JPH01147369A - Sm−B/B’抗原、Sm−B/B’抗源のクローニングとSm−B/B’抗源もしくはSm−B/B’抗源とSm−D抗源の混合物を使用した全身性紅斑性狼瘡の検出 - Google Patents
Sm−B/B’抗原、Sm−B/B’抗源のクローニングとSm−B/B’抗源もしくはSm−B/B’抗源とSm−D抗源の混合物を使用した全身性紅斑性狼瘡の検出Info
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
- G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
- G01N2800/104—Lupus erythematosus [SLE]
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[技術分野]
本発明は生物が全身性紅斑性根1m(SLE)であるか
否か人の血清試料をテストする方法に関するものであり
、更に詳細には、患者の血清がSm−B及び/又はSm
−B’と反応するか否かを調べて、SLEであるかをテ
ストする方法に関するものであ゛る6本発明はさらにS
m−B及び/又はSm−E′ポリペプチドのcDNAを
単離しクローニングする方法に関するものである。この
方法はまたSm−B及び/又はSm−B’抗原とSm−
B及び/又はSm−B’抗原とSLEに冒されている人
の抗体との反応が起ったことを示す物質との組み合わせ
ないしは組成物に関するものである。さらにSm−Dと
Sm−B及び/又はSm−B’ポリペプチドの混合物を
上記の目的に用いることに関係している。
否か人の血清試料をテストする方法に関するものであり
、更に詳細には、患者の血清がSm−B及び/又はSm
−B’と反応するか否かを調べて、SLEであるかをテ
ストする方法に関するものであ゛る6本発明はさらにS
m−B及び/又はSm−E′ポリペプチドのcDNAを
単離しクローニングする方法に関するものである。この
方法はまたSm−B及び/又はSm−B’抗原とSm−
B及び/又はSm−B’抗原とSLEに冒されている人
の抗体との反応が起ったことを示す物質との組み合わせ
ないしは組成物に関するものである。さらにSm−Dと
Sm−B及び/又はSm−B’ポリペプチドの混合物を
上記の目的に用いることに関係している。
〔従来技術1
自己免疫疾患では、生体の免疫系は自分自身の細胞内の
構成物と反応する抗体を産生ずる。その結果、抗原一抗
体複合体は種々の病理症状をもたらす。いくつかのリウ
マチ性疾患は自己免疫疾患である。そのようなリウマチ
性疾患のひとつにSLEがある。
構成物と反応する抗体を産生ずる。その結果、抗原一抗
体複合体は種々の病理症状をもたらす。いくつかのリウ
マチ性疾患は自己免疫疾患である。そのようなリウマチ
性疾患のひとつにSLEがある。
細胞核に対する抗体は自己免疫疾患の証明である。その
抗体は生体で、細胞核内の構成物に反応するので、核に
対する抗体となる。このような抗体の測定を基礎とする
検査は種々のリウマチ性疾患の診断のために臨床研究室
ではよく確立されている。(1,2)。これらの検査は
一般的に、これらの抗体に対する抗原として精製された
抗原を用いていない。従ってこれらの検査は比較的粗雑
である。細胞の抽出物が通常抗原として使われていると
いうことは、内部標準となる明確な基準がないというこ
とになる。これらの自己免疫疾患の標的となる抗原の分
子的な性質(分子構成)が比較的複雑であるため、問題
はさらに複雑になっている。
抗体は生体で、細胞核内の構成物に反応するので、核に
対する抗体となる。このような抗体の測定を基礎とする
検査は種々のリウマチ性疾患の診断のために臨床研究室
ではよく確立されている。(1,2)。これらの検査は
一般的に、これらの抗体に対する抗原として精製された
抗原を用いていない。従ってこれらの検査は比較的粗雑
である。細胞の抽出物が通常抗原として使われていると
いうことは、内部標準となる明確な基準がないというこ
とになる。これらの自己免疫疾患の標的となる抗原の分
子的な性質(分子構成)が比較的複雑であるため、問題
はさらに複雑になっている。
近年、当業者等によって、自己免疫抗体の標的抗原の分
子的性質が解明されはじめ、特にそれらを構築している
大きな構成物に関係する複雑さが認識されはじめた。そ
の大きな構成物は、RNAとタンパク質の複合体(リボ
ヌクレオプロティン: RNP)あるいはDNAとタン
パク質の複合体(デオキシリボヌクレオプロティン:
DNP)である。また彼らは、生体の細胞内でこれらの
抗体が機能している役割についての謎も解き始めている
。(3)。このような情報が得られた結果、検査結果が
明確な大量の抗原試薬の開発やこれらの試薬を使って鋭
敏で定量的な臨床検査法を開発する可能性が出てきた。
子的性質が解明されはじめ、特にそれらを構築している
大きな構成物に関係する複雑さが認識されはじめた。そ
の大きな構成物は、RNAとタンパク質の複合体(リボ
ヌクレオプロティン: RNP)あるいはDNAとタン
パク質の複合体(デオキシリボヌクレオプロティン:
DNP)である。また彼らは、生体の細胞内でこれらの
抗体が機能している役割についての謎も解き始めている
。(3)。このような情報が得られた結果、検査結果が
明確な大量の抗原試薬の開発やこれらの試薬を使って鋭
敏で定量的な臨床検査法を開発する可能性が出てきた。
リウマチ性疾患のような自己免疫疾患での抗体を検出す
る抗原として、比較的単純なポリペプチドやタンパク質
を単離する試みがなされてきた。
る抗原として、比較的単純なポリペプチドやタンパク質
を単離する試みがなされてきた。
これらのポリペプチドやタンパク質は単純な抗原である
が、それらは実際にはずっと複雑な細胞内構造の一部で
ある6その結果、そのような抗体と反応するポリペプチ
ドやタンパク質を単離することは困難であった。また同
じように、このような抗原を使ってリウマチ性疾患のよ
うな自己免疫疾患の抗体を検出する分析方法を開発する
ことも困難であった。
が、それらは実際にはずっと複雑な細胞内構造の一部で
ある6その結果、そのような抗体と反応するポリペプチ
ドやタンパク質を単離することは困難であった。また同
じように、このような抗原を使ってリウマチ性疾患のよ
うな自己免疫疾患の抗体を検出する分析方法を開発する
ことも困難であった。
SLEと呼ばれるリウマチ性疾患のための明確で豊富な
抗原を開発することは特に難しかった。
抗原を開発することは特に難しかった。
なぜならば、SLEの抗原(Smと呼ばれている)が、
s n RN P (small nuclear r
ibonucle。
s n RN P (small nuclear r
ibonucle。
protejns)と呼ばれる保存されたタンパク質と
関りあっているからである。(4)。Sm抗原となって
いるSm snRNPは5fffi類のUsnRNA
(U1、U2、U4、U5、tJ6)と少なくとも11
のポリペプチドを含んでいる。UsnRNAはウリジン
に富んでいる。
関りあっているからである。(4)。Sm抗原となって
いるSm snRNPは5fffi類のUsnRNA
(U1、U2、U4、U5、tJ6)と少なくとも11
のポリペプチドを含んでいる。UsnRNAはウリジン
に富んでいる。
本発明者らならびに当業者等はSm snRNPを固
定した。(5−8)。本発明者らは、最近SLEに関っ
ているSm−Dポリペプチド抗原を単離した。Sm−D
ポリペプチドの分子量はおよそ13,000である0本
発明者らは最近このような抗原を用いて患者がSLEに
冒されているか否かを患者の血清試料をテストする簡単
で有効な比色検査法を特許申請した。上に述べた全ての
ことは、rSm−D抗原、Sm−D抗原のクローニング
とSm−D抗原を使ったSLEの検出」という名称で1
987年6月19日米国特許庁に出願した出願番号第0
62802号の中に開示されており、その出願は本願出
願人に譲渡されている。
定した。(5−8)。本発明者らは、最近SLEに関っ
ているSm−Dポリペプチド抗原を単離した。Sm−D
ポリペプチドの分子量はおよそ13,000である0本
発明者らは最近このような抗原を用いて患者がSLEに
冒されているか否かを患者の血清試料をテストする簡単
で有効な比色検査法を特許申請した。上に述べた全ての
ことは、rSm−D抗原、Sm−D抗原のクローニング
とSm−D抗原を使ったSLEの検出」という名称で1
987年6月19日米国特許庁に出願した出願番号第0
62802号の中に開示されており、その出願は本願出
願人に譲渡されている。
本発明は以上の点に鑑みなされたものであって、上述し
た如き従来技術の欠点を解消し、Sm−B及び/又はS
m−B’ポリペプチド抗原の少なくともひとつをコード
化するcDNAを単離することである。Sm−B及び/
又はSm−B′ポリペプチド抗原の分子量はそれぞれ約
26.000と27.000である。(5−8)、本発
明の別の目的とするところは生物がSLEに冒されてい
るかをそのような抗原と人の血清試料を使って調べる簡
単で有効な比色分析物を提供することである。本発明の
更に別の目的とするところは、Sm−DとSm−B及び
/又はSm−B′ポリペプチド混合物を使った簡単で有
効な比色分析法及び分析物を提供することである。
た如き従来技術の欠点を解消し、Sm−B及び/又はS
m−B’ポリペプチド抗原の少なくともひとつをコード
化するcDNAを単離することである。Sm−B及び/
又はSm−B′ポリペプチド抗原の分子量はそれぞれ約
26.000と27.000である。(5−8)、本発
明の別の目的とするところは生物がSLEに冒されてい
るかをそのような抗原と人の血清試料を使って調べる簡
単で有効な比色分析物を提供することである。本発明の
更に別の目的とするところは、Sm−DとSm−B及び
/又はSm−B′ポリペプチド混合物を使った簡単で有
効な比色分析法及び分析物を提供することである。
〔構成1
本発明の1実施例においては、SLEに冒されている患
者の血清試料から得た抗体を使って、イムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより、snRNPタンパク質
を分離する。次にSm−B及び/又はSm−B′ポリペ
プチドをゲル電気泳動により単離し電気的に溶出する6
それからSm−B及び/又はSm−B′ポリペプチドの
アミノ末端からアミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸を
コード化する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ標識さ
れたDNAプローブを合成する。んクローニングベクタ
ーのヒトc D N’Aライブラリーをニトロセルロー
スフィルターのような適当なフィルターに移す。これら
のフィルターを標識されたプローブとハイブリダイズさ
せ、プローブの配列と合う配列を持つcDNAクローン
を固定する。
者の血清試料から得た抗体を使って、イムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより、snRNPタンパク質
を分離する。次にSm−B及び/又はSm−B′ポリペ
プチドをゲル電気泳動により単離し電気的に溶出する6
それからSm−B及び/又はSm−B′ポリペプチドの
アミノ末端からアミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸を
コード化する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ標識さ
れたDNAプローブを合成する。んクローニングベクタ
ーのヒトc D N’Aライブラリーをニトロセルロー
スフィルターのような適当なフィルターに移す。これら
のフィルターを標識されたプローブとハイブリダイズさ
せ、プローブの配列と合う配列を持つcDNAクローン
を固定する。
S m −B及び/又はSm−B’タンパク質をコード
化するcDNAをサブクローニングする。
化するcDNAをサブクローニングする。
それかSm−B及び/又はSm−B′ポリペプチドをイ
ムノアフィニティークロマトグラフィーと、さらに必要
ならばHPLC(高速液体クロマトグラフィー)により
単離する。検査では単離したSm−B及び/又はSm−
B′ポリペプチドを用い生物の血清試料とSm−B及び
/又はSm−B′ポリペプチドとの反応により生物がS
LEに冒されているかどうかを決定する。その検査は、
単離したS m −B及び/又はSm−B′ポリペプチ
ドと単離したSm−Dポリペプチド(上記のように単離
した)の混合物で行うこともできる。
ムノアフィニティークロマトグラフィーと、さらに必要
ならばHPLC(高速液体クロマトグラフィー)により
単離する。検査では単離したSm−B及び/又はSm−
B′ポリペプチドを用い生物の血清試料とSm−B及び
/又はSm−B′ポリペプチドとの反応により生物がS
LEに冒されているかどうかを決定する。その検査は、
単離したS m −B及び/又はSm−B′ポリペプチ
ドと単離したSm−Dポリペプチド(上記のように単離
した)の混合物で行うこともできる。
検査は標識酵素と共有結合した抗ヒトIgG/IgMな
どを使ったELISA法によって行うことができる。ラ
クトペルオキシダーゼ、アルカリホスファクーゼは、特
別な発色によって病気にかかっていることを示す標識酵
素の一例である。
どを使ったELISA法によって行うことができる。ラ
クトペルオキシダーゼ、アルカリホスファクーゼは、特
別な発色によって病気にかかっていることを示す標識酵
素の一例である。
[実施例]
Sm snRNPの 両
本発明の1実施例において、Sm snRNPをイム
ノアフィニティークロマトグラフィーによって分離した
。そのプロセスの最初のステップでは、SLEに冒され
た患者の血漿成分を調製し、ヒト抗Sm抗体を得た。免
疫グロブリンG(I gG)を半飽和硫安塩析による分
画とDEAE−86phace 1カラムを通過させる
ことにより精製した。精製したIgGを5ephar。
ノアフィニティークロマトグラフィーによって分離した
。そのプロセスの最初のステップでは、SLEに冒され
た患者の血漿成分を調製し、ヒト抗Sm抗体を得た。免
疫グロブリンG(I gG)を半飽和硫安塩析による分
画とDEAE−86phace 1カラムを通過させる
ことにより精製した。精製したIgGを5ephar。
5eCL−4Bにカルボニル−ジイミダゾール法によっ
て結合させた。(10)。
て結合させた。(10)。
細胞抽出液は、浮遊培養したヒト細胞株HeLa細胞を
0.35M NaC1,10mMTris−HC1、p
H7,4,1,5mMMgCI2.0.2mMphen
y1methylsulf。
0.35M NaC1,10mMTris−HC1、p
H7,4,1,5mMMgCI2.0.2mMphen
y1methylsulf。
nyl fluoride中で全細胞を超音波破壊す
ることにより調製した。(8)。細胞抽出液を調製して
ただちに前項で述べた方法で作製した抗Smイムノアフ
ィニティーカラムにかけた。カラムを抽出用緩衝液で洗
った後、O,1MNac1.6MLIrea、0.2m
Mpheny1methylsulfonyl fl
ucrideを含む10mMTr i 5−HC1、p
H7,4で溶出した。低タンパク質濃度でも、Smsn
RNPの沈殿ができるように溶出液にキャリアRNA(
20μg/ml)を加えた。Sm snRNPは、2
容量のエタノールを加えて一20℃で一晩沈殿させた。
ることにより調製した。(8)。細胞抽出液を調製して
ただちに前項で述べた方法で作製した抗Smイムノアフ
ィニティーカラムにかけた。カラムを抽出用緩衝液で洗
った後、O,1MNac1.6MLIrea、0.2m
Mpheny1methylsulfonyl fl
ucrideを含む10mMTr i 5−HC1、p
H7,4で溶出した。低タンパク質濃度でも、Smsn
RNPの沈殿ができるように溶出液にキャリアRNA(
20μg/ml)を加えた。Sm snRNPは、2
容量のエタノールを加えて一20℃で一晩沈殿させた。
イムノアフィニティーカラムの溶出物の全タンパク質構
成物(特長のあるSm snRNPの様相を含んでい
る)を5DS−ゲル電気泳動し、クマシーブリリアント
ブルーの染色により調べた。
成物(特長のあるSm snRNPの様相を含んでい
る)を5DS−ゲル電気泳動し、クマシーブリリアント
ブルーの染色により調べた。
(11)、抗原ポリペプチドをニトロセルロース膜に移
し、イムノプロット法で検出した。 (12,13)
、このようにして、直接生化学的解析に十分な純度のS
m抗原が大量に精製された。この方法は、Sm sn
RNPがタンパク質分解酵素や核酸分解酵素にさらされ
ることが最も少なかった。(9)。
し、イムノプロット法で検出した。 (12,13)
、このようにして、直接生化学的解析に十分な純度のS
m抗原が大量に精製された。この方法は、Sm sn
RNPがタンパク質分解酵素や核酸分解酵素にさらされ
ることが最も少なかった。(9)。
一且ヱ(7) S m s n RNかポリペプチド
の 肖本発明者らは、クロマトグラフィーの操作によっ
てSm snRNP粒子を容易に分離することができ
たが、クロマトグラフィーによってSm snRNP
粒子を明確に分画することはできなかった。そのかわり
本発明者らはSm snRNP粒子を5DS−ゲル電
気泳動と電気的溶出により分画した1本発明者らがこれ
を遂行するのに使用したプロトコール(と装置)はHu
nkapillerら(14)がマイクログラム量のタ
ンパク質を分離するのに使ったものである。このプロト
コールは本発明者らの目的に理想的であった。なぜなら
ば、それぞれのポリペプチドのバンドについて、大きな
アクリルアミドのかたまり(10−11cm巾/1.5
mm厚)から少量のタンパク質(10−20LLg)を
少量の容積(300−500μl)中に溶出できるから
である。
の 肖本発明者らは、クロマトグラフィーの操作によっ
てSm snRNP粒子を容易に分離することができ
たが、クロマトグラフィーによってSm snRNP
粒子を明確に分画することはできなかった。そのかわり
本発明者らはSm snRNP粒子を5DS−ゲル電
気泳動と電気的溶出により分画した1本発明者らがこれ
を遂行するのに使用したプロトコール(と装置)はHu
nkapillerら(14)がマイクログラム量のタ
ンパク質を分離するのに使ったものである。このプロト
コールは本発明者らの目的に理想的であった。なぜなら
ば、それぞれのポリペプチドのバンドについて、大きな
アクリルアミドのかたまり(10−11cm巾/1.5
mm厚)から少量のタンパク質(10−20LLg)を
少量の容積(300−500μl)中に溶出できるから
である。
Hunkapi 1lerらのプロトコールから本発明
者らが唯一改変した点はゲルからそれぞれのバンドを切
り出す前の染色の条件である。この変更は、注目してい
るいくつかのペプチドが長い(20Cm)ゲルを使った
時でさえ、非常に近接しているためになされた。これら
のペプチドを2時間の通常の脱色の後に、はっきり区別
するためクマシーブルー濃度をもとのHunkapi
l lerらのプロトコールから、0.05%に下げた
。
者らが唯一改変した点はゲルからそれぞれのバンドを切
り出す前の染色の条件である。この変更は、注目してい
るいくつかのペプチドが長い(20Cm)ゲルを使った
時でさえ、非常に近接しているためになされた。これら
のペプチドを2時間の通常の脱色の後に、はっきり区別
するためクマシーブルー濃度をもとのHunkapi
l lerらのプロトコールから、0.05%に下げた
。
それぞれのペプチドのバンドを電気的に溶出した後それ
ぞれのバンドを5DS−ゲル電気泳動(11)にかけ、
銀染色によりその均一性を検定し、プロッティング法に
より、抗体との反応性を検定した。(12,13)。
ぞれのバンドを5DS−ゲル電気泳動(11)にかけ、
銀染色によりその均一性を検定し、プロッティング法に
より、抗体との反応性を検定した。(12,13)。
タンパク のアミノ 51の゛
本発明者らは、Sm−B及び/又はSm−B′ポリペプ
チドのアミノ酸配列の決定にピコモル程度の量のタンパ
ク質しか必要でない気相法の方式を用いた。(15,1
6)、配列の決定はミズーリー州セントルイスのワシン
トン大学タンパク質化学研究室で行った。本発明者らは
Sm−B及び/又はSm−B′ポリペプチドのアミノ末
端からそれぞれ19と20残基の配列を得た。その配列
は以下に示す通りであった。
チドのアミノ酸配列の決定にピコモル程度の量のタンパ
ク質しか必要でない気相法の方式を用いた。(15,1
6)、配列の決定はミズーリー州セントルイスのワシン
トン大学タンパク質化学研究室で行った。本発明者らは
Sm−B及び/又はSm−B′ポリペプチドのアミノ末
端からそれぞれ19と20残基の配列を得た。その配列
は以下に示す通りであった。
val gly lys ser ser lys
met leu gin his Lieasp
tyr arg met arg cys ile
leu gin asp本発明者らは2つの23塩基長
のDNAプローブと1つの54塩基長のプローブをSm
−B及び/又はSm−B′タンパク質をコード化するc
DNAをクローニングするために合成した。 (ABI
Synthesizer、 The Agouron
In5titutel 、これらのプローブはSm−B
及び/又はSm−B’ポリペプチドのアミノ酸配列から
導かれる塩基組成で合成された。これらのプローブをB
1.B3、B4プローブと名付けた。プローブを放射性
リン(”P)で標識した。
met leu gin his Lieasp
tyr arg met arg cys ile
leu gin asp本発明者らは2つの23塩基長
のDNAプローブと1つの54塩基長のプローブをSm
−B及び/又はSm−B′タンパク質をコード化するc
DNAをクローニングするために合成した。 (ABI
Synthesizer、 The Agouron
In5titutel 、これらのプローブはSm−B
及び/又はSm−B’ポリペプチドのアミノ酸配列から
導かれる塩基組成で合成された。これらのプローブをB
1.B3、B4プローブと名付けた。プローブを放射性
リン(”P)で標識した。
B1.B3、B4プローブは次のように作られた。
獣 1−(j I−−−
一 ← <<<
Q [−(j < C5(:口
′A < 白 目
目上 陣 < 0 冒0 ゴ+0 −一
く トー
トー トーのトー(シ ー く トー
← ←−、euU
フ(コ(コ 5 3 C:5 I:CJ [:l:
L) 8屈 巳、 冒″−) て←
00 冒(り[jヒフ ■←− 巨 < [−1−)−ヵ 畷
日° に° # トー ω H< ロ L−z<コ (1)トー<−f: カ 斯
くト一 >≧=(コ −I lj
QeioL)(コ 完 言 イ〉
(コQ これは第1図にも示しである。上記の配列中で” N
”はA、T、G、Cの4つの塩基のいずれかを示す。”
I ”はC以外の3つの塩基の代用であり、デオキシ
イノシンに相当する。上記の配列中にシスティン残基が
見られる。このことは、のちの実験で確かめられた。し
かし実際にはB1、B2(B3の誤植と思われる)、B
4プローブを使った週はこのアミノ酸残基はリジンであ
ると考えられた。
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(コQ これは第1図にも示しである。上記の配列中で” N
”はA、T、G、Cの4つの塩基のいずれかを示す。”
I ”はC以外の3つの塩基の代用であり、デオキシ
イノシンに相当する。上記の配列中にシスティン残基が
見られる。このことは、のちの実験で確かめられた。し
かし実際にはB1、B2(B3の誤植と思われる)、B
4プローブを使った週はこのアミノ酸残基はリジンであ
ると考えられた。
示したように81プローブは最も不確かなコドンの3番
目の塩基の位置にデオキシイノシンを使用するように設
計された。(17)。従って、Blプローブは64種の
オリゴヌクレオチドの3昆合物として作られている。B
3プローブでは縮重しているコドンの3番目の位置に4
つの塩基が含まれている。さらにコドンの使用頻度に基
づいて(18)、本発明者らはロイシンのコドンの1番
目の位置をシトシンのみとした。その結果、B3プロー
ブの分子種の数は192に減少した。B4プローブとし
てヒトのコドンの使用頻度に基づいて、Sm−B/B’
ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する54塩基長の一
種類のプローブを作った。
目の塩基の位置にデオキシイノシンを使用するように設
計された。(17)。従って、Blプローブは64種の
オリゴヌクレオチドの3昆合物として作られている。B
3プローブでは縮重しているコドンの3番目の位置に4
つの塩基が含まれている。さらにコドンの使用頻度に基
づいて(18)、本発明者らはロイシンのコドンの1番
目の位置をシトシンのみとした。その結果、B3プロー
ブの分子種の数は192に減少した。B4プローブとし
てヒトのコドンの使用頻度に基づいて、Sm−B/B’
ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する54塩基長の一
種類のプローブを作った。
b ライブラリーのスクリーニング
cDNAとしてはCloneteck社(Pa1o
Alto、Ca1ifornia)のヒトBリンパ球細
胞poly−RNA由来のんgtlOベクターを用いた
cDNAライブラリーをイ吏用した。およそ25.00
0の独立した組み換え体プラークを大腸菌Y1090上
にまき、ニトロセルロースフィルター上に移した。(1
9)。これらのフィルターを[32P]で標識されたB
1プローブとハイブリダイズさせ、スクリーニングした
。
Alto、Ca1ifornia)のヒトBリンパ球細
胞poly−RNA由来のんgtlOベクターを用いた
cDNAライブラリーをイ吏用した。およそ25.00
0の独立した組み換え体プラークを大腸菌Y1090上
にまき、ニトロセルロースフィルター上に移した。(1
9)。これらのフィルターを[32P]で標識されたB
1プローブとハイブリダイズさせ、スクリーニングした
。
第一回目のスクリーニングで、[”PIで標識されたB
lプローブとハイブリダイズする19個のプラークを固
定した。さらに約25.000個の独立した組み換え体
プラークをB3プローブでスクリーニングした。このス
クリーニングで[32p]でt稟議されたB3プローブ
とハイブリダイズする16個のプラークを固定した。
lプローブとハイブリダイズする19個のプラークを固
定した。さらに約25.000個の独立した組み換え体
プラークをB3プローブでスクリーニングした。このス
クリーニングで[32p]でt稟議されたB3プローブ
とハイブリダイズする16個のプラークを固定した。
B1プローブでスクリーニングされた9個の最もシグナ
ルの強いクローンとB3プローブでスクリーニングされ
た16個のクローンについては、B3プローブによりさ
らに2回プラークの純化を行った。2度のハイブリグイ
ゼーション後、24個の純化されたクローンが得られた
。これらの24個のクローンをさらにB4プローブによ
って、低塩濃度、高温の条件でスクリーニングした。こ
の最後のスクリーニングによって、[”PIで標識され
たB4プローブとハイブリダイズする7個の組み換え体
クローンを固定した。
ルの強いクローンとB3プローブでスクリーニングされ
た16個のクローンについては、B3プローブによりさ
らに2回プラークの純化を行った。2度のハイブリグイ
ゼーション後、24個の純化されたクローンが得られた
。これらの24個のクローンをさらにB4プローブによ
って、低塩濃度、高温の条件でスクリーニングした。こ
の最後のスクリーニングによって、[”PIで標識され
たB4プローブとハイブリダイズする7個の組み換え体
クローンを固定した。
Cサブクローニングと塩基配り1の゛定B3プローブで
選別した24個の陽性クローンのDNAを調製し、(1
9)制限酵素EcoRIで消化した。消化の後ベクター
に挿入されたcDNAの長さを決定した。挿入された断
片(インサート)は、とある範囲の塩基長を持つ6つの
グループに分類された。これらのグループは、0.80
Kbから2.OKbの範囲の中にあった。B4プローブ
で陽性であった7個のクローンのうち6個は、1.3−
1.4Kbの長さのグループに属した。λB419−2
はEcoRIで切り出された1、IKbのインサートc
DNAを持っていた。λB5−1、λB22−2、λB
4O7−1、んB419−2、λB443−2のEco
RIで切り出されるcDNA挿入部分を一般的なベクタ
ーM13mp18中にサブクローニングした。(20)
。えB4O9−2と8445−2クローンのcDNAの
EcoRI断片を一般的なベクター1)UCl3中にサ
ブクローニングした。
選別した24個の陽性クローンのDNAを調製し、(1
9)制限酵素EcoRIで消化した。消化の後ベクター
に挿入されたcDNAの長さを決定した。挿入された断
片(インサート)は、とある範囲の塩基長を持つ6つの
グループに分類された。これらのグループは、0.80
Kbから2.OKbの範囲の中にあった。B4プローブ
で陽性であった7個のクローンのうち6個は、1.3−
1.4Kbの長さのグループに属した。λB419−2
はEcoRIで切り出された1、IKbのインサートc
DNAを持っていた。λB5−1、λB22−2、λB
4O7−1、んB419−2、λB443−2のEco
RIで切り出されるcDNA挿入部分を一般的なベクタ
ーM13mp18中にサブクローニングした。(20)
。えB4O9−2と8445−2クローンのcDNAの
EcoRI断片を一般的なベクター1)UCl3中にサ
ブクローニングした。
(21)、cDNA挿入部分の塩基配列をジデオキシ法
を用いて決定した。(22)。7個のクローン全てから
得られたDNAの配列はSm−B及び/又はSm−B’
ポリペプチドの知られている20個のアミノ酸のコドン
の構成と完全に一致した。
を用いて決定した。(22)。7個のクローン全てから
得られたDNAの配列はSm−B及び/又はSm−B’
ポリペプチドの知られている20個のアミノ酸のコドン
の構成と完全に一致した。
Sm−B及び/又はSm−B’タンパク質の発現は大腸
菌内で行った。この系を選んだ理由には次の2つがある
6 (I)このバクテリアは生理学的、遺伝学的、分子
生物学的に最もよく研究され、理解されている。(2)
多くのfi aJIの便利な発現ベクターがすでに開発
されている。(23−26)。これらのベクターは、バ
クテリア中で高率の転写とvI+訳が可能であるため、
クローン化した遺伝子の産物が高いレベルで合成できる
。
菌内で行った。この系を選んだ理由には次の2つがある
6 (I)このバクテリアは生理学的、遺伝学的、分子
生物学的に最もよく研究され、理解されている。(2)
多くのfi aJIの便利な発現ベクターがすでに開発
されている。(23−26)。これらのベクターは、バ
クテリア中で高率の転写とvI+訳が可能であるため、
クローン化した遺伝子の産物が高いレベルで合成できる
。
クローン化した遺伝子産物によるバクテリアの増殖の阻
害を防ぐため、条件によって活性化できる誘導可能な転
写プロモーターを使ってクローン化した遺伝子を発現さ
せる。たとえばプラスミドp I N−111(23)
やpKK233−2 (24)はそれぞれ−し」ユqや
ta旦ジブロモクーを含んでいるにれらは両方とも培養
液中に1sopr。
害を防ぐため、条件によって活性化できる誘導可能な転
写プロモーターを使ってクローン化した遺伝子を発現さ
せる。たとえばプラスミドp I N−111(23)
やpKK233−2 (24)はそれぞれ−し」ユqや
ta旦ジブロモクーを含んでいるにれらは両方とも培養
液中に1sopr。
1)3’l−β−D−thiogalactopyra
noside (IPTG)を加えることにより誘導で
きる。プラスミドpASI (25)は保温温度を30
°Cか642℃に変化させることにより活性化しつるん
pLプロモーターを持っている。
noside (IPTG)を加えることにより誘導で
きる。プラスミドpASI (25)は保温温度を30
°Cか642℃に変化させることにより活性化しつるん
pLプロモーターを持っている。
他のシステム(26)は2つのプラスミドを使って行わ
れる。ひとつのプラスミドpap 1−2は、T7RN
AポリメラーゼがえpLプロモーターの支配下にコード
されている。調べたい(発現させたい)遺伝子は別のプ
ラスミドpT7−3中にφ1OT7RNAポリメラーゼ
プロモーターの支配下にクローン化されている。
れる。ひとつのプラスミドpap 1−2は、T7RN
AポリメラーゼがえpLプロモーターの支配下にコード
されている。調べたい(発現させたい)遺伝子は別のプ
ラスミドpT7−3中にφ1OT7RNAポリメラーゼ
プロモーターの支配下にクローン化されている。
第一段階として、Sm−B及び/又はSm−B′タンパ
ク質をコード化するcDNAクローンを上に挙げた全て
のベクター中にクローニングした。次にSm−B及び/
又はSm−B′タンパク質の発現に最適な条件となるよ
うに転写の誘導の前後の培養条件を決定した。クローン
化したSm−B及び/又はSm−B′ポリペプチドの発
現量は新たに合成されたタンパク質を[”S]−メチオ
ニンで標識し、継時的にサンプリングして5DS−ゲル
電気泳動にかけ、オートラジオグラフィーを行うことに
より測定できる。
ク質をコード化するcDNAクローンを上に挙げた全て
のベクター中にクローニングした。次にSm−B及び/
又はSm−B′タンパク質の発現に最適な条件となるよ
うに転写の誘導の前後の培養条件を決定した。クローン
化したSm−B及び/又はSm−B′ポリペプチドの発
現量は新たに合成されたタンパク質を[”S]−メチオ
ニンで標識し、継時的にサンプリングして5DS−ゲル
電気泳動にかけ、オートラジオグラフィーを行うことに
より測定できる。
Sm の 折物
患者などの抗体の反応性を調べる直接的な分析物も使用
できる。直接的な分析物の大きな問題点は一般にそのよ
うな分析には比較的大量の抗原が必要とされることであ
る。はとんど単一に精製された抗原を使用することが望
ましい場合には特に問題となる。
できる。直接的な分析物の大きな問題点は一般にそのよ
うな分析には比較的大量の抗原が必要とされることであ
る。はとんど単一に精製された抗原を使用することが望
ましい場合には特に問題となる。
2つ前のパラグラフですでに述べた方法で大量の抗原を
調製することが可能である。たとえばSm−B及び/又
はSm−B’抗原はrSm snRNPの分離」とい
うセクションで述べたようにイムノアフィニティークロ
マトグラフィーによって精製し得る。このようなイムノ
アフィニティークロマトグラフィーでは、ヒトのポリク
ローン血清が使用できる。もしくはSm−B及び/又は
Sm−B’のバンドに特異的なウサギのポリクローン抗
体が使用できる。もしこれが望ましいと考えられるなら
ば、抗原のクロマトグラフィーは最後の精製のステップ
としてもよい。
調製することが可能である。たとえばSm−B及び/又
はSm−B’抗原はrSm snRNPの分離」とい
うセクションで述べたようにイムノアフィニティークロ
マトグラフィーによって精製し得る。このようなイムノ
アフィニティークロマトグラフィーでは、ヒトのポリク
ローン血清が使用できる。もしくはSm−B及び/又は
Sm−B’のバンドに特異的なウサギのポリクローン抗
体が使用できる。もしこれが望ましいと考えられるなら
ば、抗原のクロマトグラフィーは最後の精製のステップ
としてもよい。
ELISA分析物(27)はより望ましい分析物である
。精製したSm−B及び/又はSm−B′ポリペプチド
をマイクロタイタープレートの表面に吸着させる。露出
したマイクロタイタープレートの表面は高濃度の反応性
のないタンパク質溶液(ウシ血清アルブミンなど)でブ
ロックする。(28a)−血清試薬を直接Sm−B/B
’抗原と反応するか試験する6 Sm−B/B’抗原と血清試薬の反応によってできた抗
原一抗体複合体はラクトペルオキシダーゼ/アルカリホ
スファターゼのような酵素が共有結合した抗ヒトIgG
/IgM抗体によって検出する。標識となる酵素の結合
量は比色検査によって示される。さらにマイクロタイタ
ープレートは自動プレートリーダーによって測定できる
。バックグランドの測定は反応性のない病気にかかって
いない人の血清を使用して陰性反応とし、反応性のある
既知のヒト抗Sm抗体(29)やウサギ抗Sm−B及び
/又はSm−B′抗体(28b)を使用して陽性反応す
ることで測定できる。
。精製したSm−B及び/又はSm−B′ポリペプチド
をマイクロタイタープレートの表面に吸着させる。露出
したマイクロタイタープレートの表面は高濃度の反応性
のないタンパク質溶液(ウシ血清アルブミンなど)でブ
ロックする。(28a)−血清試薬を直接Sm−B/B
’抗原と反応するか試験する6 Sm−B/B’抗原と血清試薬の反応によってできた抗
原一抗体複合体はラクトペルオキシダーゼ/アルカリホ
スファターゼのような酵素が共有結合した抗ヒトIgG
/IgM抗体によって検出する。標識となる酵素の結合
量は比色検査によって示される。さらにマイクロタイタ
ープレートは自動プレートリーダーによって測定できる
。バックグランドの測定は反応性のない病気にかかって
いない人の血清を使用して陰性反応とし、反応性のある
既知のヒト抗Sm抗体(29)やウサギ抗Sm−B及び
/又はSm−B′抗体(28b)を使用して陽性反応す
ることで測定できる。
SLEの検査のためにSm−B及び/又はSm−B′抗
原のみを使用するかわりに、Sm−D抗原とSm−B及
び/又はSm−B’抗原の混合物もしくは、Sm−D抗
原とSm−B抗原かSm−B′抗原のどちらかのみとの
混合物を使用することも可能である。Sm−D抗原をS
mB抗原がSm−B′抗原の両方もしくは片方と混合し
て使用する場合は、マウス抗Sm−Dモノクローン抗体
とウサギ抗Sm−B及び/又はSm−B′抗体とを混合
して使用し、陽性反応とすることができる。もしくはS
m−B抗原かSm−B抗原をマウス抗Sm−Dモノクロ
ーン抗体がウサギ抗Sm−B及び/又はSm−B’抗体
のどちらがと個別に混合して用い、陽性反応とすること
もできる。
原のみを使用するかわりに、Sm−D抗原とSm−B及
び/又はSm−B’抗原の混合物もしくは、Sm−D抗
原とSm−B抗原かSm−B′抗原のどちらかのみとの
混合物を使用することも可能である。Sm−D抗原をS
mB抗原がSm−B′抗原の両方もしくは片方と混合し
て使用する場合は、マウス抗Sm−Dモノクローン抗体
とウサギ抗Sm−B及び/又はSm−B′抗体とを混合
して使用し、陽性反応とすることができる。もしくはS
m−B抗原かSm−B抗原をマウス抗Sm−Dモノクロ
ーン抗体がウサギ抗Sm−B及び/又はSm−B’抗体
のどちらがと個別に混合して用い、陽性反応とすること
もできる。
現在米国特許庁に係属中の特許出願第064802号の
出願の中で開示されている通り、Sm−Dポリペプチド
はDlとD2プローブを用いて次に述べるようにして単
離した。
出願の中で開示されている通り、Sm−Dポリペプチド
はDlとD2プローブを用いて次に述べるようにして単
離した。
met lys leu vat arg phe l
eu met 1ysCCCCCA(: GGG G えgtloベクターを用いたcDNAライブラリーをD
lとD2プローブを用いてスクリーニングした。スクリ
ーニングは、大筋では上に述べたように、そして特別に
第064802号の出願の中で述べたようにして行われ
た。そのようにして選別されたDNAをサブクローニン
グし、塩基配列も第064802号に述べた通りに行っ
た0組み換え体Sm−Dタンパク質は大筋においては、
上に述べたようにまた特別に第064802号に述べた
ように発現させた。
eu met 1ysCCCCCA(: GGG G えgtloベクターを用いたcDNAライブラリーをD
lとD2プローブを用いてスクリーニングした。スクリ
ーニングは、大筋では上に述べたように、そして特別に
第064802号の出願の中で述べたようにして行われ
た。そのようにして選別されたDNAをサブクローニン
グし、塩基配列も第064802号に述べた通りに行っ
た0組み換え体Sm−Dタンパク質は大筋においては、
上に述べたようにまた特別に第064802号に述べた
ように発現させた。
主なSm抗原はり、B、B’ポリペプチドと関係してい
る。イムノプロットと呼ばれる手法で、特に抗Smの反
応性について調べた3つの参考文献を下に引用した。(
30−32)、最も通常のパターンは、この3つの全て
のポリペプチドを認識するパターンである。さらに、あ
るひとつのマウスのモノクローン抗体がこの3つの全て
のポリペプチドを認識することから、この3者は少なく
ともひとつのエピトープを共通に持っていることが知ら
れている。(33)、1.がし同時に、特異的な抗原決
定基も存在する。引用した3つの調査(30−32)で
は、およそ8%のヒト抗血清がSm−B及び/又はSm
−B′ポリペプチドのみを認識する。恐らくまれにSm
−Dポリペプチドのみを認識する血清も存在するであろ
う、たとえば、Sm−Dポリペプチドのみを認識するマ
ウスモノクローン抗体が単離されている。
る。イムノプロットと呼ばれる手法で、特に抗Smの反
応性について調べた3つの参考文献を下に引用した。(
30−32)、最も通常のパターンは、この3つの全て
のポリペプチドを認識するパターンである。さらに、あ
るひとつのマウスのモノクローン抗体がこの3つの全て
のポリペプチドを認識することから、この3者は少なく
ともひとつのエピトープを共通に持っていることが知ら
れている。(33)、1.がし同時に、特異的な抗原決
定基も存在する。引用した3つの調査(30−32)で
は、およそ8%のヒト抗血清がSm−B及び/又はSm
−B′ポリペプチドのみを認識する。恐らくまれにSm
−Dポリペプチドのみを認識する血清も存在するであろ
う、たとえば、Sm−Dポリペプチドのみを認識するマ
ウスモノクローン抗体が単離されている。
この分野の研究者は今までSm−D抗原について強調す
る傾向があった。抗Sm検査に使う組織の臨床材料は、
非常に多くの場合ウサギ胸腺から調製されたENAと呼
ばれる抽出物である。ENAが調製される古い方法では
、全てではないがほとんどのSm−B及び/又はSm−
B′ポリペプチドが失われていることが示された。(3
5)。
る傾向があった。抗Sm検査に使う組織の臨床材料は、
非常に多くの場合ウサギ胸腺から調製されたENAと呼
ばれる抽出物である。ENAが調製される古い方法では
、全てではないがほとんどのSm−B及び/又はSm−
B′ポリペプチドが失われていることが示された。(3
5)。
従って、多くの臨床検査で抗Smの反応性は、Sm−D
ポリペプチドに対するものだけであると結論された。さ
らに引用文献31で結論されているように[抗り抗体は
、抗−(II)RNPの血清には見い出されないことか
ら、抗り抗体の存在は、抗Sm血清に、より特徴的なこ
とであるらしい。」別な表現をすれば、抗Sm−B及び
/又はSm−B’抗体は、ひとつ以上の表現型と関係し
ている。
ポリペプチドに対するものだけであると結論された。さ
らに引用文献31で結論されているように[抗り抗体は
、抗−(II)RNPの血清には見い出されないことか
ら、抗り抗体の存在は、抗Sm血清に、より特徴的なこ
とであるらしい。」別な表現をすれば、抗Sm−B及び
/又はSm−B’抗体は、ひとつ以上の表現型と関係し
ている。
3つの抗原(Sm−DSm−B及び/又はSm−B ′
)が全て重要であることが明らかになった。Sm−D抗
原が3者の中で最も重要ではあるが、Sm−B及び/又
はSm−B’抗原も重要な貢献をしていることが明らか
になってきた。このことにより3つの抗原を使用する方
が個々の抗原を使用するより少なくともある特定の場合
には望ましいことが明らかになった。
)が全て重要であることが明らかになった。Sm−D抗
原が3者の中で最も重要ではあるが、Sm−B及び/又
はSm−B’抗原も重要な貢献をしていることが明らか
になってきた。このことにより3つの抗原を使用する方
が個々の抗原を使用するより少なくともある特定の場合
には望ましいことが明らかになった。
上記の方法には、重要な利点がある。これによって、S
LEの検定をするSm−B及び/又はSm−B′抗原の
クローニングを行うことができる。また人がSLEにか
かっているかを検定するための血清試料と反応させる抗
原を供給する6SLEの抗体がSm−B及び/又はSm
−B′抗原(もしくはSm−DとSm−B及び/又はS
m−B′の混合物)と反応し、抗原一抗体複合体が形成
された場合には、酵素の結合した別の抗体を導入するこ
とにより、特別な発色反応を示すことができる。酵素の
結合した別の抗体は抗原一抗体複合体と反応し、酵素の
活性を比色検査により検出することができる。この特別
な色によ、す、検査された人がSLEにかかっているこ
とを検出することができる。
LEの検定をするSm−B及び/又はSm−B′抗原の
クローニングを行うことができる。また人がSLEにか
かっているかを検定するための血清試料と反応させる抗
原を供給する6SLEの抗体がSm−B及び/又はSm
−B′抗原(もしくはSm−DとSm−B及び/又はS
m−B′の混合物)と反応し、抗原一抗体複合体が形成
された場合には、酵素の結合した別の抗体を導入するこ
とにより、特別な発色反応を示すことができる。酵素の
結合した別の抗体は抗原一抗体複合体と反応し、酵素の
活性を比色検査により検出することができる。この特別
な色によ、す、検査された人がSLEにかかっているこ
とを検出することができる。
上記の方法は、他の重要な利点をも持っている。抗原は
、Sm−Dポリペプチドや多くの妨害をするポリペプチ
ドやタンパク質の含まれた複合体ではなく、Sm−B及
び/又はSm−B’ポリペプチドのみ(もしくはSm−
D抗原との混合物)であるため、Sm−B及び/又はS
m−B′ポリペプチド(もしくはSm−B及び/又はS
m−B′とSm−Dポリペプチドの混合物)とSLE抗
体の反応は、以前の技術による複雑な抗原と抗体の反応
よりも、特異的で感度もよいにのことにより、本発明者
らの検出方法は、以前の複雑な抗原に基づいた試験より
も明確で確実なものとなった。
、Sm−Dポリペプチドや多くの妨害をするポリペプチ
ドやタンパク質の含まれた複合体ではなく、Sm−B及
び/又はSm−B’ポリペプチドのみ(もしくはSm−
D抗原との混合物)であるため、Sm−B及び/又はS
m−B′ポリペプチド(もしくはSm−B及び/又はS
m−B′とSm−Dポリペプチドの混合物)とSLE抗
体の反応は、以前の技術による複雑な抗原と抗体の反応
よりも、特異的で感度もよいにのことにより、本発明者
らの検出方法は、以前の複雑な抗原に基づいた試験より
も明確で確実なものとなった。
以上、本発明の具体的実施の態様について詳細tこ説明
したが1本発明はこれら具体例にのみ限定されるべきも
のではな(、本発明の技術的範囲を逸脱することなしに
種々の変形が可能であることは勿論である6
したが1本発明はこれら具体例にのみ限定されるべきも
のではな(、本発明の技術的範囲を逸脱することなしに
種々の変形が可能であることは勿論である6
第1図は、Sm−B及び/又はSm−B’ポリペプチド
のアミノ末端のアミノ酸の配列と番号を示しており、さ
らにそのアミノ酸配列をコード化するcDNAとハイブ
リダイズさせるために合成されたプローブをした説明図
、 第2図は、Sm−Dポリペプチドのアミノ末端のアミノ
酸配列と番号を示しており、さらにそのアミノ酸配列を
コード化するcDNAとハイブリダイズさせるために合
成されたプローブを示した説明図である。 跨許J:@ス、 シ゛′ ア2°iり/ インステ
イ+ニー1〜ン 一 ヘ ロ ロ ーいい FIG、 / va工gly lys ser ser lys me
t leu gln his3’ CACCCG T
ACAGG GTCTTCTACGACGTCGTGL
le asp tyr arg met arg cy
s ile leu gln aspG
のアミノ末端のアミノ酸の配列と番号を示しており、さ
らにそのアミノ酸配列をコード化するcDNAとハイブ
リダイズさせるために合成されたプローブをした説明図
、 第2図は、Sm−Dポリペプチドのアミノ末端のアミノ
酸配列と番号を示しており、さらにそのアミノ酸配列を
コード化するcDNAとハイブリダイズさせるために合
成されたプローブを示した説明図である。 跨許J:@ス、 シ゛′ ア2°iり/ インステ
イ+ニー1〜ン 一 ヘ ロ ロ ーいい FIG、 / va工gly lys ser ser lys me
t leu gln his3’ CACCCG T
ACAGG GTCTTCTACGACGTCGTGL
le asp tyr arg met arg cy
s ile leu gln aspG
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、生物がSLEに冒されているか否かを検出する方法
において、Sm−BとSm−B′ポリペプチドのうち少
なくともひとつと抗体を含む生物の血清試料とを反応さ
せ、前記Sm−BとSm−B′ポリペプチドのうち少な
くともひとつと血清試料中の抗体との反応性により生物
がSLEに冒されているか否かを決定する、各ステップ
を有することを特徴とする方法。 2、特許請求の範囲第1項において、Sm−BとSm−
B′ポリペプチドの分子量はそれぞれ約26,000と
27,000であることを特徴とする方法。 3、特許請求の範囲第2項において、前記Sm−BとS
m−B′ポリペプチドのうち少なくともひとつと生物の
血清試料中の抗体との反応性は、反応生成物と標識酵素
を共有結合させた抗IgG/IgM抗体とを反応させる
ことによって検出することを特徴とする方法。 4、特許請求の範囲第1項において、Sm−BとSm−
B′ポリペプチドはval gly lys sers
er lys met leu gln his il
e asp tyr arg metarg cys
ile leu gln aspというアミノ酸配列を
持っていることを特徴とする方法。 5、生物がSLEに冒されているか否かを検出する方法
において、SLEに冒されている生物の血清試料から得
た抗体をsnRNPを分離するために使用し、snRN
Pのタンパク質から分子量約26,000と27,00
0のポリペプチドを単離し、分子量約26,000と2
7,000のポリペプチドの少なくともひとつをクロー
ニングし、組み換え体ポリペプチドの少なくともひとつ
を生物の血清試料と反応させ、クローン化したポリペプ
チドの少なくともひとつと生物の血清試料との反応性に
よって生物がSLEであるか否かを決定する、上記各ス
テップを有することを特徴とする方法。 6、特許請求の範囲第5項において、クローン化したポ
リペプチドの少なくともひとつと血清試料との反応性は
反応生成物に標識酵素を共有結合させた抗IgG/Ig
M抗体を加えることにより決定することを特徴とする方
法。 7、特許請求の範囲第5項において、少なくとも単離し
たポリペプチドのひとつは、Sm−BとSm−B′ポリ
ペプチドのひとつであることを特徴とする方法。 8、特許請求の範囲第5項において、分離したポリペプ
チドの少なくともひとつは、アミノ末端に、val g
ly lys ser ser lys met le
u glnhis ile asp tyr arg
met arg cys ile leu glnas
pという配列を持っていることを特徴とする方法。 9、生物がSLEに冒されているか否かを検出する方法
において、Sm−BとSm−B′ポリペプチドの少なく
ともひとつをクローニングし、生物の血清試料との反応
性を調べるために、クローニングしたSm−BとSm−
B′ポリペプチドのうちのクローニングしたものを調製
する、上記各ステップを有することを特徴とする方法。 10、特許請求の範囲第9項において、SmsnRNP
のタンパク質を分離し、snRNPのタンパク質からS
m−BとSm−B′ポリペプチドの少なくともひとつを
単離し、Sm−BとSm−B′ポリペプチド単離された
ひとつからのアミノ酸配列に基づき、Sm−BとSm−
B′ポリペプチドの少なくともひとつをコード化するD
NA配列をクローニングする、上記各ステップを有する
ことを特徴とする方法。 11、特許請求の範囲第9項において、Sm−BとSm
−B′ポリペプチドの分子量はそれぞれ約26,000
と27,000であることを特徴とする方法。 12、特許請求の範囲第9項において、Sm−BとSm
−B′ポリペプチドの少なくともひとつはアミノ末端に
val gly Iys ser ser lys m
etleu gln his ile asp tyr
arg met arg cys ileleu g
ln aspという配列を持っていることを特徴とする
方法。 13、生物がSLEに冒されているか否かを試験する方
法において、Sm−BとSm−B′ポリペプチドの少な
くともひとつをコード化するcDNAをクローニングし
、cDNAから前記Sm−BとSm−B′ポリペプチド
の少なくともひとつを単離し、マイクロタイタープレー
ト表面にSm−BとSm−B′ポリペプチドの単離した
少なくともひとつを吸着させ、露出した表面をブロッキ
ングし、マイクロタイタープレート上でSm−BとSm
−B′ポリペプチドのブロックしたひとつに生物の血清
試料を反応させ、その反応で生じた抗原−抗体複合体を
検出する、上記各ステップを有することを特徴とする方
法。 14、特許請求の範囲第13項において、抗原−抗体複
合体の形成は標識酵素を共有結合した抗ヒトIgG/I
gM抗体によって検出することを特徴とする方法。 15、特許請求の範囲第13項において、前記マイクロ
タイタープレート上の前記Sm−BとSm−B′ポリペ
プチドのブロックしたひとつの露出した表面を高濃度の
反応性のないタンパク質溶液で、ブロックすることを特
徴とする方法。 16、特許請求の範囲第14項において、Sm−BとS
m−B′ポリペプチドの少なくともひとつはイムノアフ
ィニティークロマトグラフィーによりcDNAから単離
し、マイクロタイタープレート上のSm−BとSm−B
′ポリペプチドのブロックしたひとつの露出した表面を
高濃度の反応性のないタンパク質溶液でブロックする、
上記各ステップを有することを特徴とする方法。 17、特許請求の範囲第16項において、抗原−抗体複
合体の形成を特殊な発色によって示す検査に用いられる
標識酵素は、ラクトペルオキシダーゼ/アルカリホスフ
ァターゼであることを特徴とする方法。 18、生物がSLEに冒されているか否かを検出するた
めの組成物において、SLEに冒されている生物の抗体
と反応するSm−BとSm−B′抗原の少なくともひと
つ、Sm−BとSm−B′抗原の少なくともひとつとS
LEに冒されている生物の血清試料を混合した時に形成
される抗原一抗体複合体に反応するもうひとつの後から
加える抗体、形成された抗原−抗体複合体に後から加え
た抗体が結合した時に、適当な基質を加えると、特別な
発色を起こす後から加える抗体に結合させた酵素、を有
することを特徴とする組成物。 19、特許請求の範囲第18項において、後から加える
抗体は抗ヒトIgG/IgM抗体であり、酵素はその抗
体に共有結合している、ことを特徴とする組成物。 20、特許請求の範囲第19項において、酵素はラクト
ペルオキシダーゼとアルカリホスファターゼの少なくと
も一方から成ることを特徴とする組成物。 21、生物がSLEに冒されているか否かを検出する方
法において抗体を含んでいる人の血清試料とSm−Dと
Sm−B/B′ポリペプチドの混合物を反応させ、生物
がSLEであるか否かを、Sm−DとSm−BとSm−
B′ポリペプチドの少なくともひとつとの混合物と生物
の血清試料中の抗体との反応性によって決定する、上記
各ステップを有することを特徴とする方法。 22、特許請求の範囲第21項において、Sm−BとS
m−B′ポリペプチドの分子量はそれぞれ約26,00
0と27,000であり、Sm−Dポリペプチドの分子
量は約13,000であることを特徴とする方法。 23、特許請求の範囲第22項において、Sm−DとS
m−BとSm−B′ポリペプチドの少なくともひとつと
の混合物と生物の血清試料との反応性は、反応生成物と
標識酵素を共有結合させた抗IgG/IgM抗体とを反
応させることによって検出することを特徴とする方法。 24、特許請求の範囲第21項において、Sm−BとS
m−B′ポリペプチドの少なくともひとつはval g
ly lys ser ser lys met le
u gln hisile asp tyr arg
met arg cys ile leu gln a
spというアミノ酸配列を持ち、Sm−Dポリペプチド
はmet lys leu val arg phe
leu met lys leuserというアミノ酸
配列を持つことを特徴とする方法。 25、生物がSLEに冒されているか否かを検出する方
法において、SLEに冒されている生物の血清試料から
得た抗体をsnRNPを分離するために使用し、snR
NPのタンパク質から分子量約13,000のポリペプ
チドと分子量約26,000と27,000のポリペプ
チドの少なくとも一方を単離し、単離した分子量約13
,000のポリペプチドと分子量約26,000と27
,000のポリペプチドの少なくとも一方をクローニン
グし、クローン化したポリペプチドの混合物と生物の血
清試料と反応させ、クローン化したポリペプチドの混合
物と生物の血清試料との反応性によって、生物がSLE
であるか否かを決定する、上記各ステップを有すること
を特徴とする方法。 26、特許請求の範囲第25項において、クローン化し
たポリペプチドの混合物と血清試料との反応性は標識酵
素と共有結合させた抗IgG/IgM抗体を加えること
により決定することを特徴とする方法。 27、特許請求の範囲第25項において、単離したポリ
ペプチドは、Sm−DポリペプチドとSm−BとSm−
B′ポリペプチドの少なくともひとつであることを特徴
とする方法。 28、特許請求の範囲第25項において、Sm−BとS
m−B′ポリペプチドの単離したものはアミノ末端にt
hr val gly lys ser ser ly
s metleu gln his ile asp
tyr arg met arg cys ilele
u gln aspというアミノ酸配列を持ち、Sm−
Dポリペプチドはアミノ末端にmet lys leu
valarg phe leu met lys l
eu serというアミノ酸配列を持つことを特徴とす
る方法。 29、生物がSLEに冒されているか否かを検出する方
法において、Sm−BとSm−B′ポリペプチドの少な
くともひとつとSm−Dポリペプチドをクローニングし
、Sm−BとSm−B′ポリペプチドのクローニングし
たものとクローニングしたSm−Dポリペプチドを生物
の血清試料と反応させるために調製する、上記各ステッ
プを有することを特徴とする方法。 30、特許請求の範囲第29項において、Sm snR
NPタンパク質を分離し、snRNPタンパク質の中か
らSm−BとSm−B′ポリペプチドの少なくともひと
つとSm−Dポリペプチドを単離し、Sm−BとSm−
B′ポリペプチド単離したもののアミノ酸配列に基づい
て、Sm−BとSm−B′ポリペプチドの少なくともひ
とつをコード化するDNA配列をクローニングし、単離
したSm−Dポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、
Sm−Dポリペプチドをコード化するDNA配列をクロ
ーニングする、上記各ステップを有することを特徴とす
る方法。 31、特許請求の範囲第29項において、Sm−BとS
m−B′ポリペプチドの分子量はそれぞれ約26,00
0と27,000であり、Sm−Dポリペプチドの分子
量は約13,000であることを特徴とする方法。 32、特許請求の範囲第29項において、Sm−BとS
m−B′ポリペプチドの少なくともひとつはアミノ末端
にval gly lys ser ser lys
metleu gln his ile asp ty
r arg met arg cys ileleu
gln aspという配列を持ち、Sm−Dポリペプチ
ドはアミノ末端にmet lys leu val a
rgphe leu met lys leu ser
という配列を持つことを特徴とする方法。 33、生物がSLEに冒されているか否かを試験する方
法において、Sm−BとSm−B′ポリペプチドの少な
くともひとつとSm−Dポリペプチドをコード化するc
DNAをクローニングし、cDNAからSm−BとSm
−B′ポリペプチドの少なくともひとつとSm−Dポリ
ペプチドを単離し、単離したSm−BとSm−B′ポリ
ペプチドとSm−Dポリペプチドの混合物をマイクロタ
イタープレート上の表面に吸着させ、露出した表面をブ
ロックし、生物の血清試料とマイクロタイタープレート
上において、Sm−BとSm−B′ポリペプチドのブロ
ックしたものとSm−Dポリペプチドのブロックしたも
のを反応させ、この反応で形成される抗原−抗体複合体
を検出する、上記各ステップを有することを特徴とする
方法。 34、特許請求の範囲第33項において、抗原−抗体複
合体の形成は、標識酵素が共有結合した抗ヒトIgG/
IgM抗体によって検出することを特徴とする方法。 35、特許請求の範囲第33項において、マイクロタイ
タープレート上のSm−BとSm−B′ポリペプチドの
少なくともひとつとSm−Dポリペプチドの混合物の露
出した表面は高濃度の反応性のないタンパク質溶液でブ
ロックすることを特徴とする方法。 36、特許請求の範囲第34項において、Sm−BとS
m−B′ポリペプチドの少なくともひとつとSm−Dポ
リペプチドはcDNAを発現させ、イムノアフィニティ
ークロマトグラフィーを行って分離させ、マイクロタイ
タープレート上のSm−BとSm−B′ポリペプチドの
少なくともひとつとSm−Dポリペプチドの混合物を露
出した表面を高濃度の反応性のないタンパク質溶液でブ
ロックすることを特徴とする方法。 37、特許請求の範囲第36項において、抗原−抗体複
合体の形成を特殊な発色によって示す検査に用いられる
標識酵素はラクトペルオキシダーゼ/アルカリホスファ
ターゼであることを特徴とする方法。 38、生物がSLEに冒されているか否かを検出するた
めの組成物において、SLEに冒されている生物の抗体
と反応するSm−BとSm−B′抗原の少なくともひと
つとSm−D抗原の混合物、Sm−BとSm−B′抗原
の少なくともひとつとSm−D抗原の混合物と生物の血
清試料を混合した時に形成される抗原−抗体複合体に反
応するもうひとつの後から加える抗体、形成された抗原
−抗体複合体に後から加えた抗体が結合した時に、適当
な基質を加えると、特別な発色を起こす後から加える抗
体に結合させた酵素を、有することを特徴とする組成物
。 39、特許請求の範囲第38項において、後から加える
抗体は、抗ヒトIgG/IgM抗体であり、酵素は後か
ら加える抗体に共有結合していることを特徴とする組成
物。 40、特許請求の範囲第39項において、酵素はラクト
ペルオキシダーゼとアルカリホスファターゼのうち少な
くとも一方から成ることを特徴とする組成物。
Applications Claiming Priority (2)
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---|---|---|---|
US9715987A | 1987-09-15 | 1987-09-15 | |
US97,159 | 1987-09-15 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01147369A true JPH01147369A (ja) | 1989-06-09 |
Family
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63230238A Pending JPH01147369A (ja) | 1987-09-15 | 1988-09-16 | Sm−B/B’抗原、Sm−B/B’抗源のクローニングとSm−B/B’抗源もしくはSm−B/B’抗源とSm−D抗源の混合物を使用した全身性紅斑性狼瘡の検出 |
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Country | Link |
---|---|
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JP (1) | JPH01147369A (ja) |
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GR (1) | GR3007317T3 (ja) |
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---|---|---|---|---|
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US5681700A (en) * | 1994-05-25 | 1997-10-28 | Oklahoma Medical Research Foundation | Assay for pathogenicity of anti-DNA antibodies |
EP0776906A3 (de) * | 1995-10-19 | 1998-02-25 | Imtec Immundiagnostika Gmbh | Peptide des Antigens Sm-D und ihre Verwendung, insbesondere für die Diagnostik des SLE |
CN101256168B (zh) * | 2008-04-22 | 2012-01-25 | 内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司 | 一种牛乳中乳过氧化物酶含量的检测方法 |
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---|---|---|---|---|
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- 1988-09-13 DE DE8888114945T patent/DE3879055T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1988-09-13 ES ES88114945T patent/ES2053659T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-13 AT AT88114945T patent/ATE86747T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-09-16 JP JP63230238A patent/JPH01147369A/ja active Pending
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1993
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