JPH01165380A - 固定化微生物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、固定化微生物の製造法に関するものである。

〔従来の技術〕

固定化微生物およびそれを用いた有用物質の生産方法は
、将来の主要技術として注目され、精力的に研究が行わ
れ、すでに応用または実用段階にまで進展している事例
もある。しかしながら、使用する微生物によってまだ満
足できる固定化法が確立されていないのが現状である。

このような微生物の一例として糸状菌を挙げることがで
き、該微生物の固定化法としては、高分子ゲルを用いて
固定化する方法が一般に採用されていた。上記固定化法
は、微生物を固定化する方法としては最も汎用されてい
る方法であるにもかかわらず、該方法で糸状菌を固定化
した場合には、高分子ゲル内部への通気性および培養液
または反応基質液の拡散性などの点で問題を生じ、必ず
しも満足できる方法とはなりえなかった。

高分子ゲルを用いた固定化法以外に網目状布帛または繊
維状物質を担体として使用する方法も報告されている（
たとえば、特開昭６１−１５６８７号公報、特開昭６１
−１４９０８５号公報など参照）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

網目状布帛または繊維状物質を担体として用いる方法は
、高分子ゲルを用いた固定化法の欠点を解決できる優れ
た方法であるが、固定化法として振盪培養、通気撹拌培
養などの液相中で固定化処理を採用しており、■菌体が
ペレット状になり、担体への固定化がスムーズに進行し
ない、■微生物の担体への結合が弱く、担体から微生物
が容易に剥離してしまう、等の欠点を有していた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、糸状菌の固定化法に関し種々研究を重ね
た結果、従来液相中で行われていた担体への微生物の固
定化操作を気相中で行うことにより、担体からの菌体の
脱離のない強固でかつ高活性な固定化微生物が得られる
ことを発見し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、菌体が糸状を是する微生物を多孔
性担体に接種し、該微生物を生育させることにより固定
化微生物を製造する方法において、該微生物の生育を気
相中で行うことを特徴とする固定化微生物の製造法に関
するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明方法で使用可能な微生物としては、菌体が糸状を
呈する微生物であればよく、その種類に関係なくすべて
好適に用いることができる。具体的にそれらの微生物を
例示すれば、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾプス（Ｒ
ｈｉｚｏｐｕｓ）属などの接合菌類、アスペルギルス（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ）属、アウレオバジディウム（Ａｕｒａ
ｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ボトリテイス（Ｂｏｔｒｙｔ
ｉｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、トリコ
デルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　）属などの不完全菌
類、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、サイドア（Ｓ
ａｉｔｏａ）属、ユーロチュウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）
属、ニーベニリジウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）
属、エミリセロシス（Ｅｍｓｒｉｃｅｌｌｏｐｓｉｓ）
属などの子のう菌類、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃａｓ）属などの放線菌類およびファボラス（Ｆａ
ｖｏｌｕｓ）属、フェリナス（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ）属
などの担子菌類を例示することができる。

これらの微生物を固定化するための担体としては、微生
物の菌糸が十分に伸長できる１−〜１０ｔｔｍＰＡ度の
孔を有し、微生物の培養成分を保持できる能力をを有す
る多孔性担体であればよく、その形状、構造、材質など
には限定されない。

たとえば、担体の材質としては、ナイロン、ポリエステ
ル、レーヨン、ビニロン、アクリル、ポリプロピレン、
ポリウレタン、ポリビニールアルコールなどの合成由来
のもの、紙、木綿、麻、絹、綿などの天然由来のものの
いずれであってもよい。

担体の構造としては、上記材質の繊維を規則的または不
規則的に二次元的または三次元的に編みあげたもの、ま
たは化学的もしくは物理的手段にて一部分を結合させた
もののいずれであってもよい。また、担体の材質として
合成由来のものを使用する場合には、発泡状の構造を有
していてもよい。このような発泡体は、たとえばポリオ
キシエチレン構造を有するポリオール（たとえば、ポリ
エチレングリコールなど）とポリイソシアネート（たと
えばジフェニルメタンジイソシアネートなど）を反応さ
せることにより容易に調製することができる。

担体の形状としては、平面状、丸状、円柱状、円錐状、
筒状、多面体状などの形に成形したもの、あるいは一定
の形の成形しないものであってもよい。また、担体のの
物理的強度を高め、形状を一定に保持するため、これら
の担体を金属もしくは硬質ポリマーなとのネット、棒、
リング、糸などの補強材で補強してもよい。

このような担体を具体的に示せば、編布、不織布、濾紙
、発泡体などおよびそれらの補強物を例示することがで
きる。

不織布についてさらに具体的に説明すれば、乾式不織布
、湿式不織布のいずれも好適に用いることができ、乾式
不織布は接着剤型不織布、機械結合型不織布、紡糸型不
織布のいずれのものも好適に用いることができる。これ
ら不織布は、種々市販されており、適宜に選択すればよ
い。

担体への微生物の固定化処理は、使用した微生物が資化
可能な成分を含有する培養液を担体に含浸させ、これに
微生物を接種して気相中で１時間〜３０日間培養するか
、または培養液に微生物を懸濁し、この懸濁液を担体に
含浸させてこれを気相中で１時間〜３０日間培養するこ
とにより実施することができる。

ここで「気相中」とは、気体の雰囲気中に保持し、常に
気体と微生物との接触が密接に行える条件下のことを意
味し、「気体」とは、空気、高濃度酸素含有気体、純酸
素などの酸素を含有するものもしくは必要に応じてこれ
に二酸化炭素および窒素を適当濃度含有せしめたものを
意味し、これらの気体は、強制的に撹拌または通気させ
る状態であってよい。また、「含浸させる」とは担体の
空隙に培養液、微生物Ｓ濁液などの溶液を保持させるこ
とを意味する。

担体に含浸させる培養液は特に制限されず、使用した微
生物の生育に繁用されている炭素源（グルコース、グリ
セリン、デキストリン、脂肪酸など）、窒素源（ペプト
ン、酵母エキス、コーンス、ティータ・リカー、カゼイ
ンなど）、アミノ酸類、ビタミン類、無機塩類などを一
種以上含有するものであればよい。

担体に接種または培養液に懸濁させる微生物は、胞子ま
たは生育初期の微生物のいずれであってもよく、微生物
の使用濃度は、Ｉ　Ｘ　１０’〜ｌＸ１０″個／　ｍＱ
が好適である。

気相中での生育条件は、使用する微生物が良好に生育す
る通常の温度、湿度、ｐｉなどの各条件を適宜選定すれ
ばよく、具体的には温度Ｏ〜７０℃、気体中の相対湿度
６０％以上、２１１２〜１１の条件より適宜選定できる
。

また、微生物の固定化処理は、無菌箱等で区切られた培
養容器内で無菌的に行ってもよい。

〔発明の効果〕

本発明方法は、担体への微生物の固定化操作を気相中で
行うため、固定化処理が極めて簡便であるとともに担体
へ微生物が強固に結合した高活性の固定化微生物を得る
ことができる。そして、本発明方法で得られた固定化微
生物は、物質変換反応、物質生産反応などの応用反応中
で担体から微生物が剥離せず、長時間高活性を維持する
ため、極めて有用なものである。

〔実施例〕

以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。

実施例　１ 関西フェルト製ニューファインフェルト（９，４ｃｓ　
Ｘ　８　Ｇｌ　）を円筒形にして、内側をステンレス製
金網で補強し、担体とした。

グルコース（３％）、酵母エキス（０，９％）。

マルトエキストラクト（デイフコ社１ｍ）（０，９％）
。

ペプトン（１，５％）を含有する培養液（２１１６，０
）中に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ凹μ＝ｒ）　　Ｉ　ＡＭ２０９４の胞子を懸濁し、
胞子濃度１０６〜１０７個／　ｍＱ程度の胞子懸濁液を
調製し、上記担体をこの懸濁液中に十分に浸した後、引
き上げて、ガラス製円筒管（直径５備、長さ３０１）中
に直立させ、綿栓をして３０℃、３６〜４８時間静置培
養し、固定化微生物を得た（以下、気相生育固定化微生
物と称する。）。

比較のため、実施例１と同様に処理して胞子懸濁液をし
み込ませた担体を上記のガラス製円筒管に入れ、これに
グルコース（１％）、酵母エキス（０，３％）、マルト
エキストラクト（０，３％）。

ペプトン（０，５％）を含有する培養液（ｐｉ６．０）
２００　ＩＱを加えて１円筒管底部に取り付けたガラス
ポールフィルターより空気を通気させながら、３０℃、
３６時間液相中で培養し、固定化微生物を得た（以下、
液相生育固定化微生物と称する。）６上記各固定化微生
物をそれぞれを殺菌水ＩＱを２００　ｍＱずつ用いて５
回にわけて洗浄し、以下に述べるグルコン酸生産反応に
供した。また菌体量測定用に上述と同様にして固定化微
生物を調製し、乾燥菌体総重量を測定したところ、気相
生育（空気中）のもので約３４０ｍｇ、液相生育で約４
４０■の菌体が担体に固定化されていた。

次に、気相生育および液相生育の各固定化微生物を用い
て、グルコン酸生産を実施した。

グルコン酸生産用反応液（ｐｌ−１６，０）としてはグ
ルコース（１０％）、硫酸マグネシウム（０，０１５％
）、リン酸二水素カリウム（０，０２％）、リン酸水素
二ナトリウム（０，０４％）を含有するものを用いた。

グルコン酸生成反応は、固定化微生物と反応液２００　
ｍＱをガラス管（直径５ｍ、長さ３０Ｇ）中に入れ、ガ
ラスポールフィルターより純酸素を底部から通気して、
溶存酸素濃度、３０ｐｐｍ、反応温度、３０℃、反応Ｐ
Ｈ＊　ｐｌ（７，６の条件下にて行った１反応中のｐＨ
変動は、６規定の水酸化ナトリウムを中和剤として使用
したｐＨコントローラーにより行った０反応中適時。

反応液を採取し、残存グルコース量をネルソンーソモジ
法で、生成グルコン酸量をカラムとしてＭＣｌ−置−Ｃ
ＫＯ８Ｓ　（Ｅ菱化成工業■製）を用いた高速液体クロ
マトグラフィー法（溶出剤：１％リン酸溶液、検出＝２
１０１の吸光度）にて測定し、グルコースがほぼ消費さ
れつくしたところで反応液をすべて抜き取り、新たにグ
ルコン酸生産用反応液を２００　ｍＱ加えて、引き続き
繰り返し反応を行った。

気相生育（空気中）および液相生育の各固定化微生物に
よるグルコン酸生産における反応時間、収率、グルコン
酸生産速度値を第１表および第２表に示し、それぞれの
場合の繰り返し使用によるグルコン酸生産速度の変化を
第１図に示す。

第１回目の反応は、反応開始直後のため不安定であるが
、繰り返し使用の２回目以降ではつねに気相生育固定化
微生物の方が、液相生育固定化微生物より、グルコン酸
生産速度値が高かった。また、液相生育固定化微生物で
は、繰り返しによる生産速度の低下が大きく、繰り返し
使用１０回目において、当初の速度の４０％以下になっ
てしまい、その後も低下し続けたのに対して、気相生育
固定化微生物では１０回目以後もほとんど速度の低下は
なく、反応開始当初の生産速度の７０％程度の速度を保
持した。また、気相生育固定化微生物では、繰り返し使
用中においても、担体からの菌体の剥離はほとんど認め
られなかった。

以上のように、気相生育固定化微生物は液相生育固定化
微生物と比較して、担体との結合力、グルコン酸生産に
おける生産速度およびその安定性の点において極めてす
ぐれており、のべ反応時間６８０時間余りの長期間にわ
たり、安定なグルコン酸の生産が可能であった。

第１表　気相中で生育させた固定化微生物によるグルコ
ン酸生産２　　３４　　　　８５　　９０．６　　　１
．４６３　　３３　　　１１８　　９４．４　　　１．
５０４　　３８　　　１５６　　９８．０　　　１．３
３５　　３９　　　１９５　　８９．０　　　１，２７
６　　３９　　　２３４　　８４．８　　　１．１８７
　　３９　　　２７３　　８７．４　　　１．２０８　
　５２　　　３２５　　８５．１　　　０．８９９　　
４８　　　３７３　　８６．２　　　０．９５１０　　
４９　　　４２２　　８３．９　　　０．８８１１　　
５４　　　４７６　　８８．８　　　０．８５１２　　
４７　　　５２３　　９８．４　　　１．０３１３　　
５１　　　５７４　　８８．５　　　０．９５１４　　
５６　　　６３０　　９１．０　　　０．８６１５　　
５７　　　６８７　　９２．６　　　０．８７＊）菌体
量不変として計算 第２表　液相中で生育させた固定化微生物によるグルコ
ン酸生産１　　２３　　　　２３　　８４．１　　　１
．５４２　　３２　　　　５５　　７７．８　　　１．
０１３　　２８　　　　８３　　７６．５　　　１．１
３４　　２５　　　１０８　　７５．４　　　１．２５
５　　２７　　　１３５　　７３．９　　　１．０７６
　　３２　　　１６７　　７７．４　　　０．９４７　
　３６　　　２０３　　７６．２　　　０．８８８　　
３７　　　２４０　　８４．２　　　０．８７９　　４
７　　　２８７　　７７．２　　　０．６７１０　　５
７　　　３４４　　７４．２　　　０．５５申）菌体量
不変として計算 実施例　２ 担体として関西フェルト製ニューファインフェルト（９
，４■Ｘ８ａａ）を円筒形にしたものに加えて、その外
側に同じニューファインフェルト（１５，７０ＩＸ９．
６ｍ）を円筒形にしたものを置き、二重にして、担体表
面積を内側の担体のみの場合の３倍にしたものを使用し
、実施例１と同様に処理し、担体にアスペルギルス・ニ
ガーＩＡＭ２０９４の胞子懸濁液を含浸させた。

これを実施例１と同様にガラス製円筒管に直立させ、ガ
ラス製円筒管ごと密閉容器に入れ、容器中の空気をすべ
て純酸素に置換し、純酸素中で３０’Ｃ１４８時間静置
培養し、微生物を担体上に増殖させ、固定化微生物を得
た。純酸素中で生育させた固定化微生物の乾燥菌体重量
は、９．４ａｍ×８１の担体当り、約２２５■であった
。

この固定化微生物とグルコース（１０％）、硫酸マグネ
シウム（０，０１５％）、リン酸二水素カリウム（０，
０２％）、リン酸水素二ナトリウム（０，０４％）を含
有する反応液（ｐＨ６，０）６００ｍｕを用いて、グル
コン酸の生産反応を行った。グルコン酸生産反応は、加
圧可能なステンレス製反応器（内径６．９０、高さ２７
個）を用いて、純酸素で５ｋｇ／ｄ（ゲージ圧）に加圧
し、反応器底部のガラスポールフィルターより純酸素を
通気して、溶存酸素濃度１５０ｐｐｍｔ反応温度３０”
Ｃ，反応ＰＨ６に保持し、以下実施例１と同様に、グル
コン酸生産反応を繰り返し実施した。

反応時間、収率、グルコン酸生産速度の結果を第３表お
よび第２図に示した。

第３表および第２図より、繰り返し１．２回目では反応
開始直後のため、不安定であったが、３回目以降ではグ
ルコン酸生産速度は３．２（ｇ／ｇｃｅｌｌ−６１以上
と高い値を示し、繰り返し使用１２２回目以降おいても
、生産速度はほとんど変化することなく、およそ３　（
ｇ／ｇｃｅｌｌ−ｈ）と実施例１に示した常圧反応の場
合の約３倍の値を保ち続けることが可能であった。この
高い値は、繰り返し２０回を越えても変わらなかった。

以上のように、純酸素中で菌糸を生育させて得た固定化
微生物は、高溶存酸素濃度下におけるグルコン酸生産反
応において、その生産速度および安定性において格段す
ぐれた効果が得られることが明らかとなった。

第３表　酸素中で生育させた固定化菌体による高溶存酸
素濃度下におけるグルコン酸生産 ２　２９　　　　７５　　　８５．４　　　２．５０３
　２１　　　　９６　　　８６．８　　　３．３１４　
２０　　　１１６　　　８５．８　　　３．５０５　２
０　　　１３６　　　８６．６　　　３．６３６　２０
　　　１５６　　　８５．７　　　３．５６７　１９　
　　１７５　　　９０．５　　　３．７５８　２０　　
　１９５　　　８３．２　　　３．４６９　２１　　　
２１６　　　８４．０　　　３．３０１０　２１．５　
　２３７．５　　８７．４　　　３．３１１１　２２　
　　２５９．５　　８８．５　　　３．２５１２　２４
　　　２８３．５　　８７．０　　　２，９５１３　２
５　　　３０８．５　　８８．４　　　２．９０１４　
２４．５　　３３３　　　８８．３　　　２．９３１５
　２４．５　　３５７．５　　８４．９　　　２．９２
１６　２４　　　３８１．５　　８７．６　　　３．０
０１７　２４　　　４０５．５　　８５．３　　　２．
９５１８　２４　　　４２９．５　　８２．２　　　２
．８５１９　２５　　　４５４．５　　８６．６　　　
２．８４２０　２４　　　４７８．５　　９１．４　　
　３．０５２１　２４　　　５０２．２　　９１．４　
　　３．１０り菌体量不変として計算 第１図は、液相生育固定化微生物（・−・）または気相
生育固定化微生物（０−０）を用いて、グルコン酸生産
反応を行った時の、固定化微生物の繰り返し使用による
グルコン酸の生産速度の変化を示したものである。

第２図は、高溶存酸素濃度下でグルコン酸生産反応を行
った時の、固定化微生物の繰り返し使用によるグルコン
酸生産速度の変化を示したものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）菌体が糸状を呈する微生物を多孔性担体に接種し、
   該微生物を生育させることにより固定化微生物を製造す
   る方法において、該微生物の生育を気相中で行うことを
   特徴とする固定化微生物の製造法。