JPH0121954B2 - - Google Patents
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- JPH0121954B2 JPH0121954B2 JP56065449A JP6544981A JPH0121954B2 JP H0121954 B2 JPH0121954 B2 JP H0121954B2 JP 56065449 A JP56065449 A JP 56065449A JP 6544981 A JP6544981 A JP 6544981A JP H0121954 B2 JPH0121954 B2 JP H0121954B2
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Landscapes
- Seeds, Soups, And Other Foods (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、クロレラの細胞壁の除去方法に関す
る。 単細胞緑藻クロレラは、光合成独立栄養的に増
殖するとともに光合成従属栄養的にも増殖でき、
比較的高濃度の広範囲にわたる種類の有機物を栄
養源として利用できる。 一方、クロレラはその細胞成分としての蛋白含
量が高く、又微量栄養素にも富み滋養価値が大で
ある。この二つの特性からクロレラは工場廃水、
家庭廃水等の処理、浄化を兼ねたSCP（Single
Cell Protein）生産の対象として注目されてい
る。しかしながら一般にクロレラはその細胞外縁
に堅牢な細胞壁を有し、これは物理的破砕、化学
的分解、酵素による消化等に対し極めて安定であ
り、クロレラを飼料として動物等に与えた場合、
消化不良をきたす原因となつている。 本発明者等は、このクロレラの細胞壁を除去す
るのに有効な方法を開発すべく鋭意検討した結
果、本発明に到達した。 本発明の要旨は、クロレラのプロトプラスト化
またはスフエロプラスト化に際し、セルラーゼ
と、リゾプス属（Rhizopus sp.）菌体から得ら
れる植物組織崩壊酵素（マセレーテイング エン
ザイムMacerating enzyme）と、ペクチナーゼ
との酵素混合物を用いることを特徴とするクロレ
ラの細胞壁の除去方法に存する。 本発明を詳細に説明するに、本発明方法におい
て処理されるクロレラは、クロレラ目
（Chlorococcales）に属する単細胞緑藻であつて
クロレラ（Chlorella）属に属するものが挙げら
れる。とくに２次カロチノイド（secondary
carotenoid）生成能のない種に好適である。この
ような種としては、クロレラ ブルガリス
（Chlorella vulgaris）、クロレラ サツカロフ
イラ（Chlorella saccharophila）、クロレラ
ルテオビリデイス（Chlorella luteoviridis）、
クロレラ エリプソソイデア（Chlorella
ellipsoidea）等が挙げられる。 本発明方法においては、クロレラを、セルラー
ゼと、リゾプス属（Rhizopus sp.）菌体から得
られる植物組織崩壊酵素と、ペクチナーゼとの混
合物を用いて、プロトプラスト化またはスフエロ
プラスト化する。上記植物組織崩壊酵素は、マセ
レーテイング エンザイム（macerating
enzyme）またはマセラーゼ（MACERASE）と
も呼ばれ、植物の組織を崩壊して細胞を遊離させ
る作用を有しリゾプス属（Rhizopus sp.）糸状
菌体から産生される。各酵素の使用量は、とくに
制限はなく、反応液中の濃度で0.5〜５重量％で
よい。プロトプロラスト化またはスフエロプラス
ト化は、常法に従い、クロレラを上記酵素混合
物、光照射下、常温付近の温度で、数時間で処
理・反応させればよく、生存した状態の再生能の
あるクロレラのプロトプラストまたはスフエロプ
ラストを得る。具体的には、対数増殖期細胞を弱
酸性の緩衝液中に懸濁し、上記酵素混合物を加え
て、光照射下、20〜30℃で２時間〜24時間処理す
ることにより、プロトプラストまたはスフエロプ
ラストを得ることができる。とくに(A)の酵素混合
物が、プロトプラスト化率がよく、好ましい。 本発明方法の利点および用途は次の通り。 クロレラの各種Strainsに対し完全なプロト
プラスト化が出来ない場合でも細胞壁をかなり
軟化させることができ、単細胞蛋白源として生
産された細胞の一次加工に有効である。 プロトプラスト化により細胞破砕が極めて容
易になり、よつて細胞内成分、例えばリブロー
スジホスフエートカルボキシラーゼ等の重要酵
素、特定栄養素等の抽出に有効である。 植物、農作物の育種に必要な遺伝子を供給す
ることができる。例えば、クロレラはC3−
Plantであるが太陽エネルギーの利用効率が非
常に高く、これはCO2トラツプ酵素カルボニツ
ク アンヒドラーゼによるものでこの酵素の遺
伝子を高等植物に導入することにより、みかけ
上C4Plantに変えることが出来る。 プロトプラストは細胞融合、プロトプラスト
トランスホーメーシヨン等の技術に必須であ
る。 等、応用面での価値は非常に高い。 以下、本発明方法を実施例により、さらに詳細
に説明する。なお、以下の実施例において、細胞
壁の変化はカリコフルオア（Calcofluor）染色−
螢光顕微鏡法で調べるとともに走査型及び透過型
電子顕微鏡により観察した生成した。プロトプラ
ストの生存能は、中性赤による活性染色及びプレ
ート上での再生増殖によつて調べた。％は重量％
を示す。 参考例 （クロレラの培養） クロレラの株としては東京大学応用微生物研究
所（IAM）に保存され、自由に分譲されている
株を用いる。具体的には、クロレラ エプソイデ
アIAM Ｃ−87株またはクロレラサツカロフイラ
IAM Ｃ−211株を用いる。細胞は0.1％プロテオ
ースペプトンを含むMBM培地で25℃、3000ルツ
クス光照射下、振とうしながら４〜５日培養す
る。 MBM培地組成 KNO325mg、MgSO4・7H2O7.5mg、
K2HPO47.5mg、KH2PO417.5mg、CaCl2・2H2O1
mg、 *Fe溶液0.1ml、 **A5溶液0.1mlをH2Oにて
100mlとする。（PH6.0） ＊Fe溶液 FeSO4・7H2O1ｇ、H2O500ml、Conc
H2SO42滴 ＊＊A5溶液 H3NO3286mg、MnSO4・7H2O250
mg、ZnSO4・7H2O22.2mg、CuSO4・5H2O7.9
mg、NaMoO42.1mgをH2Oにて100mlとする。 実施例 １ 参考例で得られたクロレラ エリプソイデア
（Chlorella ellipsoidea）（IAM Ｃ−87）の対数
増殖期の培養細胞を遠心分離により集め、0.3M
ソルビツト、0.3Mマンニツトを含む25ｍＭリン
酸緩衝液（等張緩衝液）で洗浄した後、４％セル
ラーゼ（オノズカ Ｒ−10、近畿ヤクルト社製）、
２％マセロチーム（登録商標）Ｒ−10（近畿ヤク
ルト社製植物組織崩壊酵素）、１％ペクチナーゼ
（Sigma社製）を含む同緩衝液に懸濁し、ゆるや
かに振盪しながら25℃、８時間保温する。この処
理により細胞の90％がプロトプラスト化する。プ
ロトプラストは低張液希釈（H2O添加）による
細胞破裂、カルコフルオア白（Calofluor
White）による細胞壁染色、走査型及び透過型電
子顕微鏡による観察により同定した。又、生成し
たプロトプラストを等張緩衝液で２回洗浄後、
1500rpm、5minの違心で集め、MBM、0.3Mソ
ルビトール、0.3Mマンニトール、0.1％プロテオ
ースペプトン、0.1％イーストエキストラクトを
含む0.7％寒天に包埋して、23℃、3000ルツクス
光照射下培養すると約二週間後に細胞が再生し、
増殖コロニーが30％程度の頻度で出現する。カル
コフルオア染色により細胞壁再生を調べると、約
48時間後には螢光を発し細胞壁合成が起こつてい
る事を確認した。
る。 単細胞緑藻クロレラは、光合成独立栄養的に増
殖するとともに光合成従属栄養的にも増殖でき、
比較的高濃度の広範囲にわたる種類の有機物を栄
養源として利用できる。 一方、クロレラはその細胞成分としての蛋白含
量が高く、又微量栄養素にも富み滋養価値が大で
ある。この二つの特性からクロレラは工場廃水、
家庭廃水等の処理、浄化を兼ねたSCP（Single
Cell Protein）生産の対象として注目されてい
る。しかしながら一般にクロレラはその細胞外縁
に堅牢な細胞壁を有し、これは物理的破砕、化学
的分解、酵素による消化等に対し極めて安定であ
り、クロレラを飼料として動物等に与えた場合、
消化不良をきたす原因となつている。 本発明者等は、このクロレラの細胞壁を除去す
るのに有効な方法を開発すべく鋭意検討した結
果、本発明に到達した。 本発明の要旨は、クロレラのプロトプラスト化
またはスフエロプラスト化に際し、セルラーゼ
と、リゾプス属（Rhizopus sp.）菌体から得ら
れる植物組織崩壊酵素（マセレーテイング エン
ザイムMacerating enzyme）と、ペクチナーゼ
との酵素混合物を用いることを特徴とするクロレ
ラの細胞壁の除去方法に存する。 本発明を詳細に説明するに、本発明方法におい
て処理されるクロレラは、クロレラ目
（Chlorococcales）に属する単細胞緑藻であつて
クロレラ（Chlorella）属に属するものが挙げら
れる。とくに２次カロチノイド（secondary
carotenoid）生成能のない種に好適である。この
ような種としては、クロレラ ブルガリス
（Chlorella vulgaris）、クロレラ サツカロフ
イラ（Chlorella saccharophila）、クロレラ
ルテオビリデイス（Chlorella luteoviridis）、
クロレラ エリプソソイデア（Chlorella
ellipsoidea）等が挙げられる。 本発明方法においては、クロレラを、セルラー
ゼと、リゾプス属（Rhizopus sp.）菌体から得
られる植物組織崩壊酵素と、ペクチナーゼとの混
合物を用いて、プロトプラスト化またはスフエロ
プラスト化する。上記植物組織崩壊酵素は、マセ
レーテイング エンザイム（macerating
enzyme）またはマセラーゼ（MACERASE）と
も呼ばれ、植物の組織を崩壊して細胞を遊離させ
る作用を有しリゾプス属（Rhizopus sp.）糸状
菌体から産生される。各酵素の使用量は、とくに
制限はなく、反応液中の濃度で0.5〜５重量％で
よい。プロトプロラスト化またはスフエロプラス
ト化は、常法に従い、クロレラを上記酵素混合
物、光照射下、常温付近の温度で、数時間で処
理・反応させればよく、生存した状態の再生能の
あるクロレラのプロトプラストまたはスフエロプ
ラストを得る。具体的には、対数増殖期細胞を弱
酸性の緩衝液中に懸濁し、上記酵素混合物を加え
て、光照射下、20〜30℃で２時間〜24時間処理す
ることにより、プロトプラストまたはスフエロプ
ラストを得ることができる。とくに(A)の酵素混合
物が、プロトプラスト化率がよく、好ましい。 本発明方法の利点および用途は次の通り。 クロレラの各種Strainsに対し完全なプロト
プラスト化が出来ない場合でも細胞壁をかなり
軟化させることができ、単細胞蛋白源として生
産された細胞の一次加工に有効である。 プロトプラスト化により細胞破砕が極めて容
易になり、よつて細胞内成分、例えばリブロー
スジホスフエートカルボキシラーゼ等の重要酵
素、特定栄養素等の抽出に有効である。 植物、農作物の育種に必要な遺伝子を供給す
ることができる。例えば、クロレラはC3−
Plantであるが太陽エネルギーの利用効率が非
常に高く、これはCO2トラツプ酵素カルボニツ
ク アンヒドラーゼによるものでこの酵素の遺
伝子を高等植物に導入することにより、みかけ
上C4Plantに変えることが出来る。 プロトプラストは細胞融合、プロトプラスト
トランスホーメーシヨン等の技術に必須であ
る。 等、応用面での価値は非常に高い。 以下、本発明方法を実施例により、さらに詳細
に説明する。なお、以下の実施例において、細胞
壁の変化はカリコフルオア（Calcofluor）染色−
螢光顕微鏡法で調べるとともに走査型及び透過型
電子顕微鏡により観察した生成した。プロトプラ
ストの生存能は、中性赤による活性染色及びプレ
ート上での再生増殖によつて調べた。％は重量％
を示す。 参考例 （クロレラの培養） クロレラの株としては東京大学応用微生物研究
所（IAM）に保存され、自由に分譲されている
株を用いる。具体的には、クロレラ エプソイデ
アIAM Ｃ−87株またはクロレラサツカロフイラ
IAM Ｃ−211株を用いる。細胞は0.1％プロテオ
ースペプトンを含むMBM培地で25℃、3000ルツ
クス光照射下、振とうしながら４〜５日培養す
る。 MBM培地組成 KNO325mg、MgSO4・7H2O7.5mg、
K2HPO47.5mg、KH2PO417.5mg、CaCl2・2H2O1
mg、 *Fe溶液0.1ml、 **A5溶液0.1mlをH2Oにて
100mlとする。（PH6.0） ＊Fe溶液 FeSO4・7H2O1ｇ、H2O500ml、Conc
H2SO42滴 ＊＊A5溶液 H3NO3286mg、MnSO4・7H2O250
mg、ZnSO4・7H2O22.2mg、CuSO4・5H2O7.9
mg、NaMoO42.1mgをH2Oにて100mlとする。 実施例 １ 参考例で得られたクロレラ エリプソイデア
（Chlorella ellipsoidea）（IAM Ｃ−87）の対数
増殖期の培養細胞を遠心分離により集め、0.3M
ソルビツト、0.3Mマンニツトを含む25ｍＭリン
酸緩衝液（等張緩衝液）で洗浄した後、４％セル
ラーゼ（オノズカ Ｒ−10、近畿ヤクルト社製）、
２％マセロチーム（登録商標）Ｒ−10（近畿ヤク
ルト社製植物組織崩壊酵素）、１％ペクチナーゼ
（Sigma社製）を含む同緩衝液に懸濁し、ゆるや
かに振盪しながら25℃、８時間保温する。この処
理により細胞の90％がプロトプラスト化する。プ
ロトプラストは低張液希釈（H2O添加）による
細胞破裂、カルコフルオア白（Calofluor
White）による細胞壁染色、走査型及び透過型電
子顕微鏡による観察により同定した。又、生成し
たプロトプラストを等張緩衝液で２回洗浄後、
1500rpm、5minの違心で集め、MBM、0.3Mソ
ルビトール、0.3Mマンニトール、0.1％プロテオ
ースペプトン、0.1％イーストエキストラクトを
含む0.7％寒天に包埋して、23℃、3000ルツクス
光照射下培養すると約二週間後に細胞が再生し、
増殖コロニーが30％程度の頻度で出現する。カル
コフルオア染色により細胞壁再生を調べると、約
48時間後には螢光を発し細胞壁合成が起こつてい
る事を確認した。
Claims (1)
- １ クロレラのプロトプラスト化またはスフエロ
プラスト化に際し、セルラーゼと、リゾプス属
（Rhizopus sp.）菌体から得られる植物組織崩壊
酵素と、ペクチナーゼとの酵素混合物を用いるこ
とを特徴とするクロレラの細胞壁の除去方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56065449A JPS57181692A (en) | 1981-04-30 | 1981-04-30 | Method for removing cell wall of chlorella |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56065449A JPS57181692A (en) | 1981-04-30 | 1981-04-30 | Method for removing cell wall of chlorella |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57181692A JPS57181692A (en) | 1982-11-09 |
| JPH0121954B2 true JPH0121954B2 (ja) | 1989-04-24 |
Family
ID=13287453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56065449A Granted JPS57181692A (en) | 1981-04-30 | 1981-04-30 | Method for removing cell wall of chlorella |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57181692A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61141879A (ja) * | 1984-12-17 | 1986-06-28 | Nisshin Oil Mills Ltd:The | クロレラのプロトプラストの調製法 |
| JPS6232877A (ja) * | 1985-08-06 | 1987-02-12 | Nisshin Oil Mills Ltd:The | 新規クロレラ |
-
1981
- 1981-04-30 JP JP56065449A patent/JPS57181692A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57181692A (en) | 1982-11-09 |
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