JPH01233225A - 抗炎症剤および免疫調節剤としてのサイクロフイリンの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の背景 サイクロフィリンは免疫抑制剤であるサイクロスポリン
Ａを結合し広く様々な組織中に存在する細胞質ゾル性タ
ンパク質（ｃｙｓｔｏｓｏｌｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）で
ある（ｌｌａｎｄｓｃｈｕｉａｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、
、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２６　：　　　’５４４−５４
７．１９８４）。サイクロフィリンは、きのこ類、海綿
動物、および西洋カポチャのほか哺乳動物を含む多くの
生物種中に存在している。その濃度は組織ごとに異なり
、またある種の癌細胞および活性化したリンパ球では増
大している。サイクロスポリンＡがその有効性を示す（
リンパ球）または毒性を示す（腎臓、脳）組織中で最も
高いレベルで存在する（Ｋｏｌｅｔｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｊ、　ｌａ＋ｗｕｎｏ１．１３７　：１０５４−
１０５９．１９８１１ｉ）。

サイクロフィリンはヒト胸腺およびウシ胸腺細胞質ゾル
から単離、精製されている（ＩＩａｒｄｌｎｇ　ｅｔａ
ｌ、、　Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　ＣｈｅＩｌ、　２６１：　
８５４７．１９８６）　、ウシおよびヒトサイクロフィ
リンの両方について主たるおよび副たるイソ型が確認さ
れていて、１７キロダルトン（ｋＤａ）の見かけ分子量
を有していることがわかっている。ウシの主たるイソ型
は完全に配列決定されており　１６３アミノ酸残基およ
びＭｒ　−１７，７１７を有していることがわかってい
る。ヒトの主たるイソ型の最初の７２個のアミノ末端残
基は決定されており、またウシの主たるイソ型サイクロ
フィリンと同一であることがわかっている（ｌｂｌｄ、
）。

ヒトサイクロフィリンをコードする相補ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）は、白血病Ｔ−細胞系統Ｊｕｒｋａｔの誘導細胞か
ら単離された伝令ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の逆転写によっ
て得られたｃＤＮＡをＥ、　ｃｏｌｉにクローン化する
ことにより得られるｃＤＮＡライブラリーから単離され
た（Ｈａｅｎｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

ＥＭＢＯＪ、　　６　：９４７．１９８７）。そのＤＮ
Ａは配列決定され、そしてそのｃＤＮＡのヌクレオチド
配列から、ヒトサイクロフィリンのアミノ酸配列が推論
された。その推論された配列と、ウシ胸腺サイクロフィ
リンの配列とは三点でしか異なっていなかった、すなわ
ちカルボキシル末端にグルタミン酸残基が加わっている
点、残基番号１６３においてイソロイシンの代わりにロ
イシンが入っている点および残基番号８３においてアス
パラギン酸の代わりにグルタミン酸が入っている点であ
る。

ヒト末梢血白血球から調製されたゲノムＤＮＡのサザー
ンプロット分析からは、いくつかのイソ型のサイクロフ
ィリンをコードするいくつかの遺伝子の存在が示された
（１ｂｌｄ、）。

サイクロスポリンＡは、組織移植片および臓器および骨
髄移植片の拒絶を防止するために用いられる環状ウンデ
カペプチド免疫抑制剤である。それは、自己免疫病の治
療に用いることについて研究されている。サイクロフィ
リンがサイクロスポリンＡを結合することは知られてい
ても、サイクロスポリンＡの免疫抑制作用においてサイ
クロフィリンがどのような役割（゛もしあるとして）を
果しているかはまだ知られていない（ｆｂｌｄ、）。サ
イクロフィリンの生体内（Ｉｎ　ｖｉｖｏ）薬学的有用
性については文献に全く報告されていない。

発明の概要 本発明は以下詳述するマウス接触感応試験においてサイ
クロフィリンが強力な生体内抗炎症作用を示すという発
見に基づくものである。この試験は、遅遅型過敏症反応
より成り、そしてヒトおよび他の咽乳動物における抗炎
症および免疫調節（ＩＩＩａｕｎｏｍｏｄｕｒａｔｏｒ
ｙ）作用の信頼し得るインジケータである。サイクロフ
ィリンがその結合リガンドであるサイクロスポリンＡに
類似した作用を示すことは予想外かつ驚くべき発見であ
った。

−面において、本発明は慢性炎症性疾患またはその他の
炎症を有する踊乳動物、または自己免疫疾患、組織移植
片、または臓器または骨髄移植片を存する哺乳動物に抗
炎症的にまたは免疫調節的に有効量のサイクロフィリン
を投与することより成る該哺乳動物の炎症軽減方法また
は免疫系調節方法である。

他の面において、本発明は、抗炎症的にまたは免疫調節
的に有効量のサイクロフィリンと薬学的担体とより本質
的に成る静脈内（１，ｖ、）、筋肉内（１，ａ＋、）、
皮下（ｓ、ｃ、）、腹腔内（１，ｐ、）、鼻内、口腔内
（頬内）または局所投与用の薬学的組成物である。好ま
しいのは、塩、緩衝剤または糖の等張水性溶液中のサイ
クロフィリンより本質的に成るｉ、ｖ、、ｉ、Ｉｎ、、
Ｓ、ｅ、またはｉ、ｐ、投与用の組成物である。本発明
は、ｉ、ｍ、、１．ｖ、、Ｓ、ｅ、または１．ｐ、注射
用組成物を与えるような等張水性溶液中に再構成するの
に適した滅菌バイアル中の凍結乾燥サイクロフィリンを
包含する。

本発明は、アミノ末端の最初の４２アミノ酸がこれまで
報告されているウシおよびヒトの主イソ型と、それぞれ
１０．１１および１３位のアラニン、バリンおよびグリ
シンがスレオニン、アラニンおよびアスパラギン酸に代
わっているほかは、実質的に同じアミノ酸組成および同
じ配列を有する、これまで単離されたことのない、ＬＰ
３’　と称される精製ヒトイソ型サイクロライリンを包
含する。

更に、１位のバリンがアセチル化されているかまたはア
セチル化メチオニル残基に先行されている新規イソ型の
ブロック化アナログも包含される。

これらの新たに単離され精製されたイソ型は他の細胞物
質を実質的に含まない。好ましくは、それらは少くとも
９５％の純度、より好ましくは少くとも９９％の純度で
ある。

本明細書中に使用される用語「サイクロフィリン」とは
、サイクロスポリンを結合でき、後述する動物モデルで
抗炎症作用を示す、約１７キロダルトンの分子量を有す
る天然細胞質ゾル性タンパク質を意味する。それは、こ
れまでに報告されているウシおよびヒトの主および副イ
ソ型、本明細書に記載されるようなＵ　−９３７細胞か
ら単離される様々なイソ型ＬＰ３．ＬＰ５．ＬＰ６゜Ｌ
Ｐ３’　、ＬＰ５’　およびＬＰ６’、および前記イソ
型と実質的に同じアミノ酸組成物および配列（７０％ま
たはそれ以上の配列相同性）を有する生物学的に等価の
タンパク質を包含する。

本明細書の特許請求の範囲は、細胞単離物から生産され
たものであろうとあるいは合成または組換え手段により
生成されたものであろうと、サイクロフィリンの等価物
、例えば翻訳後哺乳動物修飾の不在によりサイクロフィ
リンと相違するポリペプチド、および、サイクロスポリ
ンＡと結合し後述の動物モデルで抗炎症作用を示すサイ
クロフィリンの欠失、挿入および置換突然変異体をも包
含する。

本発明の詳細な説明 いずれの給源からのサイクロフィリンも本発明に用いる
ことができる。ヒトに用いるには、有害な免疫反応の可
能性を避けるために、ヒトサイクロフィリンを用いるの
が好ましい。いくつかのヒト組織中にサイクロフィリン
が広く分布している（Ｋｏｌｅｔｓｋｙ　ａｔ　ａｌ、
、　５ｕｐｒａ）こと、およびヒトＪｕｒｋａｔ細胞か
らのサイクロフィリンのｍＲＮＡの報告（ｔ（ａｃｎｄ
ｌｃｒ　ａｔ　ａｌ、、　５ｕｐｒａ）に基づき、多く
の異なる白血球細胞系統からサイクロフィリンを単離す
ることは、妥当なこととして予測し得た。以下に報告さ
れる試験において、使用されたサイクロフィリンは、Ａ
ｏ＋ｅｒｌｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ
ｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｌｌｌｅ。

ＭＤ２０８５２からＡＴＣＣ受記番号ＣＲＩ、−１５９
３の下に得られ、また公に入手し得るヒト組織球性リン
パ腫細胞系統Ｕ　−９３７のサブクローンから単離され
精製された。使用したクローン化、単離および精製方法
は以下の実施例に記載する。

下記実施例におけるサイクロフィリンの生物活性はＰｈ
ａｎｕｐｈａｋ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、　ｌ　１２：ｌ１５゜１９７４）が記載した系にお
いてマウスに対する感作剤としてジニトロフルオロベン
ゼン（ＤＮＦＢ）を用いた生体内接触感応試験系を用い
て測定した。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ系雌マウス（〜２０　ｇ　、　
ｃｈａｒｌｅｓＲｌｖｅｒ）の毛を削り除いた腹部に、
０および１日目に、４：１アセトン：オリーブ油のビヒ
クル中の０．５％ＤＮＦＢ２５Δを用いて感作した。５
０目にマウスの耳に、４：１アセトン：オリーブ油のビ
ヒクル中の０．２％ＤＮＦ８２０ｍを負荷（チャレンジ
）した。負荷直前および２４時間後に耳の一定区域をエ
ンジニア用ミクロメーターを用いて測定した。（５日目
の）負荷の１時間前に、マウス群に食塩水中の化合物を
皮下投与した。抑制率（％）は次のようにして計算した
： 抑制率（％）− 正コントロールは、薬剤注射として食塩水のみを投与し
た。負コントロールは０および１日目に感作されなかっ
たが５日目に負荷され食塩水注射を施した。１群あたり
６〜ｌＯ匹のマウスを用いた。

実施例　Ｉ Ａ、Ｕ−９３７細胞の増殖および抽出液の調製４．５　
ｇ／ＩＩグルコースを含み、３．’１ｇ／ＩＩ重炭酸ナ
トリウムおよび５〜１０％熱失活（５８℃で３０分間）
牛胎児血清を補給したＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆ’
ｉｅｄＨａｇ’ｌｃ　Ｍｅｄｉｕｍ培地でＵ　−９３７
細胞を増殖した。増殖条件は３７℃で５％ＣＯ７を含む
空気を用い、′、そして３ＯＲＰＭ攪拌とした。それら
細胞を７２．５ＸｌＯ°細胞個／ｍｌの細胞密度で集め
た。５ｈａｒｐｌｃｓ遠心分離器を用いて細胞ペー゛ス
トを調製した。その細胞ペーストをゲンタマイシン（５
０４／ｍｌ）を補給したホスフェート緩衝食塩水（Ｇｌ
ｂｃｏ　＃３１０−４０４０）で２回洗浄した。細胞ペ
ーストはＴｒｌｓ緩衝液（０，０５Ｍ、　ｐＨ８，１）
中で凍結（−２０℃）状態で保存できる。細胞（４Ｘ　
１０”）をＴｒｌｓ緩衝液で２００　ｍｌとし、そして
次の条件下に旧ｔｒａｓｏｎｌｃｓＳｏｎｉｃａｔｏｒ
（モデルＷ３７５　、　カップホーン付属装置付）を用
いて２５ｍ１アリコートずつ音波処理した：ａ）最大出
力で４５秒、連続パルス、ｂ）水浴上に１０分間保持、
Ｃ）最大出力で６０秒、５０％パルス。細胞音波処理物
を４５．０００Ｘ　１１：で６０分間遠心分離し、そし
てその上清を更なる精製の為に用いた。

Ｂ、ＤＥＡＥカラム精製 Ｕ　−９３７細胞からの音波処理抽出液のタンパク質濃
度をＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。タンパク質
濃度は８〜１２ｍｇ／ｍｌの範囲で変動した。その物質
をＤＥＡＥセルロース（ジエチルアミノエチルセルロー
ス）カラムにかけた。そのカラムを０．ｏ５ＭＴｒｊｓ
−ＨＣ１ｌ　ｐＨ８，１中で平衡させた。タンパク質対
使用樹脂最大比は２．８５４／ｍｌであった。流速は１
ｍｌ／分とし、そして１０ｍ１ずつのフラクションを集
めた。２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。

ＤＥＡＥ流通（ｒ　ｌｏｗ　−Ｌｈｒｏｕｇｂ）フラク
ションを集めプールした。典型的にはカラムにかけたタ
ンパク質の１０〜２０％は０．０５ＭＴｒ１ｓ−ＨＣｉ
ｔ　ｐＨ８，１中ではカラムに結合しなかった。

Ｃ，アルカリ性ホスファターゼ処理 ＤＥＡＥ流通フラクションを次にアルカリ性ホスファタ
ーゼで処理した。使用アルカリ性ホスファターゼはビー
ズ化アガロース（ＳｉｇｍａｃｈｅＩＩｌｉｃａｌ　ｃ
ｏＩｌｌｐａｎｙ、　＃Ｐ−０７６２）に結合した。ア
ルカリ性ホスファターゼをタンパク質溶液との混合に先
立ち０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣＤ　ｐＨ８，１中で平衡
させた。インキュベーションは２３℃で振盪しながら２
３℃で行った。使用されたアルカリ性ホスファターゼ対
タンパク質比は２５単位／ｇであった。インキュベーシ
ョン後、懸濁液をＢＩｏ　−Ｒａｄエコツカラムに通し
てアルカリ性ホスファターゼをタンパク質溶液から分離
した。サンプルを滅菌ン戸遇しそして更に処理するかま
たは４℃で貯蔵した。

Ｄ、ＨＰＬＣカラム精製 アルカリ性ホスファターゼ処理タンパク質サンプルをＶ
ｙｄａｃＣ４ＨＰＬＣカラムに直接かけるか、またはｐ
Ｈを下げてからサンプルをそのＣ４カラムにかけた。こ
のＨＰＬＣ系に用いた溶媒は水およびアセトニトリルで
、いずれも０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）を
含有させた。タンパク質はアセトニトリル濃度勾配を用
いて０４カラムから溶出した。分子ｆｆ１１７．０００
のタンパク質（ｐ　１７）（ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により測定）は、３５〜４０％のアセト
ニトリル濃度で溶出した。サンプルを２０ｍＭジチオト
レイトール（ＤＴＴ）で２０分間室温で処理してから０
４カラムにかけると、３個のｐ１７含有ピークが明らか
に得られた。サンプルをＤＴＴで処理しないと少くとも
６個の主にｐ１７を含有する６個のピークが明らかに得
られた。ＤＴＴにより６個またはそれ以上のピークが３
個に減少した。ｐ１７含有ピークを個別に集めそして乾
燥した。

０４カラムからのｐ１７含有ピークフラクションを２０
ｍ　Ｍ　　Ｄ　Ｔ　Ｔを含みまたは含まない０．１％Ｔ
ＦＡに個別に溶解した。ＤＴＴを含有するフラクション
は２３℃で２０分間インキュベートした。溶解されたタ
ンパク質をｖｙｄａｃフェニルＨＰＬＣカラムに個別に
かけた。ｐ１７はそのフェニルカラム後は９５％以上の
純度とｎ１定された。乾燥サンプルを前述の如く溶解し
た。

前記フェニルカラムからのｐ１７含有ピークフラクショ
ンをＶｙｄａｃ　Ｃ１８カラムに個別にかけた。

ｐ１７は３７〜４１％のアセトニトリル濃度で溶出した
。

ＬＰ３．ＬＰ５およびＬＰ６と称する３ＦＩｉ類のｐ１
７は９９％以上の純度であると判定された。ＬＰ３　：
　ＬＰ５　：　ＬＰ６比は約２．８　：　１　：　２．
１であった。

純度はＨＰＬＣ溶出プロフィールにより、またドデシル
硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）の存在下における還元条
件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
により判定した。ＳＤＳ・ＰＡＧＥゲルでの分子量標準
品実験と比較した結果、分子量は１７ｋＤａ　（キロダ
ルトン）と見積もられた。精製１７ｋＤａタンパク質の
アミノ酸分析はサイクロフィリンの公表されたアミノ酸
含量と一致し、またアミノ末端からのＬＰ３の、および
トリブチツクおよびヒドロキシルアミンペプチドのアミ
ノ酸配列決定（第１図）は、配列決定されたアミノ酸の
７０％についてヒトサイクロフィリンに対し予想された
配列（ｔｌａｅｎｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｕｐｒ
ａ）と正しく一致した。三種類の区別されるｐ１７は、
ブロックされていないタンパク質および、ブロック基で
あるアセチルおよびアセチルメチオニルをアミノ末端に
有するタンパク質を表わす（第２図参照）。

この実施例およびこれに続〈実施例におけるアミノ酸組
成の測定は、次のようにして行った。

サンプルを０．４％２−メルカプトエタノール含有６Ｎ
　　ＨＣ，Ｑを用いてアルゴン雰囲気中１１０℃で２４
、４８および７２時間加水分解した。得られたアミノ酸
を、ノルロイシンを内部標準として添加したクエン酸ナ
トリウム緩衝液ｐ１１２．２に再懸濁し、そしてＢｃｃ
ｌｖａｎ８３００アナライザー（イオン交換、カラム後
ニンヒドリン誘導体化）　　（Ｂｃｃｋ［ｌ１ａｎＩｎ
ｓｔｒｕＩＩｌｅｎｔｓ　５ｐｌｎｃｏ　Ｄｌｖｉｓｉ
ｏｎ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）で固定した。タ
ンパク質の配列決定は、Ｈｅｗｌｃｋ。

ａｔ、　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　ｃｈｅｆｆｉ、
　２５８：　７９９０　（１９８１）に記載されている
如く、オンラインＭｏｄｅｌ　ＰＴＨアナライザーが付
属したＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄ
ｅ１４７０Ａ気相シーケンサ−（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢＩ
ｏｓｙｓＬｅｏ＋５Ｉｎｃ、、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔ
ｙ、　ＣＡ）を用いてエドマン（ＥｄＩＩｌａｎ）分解
によって行った。トリブチツクペプチドマツプの調製に
は、逆相精製されたサイクロフィリンはトリプシンで１
　：　５０　（重／重）比で２３℃で２４時間処理した
。それらペプチドをｌ１ｅｖｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ
　１０９０Ｍ　　ＨＰ　Ｌ　Ｃを用いた０４カラムで分
割した。ＨＰＬＣ試薬は０．１％ＴＦＡおよび０．１％
ＴＦＡ／アセトニトリルであワた。

ＬＰ３．ＬＰ５およびＬＰ６はマンニトールを添加しそ
して凍結乾燥することにより個別に貯蔵のための調製を
行った。再溶解溶解物質のタンパク質濃度を１　ｍｇ　
／　ｍｌとしたときは濃度が０．３Ｍとなるのに十分な
マンニドニルを添加した。

凍結乾燥調製物をタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌとなる
ように滅菌したパイロジエン不含水に溶解した。この溶
液を滅菌ホスフェート緩衝食塩水中で希釈して、全ｍ　
０．２ｍｌ中に表示された用量を与えた。前述の接触感
応プロトコールの５日目に負荷用量のＤ　Ｎ　Ｆ　Ｂ　
（０，２％）を局所投与する１時間前にサイクロフィリ
ンを皮下投与した。耳腫脹を６日目に測定した。その活
性を標準品グルココルチコステロイド、デキサメタシン
、および〉９０℃で４５分間加熱して生物活性を破壊し
タンパク質コントロールとしたサイクロフィリン種（Ｌ
Ｐ３ｈｉ。

ＬＰ５ｈｌ、ＬＰ６ｈｌ）と比較した。

（以下余白） 正コントロール　　　食塩水　　　　８０．３±４．７
０デキサメタシン　　　２．０　　　　　　Ｂ８．０±
２．１　　１８．０２０．０　　　　　５２．０±２．
４　　３５．７２００．０　　　　　２１！±２．５　
　７４．８Ｌ　Ｐ　３　　　　　　　０．００１　　　
　５７．０±１．２　　２９．４０．０１　　　　　４
５．７±２．８　　４３．７０．１　　　　　３５．０
±２．３　　５７．２１．０　　　　　４１．８±１．
５　　４１７Ｌ　Ｐ　５　　　　　　　０．０００１　
　　　５２Ｊ±３．２　　３５．３０．００１　　　　
３５．５±２．０　　５［ｉ、６０．０１　　　　　４
１．１±３．７　　４９．５Ｇ、１　　　　　２８．７
±１．４　　８５．２１．０　　　　　３０．０±１．
４　　８３．８Ｌ　Ｐ　６　　　　　　　０．０００１
　　　　５７．０±２．４　　２９．４０．００１　　
　　５８．７±１．７　　２７．３０．０１　　　　　
４０．２±３．４　　５０．７０．１　　　　　３５．
８±１．５　　５８．５１．０　　　　　３０．１±２
．０　　　［ｉ３．４ＬＰ３ｈｌ　　　　　　　１．０
　　　　　８３．８ｆ１．４　　２１．１Ｌ　Ｐ　５ｈ
１　　　　　　１．０　　　　　８７．０±３．４　　
１６．８Ｌ　Ｐ　６ｈｉ　　　　　　　Ｏ，１５９，８
±２．３　　２５．９＆）　　１単位＝ｌＯ−４インチ
としてＳ定された５日目から６日目にかけての耳肉厚増
加 実施例　２ 実施例１のＡ−Ｃ部におけると同様にして得られたＤＥ
ＡＥ流通フ流通シラクシヨシで２０分間２゜ｍＭ　ＤＴ
Ｔで処理し、次いでＨＰＬＣのＶｙｄａｃＣ１８カラム
にかけた。使用溶媒は、０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
　Ｆ　Ａ）およびアセトニトリル１０．１％ＴＦＡとし
た。タンパク質はアセトニトリル濃度勾配を用いてカラ
ムから溶出させた。

ＬＰ３．ＬＰ５およびＬＰ６と称される３種類のサイク
ロフィリン種は３７％と４２％アセトニトリルの間でカ
ラムから溶出した。ＣＬＢカラム後のタンパク質は９０
％以上の純度であった。

いくつかの実験においてはＣ１ａカラムからのｐ１７含
有ピークを凍結乾燥し、次いで０．１％ＴＦＡに可溶化
してからＶｙｄａｃフェニルカラムにかけた。他の場合
においては、ピークを０．１％ＴＦＡを１：２希釈し、
そしてフェニルカラムにかけた。それらタンパク質はそ
のフェニルカラムかられずかにより早くに溶出した。３
種類のサイクロフィリン種はフェニルカラム後９５％以
上の純度と判定された。フェニルカラムからのｐ１７含
有ピークフラクションを次いで、最終クロマトグラフィ
段階としてＶｙｄａｅＣ４カラムを用いて更に精製した
。ｐｆ７製品は、０４力ラムクロマトグラフイ段階の後
、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより９９％以上の純度であると測
定された。前記３個の逆相カラムの順序を変えても生成
タンパク質の純度にはほとんど影響がなかった。個々の
タンパク質種を１：１：１の割合でプールし、そしてＬ
ＣＬ５と呼称した。

プールされたタンパク質は、マンニトールを添加し凍結
乾燥することにより貯蔵のための調製を行った。再溶解
物質のタンパク質濃度を１　ｍｇ　／　ｍｌとするとき
は濃度を０．３Ｍとするに十分なマンニトールを添加し
た。

凍結乾燥調製物をｌｏｇ／ｍｌのタンパク質濃度となる
よう滅菌したパイロジエン不含水に溶解した。

この溶液を滅菌ホスフェート緩衝食塩水中で希釈して全
１ｍ　０．２ｍｌ中に表示された用量を与えた。前述の
接触感応プロトコールの５日目に負荷用量のＤＮＦＢ（
０，２％）を局所投与する１時間前にサイクロフィリン
を皮下投与した。耳腫脹を６日目に測定した。その活性
を標準品グルココルチコステロイド、デキサメタシンお
よび〉９０℃で４５分間加熱して生物活性を破壊し従っ
てタンパク質コントロールとして働くサイクロフィリン
（Ｌ　ＣＬ５ｈｌ）と比較した。

（以下余白） 正コントロール　　　食塩水　　　８１．８０±２．７
０デキサメタシン　　　２．０　　　　　７１．２５±
１．８　　１３デキサメタシン　　２０．０　　　　　
５Ｂ、３０±２．２　　３２デキサメタシン　　２００
．０　　　　　１８．３５±２．７　　８４Ｌ　Ｃ１５
０，０００１５２，５Ｂ±２．３　　３７Ｌ　Ｃ１５０
，００１３８，１３±２．８　　５８Ｌ　Ｃ１５０，０
１４５，８５±２．８　　４８Ｌ　Ｃ１５０，１５８，
３５±２．４　　３０Ｌ　Ｃ１５１，４８，７０±２．
９　　４２Ｌ　Ｃ１５１（１，５９，５５±２．４　　
２８Ｌ　Ｃ１５ｈ１　　　　　　０．０００１　　　６
［ｉ、９０±３．７　　１９Ｌ　Ｃ１５ｈｉ　　　　　
　　０．００１　　　　８４．９０±３．２　　２１Ｌ
　Ｃ１５ｈｊ　　　　　　　Ｏ，０１７０，５±３．２
　　１４Ｌ　Ｃ１５ｈｌ　　　　　　　０．１　　　　
　８１．７０±４．３　　２５Ｌ　Ｃ１５ｈｉ　　　　
　　　１．　　　　　６０．２０±４．５　　２７１単
位−ＩＯ−４インチとして測定された５日目から６日目
にかけての耳肉厚の増加 実施例　３ 実施例１のＡ−Ｃ部におけると同様にして得られたＤＥ
ＡＥ流通フラクシ゛ヨンを１０ｍ　Ｍ燐酸カリウムｐＨ
７，２１５ｍＭ　　ＤＴＴに対して透析した。

このサンプルを同じ緩衝液中で平衡したＡｌ１１ｉｃｏ
ｎ月ａｔｒｃｘ　Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅ　Ａカラムにかけた
。大部分の夾雑タンパク質は１００ｍ　Ｍ燐酸カリウム
ｐＨ７゜２１５ｍＭ　　ＤＴＴと共にカラムから溶出し
た。サイクロフィリンは３５０ｍ　Ｍ燐酸カリウムｐＨ
７，２１５ｍＭ　　ＤＴＴと共に溶出した。その高塩濃
度ウォッシュ・オフ（ｈｉｇｈ　５ａｌｔ　ｗａｓｈ　
−ｏ（Ｔ）を５ｍＭ燐酸カリウムｐＨ６、８に対して透
析し、そしてＤｕ　Ｐｏｎｔ弱陽イオン交換ＨＰＬＣカ
ラム（ＷＣＸ−ＨＰＬＣ）にかけた。タンパク質は、５
ｍＭ燐酸カリウムｐＨ８，８中の０〜０．５Ｍの塩化ナ
トリウム濃度勾配を用いて溶出させた。それらタンパク
質を第二のＢｌｕｅ　Ａカラムを用いて濃縮しそして緩
衝液をＡａ＋　ｉ　ｃｏｎスピニングセル中で交換した
。生成サイクロフィリンは、９５％以上の純度であり、
ホスフェート緩衝食塩水中１．Ｏａ１ｇ／ｍｌの濃度を
有し、また１０工ンドトキシン単位／ｍｇ以下であった
。

この溶液を滅菌ホスフェート緩衝食塩水中で希釈して全
ｍＯ，２ｍｌ中に表示された用量を与えた。

接触感応プロトコールの５日目に負荷用量のＤ　Ｎ　Ｆ
　Ｂ　（０，２％）を局所投与する１時間前にサイクロ
フィリンを皮下投与した。耳腫脹を６日目にΔＩＩＩ定
した。その活性を標準品グルココルチコステロイド、デ
キサメタシン、および〉９０℃で４５分間加熱して生物
活性を破壊し従ってタンパク質コントロールとして働く
サイクロフィリン（サイクロフィリンｈｉ）と比較した
。

（以下余白） 正コントロール　　　　　食塩水　　　　７３，４±４
．００デキサメタシン　　　　　２．０　　　　　５Ｂ
、８±４．３　　２４．８２０．０　　　　　　Ｂ８．
２±２．８　　５２．１２０Ｇ、０　　　　　３．５±
２．８　１０Ｌ４サイクロフイリン　　　　０．０（］
１　　　　５１）、８±２．８　　３３．４０．８１　
　　　４７．５±２．８　　８８．４０．１　　　　　
４８！±４．０　　４０．１１．０　　　　　４５．８
±８．６　　４０．８１０．０　　　　　４１．５±３
．７　　４７．２１００．０　　　　　４２．３±３．
１　　４６．１サイクロフイリンｈ１　　　０．００１
　　　　　Ｂ２．１±４．７　　１６．７０．０１　　
　　５８．５±４．０　　２２．１０．１　　　　　６
６．３±４．０　　１０．５１．０　　　　　５８．０
±４．８　　２５．７１０．０　　　　　７２．５±３
．１１　　１．３１ｍ位−１０−４インチとして測定さ
れた５日目から６日目にかけての耳肉厚の増加。

実施例　４ Ｕ　−９３７細胞系統をＢＭ　Ｃｙｃｌｉｎ　　（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｃｒＭａｎｒ＋ｈｅ１ｍ）で処理してマイ
コプラズマを除いた。

マイコプラズマ不含細胞を次いでサブクローン化し、そ
してそのサブクローン化細胞を実施例１のＡ部に記載の
如く音波処理した後、その音波処理物を実施例１のＢ部
に記載の如（ＤＥＡＥセルロースカラムにかけた。ＤＥ
ＡＥ流通フラクションを実施例３に記載の如＜　Ａｍ１
ｃｏｎ　ＭａｔｒｅｘＧｅｌ　Ｂｌｕｅ　Ａカラムおよ
びＷＣＸ−ＨＰＬＣカラムにかけた。（１，１２Ｍ　　
Ｎ　ａ　Ｃ（ｌで溶出したＬＰ３゜ＬＰ５およびＬＰ６
に加えて、３種類の新しいサイクロフィリン種が０．０
５Ｍ　　Ｎ　ａ　ＣＯにおいてＷＣＸ−ＨＰＬＣカラム
から溶出した。それら新しいサイクロフィリン種（ＬＰ
３’、ＬＰ５’。

ＬＰ６’　と称する）は、サイクロスポリンを結合する
ことが示され、またマウス接触感応試験において活性を
有し、従って抗炎症剤および免疫調節剤として有用であ
ることが期待される。ＬＰ５’は実施例３の手順によっ
てはＬＰ６’から分離されなかったが、実施例１および
２の手順により分離することができた。ＬＰ３′はＬＰ
３と実質的に同じアミノ酸組成であり、また第２図に示
されるように、１０．１１および１３位を除いてアミノ
末端の最初の４２個のアミノ酸の配列はＬＰ３と同じで
あった。ＬＰ５’およびＬＰ６’　はアミノ末端がブロ
ックされた形であることが示され、また、それらは、１
位のバリンがＬＰ５’ではアセチル化されそしてＬＰ６
’ではアセチル化メチオニルにより先行されている点を
除きＬＰ３’　と同一であると思われる。ＬＰ３’　　
：ＬＰ５’　　：ＬＰ６’の割合は約１：１：・１．６
であった。

用量および組成物 前述の接触感応試験系は遅延型過敏症反応である；同様
の炎症反応はヒトにおいて生じる。免疫系を抑制しない
非ステロイド系抗炎症剤、例えばアスピリンおよびイブ
プロフェンはマウス接触感応反応を阻害しない。メトト
レキセート、サイクロスポリンＡ１およびグルココルチ
コステロイド例えばデキサメタシンは免疫系を抑制し、
マウス接触感応反応を阻害し、そしてヒト慢性炎症の治
療にを用である。このモデルにおける結果は、サイクロ
フィリンは炎症、特に慢性炎症性疾患例えば慢性関節リ
ウマチ、乾釘、慢性炎症性腸疾患および喘息などの治療
に有用であることを示している。マウス接触感応モデル
を用いた急性試験における広い範囲にわたる有効用ｉｎ
　（０，０５ｑ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ）に基づき、サイ
クロフィリンは、そのモデルを阻害はするがより高い用
量では毒性をも示す他の化合物よりも有利である可能性
がある。このモデルにおける結果は更に、サイクロフィ
リンが組織移植片拒絶および臓器および骨髄移植拒絶を
予防するのに有用であろうことをも示している。

更に、それは、自己免疫疾患例えば慢性関節リューマチ
、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力
症および若年性糖尿病などの治療にも、これらの病態と
接触感応反応のいずれにも主Ｔリンパ球成分が認められ
ることが知られていることから、有用なはずである。

マウス接触感応試験における活性に基づき、体ｍ　１　
ｋｇあたり　０，５〜５．０００■の範囲の用量が抗炎
症および免疫調節的に有効量のサイクロフィリンであろ
う。従って、本薬剤を局所的に、または注射により投与
するときは、７０ｋｇの大人の場合、３５■〜３５０Ｉ
Ｉ１ｇの範囲の用量が用いられよう。鼻内または口腔内
投与の場合には、この範囲の低い側の用量、例えば０，
１〜１０ｍｇを用いられよう。

投与のためには、サイクロフィリンを薬学的に適した担
体と混合すべきである。この文脈における「担体」とい
う用語は実質的に生物学的に不活性であって薬剤を患者
にとってより受容しやすいものにするおよび／または患
者にとってより利用しやすいものにする一種以上の他の
成分を意味する。担体中のサイクロフィリン濃度は、抗
炎症または免疫調節的に有効な量を不当に大容量の用量
を用いずに供与するのに十分なものとすべきである。通
常、注射可能組成物には約０．１〜５ｎｇ／ｍｌの範囲
、また局所、鼻内および口腔内投与用組成物には約０．
１〜５％の範囲の濃度となろう。しかしながら、それよ
りも高いおよび低い濃度を用いることもできる。１．ｖ
、、１．ｍ、、ｓ、ｃ、およびｔ、ｐ、投与には、サイ
クロフィリンを塩、緩衝剤または糖の等張水性溶液中に
分散すべきである。サイクロフィリン溶液は滅菌バイア
ル中で凍結乾燥することができ、また投与直前に注射用
滅菌水の添加により再構成することができる。鼻内、局
所および口腔内投与には、サイクロフィリンを吸収助長
剤と混合すべきであり、また分散剤および／または可溶
化剤と混合してもよい。適切な薬学的担体については、
Ｒｃｏ＋１ｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｃｕｔｌｃ
ａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｐｏｕｒｔｃｃｎｔｈ　Ｅｄ
ｉｔｌｏｎ、　ＨａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、
、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ　（１９７０）が参考となる
。以下は本発明の組成物の実施例であるが、本発明はこ
れら特定の組成物に限定されるものではない。

実施例　ら 注射可能液状剤形 １ｍｇのサイクロフィリンを０．０１Ｍ燐酸ナトリウム
、０．１５Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ４７および選択された保存
剤を含有する緩衝溶液に溶解して全容量を１ｍｌとする
。

生成溶液の１）！１をＮａＯＨまたはＨＣｆＩで７６２
に調節する。最終溶液を次いで無菌的に濾過しそして非
経腸的に用いるべく滅菌容器に充填する。

実施例　６ 凍結乾燥粉末 ｌｆｆ１ｇのサイクロフィリンを０．３Ｍマンニトール
水溶液に溶解して全容量を１ｍｌとし、そしてそのｐＨ
をＮａＯＨまたはＨＣ，９で７．２に調節する。最終溶
液を次に無菌的に消遇し、そしてブチルゴム栓で部分的
に栓をした滅菌バイアルに充填する。

凍結乾燥を第一乾燥温度を２０℃、第二乾燥温度を４０
℃として行う。凍結乾燥バイアルを窒素下に封栓しそし
て直ちにシールする。完成バイアルは、１ｍｇ／ｍｌの
サイクロフィリンを与え、そして非経腸用の清澄等張溶
液を作るのに十分な水を用いて再構成することができる
。

（以下余白） 実施例　７ 鼻内投与用組成物： （０，１ｃｃを運搬するように計量されるスプレー）サ
イクロフィリン　　　　　　０，１〜５％コール酸ナト
リウム（吸収助長剤）０．１メチルパラベン（保存剤）
　　　　０．０５精製水　　　　９４．８５〜９９．７
５実施例　８ ０腔（頬）用バッチ サイクロフィリン　　　　　　０．１〜５％コール酸ナ
トリウム　　　　　　０．１メチルパラベン（保存剤）
　　　　０．０５ＰＥＧ４００　　　　　　　　　　３
．ＯＣａｒｂｏｐｏｌＴＭ９３４Ｐ　　　　　　　５．
ＯＫｌｕｃｅｌＴＭＥｌ’　　　　　　　　　８６．８
５〜９１．７５コール酸ナトリウムに加えて、またはそ
の代りに使用できるその他の可能な吸収助長剤には、タ
ウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、
デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸
ナトリウム、およびグリコデオキシコール酸ナトリウム
が包含される。

以上、本発明の詳細な説明したが、本発明はさらに次の
実施態様によってこれを要約して示すことができる。

１）慢性炎症性疾患またはその他の炎症を有する咄乳動
物または自己免疫疾患、組織移植片、または臓器または
骨髄移植片を有する哺乳動物に抗炎症的にまたは免疫調
節的に有効量のサイクロフィリンを投与することより成
る該哺乳動物の炎症軽減または免疫系調節方法。

２）抗炎症的にまたは免疫調節的に有効量のサイクロフ
ィリンと薬学的に適した担体とより本質的に成る静脈内
、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻内、局所または口腔（頬）
投与用の薬学的組成物。

３）等張水性溶液としてのサイクロフィリンより本質的
に成る静脈内、筋肉内、皮下または腹腔内投与用の前項
２）記載の薬学的組成物。

４）滅菌水で再構成して請求項３記載の薬学的組成物と
するのに適した滅菌バイアル中の凍結乾燥サイクロフィ
リン。

５）約１７ｋＤａの分子量を有し、少くとも約９５重量
％の純度を有し、そして１〜４２位にＶＮＰＴＶＰＦＤ
ＩＴＡＤＤＥＰＬＧＲＶＳＰＥＬＦＡＤＫＶＰＫＴＡＥ
ＮＦＲＡＬＳＴＧＥなるアミノ酸配列を有するサイクロ
スポリンＡ結合性ヒト細胞質ゾル性タンパク質または同
じアミノ酸配列および純度を有し、１位のバリンがアセ
チル化されているかまたはアセチル化メチオニル残基に
より先行されているブロックされたアナローブ。

６）少くとも約９５重量％の純度、および１位のＶがア
セチル化されているかまたはアセチル化メチオニル残基
により先行されている ＶＮＰＴＶｒ’ＦＤ　Ｉ　ＡＶＤＧＥＰＬＧＲＶＳＦＥ
ＬＰＡＤＫＶＰＫＴＡＥＮＰＲＡＬＳＴＧＥＫＧＦＧＹ
ＫＧＳＣＰＩＩＲＩ　Ｉ　ＰＧＦＭＣＱＧＧＤＰＴＲＩ
ＩＮＧＴＧＧＫＳ　Ｉ　ＹＧＥＫＦＥＤＥＮ　Ｐ　Ｉ　
ＬＫＩＩＴＧ　ＰＧ　Ｉ　ＬＳＭＡ　ＮＡＧＰＮＴＮＧ
ＳＱＰＰ　Ｉ　ＣＴＡＫＴＥＷＬＤＧＫＩ！ＶＶＦＧＫ
ＶＫＥＧＭＮＩＶＥＡＭＥＲＰＧＳＲＮＧＫＴＳＫＫＩ
ＴＩＡＤＣＧＱＬＥなるアミノ酸配列を有するアセチル
化されたサイクロスポリンＡ結合性ヒト細胞質ゾル性タ
ンパク質。

【図面の簡単な説明】

第１図は、既に報告されたウシ胸腺サイクロフィリンの
アミノ酸配列（ｌｌａｒｄｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、。 ５ｕｐｒａ）およびそれとＵ　−９３７細胞のサブクロ
ーンから単離されたサイクロフィリンのイソ型ＬＰ３（
後述）のアミノ酸配列の差を示す。アミノ酸に用いられ
た一文字および三文字記号は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、　
Ｂｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２ｎｄ　Ｅｄ、、ｐ、７
２゜Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｌｓｈｅｒｓ、　ＮＹ（１９
７５）。ウシサイクロフィリンのアミノ酸配列の下の線
は配列決定され、アミノ酸組成分析が行われたＬＰ３の
部分を示している。８３位のＤの下のＥは、アスパラギ
ン酸からグルタミン酸に変化したことを示している。 １６３位の工の下のＬは、イソロイシンからロイシンに
変化したことを示している。更にＬＰ３はカルボキシル
末端に付加的なアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）を有
している。従って、ＬＰ３のアミノ酸配列は、Ｈａｅｎ
ｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｕｐｒａ、に報告された
Ｊｕｒｋａｔ由来ヒトサイクロフィリンの推論された配
列に対応しているものと思われる。 第２図は、後述のＵ　−９３７のサブクローンから単離
されたＬＰ３およびその他のサイクロフィリンイソ型Ｌ
Ｐ５．ＬＰ６．ＬＰ３’、ＬＰ５’　およびＬＰ６’の
部分的なアミノ酸配列を示している。ＬＰ５は、アミノ
末端のバリン残基にアセチル基（Ａｃ　）を有している
点でＬＰ３と異なっている。ＬＰ６はアミノ末端でバリ
ンに先行するアセチル化メチオニル残基を有している点
でＬＰ３と異なっている。ＬＰ３’　は、それぞれｔｏ
、　ｔｔおよび１３位にアミノ酸、アラニン、バリンお
よびグリシンに代えてトレオニン、アラニンおよびアス
パラギン酸を有している点でＬＰ３と異なっている。Ｌ
Ｐ５’およびＬＰ６’　とＬＰ３’の差異はＬＰ５およ
びＬＰ６とＬＰ３の差異と同じであると考えられる。 第３図はＬＰ３’の最初の４２個のアミノ酸のアミノ酸
配列を示している。 第２図 ＬＰ３　　ＶａｌＡｓｎＰｒｏＴｈｒＶａＩＰｈｅＰｈ
ｅＡｓｐｌｌｅＡｌａＶａｌＡｓｐＧｌｙ−−−−ＬＰ
５　ＡｃＶａＩＡｓｎＰｒｏＴｈｒＶａｌＰｈｅＰｈｅ
ＡｓｐｌｌｅＡｌａＶａｌＡｓｐＧｌｙ−−−−ＬＰ５
　ＡｃＭｅｔＶａｌＡｓｎＰｒｏＴｈｒＶａｌＰｈｅＰ
ｈｅＡｓｐＨｅＡｌａＶａｌＡｓｐＧ１ｙ−ＬＰ３’　
　ＶａｌＡｓｎＰｒｏＴｈｒＶａｌＰｈｅＰｈｅＡｓｐ
［１ｅＴｈｒＡ１ａＡｓｐＡｓｐ−−−−ＬＰ５’　Ａ
ｃＶａｌＡｓｎＰｒｏＴｈｒＶａｌＰｈｅＰｈｅＡｓｐ
ＨｅＴｈｒＡ１ａＡｓｐＡｓｐ−−−−ＬＰ６’　Ａｃ
ＭｅｔＶａｌＡｓｎＰｒｏＴｈｒＶａｌＰｈｅＰｈｅＡ
ｓｐＨｅＴｈｒＡｌａＡｓｐＡｓｐ−−−−第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）抗炎症的にまたは免疫調節的に有効量のサイクロフ
   ィリンと薬学的に適した担体とより本質的に成る静脈内
   、筋肉内、皮下腹腔内、鼻内、局所または口腔（頬）投
   与用の薬学的組成物。 ２）約１７ｋＤａの分子量を有し、少くとも約９５重量
   ％の純度を有し、そして１−４２位に 【遺伝子配列があります】 なるアミノ酸配列を有するサイクロスポリンＡ結合性ヒ
   ト細胞質ゾル性タンパク質または同アミノ酸配列および
   純度を有し１位のバリンがアセチル化されているかまた
   はアセチル化メチオニル残基により先行されているブロ
   ックされたアナローグ。 ３）少くとも約９５重量％の純度、および１位のＶがア
   セチル化されているかまたはアセチル化メチオニル残基
   により先行されている 【遺伝子配列があります】 なるアミノ酸配列を有するアセチル化されたサイクロス
   ポリンＡ結合性ヒト細胞質ゾル性タンパク質。