した。結合体を濃
縮フラクション（約１００μｇ／ｊＩＱ）中、２〜８℃
で貯Ｈし、各７ツセイ（７）前にＥＤＴＡ（１４，８９
／１２）、０．１％アジ化ナトリウム、０．４％ツイー
ン２０．５０％（Ｖ：Ｖ）正常ウシ血清および２％（Ｖ
：Ｖ）正常ヒト血清を含有する０、０１Ｍリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ６，３）［結合体希釈剤（ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ　Ｄｉｌｕｅｎｌ）］中に希釈した。
（ｃ）安定な水性システィン試薬の調製：水中において
、システィンはシスチンに酸化し、シスチンは比較的不
溶性であるので白色の沈澱を生成する。この酸化は、金
属イオン（特に銅、鉄）の存在によって、または中性も
しくはわずかにアルカリ性のｐｉ−１によって促進され
る。比較的安定なシスティンの溶液を調製する手順は以
下に述べる通りである。
バーンステッドウォーター■デイオナイザ−（Ｂａｒｎ
ｓｔｅａｄ　Ｗａｔｅｒ　−Ｉ　　Ｄｅｉｏｎｉｚｅｒ
）を用い、蒸留水を最終抵抗１８メガオームまで脱イオ
ン化した。
システィン［シグマ・ケミカル、遊離塩基］、ＥＤＴＡ
およびＤＴＴを、それぞれ最終濃度２００．１０および
１×Ｍまで添加した。溶液のｐＨは４゜５と５．０の間
であり、調節しなかった。この溶液のアリコートを、室
温および２〜８℃で閉ガラスびん中に貯蔵した。
安定性の評定は、キレート化剤（ＥＤＴＡ）および還元
剤（ＤＴＴ）がなければ水溶液中で生成するであろうシ
スチンの沈澱がないことで行った。２週間後、いずれの
温度の場合も沈澱は見られなかった（第２表）。安定性
の評定はまた、第２表に示すように、上記■群試料と同
様の抗ＨＢｃ活性を有する２つの血漿試料（Ｓ９および
ｊ１４）から、この試薬が規定時間を超過して非特異的
な抗ＨＢｃ活性を除く有効性によっても行った。２週間
の安定性は、下記微細粒子アッセイに試薬を実際に利用
するには充分であった。
（以下余白） 第２表（室温（ｒｔ）および２〜８℃におけるシス（Ｄ
）微細粒子アッセイ 感度パネル試料（１，２３ポ一ルエーリツヒ単位（Ｐａ
ｕｌ　Ｅｒｈｌｉｃｈ　Ｕｎｉｔｓ）／ＩＣ，パネル７
）、抗ＨＢｃ反応性が上記■群試料と同様の２つの試料
（Ｓ９および５１４）、陰性コントロールおよび陽性コ
ントロールを含む試料（１００μ１２）２つずつをマイ
クロタイタープレートに加えた。ついで、システィン（
２００ｍＭ）、エチレンノアミン四酢酸（ＥＤＴＡＳ　
ＩＯｍＭ）およびジチオスレイトール（ＤＴＴ、１ｍＭ
）を含有する上記システィン溶液（５０μＱ）を２つず
つ加え、水もまたコントロールとして２つずつ加えた。
ＨＢｃＡｇコーティング微細粒子（固形分０．０３６％
、５０μＣ）をすべてのウェルに加えた。この反応混合
物を４０℃の水浴中で２０分間インキュベートした。
各反応混合物（１６６μＱ）を、０．１％ツイーン２０
（５０μｇ）で前置て濡らしておいた微細粒子捕捉／フ
ロースルー（ｆ　ｌｏｗ　−ｔｈｒｏｕｇｈ）ガラス繊
維濾過漏斗（アボット・ラボラトリーズ、ノースジカゴ
、イリノイ）へ移した。ついで、各捕捉膜を０゜１％ツ
イーン２０（５０μ（１）で２回洗浄した。
各捕捉膜の表面にアクリジニウム標識抗ＨＢｃ（３７５
ｎ９／村、２０μｇ）を加え、室温で２０分間インキュ
ベートした。ついで、捕捉膜を０９１％ツイーン２０（
ｌ　ＯＯμ１２）テ２回、同（５０ｕ（１）テ１回洗浄
した。
この膜を化学発光読み取り器に移し、ここで０゜２５Ｎ
ＮａＯＨ中の０．３％Ｈ、Ｏ、を含む始動溶液（ｔｒｉ
ｇｇｅｒ　５ｏｌｕｔｉｏｎＸ約１００μ１２）を６膜
に送り込んだ。微細粒子に結合したアクリジニウム標識
試薬により生じた光の量を決定した。この量は、試料中
に存在する抗ＨＢｃの量に反比例する。その結果を第３
表に示す。パネル７の％抑制（％■）により決定される
ように、アッセイの感度はシスティン試薬の存在下でわ
ずかに向上した。システィンの存在下では陰性コントロ
ールで１０〜２０％のシグナルの減少がみられた。■群
タイプの試料、Ｓ９およびＳ１４、にみられる活性形の
タイプ（妨害因子）は、システィンの存在下でアッセイ
を行ったときに除かれた。
実施例４ ＥＤＴＡおよびＤＴＴを含有するシスティン溶液の代わ
りに新た１こ調製した０、７５Ｍシスティン（シグマ、
遊離塩基）（！０μＱ）を用いたほかは、実施例３と同
様にして、血漿試料（５２，７１゜１６６．１Ｂ９およ
び２７７と命名）、パネル７、および陰性コントロール
および陽性コントロールを試験した。試料のアッセイは
、システィンを用いた場合および用いなかった場合の両
方で行った。
第４表かられかるように、試料２７７は真に陰性の試料
である。試料７１および１６６は、抗ＨＢｃ活性か■群
の試料と同様のボーダーラインにある陽性試料であるが
、還元剤（システィン）での処理により影響を受けず、
これらが確かにボーダーラインにある、または食い違う
試料であることを示している。試料５２および１８９も
また■群試料と同様のボーダーラインにある試料である
が、これらの試料の場合は、還元剤の存在下で陰性であ
ることが確かめられた。各試料はまた、１．２３ＰＥＩ
Ｕ、／＋１２と等価な感度パネル試料（パネル５０２６
．３μｍ２）を用いた場合および用いなかった場合で試
験し、システィンの存在下および不在下で、これらの試
料に真に陽性の抗ＨＢ　ｃ試料を加えることによる効果
を決定した。その結果を第４表に示しである。システィ
ンの不在下および存在下で、パネル７はそれぞれ７１．
８％および８０．７％の抑制を示した。パネル７と等価
な量のパネル５を加えた陰性コントロールは、システィ
ンの不在下および存在下でそれぞれ７３．７％および８
０．８％の抑制を示した。未添加の血漿試料では、平均
の％抑制は、システィンの添加により３１．８％から２
１．０％に下がった。パネル７の等偏量を加えた血漿試
料の平均％抑制は、システィンの不在下および存在下で
それぞれ６７．１％および７１．５％であった。
（以下余白） ／酎（パネル７）と等価）を添加 実施例５ 抗ＨＢｃに対し陽性であることが知られている感度パネ
ル試料（パネル５．６．７．８および９と命名）を、実
施例３の微細粒子アッセイ手順により試験した。その結
果を第５表に示す。システィン試薬を用いてもアッセイ
の感度に影響はなかった。
実施例６ 市販の抗ＨＢｃキット（ｃｏ　ｒ　ａｂｓアボット・ラ
ボラトリーズ、ノースジカゴ、イリノイ）を用い、還元
剤（０、５Ｍメタ重亜硫酸ナトリウム）（１０μＱ）を
加えた場合および加えなかった場合について、血漿試料
（２５，３１１７６，９皇、１７７および１８９と命名
）を試験した。また、実施例４と同様に、陽性抗ＨＢ　
ｃ試料（パネル５Ｘ２６．３μＱ）を加えた場合および
加えなかった場合について試料を試験した。その結果を
第６表に示す。第６表かられかるように、試料２５は真
に陰性の試料である。試料３１および９１は、還元剤の
添加により陰性と確認された食い違う試料である。試料
皇７７はＭＢＳでの処理に感応せず、この試料の陰性の
程度が高いことを示していた。第６表かられかるように
、すべての陽性試料（パネル７、およびパネル５を添加
した試料を含む）はＭＢＳの添加により影響を受けなか
った。
＊：パネル５（２６，３μσ、１．２３ＰＥＩ　　Ｕ／
酎（パネル７）と等価）を添加 実施例７ ■群試料と同様の抗ＨＢｃ反応性を有する５６の血漿試
料について、実施例６に記載の方法により試験した。こ
れらの試料は、市販の抗ＨＢｃアッセイ（ｃｏｒｙｚｙ
ｍｅおよびＣｏｒａｂ）により試験した場合、および還
元剤を用いないで上記実施例３に記載した微細粒子アッ
セイにより試験した場合では、食い違った結果が得られ
た。その結果を第１１図に示す。第１１（ａ）図は置換
剤（ＭＢＳ）を用いない場合、第１１（ｂ）図は該置換
剤を用いた場合を示す。
実施例８ 上記実施例７に記載の血漿試料を、実施例３記載の微細
粒子アッセイにより試験した。その結果を第１２図に示
す。第１２（ａ）図は置換剤（システィン）を用いない
場合、第１２（ｂ）図は該置換剤を用いた場合を示す。
それぞれメタ重亜硫酸塩およびシスティン不在下での実
施例７および実施例８の結果の間の相関関係は、第１３
図に示しである。
それぞれメタ重亜硫酸塩およびシスティン存在下での実
施例７および実施例８の結果の間の相関関係は、第１４
図に示しである。
実施例９ 抗ＨＢｃ陽性試料（試料２０９）の吸光度および抗１−
ｒ　Ｉ３　ｃ活性を第１５図に示しである。この試料は
、重亜硫酸塩の存在下および不在下でＣｏｒａｂアッセ
イにより試験したときに、それぞれ８６．３％および６
５．６％の抑制を示した。簡単に説明すると、再加（ｒ
ｅｃａｌｃｉｒｉｅｄ）試料２０９　（２Ｊ１１２）を
、ＰＢＳで平衡化したセファクリルＳ−３００カラム（
２，５Ｘ５０ｃｍ）に加えた。２．５好フラクシヨンを
流速２０Ｒ（１／時間で集めた。インキュベーション時
間を長くし抗ＨＢｃ結合体の量を減少させることによっ
て感度を約５倍に上げた他は、実施例３の微細粒子アッ
セイと同様にしてフラクションをアッセイした。第１５
図に示すように、還元剤の不在下では２つの活性ピーク
が検出された。第一の抑制ピークは、システィンの存在
下では検出されなかった。第二の主要な抑制ピークはＩ
ｇＧタンパク質ピークとともに溶出されたものであるが
、システィン処理により影響を受けなかった。
免疫グロブリンＧ関連抗ＨＢｃ活性は、非急性Ｂ型肝炎
感染に特異的なものである。
実施例ＩＯ ボーダーラインにある陽性試料（試料９８３ｍ１２）を
実施例９の手順に従って試験した。この試料は、メタ重
亜硫酸塩の存在下および不在下でＣｏｔａｂアッセイに
より試験したときに、それぞれ５６．８％および５．２
％の抑制を示した。試料９の吸光度および抗ＨＢ　ｃ活
性溶出プロフィルを第１６図に示しである。還元剤の不
在下では、カラムのボイド容積付近に単独の抑制ピーク
がみられた。このピークは、システィンの存在下でアッ
セイしたときに検出されず、明らかに解離型ＩｇＧタン
パク質のピークであった。この非１ｇＧ反応性は、Ｂ型
肝炎の結果とは考えられず、従って非特異的なものであ
る。
本発明の改良された抗ＨＢｃアッセイは、多くの利点を
何している。そのような利点としては、ボーダーライン
にある反応性抗ＨＢｃ陽性試料の数を減少させることが
できること、さらに、抗Ｉ］Ｂｃに対してのみ陽性であ
り他の肝炎マーカーや病歴が存在しない試料の数を減少
させることができることが挙げられる。供血者のスクリ
ーニングにおいて、ボーダーラインにある陽性試料すな
わち偽陽性試料の数を減少させることにより、国民の血
液供給が増進され、供血者が不必要に除外されることも
ないであろう。
以上、特定の実施例を挙げて本発明を説明したが、当業
者が本発明の範囲内において種々の変更を認識するであ
ろうことが理解されねばならない。
たとえば、本発明の改良アッセイ法は、当業者にはよく
知られた種々の標識試薬および装置を用い、１または２
以上の工程で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、系列希釈した真に陽性の抗ＨＢ　ｃ試料を、
還元剤を用いて、および用いずに抗ＨＢｃについて試験
した結果を示すグラフ、 第２図および第３図は、１群の抗ＨＢｃ陽性試料を、そ
れぞれ、還元剤を用いない場合、および用いた場合の抗
ＨＢｃについて試験した結果を示す棒グラフ、 第４図および第５図は、■群の偽陽性試料を、それぞれ
、還元剤を用いない場合、および用いた場合の抗ＨＢｃ
について試験した結果を示す棒グラフ、 第６図は、真に陽性の抗ＨＢｃ試料を、還元剤を用い、
および用いずに系列希釈試験した結果を示すグラフ、 第７図および第８図は、■群の偽陽性試料を、それぞれ
、還元剤の不存在下および存在下で抗トＩＢｃについて
試験した結果を示す棒グラフ、第９図および第１０図は
、１群の陽性試料を、それぞれ、還元剤の不存在下およ
び存在下で抗ＨＢｃについて試験した結果を示すヒスト
グラム、第１１図は、ボーダーラインにある（■群）抗
ＨＢｃ試料を、ＭＢＳを用い（第１１（ｂ）図）および
用いずに（第１１（ａ）図）抗ＨＢｃについて試験した
結果を示すグラフ、 第１２図は、ボーダーラインにある（■群）抗■４Ｂｃ
試料を、システィンを用い（第１２（ｂ）図）および用
いずに（第１２　（ａ）図）抗ＨＢｃにっ・いて試験し
た結果を示すグラフ、 第１３図は、Ｃｏｔａｂアッセイおよび微細粒子アッセ
イの両アッセイについて、還元剤を用いなかった場合の
相関関係を示すグラフ、 第１４図は、Ｃｏｒａｂアッセイおよび微細粒子アッセ
イの両アッセイについて、還元剤を用いた場合の相関関
係を示すグラフ、 第１５図は、真に陽性の抗ＨＢｃ試料の吸光度および抗
Ｈ［３ｃ活性溶出プロフイルを示すグラフ、第１６図は
、ボーダーラインにある（■群）試料の吸光度および抗
ＨＢＣ活性溶出プロフィルを示すグラフである。 特許出願人　アボット・ラボラトリーズ化　理　人　弁
理士　青　山　　葆ほか１名％１ 図 募４図 抑制％ １濃　働り　５も 第７図 ヂャ　奉り　　−一 ）ｊ４８１！］ 抑１トリ　％ 第９図 −ｔｏ　　　ｏ　　　　ｔｏ　　　ｔｏ　　　ｓｏ　　
　４（ｌ　　　ｇｏ　　　＃ｌｌ　　　ｙａ　　　ａｎ
　　　ａｎ　　　ｔｏ。 第１０図 第１１（α）国 ｌｒ＞　　　俤り　　％ 第１１（ｂ）図 ｊ（ｐ　七トリ９６ 第１２（α）凹 第＋２（ｂ）図

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）生物学的試料中の抗ＨＢｃ抗体を検出するための
    イムノアッセイにおいて、還元剤を添加してアッセイに
    供することを特徴とする方法。
  2. （２）（ａ）固相をＨＢｃ抗原でコーティングし、（ｂ
    ）該固相を試料と反応させ、 （ｃ）該固相を標識抗ＨＢｃと反応させ、ついで（ｄ）
    該固相に結合した標識抗ＨＢｃの量を検出することから
    なる、生物学的試料中の抗ＨＢｃ抗体の検出のためのイ
    ムノアッセイにおいて、イムノアッセイの開始前または
    上記工程（ｂ）において試料に還元剤を加えることを特
    徴とする方法。
  3. （３）還元剤が、２−メルカプトエタノール、ジチオス
    レイトール、ジチオエリトリトール、システイン、重亜
    硫酸塩溶液およびその他のスルフヒドリル化合物よりな
    る群から選ばれたものである請求項（２）記載の方法。
  4. （４）生物学的試料中の抗ＨＢｃ抗体を検出するための
    イムノアッセイ法であって、 （ａ）ラテックス微細粒子をＨＢｃ抗原でコーティング
    し、 （ｂ）マイクロタイタープレートに生物学的試料を加え
    、 （ｃ）該試料に還元剤を加え、 （ｄ）該試料に該コーティング微細粒子を加えてインキ
    ュベートし、 （ｅ）上記工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の
    反応混合物を微細粒子捕捉／フロースルーフィルターに
    移して洗浄し、 （ｆ）該捕捉フィルターに標識抗ＨＢｃ抗体を加えてイ
    ンキュベートし、ついで （ｇ）標識を検出して試料中の抗ＨＢｃ抗体の量を決定
    する ことを特徴とする方法。
  5. （５）還元剤が、２−メルカプトエタノール、ジチオス
    レイトール、ジチオエリトリトール、システイン、重亜
    硫酸塩溶液およびその他のスルフヒドリル化合物よりな
    る群から選ばれたものである請求項（４）記載の方法。
  6. （６）還元剤がシステインである請求項（４）記載の方
    法。
  7. （７）標識がアクリジニウムである請求項（４）記載の
    方法。
  8. （８）実質的に偽陽性を示さない生物学的試料中の抗Ｈ
    Ｂｃ抗体の検出のためのアッセイ法であって、２−メル
    カプトエタノール、ジチオスレイトール、ジチオエリト
    リトール、システイン、重亜硫酸塩溶液およびその他の
    スルフヒドリル化合物よりなる群から選ばれた還元剤を
    、アッセイの前またはアッセイ中に該生物学的試料中に
    加えることを特徴とする方法。
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