JPH01107151A - レーザ磁気免疫測定方法及び測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原抗体反応を利用したレーザ免疫測定方法お
よび測定装置に関する。さらに詳しくは、極めて微岳の
検体から特定の抗体または抗原を検出可能なレーザ免疫
測定方法および測定装置に関するものである。

〔従来技術とその問題点〕

エイズ、成人ＴＩ胞白血病等の新型ウィルス性疾病、な
らびに各種層の早期検査法として、抗原抗体反応を利用
した免疫測定法の開発が現在世界的規模で進められてい
る。これは、抗原であるウィルス等が生体に侵入した場
合に形成される抗体が、上記抗原と特異的に反応する性
質（抗原抗体反応）を利用して、抗体または抗原そのも
のを検出しようとするものである。このための微型免疫
測定法として、従来からＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ
）、ＥＩＡ（酵素イムノアッセイ）、ＦＩＡ（蛍光イム
ノアッセイ）等が実用化されてぎた。

これらの方法は、アイソトープ、酵素、蛍光体で標識さ
れた抗原または抗体を用い、これと特異的に反応する抗
体または抗原の有無を検出するものである。

このうちＲＩＡは、抗原抗体反応に寄与した検体の吊を
、標識化されたアイソトープの放射線Φを測定すること
により定量するものであり、現在のところ、ピコグラム
程度の超微量測定が唯一可能な方法である。しかし、Ｒ
ＩＡは放射性物質を取り扱わなければならないため、特
殊設備が必要であり、半減期や廃棄物処理等の点から、
使用時期、場所等の制約があった。また、酵素、蛍光体
を用いるジノ法では、発色や、発光を用いて抗原抗体反
応の有無を確認するものであるため、測定が半定ｍ的で
あり、検出限界もナノグラム程度であった。従って、Ｒ
ＩＡと同程度の検出感度を有し使用上の制限のない免疫
測定方法が求められていた。

抗原抗体反応の有無の検出にレーザ光を用いる方法どし
ては、肝臓癌の検出を目的として、グラスチックの微粒
子にＡＦＰ　（アルファ・フェト・プロティン）に対す
る抗体をつけ、抗原抗体反応に基づく該プラスブック同
士の凝集により生じた質量９化を、レーザー光の散乱ま
たは透過状態の変化から調べる方法が発表されている。

この方法では、検出感度は１０”Ｏであり、従来のレー
ＩＪ’−光を用いた方法の内借以上とされているが、Ｒ
ＩＡの感度の百分の一以下である。この方法は、水溶液
中での抗原抗体のブラウン運動の変化を利用しているた
め、測定に際しては、検体を含む水ＭＥ（０ｍ度制御を
精密に行う必要が−あり゛気温や振動等）外界の影響を
受は易い欠点があった。

１１゛従来のシー１Ｆ光の散乱測定は、検体が分散して
いる水溶液の一部分のみを照射するため・本質的１検出
感度向上には限界があり、多回の検体が必要であった。

このような事情から、従来よりＲＩＡに匹敵する検出感
度並びに精度を有し、実／＋ｆｍ上の制限のない免疫測
定方法及び測定装置の開発が望まれていた。

Ｃ問題点を解決するための手段〕 本発明の第１の発明に従うと、所定の抗原あるいは抗体
に磁性体微粒子を標識として付加した磁性体標識体と、
検体たる抗体あるいは抗原とを抗原抗体反応させる第１
工程と、該第１工程後の磁性体標識体と検体との複合体
である磁性体標識検体複合体を含む溶液に磁界を作用さ
せて該磁性体標識検体複合体を定められた位置に誘導・
濃縮させる第２の工程とを少なくとも含む、レーザ磁気
免疫測定方法において、磁性体標識検体複合体の存在す
る前記濃縮位置と、該磁性体標識検体複合体が存在しな
い溶液部の非濃縮位置にレーザ光を同時あるいは時系列
的に照射し、受光した該濃縮位置からの出射光と該非濃
縮位置からの出射光との差分を検出することを特徴とす
るレーザ磁気免疫測定方法が提供される。

また、本発明の第１の発明め−っの変形例に従うと、前
記第２工程は上方に開口を有する検体容器を用いて行わ
れ、該検体容器の下方に置かれた磁石と該磁石に対向し
て該検体容器の水面真上に置かれた磁石片によって誘導
・濃縮がなされ、前記検出工程が該磁極片直下の水面と
、該磁極片近傍の水面を同時あるいは時系列的に照射す
ることによって行われる。

さらに、本発明の第１の発明の別の変形例に従うと、前
記第２工程は細管状の検体容器を用いて行われ、該検体
容器の定められた１点の磁界が最大であって、該磁界の
最大点に向がって磁界が増大するように構成されている
磁石により誘導・濃縮がなされ、磁界が最大になる該検
体容器部と、その近傍の該検体容器部を同時あるいは時
系列的に照射することによって行われる。

前記検出工程において該検体からの出射光として、散乱
光、透過光、反射光、干渉光および回折光のいずれを選
んでもよい。

また、前記検出工程において、レーザ光を２つに分割す
ることにより同時照射を行なうことができる。

さらに、前記検出工程において、シー９光を前記濃縮位
置と非濃縮位置の間で走査することにより時系列的照射
を行なうこともできる。

この場合、レーザの走査周波数に同期した出射光を這択
的に検出することによって検体の定量を行なえば検出感
度を向上させることができる。

本発明の第２の発明に従うと、磁性体微粒子によって標
識された検体を収容する検体容器と、該検体容器内の１
点に磁性体標識検体複合体を誘導・濃縮する機構と、レ
ーザ光線を該検体容器へ導く入射光学系と、該磁性体標
識検体複合体並びに該ｒ４ｉ性体標識検体複合体を含ま
ない溶液からのし一ザ散乱あるいは透過あるいは反射あ
るいは干渉光あるいは回折光を受光する光学系と、を少
なくとも含むレーザ磁気免疫測定装置であって、傾斜磁
場発生装置と、ビームスプリッタ−あるいは偏向器を具
備してなることを特徴とするレーデ磁気免疫測定装置が
提供される。

本発明の第２の発明の好ましい変形例に従うと傾斜！！
場発生装置が、永久磁石又は電磁石と、該永久磁石又は
電磁石に対向して前記検体蓉器を挟むように設置された
磁極片とから構成されている。

また、本発明の第２の発明の別の変形例に従うと、前記
検体容器または前記永久磁石又は電磁石と、前記磁極片
のいずれかが、水平面内で移動可能となるように構成さ
れている。

磁性体標識検体複合体を外部磁力により溶液内部で駆動
する方法を採った場合、溶液の粘性抵抗のため外部磁力
への追従は自ずから限度がある。

従って、Ｓ／Ｎ比を向上させる目的で、該磁性体Ｉ！識
検体複合体からの出射光あるいは透過あるいは反射ある
いは干渉光を繰り返し加算・平均化処理する場合、測定
時間がかかる問題があったが、本発明においては磁性体
標識検体複合体からの信号に妨害となる検体以外からの
バックグランド雑音を排除し得るので、短時間で高Ｓ／
Ｎ比の測定が可能となる。

なお、本発明に用いられる磁性微粒子が放射線あるいは
毒性等の問題を有しないことはいうまでもなく、これを
利用することに格別の！１１約はない。

また、磁性体微粒子には、マグネタイトやγ−フェライ
ト等の各種化合物磁性体あるいは鉄、コバルト等の金腐
磁性体等種々の材料ににるものがあり、検体に対して安
定な標識物質を容易に選択することかできる。

本発明では、標識物質が磁性体であることを利用して、
標識物質、検体あるいは抗原抗体複合物質を磁力によっ
て選択的に操作することが出来る。

即ら、未反応の磁性体標識体を検体から分離除去したり
、磁性標識体との抗原抗体複合体を特定の位置に誘導し
あるいは濃縮することが容易である。

これら本発明によれば、同じレーザ光を利用しながら、
八ＦＰを利用した方法の限界を突破することが出来る。

また、このような構成は、単に検出感度の向上に寄与づ
るのみならず測定の自動化をも極めて容易にする。

以下に図面を参照して本発明をより具体的に詳述するが
、以下に示すものは本発明の一実施例に過ぎず、本発明
の技術的範囲を何等制限するものではない。

〔実施例１〕 第１図は本発明のレーザ磁気免疫測定装置の一例を示す
ものである。

図中符号１は検体容器、２は磁性体標識検体複合体、３
は傾斜磁界発生装置、４はレーザ光源、５はビームスプ
リッタ、６ａ及び６ｂは分割レーザ光線、７ａ及び７ｂ
は透過光または回折光、８ａ及び８ｂはＮＯフィルタ、
９ａ及び９ｂはフォトダイオード、１０ａ及び１０ｂは
散乱光束、１１ａ及び１１ｂはスリット、１２ａ及び１
２ｂは集光レンズ、１３ａ及び１３ｂは光電子増倍管、
１４ａ及び１４ｂは電子回路である。

垂直に配設された透明ガラスからなるシリンダ状の検体
容器１には、検体と磁性体標識体との間で抗原抗体反応
を行なった後の磁性体標識検体複合体２が収容されてい
る。検体の調製方法には、先に本発明者らが出願した特
願昭６１−２２４５６７．６１−２５４１６４に記載の
方法を適用できる。傾斜磁界発生装置３は鋭利な先端形
状をもつ一対の希土類磁石３ａ、３ａを前記検体容器を
挟むように、対向して設置してなるものである。

該磁石３ａ、３ａの先端部の検体容器側面の磁界が最も
高いために、磁性体標識検体複合体２はこの位置に誘η
・濃縮される。なお、磁界発生装置には、先に本発明者
らが出願した特願昭６２−１５２７９１に記載の電磁石
を用いることもできる。

また、検体容器１の側方には、Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源４
と該光源４から出射されるレーザ光を二つに分割するビ
ームスプリッタ５とが検体容器１に関し一方の側に適当
な入射角度を成すように設置されており、他方の側には
それぞれの分割レーザ光６ａ、６ｂに対応する透過光ま
たは回折光を検知づるためのフォトダイオードｇａ、ｇ
ｂが配置されている。又、別の位置にはスリット１１ａ
、１１ｂと集光レンズ１２ａ、１２ｂと光電子増倍管１
３ａ、１３ｂとから成る散乱光に対する二つの受光系が
それぞれ分割された入射光に対して配置されている。散
乱光受光系は好ましくは入射系に対して直角の散乱光を
受光できるように配置されている。二つのフォトダイオ
ード９ａ、９ｂおよび光電子増倍管１３ａ、１３ｂは得
られた出射信号の処理をするための電子回路１４ｂ、１
４ａにそれぞれ接続されている。

レーザ光源４からのレーザ光は、ビームスプリッタ５を
経て二つに分割されそれぞれ検体容器１の管壁を通して
磁性体標識検体複合体を含有する液体に入射される。な
お、入射光はシリンダ状の検体容器１の軸方向に直角に
入射されるのが好ましい。一方の分〃ル−プ光６ａは傾
斜磁界発生装置３により吸い寄せられて検体容器１内の
最大磁界点の近傍に集合した磁性体標識検体複合体の存
在する濃縮位置を通過して透過光または回折光として出
射される。また、他方の分割レーザ光６ｂは磁性体標識
検体複合体の存在しない非濃縮位置を通過して透過光ま
たは回折光として出射される。

これらの出射光はＮＤフィルタ８ａ、８ｂで適当に減光
調節された後、フォトダイオード９ａ、９ｂで受光され
、電子回路１４ｂによって信口の差分が検出される。

また、磁性体標識検体複合体の粒径が大きい場合、分割
レーザ光線６ａは回折されるので、回折光線を検出する
方法を用いることもできる。さらに、透過光、回折光を
検出する方法の他に、前記濃縮位置及び非濃縮位置から
の散乱光を用いることもできる。散乱光測定の場合は、
一方の分割レーザ光１１６ａは濃縮位置で散乱され、他
方の分割レーザ光線６ｂは非濃縮位置で散乱されてそれ
ぞれ散乱光束１０ａ、１０ｂとして出射され、これら散
乱光束１０ａ、１０ｂスリット１１ａ、１１ｂ及び集光
レンズ１２ａ、１２ｂによって光電子増倍管１３ａ、１
３ｂに導かれ、電子回路１４ａによって信号の差分が検
出される。

なお、レーデ光源としては、Ｈｃ　−Ｎ　ｅに限られる
ものではな（，１ｉｅ−Ｃｄレーザのように波長の短い
ものを用いれば、磁性体標識検体複合体が小さなものの
検出には感度が向上するため、特に有効である。

本実施例ではピコグラムオーダーの極微量な検体を瞬時
に検出することかできた。

〔実施例２〕 第２図は本発明のレーザ磁気免疫測定装置の他の例を示
すものである。

３ａは電磁石、３ｂは磁極片、８はＮＤフィルタ、９は
フォトダイオード、１０は散乱光束、１１はスリット、
１２は集光レンズ、１３は光電子増倍管、１５は偏向器
である。

上方に開口を有する検体容器１内には磁性体標識検体複
合体２が収容されている。そしてこの検体容器１は電磁
石（または永久磁石）３ａの上に直接または台を介して
水平方向移動可能に載置されており、検体容器１の真上
には磁性体標識検体複合体２を誘導・濃縮するための磁
極片３Ｃが載置されている。この磁極片３Ｃはそ゛の先
端が鋭利な形状となっていることから、上記電磁石３ｂ
からでた磁束が磁極片３ｂの先端に集中するようになっ
ている。従って、該磁極片３ｂ直下の水面の磁界が最も
高く、この部分に磁性体ｅｌ識検体複合体２が濃縮され
る。

上記のような磁極片３Ｃと上記電磁石３ｂとは傾斜磁界
発生装置３を構成している。なお、この装置３は、この
例に限定−されることな−く、電磁石の代わりに例えば
希土類磁石を用いた構成であってもよい。

また、検体容器１の上方には、例えばＨｅ−Ｈｅレーザ
光源４と該光源４から出射されるレーザ光６ａ、６ｂの
方向を変えるＴｅＯ２を用いた音響光学素子からなる偏
向器１５とが磁極片３Ｃに関し一方の側に適当な入射角
度を成すように設置されており、他方の側には反射光、
干渉光、または回折光を検知するｋめのフォトダイオー
ド９が配置されている。又、別の位置には散乱光に対す
るスリット１１と集光レンズ１２と光電子増倍管１３と
からなる受光系が配置されている。なお、散乱光が微弱
である場合は、フォトカウンティング型の光電子増信管
を用いるのがよい。

レーザ光源４からの入射光６ａ、ｅｂは偏向器１５を経
て検体容器１の液面に対してそれぞれ３０°の角度で磁
極片３Ｃの真下またはその近傍の水面に入射せしめられ
、磁極片３Ｃにより吸い寄せられて水面近傍に集合した
磁性体４！！識検体複合体２の存在する領域で散乱光、
反射光、干渉光または回折光として出射される。これら
出射光はフォトダイオード９または光電子増倍管１３で
検知される。この場合、レーザ光は偏向ム１５により偏
向されて液面上を走査され磁性体標識検体複合体２の密
に集合した濃縮位置と磁性体４！識検体複合体２が存在
しない非濃縮位置との間を経時的に照射することによっ
て、該濃縮位ｎと非濃縮位置からの出射光信号はそれぞ
れフォトダイオード９または光電子増倍管１３により検
知された該濃縮位置からの信号と該非濃縮位置からの信
号との差分が公知の手段により検出される。なお、反射
光、干渉光を検出する方法の他に、散乱光を検出する方
法も適用できる。この場合は、濃縮された磁性体標識検
体複合体及び磁性体標識検体複合体の存在しない水面か
らの反射光を時系列的に１台の光電子僧侶管１３によっ
て検出する方法が適用できる。

実施例１と同様に、本実施例においてもピコグラムオー
ダーの極微量な検体を１秒以内の瞬時に検出することか
できた。

この例のレーザ磁気免疫測定装置を用いて、磁性超微粒
子を標識したインフルエンザウィルスの検出を試みた結
果、従来の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の場合、１億個程
度ウィルスが存在しなければ検出できなかったのに対し
て、本発明の方法では１０個程度のウィルスでも検出す
ることが明らかになった。

〔発明の効果〕

以上詳述のように、本発明に従うレーザ磁気免疫測定方
法及びｇｉ置によれば、標識物質として磁性微粒子を用
いた場合に最も特徴を発揮でき、極めて短時間のうちに
ＲｒＡ法に匹敵する超高感度な抗原抗体反応検査を実施
出来る。従って、従来は限定された施設でＲＩＡ法によ
らな【ブれば実施できなかった精密な測定を、−殻内な
環境で広〈実施することが可能となる。例えば集団検診
等のような一般的な状況で、各種のウィルス、癌等のス
クリーニング検査等の精密な測定が広〈実施できれば、
癌あるいはウィルス性疾患等のり期診断が可能となり、
有効な早期治療を的確に実施することが可能となる。ま
た、本発明に従うレーザ磁気免疫測定方法及び装置は、
抗原抗体反応のみに止まらず、従来ＲＩＡ法が適用され
ていたペプチドホルモン等の種々のホルモンあるいは種
々の酵素、ビタミン、薬剤などの測定にも応用すること
も可能である。このように、本発明が医学・医癲の分野
で果たす効果は計り知れない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のレーザ磁気免疫測定装置の一例を示
す概略構成図、第２図は、本発明のレーザ磁気免疫測定
装置の他の例を示づ概略構成図である。 １・・・検体容器、２・・・磁性体標識検体複合体、３
・・・傾斜磁界発生装置、４・・・レーザ光源、５・・
・ビームスプリッタ、 ６ａ及び６ｂ・・・分割レーザ線、 ７ａ及び７ｂ・・・・・・透過光または回折光、８ａ及
び８ｂ・・・・・・ＮＤフィルタ。 ９ａ及び９ｂ・・・・・・フォトダイオード、１０ａ及
び１０ｂ・・・・・・散乱光束、１１ａ及び１１ｂ・・
・・・・スリット、１２ａ及び１２ｂ・・・・・・集光
レンズ、１３ａ及び１３ｂ・・・・・・光電子増倍管、
１４ａ及び１４ｂ・・・・・パ電子回路、１５・・・偏
向器。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）所定の抗原あるいは抗体に磁性体微粒子を標識と
   して付加した磁性体標識体と、検体たる抗体あるいは抗
   原とを抗原抗体反応させる第１工程と、該第１工程後の
   磁性体標識体と検体との複合体である磁性体標識検体複
   合体を含む溶液に磁界を作用させて該磁性体標識検体複
   合体を定められた位置に誘導・濃縮させる第２の工程と
   を少なくとも含む、レーザ磁気免疫測定方法において、 磁性体標識検体複合体の存在する前記濃縮位置と、該磁
   性体標識検体複合体が存在しない溶液部の非濃縮位置に
   レーザ光を同時あるいは時系列的に照射し、受光した該
   濃縮位置からの出射光と該非濃縮位置からの出射光との
   差分を検出することを特徴とするレーザ磁気免疫測定方
   法。
2. （２）前記第２工程が上方に開口を有する検体容器を用
   いて行われ、該検体容器の下方に置かれた磁石と該磁石
   に対向して該検体容器の水面真上に置かれた磁極片によ
   って誘導・濃縮がなされ、前記検出工程が該磁極片直下
   の液面と、該磁極片近傍の液面を同時あるいは時系列的
   に照射することによつて行われることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載のレーザ磁気免疫測定方法。
3. （３）前記第２工程が細管状の検体容器を用いて行われ
   、該検体容器の定められた１点の磁界が最大であつて、
   該磁界の最大点に向かつて磁界が増大するように構成さ
   れている磁石により誘導・濃縮がなされ、磁界が最大に
   なる該検体容器部と、その近傍の該検体容器部を同時あ
   るいは時系列的に照射することによつて行われることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載のレーザ磁気免疫
   測定方法。
4. （４）前記検出工程が該検体からの散乱光又は透過光又
   は反射光又は干渉光又は回折光を検出することによりな
   されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のレ
   ーザ磁気免疫測定方法。
5. （５）前記検出工程において、レーザ光を２つに分割す
   ることにより同時照射がなされることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載のレーザ磁気免疫測定方法。
6. （６）前記検出工程において、レーザ光線を前記濃縮位
   置と非濃縮位置の間で走査することにより時系列的照射
   がなされることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   のレーザ磁気免疫測定方法。
7. （７）前記検出工程において、検体の定量がレーザ光の
   走査周波数に同期した信号を選択的に検出することによ
   ってなされることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載のレーザ磁気免疫測定方法。
8. （８）磁性体超微粒子によって標識された検体を収容す
   る検体容器と、該検体容器内の１点に磁性体標識体を誘
   導・濃縮する機構と、レーザ光線を該検体容器へ導く入
   射光学系と、該検体並びに該検体を含まない溶液からの
   出射光を受光する光学系と、を少なくとも含むレーザ磁
   気免疫測定装置であつて、 傾斜磁場発生装置と、ビームスプリッターあるいは偏向
   器を具備してなることを特徴とするレーザ磁気免疫測定
   装置。
9. （９）前記傾斜磁場発生装置が、永久磁石又は電磁石と
   、該永久磁石又は電磁石に対向して前記検体容器を挟む
   ように設置された磁極片とから構成されていることを特
   徴とする特許請求の範囲第８項記載のレーザ磁気免疫測
   定装置。
10. （１０）前記検体容器または前記永久磁石又は電磁石と
    、前記磁極片のいずれかが、水平面内で移動可能とされ
    たことを特徴とする特許請求の範囲第８項記載のレーザ
    磁気免疫測定装置。