JPH01221669A - イムノアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はイムノアッセイおよびイムノアッセイに使用す
るための試験キットに関するものである。

さらに詳しくは、本発明は非凝集性ウシ赤血球細胞のイ
ムノアッセイへの利用に関するものである。

ＩＱＭ抗体捕獲アッセイは最初Ａ型肝炎および風疹ウィ
ルス特異性ＩＱＭの検出で報告された（　ｔ＋ｕｅｒｍ
ｅｙｅｒら、Ｊ、Ｈｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、　４　巻、２５
−３２頁、１９７９年；　Ｆｌｅｈａｉｎ（Ｊら、Ｊ、
　Ｉｕｆ、旧ｓ、１４０巻、１６９−１７５頁、１９７
９年；　ＫｒｅｃｈおよびＷｉｌｈａｌｍ、Ｊ、Ｇｅｎ
、Ｖｉｒｏｌ、　４４巻、２８１−２８６頁、１９７９
年）。それ以後、この技術は多くの微生物感染の診断に
応用されてきた。ｐｒｉｃｅ　　（Ｊ。

１ｍ１Ｉｌｕｎｏ１．ｍｅｔｈｏｄｓ、　３２巻、２６
１−２７３頁、１９８０年）および計ｅｇｈ目【および
５ｉｌｌｉｓ　（Ｊ、ＩＩＶＯ。

Ｃａｍｂ、９４’ｌＪ、２１７−２２７頁、１９８５年
）は肺炎マイコプラズマ特異性１ａＭ検出用μ−捕獲Ｅ
ＬＩＳＡを開発し、これが感度が高く、信頼性の高い特
異的な試験であることを見つけた。

ここに新しい抗原特異性免疫グロブリン捕獲試験法を考
案した。抗−免疫グロブリン試薬とカップルした、いわ
ゆる非凝集性ウシ赤血球細胞は対応する免疫グロブリン
を添加するとそれを吸収する。この段階では細胞膜が異
常な構造をしているために赤血球凝集を起さない。しか
し、このウシ赤血球細胞は対応する適当な抗原と一緒に
なると凝集する。この現象から抗体および抗原の両方の
測定法が提供できる。

従って本発明は、複数個のエピトープを有する予め決め
た抗原に対して特異性の抗体、または複数個のエピトー
プを有する予め決めた抗原を測定する方法を提供し、そ
の方法は、 （ｉｉｉ）　　免疫グロブリン結合剤を結合した非凝集
性ウシ赤血球細胞を、抗体を測定する場合には試料′と
、或いは抗原を測定する場合には抗原に特異的な抗体と
接触させ、 （１１）　　このように処理した赤血球ｆ／！Ａ胞を、
抗体の測定の場合は抗体が特異性を示す抗原と、抗原測
定の場合は試料と接触させ、そして、 （ｉｉｉ）　　赤血球凝集が起るかどうか判定すること
より成る。

このような測定法は同等のμ−捕獲ＥＬＩＳＡ測定法に
対する抗原特異性ＩＱＭの優位性のような多くの長所を
有する。利点は測定法の単純さ、必要な時間がＥＬＩＳ
Ａ測定での２４時間でなく１〜２時間である点、および
特別の装置を必要としない点などがある。抗体、典型的
にはモノクローナル抗体、は予備精製や抗原測定でのス
テップ（ｉｉｉ）に於ける赤血球細胞とのカップリング
なしで使用することが出来る。

添付の図面中： 第１図は本発明による抗原特異性１（７Ｍ赤血球細胞捕
獲測定法を図示したものであり、第２図は赤血球細胞１
ｇＭ−抗体捕獲測定法（左）とμ−捕獲ＥＬ［ＳＡ（右
）の比較であり、第３図は捕獲モノクローナル抗体を用
いた本発明による抗原測定法を図示したものであり、第
４図はＨ，ｐｎｅｕｎ＋ｏｎｉａｅ感染（実施例１）を
示唆する臨床的特徴を有する患者からの血清４７検体に
ついての赤血球１ｇＭ抗体捕獲力価とＩａＭのμ−捕獲
ＥＬＩＳＡ単位の相関を示し、第５図はＨ，ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ感染（実施例１）が確認されてからいろいろ
な時間後に採取した血清中のＨ，ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
特異１ａＭの量を赤血球Ｉａ抗体捕獲試験により検出し
た値（ム）およびμ−捕獲ＥＬＩＳＡによる値（Φ）を
示す。点線は陽性切り捨て値を表わす。

第６図は実施例３の赤血球１ｏＥ抗体捕獲測定法を図示
し、赤血球凝集が起った希釈を示してあり二また、 第７図は実施例４に示寸（２）抗マウスＩｇＧをカップ
ルした安定化「非凝集性」ウシ赤血球、または（ｂ）マ
ウスＩｇＧをカップルした安定化ウシ赤血球を用いたク
ラミジア抗原測定の結果を示す。

％は室温で０．５時間インキュベーション後の陽性ＲＰ
Ｈを示す。■は室温で一晩インキュベーション後の陽性
ＲＰＨを示す。

測定には非凝集性ウシ（ウシ科）赤血球細胞が必要であ
る。多くの動物の赤血球と違って、ウシ赤血球は特異抗
体で容易には凝集しない。完全に感作してもいくつかの
試料だけが凝集し、しかも感作血清の溶血力価（Ｃｏｏ
Ｉｌｂｓら、Ｂｒ１ｔ、Ｊ、ｅｘｐ。

Ｐａｔｈ、　３２巻、１９５−２０２頁、１９５１年）
から予想されるよりずっと低い度合である。

非凝集性ウシ赤血球細胞は認められたタイプの細胞であ
る。Ｇｌｃｃｓｏｎ−Ｗｈｉｔｅら、Ｂｒ１ｔ、Ｊ、ｅ
ｘｐ。

Ｐａｔｈ、３１巻、３２１−３３１頁、１９５０年：Ｕ
ｈｌｅｎｂｒｕｃｋら、Ｖｏｘ　５ａｎａ、　　１２巻
、４２０−４２８頁、１９６７年：およびＥｄｅｂｏら
、５Ｃａｎｄ、　Ｊ。

１＊ｍｕｎｏ１．１２巻、１９３−２０１頁、１９８０
年も参照のこと。非凝集性細胞はｊｇＭＰａｕｌ−Ｂｕ
ｎｎｃｌ　ｌ抗体（Ｇｌｅｅｓｏｎ−（ｉｔｅら、１９
５０年）を用いた相対凝集性に基づいで、３つのクラス
へと便宜的に分類される。３つのクラスは「より凝集性
」、「中間」および「より非凝集性」と呼べる。これら
のクラスは元々はＧｌｅｅｓｏｎ−１４ｈｉｔｅらによ
り「良好凝集性」、［中庸凝集性１および「非凝集性」
と呼ばれた。しかし、「より凝集性」赤血球細胞でも他
の細胞タイプと比較すると非凝集性である。従ってこれ
ら３クラスのＩＩＩ！ａはいずれも測定には使用しない
。

抗グロブリン或いは他の免疫グロブリン結合剤を非凝集
性赤血球に結合する。どんな免疫グロブリン結合剤でも
使用できる。しかし結合剤は結合する免疫グロブリンの
抗原結合部位を妨げてはならない。また、結合剤は免疫
グロブリンのクラス１０Ｇ、ＩｇＡ、ＩａＭ、　Ｉｇｏ
およびＩＧＥの一つに特異的である必要がある。好まし
くは、抗体測定は特定のアイソタイプの免疫グロブリン
に対して行なう。

ＩｇＧに結合したいと望むのならば免疫グロブリン結合
剤として抗−γ抗体を使用できる。同様に、抗−α、抗
−μ、抗−δおよび抗−ε抗体をそれぞれＩＯＡ、ＩＧ
Ｍ、ＩｏＤおよびＩａＥを結合するのに使用できる。通
常構体は捕Ｗｌ′する免疫グロブリンの種に特異性を示
す。伯の免疫グロブリン結合剤としては、プロティンＡ
またはアビジン−ビオチン系のように免疫グロブリンの
Ｆｃ領域と結合することが出来るものがある。

免疫グロブリン結合剤を非凝集性赤血球とカップルする
には塩化クロムを使用するのが好ましい。

しかし、他の適当なカップリング剤も使用できる。

抗体の測定（Ｌｔｌｌｉ獲測宝） 抗体捕獲測定法は抗体、例えば特定のアイソタイプの抗
体、の試料から免疫グロブリン結合剤を結合した非凝集
性ウシ赤血球への吸着または「捕獲」に基づいている。

この段階では、免疫グロブリン結合剤を結合した赤血球
膜のたん白質骨格から長いムコペプチド鎖が伸びている
ために捕獲された抗体分子は架橋したり細胞間で結合す
ることが出来ず、従って赤血球凝集（実際には逆受身赤
血球凝集成いはＲＰ　Ｈ）は起らない１．捕獲した抗体
に特異的に反応する抗原分子をさらに添加した時のみ凝
集（むしろＲＰＨである）が起る。この時には恐らく分
子鎖は赤血膜の１有効表層」を超えて到達する大きさで
あろう。

さらに詳しくは、試料は典型的にはヒ１−血清である。

試料は通常緩衝溶液に希釈する。次に免疫グロブリン結
合剤を結合した赤血球のけん濁液を添加してインキュベ
ートする。続いて細胞を集めて洗滌し、緩衝溶液に再番
゛ノん渇する。測定しようとする抗体が特賃性を示す抗
原を次に添加してＲＰＨを測定する。抗原はより大きい
基：例えば［ＱＭ或いは好ましくは凝集性のヒツジ赤血
球細胞と結合して使用できる。そのような赤血球細胞は
ヒツジ赤血球をキモトリプシン処理して得られる。

特定試料中の抗体力価は試料の倍々希釈液を試験するこ
とにより容易に検定できる。血清試料の場合には、高い
力価は対応する微生物に最近感染したことを示す。

ＩＱＭ抗体捕獲測定法は第１図に示しである。

例えば中庸クラスの非凝集性ウシ赤血球１に抗−μ抗体
２をカップルする。これは赤血球に塩化クロムでカップ
ルしたヒツジ抗ヒトμでよい。上記赤血球１を患者血清
と接触すると１０Ｍ３が捕獲される。このＩ　ａ　Ｍ　
［３）は抗原特異結合部位４を有する。Ｈ，ｐｎｅｕｌ
Ｏｎｉａｅのような適当な抗原５を添加するとＲＰＨが
起る。赤血球膜にたん白質骨格６が存在する。ジアール
酸がＶ３合しているムコペプチド鎖７のため＄１胞が非
凝集性である。しかし、抗原５を添加すると分子鎖が赤
血球膜の有効表層８を超えて伸びる。従ってＲＰＨが起
る。

このようなＩａＭ−抗体捕獲測定法は実施が筒便で洗滌
や測定のための高価な装置を必要としない。これは他の
抗体の捕獲測定にも応用できる。

この試験は２４時間もかかるμ−捕獲ＥＬＩＳＡと比較
して１から２時間で実施できる。従って、ＩｇＭ−抗体
捕獲試験は迅速な診断に適しており、これはＨ，ｐｎｅ
ｕ＋＋ｏｎｉａｅ感染が抗性物質療法に応答するので重
要なことである。

第２図ではＩＱＭ−抗体捕獲測定法をμ−捕獲ＥＬＩＳ
Ａ測定法と比較しである。ＩＯＭ−抗体捕獲測定法（左
）は試料からの［）Ｍの捕獲と続く抗原添加が係わる。

その後赤血球凝集（ＲＰＨ）が測定できる。一方、μ−
捕獲ＥＬＩＳＡ（右）ではもつと多くの段階を伴なう：
試料からのＩＱＭの捕獲、抗原の添加、その抗原と結合
することが出来る酵素と連結した抗体９の添加、醇素基
買の添加。最後に吸収値を測定する。これらの中間に洗
滌ステップがあることも考慮する必要がある。

区Ｗ 抗体捕獲測定法の基本となる原理が抗原の測定法にも使
用できる。測定しようとする抗原に特異的な抗体を免疫
グロブリン結合剤を結合した赤血球と接触させ、結合す
る。この抗体はポリクローナル抗体でもよいが、好まし
くはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を
使用することにより抗体の赤血球への直接結合を回避で
きる。

使用する抗体量は少なくてよい。腹水または培養上澄液
のような比較的純粋でない抗体も使用できる。従って、
例えばモノクローナル抗体［ｉ液の透析も必要でない。

試料を次に免疫グロブリン結合剤を介して抗体を結合し
た赤血球細胞と接触させる。添加する試料はヒト血清、
或いは分泌または排ｄ１１物である。

抗体に特異な試料中の抗原は抗体と結合する。

ＲＰＨが起り、追跡できる。この測定は検定する抗原に
特異的な抗体を非凝集性赤血球に結合した抗免疫グロブ
リンに捕獲することに依るので、［捕獲ＲＰＨＪと呼ぶ
ことができる。

実際には、適当な免疫グロブリン結合剤を結合した赤血
球のけん濁液と測定しようとする抗原に特異的な抗体の
けん濁液を混合し、インキュベートする。次にｍ胞を集
めて洗滌し、緩衝液に再けん濁する。次に試料を、典型
的には緩衝液で希釈して、添加してＲＰＨを追跡する。

捕１１ＲＰＨに関連する手法を第３図に示す。例えば中
庸クラスの非凝集性赤血球１（ｂ）に免疫グロブリン結
合抗体をカップルする。この例では抗−γ抗体１１およ
び抗−μ抗体１２である。９両方の抗体共塩化クロムで
赤血球６にカップルしたヒツジ抗マウス免疫グロブリン
である。次に赤血球１０を測定しようとする抗原に特異
的なモノクローナル抗体と接触させる。ＩＧＧモノクロ
ーナル抗体１３およびＩＱＭモノクロ−ｊ゛ル抗体１４
はそれぞれ抗−γ抗体１１および抗−μ抗体１２により
捕獲される。族グロブリンが抗マウス免疫グロブリンの
場合にはモノクローナル抗体はマウス由来である。

赤血球膜のたん白質骨格１５からはジアール酸が結合し
たムコペプチド鎖１６が伸長している。

この鎖のために細胞が比較的非凝集性となる。しかし、
モノクローナル抗体の抗原結合部位１８により認識され
る反復したエピトープを有する微生物抗原１７を添加す
ると、分子鎖は赤血球膜の有効表層１９を超えて伸長す
る。こうしてＲＰＨが起る。

抗原は大容量の試料でも検出できる。そのような試料の
場合には抗体結合赤血球のけん濁液と室温で例えば３０
分から２４Ｒｆｉｌインキユベートする。試料の容量は
１００μｌから１０ａｇ或いはそれ以上でもよいが、大
量の試料の場合にはインキュベーション時間を長くする
必要がある。抗体連結赤血球への抗原のアフィニティー
吸着が起る。

次にアフィニティー捕獲された抗原を有する赤血球を遠
心分離で集め、より少量の液体、例えば遠心分離の上澄
液に再けん渇する。ＲＰＩ−１を判定できる。この測定
法は特に尿や糞便抽出物および他の体液など多山の試料
籾が使用できるような試験に有用である。

複数個のエピトープを有し、予め決めた抗原に特異的な
抗体、或いは複数個のエピトープを有する予め決めた抗
原を測定するのに必要な成分は試験キットとして提供さ
れる。そのようなキットは：（ｉｉｉ）　　免疫グロブ
リン結合剤を結合した非凝集性ウシ赤血球１１０１：お
よび （ｉｉｌ　　抗体測定の場合はその抗体が特異性を示す
抗原、また抗原測定の場合には抗原に特異的な抗体、を
含有する。

好ましくは成分（ｉｉｉ）はＧＢ−Ａ−２１３８１３２
による安定化した形態で提供される。免疫グロブリン結
合剤が結合した赤血球細胞をα、ω−脂肪族ジアルデヒ
ド、通常はグルタルアルデヒドで処理して凍結乾燥する
。

試験キットは緩衝液、洗滌液および／または測定しよう
とする抗体の対照液或は測定しようとする抗原の対照液
などの成分を含む場合もある。

測定は定性的または半定量的測定として実施できる。１
個以上のエピトープを有する抗原およびそのような抗原
に対する抗体は何でも測定できる。

本測定法のステップ（ｉｉ）ではＲＰＨを起すために複
数エピトープ抗原であることが必須である。好ましくは
、エピトープは同一である。従って測定は例えばバクテ
リア、ウィルスまたはカビなどの微生物抗原およびその
ような抗原に対する抗体について行なうことが出来る。

赤血球凝集が、抗体測定の場合には試料中に測定する抗
体が存在する時、また抗原測定の場合には試験試料中に
測定する抗原が存在する時に起るという知識の下に本測
定を実施すべきである。ステップ（ｉｉｉ）で免疫グロ
ブリン結合剤と結合する抗体およびステップ（ｉｉ）で
この抗体と結合する対応抗原は両者共ステップ（ｉでＲ
ＰＨが起るのに十分大きくなければならない。ステップ
（ｉｌでの抗体がＨＪＭ或いはステップ（ｉｉｌの抗原
が微生物抗原である時は問題はない。

本発明による測定の前或いは測定と同時に対照測定を実
施しなければならない。対照測定ではステップ（ｉｉｉ
）から（ｉｉｉ）は試験試料の代わりに測定する抗体の
対照溶液または測定する抗原の対照溶液を使用する以外
は同じように行なう。ステップ（ｉｉｉ）での免疫グロ
ブリン結合剤に結合する抗体およびステップ（ｉｉ）で
のその抗体と結合する対応抗原が十分大きければステッ
プ（ωでＲＰＨが起る。典型的には抗原を含む２００　
ＫＯまたはそれ以上の部分を使用する。この目的のため
に抗原はｌ０Ｍ１或いはより好ましくは凝集性ヒツジ赤
血球と必要ならカップルさせる。

試験はヒト疾患を起す広範囲の微生物病原体に起因する
感染を検出するのに有効である。例えば、Ｈ，ｐｎｅｔ
＋１ＯｎｉａｅおよびＣｈｌａｌｖｄｉａ　ｐｓｉｔｔ
ａｃｉやＢｒｕＣｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓのようなそ
の他のヒト病原体に対する抗体を検出することが出来る
。高いＩｇＭ抗体値は現在または最近の感染を表わす。

直接の抗原測定は、例えばＣｈｌａｌｙｄｉａ　ｐｓｉ
ｔｔａｃｉ、ロータウィルス、ヘルペスウイルスタイブ
エまたは■、或いは髄膜炎多糖ＡまたはＢに有効である
。

以Ｆの実施例は本発明を説明する。

実施例１： Ｈ，ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ−特異１（７Ｍの検出虻且星
Ｉ Ｈ，ｐｎｅｕ−ｏｎｉａｅによる感染を示唆する臨床的
特性を有する４１名の患者からの血清試料を合計５０検
体選んだ。全ての試料でＨ，ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの補
体結合（ＦＸ）性抗体力価６４以上、或いはより低い力
価の急性相血清に対応した。Ｈ，ｐｎｃｕｎｏｎｉａｅ
ＣＦ力価が２５６以上でＨ，ｐｎｅｕｏ＋ｏｎｉａｅ特
異ＩａＭ力価が最高値の血清をμ−捕獲ＥＬＩＳＡの陽
性対照血清として選択した。これをＨ，ｐｎｅｕｓｏｎ
ｉａｅ　−特異ＩＱＭの便宜的な値として０．１１ｔ１
当たり１００単位とした。この陽性対照血清を陰性対照
血清で希釈して３３．１０．３．３．１．０゜０．３３
および０．１単位を含有する液を得た。

１０名の患者からｓ、　ｐｎｅｕｎ＋ｏｎｉａｃ感染を
菌で確認してから６ケ月までの間隔で採取した血清の３
０検体の試料について、感染後どの位の間特異■ｇＭが
検出できるか調べた。

μ−捕獲ＥＬＩＳＡ この測定はＷｒｅｇｈｉｔｔおよび５ｉｌｌｉｓ　（１
９８５年）により記載されるように実施した。ｕ、ｐｎ
ｅｕｍｏｎｔａｅ−特異［ｊＭの人為単位が０．１ｄ当
たり０．３３以上の血清を陽性とした。

Ｈｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｎ＋ｏｎｉａｅ抗原こ
れは１４ｒｅｇｈｉｔｔおよび５ｉｌｌｉｓ　（１９８
５年）によって記載される通りに調製した。簡単には、
ＨｌｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＦ　Ｈ株を１％のグルコー
スおよび指示薬としてフェノールレッドを含有する改良
１１ａｙｒｌｉｃｋの培地（Ｌｅａｃｈ、Ｊ、Ｇｅｎ、
Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、　７５巻、１３５−１５３頁、１
９７３年）８−中で増殖させた。菌は３７℃でインキュ
ベーションしながら１１３ｇ（４オンス）の平底を横に
した中に付着１０層を形成させ、酸の呈色が認められる
まで生育させた。使用済みの培養液は定”期的に取り苔
え、培養びんを再びインキュベートして単層が一面に拡
がるまで続け、培養液を傾斜で除去して単層をりんＭ緩
衝食塩溶液（ＰＢＳ）、１）１１７．６で静かに洗った
。次に抗原をガラスからはがし、Ｐ１３Ｓにけん濁して
から凍結・融解を一回行なって最大条件で１０分間音波
処理を施し、１ｄｆつを使用するまで一２０℃で保存し
た。

非凝集性　シ赤面球の選択 本試験−第１図参照−には適当な赤血球は非凝集性の程
度に差のある赤血球であるウシ科のより凝集性赤血球で
ある。そのような赤血球はＰａｕ　ｌ　−８ｕｎｎｅ　
ｌ　Ｉ抗体の直接凝集および抗グロブリン試験（Ｅｄｅ
ｂｏら、５ｃａｎｄ、Ｊ、　Ｉｎ＋ａ＋ｕｎｏ１．１２
巻、１９３−２０１頁、１９８０年）で比較的凝集性で
あることにより選択した。

抗ヒトμ−ＦＣ試薬 これらの抗血清はヒツジに、多ＥＧＧ画分として生成さ
せ、μ−特異性を有し、ＣＯＯ１ｂＳら（Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏａｙ３３１Ｊ、１０３７−１０４４頁、１９７８年
）により記載されるとおりにアイソタイプ特異性を試験
した。これらの抗体はＺ３６８ＦおＪ：びＺ６３１Ｖと
命名した。

抗−μ試薬を前もっての酵素処理なしで塩化クロム操作
（Ｓｉｄｄｌｅら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｍｅｔｈｏ
ｄｓ、　７３巻、１６９−ｉ７６頁、１９８４年）によ
りウシ赤血球とカップルした。カップリング操作の有効
性は酵素処理したヒツジ赤血球との同じようなカップリ
ングによりチエツクした。ウシ赤血球は比較的非凝集性
であるためにこの赤血球へのカップリングをチエツクす
るのは容易ではない。

二種のＩｑＭ捕獲抗体Ｚ３６８ＦＪ５よびＺ６３１ｖの
特異性はそれらをキモトリプシンで処理したヒツジ赤血
球にカップリングし、それを二種のモノクローナルヒト
ＩａＭ抗−Ｒｈ抗体および二種のＩｇＧモノクローナル
抗体に対する逆受身赤血球凝集試験に使用して決定した
。いずれもヒトｆａＭモノクローナル抗体とのみ反応し
た。

ウシ赤血球ＴＱＭ抗体捕獲測定の実施 ヒト血清について１倍から１０または４倍希釈で１０段
階を用い、最後の試＃４管はＰＢＳのみを含有して検定
した。抗ヒトμを結合したウシ赤血球を１％けん濁液で
等吊添加した。室温で１５分間インキュベーションの後
、赤血球を低速遠心分離により集め、−回洗滌して１％
けん濁液となるように再けん濁した。洗滌した細胞（３
０μｌ）を微ａ定Ｍプレートの２列に分注した。−列に
はｓ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｃ抗原の１０段希釈液３０μ
１１もう一方にはＰＢＳ希釈液３０μｍを添加した。

プレートを振とうし、赤血球が沈降したら赤面球凝集（
ＲＰＨ）を判定した。

抗−μ結合ウシ赤血球の安定化と凍結乾燥安定化はＣｒ
ａｎａｇｅら（Ｊ、夏ｍｍｕｎｏ１．Ｈｅｔｈｏｄｓ　
６４巻、７−１６頁、１９８３年）により記載される５
　ように０．０１％のグルタルアルデヒド溶液で行なっ
た。凍結乾燥の混合液は１．５％蔗糖（Ｗ／Ｖ）および
１％ウシ血漿アルブミン（Ｒ初に適合性を調べたものを
使用）を含有するＰＢＳである。

結　　果 抗原特異性ＩＱＭ赤面球捕獲測定法についての予備実験 予備実験には二種のボリクＯ−ナルμ−特異性ヒツジＩ
ａＧ抗−ヒトＨＪＭ試薬（２６３１およびＺ３６８）を
使用した。これらの試薬のＩａＭ特異性はＣｏｏｌｂｓ
ら、１９７８年、に報告された試験で示されている。こ
れらの１ｇ試薬を２．０゜１．０または０．５１１１７
−で塩化クロムによりキモトリプシン処理ヒツジ赤血球
とカップリングするとヒト血清の１　：４０．０００希
釈でＲＰ）−１反応陽性が得られ、ＩＯＭ含ｉが測定さ
れる。

酵素で処理しないウシ赤血球（Ｅ６−より凝集性クラス
−ＥｄＱｂＯら、１９８０年）との同じようなカップリ
ングではヒト血清希釈液に添加しても凝集（ＲＰＨ）Ｉ
、ないカップルしたウシ赤血球が得られた。しかし、血
清中のＩａＭはウシ赤血球に吸着した。これはＩＱＭを
吸着したウシ赤血球を洗滌し、同じ抗−１ｇＭ＃Ｌ薬と
カップリングした酵素処理ヒツジ赤血球と、いわゆる混
合型ＲＰＨとして混ぼることによりわかる。抗−グロブ
リン結合Ｅ６ウシ赤血球では、ヒト血清から捕獲された
［ＱＭは（洗滌後）力価５．０００と示され、これは（
上記参照）酵素処理したヒツジ赤血球にカップルした同
じ抗体を用いた通常の均質ＲＰＨで得られるよりも低い
力価であった。

次の実験は、Ｈ，ｐｎｅｕ■ｏｎｉａｅ感染の急性状態
では抗−ＩＱＭ結合のＥ６ウシ赤血球により捕獲される
血Ｆ／４ＬＱＭの中に抗原（例えばＨ，ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ）特異性を有するものがあることを示した。これ
は＋４．　ｐｎｅｕｍｏｎｔａｅ抗Ｉｉ！調製物を捕獲
１ａＭを有する細胞けん濁液に添加することにより示さ
れた。試験の実施に際しては、杭−μ結合のＥ６ウシ赤
血球を患者血清の希釈液−１０倍希釈段階の１０倍希釈
液から。短時間インキュベーション後、赤血球を遠心分
離し、ＰＢＳで洗滌後Ｈ，ｐｎｅｕｓｏｎｉａｅ抗原に
１％けん濁液として添加した。血清の１０，０００倍希
釈液まで強い赤血球凝集が認められた。

ｓ、　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原の至適希釈は１：１０
であった。

しかしｉ　：　ｉ、ｏｏｏの希釈までいろいろの強度の
凝集が見られた。抗原非存在下では凝集は見られなかっ
た。

第１表は既知の陽性および陰性血清および未知の６検体
の血清について赤血球１ｑＭ抗体捕獲試験の結果を示す
。μ−捕獲ＥＬ、ＩＳＡを用いた結果も示すがよく一致
している。また血清８検体を用いて全Ｉ　ＧＭｆｆｉを
上述の混合２段ＲＰＨおよび通常の均質ＲＰＨ測定を用
いて測定した結果も少す。検出される抗原特異性ＩＱＭ
は全１ｑＭ（抗原非特異）吊と相関していないことが明
かである。

赤血球１ａＭ−捕獲系およびＦｌ−ＩＳＡμ−捕獲測定
法を用いた比較試験 以前にμ・−捕獲ＥＬＩＳＡで試験しである保存自涜に
ついて１：４０．１：１６０．１：６４０．１：２５０
０および１：１０００の希釈で赤血球１（ＪＭ抗体捕獲
測定法によって試験した。二つの試験法で得られた結果
を第４図に示す。第４図より二つの試験法の結果はよく
一致し、両試験払共同し位の感度であることがわかる。

−人の患者からｓ、　ｐｎｅｕｓｏｎｉａｃ感染後の異
なる時期に採取した三つの血清試料があり、これは対照
細胞を６４０の力価で凝集した（抗原の代わりにＰＢＳ
を用いた時）。これらの血清試料は真の力価を決定する
ことが出来なかったので第４図には加えていない。

Ｈ，ｐｎｅｕｌＯｎｉａｅ感染が確認された後のいろい
ろな期間後に採取した血清についてμ−捕獲ＥＬＩＳＡ
および赤血球１ａＭ抗体捕獲試験の結果を第５図に示す
。Ｈ，ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異性１ｑＭはいずれの測
定でも同じような期間（およそ４−６ケ月間）検出され
ることがわかる。

赤血球に結合した抗体の捕獲はヒトＩａＭに特異であっ
た。予想されるように患者血精をジスルフィド結合の還
元剤であるジチオスレイトール（ＤＴＴ）で前処Ｉ！！
！すると反応が阻害されることが明かである。血清を３
０ｍＭ、２０ｍＭまたは１０ｍＭのＤＴＴで３７℃にて
４０分間処理した。１０１１１８の１７３１度でも活性
は全て消失した。Ｃｈｌａｌｙｄｉａｐｓｉｔｔａｃｉ
に対するＩａＧモノクローナル抗体は同様な処理でその
対応抗原特異１ｑＧ赤血球捕獲測定の活性が除去されな
かった。

実施例　２： ウシ赤白球（ＯＸＥ６）を使用した。他の種属とくらべ
ると比較的非凝集性であるが、これはＰａ１ｌ　Ｂｔｌ
ｎｎｅ１１抗体（直接凝集）および族グロブリン試験（
Ｇｌｅｅｓｏｎ−１４ｈｉｔｅら、Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｅｘ
ｐ、Ｐａｔｈｏｌ。

３１巻、３２１−３３１頁、１９５０年）による凝集に
よる感度によって中廟に凝集性のウシ細胞と分類された
。赤血球は遠心分９１（３０００ｒｐｍ。

Ｈ４Ｆ　Ｃｅｎｔａｕｒ　２　）により集め、バツフイ
コートおよび血清を除去した。次に赤血球を０．１５８
ＮａＣ１で５回洗滌し、カップリングを行なう。

抗体および抗原の選択 抗体の捕獲： Ａ３６６と命名されたヒツジの抗−マウス免疫グロブリ
ンを使用した。これは硫酸アンモニウム沈澱およびその
後のＤＥ５２セルロース（ｉａｔｉａｎ　）のイオン交
換クロマトグラフィーにより精製した。ＡＸ６０９Ｇと
命名されたヒツジの抗−マウスγＦＣ！薬およびＡＸ７
０６Ｅと命名されたヒツジの抗−マウスμｌ”ｃ試薬も
使用した。

ＣＦ６／Ｊ　１２　（ＩａＧ２ａ）、ＣＦ２／４７（Ｉ
ＱＧ３）、ＣＦ６／Ｌ１３　（ＩａＧ２ａ）、ＣＦ４／
８２　（ＩＧＧ３）およびＣＦ４／８２（１ｇ０２ａ）
と命名したモノクローナル抗体をＴｈｏｒｎｌｅｙら（
Ｊ、Ｇｅｎ、旧ｃｒｏｂｉｏ１．１３１巻、７−１５頁
、１９８５年）により記載されるようにして生成した。

ｉｉ、　　抗−ロータウィルス マウスのモノクローナル抗体Ａ３Ｍ４　（ＩａＧ２ａ）
を使用した。これは腹水から４０％硫酸アンモニウム沈
澱により調製し、ＲＰＨ測定への使用については報告さ
れている（　ｃｒａｎａｇｅら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、Ｈｅ
ｔｈｏｄｓ　１１巻、２７３−２８７頁、１９８５年）
。

ｉｉｉ、　　抗−ヘルペス・シンプレックスウィルス４
つのマウスモノクローナル抗体を使用した。

これらは型共通の糖たん白質Ｄ（ＡＣ３およびＬＰ２）
　、主要ＤＮＡ結合たん白質（ＢｔｌＣｋｌａＳｔｅｒ
ら、Ｊ、ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、　１３巻、１９３−２０
２頁、１９８４年）および１型糖たん白質Ｇ　［（ＬＰ
ｌｏ　）　、Ｒｉｃｈｓａｎら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　５
７巻、６４７−６５５頁、１９８６年］に対するもので
ある、ｉｖ、杭−１！ｉｌｉ膜炎１１多糖Ａお、１ＦＢ
髄膜炎菌の多糖Ａに対して生成したマウスのモノクロ−
プール抗体ＷＭＡ／３３　（Ｉ　ａＧ３ｂ）および多糖
Ｂに対して生成したモノクローナル抗体ＭＢ６７／Ａ７
　（ＩａＭ）を使用した。

微生物抗原 Ｃｈｌａｍ　ｄｉａ　ｐｓｉｔｔａｃｉ　：オウム病Ｃ
Ｆ抗原（バッチ番号８２０２／１）はＰｕｂｌｉｃ　１
ｌｅａｌｔｈ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｅｒｖｉｃｅ　
　（ロンドン）から入手した。

ロータウィルス：感染した乳児からの１０％糞便抽出物
より１１１１しく　Ｃｒａｎａｇｅら、１９８５年）、
ＰＢＳ中で一１２℃にて保存した。

ヘルペス・シンプレックスエ型および■型：使用した抗
原ハＨＦ　Ｅ　Ｍ株（Ｉ型）Ｊ５Ｊ：ヒＨＶＤ　（２５
７６６）（ＩＩ型）の音波処理物Ｃ凍結保存した。

Ｗ膜炎菌多糖ＡおよびＢ：溶液として得られ、本文に示
す希釈で使用した。

カップリング操作： 全ての免疫グロブリンは使用前に０．１５ＨのＮａＣ１
に対して透析し、実施例１に記載したように１−２１１
１！Ｆ／ａｄの至適濃度で塩化クロムを用いて等（至）
の沈澱赤面法細胞にカップルした。

捕獲ＲＰＨの実施法 抗−マウス免疫グロブリン試薬と結合した赤血球（１％
、Ｖ／Ｖけん濁液）をＬＰ３試験管（Ｌｕｃｋｅｎｈａ
ｍ　）中の各種ｍａｔｓ囲（１−１００μｇ／ｌｌ１１
）の捕獲しようとする抗体の溶液に添加した。試験管を
２０℃で１５分間インキュベートした後細胞を遠心分離
で集め、−回洗滌してから元の容量に再けん濁した。刈
払としては、遠心分離の前に試験管にＰＢＳを満たし、
集めた赤血球は洗滌ステップなしで使用するため再けん
濁できる。

捕獲した抗体を結合した赤血球（１％Ｕん濁液）を次に
微融定量用プレート中の抗原検体（等用３０μｌを使用
）に添加した。プレートをウェルの内容物を混合するた
めに振とうし、赤血球が沈澱してから（通常１時間）赤
血球ａ集を判定した。

結　　果 （１１Ｃｈｌａｅ＋ｙｄｉａ　ｐｓｉｔｔａｃｉｆ！Ｌ
ｌｔ！検出のための−Ｅ／クローナルマウスＩ　Ｇ杭　
の　獲−なるモノクローナル抗体の試験 Ｅ６ウシ赤血球を免疫グロブリンの多いヒツジの抗−マ
ウスＩＱ調製物（Ａ３６６）とカップルさせた。専属の
カップルした１％赤白球を異なる抗−Ｃｈｌａｌｙｄｉ
ａモノクローナル抗体（Ｔｈｏｒｎｌｅｙら、１９８５
年）の種々の希釈とインキュベートした（第２表）。マ
ウスモノクローナル抗体で被覆した非凝集赤血球を洗滌
し、各けん濁液を用いてオウム病の補体結合抗原調製物
の希釈液中に存在するクラミジア抗原を測定した。５種
の異なるモノクローナル抗体での結果を第２表に示す。

クラミジア抗原は１／６４Ｇ希釈まで検出でき、これは
通常のＲＰＨにより測定可能な程度（ｙｈｏｒｎ＋ｅｙ
ら、１９８５年）に匹敵する。クラミジア抗原検出の至
適感度は抗グロブリン結合ウシ赤血球を１１５０Ｇ希釈
のモノクローナル抗体と接触させた後に得られｌζ（ｆ
１釈を１：５００（ｂ）に上げると感度の低下が見られ
た）。抗原検出感度の低下はモノクローナル抗体の濃度
が１１５００以上の時にも認められた。抗原の非存在下
［抗グロブリン結合ウシ赤血球を１１５希釈のＣＦ　２
／４７存在下での場合以外１或いは捕獲抗体非存在下で
は凝集（ＲＰＨ）は起らなかった。試験実施の際は、抗
グロブリン結合ウシ赤血球はモノクローナル抗体を捕獲
した後６回洗滌しても微生物抗原の検出力価が低下する
ことはなかった。

第２表に示ず結果が特に興味深いのは、モノクローナル
抗体ＣＦ６／Ｃ５を直接ｌｌｉ！！素処理ヒツジ赤血球
と塩化クロムでカップルすることは今まで可能でなかっ
たので、通常のＲＰＩ−１反応での使用が出来なかった
からである。また他の２つのモノクローナル抗体、ＣＦ
４／８２およびＣＦ６／Ｌ１３、は直接カップルするの
は非常に困難であった。

さらに２つの系のマウスモノクローナル抗体およびそれ
らに対応するウィルス抗原を試験した。

２（ｉｉｉ）抗−ロータウィルス 抗グロブリン結合の非凝集性ウシ赤血球を調製し、−宙
吊のＡ３Ｍ４−γ２ａ抗−ロータウィルスモノクローナ
ル抗体の５００μ’Ｊ／ｄ８１度を１１５．１１５Ｇ、
　　１／　５００おＪｉヒ１／１００ＯＩＣ希釈して共
にインキュベートした。洗滌侵、非凝集細胞番ノん濁液
（捕獲したモノクローナル抗体を有する）を用いてロー
タウィルスを含有する乳児糞便調製物の対照標準中に存
在するウィルス抗原を測定した。全ての細胞けん濁液は
糞便試料の１７５００希釈に対して捕獲ＲＰＨ反応を示
した。これはＡ３Ｍ４モノクローナル抗体を直接酵素処
理したヒツジ赤血球に結合して使用した通常のＲＰＨで
得られる感度の限界と同じであった（　Ｃｒａｎａｇｅ
ら、１９８５年）。

２（ｉｔ）抗−ヘルペス・シンプレックスウィルス４つ
のモノクローナル抗体を１型および２型ウイルスの培養
物で試験した結果を第３表に示す。

１型特賃性モノクロ一ナル抗体ＬＰ１０の至適希釈度は
１１５であり、２型特異性抗体（ＬＰ４）の捕獲至適希
釈は１１５０であった。

（３）　　髄膜炎菌多糖類測定のためのｌｉ　’ｆＡ　
ＲＰ　Ｈおよ捕獲 髄膜炎菌のグループＡ多糖に対するマウスＩｇＧ（γ２
ｂ）モノクロ−プル抗体（ＷＭＡ３３）および髄膜炎Ｂ
多糖に対するマウスＩａＭモノクローナル抗体（ＭＢ６
７／Ａ７）を用いた、抗マウスＩＱ結合のウシ赤血球と
の捕獲ＲＰＨは古典的なＲＰＨ（モノクローナル抗体が
直接塩化クロムでＭ素処理したヒツジ赤血球とカップル
している）で得られる結果と非常に類似した結果を示し
た。抗−Ａおよび抗−Ｂモノクローナル抗体の至適希釈
度は両者共１／１０であった。ＡおよびＢ多糖抗原の特
異的検出限界はいずれもおよそ１００１）Ｏ／−であっ
た。抗原過剰のプロゾーンは多糖の濃度が１００ｎｏ／
ｄ以上で起った。

ポリクローナルヒツジ抗−マウスＩＱ試薬（Ａ３６６）
はアイソタイプ特異ではなかったが、２つの他のポリク
ローナル抗−マウスＩ　Ｑ試薬（２７０４ＥおよびＺ６
０９Ｇ）はそれぞれＩａＭおよびＩａＧに特異的であっ
た。髄膜炎菌多糖Ｂに対する［ｑＭモノクローナル抗体
は捕獲され、抗−μ試薬と結合したウシ赤血球にのみ［
捕獲ＲＰＨＪで機能し、同様に髄膜炎菌多糖Ａに対する
ＩＧモノクローナル抗体は抗−マウスγ−特異試薬と結
合したウシ赤血球にのみ機能した。さらに、クラミジア
試験系でクラミジアグループの抗原に対する１（ＩＧ（
ＣＦ６／Ｊ１２　７２ａ）マウスモノクローナル抗体は
特異な抗−マウスγ試桑と結合したウシ赤血球にのみ捕
獲され、捕獲ＲＰＨ中で機能したが、特異な抗−マウス
μ試桑と結合した細胞では駄目であった。

抗グ［１プリンを結合したウシ赤血球はグルタ−ルアル
アヒトによる軽い処理（Ｃｒａｎａｇｅら、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、ＨｅｔｈｏｄＳ　６４巻、７−１６頁
、１９８３年）および続く凍結乾燥によりほとんど活性
の低下なしに安定化することが出来る。安定化したもの
を用いてＣＦ６／Ｊ１２マウスモノクローナル抗体の捕
獲およびオウム病抗原の検出、ざらにＡ３Ｍ４マウスモ
ノクローナル抗体の捕獲とロータウィルスの検出を試験
した。凍結乾燥した族グロブリン結合のウシ赤血球は理
論的にどんなモノクローナル抗体でも「捕獲」すること
が出来、「捕Ｍ　ＲＰ　Ｈ測定」に有効であった。

実施例　３： １ｏＥの検出 赤血球細胞 一頭の牛および一匹のヒツジから毎週血液を酸−クエン
酸−デキストロース（ＡＣＤ）に採取した。赤血球細胞
は洗滌および遠心分離を５回くり返えした。バツフイコ
ートは全て除去した。

抗体 （八ｌ　ｔｅｒｍａｎら、Ｃｌ１ｎ、ｅｘｐ、Ｉｍｎ＋
ｕｎｏ１．　５７巻、６１７−６２５頁、１９８７年）
を腹水から４０％飽和の硫酸アンモニウム沈澱により精
製した。

（ｉｉｌ　　マウス／ヒトキメラＩＱＥ抗−４−ヒドロ
キシ−３−ヨード−５−二トロフエプセヂル（Ｎ１Ｐ）
をモデルのＩａＥとして使用した。キメラ１（ＩＪＥは
Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ３１巻、２６８−
２７０頁、１９８５年）により記載されるように調製し
た。ＩａＥは培養濾液として得られた。

カップリングをする抗体は全て０．９％Ｗ／ＶＮａＣＩ
に対して十分に透析した。

ＮＩＰの標識 ＮＩＰ−アジド（Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏ中に２１１Ｉ１９／ｌ
ｌｌ１１８０μｍ）を重炭酸緩衝液、１）Ｈ８，８、中
で４℃２０時間ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（４０■
／ｄ、０．５ｄ）に結合した（　ａｒｏｗｎｓｔｏｎｅ
ら、Ｉｍｇａｕｎｏｌ、　１０巻、４６５−４７９頁、
１９６６年）。

Ｎ　ＩＰ−ＢＳＡ　（ＮａＣ１０，９％　ｗ／ｖ中に１
１１１９／ｄ　）の一部をＣｒ０１３法によりキモトリ
プシン処理したヒツジ赤血球（ｃ　ｈ　ｔ　Ｓ　ＲＢ　
Ｃ）とカップルした。ＮＩＰ−アジドを直接結合すると
測定系に不適当な生成物を生じる。ｃ　ｈ　ｔｓＲＢＣ
は５ＲＢＧ　（５％ｖ／ｖ　）を５ｉｄｄｌｅら（Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｈｅｔｈｏｄｓ　７３巻、１６９−
１７６頁、１９８４年）の方法に従ってキモトリプシン
（Ｓｉｇｍａ　Ｃ，４１２９、最終濃度０．１ｍｇ／ｄ
）で処理して得られた。

抗体のＲＢＧへのカップリングは５ｉｄｄｌｅら（１９
８４年）による記載のとおりに行なったが、反応時間は
５−１０分とした。モノクローナル抗体は０．５１１９
／ｒｔｔｌでカップリングした。試験で至適希釈は１％
ｗ／ｖＣｒ（，１３と得られた。

血球ＩＱＥ　　体捕獲測定法の実施 アレルギー特異ＩｃｈＥの捕獲および測定のための赤血
球−捕獲の方法を第６図に示す。実験では比較的「非凝
集性」のウシ赤血球（Ｅ６）２０をモノクローナル族−
１ｏＥ２１と結合した。結合した赤血球を１％けん濁液
としてキメラＩｏＥ抗−ＮＩＰ２１を含有する培養濾液
の検定に添加した。洗滌後も非凝集性赤血球はＢＳＡ−
Ｎ　Ｉ　Ｐ抗原に露出しており、第６図で八からＤに示
す異なる形態で表わされている。

Ａ：（比較）捕獲されたｉＱＥは抗−１ａＥ２１と結合
した高い凝集性のｃｈｔＳＲＢＣ２３を最終ステップで
添加することにより示された。赤血球凝集は１８養濾液
の１＝３２希釈まで見られた。

Ｂ：ＮＩＰ−特異キメラ抗体の吸収は同程度に見られ（
即ち、１／３２希釈）、最終ステップで至適希釈率（０
，２μ９／ＩＲＲ）では非凝集性の捕獲用赤血球がＢＳ
Ａ−Ｎ　ＩＰ２４と共に表わされる。

Ｃ：ＮＩＰ決定囚子２５が１３８　Ａよりも大きい分子
である７９２１ｇＭ２６上（６７にＤに対して９０（ｂ
）に０）に結合していると捕獲測定法はより感度が高く
なる。

Ｄ＝この捕獲測定法では、最終ステップでの１１Ｐ−抗
原が非常に凝集性の高い酵累処理ヒツジ赤血球２７　（
ＢＳＡ−Ｎ　Ｉ　Ｐにカップルした細胞）上に結合した
時に最も感度の高い検出ができた。これにより培養源液
中でのＩｏＥ抗−ＮＩＰの力価は５１２と測定された。

実施例　４： 大量の試料中のＣｈｌａｍｙｄｉａ　ｐｓｉｔｔａｃｉ
の検出Ｅ６ウシ赤血球をＡＸ６０９ｃと命名された特異
抗−マウスＩＧＧの免疫グロブリンを多く含有する両分
と、実施例２に記載したようにカップリングした。抗グ
ロブリン結合ウシ赤血球はそのままとゲルタールアルデ
ヒドで安定化したものとの両方を試験した。カップリン
グした赤血球の１％けん濁液をリボ多結層に特異的なマ
ウス抗−クラミシアＪ１２モノクローナル（ＩｏＧ２．
アイソタイプ）　　（Ｔ１１０ｒｎ＋（！Ｖら、Ｊ、Ｇ
ｅｎ、Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ　、１３１巻、７−１５頁、
１９８５年）２００ｎｇ／Ｉｄとインキュベートした。

赤血球を遠心分離により集め、ＰＢＳに【ノん濁した。

Ｐｕｂｌｉｃ　１ｌｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　５ｅｒｖｉｃｅから入手したオウム病ＣＦ抗原を０．
１％のＢＳＡ添加ＰＢＳアジドで１／　６４０希釈から
の段階希釈で試験した。オウム病抗原の検定は１００μ
ｍ、１ｊＩｅおよび１０ｄの容場で２回ずつ行なった。

それぞれの’ｆｌ￥ｆｆｌの試料に抗−クラミシア抗体
を結合したウシ赤血球のＰＢＳけん濁液を１００μｌず
つ添加した。

室で３０分または一晩インキユベーションした後、アフ
イニティ捕獲した抗原をもつ赤血球を１０００ｇで１５
分間遠心分離した。集めた赤血球を遠心上澄液２００μ
ｍに再けん濁した。各試験管の６０μｌ容量（即ち、０
．５％けん濁液の２倍容聞）を微ｍ定聞用プレートの対
応するウェルに移した。赤血球が沈降したら赤血球凝集
（ＲＰＨ）を肉眼で判定した。その結果は第７図に示す
。

（第１表の注） 十ＲＰＨ＝血消中のＩｇＭの逆受身赤血球凝集。

抗体結合のＦｆｌ素処理ヒツジ赤血球をリガンドの希釈
液に添加する通常のＲＰ　Ｈでは均質系の反応で洗滌を
伴なわない。２段階試験は族グロブリン（μ−特異）−
結合の酵素処理したヒツジ赤血球を捕１１１１０Ｍと共
にＥ６ウシ赤血球に加え、これは洗滌を行なう。この試
験は赤血球ＩＱＭ抗体捕ｖ１ｍ定に対応して実施した。

第３表　ヘルペス・シンプレックス抗原の検出検出の程
度−希釈の逆数 ネ　　　　１　型　　Ｈ）ＥＨ株 ２型　１１ＶＤ株

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による抗原特異ＩＱＭ赤血球捕獲測定を
図示したものである。 第２図は赤血球ＩｇＭ抗体捕獲測定とμ−捕獲ＥＬＩＳ
Ａの比較を示す。 第３図は捕獲モノクローナル抗体を用いた抗原の測定を
図示したものである。 第４図は赤血球■ｇＭ抗体捕獲力価とμ−捕獲ＥＬＩＳ
ＡＩ１１位の比較を表わす。 １旦ＩはＨ，ｐｎｅＵＩｌｏｎｉａｅＩｊ！Ａ染後の血
清中の特異Ｉ　ａＭｆｆｉを赤血球捕獲測定法およびμ
−捕狐ＥＬＩＳＡにより定量した結果を示す。 １旦１は赤面球ＩＧＥ−抗体捕獲測定を図示したもので
ある。 第７図はクラミジア抗原を抗−マウスＩＣＪＧ結合のウ
シ赤血球をそのままおよび安定化したものを使用して測
定した結果を示す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料について、 （ａ）複数個のエピトープを有する予め決めた抗原に特
   異的な抗体、 或いは、 （ｂ）複数個のエピトープを有する予め決めた抗原を測
   定する方法であつて、 （ｉ）免疫グロブリン結合剤を結合した非凝集性ウシ赤
   血球細胞を該抗体（ａ）の測定の場合には試料と、また
   該抗原（ｂ）の測定の場合には該抗原（ｂ）に特異な抗
   体と接触させ、 （ｉｉ）このように処理した赤血球細胞を該抗体（ａ）
   の測定の場合には該抗体（ａ）が特異性を示す抗原とま
   た該抗原（ｂ）の測定の場合には試料と接触させ；そし
   て、 （ｉｉｉ）赤血球凝集が起るかどうかを判定することを
   特徴とするアッセイ法。
2. （２）免疫グロブリン結合剤が抗グロブリンである特許
   請求の範囲第（１）項記載の方法。
3. （３）免疫グロブリン結合剤が抗−γ抗体、抗−μ抗体
   または抗−ε抗体である特許請求の範囲第（２）項記載
   の方法。
4. （４）試験試料がヒト血清である上記の特許請求の範囲
   のいずれかに記載の方法。
5. （５）免疫グロブリン結合剤を結合した赤血球細胞のけ
   ん濁液を試験試料に添加し；添加した赤血球細胞と試験
   試料とをインキュベートし；このようにインキュベート
   した赤血球細胞を集めて洗滌し、緩衝液に再けん濁し；
   測定する抗体が特異性を示す抗原を添加し；そして赤血
   球凝集が起るかどうか判定することにより抗体を測定す
   る上記の特許請求の範囲のいずれかに記載の方法。
6. （６）抗原に特異的な抗体を免疫グロブリン結合剤と結
   合した赤血球細胞と接触させ；試験試料を添加し、赤血
   球凝集が起るかどうか判定することにより抗原を測定す
   る特許請求の範囲第（１）項から（４）項のいずれかに
   記載の方法。
7. （７）抗原に対して特異的な抗体がモノクローナル抗体
   である特許請求の範囲第（６）項記載の方法。
8. （８）２個以上のエピトープを有する予め決めた抗原が
   微生物病原体である上記の特許請求の範囲のいずれかに
   記載の方法。
9. （９）（ａ）複数個のエピトープを有する予め決めた抗
   原に対して特異的な抗体、或いは（ｂ）複数個のエピト
   ープを有する予め決めた抗原の測定に使用するのに適し
   、 （ｉ）免疫グロブリン結合剤が結合している非凝集性ウ
   シ赤血球細胞；および （ｉｉ）該抗体（ａ）の測定の場合には該抗体が特異性
   を示す抗原、或いは該抗原（ｂ）の測定の場合には抗原
   （ｂ）に特異的な抗体により成ることを特徴とする試験
   キット。
10. （１０）免疫グロブリン結合剤が抗グロブリンである特
    許請求の範囲第（９）項記載のキット。