JPH0122902B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、被検液中のヒト副甲状腺ホルモン
（ヒト−PTH）またはそのＣ末端フラグメントの
ラジオ・イミユノ・アツセイ（RIA）に関する。 詳しくは、下記一般式〔〕 R2−Ala46−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro51−Arg−Lys53−
Lys−Glu55−Asp−Asn−Val −Leu−Val60−Glu−Ser−His−Glu−Lys65−Ser−Le
u−Gly−Glu−Ala70−Asp−Lys −Ala−Asp−Val75−Asp−Val−Leu−Thr−Lys80−Al
a−Lys−Ser−Gln84−OH〔〕 （ただし式中、R2はＨまたはＨ−R3−基、R3は
CysまたはTyr基を示す）で表わされるペプチド
を用いてなるヒト−PTHまたはそのＣ末端フラ
グメントのRIAに関する。 ヒト−PTHは、84個のアミノ酸よりなるペプ
チドホルモンであり、近年このPTHのＣ末端側
の血中濃度を測定することがPTH関連疾患を診
断するに重要であると報告されている〔F.P.
DiBella et al；J.Cln.Endocrinol.Metab.、46(4)、
604（1978）〕。 そこで、本発明者らは、ヒト−PTHのＣ末端
側のフラグメントである32残基〔ｈ−PTH（53−
84）〕、34残基〔ｈ−PTH（51−84）〕、39残基〔ｈ
−PTH（46−84）〕、さらに〔Cys45〕−ｈ−PTH
（46−84）および〔Tyr45〕−ｈ−PTHを合成し
（特願昭55−187686号；特開昭57−126456号）、そ
のｈ−PTH（46−84）、〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−
84）、〔Tyr45〕−ｈ−PTH（46−84）により良好に
ヒト−PTHのＣ末端フラグメントに対する抗体
を用いたRIAに基いて定量をなし得ることを見い
出した。特に好ましくは〔Cys45〕−ｈ−PTH（46
−84）またはその蛋白質結合体、例えば牛血清ア
ルブミン（BSA）との結合体を抗原として得ら
れる特異的抗体を用い、かつ〔Tyr45〕−ｈ−
PTH（46−84）をラジオ・アイソトープにて標識
せしめた標識化合物を用いることにより、被検液
中のヒト−PTHまたはヒト−PTH Ｃ末端フラ
グメントを良好に定量し得ることを見い出した。
本発明は、上記の知見に基づいてなされたもの
で、ヒト−PTHまたはそのＣ末端フラグメント
を含有する被検波に、免疫反応媒体中、標識抗原
としてラジオ・アイソトープ標識したヒト−
PTHのＣ末端フラグメントおよび抗体として下
記一般式〔〕 R2−Ala−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro−Arg−Lys−Lys−G
lu−Asp−Asn−Val−Leu −Val−Glu−Ser−His−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−G
lu−Ala−Asp−Lys−Ala−Asp −Val−Asp−Val−Leu−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−G
ln−OH〔〕 （ただし式中、R2はＨまたはＨ−R3−基、R3は
Cys基を示す）で表わされるペプチドを用いてヒ
ト以外の哺乳動物に感作せしめて得られる特異的
抗体を反応せしめ、次いで反応によつて結合した
部分と結合していない遊離部とを分離し、その後
結合した部分または結合していない誘離部のラジ
オ・アイソトープの放射活性を測定することを特
徴とする被検液のヒト−PTHまたはそのＣ末端
フラグメントの測定法である。 まず本発明に用いられる一般式〔〕で表わさ
れるペプチドは、その式〔〕で示されるアミノ
酸順序に個々のアミノ酸または低級ペプチドを縮
合せしめ、縮合反応の最終段階で側鎖の官能基の
保護基を脱離することにより得られる。縮合順序
としては式〔〕で示されるアミノ酸配列であれ
ば、如何なる順序からでも合成し得るが、Ｃ−末
端側から合成するのが有利である。また合成する
に当つては、カルボジイミド法、アジド法、活性
エステル法や無水物法などの縮合方法を用いるこ
とが好ましく、さらに縮合の各段階ではラセミ化
が起らない方法またはラセミ化が最小になる方法
を用いるのが望ましく、好ましくはアジド法、活
性エステル法、Wu¨nseh法またはGeiger法、とり
わけ縮合剤としてＮ−エチル−N′−３−ジメチ
ルアミノプロピル−カルボジイミド（WSCI）を
用いる変法などが用いられる。また合成に当つて
は、ペプチド分野の合成技術に基いて、適宜使用
し得る保護基を用い、縮合を順次行なうもので、
ペプチド分野の合成技術がひろく用いられる。な
お合成の詳細に関しては、何んら限定するもので
はないが、特願昭55−187686号（特開昭57−
126456号公報）を参照されたい。 このようにして本発明におけるｈ−PTH（46−
84）、〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−84）、〔Thy45〕−
ｈ−PTH（46−84）の一般式〔〕で表わされる
ペプチド、および対照としてのｈ−PTH（53−
84）、ｈ−PTH（51−84）を得ればよい。 このようにして一般式で表わされるペプチド
（以下、ペプチド〔〕と略す）を用いてRIAに
基いてヒト−PTHまたはそのＣ末端・フラグメ
ントを測定するものであるが、まずそのPTH測
定のための用いるRIAの実施に必要な各試薬、例
えば抗血清、または抗体やラジオ・アイソトープ
標識体までを調整するのである。まずペプチド
〔〕を用いてその特異的抗体を得るに当つては、
ペプチド〔〕をそのまま、またはBSAまたは
そのアルカリ処理もしくはソジウムラウリルサル
フエートとメルカプトエタノール処理による分子
内ジスルフイド基を開裂せしめた処理物などの蛋
白質との結合体として用いて、種々の哺乳動物、
例えばウサギ、ラツト、モルモツトやマウスなど
に投与せしめて感作せしめればよく、例えば上記
のペプチド〔〕またはその蛋白質結合体をフロ
イント・コンプリート・アジユバントに乳化せし
め、これをモルモツトに皮下注射せしめ、２週間
隔で４〜７回投与することにより感作せしめ得る
もので、次いでこの目的とする抗体を産生した動
物より採血し、これを常法により遠心処理などを
行なつてその抗血清を得ればよい。またこの抗血
清は十分高濃度の特異的抗体を含有してなるもの
で、適宜そのまま保存してもよく、またそのまま
使用時に必要に応じて希釈して用いればよい。さ
らにこの抗血清は、塩析、等電点沈澱、透析、ク
ロマトグラフイー、ゲル渦手段などの常法によ
りその特異的抗体を得てもよい。 また上記の蛋白質との結合体を得るに当つて
は、多官能性試薬、例えばスクシンアルデヒド、
グルタルアルデヒド、アジポアルデヒドなどのア
ルデヒド化合物、ヘキサメチレンジイソシアナー
ト、２，４−トルエンジイソシアナートなどのジ
イソシアナート化合物や３−（2′−ベンゾチアゾ
リル−ジチオ）プロピオン酸スクシンイミドエス
テル（特願昭53−85900号（特開昭55−17302号公
報）参照）６−Ｎ〔３−（2′−ベンゾチアゾリル−
ジチオ）プロピオニル〕カプロン酸スクシンイミ
ドエステル、マレイミド安息香酸スクシンイミド
エステル、Ｎ，N′−エチレンビスマレイミド、
ビスジアゾベンジジン、ジエチルマロンイミデー
トなどが用いられ、これらの多官能性試薬は、用
いるペプチド〔〕および蛋白質の結合に関与す
るアミノ基、カルボキシル基やチオール基などの
官能基を考慮して選択使用すればよい。特に好ま
しくは、ペプチド〔〕として〔Cys45〕−ｈ−
PTH（46−84）を用い、かつ多官能性試薬として
３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオ
ン酸スクシンイミドエステルなどのチオール基と
良好に反応する試薬を用いて蛋白質を結合せしめ
ることにより、そのCys45の基のチオール基に基
いて良好なペプチド〔〕の蛋白質結合体が得ら
れる。 また結合せしめるに当つては、本発明のペプチ
ド〔〕と蛋白質、例えばBSAとの使用量とし
てはBSA1モル当りペプチド〔〕１〜10モル程
度である。さらに反応に当つては、例えばPH７〜
８の水性媒体にペプチド〔〕を必要量加え、次
いでこれに多官能性試薬を添加して通常冷却下〜
室温下にて１〜５時間反応せしめ、適宜これをゲ
ル過などの精製手段を用いて精製した後、これ
にBSAを加えて室温下１〜５時間反応せしめ、
反応後ゲル過、透析などの手段にて精製してペ
プチド〔〕とBSAなどの蛋白質との結合体を
得ればよい。さらに前記の特異的抗体は、必要に
応じて不溶性担体、例えばアルブミンやゼラチン
などの不溶性蛋白質担体、アガロース、セルロー
スやデキストリンなどのエピクロルヒドリン処理
や臭化シアン処理、さらにこれらのアミノ基導入
試薬処理してなる不溶性半合成高分子系担体、ア
クリロニトリル、アクリル酸、アクリル酸エステ
ル、メタアクリル酸、メタアクリル酸エステル、
ビニルアルコール、酢酸ビニル、アミノスチレ
ン、アクリルアミド、エチレンなどのポリマーま
たはコポリマーなどの不溶性高分子系担体を用い
て、前述の如くの多官能性化合物にて結合せしめ
た不溶化抗体として用いてもよい。 さらにまた測定に用いられるペプチド〔〕の
ラジオ・アイソトープ標識体を得るに当つては、
常法によるラジオ・アイソトープによる標識手段
を用いればよく、例えばペプチド〔〕に 125I
などのラジオ・アイソトープを加え、これにクロ
ラミンＴを加えて撹拌反応せしめ、次いでピロ亜
硫酸ソーダを加え、さらにヨウ化カリウムを加え
た後ゲル過などの精製手段により精製し、その
放射活性を有する目的の分画を回収すればよい。
またペプチド〔〕として〔Tyr45〕−ｈ−PTH
〔46−84〕を用いれば、ラジオ・アイソトープに
よる標識化が容易であり、かつ特に試験管などの
ガラス面への吸着が著しく少なく、従つて目的の
PTHの測定に際して測定精度が高くなり、好ま
しいものである。また標識化する際にはリン酸緩
衝液やベロナール緩衝液などの水性媒体を用いれ
ばよい。 次いで本発明を実施するに当たつてRIAの競争
法が用いられる。競争法に関して詳しく例示すれ
ば、まずヒト−PTHの含量を測定しようとする
試料、ペプチド〔〕のラジオ・アイソトープ標
識体およびペプチド〔〕を用いて得られた抗血
清または抗体を免疫反応媒体、例えばリン酸緩衝
液やベロナール緩衝液中にて４〜５℃程度にて約
１〜３日間インキユベイトし、次いで免疫結合し
た部分たる結合部(B)と結合していない遊離部(F)と
を分離するためのＢ−Ｆ分離を行なうもので、好
ましくは抗血清作成に用いた哺乳動物と同一動物
の正常血清およびその動物に対する抗血清を加え
て一夜インキユベイトし、その後3000rpm、20〜
30分程度にて遠心分離してＢ−Ｆ分離し、次いで
そのＢたる沈澱物の有するラジオ・アイソトープ
の放射能測定またはそのＦたる液層部の放射能測
定を行なえばよい。また固相法としては、上記競
争法におけるペプチド〔〕を用いて得られる抗
血清または抗体の代わりに不溶化抗体を用いて競
争反応を行なわせ、反応後そのＢ−Ｆ分離を行な
い、同様に放射能測定を行なえばよい。 このようにして、ペプチド〔〕を用いて得ら
れる抗体、およびペプチド〔〕のラジオ・アイ
ソトープ標識体を用いることにより、極めて正確
かつ簡便に試料中のヒト−PTHまたはそのＣ末
端−フラグメントの定量をなし得る優れた方法で
あるり、特に〔Tyr45〕−ｈ−PTH（46−84）のラ
ジオ・アイソトープ標識体は、その測定の際に、
用いるガラス容器などへの付着を生じ難いため、
測定時のブランク値が１％以下であり、特に好ま
しいものであつた。 次に本発明の実施例および参考例を挙げて詳し
く述べるが、本発明はこれらによつて何んら限定
されるものではない。 実施例 (1) 抗原について。 各参考例の如くして得られた、ｈ−PTH（53
−84）、ｈ−PTH（51−84）、ｈ−PTH（46−
84）、および下記の如くして得られたBSA−
〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−84）を抗原として用
いた。 なお、BSA−〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−84）
の作成は、次の通りである。 BSA50mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）１ml
に溶かし、これにEDTA・４ナトリウム塩４
mgを加えた。次いでこれに、500μｇの３−
（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン
酸スクシンイミドエステル含有ジメチルホルム
アミド溶液150μを加えて氷冷下60分間撹拌
反応せしめ、反応後これに〔Cys45〕−ｈ−
PTH（46−84）50mgを加えた。氷冷下で30分間
反応した後、PHを7.0に調整し、セフアデツク
スＧ−75〔0.15M NaClを含む0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.2）にて充填〕のカラム（径１cm×50
cm）でゲル過して、15mlから20mlの流出分画
を回収し、BSA−〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−
84）含有区分を得た〔BSA1分子当り、
〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−84）は平均11分子結
合〕。 (2) 抗体について 上記各抗原を用いて、500μｇ／mlの濃度の
0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）
を調整した。この溶液各々2.5mlづつ分取し、
フロイント・コンプリート・アジユバンド2.5
mlづつ加えて乳化し、各々５匹づつの雄モルモ
ツト背部に皮下注射して免疫した（２週間毎に
５回皮下注射）。次いでその最終免疫から２週
間目に、心臓より採血し、常法に従つて各抗原
に対する抗血清を得た。 なお以下、ｈ−PTH（53−84）に対する抗血
清は(A)と略し、ｈ−PTH（51−84）に対する抗
血清は(B)と略し、ｈ−PTH（46−84）に対する
抗血清は(C)と略し、BSA−〔Cys45〕−ｈ−
PTH（46−84）に対する抗血清は(D)と略す。 (3) 標識抗原について 0.5Mリン酸緩衝液（PH7.5）25μを、小試
験管にとり、 125I1mCiを加えた後、〔Tyr45〕−
ｈ−PTH（46−84）5μｇを加えた。さらにクロ
ラミンＴ〔2.5mg／mlの0.05Mリン酸緩衝液（PH
7.5）〕10μを加えて撹拌後、ピロ亜硫酸ソー
ダ〔2.5mg／ml水溶液〕25μを加え、さらに１
％ヨウ化カリウム水溶液10μ加え、次いでこ
れを、セフアデツクスＧ−25のカラム（径１cm
×20cm）〔あらかじめ２％BSA含有0.15M
NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）１mlを
流し、0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.2）で洗浄した〕でゲル過した。各分画
の放射能を測定し、5.5から7.5mlの流出分画を
集めて、 125Iにて標識した〔Tys45〕−ｈ−
PTH（46−84）含有区分を得た。本区分は、
0.5％BSA含有0.05Mベロナール緩衝液（PH7.5）
を希釈液として１分析当り約0.01μCi使用する。 (4) 測定法について 試料液100μ、0.01μCi、の放射活性を有す
る標識抗原100μ、免疫反応媒体200μおよ
び適宜希釈した抗血清100μを５℃で２日間
インキユベイトし、次いで200倍希釈したモル
モツト正常血清100μおよび抗モルモツトγ
−グロブリンウサギ血清（10倍希釈）100μ
を加えて一度反応せしめ、遠心分離
（3000rpm、20分）して沈澱を得、その沈澱物
をγ−カウンターによる放射能測定を行なつ
た。なお、免疫反応媒体としては0.5％BSA含
有0.05Mベロナール緩衝液（PH7.5）を用いた。 (5) 各抗血清の抗体力価について 測定法(4)における試料液の代りに、免疫反応
媒体100μを用い、抗血清として各Ａ・Ｂ・
Ｃ・Ｄの希釈液を用いて、以下測定法(4)と同様
に行なつて、用いた標準抗原の放射活性値
（Ｔ）に対する沈澱物の放射活性値(B)による抗
体力価（Ｂ／Ｔ）×100％を求めた。
（ヒト−PTH）またはそのＣ末端フラグメントの
ラジオ・イミユノ・アツセイ（RIA）に関する。 詳しくは、下記一般式〔〕 R2−Ala46−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro51−Arg−Lys53−
Lys−Glu55−Asp−Asn−Val −Leu−Val60−Glu−Ser−His−Glu−Lys65−Ser−Le
u−Gly−Glu−Ala70−Asp−Lys −Ala−Asp−Val75−Asp−Val−Leu−Thr−Lys80−Al
a−Lys−Ser−Gln84−OH〔〕 （ただし式中、R2はＨまたはＨ−R3−基、R3は
CysまたはTyr基を示す）で表わされるペプチド
を用いてなるヒト−PTHまたはそのＣ末端フラ
グメントのRIAに関する。 ヒト−PTHは、84個のアミノ酸よりなるペプ
チドホルモンであり、近年このPTHのＣ末端側
の血中濃度を測定することがPTH関連疾患を診
断するに重要であると報告されている〔F.P.
DiBella et al；J.Cln.Endocrinol.Metab.、46(4)、
604（1978）〕。 そこで、本発明者らは、ヒト−PTHのＣ末端
側のフラグメントである32残基〔ｈ−PTH（53−
84）〕、34残基〔ｈ−PTH（51−84）〕、39残基〔ｈ
−PTH（46−84）〕、さらに〔Cys45〕−ｈ−PTH
（46−84）および〔Tyr45〕−ｈ−PTHを合成し
（特願昭55−187686号；特開昭57−126456号）、そ
のｈ−PTH（46−84）、〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−
84）、〔Tyr45〕−ｈ−PTH（46−84）により良好に
ヒト−PTHのＣ末端フラグメントに対する抗体
を用いたRIAに基いて定量をなし得ることを見い
出した。特に好ましくは〔Cys45〕−ｈ−PTH（46
−84）またはその蛋白質結合体、例えば牛血清ア
ルブミン（BSA）との結合体を抗原として得ら
れる特異的抗体を用い、かつ〔Tyr45〕−ｈ−
PTH（46−84）をラジオ・アイソトープにて標識
せしめた標識化合物を用いることにより、被検液
中のヒト−PTHまたはヒト−PTH Ｃ末端フラ
グメントを良好に定量し得ることを見い出した。
本発明は、上記の知見に基づいてなされたもの
で、ヒト−PTHまたはそのＣ末端フラグメント
を含有する被検波に、免疫反応媒体中、標識抗原
としてラジオ・アイソトープ標識したヒト−
PTHのＣ末端フラグメントおよび抗体として下
記一般式〔〕 R2−Ala−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro−Arg−Lys−Lys−G
lu−Asp−Asn−Val−Leu −Val−Glu−Ser−His−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−G
lu−Ala−Asp−Lys−Ala−Asp −Val−Asp−Val−Leu−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−G
ln−OH〔〕 （ただし式中、R2はＨまたはＨ−R3−基、R3は
Cys基を示す）で表わされるペプチドを用いてヒ
ト以外の哺乳動物に感作せしめて得られる特異的
抗体を反応せしめ、次いで反応によつて結合した
部分と結合していない遊離部とを分離し、その後
結合した部分または結合していない誘離部のラジ
オ・アイソトープの放射活性を測定することを特
徴とする被検液のヒト−PTHまたはそのＣ末端
フラグメントの測定法である。 まず本発明に用いられる一般式〔〕で表わさ
れるペプチドは、その式〔〕で示されるアミノ
酸順序に個々のアミノ酸または低級ペプチドを縮
合せしめ、縮合反応の最終段階で側鎖の官能基の
保護基を脱離することにより得られる。縮合順序
としては式〔〕で示されるアミノ酸配列であれ
ば、如何なる順序からでも合成し得るが、Ｃ−末
端側から合成するのが有利である。また合成する
に当つては、カルボジイミド法、アジド法、活性
エステル法や無水物法などの縮合方法を用いるこ
とが好ましく、さらに縮合の各段階ではラセミ化
が起らない方法またはラセミ化が最小になる方法
を用いるのが望ましく、好ましくはアジド法、活
性エステル法、Wu¨nseh法またはGeiger法、とり
わけ縮合剤としてＮ−エチル−N′−３−ジメチ
ルアミノプロピル−カルボジイミド（WSCI）を
用いる変法などが用いられる。また合成に当つて
は、ペプチド分野の合成技術に基いて、適宜使用
し得る保護基を用い、縮合を順次行なうもので、
ペプチド分野の合成技術がひろく用いられる。な
お合成の詳細に関しては、何んら限定するもので
はないが、特願昭55−187686号（特開昭57−
126456号公報）を参照されたい。 このようにして本発明におけるｈ−PTH（46−
84）、〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−84）、〔Thy45〕−
ｈ−PTH（46−84）の一般式〔〕で表わされる
ペプチド、および対照としてのｈ−PTH（53−
84）、ｈ−PTH（51−84）を得ればよい。 このようにして一般式で表わされるペプチド
（以下、ペプチド〔〕と略す）を用いてRIAに
基いてヒト−PTHまたはそのＣ末端・フラグメ
ントを測定するものであるが、まずそのPTH測
定のための用いるRIAの実施に必要な各試薬、例
えば抗血清、または抗体やラジオ・アイソトープ
標識体までを調整するのである。まずペプチド
〔〕を用いてその特異的抗体を得るに当つては、
ペプチド〔〕をそのまま、またはBSAまたは
そのアルカリ処理もしくはソジウムラウリルサル
フエートとメルカプトエタノール処理による分子
内ジスルフイド基を開裂せしめた処理物などの蛋
白質との結合体として用いて、種々の哺乳動物、
例えばウサギ、ラツト、モルモツトやマウスなど
に投与せしめて感作せしめればよく、例えば上記
のペプチド〔〕またはその蛋白質結合体をフロ
イント・コンプリート・アジユバントに乳化せし
め、これをモルモツトに皮下注射せしめ、２週間
隔で４〜７回投与することにより感作せしめ得る
もので、次いでこの目的とする抗体を産生した動
物より採血し、これを常法により遠心処理などを
行なつてその抗血清を得ればよい。またこの抗血
清は十分高濃度の特異的抗体を含有してなるもの
で、適宜そのまま保存してもよく、またそのまま
使用時に必要に応じて希釈して用いればよい。さ
らにこの抗血清は、塩析、等電点沈澱、透析、ク
ロマトグラフイー、ゲル渦手段などの常法によ
りその特異的抗体を得てもよい。 また上記の蛋白質との結合体を得るに当つて
は、多官能性試薬、例えばスクシンアルデヒド、
グルタルアルデヒド、アジポアルデヒドなどのア
ルデヒド化合物、ヘキサメチレンジイソシアナー
ト、２，４−トルエンジイソシアナートなどのジ
イソシアナート化合物や３−（2′−ベンゾチアゾ
リル−ジチオ）プロピオン酸スクシンイミドエス
テル（特願昭53−85900号（特開昭55−17302号公
報）参照）６−Ｎ〔３−（2′−ベンゾチアゾリル−
ジチオ）プロピオニル〕カプロン酸スクシンイミ
ドエステル、マレイミド安息香酸スクシンイミド
エステル、Ｎ，N′−エチレンビスマレイミド、
ビスジアゾベンジジン、ジエチルマロンイミデー
トなどが用いられ、これらの多官能性試薬は、用
いるペプチド〔〕および蛋白質の結合に関与す
るアミノ基、カルボキシル基やチオール基などの
官能基を考慮して選択使用すればよい。特に好ま
しくは、ペプチド〔〕として〔Cys45〕−ｈ−
PTH（46−84）を用い、かつ多官能性試薬として
３−（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオ
ン酸スクシンイミドエステルなどのチオール基と
良好に反応する試薬を用いて蛋白質を結合せしめ
ることにより、そのCys45の基のチオール基に基
いて良好なペプチド〔〕の蛋白質結合体が得ら
れる。 また結合せしめるに当つては、本発明のペプチ
ド〔〕と蛋白質、例えばBSAとの使用量とし
てはBSA1モル当りペプチド〔〕１〜10モル程
度である。さらに反応に当つては、例えばPH７〜
８の水性媒体にペプチド〔〕を必要量加え、次
いでこれに多官能性試薬を添加して通常冷却下〜
室温下にて１〜５時間反応せしめ、適宜これをゲ
ル過などの精製手段を用いて精製した後、これ
にBSAを加えて室温下１〜５時間反応せしめ、
反応後ゲル過、透析などの手段にて精製してペ
プチド〔〕とBSAなどの蛋白質との結合体を
得ればよい。さらに前記の特異的抗体は、必要に
応じて不溶性担体、例えばアルブミンやゼラチン
などの不溶性蛋白質担体、アガロース、セルロー
スやデキストリンなどのエピクロルヒドリン処理
や臭化シアン処理、さらにこれらのアミノ基導入
試薬処理してなる不溶性半合成高分子系担体、ア
クリロニトリル、アクリル酸、アクリル酸エステ
ル、メタアクリル酸、メタアクリル酸エステル、
ビニルアルコール、酢酸ビニル、アミノスチレ
ン、アクリルアミド、エチレンなどのポリマーま
たはコポリマーなどの不溶性高分子系担体を用い
て、前述の如くの多官能性化合物にて結合せしめ
た不溶化抗体として用いてもよい。 さらにまた測定に用いられるペプチド〔〕の
ラジオ・アイソトープ標識体を得るに当つては、
常法によるラジオ・アイソトープによる標識手段
を用いればよく、例えばペプチド〔〕に 125I
などのラジオ・アイソトープを加え、これにクロ
ラミンＴを加えて撹拌反応せしめ、次いでピロ亜
硫酸ソーダを加え、さらにヨウ化カリウムを加え
た後ゲル過などの精製手段により精製し、その
放射活性を有する目的の分画を回収すればよい。
またペプチド〔〕として〔Tyr45〕−ｈ−PTH
〔46−84〕を用いれば、ラジオ・アイソトープに
よる標識化が容易であり、かつ特に試験管などの
ガラス面への吸着が著しく少なく、従つて目的の
PTHの測定に際して測定精度が高くなり、好ま
しいものである。また標識化する際にはリン酸緩
衝液やベロナール緩衝液などの水性媒体を用いれ
ばよい。 次いで本発明を実施するに当たつてRIAの競争
法が用いられる。競争法に関して詳しく例示すれ
ば、まずヒト−PTHの含量を測定しようとする
試料、ペプチド〔〕のラジオ・アイソトープ標
識体およびペプチド〔〕を用いて得られた抗血
清または抗体を免疫反応媒体、例えばリン酸緩衝
液やベロナール緩衝液中にて４〜５℃程度にて約
１〜３日間インキユベイトし、次いで免疫結合し
た部分たる結合部(B)と結合していない遊離部(F)と
を分離するためのＢ−Ｆ分離を行なうもので、好
ましくは抗血清作成に用いた哺乳動物と同一動物
の正常血清およびその動物に対する抗血清を加え
て一夜インキユベイトし、その後3000rpm、20〜
30分程度にて遠心分離してＢ−Ｆ分離し、次いで
そのＢたる沈澱物の有するラジオ・アイソトープ
の放射能測定またはそのＦたる液層部の放射能測
定を行なえばよい。また固相法としては、上記競
争法におけるペプチド〔〕を用いて得られる抗
血清または抗体の代わりに不溶化抗体を用いて競
争反応を行なわせ、反応後そのＢ−Ｆ分離を行な
い、同様に放射能測定を行なえばよい。 このようにして、ペプチド〔〕を用いて得ら
れる抗体、およびペプチド〔〕のラジオ・アイ
ソトープ標識体を用いることにより、極めて正確
かつ簡便に試料中のヒト−PTHまたはそのＣ末
端−フラグメントの定量をなし得る優れた方法で
あるり、特に〔Tyr45〕−ｈ−PTH（46−84）のラ
ジオ・アイソトープ標識体は、その測定の際に、
用いるガラス容器などへの付着を生じ難いため、
測定時のブランク値が１％以下であり、特に好ま
しいものであつた。 次に本発明の実施例および参考例を挙げて詳し
く述べるが、本発明はこれらによつて何んら限定
されるものではない。 実施例 (1) 抗原について。 各参考例の如くして得られた、ｈ−PTH（53
−84）、ｈ−PTH（51−84）、ｈ−PTH（46−
84）、および下記の如くして得られたBSA−
〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−84）を抗原として用
いた。 なお、BSA−〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−84）
の作成は、次の通りである。 BSA50mgを0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0）１ml
に溶かし、これにEDTA・４ナトリウム塩４
mgを加えた。次いでこれに、500μｇの３−
（2′−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン
酸スクシンイミドエステル含有ジメチルホルム
アミド溶液150μを加えて氷冷下60分間撹拌
反応せしめ、反応後これに〔Cys45〕−ｈ−
PTH（46−84）50mgを加えた。氷冷下で30分間
反応した後、PHを7.0に調整し、セフアデツク
スＧ−75〔0.15M NaClを含む0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.2）にて充填〕のカラム（径１cm×50
cm）でゲル過して、15mlから20mlの流出分画
を回収し、BSA−〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−
84）含有区分を得た〔BSA1分子当り、
〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−84）は平均11分子結
合〕。 (2) 抗体について 上記各抗原を用いて、500μｇ／mlの濃度の
0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）
を調整した。この溶液各々2.5mlづつ分取し、
フロイント・コンプリート・アジユバンド2.5
mlづつ加えて乳化し、各々５匹づつの雄モルモ
ツト背部に皮下注射して免疫した（２週間毎に
５回皮下注射）。次いでその最終免疫から２週
間目に、心臓より採血し、常法に従つて各抗原
に対する抗血清を得た。 なお以下、ｈ−PTH（53−84）に対する抗血
清は(A)と略し、ｈ−PTH（51−84）に対する抗
血清は(B)と略し、ｈ−PTH（46−84）に対する
抗血清は(C)と略し、BSA−〔Cys45〕−ｈ−
PTH（46−84）に対する抗血清は(D)と略す。 (3) 標識抗原について 0.5Mリン酸緩衝液（PH7.5）25μを、小試
験管にとり、 125I1mCiを加えた後、〔Tyr45〕−
ｈ−PTH（46−84）5μｇを加えた。さらにクロ
ラミンＴ〔2.5mg／mlの0.05Mリン酸緩衝液（PH
7.5）〕10μを加えて撹拌後、ピロ亜硫酸ソー
ダ〔2.5mg／ml水溶液〕25μを加え、さらに１
％ヨウ化カリウム水溶液10μ加え、次いでこ
れを、セフアデツクスＧ−25のカラム（径１cm
×20cm）〔あらかじめ２％BSA含有0.15M
NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH7.2）１mlを
流し、0.15M NaCl含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.2）で洗浄した〕でゲル過した。各分画
の放射能を測定し、5.5から7.5mlの流出分画を
集めて、 125Iにて標識した〔Tys45〕−ｈ−
PTH（46−84）含有区分を得た。本区分は、
0.5％BSA含有0.05Mベロナール緩衝液（PH7.5）
を希釈液として１分析当り約0.01μCi使用する。 (4) 測定法について 試料液100μ、0.01μCi、の放射活性を有す
る標識抗原100μ、免疫反応媒体200μおよ
び適宜希釈した抗血清100μを５℃で２日間
インキユベイトし、次いで200倍希釈したモル
モツト正常血清100μおよび抗モルモツトγ
−グロブリンウサギ血清（10倍希釈）100μ
を加えて一度反応せしめ、遠心分離
（3000rpm、20分）して沈澱を得、その沈澱物
をγ−カウンターによる放射能測定を行なつ
た。なお、免疫反応媒体としては0.5％BSA含
有0.05Mベロナール緩衝液（PH7.5）を用いた。 (5) 各抗血清の抗体力価について 測定法(4)における試料液の代りに、免疫反応
媒体100μを用い、抗血清として各Ａ・Ｂ・
Ｃ・Ｄの希釈液を用いて、以下測定法(4)と同様
に行なつて、用いた標準抗原の放射活性値
（Ｔ）に対する沈澱物の放射活性値(B)による抗
体力価（Ｂ／Ｔ）×100％を求めた。
【表】
【表】
(6) 各抗血清の標準曲線について
上記抗血清において、Ａ−４、Ｂ−５、Ｃ−
３およびＤ−２の各抗血清を用いて、その標準
曲線を求めた。 またＡ−４における標準曲線に関して、その
抗血清たるＡ−４は最終希釈3000倍で使用し、
また標準物質としてｈ−PTH（53−84）（第１
図中、〇−〇）、ｈ−PTH（51−84）（第１図
中、△−△）、ｈ−PTH（46−84）（第１図中、
×−×）を用い、 125Iにて標識した〔Tyr45〕
−ｈ−PTH（46−84）を用いて、測定法(4)に従
つて、その標準曲線を求めた。その結果、第１
図に示す通りであつた。 さらにＢ−５における標準曲線に関して、そ
の抗血清たるＢ−５は最終希釈2000倍で使用
し、また標準物質としてｈ−PTH（53−84）
（第２図中、〇−〇）、ｈ−PTH（51−84）（第
２図中、△−△）、ｈ−PTH（46−84）（第２図
中、×−×）を用い、以下、上記と同様にして
測定してその標準曲線を求めた。その結果は第
２図に示す通りであつた。 さらにまたＣ−３における標準曲線に関し
て、その抗血清たるＣ−３は最終希釈8000倍で
使用し、また標準物質としてｈ−PTH（53−
84）（第３図中、〇−〇）、ｈ−PTH（51−84）
（第３図中、△−△）、ｈ−PTH（46−84）（第
３図中、×−×）を用い、以下上記と同様にし
て測定し、その標準曲線を求めた。その結果は
第３図に示す通りであつた。 さらにＤ−２における標準曲線に関して、そ
の抗血清たるＤ−２は最終希釈10000倍で使用
し、標準物質としてｈ−PTH（53−84）（第４
図中、〇−〇）を用い、以下上記と同様にして
測定し、その標準曲線を求めた。その結果は第
４図に示す通りであつた。 さらにまたＣ−３において、その抗血清たる
Ｃ−３は最終希釈8000倍の場合のものを用い、
また標準物質としてヒト−PTH（１−84）（第
５図中、▲−▲）を用い、以下上記と同様にし
て測定し、その標準曲線を求めた。その結果は
第５図に示す通りであつた。 以上の各結果より明らかな通り、各抗血清
中、ｈ−PTH（46−84）、BSA−〔Cys45〕−ｈ
−PTH（46−84）を抗原として得られた抗血清
は極めて良好な標準曲線を与える良好なもので
あつた。 (7) 標準曲線と慢性腎不全患者血清との比較につ
いて 抗血清としてＣ−２の最終希釈4000倍を用
い、標準物質としてｈ−PTH（53−84）を用い
て、前記と同様に測定して、その標準曲線（第
６図の〇−〇：100％値はBo／Ｔ48.5％である） を得た。また慢性覧不全患者血清の希釈液を試
料液とし、同一抗血清を用いて、測定法(4)に従
つて反応せしめ、その反応によつて生じる沈澱
物を回収し、その放射活性を求め、各試料液に
対するＢ／Boを求め、各値を第６図の▲にてプロ ツトし、曲線を求めた。 その結果、試料液と標準曲線とは極めて良好
なパラレル関係を示すものであつた。 (8) 各血清における測定について 正常者血清、および甲状腺機能亢進症（続発
性甲状腺機能亢進症、原発性甲状腺機能亢進
症）患者血清を試料液として測定法(4)に従つて
測定した。なお用いた抗血清としてはＤ−２の
最終希釈10000倍のものを用いた。 その結果、第７図に示す通りで、正常者血清
濃度を甲状腺機能亢進症患者血清濃度とにおい
て、明らかに差異が認められたものであつた。 参考例 １ ｈ−PTH（53−84）；Ｈ−Lys−Lys−Glu−
Asp−Asn−Val−Leu−Val−Glu−Ser−His
−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−Glu−Ala−
Asp−Lys−Ala−Asp−Val−Asp−Val−Leu
−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−Gln−OHの製
造例。 (1) BOC−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu
（OBzl）−Asp（OBzl）−Asn−Val−Leu−Val
−Glu（OBzl）−Ser（Bzl）−His−Glu（OBzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Leu−Gly−Glu−
（OBzl）−Ala−Asp（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−
Ala−Asp（OBzl）−Val−Asp（OBzl）−Val−
Leu−Thr（Bzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ
−Cl）−Ser（Bzl）−Gln−OBzl〔35〕〔アミノ酸
分析；Thr0.92(1)Ser1.60(3)、Glu4.06(5)、
Gly0.85(1)、Ala3.00(3)、Val3.33(4)、Leu2.48
(3)、Lys5.41(6)、His0.70(1)〕3.49ｇ（0.6ｍＭ）
およびアニソール３mlを無水弗化水素（HF）
25mlに０℃に冷却下加え、75分間撹拌した。反
応後、HFを減圧下留去し、残渣にエーテルを
加えた。生じた沈澱物を回収し、0.1N酢酸50
mlに溶かし、ダウエツクス×１のカラム（2.7
×35cm）に通した。流出液を凍結乾燥して粗生
成物2.18ｇを得た。これを8M尿素水溶液50ml
に溶かし、アンモニア水でPH9.5に調節した後、
50分間放置した。次いでこの溶液を8M尿素水
溶液で充填したCM−セルロースのカラム（4.4
×12cm）にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウ
ム水溶液（PH4.5）約100mlで流出した後、
0.01M酢酸アンモニウム水溶液（PH4.5）700ml
〜0.1M酢酸アンモニウム水溶液（PH4.5）700
mlの直線型濃度勾配による溶出を行い、次いで
0.2M酢酸アンモニウム水溶液（PH4.5）300ml
で溶出した。溶出液は、13.5mlづつ分画し、各
分画はFolin−Lowry法（500nｍ）により測定
して30〜50本目の区分C1、56〜119本目の区分
C2および120〜150本目の区分C3の溶出液を得
た。 各区分をセフアデツクスLH−20のカラムに
通して脱塩した。流出液は8.5mlづつ分画し、
各分画は上記と同じ方法で測定した。区分C1
は3.4×113cmのカラムに通し、31〜40本目の区
分L1、41〜44本目の区分L2および45〜54本目
の区分L3を得た。区分C2は3.4×120cmのカラム
に通し、35〜45本目の区分L1、46〜52本目の
区分L2および53〜60本目の区分L3を得た。区
分C3は3.4×120cmのカラムに通し、31〜44本目
の区分L1および45〜52本目の区分L2を得た。
各区分を凍結乾燥して、次の各成分を得た。
３およびＤ−２の各抗血清を用いて、その標準
曲線を求めた。 またＡ−４における標準曲線に関して、その
抗血清たるＡ−４は最終希釈3000倍で使用し、
また標準物質としてｈ−PTH（53−84）（第１
図中、〇−〇）、ｈ−PTH（51−84）（第１図
中、△−△）、ｈ−PTH（46−84）（第１図中、
×−×）を用い、 125Iにて標識した〔Tyr45〕
−ｈ−PTH（46−84）を用いて、測定法(4)に従
つて、その標準曲線を求めた。その結果、第１
図に示す通りであつた。 さらにＢ−５における標準曲線に関して、そ
の抗血清たるＢ−５は最終希釈2000倍で使用
し、また標準物質としてｈ−PTH（53−84）
（第２図中、〇−〇）、ｈ−PTH（51−84）（第
２図中、△−△）、ｈ−PTH（46−84）（第２図
中、×−×）を用い、以下、上記と同様にして
測定してその標準曲線を求めた。その結果は第
２図に示す通りであつた。 さらにまたＣ−３における標準曲線に関し
て、その抗血清たるＣ−３は最終希釈8000倍で
使用し、また標準物質としてｈ−PTH（53−
84）（第３図中、〇−〇）、ｈ−PTH（51−84）
（第３図中、△−△）、ｈ−PTH（46−84）（第
３図中、×−×）を用い、以下上記と同様にし
て測定し、その標準曲線を求めた。その結果は
第３図に示す通りであつた。 さらにＤ−２における標準曲線に関して、そ
の抗血清たるＤ−２は最終希釈10000倍で使用
し、標準物質としてｈ−PTH（53−84）（第４
図中、〇−〇）を用い、以下上記と同様にして
測定し、その標準曲線を求めた。その結果は第
４図に示す通りであつた。 さらにまたＣ−３において、その抗血清たる
Ｃ−３は最終希釈8000倍の場合のものを用い、
また標準物質としてヒト−PTH（１−84）（第
５図中、▲−▲）を用い、以下上記と同様にし
て測定し、その標準曲線を求めた。その結果は
第５図に示す通りであつた。 以上の各結果より明らかな通り、各抗血清
中、ｈ−PTH（46−84）、BSA−〔Cys45〕−ｈ
−PTH（46−84）を抗原として得られた抗血清
は極めて良好な標準曲線を与える良好なもので
あつた。 (7) 標準曲線と慢性腎不全患者血清との比較につ
いて 抗血清としてＣ−２の最終希釈4000倍を用
い、標準物質としてｈ−PTH（53−84）を用い
て、前記と同様に測定して、その標準曲線（第
６図の〇−〇：100％値はBo／Ｔ48.5％である） を得た。また慢性覧不全患者血清の希釈液を試
料液とし、同一抗血清を用いて、測定法(4)に従
つて反応せしめ、その反応によつて生じる沈澱
物を回収し、その放射活性を求め、各試料液に
対するＢ／Boを求め、各値を第６図の▲にてプロ ツトし、曲線を求めた。 その結果、試料液と標準曲線とは極めて良好
なパラレル関係を示すものであつた。 (8) 各血清における測定について 正常者血清、および甲状腺機能亢進症（続発
性甲状腺機能亢進症、原発性甲状腺機能亢進
症）患者血清を試料液として測定法(4)に従つて
測定した。なお用いた抗血清としてはＤ−２の
最終希釈10000倍のものを用いた。 その結果、第７図に示す通りで、正常者血清
濃度を甲状腺機能亢進症患者血清濃度とにおい
て、明らかに差異が認められたものであつた。 参考例 １ ｈ−PTH（53−84）；Ｈ−Lys−Lys−Glu−
Asp−Asn−Val−Leu−Val−Glu−Ser−His
−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−Glu−Ala−
Asp−Lys−Ala−Asp−Val−Asp−Val−Leu
−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−Gln−OHの製
造例。 (1) BOC−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu
（OBzl）−Asp（OBzl）−Asn−Val−Leu−Val
−Glu（OBzl）−Ser（Bzl）−His−Glu（OBzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Leu−Gly−Glu−
（OBzl）−Ala−Asp（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−
Ala−Asp（OBzl）−Val−Asp（OBzl）−Val−
Leu−Thr（Bzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ
−Cl）−Ser（Bzl）−Gln−OBzl〔35〕〔アミノ酸
分析；Thr0.92(1)Ser1.60(3)、Glu4.06(5)、
Gly0.85(1)、Ala3.00(3)、Val3.33(4)、Leu2.48
(3)、Lys5.41(6)、His0.70(1)〕3.49ｇ（0.6ｍＭ）
およびアニソール３mlを無水弗化水素（HF）
25mlに０℃に冷却下加え、75分間撹拌した。反
応後、HFを減圧下留去し、残渣にエーテルを
加えた。生じた沈澱物を回収し、0.1N酢酸50
mlに溶かし、ダウエツクス×１のカラム（2.7
×35cm）に通した。流出液を凍結乾燥して粗生
成物2.18ｇを得た。これを8M尿素水溶液50ml
に溶かし、アンモニア水でPH9.5に調節した後、
50分間放置した。次いでこの溶液を8M尿素水
溶液で充填したCM−セルロースのカラム（4.4
×12cm）にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウ
ム水溶液（PH4.5）約100mlで流出した後、
0.01M酢酸アンモニウム水溶液（PH4.5）700ml
〜0.1M酢酸アンモニウム水溶液（PH4.5）700
mlの直線型濃度勾配による溶出を行い、次いで
0.2M酢酸アンモニウム水溶液（PH4.5）300ml
で溶出した。溶出液は、13.5mlづつ分画し、各
分画はFolin−Lowry法（500nｍ）により測定
して30〜50本目の区分C1、56〜119本目の区分
C2および120〜150本目の区分C3の溶出液を得
た。 各区分をセフアデツクスLH−20のカラムに
通して脱塩した。流出液は8.5mlづつ分画し、
各分画は上記と同じ方法で測定した。区分C1
は3.4×113cmのカラムに通し、31〜40本目の区
分L1、41〜44本目の区分L2および45〜54本目
の区分L3を得た。区分C2は3.4×120cmのカラム
に通し、35〜45本目の区分L1、46〜52本目の
区分L2および53〜60本目の区分L3を得た。区
分C3は3.4×120cmのカラムに通し、31〜44本目
の区分L1および45〜52本目の区分L2を得た。
各区分を凍結乾燥して、次の各成分を得た。
【表】
(2) C2L2の精製
前記のC2L2565mgを0.1N酢酸５mlに溶かし、
CM−セルロースのカラム（4.4×70cm）にチヤ
ージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液（PH
4.5）500ml〜0.1M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）500mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は6.0mlづつ分画し、各分画は
Folin−Lowry法により測定して113〜136本目
の区分C2L2−C1、137〜151本目の区分C2L2−
C2および152〜190本目の区分C2L2−C3を得た。 各区分をセフアデツクスLH−20のカラムに
通して脱塩した。流出液は5.2mlづつ分画し、
各分画は上記と同じ方法で測定した。区分
C2L2−C1は3.4×120cmのカラムに通し、55〜72
本目の区分C2L2−C1L1および73〜80本目の区
分C2L2−C1L2を得た。区分C2L2−C2は3.4×
110cmのカラムに通し、50〜59本目の区分C2L2
−C2L1および60〜67本目の区分C2L2−C2L2を
得た。区分C2L2−C3は3.4×110cmのカラムに通
し、45〜60本目の区分のC2L2−C3L1および61
〜72本目の区分C2L2−C3L2を得た。各区分を
凍結乾燥して、次の各成分を得た。 C2L2−C1L1 108.7mg C2L2−C1L2 95.9mg C2L2−C2L1 53.6mg C2L2−C2L2 44.1mg C2L2−C3L1 97.0mg C2L2−C3L2 95.1mg (3) C2L2−C1L1の精製 前記のC2L2−C1L1を0.1N酢酸１mlに溶かし、
CM−セルロースのカラム（2.0×15cm）にチヤ
ージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液（PH
4.5）300ml〜0.1M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）300mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は7.4mlづつ分画し、各分画は
Folin−Lowry法（500nｍ）により測定して46
〜56本目の区分C2L2−C1L1−Ｃを得た。これ
を減圧濃縮し、セフアデツクスLH−20のカラ
ム（3.0×90cm）にチヤージし、0.1N酢酸で溶
出した。溶出液は6.0mlづつ分画し、上記と同
じ方法で測定して25〜35本目の区分C2L2−
C1L1−CLを得た。これを凍結乾燥してｈ−
PTH（53−84）90.0mgを得た。 TLC；R9＝0.76 １スポツト アミノ酸分析；Asp4.45(5)、Thr0.92(1)、
Ser2.16(3)、Glu4.94(5)、Gly0.96(1)、Ala3、
Val3.96(4)、Leu2.92(3)、Lys6.22(6)、His1.01
(1) 参考例 ２ ｈ−PTH（51−84）；Ｈ−Pro−Arg−Lys−
Lys−Glu−Asp−Asn−Val−Leu−Val−Glu
−Ser−His−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−
Glu−Ala−Asp−Lys−Ala−Asp−Val−Asp
−Val−Leu−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−
Gln−OHの製造例。 (1) Ｐ（52−54）；AOC−Arg（Tos）−Lys（Ｚ−
Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC〔36〕について。 BOC−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC
〔33〕（融点72〜75℃、元素分析値
〔C41H50O10N4Cl2として、Ｃ＝59.22％、Ｈ＝
5.98％、Ｎ＝6.81％）14.65ｇ（18ｍＭ）に
TFA50mlを加え、室温で30分間撹拌した。反
応後、TFAを減圧下留去し、残渣にエーテル
を加えた。生じた沈澱物を集め、DMF10mlに
溶かし、これにAOC−Arg（Tos）−OH9.19ｇ
（1.2倍Ｍ）−HOBT2.92ｇ（1.2倍Ｍ）および
WSCI3.95ml（1.2倍Ｍ）を加え、室温で一夜撹
拌した。反応後、DMFを減圧下留去し、残渣
を酢酸エチル300mlに溶かした後、５％重曹水、
1N塩酸、水の順に各々３回づつ洗浄した。酢
酸エチル層を無水芒硝で乾燥後、減圧乾固し、
酢酸エチル−エーテルより再結晶して〔36〕
14.46ｇ（収率69.6％）を得た。 融点；79〜82℃ TLC；Rf7＝0.76 元素分析〔C55H70O13N8SClとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 57.06 6.26 9.82 計算値 57.23 6.11 9.71 (2) Ｐ（51−54）；BOC−Pro−Arg（Tos）−Lys
（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC〔37〕について。 〔36〕14.43ｇ（12.5ｍＭ）にTFA40mlを加
え、室温で20分間撹拌した。反応後、TFAを
減圧下留去し、残渣にエーテルを加え、生じた
沈澱物を集め、DMF80mlに溶した。これに
HOBT2.03ｇ（1.2倍Ｍ）、BOC−Pro−
OH3.23ｇ（1.2倍Ｍ）およびWSCI2.75ml（1.2
倍Ｍ）を加え、室温で一夜撹拌した。反応後、
DMFを減圧下留去し、残渣を酢酸エチル300ml
に溶かした後、５％重曹水、1N塩酸水の順に
洗浄した。酢酸エチル層を無水芒硝で乾燥後、
減圧乾固し、残渣を酢酸エチル−エーテルより
２回再結晶して〔37〕14.71ｇ（収率95.1％）
を得た。 融点；90〜93℃ TLC；Rf7＝0.64 元素分析〔C59H75O14N9SCl2として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 57.33 6.20 9.79 計算値 57.27 6.11 10.19 (3) Ｐ（51−84）；BOC−Pro−Arg（Tos）−Lys
（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−OH〔38〕について。 亜鉛末20ｇ／酢酸30mlに〔37〕6.19ｇ（５ｍ
Ｍ）を酢酸40mlに溶かした溶液を加え、室温で
２時間撹拌した。反応後、亜鉛末を別し、
液を減圧濃縮し、残渣に５％重曹水とエーテル
を加えて抽出し、分離した水層を1N塩酸でPH
２に調節した後、酢酸エチルで抽出した。酢酸
エチル層を水で３回洗浄し、無水芒硝で乾燥
後、減圧乾固し、残渣を酢酸エチル−エーテル
より再結晶して〔38〕5.40ｇ（収率96.5％）を
得た。 融点；110〜113℃ TLC；Rf4＝0.43 元素分析〔C51H69O13N9SCl2として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 54.56 6.46 11.22 計算値 54.73 6.21 11.27 (4) Ｐ（51−84）；BOC−Pro−Arg（Tos）−Lys
（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu（OBzl）−Asp
（OBzl）−Asn−Val−Leu−Val−Glu（OBzl）
−Ser（Bzl）−His−Glu（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）
−Ser（Bzl）−Leu−Gly−Glu（OBzl）−Ala−
Asp（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Asp（OBzl）
−Val−Asp（OBzl）−Val−Leu−Thr（Bzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）
−Gln−OBzl〔39〕について。 BOC−Glu（OBzl）−Asp（OBzl）−Asn−Val
−Leu−Val−Glu（OBzl）−Ser（Bzl）−His−
Glu（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Leu−
Gly−Glu（OBzl）−Ala−Asp（OBzl）−Lys（Ｚ
−Cl）−Ala−Asp（OBzl）−Val−Asp（OBzl）
−Val−Leu−Thr（Bzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala
−Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Gln−OBzl〔32〕
〔アミノ酸分析；Asp4.11(5)、Thr0.92(1)、
Ser1.59(3)、Glu3.99(5)、Gly0.83(1)、Ala3、
Val3.28(4)、Leu2.49(3)、Lys4.08(4)、His0.71
(1)〕7.83ｇ（1.5ｍＭ）にTFA50mlを加え、室
温で60分間撹拌し、反応後、TFAを減圧下留
去し、残渣にエーテルを加えた。生じた沈澱物
を集め、DMF120mlとNMP120mlを加えて溶し
た。これにHOBT0.30ｇ（1.5倍Ｍ）、〔38〕2.52
ｇ（1.5倍Ｍ）およびWSCI0.41ml（1.5倍Ｍ）を
加え、室温で２日間撹拌し、反応液を氷水に加
え、生じた沈澱物を水洗後、メタノールを加え
て加熱処理した。冷却後不溶物を集め、上記の
加熱処理を２回繰り返した後、エーテルで洗浄
して〔39〕8.20ｇ（収率87.9％）を得た。 アミノ酸分析；Asp4.09(5)、Thr1.05(1)、
Ser2.30(3)、Glu4.08(5)、Pro0.52(1)、Gly0.83
(1)、Ala3、Val3.42(4)、Leu2.53(3)、Lys5.11
(6)、His0.69(1)、Arg0.51(1) （41）ｈ−PTH（51−84） 無水HF40mlに０℃に冷却下〔39〕3.73ｇ
（0.6ｍＭ）およびアニソール４mlを加え、60分
間撹拌した。反応後、HFを減圧下留去し、残
渣にエーテルを加え、生じた沈澱物を集め、
0.1N酢酸50mlに溶かし、ダウエツクス×１の
カラム（アセテート型−2.7×33cm）に通じ、
流出液を凍結乾燥して粗生成物2.41ｇを得た。 これを8M尿素水溶液50mlに溶かし、アンモ
ニア水でPH10.0に調節した後、30分間放置し
た。次いでこの溶液を8M尿素水溶液で充填し
たCM−セルロースのカラム（4.2×11.5cm）に
チヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）で尿素を流出した後、0.01M酢酸アン
モニウム水溶液（PH4.5）700ml〜0.1M酢酸ア
ンモニウム水溶液（PH4.5）700mlの直線型濃度
勾配による溶出を行い、次いで0.2M酢酸アン
モニウム水溶液（PH4.5）250mlで溶出した。溶
出液は8.5mlづつ分画し、各分画はFolin−
Lowry法（500nｍ）により測定して30〜63本
目の区分C1、105〜150本目の区分C2および151
〜195本目の区分C3の溶出液を得た。区分C2お
よび区分C3をセフアデツクスLH−20のカラム
に通して脱塩した。流出液は5.2mlづつ分画し、
区分C2は3.4×110cmのカラムに通し、51〜63本
目の区分C2L1および64〜80本目の区分C2L2を
得た。区分C3は3.4×120cmに適し、50〜69本目
の区分C3L1および70〜78本目の区分C3L2を得
た。各区分を凍結乾燥して次の各成分を得た。
CM−セルロースのカラム（4.4×70cm）にチヤ
ージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液（PH
4.5）500ml〜0.1M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）500mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は6.0mlづつ分画し、各分画は
Folin−Lowry法により測定して113〜136本目
の区分C2L2−C1、137〜151本目の区分C2L2−
C2および152〜190本目の区分C2L2−C3を得た。 各区分をセフアデツクスLH−20のカラムに
通して脱塩した。流出液は5.2mlづつ分画し、
各分画は上記と同じ方法で測定した。区分
C2L2−C1は3.4×120cmのカラムに通し、55〜72
本目の区分C2L2−C1L1および73〜80本目の区
分C2L2−C1L2を得た。区分C2L2−C2は3.4×
110cmのカラムに通し、50〜59本目の区分C2L2
−C2L1および60〜67本目の区分C2L2−C2L2を
得た。区分C2L2−C3は3.4×110cmのカラムに通
し、45〜60本目の区分のC2L2−C3L1および61
〜72本目の区分C2L2−C3L2を得た。各区分を
凍結乾燥して、次の各成分を得た。 C2L2−C1L1 108.7mg C2L2−C1L2 95.9mg C2L2−C2L1 53.6mg C2L2−C2L2 44.1mg C2L2−C3L1 97.0mg C2L2−C3L2 95.1mg (3) C2L2−C1L1の精製 前記のC2L2−C1L1を0.1N酢酸１mlに溶かし、
CM−セルロースのカラム（2.0×15cm）にチヤ
ージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液（PH
4.5）300ml〜0.1M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）300mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は7.4mlづつ分画し、各分画は
Folin−Lowry法（500nｍ）により測定して46
〜56本目の区分C2L2−C1L1−Ｃを得た。これ
を減圧濃縮し、セフアデツクスLH−20のカラ
ム（3.0×90cm）にチヤージし、0.1N酢酸で溶
出した。溶出液は6.0mlづつ分画し、上記と同
じ方法で測定して25〜35本目の区分C2L2−
C1L1−CLを得た。これを凍結乾燥してｈ−
PTH（53−84）90.0mgを得た。 TLC；R9＝0.76 １スポツト アミノ酸分析；Asp4.45(5)、Thr0.92(1)、
Ser2.16(3)、Glu4.94(5)、Gly0.96(1)、Ala3、
Val3.96(4)、Leu2.92(3)、Lys6.22(6)、His1.01
(1) 参考例 ２ ｈ−PTH（51−84）；Ｈ−Pro−Arg−Lys−
Lys−Glu−Asp−Asn−Val−Leu−Val−Glu
−Ser−His−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−
Glu−Ala−Asp−Lys−Ala−Asp−Val−Asp
−Val−Leu−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−
Gln−OHの製造例。 (1) Ｐ（52−54）；AOC−Arg（Tos）−Lys（Ｚ−
Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC〔36〕について。 BOC−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC
〔33〕（融点72〜75℃、元素分析値
〔C41H50O10N4Cl2として、Ｃ＝59.22％、Ｈ＝
5.98％、Ｎ＝6.81％）14.65ｇ（18ｍＭ）に
TFA50mlを加え、室温で30分間撹拌した。反
応後、TFAを減圧下留去し、残渣にエーテル
を加えた。生じた沈澱物を集め、DMF10mlに
溶かし、これにAOC−Arg（Tos）−OH9.19ｇ
（1.2倍Ｍ）−HOBT2.92ｇ（1.2倍Ｍ）および
WSCI3.95ml（1.2倍Ｍ）を加え、室温で一夜撹
拌した。反応後、DMFを減圧下留去し、残渣
を酢酸エチル300mlに溶かした後、５％重曹水、
1N塩酸、水の順に各々３回づつ洗浄した。酢
酸エチル層を無水芒硝で乾燥後、減圧乾固し、
酢酸エチル−エーテルより再結晶して〔36〕
14.46ｇ（収率69.6％）を得た。 融点；79〜82℃ TLC；Rf7＝0.76 元素分析〔C55H70O13N8SClとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 57.06 6.26 9.82 計算値 57.23 6.11 9.71 (2) Ｐ（51−54）；BOC−Pro−Arg（Tos）−Lys
（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC〔37〕について。 〔36〕14.43ｇ（12.5ｍＭ）にTFA40mlを加
え、室温で20分間撹拌した。反応後、TFAを
減圧下留去し、残渣にエーテルを加え、生じた
沈澱物を集め、DMF80mlに溶した。これに
HOBT2.03ｇ（1.2倍Ｍ）、BOC−Pro−
OH3.23ｇ（1.2倍Ｍ）およびWSCI2.75ml（1.2
倍Ｍ）を加え、室温で一夜撹拌した。反応後、
DMFを減圧下留去し、残渣を酢酸エチル300ml
に溶かした後、５％重曹水、1N塩酸水の順に
洗浄した。酢酸エチル層を無水芒硝で乾燥後、
減圧乾固し、残渣を酢酸エチル−エーテルより
２回再結晶して〔37〕14.71ｇ（収率95.1％）
を得た。 融点；90〜93℃ TLC；Rf7＝0.64 元素分析〔C59H75O14N9SCl2として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 57.33 6.20 9.79 計算値 57.27 6.11 10.19 (3) Ｐ（51−84）；BOC−Pro−Arg（Tos）−Lys
（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−OH〔38〕について。 亜鉛末20ｇ／酢酸30mlに〔37〕6.19ｇ（５ｍ
Ｍ）を酢酸40mlに溶かした溶液を加え、室温で
２時間撹拌した。反応後、亜鉛末を別し、
液を減圧濃縮し、残渣に５％重曹水とエーテル
を加えて抽出し、分離した水層を1N塩酸でPH
２に調節した後、酢酸エチルで抽出した。酢酸
エチル層を水で３回洗浄し、無水芒硝で乾燥
後、減圧乾固し、残渣を酢酸エチル−エーテル
より再結晶して〔38〕5.40ｇ（収率96.5％）を
得た。 融点；110〜113℃ TLC；Rf4＝0.43 元素分析〔C51H69O13N9SCl2として〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 54.56 6.46 11.22 計算値 54.73 6.21 11.27 (4) Ｐ（51−84）；BOC−Pro−Arg（Tos）−Lys
（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu（OBzl）−Asp
（OBzl）−Asn−Val−Leu−Val−Glu（OBzl）
−Ser（Bzl）−His−Glu（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）
−Ser（Bzl）−Leu−Gly−Glu（OBzl）−Ala−
Asp（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Asp（OBzl）
−Val−Asp（OBzl）−Val−Leu−Thr（Bzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）
−Gln−OBzl〔39〕について。 BOC−Glu（OBzl）−Asp（OBzl）−Asn−Val
−Leu−Val−Glu（OBzl）−Ser（Bzl）−His−
Glu（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Leu−
Gly−Glu（OBzl）−Ala−Asp（OBzl）−Lys（Ｚ
−Cl）−Ala−Asp（OBzl）−Val−Asp（OBzl）
−Val−Leu−Thr（Bzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala
−Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Gln−OBzl〔32〕
〔アミノ酸分析；Asp4.11(5)、Thr0.92(1)、
Ser1.59(3)、Glu3.99(5)、Gly0.83(1)、Ala3、
Val3.28(4)、Leu2.49(3)、Lys4.08(4)、His0.71
(1)〕7.83ｇ（1.5ｍＭ）にTFA50mlを加え、室
温で60分間撹拌し、反応後、TFAを減圧下留
去し、残渣にエーテルを加えた。生じた沈澱物
を集め、DMF120mlとNMP120mlを加えて溶し
た。これにHOBT0.30ｇ（1.5倍Ｍ）、〔38〕2.52
ｇ（1.5倍Ｍ）およびWSCI0.41ml（1.5倍Ｍ）を
加え、室温で２日間撹拌し、反応液を氷水に加
え、生じた沈澱物を水洗後、メタノールを加え
て加熱処理した。冷却後不溶物を集め、上記の
加熱処理を２回繰り返した後、エーテルで洗浄
して〔39〕8.20ｇ（収率87.9％）を得た。 アミノ酸分析；Asp4.09(5)、Thr1.05(1)、
Ser2.30(3)、Glu4.08(5)、Pro0.52(1)、Gly0.83
(1)、Ala3、Val3.42(4)、Leu2.53(3)、Lys5.11
(6)、His0.69(1)、Arg0.51(1) （41）ｈ−PTH（51−84） 無水HF40mlに０℃に冷却下〔39〕3.73ｇ
（0.6ｍＭ）およびアニソール４mlを加え、60分
間撹拌した。反応後、HFを減圧下留去し、残
渣にエーテルを加え、生じた沈澱物を集め、
0.1N酢酸50mlに溶かし、ダウエツクス×１の
カラム（アセテート型−2.7×33cm）に通じ、
流出液を凍結乾燥して粗生成物2.41ｇを得た。 これを8M尿素水溶液50mlに溶かし、アンモ
ニア水でPH10.0に調節した後、30分間放置し
た。次いでこの溶液を8M尿素水溶液で充填し
たCM−セルロースのカラム（4.2×11.5cm）に
チヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）で尿素を流出した後、0.01M酢酸アン
モニウム水溶液（PH4.5）700ml〜0.1M酢酸ア
ンモニウム水溶液（PH4.5）700mlの直線型濃度
勾配による溶出を行い、次いで0.2M酢酸アン
モニウム水溶液（PH4.5）250mlで溶出した。溶
出液は8.5mlづつ分画し、各分画はFolin−
Lowry法（500nｍ）により測定して30〜63本
目の区分C1、105〜150本目の区分C2および151
〜195本目の区分C3の溶出液を得た。区分C2お
よび区分C3をセフアデツクスLH−20のカラム
に通して脱塩した。流出液は5.2mlづつ分画し、
区分C2は3.4×110cmのカラムに通し、51〜63本
目の区分C2L1および64〜80本目の区分C2L2を
得た。区分C3は3.4×120cmに適し、50〜69本目
の区分C3L1および70〜78本目の区分C3L2を得
た。各区分を凍結乾燥して次の各成分を得た。
【表】
前記のC2L2区分375mgを0.1N酢酸４mlに溶か
し、CM−セルロースのカラム（2.0×31cm）に
チヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）500ml〜0.2M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）500mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は7.5mlづつ分画し、85〜103本
目の区分C2L2−Ｃを得た。この区分をセフア
デツクスLH−20のカラム（3.0×123cm）に通
して脱塩した。流出液は６mlづつ分画し、34〜
42本目の区分C2L2−CL1および43〜50本目の区
分C2L2−CL2を得た。各区分を凍結乾燥して次
の各成分を得た。 C2L2−CL1 80.0mg アミノ酸分析；Asp4.95(5)、Thr0.98(1)、
Ser2.47(3)、Glu5.14(5)、Gly1.01(1)、Ala3(3)、
Val4.05(4)、Leu3.02(3)、Lys6.16(6)、His0.96
(1)、Arg0.97(1)、Pro1.06(1) C2L2−CL2 197.6mg アミノ酸分析；Asp5.00(5)、Thr0.93(1)、
Ser2.30(3)、Glu5.17(5)、Gly1.01(1)、Ala3(3)、
Val4.03(4)、Leu3.00(3)、Lys6.15(6)、His0.95
(1)、Arg1.01(1)、Pro1.04(1) 前記のC2L2−CL2区分195mgを0.1N酢酸２ml
に溶かし、CM−セルロースのカラム（2.0×15
cm）にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水
溶液（PH4.5）300ml〜0.2M酢酸アンモニウム
水溶液（PH4.5）300mlの直線型濃度勾配による
溶出を行つた。溶出液は6.4mlづつ分画し、55
〜64本目の区分C2L2−CL2−C1および56〜72本
目の区分C2L2−CL2−C2を得た。各区分をセフ
アデツクスLH−20のカラムに通して脱塩し
た。区分C2L2−CL2−C1は3.0×123cmのカラム
に通し、流出液は7.4mlづつ分画し、31〜38本
目の区分C2L2−CL2−C1L1と39〜43本目の区分
C2L2−CL2−C1L2を得た。区分C2L2−CL2−
C1L1を凍結乾燥してｈ−PTH（53−84）77.2mg
を得た。 TLC；R10＝0.89 １スポツト 参考例 ３ ｈ−PTH（46−84）；Ｈ−Ala−Gly−Ser−Gln
−Arg−Pro−Arg−Lys−Lys−Glu−Asp−
Asn−Val−Leu−Val−Glu−Ser−His−Glu
−Lys−Ser−Leu−Gly−Glu−Ala−Asp−
Lys−Ala−Asp−Val−Asp−Val−Leu−Thr
−Lys−Ala−Lys−Ser−Gln−OHの製造例。 (1) Ｐ（49−50）；BOC−Gln−Arg（Tos）−OMe
〔40〕について。 Ｈ−Arg（Tos）−OMe・HCl11.37ｇ（30ｍ
Ｍ）とBOC−Gln−ONP13.21ｇ（1.2倍Ｍ）を
DMF200mlに溶かし、０℃に冷却下NMMでPH
７に調節した後、一夜撹拌した。反応後、
DMFを減圧下留去し、残渣をクロロホルムに
溶かした後、５％重曹水で３回、1N塩酸で２
回、水で３回洗浄した。クロロホルム層を無水
芒硝で乾燥し、クロロホルムで充填したシリカ
ゲルのカラムでクロマトグラフイーを行い、ク
ロロホルム−エタノール一酢酸エチルで流し、
目的物が溶出し始めるとクロロホルム−エタノ
ール−酢酸エチル（１：１：１）で溶出した。
相当する区分を集めて減圧濃縮した。残渣を酢
酸エチルに溶かし、０℃に冷却下ヘキサンを加
えて結晶化させて〔40〕を得た。収量11.86ｇ 融点；103〜107℃ (2) Ｐ（48−50）；BOC−Ser（Bzl）−Gln−Arg
（Tos）−OMe〔41〕について。 〔40〕9.39ｇ（16.5ｍＭ）にTFA50mlを加え
室温で20分間撹拌した後、TFAを減圧下留去
した。残渣にエーテルを加え、生じた沈澱物を
取し、DMF50mlに溶かした。この溶液に
HOBT3.24ｇ（1.45倍Ｍ）、BOC−Ser（Bzl）−
OH7.07ｇ（1.45倍Ｍ）およびWSCI4.39ml
（1.45倍Ｍ）を加え、室温で一夜撹拌した。反
応後、DMFを減圧下留去し、残渣を酢酸エチ
ル300mlに溶かした後、５％重曹、1N塩酸、水
の順に洗浄した。酢酸エチル層を無水芒硝で乾
燥後、減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル−エーテ
ルから結晶化を２回行い、〔41〕10.0ｇ（収率
81.0％）を得た。 融点；97〜102℃ 元素分析〔C34H49O10N7S・1/2H2Oとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 54.07 6.90 13.29 計算値 53.95 6.66 13.00 (3) Ｐ（46−50）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）−
Gln−Arg（Tos）−OMe〔42〕について。 〔41〕9.72ｇ（13ｍＭ）にTFA50mlを加え、
室温で30分間撹拌した。反応後、TFAを減圧
下で留去し、残渣にエーテルを加えた。生じた
沈澱物を取し、DMF100mlに溶かし、この溶
液にBOC−Ala−Gly−OH38.4ｇ（1.2倍Ｍ）、
HOBT2.11ｇ（1.2倍Ｍ）およびWSCI2.85ml
（1.2倍Ｍ）を加え、室温で２日間撹拌した。反
応後、DMFを減圧下留去し、残渣を酢酸エチ
ル200mlに溶かした後、水洗した。無水芒硝で
乾燥し、減圧濃縮した後、残渣をエタノール−
エーテルで２回結晶化して〔42〕10.46ｇ（収
率91.9％）を得た。 融点；154−157℃ 元素分析〔C39H57O12N9Sとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 53.21 6.90 14.38 計算値 53.47 6.56 14.39 (4) Ｐ（46−50）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）−
Gln−Arg（Tos）−NH NH2〔43〕について。 〔42〕9.64ｇ（11ｍＭ）をエタノール50mlに
溶かし、これに50％NH2NH26.4mlを加え室温
で一夜撹拌した。反応液にエタノール100mlを
加え、不溶物を取した。これをエタノール
100mlに懸濁し、加熱し、冷却後、過して
〔43〕9.02ｇ（収率93.6％）を得た。 融点；178〜180℃ 元素分析〔C33H57O11N11Sとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 52.13 6.86 16.65 計算値 52.10 6.56 17.59 (5) Ｐ（46−54）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）−
Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg（Tos）−Lys（Ｚ−
Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC〔44〕について。 参考例２に記載の〔37〕8.04ｇ（6.6ｍＭ）
にTFA40mlを加え、室温で20分間撹拌した後、
TFAを減圧下留去した。残渣にエーテルを加
え、生じた沈澱物を取して粗製のＨ−Pro−
Arg（Tos）−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−
PAC・TFAを得た。 一方、〔43〕6.83ｇ（7.8ｍＭ）をDMF30mlに
溶かし、これに−50℃に冷却下4.32N塩化水素
のジオキサン溶液5.42ml（23.4ｍＭ）とイソア
ミルニトリル1.10ml（8.09ｍＭ）を加えた後、
−20℃で20分間撹拌した。次いで上記Ｈ−Pro
−Arg（Tos）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC・TFAを加
え、−35℃でEt3N5.46ml（39ｍＭ）を加えた
後、０〜５℃で２日間撹拌した。反応後、
DMFを減圧下留去し、残渣をクロロホルム300
mlに溶かした後、５％重曹水、1N塩酸、水の
順で洗浄した。クロロホルム層を無水芒硝で乾
燥し、減圧濃縮し、エタノール−エーテルおよ
びクロロホルム−エーテルにより精製して
〔44〕13.42ｇを得た。 TLC；Rf＝0.64〔クロロホルム−メタノール酢
酸（83：18：3.5）〕 元素分析〔C92H120O22N18Cl2S・3H2Oとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 54.68 6.21 12.72 計算値 54.72 6.29 12.49 アミノ酸分析；Ser0.65(1)、Glu1.10(1)、Pro1
(1)、Gly1.02(1)、Ala1.00(1)、Lys1.89(2)、
Arg2.02(2) (6) Ｐ−（46−54）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）
−Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg（Tos）−Lys（Ｚ
−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−OH〔45〕について。 亜鉛末15ｇ／酢酸30mlに〔44〕5.31ｇの酢酸
40ml溶液を加え、室温で２時間撹拌した。反応
後、亜鉛末を別し、液を減圧濃縮した。残
渣にエーテルを加え、生じた沈澱物をエタノー
ル−エーテルで１回、エタノール−酢酸エチル
で２回精製して〔45〕4.41ｇ（収率87.7％）を
得た。 TLC；Rf4＝0.22 元素分析〔C84H114O22N18S2Cl2・2H2Oとし
て〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 52.89 6.16 13.22 計算値 53.12 6.26 13.28 アミノ酸分析；Ser0.88(1)、Glu1.11(1)、
Pro1.02(1)、Gly1.02(1)、Ala1(1)、Lys2.00(2)、
Arg2.09(2) (6) Ｐ（46−84）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）−
Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg（Tos）−Lys（Ｚ−
Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu（OBzl）−Asp（OBzl）
−Asn−Val−Leu−Val−Glu（OBzl）−Ser
（Bzl）−His−Glu（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ser
（Bzl）−Leu−Gly−Glu（OBzl）−Ala−Asp
（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Asp（OBzl）−
Val−Asp（OBzl）−Val−Leu−Thr（Bzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）
−Gln−OBZl〔46〕について。 参考例２に記載の〔32〕10.44ｇ（２ｍＭ）
にTFA80mlを加え、室温で60分間撹拌した後、
TFAを減圧下留去した。残渣にエーテルを加
え、生じた沈澱物をDMF160mlとNMP160mlの
混液に溶かし、これに０℃に冷却下〔45〕4.28
ｇ（1.15倍Ｍ）、HOBT0.32ｇ（1.2倍Ｍ）およ
びWSCI0.44ml（1.2倍Ｍ）を加えた後、室温で
２日間撹拌した。反応後DMFを減圧下留去し、
残渣に氷水を加えた後、生じた沈澱物を取し
た。これにメタノール200mlを加えて加熱し、
冷却後不溶物を取する操作を２回繰り返して
〔46〕12.17ｇ（収率87.4％）を得た。 (7) ｈ−PTH（46−84） 無水HF60ml120℃に冷却下〔46〕4.18ｇ
（0.6ｍＭ）とアニソール10mlを加え、60分間撹
拌した。反応後、HFを減圧下留去し、残渣に
エーテルを加えた。生じた沈澱物を集め、10％
酢酸50mlに溶かし、ダウエツクス×１のカラム
（アセテート型、2.5×24cm）に通じ、流出液を
凍結乾燥して粗生成物2.82ｇを得た。 これを8M尿素水溶液（PH9.0）50mlに溶か
し、60分間室温で放置した。次いでこの溶液を
8M尿素水溶液で充填したCM−セルロースの
カラム（2.0×33cm）にチヤージし、0.01M酢
酸アンモニウム水溶液（PH4.5）500ml〜0.3M
酢酸アンモニウム水溶液（PH4.5）500mlの直線
型濃度勾配による溶出を行つた。溶出液は7.5
mlづつ分画し、各分画はFolin−Lowry法
（500nｍ）により測定して１〜22本目の区分
C1、23〜45本目の区分C2、46〜80本目の区分
C3、および81〜120本目の区分C4の溶出液を得
た。各区分をセフアデツクスLH−20のカラム
に通して脱塩した。区分C1は3.0×120cmのカラ
ムに適し、流出液を7.5mlづつ分画し、28〜42
本目の区分C1Lを得た。区分C2は3.4×120cmに
達し、流出液を7.6mlづつ分画し、33〜40本目
の区分C2L1および41〜62本目の区分C2L2を得
た。区分C3は3.0×120cmのカラムに通し、流出
液を6.0mlづつ分画し、31〜40本目の区分C3L1
および41〜51本目の区分C3L2を得た。区分C4
は、3.4×120cmのカラムに通し、流出液を7.5
mlづつ分画し、35〜48本目の区分C4Lを得た。
各区分を凍結乾燥してC1L区分312mg、C2L1区
分142.3mg、C2L2区分1380mg、C3L1区分104mg、
C3L2区分510mgおよびC4L区分130mgを得た。 前記のC2L2区分1380mgを0.1N酢酸13mlに溶
かし、CM−セルロースのカラム（4.3×6.0cm）
にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）500ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）500mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は7.6mlづつ分画し、40〜50本
目の区分C2L2−C1および53〜77本目の区分
C2L2−C2を得た。各区分をセフアデツクスLH
−20のカラムに通して脱塩した。区分C2L2−
C1は2.9×120cmのカラムに通し、流出液を8.0
mlづつ分画し、26〜30本目の区分C2L2−C1L1
および31〜39本目の区分C2L2−C1L2を得た。
区分C2L2−C2は3.4×120cmのカラムに通し、流
出液を8.0mlづつ分画し、34〜44本目の区分
C2L2−C2L1および45〜53本目の区分C2L2−
C2L2を得た。各区分を凍結乾燥してC2L2−
C1L1区分79.0mg、C2L2−C1L2区分455mg、C2L2
−C2L1区分157.3mgおよびC2L2−C2L2区分551.7
mgを得た。 C2L2−C2L2区分のアミノ酸分析；Asp4.65(5)、
Thr0.97(1)、Ser3.47(4)、Glu5.99(6)、Pro0.93
(1)、Gly1.96(2)、Ala4(4)、Val3.97(4)、
Leu3.01(3)、Lys6.13(6)、His0.93(1)、Arg1.96
(2) 前記のC2L2−C2L2区分を0.1N酢酸５mlに溶
かし、CM−セルロースのカラム（4.2×7.0cm）
にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）300ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）の直線型濃度包配による溶出を行つ
た。溶出液は8.0mlづつ分画し、39〜45本目の
区分C2L2−C2L2−Ｃを得た。この区分をセフ
アデツクスLH−20のカラム（2.9×120cm）の
カラムに通して脱塩した。流出液を8.0mlづつ
分画し、24〜30本目の区分C2L2−C2L2−CL1、
31〜35本目の区分C2L2−C2L2−CL2および36〜
39本目の区分C2L2−C2L2−CL3を得た。各区分
を凍結乾燥してC2L2−C2L2−CL2区分200mgお
よびC2L2−C2L2−CL1区分〔ｈ−PTH（46−
84）〕94.9mgを得た。 TLC；Rf9＝0.76 アミノ酸分析；Asp4.86(5)、Thr0.99(1)、Ser3.5
(4)、Glu6.17(6)、Pro0.96(1)、Gly1.97(2)、
Ala4 Val4.02(4)、Leu2.93(3)、Lys6.05(6)、
His0.90(1)、Arg1.87(2) 参考例 ４ 〔Tyr45〕−ｈ−PTH（46−84）；Ｈ−Try−Ala
−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro−Arg−Lys−
Lys−Glu−Asp−Asn−Val−Leu−Val−Glu
−Ser−His−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−
Glu−Ala−Asp−Lys−Ala−Asp−Val−Asp
−Val−Leu−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−
Gln−OHの製造例。 (1) Ｐ（45−84）；BOC−Try（Bzl−Cl2）−Ala−
Gly−Ser（Bzl）−Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg
（Tos）−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu
（OBzl）−Asp（OBzl）−Asn−Val−Leu−Val
−Glu（OBzl）−Ser（Bzl）−His−Glu（OBzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Leu−Gly−Glu
（OBzl）−Ala−Asp（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−
Ala−Asp（OBzl）−Val−Asp（OBzl）−Val−
Leu−Thr（Bzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ
−Cl）−Ser（Bzl）−Gln−OBzl〔47〕について。 参考例３に記載の〔46〕6.27ｇ（0.9ｍＭ）
にTFA60mlを加え、室温で60分間撹拌した。
反応後、TFAを減圧下留去し、残渣にエーテ
ルを加える。生じた沈澱物を取して脱BOC
化物6.30ｇを得た。 上記脱BOC化物2.10ｇ（0.3ｍＭ）をDMF35
mlとNMP35mlの混液に溶かし、これに０℃に
冷却下BOC−Try（Bzl−Cl2）−OH0.16ｇ（1.2
倍Ｍ）、HOBT0.05ｇ（1.2倍Ｍ）および
WSCI0.07ml（1.2倍Ｍ）を加えた後、室温で一
夜撹拌した。反応後、DMFを減圧下留去し、
残渣に氷水を加え、生じた沈澱物を取して
〔47〕2.00ｇを得た。 (2) 〔Tyr45〕−ｈ−PTH（46−84） 無水HF20mlに０℃に冷却下〔47〕2.00ｇ
（0.27ｍＭ）およびアニソール1.0mlを加え、60
分間撹拌した。反応後、HFを減圧下留去し、
残渣にエーテルを加えた。生じた沈澱物を集
め、0.1N酢酸20mlに溶かし、ダウエツクス×
１のカラム（アセテート型、2.5×15cm）に通
じ、流出液を凍結乾燥して粗生成物1.37ｇを得
た。 これを8M尿素水溶液（PH9.5）50mlに溶か
し、室温で60分間放置した。次いでこの溶液を
8M尿素水溶液で充填したCM−セルロースの
カラム（4.3×8.0cm）にチヤージし、0.01M酢
酸アンモニウム水溶液（PH4.5）400ml〜0.3M
酢酸アンモニウム水溶液（PH4.5）400mlの直線
型濃度勾配による溶出を行つた。溶出液は6.5
mlづつ分画し、各分画はFolin−Lowry法
（500nｍ）により測定して30〜43本目の区分
C1、51〜68本目の区分C2、69〜83本目の区分
C3および84〜100本目の区分C4を得た。各区分
をセフアデツクスLH−20のカラムに通して脱
塩した。区分C1は3.4×120cmのカラムに通し、
流出液を7.5mlづつ分画し、25〜41本目の区分
C1Lを通る区分C2は3.0×120cmのカラムに通
し、流出液を7.5mlづつ分画し、25〜36本目の
区分C2Lを得た。区分C3は2.9×120cmのカラム
に通し、流出液を8.0mlづつ分画し、24〜27本
目の区分C3L1および28〜38本目の区分C3L2を
得た。区分C4は2.9×95cmのカラムに通し、流
出液を7.6mlづつ分画し、20〜25本目の区分
C4L1および26〜30本目の区分C4L2を得た。各
区分を凍結乾燥してC1L区分521.6mg、C2L区分
230.2mg、C3L1区分41.8mg、C3L2区分222.4mg、
C4L1区分74.3mgおよびC4L2区分48.9mgを得た。 前記のC2L区分を0.1N酢酸３mlに溶かし、
CM−セルロースのカラム（2.1×25cm）にチヤ
ージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液（PH
4.5）300ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）300mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は8.0mlづつ分画し、30〜36本
目の区分C2L−Ｃを得た。この区分をセフアデ
ツクスLH−20のカラム（2.9×90cm）のカラム
に通して脱塩した。流出液を8.0mlづつ分画し、
20〜29本目の区分を凍結乾燥して〔Tyr45〕−
ｈ−PTH（46−84）163.3mgを得た。 TLC；Rf9＝0.75 アミノ酸分析；Asp4.86(5)、Thr1.02(1)、
Ser3.51(4)、Glu6.05(6)、Pro0.93(1)、Gly1.90
(2)、Ala4(4)、Val4.00(4)、Leu2.93(3)、
Tyr0.88(1)、Lys6.02(6)、His0.86(1)、Arg1.81
(2) 参考例 ５ 〔Cys（Acm）45〕−ｈ−PTH（46−84）；Ｈ−
Cys（Acm）−Ala−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro
−Arg−Lys−Lys−Glu−Asp−Asn−Val−
Leu−Val−Glu−Ser−His−Glu−Lys−Ser
−Leu−Gly−Glu−Ala−Asp−Lys−Ala−
Asp−Val−Asp−Val−Leu−Thr−Lys−Ala
−Lys−Ser−Gln−OHの製造例。 (1) Ｐ（45−84）；BOC−Cys（Acm）−Aa−Gly
−Ser（Bzl）−Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg
（Tos）−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu
（OBzl）−Asp（OBzl）−Asn−Val−Leu−Val
−Glu（OBzl）−Ser（Bzl）−His−Glu（OBzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Leu−Gly−Glu
（OBzl）−Ala−Asp（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−
Ala−Asp（OBzl）−Val−Asp（OBzl）−Val−
Leu−Thr（Bzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ
−Cl）−Ser（Bzl）−Gln−OBzl〔48〕について。 参考例４で得た残りの脱BOC化物4.20mg
（0.6ｍＭ）をDMF70mlとNMP70mlの混液に溶
かし、これに０℃に冷却下HOBT0.10ｇ（1.2
倍Ｍ）、BOC−Cys（Acm）−OH0.20ｇ（1.2倍
Ｍ）およびWSCI0.13ml（1.2倍Ｍ）を加えた
後、室温で一夜撹拌した。反応後、DMFを減
圧下留去し、残渣に氷水を加え、生じた沈澱物
を集めた。これをエタノールに懸濁して加熱
し、冷却した後、不溶物を取した。この操作
を２回繰り返して〔48〕4.07ｇ（収率95.0％）
を得た。 (2) 〔Cys（Acm）45〕−ｈ−PTH（46−84）無水
HF60mlに０℃に冷却下〔48〕4.00ｇ（0.57ｍ
Ｍ）およびアニソール10mlを加え、60分間撹拌
した。反応後、HFを減圧下留去し、残渣にエ
ーテルを加えた。生じた沈澱物を集め、20％酢
酸40mlに溶かし、ダウエツクス×１のカラム
（アセテート型、2.8×35cm）に通じ、流出液を
凍結乾燥した。これを8M尿素水溶液50mlに溶
かし、アンモニア水でPH9.0に調節した後、30
分間放置した。次いでこの溶液を8M尿素水溶
液で充填したCM−セルロース（3.4×32cm）に
チヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）700ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）700mlの濃度勾配による溶出を行つた。
溶出液は8.0mlづつ分画し、各分画はFolin−
Lowry法（500nｍ）により測定して25〜35本
目の区分C1、36〜45本目の区分C2および46〜
84本目の区分C3を得た。各区分をセフアデツ
クスLH−20のカラムに通して脱塩した。区分
C2は3.0×120cmのカラムに通し、流出液を8.0
mlづつ分画し、27〜33本目の区分C2L1および
34〜40本目の区分C2L2を得た。区分C3は3.4×
120cmのカラムに通し、流出液を8.0mlづつ分画
し、35〜47本目の区分C3L1および48〜53本目
の区分C3L2を得た。各区分を凍結乾燥して
C2L1区分148mg、C2L2区分620mg、C3L1区分212
mgおよびC3L2区分605mgを得た。 前記のC2L2区分を0.1N酢酸６mlに溶かし、
これをCM−セルロースのカラム（5.0×12cm）
にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）400ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）400mlの直線型濃度勾配による溶出を
行い、溶出液は6.0mlづつ分画し、110〜126本
目の区分C2L2−Ｃを得た。これをセフアデツ
クスLH−20のカラム（4.0×120cm）に通して
脱塩した。流出液は8.0mlづつ分画し、38〜54
本目の区分C2L2−CLを得た。この区分を凍結
乾燥して〔Cys（Acm）45〕−ｈ−PTH（46−84）
246.8mgを得た。 TLC；Rf9＝0.74 アミノ酸分析；Asp4.91(5)、Thr0.98(1)、
Ser3.50(1)、Glu6.11(6)、Pro0.98(1)、Gly1.98
(2)、Ala4(4)、Val4.04(4)、Cys0.42（0.5）、
Leu2.90(3)、Lys5.99(6)、His0.87(1)、Arg1.87
(2) 参考例 ６ 〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−84）；Ｈ−Cys−Ala
−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro−Arg−Lys−
Lys−Glu−Asp−Asn−Val−Leu−Val−Glu
−Ser−His−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−
Glu−Ala−Asp−Lys−Ala−Asp−Val−Asp
−Val−Leu−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−
Gln−OHの製造例。 参考例５で得た〔Cys（Acm）45〕−ｈ−PTH
（46−84）88mg（0.02ｍＭ）を50％酢酸２mlに溶
かし、これに酢酸第二水銀57.24mg（0.18ｍＭ）
を加えた後、室温で70分間撹拌した。次いで、β
−メルカプトエタノール3.4mlを加え、室温で24
時間撹拌した。反応液を遠心分離し、上澄液をセ
フアデツクスLH−20のカラム（3.2×42cm）にチ
ヤージし、0.1M酢酸で溶出した。溶出液は５ml
づつ分画し、ニンヒドリン反応陽性の９〜14本目
の区分を集め、これを凍結乾燥して〔Cys45〕−ｈ
−PTH（46−84）76.1mgを得た。 TLC；Rf9＝0.73 尚、本明細書中に記載の略記号は次の意味を有
する。 Gln；Ｌ−グルタミン Ser；Ｌ−セリン Lys；Ｌ−リジン Ala；Ｌ−アラニン Thr；Ｌ−スレオニン Leu；Ｌ−ロイシン Val；Ｌ−バリン Asp；Ｌ−アスパラギン酸 Glu；Ｌ−グルタミン酸 Gly；グリシン His；Ｌ−ヒスチジン Asn；Ｌ−アスパラギン Arg；Ｌ−アルギニン Pro；Ｌ−プロリン Tyr；Ｌ−チロシン Cys；Ｌ−システイン BOC；ｔ−ブチルオキシカルボニル AOC；ｔ−アミルオキシカルボニル Ｚ−Cl；ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル Bzl；ベンジル Tos；トシル OMe；メチルエステル OEt；エチルエステル OBzl；ベンジルエステル OSU；Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル ONP；ｐ−ニトロフエニルエステル PAC；フエナシルエステル Acm；アセトアミドメチル TosoH；ｐ−トルエンスルホン酸 TFA；トリフルオロ酢酸 Et3N；トリエチルアミン TBA；トリベンジルアミン NMM；Ｎ−メチルモルホリン HOBT；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール DMF；ジメチルホルムアミド THF；テトラヒドロフラン NMP；Ｎ−メチル−２−ピロリドン MeOH；メタノール EtOH；エタノール BuOH；ブタノール エーテル；ジエチルエーテル WSCI；Ｎ−エチル、N′−３−ジメチルアミノプ
ロピル−カルボジイミド HOBT；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール また使用した薄層クロマトグラフイー（TLC）
の担体および展開溶媒は次の通りである。 担体；メルク社製シリカゲルＧ 展開溶媒； １；CHCl3−MeOH−酢酸（95：５：３） ２； 〃 （85：15：５） ３； 〃 （85：10：５） ４； 〃 （80：25：２） ５；ベンゼン−酢酸エチル（１：１） ６；ベンゼン−酢酸エチル（２：１） ７；CHCl3−EtOH−酢酸エチル（５：２：５） ８；CHCl3−EtOH−酢酸エチル（10：１：５） 担体；メルク社製セルロース 展開溶媒； ９；BuOH−ピリジン−酢酸−水（２：２：２：
３） 10；BuOH−ピリジン−酢酸−水（１：１：１：
２）
し、CM−セルロースのカラム（2.0×31cm）に
チヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）500ml〜0.2M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）500mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は7.5mlづつ分画し、85〜103本
目の区分C2L2−Ｃを得た。この区分をセフア
デツクスLH−20のカラム（3.0×123cm）に通
して脱塩した。流出液は６mlづつ分画し、34〜
42本目の区分C2L2−CL1および43〜50本目の区
分C2L2−CL2を得た。各区分を凍結乾燥して次
の各成分を得た。 C2L2−CL1 80.0mg アミノ酸分析；Asp4.95(5)、Thr0.98(1)、
Ser2.47(3)、Glu5.14(5)、Gly1.01(1)、Ala3(3)、
Val4.05(4)、Leu3.02(3)、Lys6.16(6)、His0.96
(1)、Arg0.97(1)、Pro1.06(1) C2L2−CL2 197.6mg アミノ酸分析；Asp5.00(5)、Thr0.93(1)、
Ser2.30(3)、Glu5.17(5)、Gly1.01(1)、Ala3(3)、
Val4.03(4)、Leu3.00(3)、Lys6.15(6)、His0.95
(1)、Arg1.01(1)、Pro1.04(1) 前記のC2L2−CL2区分195mgを0.1N酢酸２ml
に溶かし、CM−セルロースのカラム（2.0×15
cm）にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水
溶液（PH4.5）300ml〜0.2M酢酸アンモニウム
水溶液（PH4.5）300mlの直線型濃度勾配による
溶出を行つた。溶出液は6.4mlづつ分画し、55
〜64本目の区分C2L2−CL2−C1および56〜72本
目の区分C2L2−CL2−C2を得た。各区分をセフ
アデツクスLH−20のカラムに通して脱塩し
た。区分C2L2−CL2−C1は3.0×123cmのカラム
に通し、流出液は7.4mlづつ分画し、31〜38本
目の区分C2L2−CL2−C1L1と39〜43本目の区分
C2L2−CL2−C1L2を得た。区分C2L2−CL2−
C1L1を凍結乾燥してｈ−PTH（53−84）77.2mg
を得た。 TLC；R10＝0.89 １スポツト 参考例 ３ ｈ−PTH（46−84）；Ｈ−Ala−Gly−Ser−Gln
−Arg−Pro−Arg−Lys−Lys−Glu−Asp−
Asn−Val−Leu−Val−Glu−Ser−His−Glu
−Lys−Ser−Leu−Gly−Glu−Ala−Asp−
Lys−Ala−Asp−Val−Asp−Val−Leu−Thr
−Lys−Ala−Lys−Ser−Gln−OHの製造例。 (1) Ｐ（49−50）；BOC−Gln−Arg（Tos）−OMe
〔40〕について。 Ｈ−Arg（Tos）−OMe・HCl11.37ｇ（30ｍ
Ｍ）とBOC−Gln−ONP13.21ｇ（1.2倍Ｍ）を
DMF200mlに溶かし、０℃に冷却下NMMでPH
７に調節した後、一夜撹拌した。反応後、
DMFを減圧下留去し、残渣をクロロホルムに
溶かした後、５％重曹水で３回、1N塩酸で２
回、水で３回洗浄した。クロロホルム層を無水
芒硝で乾燥し、クロロホルムで充填したシリカ
ゲルのカラムでクロマトグラフイーを行い、ク
ロロホルム−エタノール一酢酸エチルで流し、
目的物が溶出し始めるとクロロホルム−エタノ
ール−酢酸エチル（１：１：１）で溶出した。
相当する区分を集めて減圧濃縮した。残渣を酢
酸エチルに溶かし、０℃に冷却下ヘキサンを加
えて結晶化させて〔40〕を得た。収量11.86ｇ 融点；103〜107℃ (2) Ｐ（48−50）；BOC−Ser（Bzl）−Gln−Arg
（Tos）−OMe〔41〕について。 〔40〕9.39ｇ（16.5ｍＭ）にTFA50mlを加え
室温で20分間撹拌した後、TFAを減圧下留去
した。残渣にエーテルを加え、生じた沈澱物を
取し、DMF50mlに溶かした。この溶液に
HOBT3.24ｇ（1.45倍Ｍ）、BOC−Ser（Bzl）−
OH7.07ｇ（1.45倍Ｍ）およびWSCI4.39ml
（1.45倍Ｍ）を加え、室温で一夜撹拌した。反
応後、DMFを減圧下留去し、残渣を酢酸エチ
ル300mlに溶かした後、５％重曹、1N塩酸、水
の順に洗浄した。酢酸エチル層を無水芒硝で乾
燥後、減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル−エーテ
ルから結晶化を２回行い、〔41〕10.0ｇ（収率
81.0％）を得た。 融点；97〜102℃ 元素分析〔C34H49O10N7S・1/2H2Oとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 54.07 6.90 13.29 計算値 53.95 6.66 13.00 (3) Ｐ（46−50）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）−
Gln−Arg（Tos）−OMe〔42〕について。 〔41〕9.72ｇ（13ｍＭ）にTFA50mlを加え、
室温で30分間撹拌した。反応後、TFAを減圧
下で留去し、残渣にエーテルを加えた。生じた
沈澱物を取し、DMF100mlに溶かし、この溶
液にBOC−Ala−Gly−OH38.4ｇ（1.2倍Ｍ）、
HOBT2.11ｇ（1.2倍Ｍ）およびWSCI2.85ml
（1.2倍Ｍ）を加え、室温で２日間撹拌した。反
応後、DMFを減圧下留去し、残渣を酢酸エチ
ル200mlに溶かした後、水洗した。無水芒硝で
乾燥し、減圧濃縮した後、残渣をエタノール−
エーテルで２回結晶化して〔42〕10.46ｇ（収
率91.9％）を得た。 融点；154−157℃ 元素分析〔C39H57O12N9Sとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 53.21 6.90 14.38 計算値 53.47 6.56 14.39 (4) Ｐ（46−50）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）−
Gln−Arg（Tos）−NH NH2〔43〕について。 〔42〕9.64ｇ（11ｍＭ）をエタノール50mlに
溶かし、これに50％NH2NH26.4mlを加え室温
で一夜撹拌した。反応液にエタノール100mlを
加え、不溶物を取した。これをエタノール
100mlに懸濁し、加熱し、冷却後、過して
〔43〕9.02ｇ（収率93.6％）を得た。 融点；178〜180℃ 元素分析〔C33H57O11N11Sとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 52.13 6.86 16.65 計算値 52.10 6.56 17.59 (5) Ｐ（46−54）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）−
Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg（Tos）−Lys（Ｚ−
Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC〔44〕について。 参考例２に記載の〔37〕8.04ｇ（6.6ｍＭ）
にTFA40mlを加え、室温で20分間撹拌した後、
TFAを減圧下留去した。残渣にエーテルを加
え、生じた沈澱物を取して粗製のＨ−Pro−
Arg（Tos）−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−
PAC・TFAを得た。 一方、〔43〕6.83ｇ（7.8ｍＭ）をDMF30mlに
溶かし、これに−50℃に冷却下4.32N塩化水素
のジオキサン溶液5.42ml（23.4ｍＭ）とイソア
ミルニトリル1.10ml（8.09ｍＭ）を加えた後、
−20℃で20分間撹拌した。次いで上記Ｈ−Pro
−Arg（Tos）−Lys（Ｚ−Cl）−PAC・TFAを加
え、−35℃でEt3N5.46ml（39ｍＭ）を加えた
後、０〜５℃で２日間撹拌した。反応後、
DMFを減圧下留去し、残渣をクロロホルム300
mlに溶かした後、５％重曹水、1N塩酸、水の
順で洗浄した。クロロホルム層を無水芒硝で乾
燥し、減圧濃縮し、エタノール−エーテルおよ
びクロロホルム−エーテルにより精製して
〔44〕13.42ｇを得た。 TLC；Rf＝0.64〔クロロホルム−メタノール酢
酸（83：18：3.5）〕 元素分析〔C92H120O22N18Cl2S・3H2Oとして〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 54.68 6.21 12.72 計算値 54.72 6.29 12.49 アミノ酸分析；Ser0.65(1)、Glu1.10(1)、Pro1
(1)、Gly1.02(1)、Ala1.00(1)、Lys1.89(2)、
Arg2.02(2) (6) Ｐ−（46−54）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）
−Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg（Tos）−Lys（Ｚ
−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−OH〔45〕について。 亜鉛末15ｇ／酢酸30mlに〔44〕5.31ｇの酢酸
40ml溶液を加え、室温で２時間撹拌した。反応
後、亜鉛末を別し、液を減圧濃縮した。残
渣にエーテルを加え、生じた沈澱物をエタノー
ル−エーテルで１回、エタノール−酢酸エチル
で２回精製して〔45〕4.41ｇ（収率87.7％）を
得た。 TLC；Rf4＝0.22 元素分析〔C84H114O22N18S2Cl2・2H2Oとし
て〕 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 測定値 52.89 6.16 13.22 計算値 53.12 6.26 13.28 アミノ酸分析；Ser0.88(1)、Glu1.11(1)、
Pro1.02(1)、Gly1.02(1)、Ala1(1)、Lys2.00(2)、
Arg2.09(2) (6) Ｐ（46−84）；BOC−Ala−Gly−Ser（Bzl）−
Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg（Tos）−Lys（Ｚ−
Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu（OBzl）−Asp（OBzl）
−Asn−Val−Leu−Val−Glu（OBzl）−Ser
（Bzl）−His−Glu（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ser
（Bzl）−Leu−Gly−Glu（OBzl）−Ala−Asp
（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Asp（OBzl）−
Val−Asp（OBzl）−Val−Leu−Thr（Bzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）
−Gln−OBZl〔46〕について。 参考例２に記載の〔32〕10.44ｇ（２ｍＭ）
にTFA80mlを加え、室温で60分間撹拌した後、
TFAを減圧下留去した。残渣にエーテルを加
え、生じた沈澱物をDMF160mlとNMP160mlの
混液に溶かし、これに０℃に冷却下〔45〕4.28
ｇ（1.15倍Ｍ）、HOBT0.32ｇ（1.2倍Ｍ）およ
びWSCI0.44ml（1.2倍Ｍ）を加えた後、室温で
２日間撹拌した。反応後DMFを減圧下留去し、
残渣に氷水を加えた後、生じた沈澱物を取し
た。これにメタノール200mlを加えて加熱し、
冷却後不溶物を取する操作を２回繰り返して
〔46〕12.17ｇ（収率87.4％）を得た。 (7) ｈ−PTH（46−84） 無水HF60ml120℃に冷却下〔46〕4.18ｇ
（0.6ｍＭ）とアニソール10mlを加え、60分間撹
拌した。反応後、HFを減圧下留去し、残渣に
エーテルを加えた。生じた沈澱物を集め、10％
酢酸50mlに溶かし、ダウエツクス×１のカラム
（アセテート型、2.5×24cm）に通じ、流出液を
凍結乾燥して粗生成物2.82ｇを得た。 これを8M尿素水溶液（PH9.0）50mlに溶か
し、60分間室温で放置した。次いでこの溶液を
8M尿素水溶液で充填したCM−セルロースの
カラム（2.0×33cm）にチヤージし、0.01M酢
酸アンモニウム水溶液（PH4.5）500ml〜0.3M
酢酸アンモニウム水溶液（PH4.5）500mlの直線
型濃度勾配による溶出を行つた。溶出液は7.5
mlづつ分画し、各分画はFolin−Lowry法
（500nｍ）により測定して１〜22本目の区分
C1、23〜45本目の区分C2、46〜80本目の区分
C3、および81〜120本目の区分C4の溶出液を得
た。各区分をセフアデツクスLH−20のカラム
に通して脱塩した。区分C1は3.0×120cmのカラ
ムに適し、流出液を7.5mlづつ分画し、28〜42
本目の区分C1Lを得た。区分C2は3.4×120cmに
達し、流出液を7.6mlづつ分画し、33〜40本目
の区分C2L1および41〜62本目の区分C2L2を得
た。区分C3は3.0×120cmのカラムに通し、流出
液を6.0mlづつ分画し、31〜40本目の区分C3L1
および41〜51本目の区分C3L2を得た。区分C4
は、3.4×120cmのカラムに通し、流出液を7.5
mlづつ分画し、35〜48本目の区分C4Lを得た。
各区分を凍結乾燥してC1L区分312mg、C2L1区
分142.3mg、C2L2区分1380mg、C3L1区分104mg、
C3L2区分510mgおよびC4L区分130mgを得た。 前記のC2L2区分1380mgを0.1N酢酸13mlに溶
かし、CM−セルロースのカラム（4.3×6.0cm）
にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）500ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）500mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は7.6mlづつ分画し、40〜50本
目の区分C2L2−C1および53〜77本目の区分
C2L2−C2を得た。各区分をセフアデツクスLH
−20のカラムに通して脱塩した。区分C2L2−
C1は2.9×120cmのカラムに通し、流出液を8.0
mlづつ分画し、26〜30本目の区分C2L2−C1L1
および31〜39本目の区分C2L2−C1L2を得た。
区分C2L2−C2は3.4×120cmのカラムに通し、流
出液を8.0mlづつ分画し、34〜44本目の区分
C2L2−C2L1および45〜53本目の区分C2L2−
C2L2を得た。各区分を凍結乾燥してC2L2−
C1L1区分79.0mg、C2L2−C1L2区分455mg、C2L2
−C2L1区分157.3mgおよびC2L2−C2L2区分551.7
mgを得た。 C2L2−C2L2区分のアミノ酸分析；Asp4.65(5)、
Thr0.97(1)、Ser3.47(4)、Glu5.99(6)、Pro0.93
(1)、Gly1.96(2)、Ala4(4)、Val3.97(4)、
Leu3.01(3)、Lys6.13(6)、His0.93(1)、Arg1.96
(2) 前記のC2L2−C2L2区分を0.1N酢酸５mlに溶
かし、CM−セルロースのカラム（4.2×7.0cm）
にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）300ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）の直線型濃度包配による溶出を行つ
た。溶出液は8.0mlづつ分画し、39〜45本目の
区分C2L2−C2L2−Ｃを得た。この区分をセフ
アデツクスLH−20のカラム（2.9×120cm）の
カラムに通して脱塩した。流出液を8.0mlづつ
分画し、24〜30本目の区分C2L2−C2L2−CL1、
31〜35本目の区分C2L2−C2L2−CL2および36〜
39本目の区分C2L2−C2L2−CL3を得た。各区分
を凍結乾燥してC2L2−C2L2−CL2区分200mgお
よびC2L2−C2L2−CL1区分〔ｈ−PTH（46−
84）〕94.9mgを得た。 TLC；Rf9＝0.76 アミノ酸分析；Asp4.86(5)、Thr0.99(1)、Ser3.5
(4)、Glu6.17(6)、Pro0.96(1)、Gly1.97(2)、
Ala4 Val4.02(4)、Leu2.93(3)、Lys6.05(6)、
His0.90(1)、Arg1.87(2) 参考例 ４ 〔Tyr45〕−ｈ−PTH（46−84）；Ｈ−Try−Ala
−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro−Arg−Lys−
Lys−Glu−Asp−Asn−Val−Leu−Val−Glu
−Ser−His−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−
Glu−Ala−Asp−Lys−Ala−Asp−Val−Asp
−Val−Leu−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−
Gln−OHの製造例。 (1) Ｐ（45−84）；BOC−Try（Bzl−Cl2）−Ala−
Gly−Ser（Bzl）−Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg
（Tos）−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu
（OBzl）−Asp（OBzl）−Asn−Val−Leu−Val
−Glu（OBzl）−Ser（Bzl）−His−Glu（OBzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Leu−Gly−Glu
（OBzl）−Ala−Asp（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−
Ala−Asp（OBzl）−Val−Asp（OBzl）−Val−
Leu−Thr（Bzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ
−Cl）−Ser（Bzl）−Gln−OBzl〔47〕について。 参考例３に記載の〔46〕6.27ｇ（0.9ｍＭ）
にTFA60mlを加え、室温で60分間撹拌した。
反応後、TFAを減圧下留去し、残渣にエーテ
ルを加える。生じた沈澱物を取して脱BOC
化物6.30ｇを得た。 上記脱BOC化物2.10ｇ（0.3ｍＭ）をDMF35
mlとNMP35mlの混液に溶かし、これに０℃に
冷却下BOC−Try（Bzl−Cl2）−OH0.16ｇ（1.2
倍Ｍ）、HOBT0.05ｇ（1.2倍Ｍ）および
WSCI0.07ml（1.2倍Ｍ）を加えた後、室温で一
夜撹拌した。反応後、DMFを減圧下留去し、
残渣に氷水を加え、生じた沈澱物を取して
〔47〕2.00ｇを得た。 (2) 〔Tyr45〕−ｈ−PTH（46−84） 無水HF20mlに０℃に冷却下〔47〕2.00ｇ
（0.27ｍＭ）およびアニソール1.0mlを加え、60
分間撹拌した。反応後、HFを減圧下留去し、
残渣にエーテルを加えた。生じた沈澱物を集
め、0.1N酢酸20mlに溶かし、ダウエツクス×
１のカラム（アセテート型、2.5×15cm）に通
じ、流出液を凍結乾燥して粗生成物1.37ｇを得
た。 これを8M尿素水溶液（PH9.5）50mlに溶か
し、室温で60分間放置した。次いでこの溶液を
8M尿素水溶液で充填したCM−セルロースの
カラム（4.3×8.0cm）にチヤージし、0.01M酢
酸アンモニウム水溶液（PH4.5）400ml〜0.3M
酢酸アンモニウム水溶液（PH4.5）400mlの直線
型濃度勾配による溶出を行つた。溶出液は6.5
mlづつ分画し、各分画はFolin−Lowry法
（500nｍ）により測定して30〜43本目の区分
C1、51〜68本目の区分C2、69〜83本目の区分
C3および84〜100本目の区分C4を得た。各区分
をセフアデツクスLH−20のカラムに通して脱
塩した。区分C1は3.4×120cmのカラムに通し、
流出液を7.5mlづつ分画し、25〜41本目の区分
C1Lを通る区分C2は3.0×120cmのカラムに通
し、流出液を7.5mlづつ分画し、25〜36本目の
区分C2Lを得た。区分C3は2.9×120cmのカラム
に通し、流出液を8.0mlづつ分画し、24〜27本
目の区分C3L1および28〜38本目の区分C3L2を
得た。区分C4は2.9×95cmのカラムに通し、流
出液を7.6mlづつ分画し、20〜25本目の区分
C4L1および26〜30本目の区分C4L2を得た。各
区分を凍結乾燥してC1L区分521.6mg、C2L区分
230.2mg、C3L1区分41.8mg、C3L2区分222.4mg、
C4L1区分74.3mgおよびC4L2区分48.9mgを得た。 前記のC2L区分を0.1N酢酸３mlに溶かし、
CM−セルロースのカラム（2.1×25cm）にチヤ
ージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液（PH
4.5）300ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）300mlの直線型濃度勾配による溶出を
行つた。溶出液は8.0mlづつ分画し、30〜36本
目の区分C2L−Ｃを得た。この区分をセフアデ
ツクスLH−20のカラム（2.9×90cm）のカラム
に通して脱塩した。流出液を8.0mlづつ分画し、
20〜29本目の区分を凍結乾燥して〔Tyr45〕−
ｈ−PTH（46−84）163.3mgを得た。 TLC；Rf9＝0.75 アミノ酸分析；Asp4.86(5)、Thr1.02(1)、
Ser3.51(4)、Glu6.05(6)、Pro0.93(1)、Gly1.90
(2)、Ala4(4)、Val4.00(4)、Leu2.93(3)、
Tyr0.88(1)、Lys6.02(6)、His0.86(1)、Arg1.81
(2) 参考例 ５ 〔Cys（Acm）45〕−ｈ−PTH（46−84）；Ｈ−
Cys（Acm）−Ala−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro
−Arg−Lys−Lys−Glu−Asp−Asn−Val−
Leu−Val−Glu−Ser−His−Glu−Lys−Ser
−Leu−Gly−Glu−Ala−Asp−Lys−Ala−
Asp−Val−Asp−Val−Leu−Thr−Lys−Ala
−Lys−Ser−Gln−OHの製造例。 (1) Ｐ（45−84）；BOC−Cys（Acm）−Aa−Gly
−Ser（Bzl）−Gln−Arg（Tos）−Pro−Arg
（Tos）−Lys（Ｚ−Cl）−Lys（Ｚ−Cl）−Glu
（OBzl）−Asp（OBzl）−Asn−Val−Leu−Val
−Glu（OBzl）−Ser（Bzl）−His−Glu（OBzl）−
Lys（Ｚ−Cl）−Ser（Bzl）−Leu−Gly−Glu
（OBzl）−Ala−Asp（OBzl）−Lys（Ｚ−Cl）−
Ala−Asp（OBzl）−Val−Asp（OBzl）−Val−
Leu−Thr（Bzl）−Lys（Ｚ−Cl）−Ala−Lys（Ｚ
−Cl）−Ser（Bzl）−Gln−OBzl〔48〕について。 参考例４で得た残りの脱BOC化物4.20mg
（0.6ｍＭ）をDMF70mlとNMP70mlの混液に溶
かし、これに０℃に冷却下HOBT0.10ｇ（1.2
倍Ｍ）、BOC−Cys（Acm）−OH0.20ｇ（1.2倍
Ｍ）およびWSCI0.13ml（1.2倍Ｍ）を加えた
後、室温で一夜撹拌した。反応後、DMFを減
圧下留去し、残渣に氷水を加え、生じた沈澱物
を集めた。これをエタノールに懸濁して加熱
し、冷却した後、不溶物を取した。この操作
を２回繰り返して〔48〕4.07ｇ（収率95.0％）
を得た。 (2) 〔Cys（Acm）45〕−ｈ−PTH（46−84）無水
HF60mlに０℃に冷却下〔48〕4.00ｇ（0.57ｍ
Ｍ）およびアニソール10mlを加え、60分間撹拌
した。反応後、HFを減圧下留去し、残渣にエ
ーテルを加えた。生じた沈澱物を集め、20％酢
酸40mlに溶かし、ダウエツクス×１のカラム
（アセテート型、2.8×35cm）に通じ、流出液を
凍結乾燥した。これを8M尿素水溶液50mlに溶
かし、アンモニア水でPH9.0に調節した後、30
分間放置した。次いでこの溶液を8M尿素水溶
液で充填したCM−セルロース（3.4×32cm）に
チヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）700ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）700mlの濃度勾配による溶出を行つた。
溶出液は8.0mlづつ分画し、各分画はFolin−
Lowry法（500nｍ）により測定して25〜35本
目の区分C1、36〜45本目の区分C2および46〜
84本目の区分C3を得た。各区分をセフアデツ
クスLH−20のカラムに通して脱塩した。区分
C2は3.0×120cmのカラムに通し、流出液を8.0
mlづつ分画し、27〜33本目の区分C2L1および
34〜40本目の区分C2L2を得た。区分C3は3.4×
120cmのカラムに通し、流出液を8.0mlづつ分画
し、35〜47本目の区分C3L1および48〜53本目
の区分C3L2を得た。各区分を凍結乾燥して
C2L1区分148mg、C2L2区分620mg、C3L1区分212
mgおよびC3L2区分605mgを得た。 前記のC2L2区分を0.1N酢酸６mlに溶かし、
これをCM−セルロースのカラム（5.0×12cm）
にチヤージし、0.01M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）400ml〜0.3M酢酸アンモニウム水溶液
（PH4.5）400mlの直線型濃度勾配による溶出を
行い、溶出液は6.0mlづつ分画し、110〜126本
目の区分C2L2−Ｃを得た。これをセフアデツ
クスLH−20のカラム（4.0×120cm）に通して
脱塩した。流出液は8.0mlづつ分画し、38〜54
本目の区分C2L2−CLを得た。この区分を凍結
乾燥して〔Cys（Acm）45〕−ｈ−PTH（46−84）
246.8mgを得た。 TLC；Rf9＝0.74 アミノ酸分析；Asp4.91(5)、Thr0.98(1)、
Ser3.50(1)、Glu6.11(6)、Pro0.98(1)、Gly1.98
(2)、Ala4(4)、Val4.04(4)、Cys0.42（0.5）、
Leu2.90(3)、Lys5.99(6)、His0.87(1)、Arg1.87
(2) 参考例 ６ 〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−84）；Ｈ−Cys−Ala
−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro−Arg−Lys−
Lys−Glu−Asp−Asn−Val−Leu−Val−Glu
−Ser−His−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−
Glu−Ala−Asp−Lys−Ala−Asp−Val−Asp
−Val−Leu−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−
Gln−OHの製造例。 参考例５で得た〔Cys（Acm）45〕−ｈ−PTH
（46−84）88mg（0.02ｍＭ）を50％酢酸２mlに溶
かし、これに酢酸第二水銀57.24mg（0.18ｍＭ）
を加えた後、室温で70分間撹拌した。次いで、β
−メルカプトエタノール3.4mlを加え、室温で24
時間撹拌した。反応液を遠心分離し、上澄液をセ
フアデツクスLH−20のカラム（3.2×42cm）にチ
ヤージし、0.1M酢酸で溶出した。溶出液は５ml
づつ分画し、ニンヒドリン反応陽性の９〜14本目
の区分を集め、これを凍結乾燥して〔Cys45〕−ｈ
−PTH（46−84）76.1mgを得た。 TLC；Rf9＝0.73 尚、本明細書中に記載の略記号は次の意味を有
する。 Gln；Ｌ−グルタミン Ser；Ｌ−セリン Lys；Ｌ−リジン Ala；Ｌ−アラニン Thr；Ｌ−スレオニン Leu；Ｌ−ロイシン Val；Ｌ−バリン Asp；Ｌ−アスパラギン酸 Glu；Ｌ−グルタミン酸 Gly；グリシン His；Ｌ−ヒスチジン Asn；Ｌ−アスパラギン Arg；Ｌ−アルギニン Pro；Ｌ−プロリン Tyr；Ｌ−チロシン Cys；Ｌ−システイン BOC；ｔ−ブチルオキシカルボニル AOC；ｔ−アミルオキシカルボニル Ｚ−Cl；ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル Bzl；ベンジル Tos；トシル OMe；メチルエステル OEt；エチルエステル OBzl；ベンジルエステル OSU；Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル ONP；ｐ−ニトロフエニルエステル PAC；フエナシルエステル Acm；アセトアミドメチル TosoH；ｐ−トルエンスルホン酸 TFA；トリフルオロ酢酸 Et3N；トリエチルアミン TBA；トリベンジルアミン NMM；Ｎ−メチルモルホリン HOBT；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール DMF；ジメチルホルムアミド THF；テトラヒドロフラン NMP；Ｎ−メチル−２−ピロリドン MeOH；メタノール EtOH；エタノール BuOH；ブタノール エーテル；ジエチルエーテル WSCI；Ｎ−エチル、N′−３−ジメチルアミノプ
ロピル−カルボジイミド HOBT；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール また使用した薄層クロマトグラフイー（TLC）
の担体および展開溶媒は次の通りである。 担体；メルク社製シリカゲルＧ 展開溶媒； １；CHCl3−MeOH−酢酸（95：５：３） ２； 〃 （85：15：５） ３； 〃 （85：10：５） ４； 〃 （80：25：２） ５；ベンゼン−酢酸エチル（１：１） ６；ベンゼン−酢酸エチル（２：１） ７；CHCl3−EtOH−酢酸エチル（５：２：５） ８；CHCl3−EtOH−酢酸エチル（10：１：５） 担体；メルク社製セルロース 展開溶媒； ９；BuOH−ピリジン−酢酸−水（２：２：２：
３） 10；BuOH−ピリジン−酢酸−水（１：１：１：
２）
第１図はｈ−PTH（53−84）を抗原として得ら
れた抗血清を用いてなる標準曲線、第２図はｈ−
PTH（51−84）を抗原として得られた抗血清を用
いてなる標準曲線、第３図はｈ−PTH（46−84）
を抗原として得られた抗血清を用いてなる標準曲
線、第４図はBSA−〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−
84）を抗原として得られた抗血清を用いてなる標
準曲線、第５図はｈ−PTH（46−84）を抗原とし
て得られた抗血清、およびヒト−PTH（１−84）
を用いてなる標準曲線、第６図はｈ−PTH（46−
84）を抗原として得られた抗血清の標準曲線と慢
性腎不全患者血清を試料として同一抗血清を用い
てなる定量曲線、第７図はBSA−〔Cys45〕−ｈ−
PTH（46−84）を抗原として得られた抗血清によ
る各種血清の定量結果を示す。
れた抗血清を用いてなる標準曲線、第２図はｈ−
PTH（51−84）を抗原として得られた抗血清を用
いてなる標準曲線、第３図はｈ−PTH（46−84）
を抗原として得られた抗血清を用いてなる標準曲
線、第４図はBSA−〔Cys45〕−ｈ−PTH（46−
84）を抗原として得られた抗血清を用いてなる標
準曲線、第５図はｈ−PTH（46−84）を抗原とし
て得られた抗血清、およびヒト−PTH（１−84）
を用いてなる標準曲線、第６図はｈ−PTH（46−
84）を抗原として得られた抗血清の標準曲線と慢
性腎不全患者血清を試料として同一抗血清を用い
てなる定量曲線、第７図はBSA−〔Cys45〕−ｈ−
PTH（46−84）を抗原として得られた抗血清によ
る各種血清の定量結果を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒト−PTHまたはそのＣ末端フラグメント
を含有する被検液に、免疫反応媒体中、標識抗原
としてラジオ・アイソトープ標識したヒト−
PTHのＣ末端フラグメントおよび抗体として下
記一般式〔〕 R2−Ala−Gly−Ser−Gln−Arg−Pro−Arg−Lys−Lys−G
lu−Asp−Asn−Val−Leu −Val−Glu−Ser−His−Glu−Lys−Ser−Leu−Gly−G
lu−Ala−Asp−Lys−Ala−Asp −Val−Asp−Val−Leu−Thr−Lys−Ala−Lys−Ser−G
ln−OH〔〕 （ただし式中、R2はＨまたはＨ−R3−基、R3は
Cys基またはTyr基を示す）で表わされるペプチ
ドを用いてヒト以外の哺乳動物に感作せしめて得
られる特異的抗体を反応せしめ、次いで反応によ
つて結合した部分と結合していない遊離部とを分
離し、その後結合した部分または結合していない
誘離部のラジオ・アイソトープの放射活性を測定
することを特徴とする被検液のヒト−PTHまた
はそのＣ末端フラグメントの測定法。 ２ 抗体が、R2がＨ−R3−基であり、R3がCys
基である一般式〔〕で表わされるペプチドを用
いて得られる抗体である特許請求の範囲第１項記
載の測定法。 ３ 抗体が、R2がＨ−R3−基であり、R3がCys
基である一般式〔〕で表わされるペプチド−蛋
白質結合体を用いて得られる抗体である特許請求
の範囲第１項記載の測定法。 ４ ラジオ・アイソトープ標識したヒト−PTH
のＣ末端フラグメントが、一般式〔〕で表わさ
れるペプチドのラジオ・アイソトープ標識体であ
る特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ５ 一般式〔〕で表わされるペプチドが、R2
がＨ−R3−基であり、R3がTyr基である特許請
求の範囲第４項記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3837681A JPS5824860A (ja) | 1981-03-16 | 1981-03-16 | ヒト−ｐｔｈの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3837681A JPS5824860A (ja) | 1981-03-16 | 1981-03-16 | ヒト−ｐｔｈの測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5824860A JPS5824860A (ja) | 1983-02-14 |
| JPH0122902B2 true JPH0122902B2 (ja) | 1989-04-28 |
Family
ID=12523558
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3837681A Granted JPS5824860A (ja) | 1981-03-16 | 1981-03-16 | ヒト−ｐｔｈの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5824860A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0672880B2 (ja) * | 1985-10-09 | 1994-09-14 | ヤマサ醤油株式会社 | イムノアッセイ用試薬 |
-
1981
- 1981-03-16 JP JP3837681A patent/JPS5824860A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5824860A (ja) | 1983-02-14 |
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