JPH01224392A - 新規核酸誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素を１１１用したＤＮＡ合成において、合
成原料として有用な基質である新規核酸誘導体に関する
しのである。

［従来の技術および課題］ 従来、ウィルス等の増殖を阻害する方法として、ウィル
ス由来のｍＲＮ　Ａの塩基配列に対して相補なオリゴデ
オキシリボヌクレオチドをウィルスに作用させることに
より、その蛋白合成を阻害し増殖を抑制する方法が知ら
れていた。この方法の基礎となる理論は、発癌遺伝子を
有する癌細胞等にも応用が可能であることから、抗ウィ
ルス剤、抗癌剤を開発する上で重要な意義を有する。す
なわち、これらに由来するｍ　ＲＮ　Ａの塩基配列に対
して相補なオリゴデオキシリボヌクレオチド（以下、単
にオリゴデオキシリボヌクレオチドと称する。）を投与
することにより癌細胞の増殖抑制、ウィルスの増殖抑制
等の医療上有用な効果が期待されるのである。

ところで、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、ＤＮＡ
合成装置等で容易に合成することができるものの、核酸
分解酵素により分解されやすく、また、細胞透過性が低
いという性質のために医薬品としては不適当な物質であ
るという欠点を何していた。

そこで、オリゴデオキシリボヌクレオチドのヌクレオノ
ド間のリン酸をメチルリン酸結合に替えることで、核酸
分解酵素に安定で、細胞透過性が良好なオリゴデオキシ
リボヌクレオチド（以下、メチルリン酸化したオリゴデ
オキシリボヌクレオチドと称する。）が得られることが
見いたされた。

し、かじ、メチルリン酸化したオリゴデオキシリボヌク
レオチドを、ＤＮＡ合成装置によって合成するとなると
生産効率が低すぎるため、医薬品として供給するために
は、より効率的にメチルリン酸化したオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドを合成する必要があった・ ［課題を解決するための手段］ 本発明者は、より効率的にメチルリン酸化したオリゴデ
オキシリボヌクレオチドを合成するためには、酵素を利
用した合成法を確立すべきであると考え、鋭き研究した
結果、その合成法において有用な原料となる新規核酸誘
導体を見いだすに至った。すなわち本発明は、 （式中、Ｒはシトシン残基、アデニン残基、チミン残基
、またはグアニン残基を示す。）で表される化合物およ
びその塩（以下、本発明の化合物と称する。）である。

本発明の化合物は、例えば以下のように合成して得るこ
とができる。

出発物質となる核酸としては、市販のチミジン、Ｎ４−
ベンゾイル−２°−デオキシシチジン、Ｎ８−ベンゾイ
ル−２゛−デオキシアデノシンまたはＮ２−イソブチリ
ル−２°−デオキシグアノノンの５゛位の一級水酸基を
４，４′−ジメトキシトリチルクロライト等を用いて保
護し、次いで３゛位の二級水酸基を無水酢酸処理等によ
り保護した後、５゛位の一級水酸基の保護基を除き、こ
れにメチルリン酸を結合させ、３゛位の水酸基の保護基
および核酸塩基のアミノ基の保護基を除き、さらにビロ
リン酸と反応させることにより得ることができる。

出発物質の核酸のうち、Ｎ４−ベンゾイル−２°−デオ
キシシチジンおよびＮ８−ベンゾイル−２°−デオキシ
アデノシンについては、市販の２′−デオキシシチジン
および２゛−デオキシアデノシンのアミノ基をベンゾイ
ルクロリド等で処理することにより、また、Ｎ！−イソ
ブチリル−２゛−デオキシグアノシンについては、市販
の２°−デオキシグアノシンのアミノ基をイソブチリル
クロリド等で処理することにより得ることもできる。

５゛位の一級水酸基の保護は、ピリノン等の溶媒中、４
．４゛−ジメトキシトリチルクロライドを室温下、３〜
９時間作用させろことにより終了する。また、場合によ
っては５゛位の一級水酸基を保護した市販品を用いる三
とができる。

３゛位の二級水酸基の保護は、無水ピリジン等の溶媒中
、無水酢酸を室温下、１〜２日間作用させることにより
終了する。

この反応液に２％ベンゼンスルホン酸クロロホルム−メ
タノール溶液を加えることにより５゛位の一級水酸基の
保護基を除くことができる。

メチルリン酸を結合させるには、無水ピ°リジン中ジシ
クロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いることに
より達成される。

３゛位の水酸基の保護基および核酸塩基のアミビロリン
酸との反応は、常法に従い、無水ジメチルフラン中Ｎ、
Ｎ’カルボニルジイミダゾールとヌクレオチドを反応さ
せた後ビロリン酸を加えることにより行うことができる
。

このようにして得た本発明の化合物は、酵素を利用して
メチルリン酸化したオリゴデオキシリボヌクレオチドを
合成するにあたり、原料となる基質として有用である。

また、合成過程においては、本発明の化合物のα位リン
原子において反応が進行するものであるから、本発明の
化合物はどのような塩であっても反応は進行する。具体
的な塩としてはナトリウム塩、トリエチルアミン塩また
はアンモニウム塩等が挙げられる。

合成に用いる酵素としては、市販のＤＮＡポリメラーゼ
、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素等を用い
ることができ、鋳型またはブライマーは必要とする配列
に従って適宜ＤＮＡ合成装置により合成したらのを用い
ることができる。

酵素反応は、酵素の性質によって適宜、温度、時間等の
条件を設定して行う、反応液としてトリス塩酸緩衝液（
逆転写酵素）、カコジル酸ナトリウム緩衝液（ターミナ
ルトランスフェラーゼ）またはリン酸カリウム緩衝液（
Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ）等を用いろことができろ。

次にメチルリン酸化しｆこオリゴデオキシリボヌクレオ
チドの製造の具体例を示す。

実験例 鋳型として３″−ＧＡＡＡＣＡＧＧＡＣＣＴΔＡＡ　Ａ
　Ａ　ＣＡ　Ａ　−５°、ブライマーとして５　ニーＣ
Ｔ　ＴＴＧＴＣＣＴＧＧＡ−３°をＤＮＡ合成装置によ
り合成し、最終濃度として、トリス塩酸（ｐＨ８，３）
５０２Ｈ１塩化カリウム５０關、塩化マグネシウム２０
緒、ノチオスレイトールＩＯｕＭの各濃度からなる反応
混合液中に鋳型０．ｌＯＤ、プライマー０．０５０Ｄ、
後記実施例で得た化合物０．５０　Ｄ。

逆転写酵素１００単位を加えて３７°Ｃで１日反応させ
た結果、５°−ＣＴ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　ＣＣＴ　Ｇ　Ｇ
　Ａ　ｐＣＨ３Ｔ　ｐｃＩ１３Ｔ　１）Ｃ１１３Ｔ　ｐ
ｃｌｌ＊　Ｔ　−３′を得た。

次に、実施例を示し本発明を具体的に説明するが、これ
により本発明は同等制限されない。

実施例１ チミジン（ヤマサ醤油株式会社製）３６ｇをピリジン１
５０−に溶解した後、４．４°−ジメトキシトリデルク
ロリド（同仁化学株式会社製）５６．８ｇを加え、室温
で４時間撹拌した。得られた反応液にメタノール１０滅
を加え、クロロホルムで抽出、水洗後、有機層を減圧上
濃縮して得た残渣をエーテルに加え、沈殿とし、５′−
〇　−（４，４°−ジメトキシトリデル）デミジン８２
．８ｇを得た。

この５°−０−（４，４°−ジメトキシトリデル）チミ
ジン３９を無水ピリジン４０７に溶解し、無水酢酸２．
５−を加え、室温で１日撹拌した。得られた反応液を減
圧上濃縮後、水冷下、２％ベンゼンスルホン酸クロロホ
ルム−メタノール（７：３　）溶液９５７を加え、室温
で１時間撹拌後、５％炭酸水素ナトリウム溶液１９．５
−を加え、クロロホルムで抽出、水洗後、有機層を減圧
上濃縮して得た残渣をエーテル−ヘキサン（１：１）に
加え、沈殿とし、３′−０−アセチルデミノン６７３１
１９を得た。

この３”−Ｏ〜ルアセチルチミジン　００　Ｉｌ！９お
よびメチルリン酸６００句を無水ピリジン６０−に溶解
し、シンクロヘキシルカルボッイミド５．５９を加え、
室温で３日間撹拌した。得られた反応液を冷水に注ぎ、
２５°Ｃで、２時間撹拌後、不溶物を濾別し、濾液を石
油エーテルで抽出し、水層を減圧上濃縮した。残渣をメ
タノール２５ｄに溶解し、１．５Ｍアンモニア−メタノ
ール溶液２５７を加え、室温で１６時間撹拌した。得ら
れた反応液を減圧上濃縮して得た残渣をセファデックス
Ｇ−１５を用いて、ゲル濾過を行い溶出する紫外線吸収
を示す部分を集め、チミジン５′−Ｏ−メチルホスホネ
ートアンモニウム塩５５０　Ｒ９を得た。

このデミジン５°−０−メチルホスホネートアンモニウ
ム塩３３ｍｇを無水ピリジンおよび無水ジメチルフラン
で共沸した後、無水ジメチルフラン１、ｄに溶解し、Ｎ
、Ｎ’−力ルボニルジイミダゾール８０Ｍ９を無水ジメ
チルフランｌ−に溶解したものを加えて、１時間撹拌し
た。得られた反応液にビロリン酸トリブチルアミン塩１
ｍ−をジメチルフラン５ｄに溶解したものを加え、さら
に１時間撹拌し、析出する沈殿を遠心分離して除き、母
液を減圧上濃縮して得た残渣をＤＥＡＥ　トヨバール　
６５０Ｍ［展開溶媒：０．０５〜０．２５Ｎ）リエチル
アンモニウム炭酸緩衝液（ｐｌ＋　７　、５　Ｂを用い
て精製を行い溶出する紫外線吸収を示す部分を集め、減
圧上濃縮し、ナトリウム塩に変換することにより化合物
２１１１９を得た。

下記に示す理化学的性質により本発明の化合物であるチ
ミジン５°−メチルホスホニルピロホスフェート３ナト
リウム塩であると決定した。

マススペクトル　ｍＨｚ： ５４７　（Ｍ”、　ｌ　）、　　５６９　（Ｍ”、Ｎａ
）紫外線吸収スペクトル　λ□ｘ　刀ｍ（ｉｎ、Ｈｔｏ
　）２６６．７ 実施例２ Ｒ８−ベンゾイル−５’−０−（４，４°−ジメトキシ
トリデル）−２°−デオキシアデノシン（同位化学）６
．６９を無水ピリジン９７７に溶解し、無水酢酸４．２
ｄを加え、室温で１日撹拌した。得られた反応液を減圧
上濃縮後、水冷下、２％ベンゼンスルホシ酸クロロホル
ム−メタノール（７：３）溶液３２４ｄを加え、水冷下
１０分間撹拌後０．５％炭酸水素ナトリウム溶液１２０
７を加え、クロロホルムで抽出、水洗後、有機層を減圧
下濃縮して得た残渣をエーテル−ヘキサン（１：Ｉ）に
加え、沈殿とし、Ｎ６−ペンゾイルー３°−０−（アセ
チル）−２°−デオキシアデノノン２．＝１９を得た。

このＮ６−ヘンゾイルー３゛−０−アセデル−２゛−デ
オキシアデノシン２００〜およびメチルリン酸１５２〜
を無水ピリジン１４／１ｔｆｌに溶解し、ノンクロへキ
ノルカルボジイミド１．２ｇを加え、室温で３日間撹拌
した。得られた反応液を冷水に注ぎ、２５℃で、２時間
撹拌後、不溶物を濾別し、濾液を石油エーテルで抽出し
、水層を減圧下濃縮した。

残渣をメタノール５−に溶解し、濃アンモニア水１０、
ｄを加え、室温で１３時間撹拌した。得られた反応液を
減圧下濃縮して得た残渣をセファデックスＧ−１５を用
いて、ゲル濾過を行い溶出する紫外線吸収を示す部分を
集め、２°−デオキシアデノシン−５゛−Ｏ−メチルホ
スホネートアンモニウム塩１２０肩９を得た。

この２°−デオキシアデノシン−５゛−０−メチルホス
ホネートアンモニウム塩３５ｍ９を無水ピリジンおよび
無水ツメチルフランで共沸した後、無水ジメチルフラン
１−に溶解し、Ｎ、Ｎ’−カルボニルジイミダゾール８
０ｍｇを無水ジメチルフランｌ　ｔｒｔＱに溶解したも
のを加えて、１時間撹拌した。得られた反応液にピロリ
ン酸トリブチルアミン塩１ｍ−をジメチルフラン５ｄに
溶解したものを加え、さらに１時間撹拌し、析出する沈
殿を遠心分離して除き、母液を減圧下濃縮して得た残渣
をＤＥＡＥ　　）ヨパール　６５０Ｍ［展開溶媒：０．
０５〜０．２５Ｎトリエチルアンモニウム炭酸緩衝液（
ｐＨ７、５）］を用いて精製を行い溶出する紫外線吸収
を示す部分を集め、減圧下濃縮し、ナトリウム塩に変換
することにより化合物１９Ｍ９を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒはシトシン残基、アデニン残基、チミン残基
   、またはグアニン残基を示す。）で表される化合物およ
   びその塩。