JPH01147369A - Ｓｍ−Ｂ／Ｂ’抗原、Ｓｍ−Ｂ／Ｂ’抗源のクローニングとＳｍ−Ｂ／Ｂ’抗源もしくはＳｍ−Ｂ／Ｂ’抗源とＳｍ−Ｄ抗源の混合物を使用した全身性紅斑性狼瘡の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は生物が全身性紅斑性根１ｍ（ＳＬＥ）であるか
否か人の血清試料をテストする方法に関するものであり
、更に詳細には、患者の血清がＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ
−Ｂ’と反応するか否かを調べて、ＳＬＥであるかをテ
ストする方法に関するものであ゛る６本発明はさらにＳ
ｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｅ′ポリペプチドのｃＤＮＡを
単離しクローニングする方法に関するものである。この
方法はまたＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ’抗原とＳｍ−
Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ’抗原とＳＬＥに冒されている人
の抗体との反応が起ったことを示す物質との組み合わせ
ないしは組成物に関するものである。さらにＳｍ−Ｄと
Ｓｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ’ポリペプチドの混合物を
上記の目的に用いることに関係している。

〔従来技術１ 自己免疫疾患では、生体の免疫系は自分自身の細胞内の
構成物と反応する抗体を産生ずる。その結果、抗原一抗
体複合体は種々の病理症状をもたらす。いくつかのリウ
マチ性疾患は自己免疫疾患である。そのようなリウマチ
性疾患のひとつにＳＬＥがある。

細胞核に対する抗体は自己免疫疾患の証明である。その
抗体は生体で、細胞核内の構成物に反応するので、核に
対する抗体となる。このような抗体の測定を基礎とする
検査は種々のリウマチ性疾患の診断のために臨床研究室
ではよく確立されている。（１，２）。これらの検査は
一般的に、これらの抗体に対する抗原として精製された
抗原を用いていない。従ってこれらの検査は比較的粗雑
である。細胞の抽出物が通常抗原として使われていると
いうことは、内部標準となる明確な基準がないというこ
とになる。これらの自己免疫疾患の標的となる抗原の分
子的な性質（分子構成）が比較的複雑であるため、問題
はさらに複雑になっている。

近年、当業者等によって、自己免疫抗体の標的抗原の分
子的性質が解明されはじめ、特にそれらを構築している
大きな構成物に関係する複雑さが認識されはじめた。そ
の大きな構成物は、ＲＮＡとタンパク質の複合体（リボ
ヌクレオプロティン：　ＲＮＰ）あるいはＤＮＡとタン
パク質の複合体（デオキシリボヌクレオプロティン：　
ＤＮＰ）である。また彼らは、生体の細胞内でこれらの
抗体が機能している役割についての謎も解き始めている
。（３）。このような情報が得られた結果、検査結果が
明確な大量の抗原試薬の開発やこれらの試薬を使って鋭
敏で定量的な臨床検査法を開発する可能性が出てきた。

リウマチ性疾患のような自己免疫疾患での抗体を検出す
る抗原として、比較的単純なポリペプチドやタンパク質
を単離する試みがなされてきた。

これらのポリペプチドやタンパク質は単純な抗原である
が、それらは実際にはずっと複雑な細胞内構造の一部で
ある６その結果、そのような抗体と反応するポリペプチ
ドやタンパク質を単離することは困難であった。また同
じように、このような抗原を使ってリウマチ性疾患のよ
うな自己免疫疾患の抗体を検出する分析方法を開発する
ことも困難であった。

ＳＬＥと呼ばれるリウマチ性疾患のための明確で豊富な
抗原を開発することは特に難しかった。

なぜならば、ＳＬＥの抗原（Ｓｍと呼ばれている）が、
ｓ　ｎ　ＲＮ　Ｐ　（ｓｍａｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｒ
ｉｂｏｎｕｃｌｅ。

ｐｒｏｔｅｊｎｓ）と呼ばれる保存されたタンパク質と
関りあっているからである。（４）。Ｓｍ抗原となって
いるＳｍ　　ｓｎＲＮＰは５ｆｆｆｉ類のＵｓｎＲＮＡ
（Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、ｔＪ６）と少なくとも１１
のポリペプチドを含んでいる。ＵｓｎＲＮＡはウリジン
に富んでいる。

本発明者らならびに当業者等はＳｍ　　ｓｎＲＮＰを固
定した。（５−８）。本発明者らは、最近ＳＬＥに関っ
ているＳｍ−Ｄポリペプチド抗原を単離した。Ｓｍ−Ｄ
ポリペプチドの分子量はおよそ１３，０００である０本
発明者らは最近このような抗原を用いて患者がＳＬＥに
冒されているか否かを患者の血清試料をテストする簡単
で有効な比色検査法を特許申請した。上に述べた全ての
ことは、ｒＳｍ−Ｄ抗原、Ｓｍ−Ｄ抗原のクローニング
とＳｍ−Ｄ抗原を使ったＳＬＥの検出」という名称で１
９８７年６月１９日米国特許庁に出願した出願番号第０
６２８０２号の中に開示されており、その出願は本願出
願人に譲渡されている。

本発明は以上の点に鑑みなされたものであって、上述し
た如き従来技術の欠点を解消し、Ｓｍ−Ｂ及び／又はＳ
ｍ−Ｂ’ポリペプチド抗原の少なくともひとつをコード
化するｃＤＮＡを単離することである。Ｓｍ−Ｂ及び／
又はＳｍ−Ｂ′ポリペプチド抗原の分子量はそれぞれ約
２６．０００と２７．０００である。（５−８）、本発
明の別の目的とするところは生物がＳＬＥに冒されてい
るかをそのような抗原と人の血清試料を使って調べる簡
単で有効な比色分析物を提供することである。本発明の
更に別の目的とするところは、Ｓｍ−ＤとＳｍ−Ｂ及び
／又はＳｍ−Ｂ′ポリペプチド混合物を使った簡単で有
効な比色分析法及び分析物を提供することである。

〔構成１ 本発明の１実施例においては、ＳＬＥに冒されている患
者の血清試料から得た抗体を使って、イムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより、ｓｎＲＮＰタンパク質
を分離する。次にＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ′ポリペ
プチドをゲル電気泳動により単離し電気的に溶出する６
それからＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ′ポリペプチドの
アミノ末端からアミノ酸配列を決定し、そのアミノ酸を
コード化する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ標識さ
れたＤＮＡプローブを合成する。んクローニングベクタ
ーのヒトｃ　Ｄ　Ｎ’Ａライブラリーをニトロセルロー
スフィルターのような適当なフィルターに移す。これら
のフィルターを標識されたプローブとハイブリダイズさ
せ、プローブの配列と合う配列を持つｃＤＮＡクローン
を固定する。

Ｓ　ｍ　−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ’タンパク質をコード
化するｃＤＮＡをサブクローニングする。

それかＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ′ポリペプチドをイ
ムノアフィニティークロマトグラフィーと、さらに必要
ならばＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により
単離する。検査では単離したＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−
Ｂ′ポリペプチドを用い生物の血清試料とＳｍ−Ｂ及び
／又はＳｍ−Ｂ′ポリペプチドとの反応により生物がＳ
ＬＥに冒されているかどうかを決定する。その検査は、
単離したＳ　ｍ　−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ′ポリペプチ
ドと単離したＳｍ−Ｄポリペプチド（上記のように単離
した）の混合物で行うこともできる。

検査は標識酵素と共有結合した抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭな
どを使ったＥＬＩＳＡ法によって行うことができる。ラ
クトペルオキシダーゼ、アルカリホスファクーゼは、特
別な発色によって病気にかかっていることを示す標識酵
素の一例である。

［実施例］ Ｓｍ　　ｓｎＲＮＰの　両 本発明の１実施例において、Ｓｍ　　ｓｎＲＮＰをイム
ノアフィニティークロマトグラフィーによって分離した
。そのプロセスの最初のステップでは、ＳＬＥに冒され
た患者の血漿成分を調製し、ヒト抗Ｓｍ抗体を得た。免
疫グロブリンＧ（Ｉ　ｇＧ）を半飽和硫安塩析による分
画とＤＥＡＥ−８６ｐｈａｃｅ　１カラムを通過させる
ことにより精製した。精製したＩｇＧを５ｅｐｈａｒ。

５ｅＣＬ−４Ｂにカルボニル−ジイミダゾール法によっ
て結合させた。（１０）。

細胞抽出液は、浮遊培養したヒト細胞株ＨｅＬａ細胞を
０．３５Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１、ｐ
Ｈ７，４，１，５ｍＭＭｇＣＩ２．０．２ｍＭｐｈｅｎ
ｙ１ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆ。

ｎｙｌ　　ｆｌｕｏｒｉｄｅ中で全細胞を超音波破壊す
ることにより調製した。（８）。細胞抽出液を調製して
ただちに前項で述べた方法で作製した抗Ｓｍイムノアフ
ィニティーカラムにかけた。カラムを抽出用緩衝液で洗
った後、Ｏ，１ＭＮａｃ１．６ＭＬＩｒｅａ、０．２ｍ
Ｍｐｈｅｎｙ１ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　　ｆｌ
ｕｃｒｉｄｅを含む１０ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣ１、ｐ
Ｈ７，４で溶出した。低タンパク質濃度でも、Ｓｍｓｎ
ＲＮＰの沈殿ができるように溶出液にキャリアＲＮＡ（
２０μｇ／ｍｌ）を加えた。Ｓｍ　　ｓｎＲＮＰは、２
容量のエタノールを加えて一２０℃で一晩沈殿させた。

イムノアフィニティーカラムの溶出物の全タンパク質構
成物（特長のあるＳｍ　　ｓｎＲＮＰの様相を含んでい
る）を５ＤＳ−ゲル電気泳動し、クマシーブリリアント
ブルーの染色により調べた。

（１１）、抗原ポリペプチドをニトロセルロース膜に移
し、イムノプロット法で検出した。　　（１２，１３）
、このようにして、直接生化学的解析に十分な純度のＳ
ｍ抗原が大量に精製された。この方法は、Ｓｍ　　ｓｎ
ＲＮＰがタンパク質分解酵素や核酸分解酵素にさらされ
ることが最も少なかった。（９）。

一且ヱ（７）　Ｓ　ｍ　　ｓ　ｎ　ＲＮかポリペプチド
の　肖本発明者らは、クロマトグラフィーの操作によっ
てＳｍ　　ｓｎＲＮＰ粒子を容易に分離することができ
たが、クロマトグラフィーによってＳｍ　　ｓｎＲＮＰ
粒子を明確に分画することはできなかった。そのかわり
本発明者らはＳｍ　　ｓｎＲＮＰ粒子を５ＤＳ−ゲル電
気泳動と電気的溶出により分画した１本発明者らがこれ
を遂行するのに使用したプロトコール（と装置）はＨｕ
ｎｋａｐｉｌｌｅｒら（１４）がマイクログラム量のタ
ンパク質を分離するのに使ったものである。このプロト
コールは本発明者らの目的に理想的であった。なぜなら
ば、それぞれのポリペプチドのバンドについて、大きな
アクリルアミドのかたまり（１０−１１ｃｍ巾／１．５
ｍｍ厚）から少量のタンパク質（１０−２０ＬＬｇ）を
少量の容積（３００−５００μｌ）中に溶出できるから
である。

Ｈｕｎｋａｐｉ　１ｌｅｒらのプロトコールから本発明
者らが唯一改変した点はゲルからそれぞれのバンドを切
り出す前の染色の条件である。この変更は、注目してい
るいくつかのペプチドが長い（２０Ｃｍ）ゲルを使った
時でさえ、非常に近接しているためになされた。これら
のペプチドを２時間の通常の脱色の後に、はっきり区別
するためクマシーブルー濃度をもとのＨｕｎｋａｐｉ　
ｌ　ｌｅｒらのプロトコールから、０．０５％に下げた
。

それぞれのペプチドのバンドを電気的に溶出した後それ
ぞれのバンドを５ＤＳ−ゲル電気泳動（１１）にかけ、
銀染色によりその均一性を検定し、プロッティング法に
より、抗体との反応性を検定した。（１２，１３）。

タンパク　のアミノ　　５１の゛ 本発明者らは、Ｓｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ′ポリペプ
チドのアミノ酸配列の決定にピコモル程度の量のタンパ
ク質しか必要でない気相法の方式を用いた。（１５，１
６）、配列の決定はミズーリー州セントルイスのワシン
トン大学タンパク質化学研究室で行った。本発明者らは
Ｓｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ′ポリペプチドのアミノ末
端からそれぞれ１９と２０残基の配列を得た。その配列
は以下に示す通りであった。

ｖａｌ　ｇｌｙ　ｌｙｓ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　　ｌｙｓ　
ｍｅｔ　ｌｅｕ　ｇｉｎ　ｈｉｓ　　Ｌｉｅａｓｐ　　
ｔｙｒ　ａｒｇ　ｍｅｔ　ａｒｇ　ｃｙｓ　　ｉｌｅ　
ｌｅｕ　ｇｉｎ　ａｓｐ本発明者らは２つの２３塩基長
のＤＮＡプローブと１つの５４塩基長のプローブをＳｍ
−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ′タンパク質をコード化するｃ
ＤＮＡをクローニングするために合成した。　（ＡＢＩ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、　Ｔｈｅ　Ａｇｏｕｒｏｎ　
Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｌ　、これらのプローブはＳｍ−Ｂ
及び／又はＳｍ−Ｂ’ポリペプチドのアミノ酸配列から
導かれる塩基組成で合成された。これらのプローブをＢ
１．Ｂ３、Ｂ４プローブと名付けた。プローブを放射性
リン（”Ｐ）で標識した。

Ｂ１．Ｂ３、Ｂ４プローブは次のように作られた。

獣　　１−（ｊ　　　　　Ｉ−−− 一　　　←　　　　　　　　＜＜＜ Ｑ　　［−（ｊ　　　＜　Ｃ５（：口 ′Ａ　　＜　　　　　　白　　　　目　　　　　　　　
目上　　陣　＜　０　　冒０　　ゴ＋０　　　　−一　
　　　　く　　　　　　　　　　　トー　　　　　　　
　トー　　　　　　　　　　　　　　　トーのトー（シ ー　　　　　く　　　　　　　　　　　トー　　　　　
　　　←　　　　　　　　　　　　　　　←−、ｅｕＵ
フ（コ（コ ５　　３　Ｃ：５　　　　　Ｉ：ＣＪ　　　［：ｌ：　
Ｌ）　　　　　　　８屈　巳、　　　冒″−）　　て←
００　冒（り［ｊヒフ ■←− 巨　　　＜　　　　　　　　　［−１−）−ヵ　畷　　
　　日°　に°　　　　＃ トー ω　Ｈ＜　　　　　　　　　　ロ Ｌ−ｚ＜コ （１）トー＜−ｆ： カ　　斯　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　くト一 ＞≧＝（コ −Ｉ　　　　ｌｊ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ＱｅｉｏＬ）（コ 完　　言　　　　　　　　　　　　　　　　　　　イ〉
（コＱ これは第１図にも示しである。上記の配列中で”　Ｎ　
”はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの４つの塩基のいずれかを示す。”
　Ｉ　”はＣ以外の３つの塩基の代用であり、デオキシ
イノシンに相当する。上記の配列中にシスティン残基が
見られる。このことは、のちの実験で確かめられた。し
かし実際にはＢ１、Ｂ２（Ｂ３の誤植と思われる）、Ｂ
４プローブを使った週はこのアミノ酸残基はリジンであ
ると考えられた。

示したように８１プローブは最も不確かなコドンの３番
目の塩基の位置にデオキシイノシンを使用するように設
計された。（１７）。従って、Ｂｌプローブは６４種の
オリゴヌクレオチドの３昆合物として作られている。Ｂ
３プローブでは縮重しているコドンの３番目の位置に４
つの塩基が含まれている。さらにコドンの使用頻度に基
づいて（１８）、本発明者らはロイシンのコドンの１番
目の位置をシトシンのみとした。その結果、Ｂ３プロー
ブの分子種の数は１９２に減少した。Ｂ４プローブとし
てヒトのコドンの使用頻度に基づいて、Ｓｍ−Ｂ／Ｂ’
ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する５４塩基長の一
種類のプローブを作った。

ｂ　ライブラリーのスクリーニング ｃＤＮＡとしてはＣｌｏｎｅｔｅｃｋ社（Ｐａ１ｏ　　
Ａｌｔｏ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）のヒトＢリンパ球細
胞ｐｏｌｙ−ＲＮＡ由来のんｇｔｌＯベクターを用いた
ｃＤＮＡライブラリーをイ吏用した。およそ２５．００
０の独立した組み換え体プラークを大腸菌Ｙ１０９０上
にまき、ニトロセルロースフィルター上に移した。（１
９）。これらのフィルターを［３２Ｐ］で標識されたＢ
１プローブとハイブリダイズさせ、スクリーニングした
。

第一回目のスクリーニングで、［”ＰＩで標識されたＢ
ｌプローブとハイブリダイズする１９個のプラークを固
定した。さらに約２５．０００個の独立した組み換え体
プラークをＢ３プローブでスクリーニングした。このス
クリーニングで［３２ｐ］でｔ稟議されたＢ３プローブ
とハイブリダイズする１６個のプラークを固定した。

Ｂ１プローブでスクリーニングされた９個の最もシグナ
ルの強いクローンとＢ３プローブでスクリーニングされ
た１６個のクローンについては、Ｂ３プローブによりさ
らに２回プラークの純化を行った。２度のハイブリグイ
ゼーション後、２４個の純化されたクローンが得られた
。これらの２４個のクローンをさらにＢ４プローブによ
って、低塩濃度、高温の条件でスクリーニングした。こ
の最後のスクリーニングによって、［”ＰＩで標識され
たＢ４プローブとハイブリダイズする７個の組み換え体
クローンを固定した。

Ｃサブクローニングと塩基配り１の゛定Ｂ３プローブで
選別した２４個の陽性クローンのＤＮＡを調製し、（１
９）制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。消化の後ベクター
に挿入されたｃＤＮＡの長さを決定した。挿入された断
片（インサート）は、とある範囲の塩基長を持つ６つの
グループに分類された。これらのグループは、０．８０
Ｋｂから２．ＯＫｂの範囲の中にあった。Ｂ４プローブ
で陽性であった７個のクローンのうち６個は、１．３−
１．４Ｋｂの長さのグループに属した。λＢ４１９−２
はＥｃｏＲＩで切り出された１、ＩＫｂのインサートｃ
ＤＮＡを持っていた。λＢ５−１、λＢ２２−２、λＢ
４Ｏ７−１、んＢ４１９−２、λＢ４４３−２のＥｃｏ
ＲＩで切り出されるｃＤＮＡ挿入部分を一般的なベクタ
ーＭ１３ｍｐ１８中にサブクローニングした。（２０）
。えＢ４Ｏ９−２と８４４５−２クローンのｃＤＮＡの
ＥｃｏＲＩ断片を一般的なベクター１）ＵＣｌ３中にサ
ブクローニングした。

（２１）、ｃＤＮＡ挿入部分の塩基配列をジデオキシ法
を用いて決定した。（２２）。７個のクローン全てから
得られたＤＮＡの配列はＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ’
ポリペプチドの知られている２０個のアミノ酸のコドン
の構成と完全に一致した。

Ｓｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ’タンパク質の発現は大腸
菌内で行った。この系を選んだ理由には次の２つがある
６　（Ｉ）このバクテリアは生理学的、遺伝学的、分子
生物学的に最もよく研究され、理解されている。（２）
多くのｆｉ　ａＪＩの便利な発現ベクターがすでに開発
されている。（２３−２６）。これらのベクターは、バ
クテリア中で高率の転写とｖＩ＋訳が可能であるため、
クローン化した遺伝子の産物が高いレベルで合成できる
。

クローン化した遺伝子産物によるバクテリアの増殖の阻
害を防ぐため、条件によって活性化できる誘導可能な転
写プロモーターを使ってクローン化した遺伝子を発現さ
せる。たとえばプラスミドｐ　Ｉ　Ｎ−１１１（２３）
やｐＫＫ２３３−２　（２４）はそれぞれ−し」ユｑや
ｔａ旦ジブロモクーを含んでいるにれらは両方とも培養
液中に１ｓｏｐｒ。

１）３’ｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａ
ｎｏｓｉｄｅ　（ＩＰＴＧ）を加えることにより誘導で
きる。プラスミドｐＡＳＩ　（２５）は保温温度を３０
°Ｃか６４２℃に変化させることにより活性化しつるん
ｐＬプロモーターを持っている。

他のシステム（２６）は２つのプラスミドを使って行わ
れる。ひとつのプラスミドｐａｐ　１−２は、Ｔ７ＲＮ
ＡポリメラーゼがえｐＬプロモーターの支配下にコード
されている。調べたい（発現させたい）遺伝子は別のプ
ラスミドｐＴ７−３中にφ１ＯＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
プロモーターの支配下にクローン化されている。

第一段階として、Ｓｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ′タンパ
ク質をコード化するｃＤＮＡクローンを上に挙げた全て
のベクター中にクローニングした。次にＳｍ−Ｂ及び／
又はＳｍ−Ｂ′タンパク質の発現に最適な条件となるよ
うに転写の誘導の前後の培養条件を決定した。クローン
化したＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ′ポリペプチドの発
現量は新たに合成されたタンパク質を［”Ｓ］−メチオ
ニンで標識し、継時的にサンプリングして５ＤＳ−ゲル
電気泳動にかけ、オートラジオグラフィーを行うことに
より測定できる。

Ｓｍ　　　の　折物 患者などの抗体の反応性を調べる直接的な分析物も使用
できる。直接的な分析物の大きな問題点は一般にそのよ
うな分析には比較的大量の抗原が必要とされることであ
る。はとんど単一に精製された抗原を使用することが望
ましい場合には特に問題となる。

２つ前のパラグラフですでに述べた方法で大量の抗原を
調製することが可能である。たとえばＳｍ−Ｂ及び／又
はＳｍ−Ｂ’抗原はｒＳｍ　　ｓｎＲＮＰの分離」とい
うセクションで述べたようにイムノアフィニティークロ
マトグラフィーによって精製し得る。このようなイムノ
アフィニティークロマトグラフィーでは、ヒトのポリク
ローン血清が使用できる。もしくはＳｍ−Ｂ及び／又は
Ｓｍ−Ｂ’のバンドに特異的なウサギのポリクローン抗
体が使用できる。もしこれが望ましいと考えられるなら
ば、抗原のクロマトグラフィーは最後の精製のステップ
としてもよい。

ＥＬＩＳＡ分析物（２７）はより望ましい分析物である
。精製したＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ′ポリペプチド
をマイクロタイタープレートの表面に吸着させる。露出
したマイクロタイタープレートの表面は高濃度の反応性
のないタンパク質溶液（ウシ血清アルブミンなど）でブ
ロックする。（２８ａ）−血清試薬を直接Ｓｍ−Ｂ／Ｂ
’抗原と反応するか試験する６ Ｓｍ−Ｂ／Ｂ’抗原と血清試薬の反応によってできた抗
原一抗体複合体はラクトペルオキシダーゼ／アルカリホ
スファターゼのような酵素が共有結合した抗ヒトＩｇＧ
／ＩｇＭ抗体によって検出する。標識となる酵素の結合
量は比色検査によって示される。さらにマイクロタイタ
ープレートは自動プレートリーダーによって測定できる
。バックグランドの測定は反応性のない病気にかかって
いない人の血清を使用して陰性反応とし、反応性のある
既知のヒト抗Ｓｍ抗体（２９）やウサギ抗Ｓｍ−Ｂ及び
／又はＳｍ−Ｂ′抗体（２８ｂ）を使用して陽性反応す
ることで測定できる。

ＳＬＥの検査のためにＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ′抗
原のみを使用するかわりに、Ｓｍ−Ｄ抗原とＳｍ−Ｂ及
び／又はＳｍ−Ｂ’抗原の混合物もしくは、Ｓｍ−Ｄ抗
原とＳｍ−Ｂ抗原かＳｍ−Ｂ′抗原のどちらかのみとの
混合物を使用することも可能である。Ｓｍ−Ｄ抗原をＳ
ｍＢ抗原がＳｍ−Ｂ′抗原の両方もしくは片方と混合し
て使用する場合は、マウス抗Ｓｍ−Ｄモノクローン抗体
とウサギ抗Ｓｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ′抗体とを混合
して使用し、陽性反応とすることができる。もしくはＳ
ｍ−Ｂ抗原かＳｍ−Ｂ抗原をマウス抗Ｓｍ−Ｄモノクロ
ーン抗体がウサギ抗Ｓｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ’抗体
のどちらがと個別に混合して用い、陽性反応とすること
もできる。

現在米国特許庁に係属中の特許出願第０６４８０２号の
出願の中で開示されている通り、Ｓｍ−Ｄポリペプチド
はＤｌとＤ２プローブを用いて次に述べるようにして単
離した。

ｍｅｔ　ｌｙｓ　ｌｅｕ　ｖａｔ　ａｒｇ　ｐｈｅ　ｌ
ｅｕ　ｍｅｔ　１ｙｓＣＣＣＣＣＡ（： ＧＧＧ　　　Ｇ えｇｔｌｏベクターを用いたｃＤＮＡライブラリーをＤ
ｌとＤ２プローブを用いてスクリーニングした。スクリ
ーニングは、大筋では上に述べたように、そして特別に
第０６４８０２号の出願の中で述べたようにして行われ
た。そのようにして選別されたＤＮＡをサブクローニン
グし、塩基配列も第０６４８０２号に述べた通りに行っ
た０組み換え体Ｓｍ−Ｄタンパク質は大筋においては、
上に述べたようにまた特別に第０６４８０２号に述べた
ように発現させた。

主なＳｍ抗原はり、Ｂ、Ｂ’ポリペプチドと関係してい
る。イムノプロットと呼ばれる手法で、特に抗Ｓｍの反
応性について調べた３つの参考文献を下に引用した。（
３０−３２）、最も通常のパターンは、この３つの全て
のポリペプチドを認識するパターンである。さらに、あ
るひとつのマウスのモノクローン抗体がこの３つの全て
のポリペプチドを認識することから、この３者は少なく
ともひとつのエピトープを共通に持っていることが知ら
れている。（３３）、１．がし同時に、特異的な抗原決
定基も存在する。引用した３つの調査（３０−３２）で
は、およそ８％のヒト抗血清がＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ
−Ｂ′ポリペプチドのみを認識する。恐らくまれにＳｍ
−Ｄポリペプチドのみを認識する血清も存在するであろ
う、たとえば、Ｓｍ−Ｄポリペプチドのみを認識するマ
ウスモノクローン抗体が単離されている。

この分野の研究者は今までＳｍ−Ｄ抗原について強調す
る傾向があった。抗Ｓｍ検査に使う組織の臨床材料は、
非常に多くの場合ウサギ胸腺から調製されたＥＮＡと呼
ばれる抽出物である。ＥＮＡが調製される古い方法では
、全てではないがほとんどのＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−
Ｂ′ポリペプチドが失われていることが示された。（３
５）。

従って、多くの臨床検査で抗Ｓｍの反応性は、Ｓｍ−Ｄ
ポリペプチドに対するものだけであると結論された。さ
らに引用文献３１で結論されているように［抗り抗体は
、抗−（ＩＩ）ＲＮＰの血清には見い出されないことか
ら、抗り抗体の存在は、抗Ｓｍ血清に、より特徴的なこ
とであるらしい。」別な表現をすれば、抗Ｓｍ−Ｂ及び
／又はＳｍ−Ｂ’抗体は、ひとつ以上の表現型と関係し
ている。

３つの抗原（Ｓｍ−ＤＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ　′
）が全て重要であることが明らかになった。Ｓｍ−Ｄ抗
原が３者の中で最も重要ではあるが、Ｓｍ−Ｂ及び／又
はＳｍ−Ｂ’抗原も重要な貢献をしていることが明らか
になってきた。このことにより３つの抗原を使用する方
が個々の抗原を使用するより少なくともある特定の場合
には望ましいことが明らかになった。

上記の方法には、重要な利点がある。これによって、Ｓ
ＬＥの検定をするＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ′抗原の
クローニングを行うことができる。また人がＳＬＥにか
かっているかを検定するための血清試料と反応させる抗
原を供給する６ＳＬＥの抗体がＳｍ−Ｂ及び／又はＳｍ
−Ｂ′抗原（もしくはＳｍ−ＤとＳｍ−Ｂ及び／又はＳ
ｍ−Ｂ′の混合物）と反応し、抗原一抗体複合体が形成
された場合には、酵素の結合した別の抗体を導入するこ
とにより、特別な発色反応を示すことができる。酵素の
結合した別の抗体は抗原一抗体複合体と反応し、酵素の
活性を比色検査により検出することができる。この特別
な色によ、す、検査された人がＳＬＥにかかっているこ
とを検出することができる。

上記の方法は、他の重要な利点をも持っている。抗原は
、Ｓｍ−Ｄポリペプチドや多くの妨害をするポリペプチ
ドやタンパク質の含まれた複合体ではなく、Ｓｍ−Ｂ及
び／又はＳｍ−Ｂ’ポリペプチドのみ（もしくはＳｍ−
Ｄ抗原との混合物）であるため、Ｓｍ−Ｂ及び／又はＳ
ｍ−Ｂ′ポリペプチド（もしくはＳｍ−Ｂ及び／又はＳ
ｍ−Ｂ′とＳｍ−Ｄポリペプチドの混合物）とＳＬＥ抗
体の反応は、以前の技術による複雑な抗原と抗体の反応
よりも、特異的で感度もよいにのことにより、本発明者
らの検出方法は、以前の複雑な抗原に基づいた試験より
も明確で確実なものとなった。

以上、本発明の具体的実施の態様について詳細ｔこ説明
したが１本発明はこれら具体例にのみ限定されるべきも
のではな（、本発明の技術的範囲を逸脱することなしに
種々の変形が可能であることは勿論である６

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｓｍ−Ｂ及び／又はＳｍ−Ｂ’ポリペプチド
のアミノ末端のアミノ酸の配列と番号を示しており、さ
らにそのアミノ酸配列をコード化するｃＤＮＡとハイブ
リダイズさせるために合成されたプローブをした説明図
、 第２図は、Ｓｍ−Ｄポリペプチドのアミノ末端のアミノ
酸配列と番号を示しており、さらにそのアミノ酸配列を
コード化するｃＤＮＡとハイブリダイズさせるために合
成されたプローブを示した説明図である。 跨許Ｊ：＠ス、　　　シ゛′　ア２°ｉり／　インステ
イ＋ニー１〜ン 一　　　ヘ ロ　　　　ロ ーいい ＦＩＧ、　　／ ｖａ工ｇｌｙ　ｌｙｓ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　ｌｙｓ　ｍｅ
ｔ　ｌｅｕ　ｇｌｎ　ｈｉｓ３’　　ＣＡＣＣＣＧ　Ｔ
ＡＣＡＧＧ　ＧＴＣＴＴＣＴＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＬ
ｌｅ　ａｓｐ　ｔｙｒ　ａｒｇ　ｍｅｔ　ａｒｇ　ｃｙ
ｓ　ｉｌｅ　ｌｅｕ　ｇｌｎ　ａｓｐＧ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物がＳＬＥに冒されているか否かを検出する方法
   において、Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドのうち少
   なくともひとつと抗体を含む生物の血清試料とを反応さ
   せ、前記Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドのうち少な
   くともひとつと血清試料中の抗体との反応性により生物
   がＳＬＥに冒されているか否かを決定する、各ステップ
   を有することを特徴とする方法。 ２、特許請求の範囲第１項において、Ｓｍ−ＢとＳｍ−
   Ｂ′ポリペプチドの分子量はそれぞれ約２６，０００と
   ２７，０００であることを特徴とする方法。 ３、特許請求の範囲第２項において、前記Ｓｍ−ＢとＳ
   ｍ−Ｂ′ポリペプチドのうち少なくともひとつと生物の
   血清試料中の抗体との反応性は、反応生成物と標識酵素
   を共有結合させた抗ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体とを反応させる
   ことによって検出することを特徴とする方法。 ４、特許請求の範囲第１項において、Ｓｍ−ＢとＳｍ−
   Ｂ′ポリペプチドはｖａｌ　ｇｌｙ　ｌｙｓ　ｓｅｒｓ
   ｅｒ　ｌｙｓ　ｍｅｔ　ｌｅｕ　ｇｌｎ　ｈｉｓ　ｉｌ
   ｅ　ａｓｐ　ｔｙｒ　ａｒｇ　ｍｅｔａｒｇ　ｃｙｓ　
   ｉｌｅ　ｌｅｕ　ｇｌｎ　ａｓｐというアミノ酸配列を
   持っていることを特徴とする方法。 ５、生物がＳＬＥに冒されているか否かを検出する方法
   において、ＳＬＥに冒されている生物の血清試料から得
   た抗体をｓｎＲＮＰを分離するために使用し、ｓｎＲＮ
   Ｐのタンパク質から分子量約２６，０００と２７，００
   ０のポリペプチドを単離し、分子量約２６，０００と２
   ７，０００のポリペプチドの少なくともひとつをクロー
   ニングし、組み換え体ポリペプチドの少なくともひとつ
   を生物の血清試料と反応させ、クローン化したポリペプ
   チドの少なくともひとつと生物の血清試料との反応性に
   よって生物がＳＬＥであるか否かを決定する、上記各ス
   テップを有することを特徴とする方法。 ６、特許請求の範囲第５項において、クローン化したポ
   リペプチドの少なくともひとつと血清試料との反応性は
   反応生成物に標識酵素を共有結合させた抗ＩｇＧ／Ｉｇ
   Ｍ抗体を加えることにより決定することを特徴とする方
   法。 ７、特許請求の範囲第５項において、少なくとも単離し
   たポリペプチドのひとつは、Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリ
   ペプチドのひとつであることを特徴とする方法。 ８、特許請求の範囲第５項において、分離したポリペプ
   チドの少なくともひとつは、アミノ末端に、ｖａｌ　ｇ
   ｌｙ　ｌｙｓ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　ｌｙｓ　ｍｅｔ　ｌｅ
   ｕ　ｇｌｎｈｉｓ　ｉｌｅ　ａｓｐ　ｔｙｒ　ａｒｇ　
   ｍｅｔ　ａｒｇ　ｃｙｓ　ｉｌｅ　ｌｅｕ　ｇｌｎａｓ
   ｐという配列を持っていることを特徴とする方法。 ９、生物がＳＬＥに冒されているか否かを検出する方法
   において、Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドの少なく
   ともひとつをクローニングし、生物の血清試料との反応
   性を調べるために、クローニングしたＳｍ−ＢとＳｍ−
   Ｂ′ポリペプチドのうちのクローニングしたものを調製
   する、上記各ステップを有することを特徴とする方法。 １０、特許請求の範囲第９項において、ＳｍｓｎＲＮＰ
   のタンパク質を分離し、ｓｎＲＮＰのタンパク質からＳ
   ｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドの少なくともひとつを
   単離し、Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチド単離された
   ひとつからのアミノ酸配列に基づき、Ｓｍ−ＢとＳｍ−
   Ｂ′ポリペプチドの少なくともひとつをコード化するＤ
   ＮＡ配列をクローニングする、上記各ステップを有する
   ことを特徴とする方法。 １１、特許請求の範囲第９項において、Ｓｍ−ＢとＳｍ
   −Ｂ′ポリペプチドの分子量はそれぞれ約２６，０００
   と２７，０００であることを特徴とする方法。 １２、特許請求の範囲第９項において、Ｓｍ−ＢとＳｍ
   −Ｂ′ポリペプチドの少なくともひとつはアミノ末端に
   ｖａｌ　ｇｌｙ　Ｉｙｓ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　ｌｙｓ　ｍ
   ｅｔｌｅｕ　ｇｌｎ　ｈｉｓ　ｉｌｅ　ａｓｐ　ｔｙｒ
   　ａｒｇ　ｍｅｔ　ａｒｇ　ｃｙｓ　ｉｌｅｌｅｕ　ｇ
   ｌｎ　ａｓｐという配列を持っていることを特徴とする
   方法。 １３、生物がＳＬＥに冒されているか否かを試験する方
   法において、Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドの少な
   くともひとつをコード化するｃＤＮＡをクローニングし
   、ｃＤＮＡから前記Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチド
   の少なくともひとつを単離し、マイクロタイタープレー
   ト表面にＳｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドの単離した
   少なくともひとつを吸着させ、露出した表面をブロッキ
   ングし、マイクロタイタープレート上でＳｍ−ＢとＳｍ
   −Ｂ′ポリペプチドのブロックしたひとつに生物の血清
   試料を反応させ、その反応で生じた抗原−抗体複合体を
   検出する、上記各ステップを有することを特徴とする方
   法。 １４、特許請求の範囲第１３項において、抗原−抗体複
   合体の形成は標識酵素を共有結合した抗ヒトＩｇＧ／Ｉ
   ｇＭ抗体によって検出することを特徴とする方法。 １５、特許請求の範囲第１３項において、前記マイクロ
   タイタープレート上の前記Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペ
   プチドのブロックしたひとつの露出した表面を高濃度の
   反応性のないタンパク質溶液で、ブロックすることを特
   徴とする方法。 １６、特許請求の範囲第１４項において、Ｓｍ−ＢとＳ
   ｍ−Ｂ′ポリペプチドの少なくともひとつはイムノアフ
   ィニティークロマトグラフィーによりｃＤＮＡから単離
   し、マイクロタイタープレート上のＳｍ−ＢとＳｍ−Ｂ
   ′ポリペプチドのブロックしたひとつの露出した表面を
   高濃度の反応性のないタンパク質溶液でブロックする、
   上記各ステップを有することを特徴とする方法。 １７、特許請求の範囲第１６項において、抗原−抗体複
   合体の形成を特殊な発色によって示す検査に用いられる
   標識酵素は、ラクトペルオキシダーゼ／アルカリホスフ
   ァターゼであることを特徴とする方法。 １８、生物がＳＬＥに冒されているか否かを検出するた
   めの組成物において、ＳＬＥに冒されている生物の抗体
   と反応するＳｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′抗原の少なくともひと
   つ、Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′抗原の少なくともひとつとＳ
   ＬＥに冒されている生物の血清試料を混合した時に形成
   される抗原一抗体複合体に反応するもうひとつの後から
   加える抗体、形成された抗原−抗体複合体に後から加え
   た抗体が結合した時に、適当な基質を加えると、特別な
   発色を起こす後から加える抗体に結合させた酵素、を有
   することを特徴とする組成物。 １９、特許請求の範囲第１８項において、後から加える
   抗体は抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ抗体であり、酵素はその抗
   体に共有結合している、ことを特徴とする組成物。 ２０、特許請求の範囲第１９項において、酵素はラクト
   ペルオキシダーゼとアルカリホスファターゼの少なくと
   も一方から成ることを特徴とする組成物。 ２１、生物がＳＬＥに冒されているか否かを検出する方
   法において抗体を含んでいる人の血清試料とＳｍ−Ｄと
   Ｓｍ−Ｂ／Ｂ′ポリペプチドの混合物を反応させ、生物
   がＳＬＥであるか否かを、Ｓｍ−ＤとＳｍ−ＢとＳｍ−
   Ｂ′ポリペプチドの少なくともひとつとの混合物と生物
   の血清試料中の抗体との反応性によって決定する、上記
   各ステップを有することを特徴とする方法。 ２２、特許請求の範囲第２１項において、Ｓｍ−ＢとＳ
   ｍ−Ｂ′ポリペプチドの分子量はそれぞれ約２６，００
   ０と２７，０００であり、Ｓｍ−Ｄポリペプチドの分子
   量は約１３，０００であることを特徴とする方法。 ２３、特許請求の範囲第２２項において、Ｓｍ−ＤとＳ
   ｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドの少なくともひとつと
   の混合物と生物の血清試料との反応性は、反応生成物と
   標識酵素を共有結合させた抗ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体とを反
   応させることによって検出することを特徴とする方法。 ２４、特許請求の範囲第２１項において、Ｓｍ−ＢとＳ
   ｍ−Ｂ′ポリペプチドの少なくともひとつはｖａｌ　ｇ
   ｌｙ　ｌｙｓ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　ｌｙｓ　ｍｅｔ　ｌｅ
   ｕ　ｇｌｎ　ｈｉｓｉｌｅ　ａｓｐ　ｔｙｒ　ａｒｇ　
   ｍｅｔ　ａｒｇ　ｃｙｓ　ｉｌｅ　ｌｅｕ　ｇｌｎ　ａ
   ｓｐというアミノ酸配列を持ち、Ｓｍ−Ｄポリペプチド
   はｍｅｔ　ｌｙｓ　ｌｅｕ　ｖａｌ　ａｒｇ　ｐｈｅ　
   ｌｅｕ　ｍｅｔ　ｌｙｓ　ｌｅｕｓｅｒというアミノ酸
   配列を持つことを特徴とする方法。 ２５、生物がＳＬＥに冒されているか否かを検出する方
   法において、ＳＬＥに冒されている生物の血清試料から
   得た抗体をｓｎＲＮＰを分離するために使用し、ｓｎＲ
   ＮＰのタンパク質から分子量約１３，０００のポリペプ
   チドと分子量約２６，０００と２７，０００のポリペプ
   チドの少なくとも一方を単離し、単離した分子量約１３
   ，０００のポリペプチドと分子量約２６，０００と２７
   ，０００のポリペプチドの少なくとも一方をクローニン
   グし、クローン化したポリペプチドの混合物と生物の血
   清試料と反応させ、クローン化したポリペプチドの混合
   物と生物の血清試料との反応性によって、生物がＳＬＥ
   であるか否かを決定する、上記各ステップを有すること
   を特徴とする方法。 ２６、特許請求の範囲第２５項において、クローン化し
   たポリペプチドの混合物と血清試料との反応性は標識酵
   素と共有結合させた抗ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体を加えること
   により決定することを特徴とする方法。 ２７、特許請求の範囲第２５項において、単離したポリ
   ペプチドは、Ｓｍ−ＤポリペプチドとＳｍ−ＢとＳｍ−
   Ｂ′ポリペプチドの少なくともひとつであることを特徴
   とする方法。 ２８、特許請求の範囲第２５項において、Ｓｍ−ＢとＳ
   ｍ−Ｂ′ポリペプチドの単離したものはアミノ末端にｔ
   ｈｒ　ｖａｌ　ｇｌｙ　ｌｙｓ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　ｌｙ
   ｓ　ｍｅｔｌｅｕ　ｇｌｎ　ｈｉｓ　ｉｌｅ　ａｓｐ　
   ｔｙｒ　ａｒｇ　ｍｅｔ　ａｒｇ　ｃｙｓ　ｉｌｅｌｅ
   ｕ　ｇｌｎ　ａｓｐというアミノ酸配列を持ち、Ｓｍ−
   Ｄポリペプチドはアミノ末端にｍｅｔ　ｌｙｓ　ｌｅｕ
   　ｖａｌａｒｇ　ｐｈｅ　ｌｅｕ　ｍｅｔ　ｌｙｓ　ｌ
   ｅｕ　ｓｅｒというアミノ酸配列を持つことを特徴とす
   る方法。 ２９、生物がＳＬＥに冒されているか否かを検出する方
   法において、Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドの少な
   くともひとつとＳｍ−Ｄポリペプチドをクローニングし
   、Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドのクローニングし
   たものとクローニングしたＳｍ−Ｄポリペプチドを生物
   の血清試料と反応させるために調製する、上記各ステッ
   プを有することを特徴とする方法。 ３０、特許請求の範囲第２９項において、Ｓｍ　ｓｎＲ
   ＮＰタンパク質を分離し、ｓｎＲＮＰタンパク質の中か
   らＳｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドの少なくともひと
   つとＳｍ−Ｄポリペプチドを単離し、Ｓｍ−ＢとＳｍ−
   Ｂ′ポリペプチド単離したもののアミノ酸配列に基づい
   て、Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドの少なくともひ
   とつをコード化するＤＮＡ配列をクローニングし、単離
   したＳｍ−Ｄポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、
   Ｓｍ−Ｄポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列をクロ
   ーニングする、上記各ステップを有することを特徴とす
   る方法。 ３１、特許請求の範囲第２９項において、Ｓｍ−ＢとＳ
   ｍ−Ｂ′ポリペプチドの分子量はそれぞれ約２６，００
   ０と２７，０００であり、Ｓｍ−Ｄポリペプチドの分子
   量は約１３，０００であることを特徴とする方法。 ３２、特許請求の範囲第２９項において、Ｓｍ−ＢとＳ
   ｍ−Ｂ′ポリペプチドの少なくともひとつはアミノ末端
   にｖａｌ　ｇｌｙ　ｌｙｓ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　ｌｙｓ　
   ｍｅｔｌｅｕ　ｇｌｎ　ｈｉｓ　ｉｌｅ　ａｓｐ　ｔｙ
   ｒ　ａｒｇ　ｍｅｔ　ａｒｇ　ｃｙｓ　ｉｌｅｌｅｕ　
   ｇｌｎ　ａｓｐという配列を持ち、Ｓｍ−Ｄポリペプチ
   ドはアミノ末端にｍｅｔ　ｌｙｓ　ｌｅｕ　ｖａｌ　ａ
   ｒｇｐｈｅ　ｌｅｕ　ｍｅｔ　ｌｙｓ　ｌｅｕ　ｓｅｒ
   という配列を持つことを特徴とする方法。 ３３、生物がＳＬＥに冒されているか否かを試験する方
   法において、Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドの少な
   くともひとつとＳｍ−Ｄポリペプチドをコード化するｃ
   ＤＮＡをクローニングし、ｃＤＮＡからＳｍ−ＢとＳｍ
   −Ｂ′ポリペプチドの少なくともひとつとＳｍ−Ｄポリ
   ペプチドを単離し、単離したＳｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリ
   ペプチドとＳｍ−Ｄポリペプチドの混合物をマイクロタ
   イタープレート上の表面に吸着させ、露出した表面をブ
   ロックし、生物の血清試料とマイクロタイタープレート
   上において、Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドのブロ
   ックしたものとＳｍ−Ｄポリペプチドのブロックしたも
   のを反応させ、この反応で形成される抗原−抗体複合体
   を検出する、上記各ステップを有することを特徴とする
   方法。 ３４、特許請求の範囲第３３項において、抗原−抗体複
   合体の形成は、標識酵素が共有結合した抗ヒトＩｇＧ／
   ＩｇＭ抗体によって検出することを特徴とする方法。 ３５、特許請求の範囲第３３項において、マイクロタイ
   タープレート上のＳｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドの
   少なくともひとつとＳｍ−Ｄポリペプチドの混合物の露
   出した表面は高濃度の反応性のないタンパク質溶液でブ
   ロックすることを特徴とする方法。 ３６、特許請求の範囲第３４項において、Ｓｍ−ＢとＳ
   ｍ−Ｂ′ポリペプチドの少なくともひとつとＳｍ−Ｄポ
   リペプチドはｃＤＮＡを発現させ、イムノアフィニティ
   ークロマトグラフィーを行って分離させ、マイクロタイ
   タープレート上のＳｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′ポリペプチドの
   少なくともひとつとＳｍ−Ｄポリペプチドの混合物を露
   出した表面を高濃度の反応性のないタンパク質溶液でブ
   ロックすることを特徴とする方法。 ３７、特許請求の範囲第３６項において、抗原−抗体複
   合体の形成を特殊な発色によって示す検査に用いられる
   標識酵素はラクトペルオキシダーゼ／アルカリホスファ
   ターゼであることを特徴とする方法。 ３８、生物がＳＬＥに冒されているか否かを検出するた
   めの組成物において、ＳＬＥに冒されている生物の抗体
   と反応するＳｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′抗原の少なくともひと
   つとＳｍ−Ｄ抗原の混合物、Ｓｍ−ＢとＳｍ−Ｂ′抗原
   の少なくともひとつとＳｍ−Ｄ抗原の混合物と生物の血
   清試料を混合した時に形成される抗原−抗体複合体に反
   応するもうひとつの後から加える抗体、形成された抗原
   −抗体複合体に後から加えた抗体が結合した時に、適当
   な基質を加えると、特別な発色を起こす後から加える抗
   体に結合させた酵素を、有することを特徴とする組成物
   。 ３９、特許請求の範囲第３８項において、後から加える
   抗体は、抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ抗体であり、酵素は後か
   ら加える抗体に共有結合していることを特徴とする組成
   物。 ４０、特許請求の範囲第３９項において、酵素はラクト
   ペルオキシダーゼとアルカリホスファターゼのうち少な
   くとも一方から成ることを特徴とする組成物。