JPH01105164A - 蛋白質またはペプチド配列決定方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は蛋白質またはペプチド配列決定用の装置及び方
法に関する。特に、本発明はペプチド配列決定器用の連
続流反応器に関し、且つこのような反応器が使用される
配列決定方法及び装置に関する。

従来の技術 実用の自動化ペプチド配列決定は、１９６７年の液相ス
ピニングカップ配列決定器の導入から始まシ、この配列
決定器（以下、配列器と略記する）に於いて反応は回転
反応セルの内壁に形成される薄い液膜中で進行する。Ｅ
ｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　１巻８０〜９１頁（１９６７年）のＥｄｍ
ａｎ　Ｍ　Ｐ−及びＢｅｇｇ、Ｇ、著”蛋白質配列決定
器（ａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎａｔｏｒ）”参
照のこと。スピニングカップ配列器に関連する焦点の問
題は、特に短かいペプチドの、試料損失である。別の固
相分解法は、ペプチドが共有結合的に、または吸着によ
り付着されるマクロポーラスなポリスチレンマトリック
スまたは好ましくは多孔性のガラスピーズの如き多孔性
物質が充填されたカラム中を適切なプログラムで試薬及
び溶媒を通すことを伴なう。別の公知の型の自動配列器
に於いて、分解すべきペプチドは管状反応室内に含まれ
るゲル型の固相支持体に共有結合される０反応室及び反
応室を配列器に連結する管の両者は、ガラスまたはポリ
テトラフルオロエチレン、例えばテフロンから形成され
てもよい。ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０巻８９〜１０２頁（１９
７１年）のＬａｕｒｓｅｎ　ｍ　Ｒ，Ａ、著６固相ペプ
チド配列器（ａ　５ｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄ
ｅ　５ｅｑｕｅｎａｔｏｒ　）”及びニュージャーシイ
、−クリ７トンの７マナ・ブレス（ＨｕｍａｎａＰｒｅ
ｓｓ　）　の５ｈｉｖｅｌｙ著”蛋白質の特性決定法（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈａｒａｃ
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）”９章（１９８６年）参照のこ
と。

エドマン（Ｅｄｍａｎ　）分解に於いて臨界点で液相試
薬に代えて気相試薬を用いる配列器が１９８１年に提案
された。Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５６巻７９９０〜７９
９７ｍ（１９８１年）のＨｅｗｉｃｋ　、　Ｒ，Ｍ、　
ｓ　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ　ｓＭ、　Ｗ、。

Ｈｏｏｄ　、　Ｌ、　Ｅ　、　Ｄｒｅｙｅｒ　、　Ｗ、
　Ｊ、著”気−液固相ペプチド及び蛋白質配列器（ａ　
Ｇａｓ　−ＬｉｑｕｉｄＳｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎａｔ
ｏｒ　）”、米国特許第４，６０３，１１４号及び５ｈ
ｉｖｅｌｙ　著の上記文献、８章、６１４節。

２２９頁を参照のこと。この装置はペプチド試料が多孔
性ガラス繊維ディスク上に担持された重合体の四級アン
モニウム塩の薄膜中に分散物として存在する小型の連続
流反応室を収容する二つの部分のガラスカートリッジ組
立体を含む。試料が負荷される毎に上記カートリッジを
その取付基材から分離する手段が設けられている。この
カートリッジはその入口端部及び出口端部でテフロン管
により配列器に連結されている。

上記のＨｅｗｉｃｋ　　配列器の修正がＡｎａｌｙｔｉ
ｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１４７巻３１５〜３
３０頁（１９８５年）にＨａｗｋｅ　、　Ｈａ　ｒ　ｒ
　ｉｓ及び５ｈｉｖｅｌｙ　によυ。

及び５ｈｉｖｅｌｙ　の上記文献７章２１０頁以下に記
載されている。この修正はＨｅｗｉｃｋのガラス反応器
カートリッジを同様の設計の全テフロン製カートリッジ
に置換したもので、かくして全テフロン製の送出及び反
応系を与える。試料はトリメチルシリル化されたガラス
繊維ディスク上の反応室内に存在する。ハウク（Ｈａｗ
ｋｅ　）等は、テフロンが自己シール性であることに留
意し、低いバックグラウンド水準及び増大された収率は
、ヘビツク（Ｈｅｗｉ　ｃｋ　）　　ガラスカートリッ
ジに観察されるシールに較べ全テフロン設計に於いて達
成される一層良好なシールの結果として得られるものと
考えられると報告している。シルベリイの文献２１７頁
を参照のこと。

スピニングカップ、カラム、またはカートリツジの機能
を果たすことができる形態に容易に変換するための相互
変換可能な装置で構成された多目的配列器が記載されて
いる。配列器に取り付けるためのテフロン管入口及び出
口導管を有する、ペプチドが結合されたガラス支持物体
が充填されたポリフルオロクロロ（Ｋｅｌ−Ｆ）ミクロ
カラム装置が提供される。シルベリイの上記文献２４９
頁以下を参照のこと。

発明の要約 本発明は、アミノ酸、副生成物、及び試薬の蓄積が最小
にされる、非押退は量（ｕｎｓｗｅｐｔｖｏｌｕｍｅ　
）が実質的にない安価な連続流反応器カラムを提供する
。上記反応器は安価である。新しくて汚染のない反応器
の使用は配列器への容易な挿入及び取りはずしにより容
易にされる。

上記反応器は化学的に不活性な合成樹脂管から形成され
る。比較的大きい内径のこのような管部分を含む反応室
は、適当な寸法の干渉嵌合された入口及び出口管が°設
けられている。本発明の好ましい態様に於いて、上記反
応器はテフロン管から形成される。反応器は別個の物品
、例えば多孔性のガラスピーズ、または配列決定される
蛋白質もしくはペプチドで被覆されたポリスチレンの如
き多孔性の合成樹脂で満たされてもよい。このようなバ
ッキングを使用する場合、多孔性の支持部材、好ましく
はテフロンが設けられてもよい。本発明の別の態様に従
って、上記試料は蛋白質が接着するポリビニルジフルオ
リド（ＰＶＤＦ）の如き疎水性膜により支持されてもよ
い。上記の疎水性膜は、１，５−ジメチル−１，５−ジ
アザウンデカメチレン、ポリメソプロミド、またはポリ
（Ｎ、Ｎ−ジメチル−６，５−ジメチレン）ピペリジニ
ウムクロリドの如き重合体の四級アンモニウム塩で任意
に被覆されてもよい。このような製品はアルドリッヒ・
ケミカル・カンバニイ（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　）から商品名ポリプレン（Ｐｏｌ
ｙｂｒｅｎｅ）として入手し得る。

本発明の新規な特徴は、添付図面と併せて以下の記載か
ら一層容易に理解されよう。尚１図面に於いて相当する
構成部品は、種々の図面をとおして同じ参照番号で示さ
れている。

発明の詳細な説明 本発明の連続流反応器は第１図に示されており、図中反
応器は参照番号１０で一般に示されている。

連続流反応器１０は１反応管１４及び干渉嵌合された供
給、排出管１２及び１６を含む。管１２゜１４及び１６
の夫々は、ポリテトラフルオロエチレンの如き自己潤滑
性フルオロカーボンから形成される。多くのフルオロカ
ーボンが入手し得る。

例えば、グアノ・ノストランド・レインホルドカンパニ
イ（Ｖａｎ　Ｎｏ５ｔｒａｎｄ　Ｒｅ１ｎｈｏｌｄ　Ｃ
ｏ、　）のＰｌａｓｔｉｃｓ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　６０〜６２頁（１９７６年）を参
照のこと。

管１２及び１６は、夫々実質的に同じ大きさであっても
よく、反応管１４は管１２及び１６よシも大きくてもよ
い。例えば、管１２及び１６は約１／１６（０，０６２
５）インチの外径を有してもよい。

反応管１４は、約１／１６（０，０６２５）インチの内
径及び約１／８（０，１２５）インチの外径を有しても
よい。反応管１４の内径は、管１２及び１６の外径よシ
もわずかに小さい大きさにされている。

これらの大きさの関係によって、管１２と管１６の間に
干渉嵌合またはプレス嵌めによって漏れ止め継手が与え
られる。

また、排出管１６は一層大きくて第１図に示すような反
応管１４の内側に代えて外側にプレス嵌めを与えるよう
な寸法にされていてもよい。このようにして非押込は量
のない反応帯域が与えられる。

ディスクの如き、多孔性の支持部材１８は、反応管１４
の内側に堅固に嵌合される。好ましくは、支持部材１８
は、第１図に示される態様のように管１６の上端部の位
置付辺に配置される。支持部材１８は、流体の通過を可
能にしかつ反応管１４の上部に詰められたビーズの如き
別個の物体２０を保持するのに必要な多孔度を有してい
る。支持部材１８は化学的に不活性な合成樹脂、好まし
くはフルオロカーボンから形成される。例えば、支持部
材１８は、反応管１４の内径よシもわずかに大きい円形
ディスクを与えるように１４−ゲージニードルによりポ
リテトラフルオロエチレンカットからつくることができ
る。このディスクは反応管１４中に圧締めすることがで
き、反応管に於いてディスクは得られるプレス嵌めによ
り所望の位置に保持される。

有用な支持部材１８は、商品名ジテックス（ＺＩＴＥＸ
）として販売される合成樹脂物質から形成されてもよい
。この物質は、超微細、微細、及び中間の如き種々の多
孔度で、ニューシャーシー、ワイン、デイロード１５０
のツートン・ケムプラスト（Ｎｏｒｔｏｎ　Ｃｈｅｍｐ
ｌａｓｔ　）を含む多くの供給者から人手し得る。これ
らの種々の多孔度の全てを備えた材料は、連続流反応器
１０中で満足に使用することができる。

反応管１４は、別個の物体２０で詰められるのが適切で
ある。好ましくは、別個の物体は多孔性シリカ、微孔性
のガラスピーズ、または巨大綱状のポリスチレンの如き
多孔性物質からつくられる。

別個の物体は不ぞろいであってもよく、あるいは球形で
あってもよい。不ぞろいで多孔性の形態を有する好適な
別個の物体は、ニュージャーシイ、フェアフィールド、
パサイック街５６８のエレクトローヌクレオニクス（Ｅ
ｌｅｃｔｒｏ　−Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ　）から入手し
得る。好ましい不ぞろいの別個の物体は、１２０＾〜２
００λのメツシュサイズ及び約６７９＾の孔径を有して
いる。この規格を満足するシリカバッキング物質はマサ
テユーセッツ、ミルフォード、メープルストリート３４
のミリボア・コーボレーシａ　ノ（Ｍｔｌｌｉｐｏｒｅ
　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のウォーターズークロマト
グラフィ・デビジョン（Ｗａｔｅｒｓ　Ｃｈｒｏｍａｔ
’ｏｇｒａｐｙＤｉｖｉｓｉｏｎ）　　からＧＣボラシ
イルズ（Ｐｏｒａｓｉｌｓ　）　Ｂ及びＣとして入手し
得る。Ｗａｔｅｒｓ　５ｏｕｒｃｅｂｏｏｋ　ｆｏｒＣ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｃｏｌｕｍｎｓ　ａｎｄ
　５ｕｐｐｌｉｅｓ”（１９８６年）参照のこと。

約１００μ〜３００μの直径を有する球形の別個の物体
が好ましい。このような球形の物体は、反応室１４中に
詰められると、流体が実質的に非線形の通路に沿って流
れ捕捉されずに排出されることを確実にする間隙を与え
る。更に、非線形流路の提供は複数の異なる大きさの球
形の物体を含むバッキングの使用により容易になる。例
えば、１００μ〜３００μの範囲の異なる直径の球形粒
子の混合物が適当である。

また、オクタデシルシリカ及びオクチルシリカの如きシ
リカ誘導体が別個の物体２０として使用することができ
、或種のペプチドまたは蛋白質の配列決定に好ましいこ
とがある。逆相高性能液体クロマトグラフィーとして現
在入手し得る種々のその他のシリカ誘導体が使用し得る
。このような誘導体は本発明の反応器中で使用するため
に特別に調製、製造されてもよく、また購入されてもよ
い。ウォーターズＧＣボラシルズＢ及びＣ並びにウォー
ターズＧＣポンダパック（Ｂｏｎｄａｐａｃｋ）Ｃ１８
物質がシリカ誘導体の調製の出発原料として使用し得る
。

別個の物体は、配列決定すべきペプチド２２（第２図参
照のこと）で被覆されてもよい。例えば、１μｆ以下の
ペプチドが各１ｒｎｇの別個の物体にあてがわれてもよ
い。特別の場合に於いて、１〜３μｍの鯨精子アポミオ
グロビンが５〜１０■の別個の物体に添加されてもよい
。

ペプチド試料の大きさは、純度、分子の大きさ及び測定
すべきアミノ酸残渣の所望の数に依存する。それは０．
１〜１０ピコモル程度に少なくすることができる。一般
に、１０〜２０ｒｖの別個の物体が０．１〜１０，００
０　　ピコモルの試料を与えるのに適当である。しかし
ながら、このような物体の必要量は成る用途には１０倍
程度の多量まで変化してもよい。

また、物体及びペプチド２２の両者に親和性のあるポリ
プレンの如き第一被覆材２４（第６図参照のこと）が適
用される。多孔性の別個の物体が用いられる場合、ポリ
ブレン被覆物が特に適切である。好ましくは、別個の物
体２０の１１ｎｇ当り少くとも１■のポリブレンが適用
される。しかしながら、ポリプレンの量は約５０４以上
あるいは約５０４以下に変化してもよい。

ポリプレンの如き重合体の四級アンモニウム塩は、別個
の物体２０が連続流反応器中に置かれる前または後に適
用してもよい。第１図の１４で示される反応管（約３（
ｍの長さであってもよい）の場合、約０．５〜１．０α
の長さの別個の物体の床が適切であり、かくして５〜１
０■のシリカを与える。ついで１００　ｒｎ９／ｍｌの
ポリプレン溶液約５ｆｉ１が反応管中の別個の物体に適
用される。

反応管の外側で適用される場合、別個の物体の表面を完
全に湿らすのに充分な・量のポリブレン等が好ましい。

例えば、約１０ｍｇのシリカを与える別個の物体か、あ
るいは約６０■／　ｍｌを含有するポリプレ／溶液が適
当である。

第４図は、クロージヤ一部材２６が入口管１２の端部付
辺の位置で反応管１４中に配置されることを示す。これ
は支持部材１８と同様に構成されてもよい。これは反応
管１４の頂部を囲い別個の物体２０を閉じ込める。

第５図は、ハウケ（Ｈａｗｋｅ　）　（１９８５年）に
示されるようなカートリッジ反応室及び本発明の連続流
反応器１０で得られるサイクル１〜４．７゜９．１０及
び１２に於ける鯨精子アポミオグロビンの配列決定の結
果の比較を与えるクロマトグラムを示す。

第５図の上側のパネルＡ〜Ｈは、ハウケ（１９８５年）
により記載されているようなポリテトラフルオロエチレ
ンからつくられたカートリッジ反応管を用いる２００ピ
コモルの鯨精子アポミオグロビンの配列決定のエドマン
分解サイクルを示す。試料が適用し得る前に、反応室中
のガラス繊維ディスクをポリプレン（１■）で被覆し、
ディスクをエドマン化学処理の２回の４５分サイクルに
予備サイクルする必要があった。

カートリッジ反応室から得られたアミノ酸誘導体は、ハ
ウケ（１９８５年）と同様の方法により逆相高性能クロ
マトグラフィて分析された。

第５図の下側のパネルＡ′〜Ｈ′は、先行技術のカート
リッジ反応室について上記したのと同じ配列決定装置に
連結された本発明の連続流反応器を用い鯨精子アポミオ
グロビンの８０ピコモルの試験から得られたクロマトグ
ラムである。上記誘導体のクロマトグラフィ分析は同様
の方法及び同様の減衰セツティングで行なった。

第５図のパネルに於いて、ＤＥＡ及びＤＰＴＵとラベル
した大きなオフスケールのピークはエドマン化学処理に
観察される通常のバックグラウンドピークである。ＤＥ
Ａピークはジエチルアミン（ＤＥＡ）のフェニルチオカ
ルバミル誘導体、痕跡混入物のトリエチルアミン（ＴＥ
Ａ）である。

ＤＰＴＵピークはジフェニルチオウレアであり。

これはフェニルイソテオシアネー）　（ＰＩＴＣ）とＰ
ＩＴＣの塩基触媒による分解により形成されるアニリン
との反応により形成される。

これらのピークと少数の一層小さな未同定ピークは、フ
ェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸誘導体の同
定を妨害するバックグラウンドノイズを構成する。各サ
イクルに於いて、単一文字でラベルしたピークは、次の
指定に相当する。

■＝バリン、Ｌ＝ロイシン、Ｓ＝セリン（Ｓ′＝セリ／
の分解生成物）、Ｅ＝グルタミン酸、Ｗ＝ニトリブトフ
ァン及びＨ＝ヒスチン。”　ｓｔｄ”とラベルしたピー
クは内部標準（アミノイン酪酸のＰＨＴ誘導体）である
。パネルに於いて０中にラベルしたピークは前のサイク
ルからのキャリオーバーシグナルである。クロマトグラ
ム上のその出現は通常のことである。

たとえ鯨精子アポミオグロビンの量の５０４以下が連続
流反応器１０で配列決定されたとしても、カー）　ＩＪ
ッジ反応室を用いて得られた結果に比べて充分な感度が
ある。これは、例えばパネルＡ及びＡ′中のバリン（Ｖ
）のシグナルまたはパネルＢ及ヒＢ′中のロイシン（Ｌ
）のジグネルを比較することによりわかる。

相当な感度に加えて、改良されたシグナル対ノイズの比
が反応器１０により与えられる。この改良されたシグナ
ル対ノイズの比は、パネルＡ及びＡ′中のＤＥＡ、Ｖ及
びＤＰＴＵのシグナル強度を比較することにより直接的
に明らかである。パネルＡに於いて、ＤＥＡ及びＤＰＴ
Ｕのバックグラウンドノイズシグナルのシグナル強度は
必要とされる指定のＶのシグナル強度よりも太きい。こ
のシグナル強度の関係はパネルＡ′では逆になっておリ
、このパネルには連続流反応器１０を用いた結果が示さ
れている。このような改良されたシグナル対ノイズの比
は、全てのパネルに繰り返される。

本発明の連続流反応器１０は、少量の試料の配列決定を
かなり容易にする。加えて、この試料はポリプレンの添
加後に予備サイクルせずに直接分析され、従って時間の
節約になった。

本発明の連続流反応器の第二の態様が第６図及び第７図
の６２に示される。この反応器６２は、反応管６４、干
渉嵌合されたアダプターキャップ６６、及び供給、排出
管１２及び１６が干渉嵌合されるアダプタープラグ６８
を含む。反応管３４゜アダプターギャップ６６、アダプ
タープラグ３８、供給、排出管１２及び１６の夫々は、
化学的に不活性な柔軟な合成樹脂物質、好ましくは自己
潤滑性のフルオロカーボン、例えばポリテトラフルオロ
エチレンから形成される。

漏れ止め継手は反応管６４とアダプターキャップ６６と
の間及びアダプタープラグ６８と供給。

排出管１２及び１６との間の密な干渉嵌合またはプレス
嵌めにより与えられる。この干渉嵌合部分は面取シして
組立を容易にすることができる。アダプターキャップ３
６とアダプタープラグ６８との間の嵌合は、アダプター
プラグ６８の外表面が接するアダプターキャップ６６の
内表面が円錐形になるようにつくることができる。これ
らの表面は粗面にしてもよく、その結果摩擦接触が増大
されて反応管５４と管１２及び１６との間の漏れ止め継
手の破損を防止する。

連続流反応器の第三の態様４０が第８図及び第９図に示
される。これはアダプター１ラグ４４及び供給、排出管
１２及び１６を備えた反応管４２を含む。第二の態様の
アダプターキャップ３６は、アダプタープラグ４４とか
み合うための反応管４２の端部にある円錐形表面で置換
されている。

漏れ止め継手を与えるため、反応器４０の全ての部分は
、化学的に不活性な柔軟な合成樹脂物質、例えばポリテ
トラフルオロエチレンから形成されることが好ましい。

ディスクの如き多孔性の支持部材１８は１反応管３４（
第三の態様、第６図及び第７図参照のこと）及び４２（
第三の態様、第８図及び第９図参照のこと）の内側に堅
固に嵌合されている。支持部材１８は、使用される場合
、好ましくは反応管６４及び４２の内（＋’ｌに位置さ
れて供給、排出管１２及び１６と反応管６４及び４２と
の間の干渉嵌合として約４ｍの長さを与える。第６図及
び第８図に夫々示されるように、支持部材１８は流体の
通過を可能にし、しかも反応管６４及び４２中に詰めら
れたビーズの如き別個の物体２０を保持するのに必要な
多孔度を有している。

連続流反応器４０は、反応性流体、例えばＮ−末端配列
決定のためのエドマン試薬またはＣ−末端配列決定のた
めのスターク試薬を導入する装置（配列器）に管１２に
より連結される。

ミクロ配列決定分析のための充分な純度の低ピコモル範
囲の蛋白質の単離は継続の問題であった。

一つの長く必要とされた到達点はゲル、特にナトリウム
、ドデシルスルフェート（ＳＤＳ）ゲルカラ単離された
試料の配列決定である。ＳＤＳゲルから陽電荷されたガ
ラス繊維紙へ試料を電気プロッティングする方法が提案
された。

検子は、Ｊ、　Ｂｉｏｉ　Ｃｈｅｍ、　２６２巻１００
３５〜１００３８（１９８７年）に於いて、ＳＤＳゲル
からコマシイブルーで染色されたＰＶＤＦへ電気転送さ
れＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｔｅｍ　］ＶＩｏｄｅ
ｌ　４７０配列器によるミクロ配列分析に直接かけられ
た蛋白試料の高収率を報告している。染色バンドは切断
され。

テフロンカートリッジシール上の中央に集められ配列器
中に置かれた。米国特許第４６０３１１４号の第５図を
参照のこと。

小さいＰＤＶＦストリップにより運ばれる蛋白質のミク
ロ配列分析は、このようなカートリッジ系のミクロ配列
決定器に関し特異な問題を呈する。

この試料は二つ以上のストリップ上に存在しているよう
である。検子が説明するようにカートリッジシールを横
切って膜ストリップを置くことが必要である。ス）　Ｉ
Ｊツブが移動するか、あるいは試薬もしくは溶媒の流れ
がス）　ＩＪツブを横切って一様でないならば、貧弱な
、ま次は再生不能な化学処理が起こるようである。

これらの問題は、本発明の第四の態様により解消される
。この態様に従って、配列決定すべき蛋白質またはペプ
チドはＰＶＤＦま九は同様の疎水性の膜上に置かれ、膜
は例えばコマシイブルーで染色され、本発明の連続流反
応器に挿入する念め薄く伸ばされたストリップに切断さ
れる。非多孔性の支持部材１８が用いられる。配列決定
は試料が別個の多孔性物体により運ばれる時と同様の方
法で行なわれる。

第１０図は、複数の試料を支持するＰＶＤＦストリップ
４６を含む反応管１４に干渉嵌合された供給、排出管１
２及び１６を含む連続流反応器４５を示す。管１２及び
１６の管１４への挿入の深さは、好ましくはストリップ
４６の長さと相関関係にあシ管端部とストリップ端部と
の間の間隙を最小にする。

第１１図及び第１２図は、試料を支持するＰＶＤＦスト
リップを用いるための好ましい反応器設計４７を示す。

第１１図に示された反応管４８は一般に凸の内表面４９
がその各端部に設けられ、内表面４９は第１２図に示さ
れるように供給または排出管を支持するキャップ５１の
一般に凹の外表面５０とかみ合う。

反応管４８の内径はその中央部分の長さ５２にわたって
減少され、かくして管４８内に上部及び下部の肩部５６
及び５４を与える。試料を支持するストリップ４６は減
小された内径の管４８の部分に置かれる。好ましくはこ
のようなストリップの長さは、減小された内径の管４８
の部分５２の長さと類似する。

同様に供給、排出管を支持するキャップ５１（第１２図
参照のこと）は、外側に輪郭されて反応管４８の各端部
で湾曲内表面４９の各々と沿れ止め嵌合を実質的に与え
る。

第１２図に示すように、同様の供給または排出管５６は
キャップ５１の夫々により運ばれる。夫々の供給または
排出管５６の外表面は１反応器４７中に挿入される管端
部で管５６をわずかに越えて伸び得る対向する隆起のプ
レーナー表面要素５７が設けられている。キャップ５６
を反応管４８に挿入する際、これらの隆起プレーナー要
素５７の端部５７は肩部５３及び５４に対して設置する
。

本発明は、特に蛋白質またはペプチドがＰＶＤＦ及び同
様の疎水性の膜ス）　＋Ｊツブから配列決定される時に
使用される米国特許第４７０４２５６号に記載された型
の装置を含む種々の型の自動化配列決定器用の連続流反
応器及び関連の供給、排出管を含む。従って、本発明は
、反応器の長さ方向の軸に平行に位置された伸ばされた
ＰＶＤＦまたは同様の試料を支持するストリップを受容
するための実質的に円筒形の反応器を含む。従って、こ
のような反応器及び関連の供給、排出管は所望の化学的
に不活性なプラスチック、例えばポリエチレンまたはポ
リプロピレンから加工されてもよい。

特に第１０図、第１１図及び第１２図に示される形態の
反応器に於いて、構成部品は第１図に関して記載された
反応管１４及び供給、排出管１２及び１６について記載
されたものと同じ樹脂物質からつくられ、干渉嵌合によ
り組立てられる。

ペプチドが、例えば吸着により接着し、配列器の化学処
理に安定である多孔性の疎水性膜が使用し得る。ＰＶＤ
Ｆ膜が好ましい。ＰＶＤＦ膜は、マサテユセッツ、ベツ
ドフォードのミリボアコーポレーションから商品名”イ
モピロンＰＶＤＦ　）ランスフプーメ／プレン（Ｉｍｍ
ｏｂｉｌｏｎ　ＰＶＤＦ７註） ｔｒａｎｓｊｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　）　　　　とし
て、０．４５　ｉｔｍを含む種々の孔径、及び種々の厚
さで入手し得る。

註）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４巻２７２頁（１
９８６年）のプルスカル（Ｐｌｕｓｋａｌ　）等著”　
ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＴＭＰ　ＶＤ　Ｆ　　Ｔｒａｎｓイ
ｅｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　：　Ａ　ＮｅｗＭｅｍｂｒａ
ｎｅ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　ｆｏｒ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　
Ｂｌｏｔｔｉｎｇｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”参照のこと
。

ＰＶＤＦ膜は高表面積及び疎水性相互作用により吸着さ
れた蛋白質の強い保留を与える調節された開放多孔性構
造を有している。ＰＶＤＦ膜の化学構造は安定性及び配
列決定処理に対する耐性を提供する。

また本発明は一部ポリブレンの如き重合体の四級アンモ
ニウム塩から、及び一部ＰＶＤＦから形成される膜を含
む。約２５重量係〜約７５重ｉ％、好ましくは約５０重
量係のポリプレン等を含むＰＶＤＦ−ポリブレン組成物
が、このような膜の形成に好適である。

本発明の方法の好ましい実施に於いて、蛋白質またはペ
プチド試料はＳＤＳゲル、例えば８％ゲルまたは１２係
ゲルからＰＶＤＦ膜へ電気転送される。通常の電気転送
技術が有用である。１０分の短かい転送時間でさえも５
０Ｖ（５００ｍＡ）で５０〜５０憾程度の転送収率が観
察された。転送収率は２５〜５０　Ｖ　（３００ｍＡ　
）の電圧設定を用い、膜の複数の層、例えば二層を加え
、膜をメタノールまたはアクリロニトリルで予め湿らす
ことにより改良し得る。

好ましい操作はポリブレンが被覆されたＰＶＤＦ膜また
は組合せられたポリプレン−ＰＶＤＦの膜への転送を伴
う。１２％ＳＤＳゲルの２５〜１００ピコモルの試料の
範囲で、ラクトグロブリン、オバルプミン及びボビン血
清アルブミンの最適転送時間は約１００分である。約８
０憾〜約９５憾の転送効率が得られる。実際の値は試料
の関数である。−層長い転送時間が回収を減少すること
が観察された。

試料は、膜上で直接コマシイブルーにより染色されても
よい。ポリプレンの不在下で、バックグラウンド染色が
観察されない。ポリプレンの存在下で、−様なバックグ
ラウンドが観察されるが、試料の検出を妨害しない。

好ましくは染色後に、ＰＶＤＦ膜に転送された試料は、
円筒形反応器への便利な挿入のため、幅約０．０５〜２
　ｍｓ、長さ約１〜５ｃｌｒＬのストリップに切断され
る。

実施例１ β−ラクトグロブリン標準物をシグマ・ケミカ／Ｌ／−
カンパニイ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐ
ａｎｙ　）から入手し工　を用いて放射ヨウ素化した。

放射線ラベルした蛋白質は、遠心分離されたゲル透過ク
ロマトグラフにより遊離ヨウ素から分離された。

ヨウ素化した蛋白質の特別の活性は、０．０２〜０、０
３１１ｃｉ　／μｆ　の範囲であった。ラベル化試料を
非ラベル化試料と混合して蛋白質１００ピコモル当り１
００，０００Ｃｐｍ　　を得た。

ＰＶＤＦ膜をポリプレ／（メタノール／水（１／１）中
１０　ｍ９７ｍ１　）　　で１〜２秒間処理し、空気乾
燥しメタノールですすいだ。二層のポリプレン処理ＰＶ
ＤＦ膜をメタノールで湿らし、１２憾ＳＤＳゲルから試
料を転送するための電気転送装置に適用した。この転送
は３００　ｍＡで２５〜６０Ｖの電圧設定で約１００分
間行なった。転送収率は９０〜９５憾であった。５０ピ
コモル、２０ピコモル及び１０ピコモルの試料を調製し
た。

上記の試料を支持するＰＶＤＦをコマシイブルーで染色
し、複数の１〜１．５　ｗａのストリップ４６に切断し
、これらを第１０図に示される連続流反応器の反応管１
４中に挿入した。配列決定は一般に第５図に関して記載
した方法で行なった。初期収率は５０〜６０優であり、
反覆収率は９１〜９４壬の範囲であった。染色したＰＶ
ＤＦストリップからは、バックグランドビークは殆どあ
るいは全く観察されなかった。

実施例２及び３ 試料としてβ−ラクトグロブリンに代、ｔてオバルプミ
ン及びボビン血清アルブミンを用いて実施例１を繰シ返
した。同様の結果が観察された。電気転送の効率はオバ
ルプミンについて９０〜９５憾であり、ボビン血清アル
ブミンについて８０〜９０％であった。

ボビン血清アルブミンについては、５０ピコモルの試料
からの初期収率は約２０係であり、反覆収率は約９４憾
〜約９９係の範囲であった。

本発明の連続流反応器は重要な利点を有している。これ
らの反応器は、 （１）安価であり、使い捨てであり、組み立てが簡単で
あり、配列決定器に設置、取シはずしが容易である。こ
れらの特徴は、一連の反応器を予め仕込みひき続いて必
要な配列決定器に挿入することを可能にする。

（２１物質が蓄積し得る。非押退は量、すなわち流体で
フラッジされない容量を殆どもたない。本質的には、反
応器の長さにわたって蒸気及び流体に対し漏れ止めシー
ルが与えられる。この特徴は副生物または配列決定され
たペプチドから単離された逐次アミノ酸の蓄積を最小に
し、それ故ペプチドからの逐次アミノ酸のクロマトグラ
ム同定を妨害し得るバックグラウンドを最小にする。

（３）アミノ酸または副生物が捕捉、蓄積される表面を
殆どもたないか、あるいはもつとしてもわずかである。

これらは、捕捉、蓄積されると、後に流れに浸出しても
どジペプチドからのアミノ酸誘導体の逐次単離に於いて
バックグラウンドシグナルを生ずるであろう。

（４）反応管、例えば管１４中に配置される別個の物体
２０は、逆相高性能液体クロマトグラフィー技術に使用
されるのと類似の方法で試料濃縮器として使用し得る。

連続流反応器、例えば反応器１０は、高性能液体クロマ
トグラフィー技術並びにエドマン及びスターク化学処理
技術と適合し得る。連続流反応器１０中の別個の物体２
０は、既存のカートリッジ技術の特徴よりも明らかに優
れた、良好な物質移動特性を与える。

本発明の上記検討及び関連の説明は主として本発明の好
ましい態様及び実施に関する。しかしながら、本明細書
中に記載された概念の実際の履行に於いて多くの変形及
び修正が当業者に明らかであると考えられ、このような
変形及び修正は特許請求の範囲に記載された本発明の範
囲から逸脱せずになし得るものと解される。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明の一態様を構成する連続流反応器の部
分断面正面図である。 第２図は、第１図に示された連続流反応器に使用される
一つの被覆物を備えた別個の物体の断面平面図である。 第６図は第１図に示された連続流反応器に使用される二
つの被覆物を備えた別個の物体１例えばガラスピーズの
断面平面図である。 第４図は、第１図に示された本発明の別の態様を構成す
る連続流反応器の部分断面正面図である。 第５図は、本発明の連続流反応器及び先行技術のカート
リッジ反応器を用いて得られたクロマトグラムの比較組
である。 第６図は、本発明の第二の態様を構成する連続流反応器
の部分断面正面図である。 第７図は、第６図に示された連続流反応器の分解図であ
る。 第８図は１本発明の第三の態様を構成する連続流反応器
の部分断面平面図である。 第９図は、第８図に示された連続流反応器の分解図であ
る。 第１０図は、ポリビニルジフルオリド（ＰＶＤＦ）の如
き疎水性の蛋白質またはペプチドを支持する膜のストリ
ップを収容するように設計された本発明の第四の態様の
断面図である。 第１１図は、配列決定すべき蛋白質またはペプチドを支
持するＰＶＤＦまたは等個物の膜を使用するための別の
形態の連続流反応器の断面平面図である。 第１２図は、第１２図に示された反応器用の入口（供給
）または出口（排出）管を支持するキャップの断面図で
ある。 手続補正書（放 昭和６３年１１月ｆ日 特許庁長官　　　吉　１）文　毅　　殿２、発明の名称 蛋白質またはペプチド配列決定方法及び装置３、補正を
する者 事件との関係　　出　願　人 住所 名　称　　シティ・オブ・ホープ ４、代理人 住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新人手
町ビル　２０６区 ５、補＋Ｅ命令の日付　　昭和６３年　９月２７日　（
発送旧）６、補正の対象

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（Ａ）柔軟な化学的に不活性な管から形成された反
   応室、 （Ｂ）上記反応室を配列決定器に連結する第一及び第二
   の柔軟な化学的に不活性な管、 （Ｃ）上記反応室管及び上記の第一及び第二連結管の内
   径及び外径は、管の一端部を別の管の端部に挿入するこ
   とにより二つの漏れ止めの干渉嵌合継手が設けられるよ
   うな寸法であり、該漏れ止めの干渉嵌合継手の一つが該
   第一管と該反応室との間に設けられており、該継手の他
   の一つが該第二管と該反応室との間に設けられているこ
   と、を含むことを特徴とする、ペプチド配列決定器から
   の反応流体及び溶媒をペプチドが被覆された別個の物体
   が充填された反応室に通す第一管と反応室から溶媒及び
   反応生成物を除去する第二管とを含む連続流反応器。 ２、上記反応室管及び夫々の第一及び第二連結管がフル
   オロカーボンポリマーから形成される請求項１記載の連
   続流反応器。 ３、上記の反応室管及び夫々の第一及び第二の連結管が
   ポリテトラフルオロエチレンから形成される請求項１記
   載の連続流反応器。 ４、上記反応室に充填される別個のペプチドが被覆され
   た物体はペプチドが被覆された多孔性のシリカ物体であ
   る請求項１記載の連続流反応器。 ５、該物体はペプチドが被覆された多孔性のシリカビー
   ズである請求項４記載の連続流反応器。 ６、上記反応室管は該室に充填される別個の物品のため
   の多孔性支持手段が設けられている請求項１記載の連続
   流反応器。 ７、上記反応室管及び上記の第一及び第二の連結管の内
   径及び外径は、上記の第一及び第二の連結管が反応室管
   内に干渉嵌合されるような寸法である請求項１記載の連
   続流反応器。 ８、上記の第一連結管及び反応室管の内径及び外径は第
   一連結管が反応室内に干渉嵌合されるような寸法であり
   、且つ上記の反応室管及び第二連結管の内径及び外径は
   反応室管が第二連結管内に干渉嵌合されるような寸法で
   あって非押退け量のない反応室を与える請求項１記載の
   連続流反応器。 ９、（Ａ）柔軟な化学的に不活性な管から形成された反
   応室、 （Ｂ）上記反応室を配列決定器に連結する第一及び第二
   の柔軟な化学的に不活性な管、 （Ｃ）上記の反応室管及び第一及び第二の連結管の内径
   及び外径は、管の一端部を別の管の端部に挿入すること
   により二つの漏れ止めの干渉嵌合継手が設けられるよう
   な寸法であり、該漏れ止めの干渉嵌合継手の一つが該第
   一管と該反応室との間に設けられており、該継手の他の
   一つが該第二管と該反応室との間に設けられていること
   、該反応室がペプチド試料を支持する少くとも一つの疎
   水性膜のストリップを含み、該ストリップは該円筒形の
   反応室内にその長さ方向の軸が該室の長さ方向の軸に実
   質的に平行となるように位置されていること を含むことを特徴とするペプチド配列決定器用の連続流
   反応器。 １０、試料を支持するポリビニルジフルオリドの少くと
   も一つのストリップが該反応室内に含まれる請求項９記
   載の反応器。 １１、上記の試料を支持するポリビニルジフルオリドス
   トリップがコマシイブルーで染色される請求項１０記載
   の連続流反応器。 １２、上記の試料を支持するポリビニルジフルオリドス
   トリップが重合体の四級アンモニウム塩で被覆される請
   求項１０記載の連続流反応器。 １３、蛋白質試料をその上に吸着させる開放多孔性の構
   造の合成樹脂膜の少くとも一つのストリップを含有し、
   該樹脂膜が配列決定化学処理に耐性であり、該ストリッ
   プの長さ方向の軸が円筒形反応室の長さ方向の軸に実質
   的に平向である、蛋白質またはペプチド配列決定器用の
   円筒形反応室。 １４、上記樹脂膜がポリビニルジフルオリド膜である請
   求項１３記載の反応室。 １５、上記樹脂膜がポリビニルジフルオリドと重合体の
   四級アンモニウム塩との組合せを含む請求項１３記載の
   反応室。 １６、（１）蛋白質またはペプチドの混合物をゲル電気
   泳動により分割し、 （２）該ゲル上に単離された蛋白質またはペプチド試料
   を、該試料が吸着される開放多孔性の構造の疎水性合成
   樹脂膜に移し、 （３）該膜に吸着された該試料を染色し、 （４）上記の膜を上記の染色された試料の部分を支持す
   るストリップに分割し、 （５）該ストリップの少くとも一つを請求項１３記載の
   配列決定器反応室中に置き、 （６）上記反応室を配列決定器中に置き、ついで （７）上記試料を配列分析にかける ことを含むことを特徴とする方法。 １７、上記ゲルがドデシル硫酸ナトリウムゲルであり、
   上記の合成樹脂膜がポリビニルジフルオリド膜であり、
   上記試料がコマシイブルーで染色される請求項１６記載
   の方法。 １８、上記の膜がポリビニルジフルオリドと重合体の四
   級アンモニウム塩との組合せから形成される請求項１７
   記載の方法。 １９、伸びた本体部材、 該本体部材中の流体の流れ用の長さ方向の通路、凹形の
   外表面を有するキャップ部材を収容するための凸形の表
   面を有する該通路の少くとも一つの端部、 該通路の中央部分の内壁が隆起しており、これにより該
   部分の通路の直径が減少されていること、及び 該キャップ部材により運ばれる入口もしくは出口管の端
   部と接するための該通路中の該隆起部分の一端にある肩
   部分 を含むことを特徴とする蛋白質またはペプチド配列決定
   器用の反応器。 ２０、流体流路を有するキャップ部材を少くとも一端に
   備えており、且つ該反応器の凸形内表面と嵌合する凹形
   外表面をもつプラグ及び該流体流路中に位置される入口
   もしくは出口管を含み、該管はその外表面上に少くとも
   一つの長さ方向に伸びる隆起要素を有しており、その結
   果該キャップが該反応器中に挿入されると該隆起要素の
   挿入された端部が該反応器の流体流路の内壁上の肩部分
   と接する、請求項１９記載の反応器。