DE3879055T2 - Die sm-b/b1-antigene, das klonen der sm-b/b1-antigene und der nachweis von systemischem lupus erythematosus unter verwendung der sm b/b1-antigene. - Google Patents
Die sm-b/b1-antigene, das klonen der sm-b/b1-antigene und der nachweis von systemischem lupus erythematosus unter verwendung der sm b/b1-antigene.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein rekombinantes Polypeptid, welches mit einem Anti-Sm-Antikörper reagieren kann, ein DNA-Fragment, welches für das Polypeptid kodiert, einen Vektor, der dieses DNA-Fragment umfaßt, ein Verfahren zum Herstellen des rekombinanten Polypeptids und ein Verfahren zum Testen einer Serumprobe eines Lebewesens, um festzustellen, ob oder ob nicht das Lebewesen von systemischen Lupus Erythematodes betroffen ist.
- Bei einer Autoimmunerkrankung erzeugt das Immunsystem des Körpers Antikörper, die mit den körpereigenen zellulären Komponenten reagieren. Die daraus hervorgehende Bildung von Immunkomplexen kann zu verschiedenen pathologischen Zuständen führen. Einige rheumatische Erkrankungen sind Autoimmunerkrankungen. Eine Art einer solchen rheumatischen Erkrankung ist systemischer Lupus Erythematodes.
- Antinukleare Antikörper sind ein Kennzeichen von Autoimmunerkrankungen. Die Antikörper sind antinuklear, weil sie gegen Komponenten im Zellkern der Zellen in den Lebewesen wirken. Testverfahren auf der Basis der Messung dieser Antikörper haben einen festen Platz in der Labormedizin zur Diagnose einer Anzahl von rheumatischen Erkrankungen. (1,2). Die Testverfahren verwenden im allgemeinen nicht ein gereinigtes Antigen als Ziel dieser Antikörper. Somit sind die Testverfahren relativ grob. Dies rührt von der Tatsache her, daß Zellextrakte routinemäßig als Quelle des Antigens dienen, so daß es keinen definierten Standard gibt, der als interne Kontrolle dienen könnte. Das Problem ist dadurch kompliziert worden, daß die molekulare Natur der Zielantigene für diese Autoimmunantikörper relativ komplex ist.
- In den vergangenen Jahren haben Fachleute begonnen, die molekulare Natur der Zielantigene für die Autoimmunantikörper und insbesondere ihre Komplexität bezüglich der großen Strukturelemente, von denen sie ein Teil sein können, zu erkennen. Das große Strukturelement können spezifisch Ribonukleoprotein-(RNP) oder Desoxyribonukleoprotein-(DNP)-Partikel sein. Fachleute haben auch begonnen, die Komplexität dieser Antigene bezüglich der Rolle, die sie beim Funktionieren von Zellen in Lebewesen spielen, zu erkennen. (3). Mit der Verfügbarkeit solcher Informationen existiert das Potential zur Entwicklung von definierten und reichlich vorhandenen Antigenreagenzien und zur Verwendung dieser Reagenzien bei der Entwicklung von empfindlichen und quantitativen klinischen Testverfahren.
- Versuche sind unternommen worden, um relativ einfache Polypeptide oder Proteine als Antigene beim Nachweisen der Antikörper bei Autoimmunerkrankungen wie etwa rheumatischen Erkrankungen zu isolieren. Obwohl diese Polypeptide oder Proteine einfache Antigene sind, sind sie eigentlich ein Teil von noch komplexeren zellulären Strukturen. Folglich ist es schwierig gewesen, die Polypeptide oder Proteine zu isolieren, die mit solchen Antikörpern reagieren. Es ist auch schwierig gewesen, ein Testverfahren zu entwickeln, in dem solche Antigene verwendet werden, um die Antikörper der Autoimmunerkrankungen wie etwa rheumatische Erkrankungen nachzuweisen.
- Es ist insbesondere schwierig gewesen, ein definiertes und reichlich vorhandenes Antigen für die rheumatische Erkrankung zu entwickeln, welche als systemischer Lupus Erythematodes bezeichnet wird, da das Antigen (als Sm bezeichnet) für systemischen Lupus Erythematodes mit einer konservierten Klasse von Proteinen verbunden ist, welche snRNP (kleine nukleare Ribonukleoproteine) genannt werden (4). Die kleinen nuklearen Sm-Ribonukleoproteine (snRNP), welche mit den Sm-Antigenen assoziiert sind, enthalten 5 Arten von U snRNA (U1, U2, U4, U5 und U6) und mindestens 11 Polypeptide. Die U snRNA sind reich an Uridin.
- Die Anmelder und andere Fachleute auf diesem Gebiet haben Sm snRNP identifiziert. (5-8). Die Anmelder haben kürzlich das Sm-D-Polypeptidantigen, welches mit systemischen Lupus Erythematodes verbunden ist, isoliert. Das Sm-D-Polypeptid hat ein Molekulargewicht von ungefähr dreizehntausend (13.000). Die Anmelder haben auch kürzlich ein einfaches und wirksames colorimetrisches Testverfahren entwickelt, in dem ein solches Antigen mit einer Serumprobe eines Lebewesens verwendet werden kann, um festzustellen, ob das Lebewesen von systemischen Lupus Erythematodes betroffen ist. Alles dies oben genannte ist in der europäischen Patentanmeldung 88 109 795.0 (EP-A-0 295 719) für "Das Sm-D-Antigen, das Klonieren des Sm-D-Antigens und der Nachweis von systemischen Lupus Erythematodes durch Verwendung des Sm-D-Antigens" beschrieben und beansprucht und dem Anmelder der vorliegenden Anmeldung übertragen worden. Die europäische Patentanmeldung ist Teil des Standes der Technik nach Artikel 54(3) EPC.
- In Arthritis and Rheumatism, Band 29 (1986) Seiten 986 bis 996, wird über die Untersuchung von Seren von Patienten mit gemischten Bindegewebserkrankungen und systemischen Lupus Erythematodes berichtet. Die Seren werden auf das Vorhandensein von Autoantikörpern durch Verwendung der Immuno-Blotting-Methode untersucht. Dieses Dokument offenbart jedoch keine Information über die Aminosäuresequenz der nachgewiesenen Antigene.
- In J. Biol. Chem., Band 259 (1984), Seiten 12850 bis 12856 sind verschiedene Polypeptide durch ihr Molekulargewicht und ihre Reaktivität mit menschlichen Anti-Sm-Autoantikörpern charakterisiert. Dieses Dokument bringt jedoch keine Information über die Aminosäuresequenz der verschiedenen nachgewiesenen Proteine. Weiterhin läßt dieses Dokument offen, ob die aufgelösten Proteinbanden eine einzelne molekulare Spezies darstellen.
- Weiterhin beschreibt J. Biol. Chem., Band 259 (1984), Seiten 5907 bis 5914 die Molekulargewichte von kleinen nuklearen Ribonukleoproteinen von Säugetieren, die mit Anti-Sm-Seren bzw. einem monoklonalen Antikörper aus der Maus nachweisbar sind. Besondere Aminosäuresequenzen sind in dieser Literaturstelle ebenfalls nicht offenbart und die Reinheit der beobachteten Banden bleibt unklar.
- Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein rekombinantes Polypeptid bereitzustellen, welches mit einem Anti-Sm-Antikörper reagiert.
- Diese Aufgabe wird gelöst durch ein rekombinantes Polypeptid, welches die folgende Sequenz umfaßt:
- und das rekombinante Polypeptid umfaßt mindestens ein Epitop, welches mit einem Anti-Sm-Antikörper reagieren kann.
- Eine weitere Aufgabe ist das Bereitstellen eines DNA-Fragments, eines Vektors und eines transformierten Wirtes, die zum Herstellen des vorstehenden Polypeptids brauchbar sind. Diese Aufgaben werden durch ein DNA-Fragment, welches eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für das vorstehende rekombinante Polypeptid kodiert, einen Vektor, der ein solches DNA-Fragment umfaßt, und einen Wirt, der das DNA-Fragment oder den Vektor umfaßt, gelöst.
- Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zum Herstellen des vorstehenden rekombinanten Polypeptids bereitzustellen.
- Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches die Schritte des
- (a) Isolierens eines natürlich vorkommenden Polypeptids, das mit systemischem Lupus Erythematodes assoziiert ist,
- (b) Identifzierens der Aminosäuresequenz von mindestens einem Teil des natürlich vorkommenden Polypeptids,
- (c) Herstellens einer Nukleinsäureprobe, basierend auf der in Schritt (b) identifzierten Aminosäuresequenz, worin die Nukleinsäureprobe mit mindestens einem Teil der DNA, die für das natürlich vorkommende Polypeptid kodiert, hybridisieren kann,
- (d) Umsetzens der Nukleinsäureprobe mit einer DNA-Bank,
- (e) Isolierens der DNA, die mit der Nukleinsäureprobe reagiert und
- (f) Verwendens der isolierten DNA oder einer synthetischen DNA, um das rekombinante Polypeptid herzustellen, worin die synthetische DNA für das gleiche Polypeptid kodieren kann, wie die isolierte DNA,
- worin das natürlich vorkommende Polypeptid gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Sm-B- und Sm-B'-Polypeptiden,
- umfaßt.
- Diese Aufgabe wird auch durch ein Verfahren gelöst, welches den Schritt des Kultivierens eines transformierten Wirtes umfaßt, welcher einen Vektor umfaßt, der für das rekombinante Polypeptid der Erfindung kodiert, wobei der Wirt in der Lage ist, die fremde DNA zu exprimieren.
- Es ist eine weitere Aufgabe, ein Verfahren zum Untersuchen einer Serumprobe eines Lebewesens bereitzustellen, um festzustellen, ob oder ob nicht das Lebewesen von systemischem Lupus Erythematodes betroffen ist.
- Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches die Schritte des
- (a) Umsetzens des rekombinanten Polypeptids nach Anspruch 1 mit der Serumprobe, die untersucht werden soll, und
- (b) Ermittelns der Anwesenheit oder Menge von in der Probe enthaltenen Antikörper, der mit dem Polypeptid reaktionsfähig ist,
- einschließt.
- Es ist eine weitere Aufgabe, ein Testkit für den Nachweis von Antikörpern, die mit systemischem Lupus Erythematodes assoziiert sind, bereitzustellen.
- Diese Aufgabe wird durch ein Testkit erfüllt, welches umfaßt
- (a) das rekombinante Polypeptid nach Anspruch 1,
- (b) einen gegen menschliches IgG/IgM gerichteten Antikörper, der mit einem Enzym verbunden ist, und
- (c) ein Substrat, welches mit dem Enzym reagieren kann, um eine nachweisbare Reakton zu ergeben.
- Die Anmelder haben nun cDNA isoliert, die für mindestens eines der Sm-B- und/oder Sm-B'-Polypeptidantigene kodiert. Die Sm-B- und /oder Sm-B'-Polypeptidantigene haben jeweils Molekulargewichte von sechsundzwanzigtausend (26.000) und siebenundzwanzigtausend (27.000). (5-8). Die Anmelder haben auch ein einfaches und wirksames colorimetrisches Nachweisverfahren entwickelt, in dem solche Antigene mit einer Serumprobe eines Lebewesens verwendet werden können, um festzustellen, ob das Lebewesen von systemischem Lupus Erythematodes betroffen ist. Die Anmelder haben auch ein einfaches und wirksames colorimetrisches Testverfahren entwickelt, welches eine Mischung der Sm-D- und Sm-B- und/oder Sm-B'-Polypeptidtestverfahren miteinbezieht.
- In einer Ausführungsform der Erfindung werden snRNP-Proteine durch Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern aus einer Serumprobe eines Lebewesens, welches von systemischen Lupus Erythematodes betroffen ist, isoliert. Die Sm-B- und/oder Sm-B'- Polypeptide werden ihrerseits aus dem snRNP-Protein durch Gelelektrophorese und Elektroelution isoliert. Die Aminoenden der Sm-B- und/oder Sm-B'- Polypeptide werden dann sequenziert und markierte DNA-Proben mit einer Nukleotidsequenz, die zu der komplementär sind, welche für die Aminosäuresequenz kodiert, werden synthetisiert. Eine menschliche cDNA-Genbank in einem lambda-Klonierungsvektor wird auf geeignete Filter, wie Nitrozellulosefilter, übertragen. Diese Filter werden durch Hybridisierung mit den markierten Proben durchsucht, um die cDNA-Klone in der Genbank mit Sequenzen, die zu denen der markierten Proben passen, zu identifizieren.
- Die für die Sm-B- und/oder Sm-B'-Proteine kodierende cDNA wird dann subkloniert. Die Sm-B- und/oder Sm-B'-Polypeptide werden dann durch Immunoaffinitätschromatographie und wenn weiter gewünscht, durch HPLC-Chromatographie isoliert. Ein Testverfahren wird dann mit den isolierten Sm-B- und/oder Sm-B'-Polypeptiden durch Umsetzen der Sm-B und/oder Sm-B'-Polypeptide mit einer Serumprobe eines Lebewesens durchgeführt, um festzustellen, ob das Lebewesen von systemischen Lupus Erythematodes betroffen ist. Das Testverfahren kann auch mit einer Mischung der isolierten Sm-B- und/oder Sm-B'-Polypeptide und dem isolierten Sm-D-Polypeptid (wie oben beschrieben isoliert) durchgeführt werden.
- Das Testverfahren kann als enzymverknüpfter Immunoabsorptionsassay, etwa unter Verwendung von gegen menschliches IgG/IgM gerichteten Antikörpern, die kovalent an einen Enzymindikator angebunden sind, durchgeführt werden. Lactoperoxidase/alkalische Phosphatase sind jeweils ein Beispiels eines Enzymindikators, um durch eine deutlich unterscheidbare Farbe eine betroffene Person anzuzeigen.
- In den Abbildungen:
- Figur 1 zeigt die Sequenz einer Anzahl von Aminosäuren am Aminoende der Sm-B und/oder Sm-B'-Polypeptide und zeigt weiter Proben, die synthetisiert wurden, um mit der cDNA zu hybridisieren, welche für solche Aminosäuresequenzen kodiert; und
- Figur 2 zeigt die Sequenz einer Anzahl von Aminosäuren am Aminoende des Sm-D-Polypeptids und zeigt weiter Proben, die synthetisiert wurden, um mit der cDNA zu hybridisieren, die für solche Aminosäuresequenzen kodiert, wie sie in der europäischen Patentanmeldung 88 109 795.0 beschrieben sind.
- In einer Ausführungsform der Erfindung wurde das Sm snRNP durch Immunoaffinitätschromatographie isoliert. Als erster Schritt in einem solchen Verfahren wurde eine Plasmapherese eines an systemischem Lupus Erythematodes erkrankten Patienten als Quelle von humanen anti-Sm-Antikörpern erhalten. Das Immunoglobulin G (IgG) wurde durch Halbsättigungs-Ammoniumsulfatfraktionierung und Passage über eine DEAE-Sephacel -Säule gereinigt. Das isolierte IgG wurde an Sepharose CL-4B durch ein Carbonyl-Diimidazolverfahren angebunden. (10).
- Aus Suspensionskulturen einer menschlichen Zellinie, die als HeLa bezeichnet wird, wurden Extrakte hergestellt durch Ultrabeschallen von ganzen Zellen in 0,35 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid. (8). Die Zellextrakte wurden unmittelbar nach der Herstellung über die anti-Sm-Immunoaffinitätsäule geleitet, welche wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben, hergestellt wurde. Die Säulen wurden dann mit einem Extraktionspuffer gewaschen und in 10 mM Tris HCl, pH 7,4, welches 0,1 M NaCl, 6 M Harnstoff und 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt, eluiert. Träger-RNA (20 ug/ml) wurde dem Eluat zugegeben, um die anschließende Ausfällung des Sm snRNP bei verdünnten Proteinkonzentrationen zu erleichtern. Das Sm snRNP wurde dann über Nacht bei -20ºC durch die Zugabe von zwei (2) Volumina Ethanol ausgefällt.
- Die Immunoaffinitätsäulen-Eluate wurden auf Gesamtproteingehalt hin (einschließlich des charakteristischen Sm snRNP-Profils) durch eine Coomassie-Blue-Färbung nach einer Natriumdodecylsulfat (SDS)-Gelelektrophorese untersucht (11). Antigen-Polypeptide wurden durch Immun- Blot nach der Übertragung auf Nitrozellulose nachgewiesen. (12, 13). Auf diese Weise wurden die Sm-Antigene in großem Umfang in ausreichender Reinheit für die direkte biochemische Analyse gereinigt. Dieses Verfahren minimierte die Aussetzung des Sm snRNP gegen Proteasen und Nukleasen (9).
- Obwohl die Anmelder das Sm snRNP-Partikel leicht durch chromatographische Methoden isolieren konnten, waren sie nicht in der Lage, das Sm snRNP-Partikel durch chromatographische Methoden zu fraktionieren. Stattdessen fraktionierten die Anmelder das Sm snRNP-Partikel unter Verwendung von SDS-Polyacryl-Gelelektrophorese und Elektroelution. Die Vorschrift (und Geräte) die von den Anmeldern verwendet wurden, um dies zu erreichen, war diejenige, die von Hunkapiller et al (14) verwendet wurde, um Mikrogramm-Mengen von Protein zu isolieren. Diese Vorschrift war ideal für die Zwecke der Anmelder, da sie in der Lage waren, für jede Polypeptidbande, eine kleine Menge an Protein (10 - 20 ug) aus einem großen Stück Acrylamidgel (10 - 11 cm breit / 1,5 mm dick) in ein kleines Volumen (300 - 500 ul) zu eluieren.
- Die einzige Veränderung, welche die Anmelder an der Vorschrift von Hunkapiller et al vornahmen, war die Veränderung der Färbebedingungen vor dem Herausschneiden von einzelnen Banden aus dem Gel. Diese Änderung wurde vorgenommen, da eine Anzahl der interessierenden Peptide selbst auf langen (20 cm) Gelen ziemlich nahe beieinander lagen. Um in der Lage zu sein, zwischen solchen interessierenden Peptiden nach der üblichen Entfärbungsperiode von zwei (2) Stunden klar zu unterscheiden, wurde das Coomassie-Blue auf Fünfhundertstel eines Prozentes (0,05 %) der Originalvorschrift von Hunkapiller et al herabgesetzt. Nach der Elektroelution von einzelnen Banden von Peptiden, wurde jede Bande auf Homogenität durch eine Silberfärbung nach der SDS-Gelelektrophorese (11) und auf Immunoreaktivität durch Proteinblot untersucht. (12, 13).
- Die Anmelder wählten ein Gasphasensystem, um die Aminosäuren in dem Sm-B- und/oder Sm-B'-Polypeptid zu sequenzieren, da nur pMol-Mengen an Protein erforderlich waren. (15, 16). Das Sequenzieren wurde am Proteinchemielabor der Washington University, St. Louis, Missouri durchgeführt. Die Anmelder erhielten Sequenzen von neunzehn (19) und zwanzig (20) Resten von jeweils den Sm-B und/oder Sm-B'-Polypeptiden am Aminoende der Sm-B und/oder Sm-B'-Polypeptide. Die Sequenz war wie folgt:
- Die Anmelder synthetisierten zwei (2) dreiundzwanzig (23)-mere und eine (1) vierundfünfzig (54)-mere Oligonukleotidprobe (ABI-Synthesizer, The Agouron Institute) um die cDNA, welche für das Sm-B- und/oder Sm-B'-Protein kodiert, zu klonieren. Diese Proben wurden mit einer Basenzusammensetzung synthetisiert, die aus der Aminosäuresequenz abgeleitet wurde, welche aus dem Sequenzieren der Sm-B und/oder Sm-B'- Polypeptid(e) erhalten werden kann. Diese Proben wurden als die B1, B3 und B4 Proben bezeichnet. Die Proben wurden mit radioaktivem Phosphor markiert. Die B1, B3 und B4-Proben wurden wie folgt gebildet: kodierender Strang Probe
- Dies wird auch in Figur 1 gezeigt. In den vorstehenden Sequenzen bedeutet "N" eines der vier (4) Nukleotide A, T, G und C. "I" substituiert alle vier (4) Nukleotide außer das Nukleotid "C". Dies entspricht Deoxyinosin. In der vorstehenden Sequenz wird Cystein als eine der Aminosäuren gezeigt. Dies ist durch nachfolgende Experimente bestätigt worden. Tatsächlich wurde jedoch während der Woche mit den B1, B2, B4-Proben diese Aminosäure für Lysin gehalten.
- Wie man sehen wird, wurde die B1-Probe so entworfen, daß sie Deoxyinosin an der dritten Stelle der am meisten zweifelhaften Codons verwendet wurde. (17). Die B1-Probe wurde demgemäß als eine Mischung von vierundsechzig (64) verschiedenen Oligonukleotiden gebildet. In der B3-Probe wurden alle vier (4) Nukleotide an der dritten (3.) Position der redundanten Codons eingeschlossen. Im folgenden zogen die Anmelder auf der Basis der üblichen Codonverwendung (18) nur Cytosin an der ersten Stelle von Leucintriplets in Betracht. Infolgedessen wurde die gesamte Anzahl der molekularen Spezies für die B3-Probe auf einhundertundzweiundneunzig (192) reduziert. Für die B4-Probe wurde eine einzige vierundfünfzig (54)-mere Spezies entworfen, basierend auf der üblichen Verwendung in menschlichen Codons (18) für die bekannten Aminosäuren der Sm-B- und/oder Sm-B'-Polypeptide.
- Als Quelle der cDNA wurde eine Genbank, welche λgt10-Klonierungsvektoren enthielt und aus menschlicher B-Lymphozyten poly-RNA gemacht war, von Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, California erworben. Annähernd zweihundertfünfzigtausend (250.000) unabhängige λ-rekombinante Plaques wurden auf E. coli Y1090 Bakterienrasen ausplattiert und auf Nitrozellulosefilter übertragen. (19). Diese Filter wurden durch Hybridisieren mit der [³²p] -markierten B1-Probe durchsucht.
- Nach der ersten Durchsuchungsrunde wurden neunzehn (19) Plaques identifiziert, die mit der [³²p]-markierten B1-Probe hybridisiert waren. Annähernd zweihundertundfünfzigtausend (250.000) zusätzliche unabhängige λ-rekombinante Plaques wurden mit der Probe B3 wie oben beschrieben durchsucht. Bei dieser Durchsuchung wurden sechzehn (16) Plaques identifiziert, welche mit der [³²p]-markierten B3-Probe hybridisiert waren.
- Die neun (9) am meisten positiven Klone aus der Durchsuchung mit der B1-Probe und alle sechzehn (16) positiven Klone der Durchsuchung mit der B3-Probe wurden zwei (2) weiteren Reinigungszyklen unter Verwendung der B3-Probe unterworfen. Nach zwei (2) solchen zusätzlichen Hybridisierungszyklen wurde eine Gesamtzahl von vierundzwanzig (24) reinen positiven Klonen erhalten. Diese vierundzwanzig (24) Klone wurden weiter mit der B4-Probe unter niedrigen Salz- und hohen Temperaturbedingungen durchsucht. Aus dieser letzten Durchsuchung wurden sieben (7) rekombinante Klone identifiziert, welche mit der [³²p] -markierten B4-Probe hybridisiert waren.
- DNA aus den vierundzwanzig (24) λ-positiven Klonen, welche mit der B3-Probe durchsucht worden waren, wurde hergestellt (19) und mit dem EcoRI-Enzym geschnitten. Die Größe der cDNA wurde nach solch einem Schneiden bestimmt. Die Inserts wurden in sechs (6) Gruppen eingeteilt, die jede Inserts in einem bestimmten Bereich von Nukleotidlängen enthielten. Diese Gruppen hatten Längen im Bereich von 0,80 Kb bis 2,0 Kb. Von den sieben (7) positiven Klonen, die mit der B4-Probe identifiziert wurden, gehörten sechs (6) zu der Gruppe mit der 1,3 bis 1,4 Kb-Größe. Der positive Klon λ B4l9-2 hatte eine Insertgröße von 1,1 Kb. Die cDNA EcoRI Inserts aus den Rekombinanten λ B3-1, λ B22-2, λ B407-1, λ B419-2 und λ- B443-2 wurden in einen allgemeinen (generic) Vektor subkloniert, der als M13mp18 (20) bezeichnet wurde. Die cDNA EcoRI-Fragmente aus den Klonen λ-B409-2 und B445-2 wurden in einen allgemeinen Vektor subkloniert, der als pUC18 bezeichnet wird (21). Die Nukleotidsequenz der cDNA Inserts wurde durch Anwenden des Dideoxyverfahrens (22) bestimmt. Es wurde gefunden, daß alle sieben (7) Klone eine DNA-Sequenz enthielten, die vollkommen zu der Codonzusammensetzung für die bekannte Sequenz von zwanzig (20) Aminosäuren in den Sm-B- und/oder Sm-B'-Polypeptiden paßten.
- Die Sm-B- und/oder Sm-B'-Proteine können in E. coli. exprimiert werden. Es gibt zwei (2) Hauptgründe für diese Wahl: (1) Ist dieses Bakterium der am meisten untersuchte und verstandene Organismus in Hinblick auf seine Physiologie, Genetik und molekulare Biologie; und (2) gibt es bereits eine große Anzahl von geeigneten Expressionsvektoren. (23-26). Diese Vektoren verwenden starke bakterielle Transkriptions- und Translationssignale, um hohe Werte der Synthese des klonierten Genprodukts zu erreichen.
- Um Probleme der Inhibition des Bakterienwachstums durch das klonierte Genprodukt zu vermeiden, kann die Expression des klonierten Genprodukts konditional aktiviert werden durch Verwendung von induzierbaren Promotoren der Transkription. Z.B. enthalten die Plasmide pIN-III (23) und pKK233-2 (24) die lac und tac-Promotoren. Beide können durch die Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zu den Kulturen induziert werden. Das Plasmid pAS1 (25) trägt den λpL-Promotor, der durch Erhöhen der Inkubationstemperatur von 30ºC auf 42ºC aktiviert wird. Ein anderes System, (26) beruht auf der Verwendung von zwei (2) Plasmiden. Ein Plasmid pGP1-2 kodiert für die T7 RNA-Polymerats unter der Kontrolle des λ-pL-Promotors. Das interessierende Gen wird in ein zweites Plasmid pT7-3 unter der Kontrolle des 10 T7 RNA-Polymerasepromotors kloniert.
- Als ersten Schritt kann die cDNA, welche für die Sm-B- und/oder Sm-B'-Proteine kodiert, in alle der oben genannten Vektoren kloniert werden. Als zweites kann die Expression des rekombinanten Sm-B- und/oder Sm-B'-Proteins optimiert werden durch Bestimmen der besten Inkubationsbedingungen vor und nach der Induktion des bakteriellen Transkriptionspromotors. Die Werte der Expression der klonierten Sm-B- und/oder Sm-B'-Polypeptide können durch Markieren der neu synthetisierten Polypeptide mit [³&sup5;S] - Methionin und das Entnehmen von Proben zu verschiedenen Zeiten, welche dann einer SDS-Polyacrylamidelektrophorese und Autoradiographie unterzogen werden, verfolgt werden.
- Ein direktes Testverfahren kann verwendet werden, um die Reaktivität der Antikörper in einem Lebewesen wie einem Patienten zu bestimmen. Eine Haupteinschränkung eines direkten Testverfahrens ist allgemein, daß eine relativ große Menge an Antigen erforderlich ist, um ein solches Testverfahren durchzuführen. Dies ist besonders dann der Fall, wenn es gewünscht wird, das Antigen in vollständiger oder fast vollständiger Homogenität zu haben.
- Große Mengen des Antigens können wie zwei (2) Abschnitte weiter oben diskutiert, hergestellt werden. Z.B. kann das Sm-B- und/oder Sm-B'-Antigen durch Immunoaffinitätschromatographie wie in dem Abschnitt mit der Überschrift "Isolierung der Sm snRNP" diskutiert, isoliert werden. Bei einer solchen Immunoaffinitätschromatographie kann ein polyklonales menschliches Serum verwendet werden. Alternativ dazu kann ein polyklonaler Antikörper aus Kaninchen verwendet werden, welcher Spezifität für die Sm-B- und/oder Sm-B'-Banden besitzt. Wenn dies als wünschenswert erachtet wird, kann Chromatographie auf das Antigen als abschließender Reinigungsschritt angewendet werden.
- Ein enzymgekoppelter Immunoabsorptionsassay (27) ist das bevorzugte Testverfahren. Die gereinigten Sm-B und/oder Sm-B'-Polypeptide werden vorzugsweise auf der Oberfläche von Mikrotiterplatten absorbiert. Jede exponierte Oberfläche auf den Mikrotiterplatten wird vorzugsweise mit einer konzentrierten nicht-reaktiven Proteinlösung (z.B. Rinderserumalbumin) blockiert (28a). Die Serumprobe, welche untersucht werden soll, wird vorzugsweise direkt mit den Sm-B- und/oder Sm-B'-Antigenen reagieren gelassen.
- Jeder Antigen-Antikörper-Immunkomplex, der als Folge der Reaktion der Serumprobe mit dem Sm-B- und/oder Sm-B'-Antigen gebildet wurde, wird vorzugsweise durch gegen menschliches IgG/IgM gerichtete Antikörper, welche kovalent an einen Enzymindikator (z.B. Lactoperoxidase/alkalische Phosphatase) gebunden sind, nachgewiesen. Die quantitative Bestimmung des angehängten Enzymindikators kann durch ein colorimetrisches Testverfahren angezeigt werden. Weiter können die Mikrotiterplatten in einem automatischen Plattenlesegerät abgelesen werden. Hintergrundmessungen können auch durch geeignete Kontrollen unter Verwendung eines Serums einer nicht erkrankten Person, um eine negative Antwort zu ergeben und unter Verwendung von bekannten menschlichen anti-Sm-Autoantikörpern (29) oder eines Kaninchen-anti-Sm-B- und/oder Sm-B'-Antikörpers (28b), um eine positive Antwort zu erhalten, erhalten werden.
- Anstatt nur die Sm-B- und/oder Sm-B'-Antigene wie oben beschrieben bereitzustellen, um auf systemischen Lupus Erythematodes zu untersuchen, kann eine Mischung aus dem Sm-D- und dem Sm-B- und/oder Sm-B'-Antigenen bereitgestellt werden oder das Sm-D-Antigen kann mit nur dem Sm-B-Antigen oder dem Sm-B'-Antigen vermischt werden. Wenn das Sm-D Antigen mit einem oder beiden der Sm-B- und/oder Sm-B'-Antigene verwendet wird, kann ein monoklonaler anti-Sm-D- Antikörper aus der Maus mit dem anti-Sm-B- und /oder Sm-B'-Antikörper aus Kaninchen vermischt werden, um eine positive Antwort zu erhalten. Alternierend kann entweder das Sm-B- oder das Sm-B'-Antigen einzeln mit dem monoklonalen anti-Sm-D- Antikörper aus der Maus oder dem anti-Sm-B- und/oder Sm-B'-Antikörper aus Kaninchen vermischt werden, um die positive Antwort zu erhalten.
- Wie in der europäischen Patentanmeldung 88 109 795.0 (EP-A-295719) beschrieben und beansprucht, wurde das Sm-D-Polypeptid unter Verwendung von D1 und D2-Proben wie folgt isoliert: kodierender Strang Probe
- Eine cDNA Genbank in dem λgt10-Klonierungsvektor wurde unter Verwendung der D1 und D2-Proben durchsucht. Das Durchsuchen wurde im wesentlichen wie oben beschrieben und speziell wie in der oben erwähnten europäischen Patentanmeldung beschrieben durchgeführt. Die DNA, die gemäß einem solchen Durchsuchungsverfahren ausgewählt wurde, wurde subkloniert und sequenziert, wie in der oben erwähnten europäischen Patentanmeldung beschrieben.
- Das rekombinante Sm-D-Protein kann im wesentlichen wie oben beschrieben und speziell wie in der europäischen Patentanmeldung 88 109 795.0 beschrieben exprimiert werden.
- Die Haupt-Sm-Antigene sind mit den D, B und B'-Polypeptiden assoziiert. Drei (3) Literaturstellen sind unten zitiert, in denen Forscher speziell nach der Anti-Sm- Reaktivität unter Verwendung eines Verfahrens gesucht haben, welches Immun-Blot genannt wird. (30-32). Das am meisten verbreitete Muster weist alle drei (3) dieser Polypeptide auf. Weiterhin ist bekannt, daß diese drei (3) Polypeptide mindestens ein (1) Epitop gemeinsam haben, da es einen monoklonalen Antikörper aus der Maus gibt, der alle drei (3) der Polypeptide erkennt. (33). Es gibt jedoch auch einzigartige Determinanten. In den drei (3) Übersichten, welche zitiert wurden (30-32), erkannten ungefähr acht Prozent (8 %) der menschlichen Antiseren nur das Sm-B und/oder Sm-B'-Polypeptid. Vermutlich gibt es auch seltene Seren, welche nur das Sm-D-Polypeptid erkennen. Z.B. ist ein monoklonaler Antikörper aus der Maus isoliert worden, der nur das Sm-D-Polypeptid erkannte. (34).
- Forscher auf diesem Arbeitsgebiet haben bis jetzt das Sm-D-Antigen hervorgehoben. Die klinische Quelle für Gewebe für Anti-Sm-Assays ist sehr häufig ein Extrakt, der ENA genannt wird, welcher aus Kaninchenthymusdrüse gemacht wird. Es ist gezeigt worden, daß in der klassischen Art und Weise, in der ENA hergestellt wird, die meisten, wenn nicht alle der Sm-B- und/oder Sm-B'- Polypeptide verloren gingen. (35). So konnte daraus geschlossen werden, daß in vielen klinischen Assays die anti-Sm-Reaktivität nur gegen das Sm-D-Polypeptid gerichtet war. Weiterhin, wie in der Literaturstelle 31 geschlossen wurde, "scheint die Anwesenheit von anti-D- Antikörpern charakteristischer für anti-Sm-Seren zu sein, da sie nicht in anti-(U1)-RNP-Seren gefunden werden". Anders ausgedrückt können anti-Sm-B- und/oder Sm-B'-Antikörper mit mehr als einem (1) Phänotyp assoziiert sein.
- Alle drei Antigene (Sm-D und Sm-B und/oder Sm-B') scheinen wichtig zu sein. Das Sm-D-Antigen scheint das wichtigste der drei (3) zu sein, aber die Sm-B- und/oder Sm-B'-Antigene scheinen ebenfalls einen signifikanten Beitrag zu leisten. Deswegen scheint eine Mischung der drei (3) Antigene wünschenswerter zu sein, zumindest in bestimmten Fällen, als jedes einzelne dieser Antigene.
- Die oben beschriebenen Verfahren haben bestimmte wichtige Vorteile. Sie ermöglichen das Klonieren der Sm-B- und/oder Sm-B'-Antigene, um systemischen Lupus Erythematodes nachzuweisen. Sie ermöglichen auch die Reaktion dieser Antigene mit einer Serumprobe einer Person, um festzustellen, ob die Person von systemischen Lupus Erythematodes betroffen ist. Ein weiterer Antikörper mit einem Enzym kann eingeschlossen werden, um eine deutlich unterscheidbare Farbe zu ergeben, wenn der Antikörper von systemischen Lupus Erythematodes mit den Sm-B- und/oder Sm-B'- Antigenen (oder mit der Mischung aus den Sm-D- und Sm-B- und/oder Sm-B'-Antigenen) reagiert, um einen Antigen-Antikörperkomplex herzustellen, und der andere enzymverknüpfte Antikörper reagiert mit dem Antigen-Antikörper-Komplex und wird durch ein colorimetrisches Testverfahren der Aktivität des Enzyms nachgewiesen. Diese eindeutig unterscheidbare Farbe kann nachgewiesen werden, um anzuzeigen, daß die untersuchte Person von systemischen Lupus Erythematodes betroffen ist.
- Die oben beschriebenen Verfahren haben auch andere wichtige Vorteile. Da die Antigene nur die Sm-B- und/oder Sm-B'-Polypeptide (allein oder vermischt mit dem Sm-D-Antigen) sind, anstatt eines Komplexes, der das Sm-D-Polypeptid und eine Anzahl anderer störender Polypeptide und Proteine enthält, ist die Reaktion der Sm-B- und/oder Sm-B'-Polypeptide (oder der Mischung dieser Polypeptide mit dem Sm-D-Polypeptid) mit den Antikörpern von systemischen Lupus Erythematodes spezifischer und empfindlicher als die Reaktion solcher Komplexe mit solchen Antikörpern im Stand der Technik. Dies ist der Grund dafür, daß das Nachweisverfahren des Anmelders eindeutiger und sicherer ist, als die Untersuchungen der Komplexe des Standes der Technik.
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- 35. Billings, P.B. und S.O. Hoch. 1983. J. Immunol. 131:347.
Claims (21)
1. Ein rekombinantes Polypeptid, umfassend die folgende
Sequenz:
worin das rekombinante Polypeptid mindestens ein Epitop
umfaßt, das mit einem Anti-Sm-Antikörper reagieren kann.
2. Ein DNA-Fragment, umfassend eine Nukleotidsequenz,
die für das rekombinante Polypeptid von Anspruch 1
codiert.
3. Das DNA-Fragment von Anspruch 2, weiterhin umfassend
eine Nukleotidsequenz, die die Expression der Sequenz,
die für das rekombinante Polypeptid codiert, beeinflussen
kann.
4. Das DNA-Fragment nach Anspruch 3, worin die weitere
Nukleotidseguenz für einen Promotor codiert.
5. Das DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 2 bis 4,
worin das Fragment das Polypeptid von Anspruch 1 in einer
Wirtszelle exprimieren kann.
6. Ein Vektor, umfassend das DNA-Fragment nach einem der
Ansprüche 2 bis 5.
7. Der Vektor nach Anspruch 6, worin der Vektor eine
Wirtszelle transformieren kann.
8. Ein transformierter Wirt, umfassend das DNA-Fragment
nach einem der Ansprüche 2 bis 5.
9. Ein transformierter Wirt, umfassend den Vektor nach
Anspruch 7.
10. Der transformierte Wirt von Anspruch 9, worin der
Wirt das in dem Vektor enthaltene DNA-Fragment exprimieren
kann.
11. Ein Verfahren zum Herstellen des rekombinanten
Polypeptids von Anspruch 1, umfassend die Schritte des
(a) Isolierens eines natürlich vorkommenden Polypeptids,
das mit systemischem Lupus Erythematodes assoziiert
ist,
(b) Identifizierens der Aminosäureseguenz von mindestens
einem Teil des natürlich vorkommenden Polypeptids,
(c) Herstellens einer Nukleinsäureprobe, basierend auf
der in Schritt (b) identifizierten Aminosäuresequenz,
worin die Nukleinsäureprobe mit mindestens einem
Teil der DNA, die für das natürlich vorkommende
Polypeptid codiert, hybridisieren kann,
(d) Umsetzens der Nukleinsäureprobe mit einer DNA-Bank,
(e) Isolierens der DNA, die mit der Nukleinsäureprobe
reagiert, und
(f) Verwendens der isolierten DNA oder einer synthetischen
DNA, um das rekombinante Polypeptid herzustellen,
worin die synthetische DNA für das gleiche Polypeptid
codieren kann, wie die isolierte DNA,
worin das natürlich vorkommende Polypeptid gewählt wird aus
der Gruppe, bestehend aus Sm-B- und und Sm-B'-Polypeptiden.
12. Das Verfahren nach Anspruch 11, worin Schritt (a)
umfaßt
(i) Isolieren von snRNP aus Zellextrakten von
menschlichen Zellen durch
Immunaffinitätschromatographie
unter Verwendung von Antikörpern aus Serum einer
Person, die von Systemischem Lupus Erythematodes
betroffen ist, und
(ii) Isolieren des natürlich vorkommenden Polypeptids von
dem snRNP.
13. Verfahren nach Anspruch 11, worin Schritt (f) umfaßt
die Schritte des
(i) Einbringens der isolierten oder synthetischen DNA
in eine Wirtszelle, um einen transformierten Wirt
herzustellen, der das rekombinante Polypeptid
exprimieren kann, und
(ii) Propagierens des transformierten Wirts, um das
rekombinante Polypeptid herzustellen.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin Schritt (i) umfaßt
Einfügen der isolierten oder synthetischen DNA in ein
Plasmid, um einen Vektor herzustellen, der eine Wirtszelle
transformieren kann, und Transformieren der Wirtszelle
mit dem Vektor.
15. Ein Verfahren zum Herstellen des rekombinanten
Polypeptids von Anspruch 1, umrassend den Schritt des
Kultivierens des transformierten Wirts von Anspruch 10.
16. Ein Verfahren zum Testen einer Serumanalysenprobe eines
Lebewesens, um festzustellen, ob oder ob nicht das Lebewesen
von Systemischem Lupus Erythematodes betroffen ist,
umfassend die Schritte des
(a) Umsetzens des rekombinanten Polypeptids von Anspruch 1
mit der zu testenden Serumanalysenprobe, und
(b) Ermittelns der Anwesenheit oder Menge von in der
Analysenprobe enthaltenem Antikörper, der mit dem
Polypeptid reaktionsfähig ist.
17. Das Verfahren von Anspruch 16, worin in Schritt (b)
die Anwesenheit oder Menge von Antikörper ermittelt wird
durch Umsetzen der Mischung mit einem Anti-Immunglobulin-
Antikörper, der kovalent mit einem Enzymindikator verbunden
ist.
18. Das Verfahren nach Anspruch 17, worin der Enzymindikator
Lactoperoxidase/alkalische Phosphatase ist.
19. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, worin
in Schritt (a) das rekombinante Polypeptid auf einer
Testoberfläche absorbiert ist.
20. Ein Testkit für den Nachweis von Antikörpern, die mit
Systemischem Lupus Erythematodes assoziiert sind, umfassend
(a) das rekombinate Polypeptid von Anspruch 1,
(b) einen Antikörper, der gegen menschliches Immunglobulin
gerichtet ist, der mit einem Enzym verbunden ist, und
(c) ein Substrat, das mit dem Enzym reagieren kann, um eine
nachweisbare Reaktion zu bilden.
21. Der Testkit nach Anspruch 20, worin das Enzym
Lactoperoxidase oder alkalische phosphatase ist.
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