JPH01265897A - 酵素測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、牛乳中の酵素測定方法に関する。

〔従来の技術とその課題〕

乳牛における乳房炎の蔓延状況は極めて高く、乳牛の２
５〜５０％が臨床型あるいは潜在性乳房炎に侵されてい
るといわれている。乳房炎は乳牛の他の疾病に比べて特
に経済的な損失が大きい。

この損失の約７０％は乳量の低下によるとされている。

また乳腺細胞の破壊や透過性の亢進によって牛乳中に血
液成分（白血球やＣ１，Ｎａ等の電解質）の漏出がおこ
り、細菌数の増加と相俟って乳質を著しく低下させるこ
とになる。

乳房炎による損害は、生産性の低下や治療費、衛生費の
増加をはじめ、牛乳廃棄など１頭１年間で約５２，００
０円と試算され、我が国全体では２６０〜５２０億円の
損失と見込まれている。

乳房炎は乳腺の炎症性の変化で、大部分は微生物の感染
によって起こる。その変化は、牛乳の物理学的、化学的
、微生物学的変化となって現われる。また、乳中体細胞
数（とくに白血球）の増加に特徴がみられ、ざらには乳
腺組織の病理学的変化もみられるようになる。乳牛を乳
房炎から護り損失を最低限に押えるためには、徹底した
予防措置と早期診断による早急な対策が重要な課題にな
っている。

乳房炎の診断は、これら牛乳の変化をいかに早く的確に
、しかも量的に把握できるかにかかっており、今日まで
その方向に向って種々の診断法が開発されてきた。

現在乳房炎の診断は、実験室内診断法としては、体細胞
数検査法、細菌学的検査法が一般に用いられ一部にＮＡ
Ｇａｓｅ診断法が行われている。また、野外診断法とし
てはストリップカップ法やＣＭＴ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ　Ｍａｓｔｉｔｉｓ　ｔｅｓｔ　）変法が広く用いら
れている。

体細胞数検査や細菌学的検査及び従来のＮＡＧａｓｅ検
査は、繁雑な操作と高度の技術性が要求され、かつ、試
薬も高価なものがあり、熟練した技術者が行えば信頼性
は高いが日常の臨床検査法としての普遍性はほとんど期
待できない。

最近、体細胞数検査の電気的計測機が開発され優れた診
断法として評価されている。しかし、器機が高額なため
、普及性が少なく臨床的に応用されるに至っていない。

野外においては技術的に簡便なストリップカップ法やＣ
ＭＴ変法が専ら診断的に用いられている。

ストリップカップ法は黒布または１００メシユの金網上
に乳汁をしぼり取り、凝固物の有無や色調、臭気、粘稠
度等牛乳の状態を肉眼的に検査する方法である。ＣＭＣ
変法は、陰イオン系界面活性剤と指示薬の混合試薬を牛
乳にま、ぜて牛乳の非免疫学的な凝集状況と色調の変化
によって体細胞数とｐｉを推定し乳房炎を診断する方法
である。また最近ポータプルの電気伝導度計により牛乳
中に滲出した血漿成分の電解質ＮａやＣａの存在を測定
し診断する方法も開発されている。これらの診断法は、
簡便で野外で簡単に実施できるが正確性に欠け、乳房炎
との相関が必ずしも一致しない場合がある。

本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、多種
の検体から酵素を短時間にかつ正確に、しかも安価に測
定できる酵素測定方法を提供するものである。

〔課題を解決するための手段および作用〕本発明は、４
−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニド（以下４ＭＵ−ＮＡＧと記す）からなる基
質溶液をＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（
ＮＡＧａｓｅと記す）で加水分解して得た、４−メチル
ウンベリフェリル（以下４ＭＵと記す）の蛍光強度を標
準溶液の蛍光強度を基準にしてアルカリ溶液中で定量す
ることを特徴とする酵素測定方法である。

ここで、標準溶液は、例えば乳房炎罹患乳の脱脂したも
のに、正常牛から採取した酵素不活化脱脂乳を加え、Ｎ
ＡＧａｓｅの量を一定にして得たものを使用する。

また、基質溶液は、基質４　ＭＵ−ＮＡＧ　４．３■、
クエン酸（Ｃ６）１１１０？）　１１６．８５■及びク
エン酸ナトリウムＣｃｂＨｓＮ３ｃｔ・２１１□Ｏ）　
２０４．０３ｍｇを混合したものを容器に保存し、用時
に精製水５　ｍｌを加えて溶解する。この基質溶液は溶
解したときｐＨ４，３〜４．９になるよう調整する。

また、本発明にて用いる標準液は例えば次のようにして
調製する。

イ）乳房炎に罹患した乳牛の生乳を５°Ｃにおいて毎分
４０００回転で１０分間遠心分離し脱脂する。別に正常
な牛の新鮮生乳を６５°Ｃに加温して１．５時間以上の
温度感作を行い、ＮＡＧａｓｅを不活化する。次いで、
これを５°Ｃで毎分４０００回転１０分間遠心分離し脱
脂する。この脱脂乳２液を適宜混合しＮＡＧａｓｅの含
量を４ＭＵが５×１０−ｌ２Ｍ／分／μｌ生成するよう
に調製し凍結乾燥する。

口）正常な牛の新鮮生乳を５°Ｃで毎分４０００回転で
１０分間遠心分離して脱脂した牛乳か、または市販の脱
脂粉乳の温湯に溶解したものを、６５°Ｃにおいて１．
５時間以上温度感作を行ってＮＡＧａｓｅを不活性化し
たものの何れかにＮＡＧａｓｅを溶解し、４ＭＵが５　
Ｘ　１０−”　Ｍ／分／μ２生成するように調製し凍結
乾燥する。

ハ）正常な牛の新鮮生乳を５°Ｃで毎分４０００回転で
１０分間遠心分離して脱脂したもの、あるいは市販の脱
脂粉乳の温湯に溶解したものを６５°Ｃで１．５時間以
上温度感作を行い、ＮＡＧａｓｅを不活性化したのち、
これに４ＭＵを５　Ｘ　１０−１２Ｍ／μρになるよう
に加えて熔解し凍結乾燥する。

また、本発明にて用いる反応停止（緩衝）液は、グリシ
ン１．５ｇを精製氷約５０ｍ！に溶解し、さらに０．２
Ｎ水酸化すトリウムを加えｐＨを１０．５〜Ｉ１．０に
調整して全量を精製水で１００　ｍｌとする。

基質溶液、標準液および反応停止液には、保存期間を延
長させるために防腐剤としてアジカナＩ・リウム、プロ
ノポールあるいは重クロム酸カリウム、正はう酸（ｏｒ
ｔｈｏｂｏｒｉｃ　ａｃｉｄ）等を０．００５〜０．６
％の割合で１種または２種以上を加えることができる。

ごこで、ＮＡＧａｓｅは、乳汁中に含まれるライソゾー
ム酵素の一つであり生体の炎症現象、線維化と深いかか
わりあいを持つ酵素として乳房炎など炎症症状によって
増えることが知られている。

この酵素は、細菌の細胞壁構成々分であるグルコザミノ
ベプタイトの中のＮ−アセチルノイラミ酸とＮ−アセチ
ルグルコサミンのグルコシド結合を切り、生体内に侵入
してきた細菌を殺滅する機構の一助をなしている。

本発明における牛乳中のＮＡＧａｓｅ活性測定は、基質
として４　Ｍ　Ｕ　−ＮＡＧ（４−メチルウンベリフェ
リル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ　−クルコサミニド）ヲ用
い、ＮＡＧａｓｅの加水分解作用により産生された４Ｍ
Ｕ　（４−メチルウンベリフェロン）の量を蛍光を用い
てはかり、これによりＮＡＧ活性を測定する方法である
。この測定の原理における基質と非蛍光物質及び蛍光物
質の関係を示すと次のとおりである。

次に、本発明方法について説明する。なお本発明の操作
には規定のマイクロプレー１・（１列８ホー□ル×１２
列　計９６ホール）を使用する。１列目の上４ホールは
対照用に用い、同じく１列目の下４ボールを標準検査用
に使用し、２列目以降の８８ホールは被検試料の検査用
に使用する。

これに対して、従来のＮＡＧａｓｅ測定法は、ＮＡＧａ
ｓｅ活性を基質としてパラニトロフェノール−Ｎ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコザミニドを用いて測定する。すな
わち、ＮＡＧａｓｅは基質のパラニトロフェノールの結
合部を切断する作用があり、この作用が酵素活性の強さ
と比例することから、産生じたパラニトロフェノールル
の量を吸光度計を用いて測定するものである。

この従来の方法に用いる試薬は次のようにして作製する
。

（１）クエン酸緩衝液 クエン酸６９．３　ｇを精製水に溶かして１２としたも
のと、クエン酸すトリウｌ、　９７．１　ｇを精製水に
溶かし１１にしたものを適宜混合しｐ］１を４．６とし
たクエン酸緩衝液を調製する。

（２）基質溶液 基質物質パラニトロフェノール〜Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニド１１２■をクエン酸緩衝液に溶かして
１００戚にして基質溶液とする。

（３）標準液 パラニトロフェノール５５．６　ｍｇを精製水に溶かし
１００　ｍｌ　（４ａ　ｍｏｌ／ｍＲ）とする。この液
を（１）で調製したクエン酸緩衝液で８倍に希釈して０
．５μｍｏｌ／ｍ［の標準液をつくり、さらにクエン酸
緩衝液で倍々希釈しそれぞれ０．２５　。

０．１２５　、　０．０６３　ＩＩ　ｍｏｌ／Ｉｄの標
準液を調製する。

（４）反応停止液（ｐＨ１０，５） グリシン７５．１　ｇを適量の精製水に溶かし、水酸化
ナトリウム試液によりｐＨ１０，５に調整したのち、精
製水を加えて全量を１℃とする。

このようにして得た試薬を用いて次のようにして従来の
方法による酵素の測定が行われる。この場合、１０ｍ１
の共栓遠沈管を用いて行う。

検　　　　査　　　　　　　　　　　対　　　　照十　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干↓ 激しく振盪し、３０００　ｒｐｍで３０分遠沈↓ 別に標準液により同様に操作して測定用標準線をつくり
、これによって被検牛乳のＮＡＧａｓｅを測定する。次
にこの標準線作成の操作法を示すと下記の通りである。

このように上述した従来方法に対して、本発明は次のよ
うな効果を有する。

（１）　　ＮＡＧａｓｅ測定ば、生化学的反応を理化学
的検査によって測定する方法であるが、従来法では分光
光度計を用いるのに対し、本発明では蛍光光度計を使用
して行う。

本発明で用いる蛍光光度計は、励起及び蛍光波長を一定
に固定して測定できるので器機の機構が簡略化でき、検
査コストを著しく安くすることができる。

また、吸光度の測定では高価な石英製セルを必要とする
が、蛍光度の測定では安価な透明プラスチック製のプレ
ートで測定できる。

（２）従来の吸光度測定法では、１検体の測定にまず４
標準品について測定標準線（検量線）を作成する操作が
ある。次いで、検体と対照Ｇこついて′Ａ１１１定植を
求めて補正し、さらに標準線（検量線）によって測定値
を判定するなど操作は非常に繁雑である。

本発明における蛍光測定を利用したマイクロプレート法
では、１枚のマイクロプレートに検体、対照及び標準を
同時にセットし、検体の測定価が自動的に補正されて表
示されるので操作は簡便である。

（３）　　Ｎ　Ａ　Ｇ　ａ　ｓ　ｅの測定法では主な試
薬である基質が非常に高価である。これに対して１検体
測定時における使用量は、本発明の蛍光測定法での使用
量が従来の吸光度測定法に比較して１／２０以下で済み
、コストの低廉化をはかることができる。

（４）従来の吸光度測定法では基質溶液を３７°Ｃで１
時間保温して反応させなければならない。これに対して
、本発明の蛍光度測定法では常温（１５〜２５°Ｃ）に
おいて１５分間で反応させることができる。このため、
測定時間を大巾に短縮させると同時に、吸光度法で使用
するような器具器材をほとんど必要としないで測定する
ことができる。

（５）従来の吸光度測定法では１０数検体当たりの測定
に１〜２時間を要するが、本発明における蛍光度測定に
よるマイクロプレートを用いるものでは、１枚のプレー
ト８８検体を約３０〜４０分間で測定することができる
。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例について説明する。この実施例は
、本発明の方法により野外で採取した牛乳について試験
を行ったものである。試験結果は、下記第１表の通りで
あった。乳房炎の診断は、本発明と比較するため本発明
方法のＮＡＧａｓｅの測定の他に、野外で広く頻用され
ているＣＭＴ変法及び細菌検査法を併用した。

ＣＭＴ変法は、陰イオン系界面活性剤に指示薬を配合し
た試薬で、界面活性剤が細胞のＤＮＡを非免疫学的に疑
集する性質を利用して牛乳中の体細胞の量を推定し、併
せて指示薬ＢＴＢにより牛乳のｐ＋＋を測定し′Ｃ乳房
炎の程度を判定する方法である。

また、細菌検査は塗抹培養により牛乳中の総組菌数を検
べた。

第　　　１　　　表 注）（１）計算式 標準活性値の蛍光強度　２１５ （２）　　ＣＭＴ変法 一：陰性　王：再検査　士：縦隔性 十〜＋４＋：陽性 本発明のＮＡＧａｓｅ測定による乳房炎の診断成績は以
上のとおりである。

この第１表の成績から明らかなように乳房炎の診断を、
本発明によるＮＡＧａｓｅ酵素測定と細菌数およびＣＭ
Ｔ変法の総合的な判定によって判断したが、このうち、
判定の結果をＮＡＧａｓｅ酵素だけの成績と比較すると
、ＮＡＧａｓｅ酵素の測定値が１０．０以下の場合は陰
性、１０．０〜１５．０の場合は縦隔性、１５．０以上
の場合は陽性と判定されている。このことは本発明の方
法によるＮＡＧａｓｅ酵素の測定が、乳房炎の診断を数
値により容易に表すことができることを示している。

〔発明の効果〕

以上説明した如く、本発明にかかる酵素測定方法によれ
ば、多種の検体から酵素を短時間にかつ、正確に、しか
も安価に判定できる等顕著な効果を有するものである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β
   −Ｄ−グルコサミニドからなる基質溶液をＮ−アセチル
   −β−Ｄ−グルコサミニダーゼで加水分解して得た、４
   −メチルウンベリフェロンの蛍光強度を標準溶液の蛍光
   強度を基準にしてアルカリ溶液中で定量することを特徴
   とする酵素測定方法。
2. （２）標準溶液は、乳房炎罹患乳の脱脂したものに、正
   常牛から採取した酵素不活化脱脂乳を加え、Ｎ−アセチ
   ル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼの量を一定にして得た
   ものである請求項第１項記載の酵素測定方法。