JP7846626B2 - 大型遺伝子ベクターならびにその送達および使用の方法 - Google Patents

大型遺伝子ベクターならびにその送達および使用の方法

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Description

関連出願の相互参照
このPCT国際出願は、事実上参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、2020年2月7日に出願された米国仮出願第62/971,555号に基づく恩典および優先権を主張する。
背景
聴覚消失は、先進国または工業国における最も一般的な神経障害のうちの1つであり、世界中で4億6,600万人を超える症例を占める、最も有病率の高い感音障害である。非症候性難聴または非症候性遺伝性難聴は、他の徴候または症状と関連しない聴覚消失である。非症候性難聴には、DFNA（常染色体優性）、DFNB（常染色体劣性）、DFNX（X連鎖性）、およびミトコンドリア性の4種類の非症候性難聴がある。16番目に記載された常染色体劣性型の非症候性難聴DFNB16は、ステレオシリンとして公知の細胞外構造タンパク質をコードするSTRC遺伝子の変異によって引き起こされる一遺伝子性、非症候性、劣性の聴覚消失である。内耳におけるSTRCの正常な発現は、聴覚機能のために必須である。内耳の感覚有毛細胞の頂面にある修飾された微絨毛の上部に見出されるステレオシリンは、内耳の特殊な細胞から突出する不動毛として公知の毛様構造に関連している。STRCの変異は、中等度から重度の聴覚消失を引き起こし、米国で推定およそ50,000人の患者に影響を与えており、従って、遺伝子治療のための魅力的な候補である。ステレオシリンは、微絨毛の凝集束を維持し、その束を内耳の蝸牛にある上層蓋膜に繋げるよう機能する。世界的な統計は、DFNB16が、特に中等度の聴覚障害を有する者において、遺伝性難聴の相当の割合を占めることを示唆している。Partners Laboratory of Molecular Medicineからのデータに基づくと、ボストンにおいて試験された遺伝性聴覚消失患者の19％が、STRCの変異を有しており、従って、それは、遺伝性聴覚消失の2番目に一般的な型であり、内耳の感覚有毛細胞に影響を与える最も一般的な型である。約40の異なる変異（主に、劣性）が、STRC遺伝子において同定されており、その大部分が、欠陥ステレオシリンの合成をもたらすか、またはその合成を完全に妨げる。正常STRCタンパク質の欠如は、適切な音誘発刺激のために必要な上層蓋膜から感覚毛束を分離する。DFNB16患者は、中等度から重度の聴覚消失を有し、典型的には、補聴器または人工内耳によって処置される。しかしながら、現在、DFNB16聴覚消失のための生物学的処置は存在しない。
AAVは、遺伝性障害の遺伝子治療処置のための魅力的なベクターシステムを提供する。安全性を考慮した、これらおよび遺伝子送達。組換えAAV（rAAV）は、非病原性複製欠損ウイルスに由来し、その宿主細胞に対して非細胞傷害性である。さらに、rAAVは、末端逆位反復（ITR）を除く全てのウイルスDNA配列を欠き、さらなる安全特性を提示する。ITRは、AAVのDNA複製、パッケージング、染色体組み込み、およびプロウイルスレスキューのために必要である。AAVベクターは、例えば、内耳細胞において、効果的なトランスジーンの送達および持続発現のための強力なツールであることも証明されている。しかしながら、内耳機能のために重要な多くのタンパク質は、AAVベクターの積荷容量（およそ4.5kB）を超える、例えば、STRCの積荷容量（およそ5.8kB）を超える、コード配列を有する。従って、遺伝子治療の効果的な型としての、大きい（例えば、4kBより大きい）遺伝子によってコードされるタンパク質の送達および発現の方法、それらのいずれかの構築物およびベクターが、必要とされている。
概要
従って、遺伝子変異に罹患している対象を処置するための、大きい（例えば、4kBより大きい）遺伝子のための遺伝子治療を提供することが、本開示の目的である。遺伝子治療は、例えば、DFNB16聴覚消失を有する子供および成人における聴覚の防止および/または回復を可能にし得る。
ベクターのサイズ制限を克服する、大きい遺伝子配列（例えば、4kBより大きいもの；STRC）を送達する方法、ならびに大きい遺伝子配列を送達するためのベクターおよび構築物を提供することが、もう1つの目的である。
1つの局面は、細胞において関心対象のタンパク質を発現させるためのベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）を提供し、ここで、二重ベクターシステムは、
（a）5'から3'の方向に、
- 関心対象のタンパク質のアミノ末端（N末端）部分をコードする部分コード配列の5'末端にある、シグナル配列（例えば、SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:11）；
- 関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、N-STRC；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16）をコードする部分コード配列；
- 部分コード配列の下流に隣接する、スプライスドナー配列をコードする配列（例えば、スプリットインテイン-Nとしても公知のインテインのN末端断片（N-インテイン）；SEQ ID NO:14をコードするSEQ ID NO:13）
を含む第1のヌクレオチド配列（例えば、SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7）を含む、第1のベクター、および
（b）5'から3'の方向に、
- 関心対象のタンパク質のカルボキシ末端（C末端）部分をコードする部分コード配列の5'末端にある、シグナル配列（例えば、SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:11）；
- スプライスアクセプター配列をコードする配列（例えば、スプリットインテイン-Cとしても公知のインテインのC末端断片（C-インテイン）；SEQ ID NO:22をコードするSEQ ID NO:21）であって、スプライスアクセプター配列が、シグナル配列と関心対象のタンパク質のC末端部分をコードする部分コード配列とに挟まれている、スプライスアクセプター配列をコードする配列；
- 関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、C-STRC；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24）をコードする部分コード配列
を含む第2のヌクレオチド配列（例えば、SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19）を含む、第2のベクター
を含む。
もう1つの局面は、細胞において関心対象のタンパク質を発現させるための二重ベクターシステムであって、
（a）5'から3'の方向に、
- 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
- プロモーター配列；
- プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、シグナル配列；
- 関心対象のタンパク質のアミノ末端（N末端）部分（例えば、N-STRC）をコードする部分コード配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、部分コード配列；
- インテインのアミノ末端断片（N-インテイン）をコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、N-インテインをコードする配列；
- ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；
- 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
を含む第1のヌクレオチド配列を含む、第1のベクター、および
（b）5'から3'の方向に、
- 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
- プロモーター配列；
- プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、シグナル配列；
- インテインのカルボキシ末端断片（C-インテイン）をコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、C-インテインをコードする配列；
- 関心対象のタンパク質のカルボキシ末端（C末端）部分（例えば、C-STRC）をコードする部分コード配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、部分コード配列；
- ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；
- 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
を含む第2のヌクレオチド配列を含む、第2のベクター
を含む、二重ベクターシステムを提供する。
二重ベクターシステムのもう1つの局面において、第1のベクターおよび第2のベクターは、細胞において、
（a）N末端からC末端の方向に、
- シグナルペプチド配列であって、関心対象のタンパク質配列（例えば、STRC）のN末端部分に連結されており、関心対象のタンパク質配列がそのC末端においてN-インテインタンパク質配列に融合している、シグナルペプチド配列
を含む、第1のタンパク質配列、および
（b）N末端からC末端の方向に、
- シグナルペプチド配列であって、C-インテインタンパク質配列に連結されており、C-インテインタンパク質配列が関心対象のタンパク質配列（例えば、STRC）のC末端部分のN末端に融合している、シグナルペプチド配列
を含む、第2のタンパク質配列
をそれぞれ発現する。
さらにもう1つの局面において、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、N-STRC）および関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、C-STRC）は、関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC）を形成する。いくつかの局面において、第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列は、同じであるか、もしくは異なっており、または第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列は、第1のタンパク質配列および第2のタンパク質配列を同じ細胞コンパートメントに輸送するように構成されている。さらなる局面は、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:11と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含み、SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:12と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチド配列をコードするシグナル配列に関することができる。他の局面は、ウイルスベクターであり得るベクター（例えば、第1のベクターおよび第2のベクター）を提供し、ここで、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターまたはレンチウイルスであり得る。1つの局面は、同じ、または異なる血清型を有するウイルスベクターに関することができる。二重ベクターシステムのもう1つの局面は、関心対象のタンパク質のインテイン媒介トランススプライシングを提供し、ここで、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、N-STRC）および関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、C-STRC）は、ペプチド結合を通して、関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC）を形成することができ、ここで、関心対象のタンパク質は、STRC遺伝子によってコードされるSTRCタンパク質であり得る。関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、N-STRC；ヒトSEQ ID NO:15またはマウスSEQ ID NO:16）をコードするヌクレオチド配列は、関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:25もしくはSEQ ID NO:26）のN末端部分の少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）もしくは54％未満（例えば、53％、52％、51％、50％、45％、43％、41％）、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:25もしくはSEQ ID NO:26）のN末端部分との54％未満の同一性、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:25もしくはSEQ ID NO:26）のN末端部分の54％未満の長さを有する、関心対象のアミノ酸配列（例えば、STRC；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16）をコードする、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、STRC；SEQ ID NO:5またはSEQ ID NO:7）と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含む。もう1つの局面は、関心対象の全長タンパク質（例えば、SEQ ID NO:25もしくはSEQ ID NO:26）のN末端部分の41％以上（例えば、42％、43％、44％、45％、50％、51％、52％、53％）、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、SEQ ID NO:25もしくはSEQ ID NO:26）のN末端部分との41％以上の同一性、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、SEQ ID NO:25もしくはSEQ ID NO:26）のN末端部分の41％以上の長さを有するアミノ酸配列を含む、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分を提供する。
さらなる局面は、所望のシグナルペプチド配列（例えば、SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:12）と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチド配列をコードする、所望のシグナル配列（例えば、SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:11）と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を有するシグナル配列を含むヌクレオチド配列を提供する。
さらにもう1つの局面は、所望のN-インテインアミノ酸配列（例えば、SEQ ID NO:14）と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する所望のN-インテインアミノ酸配列をコードする、所望のN-インテインヌクレオチド配列（例えば、SEQ ID NO:13）と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含む所望のN-インテイン配列を提供し得る。さらなる局面は、所望のC-インテインアミノ酸配列（例えば、SEQ ID NO:22）と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する所望のC-インテインアミノ酸配列をコードする、所望のC-インテインヌクレオチド配列（例えば、SEQ ID NO:21）と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含む所望のC-インテイン配列に関することができる。
本開示の二重ベクターシステムのさらにもう1つの局面において、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のC末端部分は、関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26）のC末端部分の少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）もしくは46％以上、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26）のC末端部分との46％以上の同一性、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26）のC末端部分の46％以上の長さを有する、関心対象のアミノ酸配列（例えば、STRC；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24）をコードする、ヌクレオチド配列（例えば、STRC；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19）と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含み得る。もう1つの局面は、関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26）のC末端部分との60％以下の同一性、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26）のC末端部分の60％以下の長さを有するアミノ酸配列を含む、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のC末端部分を提供し得る。
さらなる局面は、宿主細胞においてSTRC遺伝子のコード配列を発現させるためのベクターシステムを提供することができ、ここで、コード配列は、例えば、ヒトSTRC：SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:30またはマウスSTRC：SEQ ID NO:3もしくはSEQ ID NO:32のSTRCヌクレオチドコード配列を含む少なくとも1つのベクターを含み、STRCヌクレオチドコード配列は、例えば、SEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:4もしくはSEQ ID NO:26のSTRCタンパク質をコードする。もう1つの局面は、所望の全長タンパク質をコードするヌクレオチド配列に関することができ、ここで、ヌクレオチド配列は、例えば、所望のタンパク質、例えば、ヒトSTRC：SEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:25またはマウスSTRC：SEQ ID NO:4もしくはSEQ ID NO:26をコードする、ヒトSTRC：SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:33またはマウスSTRC：SEQ ID NO:3もしくはSEQ ID NO:39を含む。
本明細書に記載された宿主細胞においてSTRC遺伝子のコード配列を発現させるための二重ベクターシステムを含むベクターシステムの1つの局面であって、二重ベクターシステムが、関心対象の所望の核酸配列（例えば、SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7）と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する所望の核酸配列を含む第1のヌクレオチド配列を含む第1のベクターを提供する、局面。1つの局面において、第1のベクター（例えば、プラスミド、トランスプライシング（transplicing）プラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルス、AAV、AAVゲノム）は、5'から3'の方向に、部分コード配列の5'末端にある、シグナル配列（例えば、SEQ ID NO:10をコードするSEQ ID NO:9；またはSEQ ID NO:12をコードするSEQ ID NO:11）（部分コード配列は、スプライスドナー配列をコードする下流配列（例えば、N末端インテイン（スプリットインテイン-Nとしても公知のN-インテイン）；SEQ ID NO:14をコードするSEQ ID NO:13）と隣接していてよい）；関心対象のタンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16）のアミノ末端（N末端）部分をコードする部分コード配列：を含む第1のヌクレオチド配列（例えば、SEQ ID NO:6をコードするSEQ ID NO:5；SEQ ID NO:8をコードするSEQ ID NO:7）を含む。もう1つの局面は、関心対象のタンパク質のN末端部分を含み、シグナル配列および所望のN-インテインタンパク質をコードする配列も含有し、末端逆位反復（ITR）、プロモーター、およびポリアデニル化（ポリA）配列も含有する第1のヌクレオチド配列を含む。第1のヌクレオチド配列は、所望のアミノ酸配列（例えば、SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:16）または関心対象の全長アミノ酸配列（例えば、SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26）と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する関心対象のアミノ酸配列をコードし得る。
本開示の二重ベクターシステムのもう1つの局面は、関心対象の所望の核酸配列（例えば、SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19）と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する所望の核酸配列の残りの部分を含む第2のヌクレオチド配列も提供する。1つの局面において、第2のベクター、例えば、プラスミド、トランスプライシングプラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルス、AAV、AAVゲノムは、5'から3'の方向に、シグナル配列（例えば、SEQ ID NO:10をコードするSEQ ID NO:9；またはSEQ ID NO:12をコードするSEQ ID NO:11）が、スプライスアクセプター配列（例えば、C末端インテイン（C-インテイン）；SEQ ID NO:22をコードするSEQ ID NO:21）の上流にあってよく、それが、関心対象のタンパク質の全長コード配列の残りの部分、即ち、関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、STRC；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24）をコードする下流の部分コード配列に直接隣接しているものを含む、第2のヌクレオチド配列（例えば、SEQ ID NO:18をコードするSEQ ID NO:17；SEQ ID NO:20をコードするSEQ ID NO:19）を含む。もう1つの局面は、関心対象のタンパク質のC末端部分、シグナル配列をコードする配列、および所望のC-インテインタンパク質をコードする配列を含み、末端逆位反復（ITR）、プロモーター、およびポリアデニル化（ポリA）配列も含む第2のヌクレオチド配列を含む。いくつかの局面において、第2のヌクレオチド配列は、リンカー配列およびmycタグ配列も含有し得る。第2のヌクレオチド配列は、所望のアミノ酸配列（例えば、SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24）または関心対象の全長アミノ酸配列（例えば、SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26）と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。
他の局面は、所望の遺伝子またはその所望のタンパク質（例えば、STRCタンパク質）を送達するための本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）を含有する細胞または宿主細胞を提供し得る。
さらなる局面は、所望の遺伝子またはその所望のタンパク質（例えば、STRCタンパク質）を送達するための本開示のベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）と、薬学的に許容される媒体（例えば、希釈剤、賦形剤）とを含む薬学的組成物に関することができる。
もう1つの局面において、本開示のベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）の有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む、疾患または状態の遺伝子変異に罹患している対象における疾患または状態を処置する方法であって、所望の野生型遺伝子もしくは矯正された遺伝子または所望の野生型タンパク質もしくは矯正されたタンパク質（例えば、STRC）を、同遺伝子の遺伝子変異によって引き起こされる疾患または状態に罹患している対象へ送達し、それによって、対象における疾患または状態を処置する方法。さらにもう1つの局面は、所望の野生型遺伝子もしくは矯正された遺伝子または所望の野生型タンパク質もしくは矯正されたタンパク質（例えば、STRC）を送達する、本明細書に記載された二重ベクターシステムの有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む、常染色体劣性聴覚消失に罹患している対象における疾患または状態を処置する方法を提供する。所望の遺伝子またはその所望のタンパク質（例えば、STRCタンパク質）を送達するための本明細書に記載された二重ベクターシステムを含有する細胞または宿主細胞または（薬学的に許容される媒体（例えば、希釈剤、賦形剤）を含む）薬学的組成物を、それを必要とする対象へ投与することを含む、対象における常染色体劣性聴覚消失を処置する方法。もう1つの局面は、常染色体劣性聴覚消失DFNB16を提供し得る。
1つの局面において、本開示の方法は、所望の遺伝子またはその所望のタンパク質（例えば、STRCタンパク質）を送達するための本開示のベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）と、薬学的に許容される媒体（例えば、希釈剤、賦形剤）とを含む組成物と、対象の細胞を接触させることを含み得、ここで、接触は、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列の細胞への送達をもたらし、細胞は、所望の全長タンパク質が形成されるようペプチド結合によって接続される所望のタンパク質のN末端部分および所望のタンパク質のC末端部分を発現し得る。もう1つの局面は、所望の遺伝子もしくはその所望のタンパク質（例えば、STRCタンパク質）を送達するための本明細書に記載された二重ベクターシステム、または本明細書に記載された二重ベクターシステムを含有する細胞もしくは（薬学的に許容される媒体（例えば、希釈剤、賦形剤）を含む）薬学的組成物の有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む、聴覚消失を特徴とする病理または疾患の処置および/または防止の方法を提供する。いくつかの局面において、細胞は、耳の内耳細胞、内有毛細胞、または外有毛細胞であってよく、ここで、細胞、または細胞へ投与する方法は、インビボ、エクスビボ、および/またはインビトロであり得る。本明細書に記載された方法のいずれかが、対象における聴覚機能の改善または回復をもたらす、本開示のさらなる局面。
本開示の他の特色および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
[本発明1001]
細胞において関心対象のタンパク質を発現させるための二重ベクターシステムであって、
（a）5'から3'の方向に、
- 関心対象のタンパク質のアミノ末端（N末端）部分をコードする部分コード配列の5'末端にある、シグナル配列；
- 関心対象のタンパク質のN末端部分をコードする部分コード配列；
- 部分コード配列の下流に隣接している、インテインのアミノカルボキシ末端断片（N-インテイン）をコードする配列
を含む第1のヌクレオチド配列を含む、第1のベクター、および
（b）5'から3'の方向に、
- 関心対象のタンパク質のカルボキシ末端（C末端）部分をコードする部分コード配列の5'末端にある、シグナル配列；
- インテインのカルボキシ末端断片（C-インテイン）をコードする配列であって、C-インテインが、シグナル配列と関心対象のタンパク質のC末端部分をコードする部分コード配列とに挟まれている、C-インテインをコードする配列；
- 関心対象のタンパク質のC末端部分をコードする部分コード配列
を含む第2のヌクレオチド配列を含む、第2のベクター
を含む、二重ベクターシステム。
[本発明1002]
二重ベクターシステムであって、
（a）5'から3'の方向に、
- 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
- プロモーター配列；
- プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、シグナル配列；
- 関心対象のタンパク質のアミノ末端（N末端）部分をコードする部分コード配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、部分コード配列；
- スプリットインテイン-Nをコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、スプリットインテイン-Nをコードする配列；
- ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；
- 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
を含む第1のヌクレオチド配列を含む、第1のベクター、および
（b）5'から3'の方向に、
- 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
- プロモーター配列；
- プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、シグナル配列；
- スプリットインテイン-Cをコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、スプリットインテイン-Cをコードする配列；
- 関心対象のタンパク質のカルボキシ末端（C末端）部分をコードする部分コード配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、部分コード配列；
- ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；
- 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
を含む第2のヌクレオチド配列を含む、第2のベクター
を含む、二重ベクターシステム。
[本発明1003]
第1のベクターおよび第2のベクターが、細胞において、
（a）N末端からC末端の方向に、
- シグナルペプチド配列であって、関心対象のタンパク質配列のN末端部分に連結されており、関心対象のタンパク質配列がそのC末端においてN-インテインタンパク質配列に融合している、シグナルペプチド配列
を含む、第1のタンパク質配列、および
（b）N末端からC末端の方向に、
- シグナルペプチド配列であって、C-インテインタンパク質配列に連結されており、C-インテインタンパク質配列が関心対象のタンパク質配列のC末端部分のN末端に融合している、シグナルペプチド配列
を含む、第2のタンパク質配列
をそれぞれ発現する、本発明1001または1002の二重ベクターシステム。
[本発明1004]
関心対象のタンパク質のN末端部分および関心対象のタンパク質のC末端部分が、関心対象の全長タンパク質を形成するように構成されている、本発明1001～1003のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1005]
第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列が同じである、本発明1003の二重ベクターシステム。
[本発明1006]
第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列が、第1のタンパク質配列および第2のタンパク質配列を細胞の同じ細胞コンパートメントに輸送するように構成されている、本発明1003の二重ベクターシステム。
[本発明1007]
第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列が異なり、各シグナルペプチド配列が、それぞれのタンパク質配列を細胞の同じ細胞コンパートメントに向ける、本発明1003の二重ベクターシステム。
[本発明1008]
第1のベクターおよび第2のベクターが各々ウイルスベクターである、本発明1001～1003のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1009]
ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターまたはレンチウイルスである、本発明1008の二重ベクターシステム。
[本発明1010]
関心対象のタンパク質がSTRCタンパク質である、本発明1001～1004のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1011]
シグナル配列が、SEQ ID NO:9もしくはSEQ ID NO:11と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはシグナル配列が、SEQ ID NO:10もしくはSEQ ID NO:12と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチド配列をコードする、本発明1001～1004のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1012]
関心対象のタンパク質のN末端部分が、SEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:16をコードする核酸配列と少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:16と少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明1001～1004のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1013]
N-インテイン配列が、SEQ ID NO:13と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:14と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明1001～1004のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1014]
関心対象のタンパク質のC末端部分が、SEQ ID NO:23もしくはSEQ ID NO:24をコードする核酸配列と少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:23もしくはSEQ ID NO:24と少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明1001～1004のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1015]
C-インテイン配列が、SEQ ID NO:21もしくはSEQ ID NO:46と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:22もしくはSEQ ID NO:49と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明1001～1004のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1016]
第1のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:5もしくはSEQ ID NO:7と少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:6もしくはSEQ ID NO:8と少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明1001～1004のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1017]
第2のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:17もしくはSEQ ID NO:19と少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:18もしくはSEQ ID NO:20と少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明1001～1004のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1018]
宿主細胞においてSTRC遺伝子のコード配列を発現させるためのベクターシステムであって、コード配列が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、もしくはSEQ ID NO:38のSTRC遺伝子、SEQ ID NO:30もしくはSEQ ID NO:32のmRNA配列、またはこれらの断片を含む少なくとも1つのベクターを含む、ベクターシステム。
[本発明1019]
STRC遺伝子が、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、またはこれらの組み合わせのSTRCタンパク質をコードする、本発明1018のベクターシステム。
[本発明1020]
宿主細胞においてSTRC遺伝子のコード配列を発現させるための二重ベクターシステムを含む、本発明1018または本発明1019のベクターシステムであって、コード配列が5'末端断片および3'末端断片を含み、二重ベクターシステムが、
（a）5'から3'の方向に、
- 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
- プロモーター配列；
- プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、シグナル配列；
- STRC遺伝子コード配列の5'末端断片であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、5'末端断片；
- インテインのアミノ末端断片（N-インテイン）をコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、N-インテインをコードする配列；
- ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；および
- 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
を含む第1のヌクレオチド配列を含む、第1のベクター、ならびに
（b）5'から3'の方向に、
- 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
- プロモーター配列；
- プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、シグナル配列；
- インテインのカルボキシ末端断片（C-インテイン）をコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、C-インテインをコードする配列；
- STRC遺伝子コード配列の3'末端断片であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、3'末端断片；
- ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；および
- 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
を含む第2のヌクレオチド配列を含む、第2のベクター
を含む、ベクターシステム。
[本発明1021]
第1のベクターおよび第2のベクターが、細胞において、
（a）N末端からC末端の方向に、
- シグナルペプチド配列であって、STRCタンパク質配列のN末端部分に連結されており、STRCタンパク質配列がそのC末端においてN-インテインタンパク質配列に融合している、シグナルペプチド配列
を含む、第1のタンパク質配列、および
（b）N末端からC末端の方向に、
- シグナルペプチド配列であって、C-インテインタンパク質配列に連結されており、C-インテインタンパク質配列がSTRCタンパク質配列のC末端部分のN末端に融合している、シグナルペプチド配列
を含む、第2のタンパク質配列
をそれぞれ発現する、本発明1020の二重ベクターシステム。
[本発明1022]
STRCタンパク質のN末端部分およびSTRCタンパク質のC末端部分が、全長STRCタンパク質を形成するように構成されている、本発明1020～1021のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1023]
第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列が同じである、本発明1021の二重ベクターシステム。
[本発明1024]
第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列が、第1のタンパク質配列および第2のタンパク質配列を同じ細胞コンパートメントに輸送するように構成されている、本発明1021の二重ベクターシステム。
[本発明1025]
第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列が異なり、各シグナルペプチド配列が、それぞれのタンパク質配列を同じ細胞コンパートメントに向ける、本発明1021の二重ベクターシステム。
[本発明1026]
ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、本発明1020～1021のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1027]
シグナル配列が、SEQ ID NO:9もしくはSEQ ID NO:11と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:10もしくはSEQ ID NO:12と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明1020～1021のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1028]
STRCタンパク質のN末端部分が、SEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:16をコードする核酸配列と少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、もしくはSEQ ID NO:16と少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明1020～1021のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1029]
STRCタンパク質のN末端部分が全長STRCタンパク質のN末端部分の54％未満を含む、本発明1020～1021のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1030]
N-インテイン配列が、SEQ ID NO:13と少なくとも80％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:14と少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明1020～1021のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1031]
STRCタンパク質のC末端部分が、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、もしくはSEQ ID NO:24をコードする核酸配列と少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、もしくはSEQ ID NO:24と少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明1020～1021のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1032]
STRCタンパク質のC末端部分が、全長STRCタンパク質のC末端部分の46％以上を含む、本発明1020～1021のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1033]
C-インテイン配列が、SEQ ID NO:21と少なくとも80％同一の核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:22と少なくとも80％同一のアミノ酸配列をコードする、本発明1020～1021のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1034]
第1のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:5もしくはSEQ ID NO:7と少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、もしくはSEQ ID NO:16と少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明1020～1021のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1035]
第2のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:17もしくはSEQ ID NO:19と少なくとも70％の同一性を有する核酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、もしくはSEQ ID NO:24と少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、本発明1020～1021のいずれかの二重ベクターシステム。
[本発明1036]
本発明1001～1035のいずれかのベクターシステムを含有する、細胞。
[本発明1037]
本発明1001～1035のいずれかのベクターシステムと、薬学的に許容される媒体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1038]
対象における常染色体劣性聴覚消失を処置するための方法であって、それを必要とする対象へ本発明1001～1035のいずれかの二重ベクターシステムの有効量を投与する工程を含む、方法。
[本発明1039]
対象における常染色体劣性聴覚消失を処置するための方法であって、それを必要とする対象へ本発明1036の細胞を投与する工程を含む、方法。
[本発明1040]
対象における常染色体劣性聴覚消失を処置するための方法であって、それを必要とする対象へ本発明1037の薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
[本発明1041]
常染色体劣性聴覚消失がDFNB16である、本発明1038～1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
対象の少なくとも1つの細胞を本発明1037の薬学的組成物と接触させる工程を含む方法であって、
接触が、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含むベクターシステムを、対象の少なくとも1つの細胞に送達し、
接触した少なくとも1つの細胞が、全長タンパク質を形成するようペプチド結合によって接続されるタンパク質のN末端部分およびタンパク質のC末端部分を発現する、方法。
[本発明1043]
聴覚消失を特徴とする病理または疾患を処置および/または防止するための方法であって、それを必要とする対象へ、本発明1001～1035のいずれかのベクターシステム、本発明1036の少なくとも1つの細胞、または本発明1037の薬学的組成物の有効量を投与する工程を含む、方法。
[本発明1044]
少なくとも1つの細胞が内耳細胞である、本発明1042～1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
少なくとも1つの細胞が内有毛細胞または外有毛細胞である、本発明1042～1043のいずれかの方法。
[本発明1046]
少なくとも1つの細胞がインビボまたはインビトロである、本発明1042～1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
対象における聴覚機能を改善するか、または回復させる、本発明1042～1046のいずれかの方法。
図1は、所望の全長タンパク質（例えば、STRC）の発現のための単一ベクターシステムのための構築物であって、AAV2末端逆位反復（ITR）、プロモーター、およびポリアデニル化（ポリA）配列を有する構築物の概略図を示す。 図2A～2Cは、ヒトSTRCタンパク質、シグナルペプチド配列、リンカー配列、Mycタグをコードする配列、ならびに開始コドンおよび終止コドンをコードするヌクレオチド配列（SEQ ID NO:33）を示す。 図2Aの説明を参照。 図2Aの説明を参照。 図3は、図2A～図2Cに提示されるヌクレオチド配列によってコードされる、シグナルペプチド配列、ヒトSTRCタンパク質配列、リンカー配列、およびmycタグを含有するアミノ酸配列（SEQ ID NO:36）を示す。 図4A～4Dは、マウスSTRCタンパク質、シグナルペプチド配列、リンカー配列、Mycタグをコードする配列、ならびに開始コドンおよび終止コドンをコードするヌクレオチド配列（SEQ ID NO:38）を示す。 図4Aの説明を参照。 図4Aの説明を参照。 図4Aの説明を参照。 図5は、図4Aおよび図4Dに提示されるヌクレオチド配列によってコードされる、シグナルペプチド配列、マウスSTRCタンパク質配列、リンカー配列、およびMycタグを含有するアミノ酸配列（SEQ ID NO:39）を示す。 図6は、AAV2末端逆位反復、プロモーター、およびポリアデニル化配列を使用した二重AAVインテイン媒介ステレオシリンタンパク質トランススプライシングの概略図を示す。インテイン断片は、タンパク質組換えを媒介して、自身を切り出し、残りのSTRC断片（エクステイン）をペプチド結合によって接続する。 図7Aおよび図7Bは、ヒトSTRCタンパク質のN末端部分、シグナルペプチド配列、およびスプライスドナー配列（例えば、N-インテイン）をコードするヌクレオチド配列（SEQ ID NO:5）（CFS-N-Strc-N-Int、構築物2、N-部分）を示す。ヌクレオチド配列は、シグナル配列、5'Strc（野生型Strcコード配列の5'断片）、および（インテインタンパク質のN末端断片をコードする）N-インテイン配列を含有する。 図7Aの説明を参照。 図8Aおよび図8Bは、マウスSTRCタンパク質のN末端部分、シグナルペプチド配列、およびN-インテインをコードするヌクレオチド配列（SEQ ID NO:7）（例えば、CFS-N-Strc-N-Int、構築物2、N-部分）を示す。ヌクレオチド配列は、シグナル配列、5'Strc（野生型Strcコード配列の5'断片）、および（インテインタンパク質のN末端断片をコードする）N-インテイン配列を含有する。 図8Aの説明を参照。 図9は、本明細書に記載された二重AAVインテイン媒介タンパク質トランススプライシングにおいて使用される、シグナルペプチド配列、STRCタンパク質のN末端部分、およびN-インテインをコードする図8Aおよび図8Bのヌクレオチド配列を含有する構築物の概略図を示す。 図10は、図7Aおよび図7Bに提示されたヌクレオチド配列によってコードされる、ヒトSTRCタンパク質のN末端部分、シグナルペプチド配列、およびN-インテインを含有するアミノ酸配列（SEQ ID NO:6）を示す。 図11は、図8Aおよび図8Bに提示されるヌクレオチド配列によってコードされる、マウスSTRCタンパク質のN末端部分、シグナルペプチド配列、およびN-インテインを含有するアミノ酸配列（SEQ ID NO:8）を示す。 図12Aおよび図12Bは、ヒトSTRCタンパク質のC末端部分、シグナルペプチド配列、およびC-インテインをコードするヌクレオチド配列（SEQ ID NO:17）（例えば、CFS-C-Strc-C-Int、構築物2、C-部分）を示す。ヌクレオチド配列は、シグナル配列、（インテインタンパク質のC末端断片をコードする）C-インテイン配列、3'Strc（野生型Strcコード配列の3'断片）、リンカー配列、およびmycタグ配列を含有する。 図12Aの説明を参照。 図13Aおよび図13Bは、マウスSTRCタンパク質のC末端部分、シグナルペプチド配列、およびC-インテインをコードするヌクレオチド配列（SEQ ID NO:19）（例えば、CFS-C-Strc-C-Int、構築物2、C-部分）を示す。ヌクレオチド配列は、シグナル配列、（インテインタンパク質のC末端断片をコードする）C-インテイン配列、3'Strc（野生型Strcコード配列の3'断片）、リンカー配列、およびmycタグ配列を含有する。 図13Aの説明を参照。 図14は、本明細書に記載された二重AAVインテイン媒介タンパク質トランススプライシングにおいて使用される、シグナルペプチド配列、C-インテイン、およびSTRCタンパク質のC末端部分をコードする図13Aおよび図13Bのヌクレオチド配列を含有する構築物の概略図を示す。 図15は、図12Aおよび図12Bに提示されるヌクレオチド配列によってコードされる、シグナルペプチド配列、C-インテイン、ヒトSTRCタンパク質のC末端部分、リンカー配列、およびmycタグを含有するアミノ酸配列（SEQ ID NO:18）を示す。 図16は、図13Aおよび図13Bに提示されるヌクレオチド配列によってコードされる、シグナルペプチド配列、C-インテイン、マウスSTRCタンパク質のC末端部分、リンカー配列、およびmycタグを含有するアミノ酸配列（SEQ ID NO:20）を示す。 図17は、図9および14の構築物によって図示される、図8A、図8B、13A、および13Bの配列によって産生される、図11および図16のシステイン（C；Cys）、フェニルアラニン（F、Phe）、およびセリン（S；Ser）を含有する指定されたCFS分割部位を含むステレオシリン（STRC）タンパク質の予測された構造を示す。 図18Aおよび図18Bは、STRCタンパク質のN末端部分、シグナルペプチド配列、およびN-インテインをコードするヌクレオチド配列（SEQ ID NO:51）（例えば、CFS-N-Strc-N-Int、構築物1、N-部分）を示す。ヌクレオチド配列は、シグナル配列、5'Strc（野生型Strcコード配列の5'断片）、および（インテインタンパク質のN末端断片をコードする）N-インテイン配列を含有する。 図18Aの説明を参照。 図19は、本明細書に記載された二重AAVインテイン媒介タンパク質トランススプライシングにおいて使用される、シグナルペプチド配列、STRCタンパク質のN末端部分、およびN-インテインをコードする図18Aおよび18Bのヌクレオチド配列を含有する構築物の概略図を示す。 図20は、図18Aおよび18Bに提示されるヌクレオチド配列によってコードされる、STRCタンパク質のN末端部分、シグナルペプチド配列、およびN-インテインを含有するアミノ酸配列（SEQ ID NO:52）を示す。 図21Aおよび図21Bは、STRCタンパク質のC末端部分、シグナルペプチド配列、およびC-インテインをコードするヌクレオチド配列（SEQ ID NO:53）（例えば、CFS-C-Strc-C-Int、構築物1、C-部分）を示す。ヌクレオチド配列は、シグナル配列、（インテインタンパク質のC末端断片をコードする）C-インテイン配列、3'Strc（野生型Strcコード配列の3'断片）、リンカー配列、およびmycタグ配列を含有する。 図21Aの説明を参照。 図22は、本明細書に記載された二重AAVインテイン媒介タンパク質トランススプライシングにおいて使用される、シグナルペプチド配列、C-インテイン、およびSTRCタンパク質のC末端部分をコードする図21Aおよび図21Bのヌクレオチド配列を含有する構築物の概略図を示す。 図23は、図21Aおよび図21Bに提示されるヌクレオチド配列によってコードされる、シグナルペプチド配列、C-インテイン、STRCタンパク質のC末端部分、リンカー配列、およびmycタグを含有するアミノ酸配列（SEQ ID NO:54）を示す。 図24は、図9および図14の構築物（AAV2/AAV9-Php.B-STRC-構築物2）によって図示される、図8A、8B、13A、および13Bの配列を使用した、レーン4における単離されたSTRCタンパク質のウエスタンブロットによって証明される、本明細書に記載された二重AAVインテイン媒介タンパク質トランススプライシングおよびプロセシングを確認する。 図25は、シグナル配列を欠くレーン4とは対照的な、シグナル配列を含む、図9および図14の構築物（AAV2/AAV9-Php.B-STRC-構築物2）によって図示される、図8A、8B、13A、および13Bの配列を使用した、レーン6における単離されたSTRCタンパク質のウエスタンブロットによって証明される、本明細書に記載された二重AAVインテイン媒介タンパク質トランススプライシングおよびプロセシングにおけるシグナル配列の有用性を確認する。 図26は、野生型（WT）マウス（StrcWT/WT）およびSTRCノックアウトマウス（Strc-/-）と比較した、図9および14の構築物を感染させたSTRCノックアウトマウス（Strc-/-）における音圧レベル（デシベル、dB）の回復によって証明される、本明細書に記載された二重AAVイン媒介タンパク質トランススプライシングおよびプロセシングを使用した聴覚消失の回復を示す。 図27は、Strcノックアウトマウスにおける、本明細書に記載された二重AAVインテイン媒介タンパク質トランススプライシング系（構築物2：AAV2/AAV9-PHP.B-CMV-Strc-N；AAV2/AAV9-PHP.B-CMV-Strc-C）による処置による聴覚機能の回復を証明する、ABRおよびDPOAEの結果を示す。 図28は、図9に図示されたSTRCタンパク質のN末端部分をコードする構築物のみを使用した、Strcノックアウトマウスにおける聴覚機能回復の欠如を証明する、ABRおよびDPOAEの結果を示す。 図29は、図14に図示されたSTRCタンパク質のC末端部分をコードする構築物のみを使用した、Strcノックアウトマウスにおける聴覚機能回復の欠如を証明する、ABRおよびDPOAEの結果を示す。 図30は、本明細書に記載された二重AAVインテイン媒介タンパク質トランススプライシング系（構築物2：AAV2/AAV9-PHP.B-CMV-Strc-N；AAV2/AAV9-PHP.B-CMV-Strc-C）によるStrcノックアウトマウスの処置の後のインビボの経時的なABRおよびDPOAEの結果を示す。 図31A～31Cは、インテイン媒介タンパク質組換えを使用した二重ベクター戦略を提供する。図31Aは、生成され、4つの異なる二重ベクターバリアントに含められた、8つのAAV2プラスミドを提供する。N末端およびC末端のインテインは、4つのバリアントの各々について示された部位においてインフレームで融合していた。バリアント1および2は、分割部位が異なっており、天然システインが747位（バリアント1）および970位（バリアント2）に位置している。バリアント3および4は、同一の分割部位1および2をそれぞれ有していた。さらに、バリアント3および4は、C-インテイン配列の上流に、C末端断片のN末端に融合した、STRCのN末端に見られるシグナル配列を有していた。インテイン媒介タンパク質組換えは、全長STRCおよび切り出されたインテイン断片を与えると予測された。Mycタグ（示されない）が、全てのC末端断片のC末端に融合していた。図31Bは、4つのバリアントについての分割部位および周囲のアミノ酸配列を示す。図31Cは、全長STRCをコードするプラスミドによってトランスフェクトされたヒト胎児腎臓（HEK）293細胞（レーン1）、トランスフェクトされていない対照（レーン2）、バリアント1（レーン3）およびバリアント3（レーン5）のC末端断片をコードするプラスミドによってトランスフェクトされたHEK293細胞、ならびにバリアント1（レーン4）およびバリアント3（レーン6）のN-断片およびC-断片の両方によってコトランスフェクトされたHEK293細胞に由来する溶解物の代表的なウエスタンブロット分析を提供する。C末端断片（120kD）および全長STRC（220kD）を同定するため、抗Myc抗体が使用された。 図31Aの説明を参照。 図31Aの説明を参照。 図32A～32Gは、StrcΔ/Δマウスの生成および特徴決定を示す。図32Aは、WT Strcの破壊のためのCRISPR/Cas9戦略を例示する。エクソン4を標的とするため、3つのガイドRNA（sgRNA）が設計された。遺伝子破壊戦略は、変異Strc対立遺伝子に早熟終止コドンを導入する、249ヌクレオチドの欠失ならびに2つの転位および逆位（947-1139-紫色および1758-1835-黄色）を与えた。図32Bは、ゲル上で実行された時に、WT（1kB）および変異Strc（751bp）対立遺伝子についての明確なバンドを与えた、ゲノムDNAを増幅するために使用されたPCRの結果を提供する。図32C～32Dは、毛束を照射するため、抗STRC抗体、Alexa488二次、およびファロイジン-Alexa555によって染色された、組織から採取されたWT蝸牛およびStrcΔ/Δ蝸牛の共焦点画像を例示する。内有毛細胞（IHC）および3列の外有毛細胞（OHC）が可視である。緑色STRC染色は、WTのOHCに見られ、赤色アクチン染色は、WTおよびStrcΔ/Δの両方のIHCに見られる。スケールバー＝10mm。図32Eは、StrcΔ/+マウス（ヘテロ-黒丸）およびStrcΔ/Δマウス（ホモ-赤菱形）のIHCおよびOHCから測定された感覚伝達電流振幅の平均値±S.D.を示す。図32Fは、StrcD/Dマウス（n＝6；赤）およびWTマウス（n＝5；黒）から得られたDPOAE閾値の平均値±S.D.を示す。図32Gは、StrcΔ/Δマウス（n＝6；赤）およびWTマウス（n＝5；黒）から得られたABR閾値の平均値±S.D.を示す。 図32Aの説明を参照。 図32Aの説明を参照。 図32Aの説明を参照。 図32Aの説明を参照。 図32Aの説明を参照。 図32Aの説明を参照。 図33A～Bは、二重AAV送達が、STRC発現および毛束形態を回復させることを証明する。図33Aは、抗STRC抗体とAlexa488コンジュゲート二次（緑）およびAlexa546-ファロイジン（赤）とによって染色された、WT蝸牛（左）、StrcΔ/Δ蝸牛（中央）、および二重ベクター注射StrcΔ/Δ蝸牛（右）の共焦点画像を提供する。スケールバー＝10mm。画像の上列は、マージされた2つのチャンネルを示す。下列は、単独のSTRCの局在を示す。図33Bは、WT（上段）、StrcΔ/Δ（中央）、および二重ベクター注射StrcΔ/Δ（下段）の外有毛細胞束の走査型電子顕微鏡像を示す。組織を採取し、固定し、上記のように4週目または12週目に画像化した。スケールバー＝5mm（左および中央）または2mm（右）。 図33Aの説明を参照。 図34A～34Dは、二重AAV送達が、DPOAEおよびABRの閾値を回復させることを示す。図34Aは、WTマウス蝸牛における刺激周波数f1（13.3kHz）およびf2（16kHz）における2つの周波数成分、ならびに予測周波数2f1-f2（10.6kHz）における歪成分を明らかにしたDPOAE波形のフーリエ分析を提供する（上トレース）。下トレースは、WT蝸牛（左）、StrcΔ/Δ蝸牛（中央）、および二重ベクター注射StrcΔ/Δ蝸牛（右）についての拡張された周波数および振幅スケールでの10～50dBの音圧レベルについての歪成分を示す。太線トレースは、DPOAE閾値を示す。図34Bは、WTマウス（黒）ならびに回復した二重ベクター注射StrcΔ/Δマウス（紫）および回復しなかったマウス（StrcΔ/Δ；赤；n＝20；上部の水平線）についての（f2）刺激周波数の関数としてのDPOAE閾値を提供する。赤および紫の線は、個体からのデータを表す。平均値±S.E.が、WT（黒；n＝5；一番下の線）、回復した20匹の二重ベクター注射StrcΔ/Δマウス（紫；n＝20；上から2番目の線）、および最も良く回復した5匹（緑；n＝5；上から3番目の線）について示される。図34Cは、25～110dBの音圧レベルによって誘発された、WT蝸牛（左）、StrcΔ/Δ蝸牛（中央）、および二重ベクター注射StrcΔ/Δ蝸牛（右）から記録されたABRトレースのファミリーを例示する。太線トレースは ABR閾値を示す。図34Dは、WTマウス（黒；n＝5；一番下の線）ならびに回復した二重ベクター注射StrcΔ/Δマウス（紫色；n＝20；上から2番目の線）および回復しなかったマウス（StrcΔ/Δ；赤；n＝20；一番上の線）についての刺激周波数の関数としてプロットされたABR閾値を提供する。紫の線は、個体からのデータを表す。平均値±S.E.が、WTマウス（黒；n＝5；一番下の線）、回復した二重ベクター注射StrcΔ/Δマウス（紫；n＝20；上から2番目の線）および回復しなかったマウス（StrcΔ/Δ；赤；n＝20；一番上の線）、ならびに最も良く回復したマウス（緑；n＝5；上から3番目の線）について示される。 図34Aの説明を参照。 図34Aの説明を参照。 図34Aの説明を参照。
詳細な説明
本開示の詳細な態様が、本明細書に開示される；しかしながら、開示された態様は、様々な形態で具現化され得る本開示を例示するものに過ぎないことを理解されたい。さらに、本開示の様々な態様に関して与えられる例の各々は、例示的なものであって、限定的なものではない。
ステレオシリン（STRC）の発現を通して聴覚を回復させる組成物および方法が、本明細書において提供される。1つはシグナル配列、遺伝子コード配列の5'末端断片、およびインテインのアミノ末端断片（N-インテイン、スプリットインテイン-Nとしても公知）をコードする配列を含み、1つはシグナル配列、インテインのカルボキシ末端断片（C-インテイン、スプリットインテインCとしても公知）をコードする配列、および遺伝子コード配列の3'末端断片を含む、2つの別々のAAV粒子またはベクターを使用した、関心対象の遺伝子による処置。
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参照は、本発明において使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)；およびHale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。
定義
本明細書において使用される全ての用語は、他に提供されない限り、当技術分野における通常の意味を有するものとする。全ての濃度は、他に定義されない限り、局所組成物の全重量に対する指定された成分の重量百分率による。
本明細書において使用されるように、「1つの（a）」または「1つの（an）」は、1またはそれ以上を意味するものとする。本明細書において使用されるように、「含む」という単語と併せて使用される時、「1つの（a）」または「1つの（an）」という単語は、1または複数を意味する。本明細書において使用されるように、「もう1つ」とは、少なくとも第2またはそれ以上を意味する。
「アデノ随伴ウイルス」（AAV）は、ヒトおよびその他のいくつかの霊長類種に感染し得る小さいウイルスである。AAVを使用したベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、分裂細胞および静止細胞に感染し得る。これらの特性のため、AAVは、遺伝子治療ウイルスベクターの魅力的な候補である。
「AAV9-php.bベクター」とは、細胞、例えば、内耳の細胞をトランスフェクトすることができる、AAV9-php.bポリヌクレオチドまたはその断片を含むウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス血清型9を意味する。1つの態様において、AAV9-php.bベクターは、細胞の少なくとも70％以上（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）をトランスフェクトする。もう1つの態様は、AAV9-php.bベクターを対象の内耳に投与した後、またはインビトロでAAV9-php.bベクターを内耳由来の細胞と接触させた後、内有毛細胞および/または外有毛細胞の少なくとも70％以上（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）をトランスフェクトすることができる、AAV9-php.bポリヌクレオチドまたはその断片を含むAAV9-php.bベクターに関することができる。他の態様において、内有毛細胞の少なくとも85％（例えば、90％、95％、100％）および/または外有毛細胞の少なくとも85％（例えば、90％、95％、100％）が、AAV9-php.bベクターによってトランスフェクトされる。トランスフェクション効率は、マウスモデルにおいて、標識またはタグ（例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする遺伝子）を使用して査定され得る。
本開示の1つの態様は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つのベクター（例えば、プラスミド、トランスプライシングプラスミド、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス）、アデノウイルス、AAV、AAVゲノム）に関することができる（図1）。図2A～2Cは、以下のような（図3中のヒトSTRCタンパク質配列（大文字）、SEQ ID NO:2をコードする）ヒトSTRC遺伝子コード配列（SEQ ID NO:1）を5'から3'の方向に含有するヌクレオチド配列（SEQ ID NO:33）を示す：
さらなる態様は、以下のような（図5中のマウスSTRCタンパク質配列、SEQ ID NO:4をコードする）マウスSTRC遺伝子コード配列（SEQ ID NO:3）を5'から3'の方向に含む少なくとも1つのベクター（例えば、プラスミド、トランスプライシングプラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルス、AAV、AAVゲノム）（例えば、図4A～4D；SEQ ID NO:38を参照すること）に関することができる：
本開示のもう1つの態様は、5'から3'の方向に、部分コード配列の5'末端にある、シグナル配列（例えば、SEQ ID NO:10をコードするSEQ ID NO:9；またはSEQ ID NO:12をコードするSEQ ID NO:11）（部分コード配列は、スプライスドナー配列をコードする下流配列（例えば、N末端インテイン（N-インテイン）；SEQ ID NO:14をコードするSEQ ID NO:13）と隣接していてよい）；関心対象のタンパク質のアミノ末端（N末端）部分（例えば、STRC；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16）をコードする部分コード配列：を含む第1のヌクレオチド配列（例えば、SEQ ID NO:6をコードするSEQ ID NO:5；SEQ ID NO:8をコードするSEQ ID NO:7）を含む第1のベクター（例えば、プラスミド、トランスプライシングプラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルス、AAV、AAVゲノム）；および5'から3'の方向に、シグナル配列（例えば、ヒトのSEQ ID NO:10をコードするSEQ ID NO:9；またはマウスのSEQ ID NO:12をコードするSEQ ID NO:11）が、スプライスアクセプター配列（例えば、C末端インテイン（C-インテイン）；SEQ ID NO:22をコードするSEQ ID NO:21）の上流にあってよく、それが、関心対象のタンパク質の全長コード配列の残りの部分、即ち、関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、STRC；ヒトSEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24）をコードする下流の部分コード配列に直接隣接して位置しているものを含む第2のヌクレオチド配列（例えば、SEQ ID NO:18をコードするSEQ ID NO:17；SEQ ID NO:20をコードするSEQ ID NO:19）を含む第2のベクター（例えば、プラスミド、トランスプライシングプラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルス、AAV、AAVゲノム）を提供し得る。細胞（例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、マウス）宿主細胞）において発現された時、第1のベクターおよび第2のベクターは、関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26）を形成する、関心対象のタンパク質のそれぞれの部分（例えば、N-STRC、C-STRC）を各々発現することができる。
もう1つの態様は、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のアミノ末端（N末端）部分をコードする部分コード配列を含有し、部分コード配列の5'末端にシグナル配列を含む第1のヌクレオチド配列を含む第1のベクター（例えば、プラスミド、トランスプライシングプラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルス、AAV、AAVゲノム）を提供することができ、ここで、部分コード配列は、スプライスドナー配列（例えば、N末端インテイン（N-インテイン））をコードする下流配列と隣接していてよく、スプライスドナー配列は、下流の3'ITR配列と隣接している（例えば、AAV9-php.B-Prot-トランス/ドナー）。関心対象のタンパク質（例えば、STRC）の残りのC末端部分をコードする下流の部分コード配列に直接隣接して位置するスプライスアクセプター配列（例えば、C末端インテイン（C-インテイン））の上流にあり得るシグナル配列の上流にある5'ITR配列：を含有する第2のヌクレオチド配列であって、関心対象のタンパク質のC末端部分をコードする部分コード配列の下流にC末端mycタグをさらに含有してもよい第2のヌクレオチド配列を含む第2のベクター（例えば、プラスミド、トランスプライシングプラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルス、AAV、AAVゲノム）（例えば、AAV9-phpB-Prot-トランス/アクセプター）。2つのベクター（例えば、プラスミド、トランスプライシングプラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルス、AAV、AAVゲノム）を同時感染させた細胞において、2つのトランスプライシングプラスミドのヘッドトゥーテール組換え（5'末端-3'末端-5'末端-3'末端）、転写、およびその後の末端逆位反復（ITR）接続部におけるスプライシングによって、関心対象の全長mRNA（例えば、STRC mRNA）が形成され得る。
「関心対象のタンパク質のN末端部分またはN末端断片をコードする配列」とは、関心対象のタンパク質が、例えば、ステレオシリン（STRC）タンパク質である場合、STRCのN末端部分またはN末端断片の部分コード配列を意味し、いくつかの場合において、「STRCのN末端部分またはN末端断片をコードする配列」は、STRCのN末端部分またはN末端断片の部分コード配列（大文字）の上流に、シグナルペプチドコード配列をコードする配列（小文字、斜体、下線付き）を含み得る。いくつかの態様において、「ステレオシリン（STRC）のN末端断片をコードする配列」は、シグナルペプチドコード配列をコードするヌクレオチド配列を含まなくてもよい。もう1つの態様は、インテインのN末端部分またはN末端断片（N-インテイン）（太字、下線付き）に、そのC末端において融合した「STRCのN末端断片またはN末端部分をコードする配列」を含むヌクレオチド配列を提供することができ、ここで、ヌクレオチド配列は、5'末端において「ATG」開始コドン（太字）で始まり、終止コドン（大文字、斜体、下線付き）で終わる。
「STRCのN末端部分またはN末端断片をコードする配列」を含む例示的なヒトヌクレオチド配列は、以下の通りであり得る：
「STRCのN末端部分またはN末端断片をコードする配列」を含むもう1つの例示的なマウスヌクレオチド配列は、以下の通りであり得る：
「関心対象のタンパク質のN末端部分またはN末端断片」とは、関心対象のタンパク質が、例えば、STRCタンパク質である場合、ステレオシリン（STRC）ポリペプチドのN末端部分またはN末端断片のアミノ酸配列を意味する。例えば、STRCのN末端断片のアミノ酸配列は、ATG開始コドンによってコードされるメチオニン（M）（N末端の太字）で始まるN末端に、（例えば、22アミノ酸の）シグナルペプチド配列（小文字、斜体、下線付き）を含み得る。「STRCタンパク質のN末端部分またはN末端断片」を含むアミノ酸配列は、その下流に、かつ/または隣接して、インテインのN末端断片（N-インテイン）（太字、下線付き）をさらに含み得る。さらにもう1つの態様において、「STRCタンパク質のN末端部分またはN末端断片」とは、シグナルペプチド配列を含まない、STRCのN末端断片のアミノ酸配列を意味する。
ヒト「STRCタンパク質のN末端部分またはN末端断片」を含む例示的なアミノ酸配列は、以下の通りであり得る：
マウス「STRCタンパク質のN末端部分またはN末端断片」を含むもう1つの例示的なアミノ酸配列は、以下の通りであり得る：
例示的な「N末端STRCポリペプチド」配列を、それぞれ、ヒトおよびマウスについて、以下に提供する（N末端からC末端の方向）。
ATG開始コドンによってコードされるメチオニンまたはシグナルペプチド配列を含まない例示的なヒトN末端STRCポリペプチド配列（N末端からC末端の方向）は、以下に提供される（N末端からC末端の方向）：
ATG開始コドンによってコードされるメチオニンまたはシグナルペプチド配列を含まないもう1つの例示的なマウスN末端STRCポリペプチド配列（N末端からC末端の方向）（17残基疎水性領域は下線付き）（N末端からC末端の方向）：
「ステレオシリン（STRC）のC末端部分またはC末端断片をコードする配列」とは、STRCのC末端部分またはC末端断片の部分コード配列を意味する。1つの態様は、5'末端に「ATG」開始コドン（5'末端の太字）を含み、「STRCタンパク質のC末端部分またはC末端断片をコードするヌクレオチド配列」の上流に隣接している、インテインのC末端断片（C-インテイン）をコードする配列（太字、下線付き）の上流に隣接している、シグナルペプチドコード配列をコードする配列（小文字、斜体、下線付き）を含むヌクレオチド配列を提供することができる。もう1つの態様は、下流リンカー配列（太字、斜体）、Mycタグ（小文字）、および終止コドン（大文字、斜体、下線付き）を含む、STRCのC末端部分またはC末端断片をコードするヌクレオチド配列をさらに提供し得る。
「STRCのC末端部分またはC末端断片をコードする配列」を含む例示的なヒトヌクレオチド配列は、以下の通りであり得る：
「STRCのC末端部分またはC末端断片をコードする配列」を含む例示的なマウスヌクレオチド配列は、以下の通りであり得る：
「STRCタンパク質のC末端部分またはC末端断片」とは、ステレオシリン（STRC）ポリペプチドのC末端部分またはC末端断片のアミノ酸配列を意味する。「STRCタンパク質のC末端部分またはC末端断片」を含むアミノ酸配列には、N末端からC末端の方向に、ATG開始コドンによってコードされるメチオニン（M）（N末端の太字）、シグナルペプチド配列（小文字、斜体、下線付き）、およびインテインのC末端断片（C-インテイン）（太字、下線付き）が先行し得る。アミノ酸配列は、「STRCタンパク質のC末端部分またはC末端断片」の下流に、リンカー配列（太字、斜体）およびMycタグ（小文字）をさらに含み得る。
ヒト「STRCタンパク質のC末端部分またはC末端断片」を含む例示的なアミノ酸配列は、以下の通りであり得る：
マウス「STRCタンパク質のC末端部分またはC末端断片」を含むもう1つの例示的なアミノ酸配列は、以下の通りであり得る：
例示的な「C末端STRCポリペプチド」配列を、それぞれ、ヒトおよびマウスについて以下に提供する（N末端からC末端の方向）。
シグナルペプチド配列を含まないSTRCタンパク質の例示的なヒトC末端部分は、以下の通りであり得る：
シグナルペプチド配列を含まないが、下線付きの少なくとも16残基の疎水性領域を含む、STRCタンパク質の例示的なマウスC末端部分は、以下の通りであり得る：
STRCタンパク質のN末端部分とSTRCタンパク質のC末端部分とのライゲーションは、例えば、ペプチド結合を通して起こり、それによって、全長STRCタンパク質をもたらし得る。
「インテイン」とは、タンパク質スプライシングとして公知の過程において、自身を切り出し、残りの断片（エクステイン）をペプチド結合によって接続することができる、タンパク質の断片である。インテインは、「タンパク質イントロン」とも呼ばれる。インテインが、自身を切り出し、タンパク質の残りの部分を接続する過程を、本明細書において、「タンパク質スプライシング」または「インテイン媒介タンパク質スプライシング」と呼ぶ。いくつかの態様において、前駆体タンパク質（インテイン媒介タンパク質スプライシング前のインテイン含有タンパク質）のインテインは、2つの遺伝子に由来する。そのようなインテインを、本明細書において、スプリットインテイン（例えば、スプリットインテイン-Nおよびスプリットインテイン-C）と呼ぶ。例えば、ラン藻において、DNAポリメラーゼIIIの触媒サブユニットaであるDnaEは、dnaE-nおよびdnaE-cという2つの別々の遺伝子によってコードされる。dnaE-n遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書において、「インテイン-N」と呼ばれ得る。dnaE-c遺伝子によってコードされるインテインは、本明細書において、「インテイン-C」と呼ばれ得る。
他のインテイン系も使用され得る。例えば、dnaEインテインに基づく合成インテイン、Cfa-N（例えば、スプリットインテイン-N）およびCfa-C（例えば、スプリットインテイン-C）のインテイン対が、（例えば、参照により本明細書に組み入れられるStevens et al.,J Am Chem Soc.2016 Feb.24;138(7):2162-5に）記載されている。本開示に従って使用され得るインテイン対の非限定的な例には、Cfa DnaEインテイン、Ssp GyrBインテイン、Ssp DnaXインテイン、Ter DnaE3インテイン、Ter ThyXインテイン、Rma DnaBインテイン、およびCne Prp8インテイン（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,394,604号に記載されているもの）が含まれる。
「mycタグ」とは、c-myc遺伝子に由来するポリペプチドタンパク質を意味し、合成ペプチド配列（即ち、EQKLISEEDL（SEQ ID NO:27））は、ヒトc-mycタンパク質のC末端アミノ酸（410-419）に相当する。このタグは、さらなる研究、例えば、限定されるわけではないが、タンパク質単離（例えば、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光、免疫沈降）を可能にする。
例示的なAAV9-php.bベクターの配列を以下に提供する。AAV9-php.bベクター（5'から3'）は、いくつかの態様において、
と少なくとも70％以上（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、97％、100％）の同一性を有するヌクレオチド配列を提供し得る。
「投与する」とは、本明細書に記載された1つまたは複数の組成物、構築物、またはウイルスベクターを対象へ提供することを意味する。例として、非限定的に、投与は、例えば、蝸牛への注射によって実施され得る。変異によって影響を受けた細胞へ組成物を送達する他の経路（例えば、静脈内、直接注射、皮下、血管、および/または非血管静脈内）が利用されてもよい。投与は、例えば、ボーラス注射によってもよいし、またはある期間にわたる低速灌流によってもよい。
「薬剤」とは、任意の低分子化学的化合物、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。
「改変」とは、標準的な公知の方法、例えば、本明細書に記載されたものによって検出される、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化（増加または減少）を意味する。本明細書において使用されるように、改変は、10％以上（例えば、20％、25％、30％、40％、50％）の発現レベルの変化を含み得る。
「寛解させる」とは、疾患または状態の発症または進行を低下させるか、減少させるか、抑制するか、減弱させるか、縮小させるか、停止させるか、または安定化することを意味する。例示的な疾患または状態には、任意の疾患、例えば、遺伝子変異に関連したものが含まれ得る。1つの態様において、疾患は、優性変異または劣性変異に関連したもの、例えば、以下に限定されるわけではないが、常染色体劣性難聴1A（DFNB1A）；常染色体劣性難聴1B（DFNB1B）；常染色体劣性難聴2（DFNB2）；常染色体劣性難聴4（DFNB4）；常染色体劣性難聴6（DFNB6）；常染色体劣性難聴7（DFNB7）；常染色体劣性難聴8（DFNB8）；常染色体劣性難聴9（DFNB9）；常染色体劣性難聴10（DFNB10）；常染色体劣性難聴16（DFNB16）；常染色体劣性難聴24（DFNB24）；常染色体劣性難聴25（DFNB25）；常染色体劣性難聴59（DFNB59）；常染色体劣性難聴98（DFNB98）；常染色体劣性難聴110（DFNB110）；常染色体劣性先天性角化異常症5（DKCB5）；常染色体優性難聴2B（DFNA2B）；常染色体優性難聴3A（DFNA3A）；常染色体優性難聴9（DFNA9）；常染色体優性難聴30（DFNA30）；常染色体優性難聴36（DFNA36）；常染色体優性単独（isolated）感音難聴型（DFNA）；常染色体優性先天性角化異常症4；常染色体優性非症候性感音難聴（NSSHL）；常染色体優性ウルフラム様症候群（WFSL）であり得る。
本明細書に記載された二重ベクターシステムが処置し得るさらなる疾患または状態には、象牙質形成不全症（DGI）1；常染色体劣性難聴16、難聴不妊症候群（DIS）、CATSPER関連男性不妊症；精子形成不全7（SPGF7）；アッシャー症候群I型（USH1）；ブルーム症候群（BLM）；総排泄腔外反症；ペンドレッド症候群（PDS）；脳回転状網膜脈絡膜萎縮（GACR）；白内障41（CTRCT41）；前立腺癌；および乳癌が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。
本開示は、関心対象の物質を保持する、または保持することができる任意の細胞である細胞（例えば、宿主細胞）を提供し得る。しばしば、宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、マウス）である。宿主細胞は、例えば、AAV構築物、AAVプラスミド、ヘルパー構築物、補助機能ベクター等を受容することができる。本明細書において使用され得る宿主細胞には、トランスフェクトされた最初の細胞の子孫が含まれる。本開示の「宿主細胞」とは、外来性DNA配列によってトランスフェクトされた細胞もさすことができる。単一の親細胞の子孫は、自然変異、意図されない変異、または意図された変異のため、形態またはゲノムもしくは全DNA相補鎖が最初の親と完全に同一ではない可能性がある。「トランスフェクション」という用語は、本明細書において使用されるように、細胞による外来DNAの取り込みをさすことができ、外来性DNAが細胞膜の内側に導入されている時に、その細胞は「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当技術分野において一般に公知である。例えば、Graham et al.(1973)Virology,52:456、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York、Davis et al.(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier、およびChu et al.(1981)Gene 13:197を参照すること。そのような技術は、1つまたは複数の外来性核酸、例えば、ヌクレオチド組み込みベクターおよびその他の核酸分子を、適当な宿主細胞に導入するために使用され得る。
「核酸」、「ヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド配列」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを意味し、他に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で機能し得る天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含する。
「実質的に相同」、「実質的に同一」、または「実質的に相当する」という用語は、選択された核酸配列またはアミノ酸配列が、選択された参照の核酸配列またはアミノ酸配列と比較して、少なくとも70％の配列同一性を有する、核酸配列またはアミノ酸配列の特徴をさす。選択された配列と参照配列とは、少なくとも75％以上（例えば、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％）の配列同一性を有し得る。
配列の同一性または相同性は、比較される配列の全長において決定されてもよいし、または選択された参照配列のそれより合計25％以下（例えば、20％、15％、10％、5％）であり得る配列の断片によって決定されてもよい。参照配列は、より大きい配列の一部分、例えば、遺伝子もしくは隣接する配列の一部分、または染色体の反復部分であってもよい。2つ以上のポリヌクレオチド配列は、典型的には、少なくとも18～25ヌクレオチド、少なくとも26～35ヌクレオチド、または少なくとも40（例えば、50、60、70、80、90、100、500、1000、1500、2000）ヌクレオチドを有する参照配列と比較され得る。配列の同一性または相同性は、周知の配列比較アルゴリズム、例えば、FASTA生物学的配列アラインメント/比較ソフトウエアプログラムを使用して決定され得る（例えば、Pearson and Lipman,1985,1988を参照すること）。
関心対象の遺伝子コード配列、例えば、ステレオシリンタンパク質をコードするSTRC遺伝子の一部分を細胞に送達するためのポリヌクレオチド、例えば、ベクター、プラスミド等が、本明細書において提供される。いくつかの態様は、19kbの29のエクソンを含有するヒトSTRC遺伝子に由来するコード配列を提供し得る（例えば、NCBI遺伝子ID：161497；AC016135.3；NG_011636.1；NCBIヌクレオチドID：NM_153700.2；AF375594を参照すること）。他の態様は、マウス（Mus musculus）STRC遺伝子を提供し得る（例えば、NCBI遺伝子ID：140476；AL845466；AF375593；AK144985；NM_080459を参照すること）。1,809アミノ酸を有するステレオシリン（STRC）タンパク質またはSTRC前駆体（例えば、NCBIタンパク質ID：NP_714544；AAL35321；BAE26168；NP_536707；UniProtKB/Swiss Prot：Q7RTU9を参照すること）は、内耳の外有毛細胞の不動毛に見出される大きい細胞外構造タンパク質である。
STRC遺伝子（例えば、NCBIアクセッション番号NG_011636；OMIM＃603720；MIM 606440）は、不動毛先端の適切な凝集および位置決めのために重要な水平な上部連結器（top connectors）および蓋膜付着冠（tectorial membrane attachment crowns）に関連している、内耳の外有毛細胞の不動毛に見出される大きい細胞外構造タンパク質であるステレオシリン（STRC）タンパク質をコードする。STRC遺伝子は、染色体15q15上に位置し、常染色体劣性DFNB16難聴遺伝子座を定義し、19kbを包含する29のエクソンを含有する。「STRCポリヌクレオチド」とは、STRCポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子を意味する。
常染色体劣性非症候性難聴DFNB16聴覚消失の根底にある原因は、変異STRC遺伝子と関連付けられている。ヒトステレオシリン（STRC）タンパク質（NCBI RefSeq：NP_714544）をコードするヒトヌクレオチドSTRCコード配列を含有するヒトSTRC遺伝子配列（遺伝子ID：161497）。シグナル配列を含まないヒトSTRCコード配列（例えば、SEQ ID NO:29）は、以下の通りである：
。ヒトSTRCコード配列は、図2A～2Cの構築物中に見出され得、ヒトSTRCコード配列の一部分は、図7A～7Bおよび図12A～12Bの構築物中に見出され得る。
ヒトSTRCタンパク質をコードするヒトmRNA配列（NCBI RefSeq：NM153700）（SEQ ID NO:30）は、以下の通りである：
ステレオシリン発現は、内耳の感覚有毛細胞にのみ見出されており、不動毛、即ち、音刺激の機械受容のための構造を形成する硬い微絨毛と関連付けられている。シグナルペプチド配列（アミノ酸1～21、下線付き）が含まれ、リンカー配列またはMycタグ配列が含まれず、スプライス部位がAla708とCys709の間またはAla933とCys934の間（太字、下線付き）であり得る、ヒトSTRCタンパク質（1,775アミノ酸；SEQ ID NO:25）は、以下の通りである：
推定シグナルペプチドおよびいくつかの疎水性部分を含む1,809アミノ酸を含むマウスSTRCタンパク質（NCBI RefSeq：NP_536707）をコードするマウス（Mus musculus）STRC遺伝子（遺伝子ID：140476；塩基対79～5508にCDS）。シグナル配列を含まないマウスSTRCコード配列（例えば、SEQ ID NO:31）は、以下の通りである：
。マウスSTRCコード配列は、図4A～4Dの構築物中に見出され得、マウスSTRCコード配列の一部分は、図8A～8Bおよび図13A～13Bの構築物中に見出され得る。
マウスSTRCタンパク質をコードするマウスmRNA配列（NCBI RefSeq：NM_080459；SEQ ID NO:32）は、以下の通りである：
22アミノ酸シグナルペプチド配列の切断が、194kDの予測分子量を有する1,787アミノ酸を有するタンパク質を残す、シグナルペプチド配列（アミノ酸1～22；下線付き）を含み、リンカー配列またはMycタグ配列を含まないマウスSTRCタンパク質（1,809アミノ酸；SEQ ID NO:26）は、以下の配列を有し、ここで、Ser746とCys747およびAla969とCys970のスプライス部位は、太字、下線付きである：
「ステレオシリン（STRC）タンパク質」とは、例えば、NCBIアクセッション番号NP_714544またはNP_536707；GenBank番号AAL35321と少なくとも約80％（例えば、82％、85％、88％、90％、95％、97％、98％、99％、100％）のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。
「検出する」とは、検出すべき分析物の存在、欠如、または量を同定することをさす。
「検出可能な標識」とは、関心対象の分子に連結された時に、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段を介して、それを検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識には、放射性同位元素、磁性ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、例えば、緑色蛍光タンパク質、高電子密度試薬、（例えば、ELISAにおいて一般的に使用されるような）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが含まれる。
「疾患」とは、細胞、組織、もしくは器官の正常な機能を損なうか、またはそれらに干渉する任意の状態または障害を意味する。疾患の例には、任意の病理、例えば、聴覚障害、例えば、劣性変異に関連した聴覚障害、例えば、DFNB16が含まれるが、これに限定されるわけではない。
「有効量」とは、未処置の患者と比べて、疾患の症状を寛解させるために必要とされる薬剤の量を意味する。疾患の治療的処置を実施するために使用される活性化合物の有効量は、投与の様式、対象の年齢、体重、および全身健康状態によって変動する。最終的には、主治医または獣医師が、適切な量および投与計画を決定する。そのような量は、「有効」量と呼ばれる。
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸配列または分子の一部分を意味する。この一部分は、参照の核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10％以上（例えば、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％）を含有し得る。断片は、10個以上（例えば、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、または100個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1100個、1200個、1300個、1400個、1500個）のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有し得る。
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的な核酸塩基間の、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型の水素結合であり得る、水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して塩基対形成する相補的な核酸塩基である。
「同一性」とは、関心対象の配列と参照配列との間のアミノ酸配列または核酸配列の同一性を意味する。「実質的に同一」とは、参照のアミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されたアミノ酸配列のいずれか1つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載された核酸配列のいずれか1つ）と少なくとも50％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。そのような配列は、比較のために使用される配列または参照配列に対して、アミノ酸レベルまたは核酸レベルで、少なくとも60％以上（例えば、70％、75％、80％、85％、85％、90％、95％、99％、100％）の同一性を有し得る。
配列同一性は、配列分析ソフトウエア（例えば、Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center（1710 University Avenue,Madison,Wis.53705）の配列分析ソフトウエアパッケージ、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を使用して測定され得る。そのようなソフトウエアは、様々な置換、欠失、および/またはその他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチにおいて、e-3～e-100の確率スコアが、密接に関連した配列を示す、BLASTプログラムが使用され得る。
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態で見出される通常それに付随する成分が様々な程度に除去されている材料をさす。「単離する」とは、最初の起源または周囲からのある程度の分離を意味する。「精製する」とは、単離より高度の分離を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を与えず、その他の有害な結果も引き起こさないよう、十分に他の材料が除去されている。即ち、本開示の核酸またはペプチドは、精製されており、例えば、組換えDNA技術によって作製された時には、細胞材料、ウイルス材料、培養培地が実質的に除去されており、または化学合成された時には、化学的前駆体もしくはその他の化学物質が実質的に除去されている。純度および均質性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィを使用して決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル中で本質的に1本のバンドを生じることを示し得る。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化を受け得るタンパク質について、異なる修飾は、異なる単離されたタンパク質を生じ得、それらは別々に精製され得る。
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、その遺伝子に隣接する遺伝子が、除去されている、本開示の核酸（例えば、DNA）を意味する。従って、この用語には、例えば、ベクター；自律複製性のプラスミドもしくはウイルス；または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれているか；または他の配列から独立した別の分子（例えば、PCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって作製されたcDNAまたはゲノムもしくはcDNAの断片）として存在する組換えDNAが含まれる。さらに、この用語には、DNA分子から転写されるRNA分子が含まれ、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも含まれる。
「単離されたポリペプチド」とは、それに天然に付随する成分から分離されている本開示のポリペプチドを意味する。典型的には、それが天然に関連しているタンパク質および天然に存在する有機分子が、重量で少なくとも60％以上（例えば、75％、80％、90％、95％、99％）除去されている時、そのポリペプチドは、単離されている。本開示の単離されたポリペプチドは、例えば、天然起源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；またはタンパク質の化学合成によって、入手され得る。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定され得る。
「マーカー」とは、疾患または障害に関連した発現レベルまたは活性の改変を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。
「機械的感覚」とは、機械的刺激に対する反応を意味する。機械的刺激のニューロン信号への変換の例の触覚、聴覚、および平衡感覚。機械的感覚の入力は、「メカノトランスダクション」と呼ばれる過程を通して、機械的刺激に対する反応に変換される。
本明細書において使用されるように、「薬剤の入手」における「入手」には、薬剤の合成、購入、またはその他の方法による取得が含まれる。
本明細書において使用されるように、「防止する」、「防止すること」、「防止」、「予防的処置」等の用語は、障害または状態を有していないが、発症するリスクを有するか、または発症しやすい対象において、障害または状態を発症する確率を低下させることをさす。
「プロモーター」とは、下流のポリヌクレオチドの転写を指図するために十分なポリヌクレオチドを意味する。いくつかの態様において、本明細書に記載されたポリヌクレオチドは、1つまたは複数の制御要素を含み得る。当業者は、細胞、例えば、哺乳動物またはヒトの宿主細胞において使用するために適切な制御要素を選択し得る。制御要素の非限定的な例には、プロモーター、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサー、およびポリアデニル化要素が含まれる。本明細書に記載されたポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド、例えば、ステレオシリンをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーター配列を含み得る。本発明において使用するために企図されるプロモーターには、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、SV40プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター、キメラCMV/ニワトリβアクチンプロモーター（CBA）、およびCBAの短縮型（smCBA）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、プロモーターは、CMVプロモーターである。
「薬学的に許容される賦形剤」という語句には、ある器官または身体部分から、もう1つの器官または身体部分への、本発明の化合物の運搬または輸送に関与する、薬学的に許容される材料、組成物、または媒体、例えば、液体または固体の増量剤、希釈剤、担体、溶媒、または封入材料が含まれ得る。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に有害ではないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例には、（1）糖、例えば、乳糖、ブドウ糖、およびショ糖；（2）デンプン、例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプン；（3）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；（4）トラガント末；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）タルク；（8）賦形剤、例えば、カカオ脂および坐剤用ロウ；（9）油、例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油；（10）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（11）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール；（12）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（13）寒天；（14）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（15）アルギン酸；（16）発熱物質不含水；（17）等張生理食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）リン酸緩衝水溶液；ならびに（21）薬学的製剤化において利用されるその他の非毒性の適合性の物質が含まれる。
付加的な適当な担体およびそれらの製剤は、例えば、E.W.MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。投与される治療剤の量は、投与の様式およびモード、年齢および疾患状態（例えば、処置前に存在する聴覚消失の程度）によって変動する。
「ステレオシリンプロモーター」とは、成熟蝸牛の内有毛細胞（IHC）または外有毛細胞（OHC）、毛束内の隣接する不動毛の頂端領域を接続する水平な上部連結器、および最も長い不動毛を上層蓋膜（TM）に付着させる結合部において、下流ポリヌクレオチドの発現を指図するために十分な、NCBI参照配列：NG_011636.1に由来する制御ポリヌクレオチド配列を意味する。ステレオシリンは、前庭有毛細胞および未熟OHCの動毛の周辺にも発現され得る。本開示の1つの態様は、ステレオシリンコード配列の上流に、少なくとも350塩基対もしくはそれ以上（例えば、500、1000、2000、3000、4000、5000塩基対）を含むか、またはからなるステレオシリンプロモーターを提供する。
「低下させる」とは、少なくとも5％またはそれ以上（例えば、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％）の負の改変を意味する。
「参照」とは、標準条件または対照条件を意味する。
「参照配列」とは、明確であり、配列比較の基礎として使用され得る配列である。参照配列は、特定の配列の一部分または全部、例えば、全長cDNAもしくは遺伝子配列の断片、または完全なcDNAもしくは遺伝子配列であり得る。ポリペプチドについて、参照ポリペプチド配列の長さは、少なくとも10アミノ酸もしくはそれ以上（例えば、15、20、25、30、35、50、100）、またはその近くもしくは間の任意の整数であり得る。核酸について、参照核酸配列の長さは、少なくとも50ヌクレオチドもしくはそれ以上（例えば、55、60、75、90、100、200、300）、またはその近くもしくは間の任意の整数であり得る。
「特異的に結合する」とは、本開示のポリペプチドを天然に含む試料、例えば、生物学的試料において、本開示のポリペプチドを認識し、それに結合するが、他の分子を実質的に認識し、それに結合することはない化合物または抗体を意味する。
本開示の方法において有用な核酸分子には、本開示のポリペプチドまたはその断片もしくは一部分をコードする任意の核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内在性核酸配列と100％同一である必要はないが、典型的には、実質的な同一性を示すであろう。内在性配列との「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内在性核酸配列と100％同一である必要はないが、典型的には、実質的な同一性を示すであろう。内在性配列との「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシー条件下で、相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載された遺伝子）またはその一部分の間の二本鎖分子を形成する対を意味する（例えば、Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507を参照すること）。
ハイブリダイゼーションは、例えば、通常750mM NaCl未満（例えば、500mM；250mM）および75mMクエン酸三ナトリウム未満（例えば、50mM；25mM）であり得るストリンジェントな塩濃度の下で起こり得る。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で入手され得、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも35％ホルムアミド（例えば、50％ホルムアミド）の存在下で入手され得る。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも30℃（例えば、37℃、42℃）の温度を含み得る。変動する付加的なパラメータ、例えば、ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、およびキャリアDNAの内含または排除は、当業者に周知である。ストリンジェンシーの様々なレベルは、必要に応じて、これらの様々な条件を組み合わせることによって達成され得る。1つの態様において、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム、および1％SDSにおいて30℃で起こり得る。もう1つの態様において、ハイブリダイゼーションは、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、35％ホルムアミド、および100μg/ml変性サケ精子DNA（ssDNA）において37℃で起こり得る。さらなる態様において、ハイブリダイゼーションは、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、50％ホルムアミド、および200μg/ml ssDNAにおいて42℃で起こり得る。これらの条件の有用な変動は、当業者には容易に明らかであろう。
大部分の適用について、ハイブリダイゼーション後の洗浄工程のストリンジェンシーも変動し得る。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義され得る。前記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度の減少または温度の上昇によって増加し得る。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、30mM NaCl未満（例えば、15mM）および3mMクエン酸三ナトリウム未満（例えば、1.5mM）であり得る。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも25℃（例えば、42℃、68℃）の温度を含み得る。さらにもう1つの態様において、洗浄工程は、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSにおいて25℃で行われ得る。もう1つの態様は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSにおいて42℃で行われる洗浄工程を提供し得る。さらなる態様は、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDSにおいて68℃で行われる洗浄工程を提供し得る。これらの条件のさらなる変動は、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York)；およびSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New Yorkに記載されている。
「対象」とは、哺乳動物、例えば、以下に限定されるわけではないが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、ネコ、またはマウスを意味する。
「STRCタンパク質またはポリペプチド」とは、聴覚機能に必須である、STRCを発現するために十分な活性を有する、NCBIアクセッション番号NP_714544もしくはGenBank No.AAL35321と少なくとも約85％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドまたはそれらの断片を意味する。
本明細書において使用されるように、「処置する」、「処置すること」、「処置」等の用語は、何らかの障害および/またはそれに関連する症状の低下または寛解をさす。除外されるわけではないが、障害または状態の処置は、障害、状態、またはそれに関連する症状が完全に排除されることを必要としないことが理解されるであろう。
具体的に記述されず、前後関係から明白でない限り、本明細書において使用されるように、「または」という用語は、包括的であることが理解される。具体的に記述されず、前後関係から明白でない限り、本明細書において使用されるように、「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」という用語は、単数形または複数形であると理解される。
本開示において、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する」、および「有する」等は、米国特許法においてそれらに与えられた意味を有することができ、「含む（includes）」、「含む（including）」等を意味することができ；「から本質的になる」または「本質的になる」も、同様に、米国特許法において与えられた意味を有し、これらの用語は、非制限的（open-ended）であり、記述されたものの基本的なまたは新規の特徴が、記述されたもの以外の存在によって変化しない限り、記述されたもの以外の存在を可能にするが、先行技術の態様は排除する。「本質的になる」とは、例えば、成分が、市販の材料に存在する通常の不純物、および本明細書に開示される態様の実行に影響を与えないレベル、例えば、5重量％未満または1重量％もしくはさらには0.5重量％未満のレベルで存在する任意の他の添加剤と共に、記載された成分のみを含むことを意味する。
本明細書において使用されるように、全ての数値範囲は、開示された値の間に開示される終点および全ての可能な値を含む。全ての半整数値の正確な値も、具体的に開示されているものとして企図され、開示された範囲の全てのサブセットについての限度として企図される。例えば、1～50という範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むと理解される。さらに、0.1％～3％という範囲は、具体的には、例えば、0.1％、1％、1.5％、2.0％、2.5％、および3％の割合、またはその間の任意の他の数値を開示する。さらに、0.1～3％という範囲は、最初の範囲のサブセット、例えば、0.5％～2.5％、1％～3％、0.1％～2.5％等を含む。個々の成分の全ての重量％の合計は100％を超えないことが理解されるであろう。本明細書に提供される範囲は、その範囲内の全ての値のための略記であることが理解される。
本明細書における変数の任意の定義における化学基のリストの列挙は、任意の単一の基または記載された基の組み合わせとしての、その変数の定義を含む。本明細書における変数または局面についての態様の列挙は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはその一部分と組み合わせられた、その態様を含む。
本明細書に提供される任意の組成物または方法は、本明細書に提供される他の組成物および方法のいずれかの1つまたは複数と組み合わせられ得る。
本開示は、関心対象のスプリットタンパク質、例えば、STRCタンパク質をコードする系（例えば、ベクター、組換えウイルス）、核酸配列、または構築物、および本明細書に記載される核酸配列または構築物を使用して、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）を、宿主、宿主細胞、または細胞へ送達する方法に関する。タンパク質のアミノ末端（N末端）断片およびタンパク質のカルボキシ末端（C末端）断片を含むスプリットタンパク質は、例えば、ベクター（例えば、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（AAV）またはレンチウイルス）を使用して、細胞に送達するため、各々、異なる別々の核酸配列または構築物にコードされる。関心対象のタンパク質のN末端ポリペプチド断片およびC末端ポリペプチド断片は、例えば、関心対象のタンパク質のN末端ポリペプチド断片および末端ポリペプチド断片がペプチド結合によって接続されるインテイン媒介タンパク質スプライシングを使用して、関心対象の全長タンパク質を形成するよう、共に接続され得る。分割部位は、異種間で、類似のまたは相同な領域に位置するであろう。
ベクターシステム
いくつかの態様は、所望の遺伝子構築物を含有する少なくとも1つのベクターを含む、所望の全長タンパク質のコード配列を送達するためのベクター（例えば、カプシド、プラスミド、トランスプライシングプラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルス、AAV、AAVゲノム、レンチウイルス）系を提供し得る。図1は、そのような例示的なAAV STRC構築物の概略図を示す。他の態様において、ベクターシステムは、ヌクレオチド配列（図2A～2C；SEQ ID NO:33）が5'末端において「ATG」開始コドン（太字）で始まり、終止コドン（大文字、斜体、下線付き）で終わり、シグナルペプチドコード配列（小文字、斜体、下線付き；SEQ ID NO:9）がSTRCコード配列の上流に位置する、ヒトSTRCコード配列全体（SEQ ID NO:1）を含み得る。その後の研究、例えば、以下に限定されるわけではないが、タンパク質単離（例えば、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光、免疫沈降）のために使用され得る、リンカー配列（太字、斜体；SEQ ID NO:34）およびmycタグをコードする配列（小文字；SEQ ID NO:35）が、任意で、3'末端に含まれてもよい。図3は、図2のヒトSTRCヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（SEQ ID NO:36）を提示し、ヒトSTRCタンパク質配列は、ATGコドンによってコードされるメチオニン（M）（太字）、シグナルペプチド配列（小文字、斜体、下線付き；SEQ ID NO:10）、任意選択のリンカー配列（太字、斜体）（N末端-TRTRPL-C末端；SEQ ID NO:37）、および任意選択のMycタグ（小文字；SEQ ID NO:27）を含む。
他の態様において、ベクターシステムは、ヌクレオチド配列（図4A～4D；SEQ ID NO:38）が5'末端において「ATG」開始コドン（太字）で始まり、終止コドン（大文字、斜体、下線付き）で終わり、シグナルペプチドコード配列（小文字、斜体、下線付き；SEQ ID NO:11）がSTRCコード配列の上流に位置する、マウスSTRCコード配列全体（SEQ ID NO:3）を含み得る。その後の研究、例えば、以下に限定されるわけではないが、タンパク質単離（例えば、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光、免疫沈降）のために使用され得る、リンカー配列（太字、斜体；SEQ ID NO:34）およびmycタグをコードする配列（小文字；SEQ ID NO:35）が、任意で、3'末端に含まれてもよい。図5は、図4のマウスSTRCヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示し、マウスSTRCタンパク質配列（SEQ ID NO:39）は、ATGコドンによってコードされるメチオニン（M）（太字）、シグナルペプチド配列（小文字、斜体、下線付き）、任意選択のリンカー配列（太字、斜体）（SEQ ID NO:37）、および任意選択のMycタグ（小文字）（SEQ ID NO:27）を含む。
当業者は、いずれも参照により本明細書に組み入れられる、MR Green and J Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2012),4th Ed.；Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(2003)に記載されている標準的な組換え技術を通して、ベクター（例えば、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス、カプシド）、プラスミド、コスミド、ならびに人工染色体（例えば、YAC））を構築することが十分に可能であることが理解される。さらに、DNAを細胞へ移入または送達する方法は、例えば、各々、参照により本明細書に組み入れられる、Sung,Y.,Kim,S."Recent advances in the development of gene delivery systems."Biomater Res 23,8(2019)；Jin,Lian et al."Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers."Theranostics 4(3):240-255,2014；Nayerossadat N,Maedeh T,Ali PA."Viral and nonviral delivery systems for gene delivery."Adv Biomed Res.1:27,2012；Machida,Curtis A.Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols.Humana Press,2003；Heiser,William C.Gene Delivery to Mammalian Cells.Humana Press,2004に開示されている。
インテイン媒介タンパク質トランススプライシング
他の態様は、ベクターシステム、例えば、インテインを使用して関心対象の同じ所望のタンパク質の異なる部分を各々送達するための2つのベクターを含む二重ベクターシステムを提供し得る。インテインは、タンパク質スプライシングとして公知の過程によって、アミノ酸配列から自身を切り出し、残りの隣接する領域（エクステイン）をペプチド結合によって接続するタンパク質の一部である、タンパク質イントロンであると見なされ得る。インテイン媒介タンパク質トランススプライシング過程については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Mills et al."Protein Splicing:How Inteins Escape from Precursor Protein"JBC.289(21):14498-14505,2014を参照すること。インテイン媒介タンパク質スプライシングは、インテインを含有するmRNAがタンパク質に翻訳された後に起こる。図6を参照すること。
インテインは、ホストタンパク質-インテイン融合物から自身を切り出し、それによって、成熟ホストタンパク質（エクステイン）および分離されたインテインをもたらす反応を触媒する酵素のクラスであり、ここで、ペプチド結合が、ドナーインテインとアクセプターインテインとの間のスプライス接続部をライゲートする。全て、参照によりその全体が本明細書に組み入れられ得る、Perler,F.B.（InBase.The intein database.Nucleic Acids Res.30:383-384,2002）によって同定されたもの（例えば、全て、参照によりその全体が本明細書に組み入れられ得る、ノストック・プンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）PCC 73102（ATCC（登録商標）29133（商標））由来のNpu-PCC73102（DnaE-cインテイン（アクセッション番号ZP_00108882）；DnaE-nインテイン（アクセッション番号ZP_00111398））を含むが、これらに限定されるわけではない、公知のインテインのいずれかが、本開示の態様において使用され得る。
本開示のいくつかの態様において、ラン藻ノストック・プンクチフォルメ（Npu）由来のDNAポリメラーゼIII DnaEの触媒サブユニットが、本明細書に記載されたスプリットインテイン-STRC二重ベクターシステムにおいて使用され得る。例えば、ラン藻ノストック・プンクチフォルメ（Npu）由来のDNAポリメラーゼIII dnaEのαサブユニットは、天然に分割されており、dnaE-nおよびdnaE-cという2つの遺伝子に位置する。dnaEのN末端部分およびC末端部分は、ゲノム内の反対のDNA鎖上の2つの別々の遺伝子によってコードされる。dnaE-nによってコードされるタンパク質は、アミノ末端（N末端）dnaE断片（例えば、N-エクステイン）およびアミノ末端インテイン（N-インテイン）を含有し、dnaE-cは、カルボキシ末端インテイン（C-インテイン）実体の後にカルボキシ末端（C末端）dnaE断片（例えば、C-エクステイン）を含有するタンパク質をコードする。N-インテインおよびC-インテインは、互いを認識し、アミノ酸配列から自身をスプライスアウトし、同時に、ペプチド結合を通して、関心対象の隣接するN末端エクステインおよびC末端エクステインをライゲートするか、または融合させ、それによって、関心対象の全長タンパク質を形成する融合物をもたらす。
インテイン活性は、環境依存的であり得、効率的なスプライシングが起こるためには、（N-エクステインおよびC-エクステインと呼ばれる）ライゲーションまたは融合の接続部の周囲に特定のペプチド配列が必要とされ得る。例えば、C-エクステインの最初の残基としての、チオール基またはヒドロキシル基を含有するアミノ酸（例えば、システイン（Cys）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr））は、効率的なスプライシングのために有用であり得る。天然システインが、スプライス部位として使用され得る。例えば、AAVベクターは、例えば、Ser746とCys747との間またはAla969とCys970との間にスプライス部位を提供することができる、SEQ ID NO:26の747位（Cys747；バリアント1および3）および970位（Cys970；バリアント2および4）にある天然システインを活用することができ（図31A～31B）、ここで、分割部位は、アミノ酸配列：
またはその一部分に存在し得る。もう1つの例は、SEQ ID NO:25のAla708とCys709との間またはAla933とCys934との間にスプライス部位を提供し、ここで、分割部位は、アミノ酸配列：
またはその一部分に存在し得る。
本開示の1つの態様は、関心対象のタンパク質、例えば、ステレオシリンのそれぞれの半分を含むエクステイン領域を提供する。例えば、エクステイン領域は、ペプチド結合を通して融合した時、全長ステレオシリン（例えば、NCBI：NM_153700；NP_714544；NM_080459；NP_536707；GenBank：BK000138；AF375594；DAA00085；AF375593；AAL35321）を構成する、N末端ステレオシリンおよびC末端ステレオシリンを含み得る。図6を参照すること。もう1つの態様は、関心対象のタンパク質（例えば、ステレオシリン）のN末端部分およびC末端部分が合わせて100％となる、ステレオシリンについての異なる分割部位を提供する。さらに、さらなる態様において、分割部位は、タンパク質二次構造のらせん（例えば、α）の内部、後、前、または隣に存在し得る。1つの態様は、β鎖または架橋の内部にない分割部位を提供し得る。もう1つの態様は、コイル領域の直ぐ上流のらせん（例えば、α）の内部の分割部位を提供する。さらにもう1つの態様は、膜貫通ドメインの外部にある、即ち、膜貫通部分にない、関心対象のタンパク質（例えば、ステレオシリン）および関心対象のタンパク質の断片を提供する。
例えば、分割は、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、ステレオシリン；ヒトSEQ ID NO:15またはマウスSEQ ID NO:16）が、関心対象の全長タンパク質（例えば、全長ヒトSEQ ID NO:2もしくはSEQ ID NO:25またはマウスSEQ ID NO:4もしくはSEQ ID NO:26）のN末端の少なくとも10％以上（例えば、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％）の長さを含むよう、起こり得る。さらなる態様は、関心対象の全長タンパク質（例えば、全長ヒトSEQ ID NO:25またはマウスSEQ ID NO:26）のN末端の100％以下（例えば、99％、97％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％）の長さを含む、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、ステレオシリン；ヒトSEQ ID NO:15またはマウスSEQ ID NO:16）を提供する。1つの他の態様は、関心対象の全長タンパク質（例えば、全長ヒトSEQ ID NO:25またはマウスSEQ ID NO:26）のN末端部分の10％～100％（例えば、15％～90％、20％～80％、30％～70％、40％～60％、50％）の長さを含む、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、ステレオシリン；ヒトSEQ ID NO:15またはマウスSEQ ID NO:16）を提供し得る。さらなる態様は、関心対象の全長タンパク質（例えば、全長ヒトSEQ ID NO:25もしくはマウスSEQ ID NO:26）のN末端の54％未満（例えば、53％、52％、51％、50％、45％、43％、41％、40％）、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、全長ヒトSEQ ID NO:25もしくはマウスSEQ ID NO:26）のN末端に対する54％未満の同一性、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、全長ヒトSEQ ID NO:25もしくはマウスSEQ ID NO:26）のN末端の54％未満の長さを含む、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、ステレオシリン；ヒトSEQ ID NO:15またはマウスSEQ ID NO:16）を提供する。さらに、さらなる態様は、関心対象の全長タンパク質（例えば、全長ヒトSEQ ID NO:25またはマウスSEQ ID NO:26）のN末端の54％未満である長さを含む、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、ステレオシリン；ヒトSEQ ID NO:15またはマウスSEQ ID NO:16）に関することができる。もう1つの態様は、関心対象の全長タンパク質（例えば、全長ヒトSEQ ID NO:25もしくはマウスSEQ ID NO:26）のN末端の40％以上（例えば、41％、42％、43％、44％、45％、50％、51％、52％、53％）、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、全長ヒトSEQ ID NO:25もしくはマウスSEQ ID NO:26）のN末端部分に対する41％以上の同一性、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、全長ヒトSEQ ID NO:25もしくはマウスSEQ ID NO:26）のN末端部分の41％以上の長さを含む、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、ステレオシリン；ヒトSEQ ID NO:15またはマウスSEQ ID NO:16）を提供する。
さらにもう1つの態様において、関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、ステレオシリン；ヒトSEQ ID NO:23またはマウスSEQ ID NO:24）は、関心対象の全長タンパク質（ステレオシリン；全長ヒトSEQ ID NO:25またはマウスSEQ ID NO:26）のC末端の少なくとも10％以上（例えば、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％；100％）の長さを含む。さらなる態様は、関心対象の全長タンパク質（ステレオシリン；全長ヒトSEQ ID NO:25またはマウスSEQ ID NO:26）のC末端の100％以下（例えば、99％、97％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％）の長さを含む、関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、ステレオシリン；ヒトSEQ ID NO:23またはマウスSEQ ID NO:24）を提供する。1つの他の態様は、関心対象の全長タンパク質（例えば、ステレオシリン；全長ヒトSEQ ID NO:25またはマウスSEQ ID NO:26）のC末端部分の10％～99％（例えば、15％～90％、20％～80％、30％～70％、40％～60％、50％）の長さを含む、関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、ステレオシリン；ヒトSEQ ID NO:23またはマウスSEQ ID NO:24）を提供し得る。さらなる態様は、関心対象の全長タンパク質（例えば、ステレオシリン；全長ヒトSEQ ID NO:25またはマウスSEQ ID NO:26）のC末端部分の46％以上を含む、関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、ステレオシリン；ヒトSEQ ID NO:23またはマウスSEQ ID NO:24）を提供する。さらに、さらなる態様は、関心対象の全長タンパク質（例えば、ステレオシリン；全長ヒトSEQ ID NO:25もしくはマウスSEQ ID NO:26）のC末端部分の46％以上（例えば、47％、48％、49％、50％、55％、60％）、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、ステレオシリン；全長ヒトSEQ ID NO:25もしくはマウスSEQ ID NO:26）のC末端部分との46％以上の同一性、および/または（例えば、全長ヒトSEQ ID NO:25もしくはマウスSEQ ID NO:26）のC末端部分の46％以上の長さを含む、関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、ステレオシリン；ヒトSEQ ID NO:23またはマウスSEQ ID NO:24）に関することができる。さらに、さらなる態様は、関心対象の全長タンパク質（例えば、ステレオシリン；全長ヒトSEQ ID NO:25またはマウスSEQ ID NO:26）のN末端の46％以上（例えば、47％、48％、49％、50％、55％、60％）である長さを含む、関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、ステレオシリン；ヒトSEQ ID NO:23またはマウスSEQ ID NO:24）に関することができる。もう1つの態様は、関心対象の全長タンパク質（例えば、ステレオシリン；全長ヒトSEQ ID NO:25もしくはマウスSEQ ID NO:26）のC末端の60％以下（例えば、59％、58％、57％、56％、55％、50％、45％）、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、ステレオシリン；全長ヒトSEQ ID NO:25もしくはマウスSEQ ID NO:26）のC末端との60％以下の同一性、および/または関心対象の全長タンパク質（例えば、ステレオシリン；全長ヒトSEQ ID NO:25もしくはマウスSEQ ID NO:26）のC末端の60％以下の長さを含む、関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、ステレオシリン；ヒトSEQ ID NO:23またはマウスSEQ ID NO:24）を提供する。
さらなる態様は、ステレオシリンのN末端断片およびC末端断片を形成する、例えば、ヒトSEQ ID NO:25のAla708とCys709との間もしくはAla933とCys934との間、またはマウスSEQ ID NO:26のSer746とCys747との間もしくはAla969とCys970との間における全長野生型ステレオシリンタンパク質の分割を提供する。
二重ベクターシステム
本開示の1つの態様は、細胞において関心対象のタンパク質を発現させるための二重ベクターシステムであって、
（a）5'から3'の方向に、
- 部分コード配列の5'末端にある、シグナル配列（例えば、SEQ ID NO:12をコードするSEQ ID NO:11）；
- 関心対象のタンパク質のアミノ末端（N末端）部分をコードする部分コード配列（例えば、STRC；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16）；
- スプライスドナー配列をコードする配列（例えば、インテインのアミノ末端断片（N-インテイン）；SEQ ID NO:14をコードするSEQ ID NO:13）
を含む第1のヌクレオチド配列を含む、第1のベクター（例えば、カプシド、プラスミド、トランスプライシングプラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルス、AAV、AAVゲノム、レンチウイルス）、および
（b）5'から3'の方向に、
- スプライスアクセプター配列の上流にあり得る、シグナル配列（例えば、SEQ ID NO:12をコードするSEQ ID NO:11）；
- スプライスアクセプター配列をコードする配列（例えば、インテインのカルボキシ末端断片（C-インテイン）；SEQ ID NO:22をコードするSEQ ID NO:21）；
- 関心対象のタンパク質のカルボキシ末端（C末端）部分をコードする部分コード配列（例えば、STRC；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24）
を含む第2のヌクレオチド配列を含む、第2のベクター（例えば、カプシド、プラスミド、トランスプライシングプラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルス、AAV、AAVゲノム、レンチウイルス）
を含む、二重ベクターシステムを提供する。
さらなる態様は、細胞において関心対象のタンパク質を発現させるための二重ベクターシステムであって、以下のものを含む二重ベクターシステムを提供する（例えば、図6を参照すること）：
（a）5'から3'の方向に、
- 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
- プロモーター配列；
- プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、シグナル配列（例えば、SEQ ID NO:12をコードするSEQ ID NO:11）；
- 関心対象のタンパク質のアミノ末端（N末端）部分をコードする部分コード配列（例えば、STRC；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16）であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、部分コード配列；
- スプライスドナー配列をコードする配列（例えば、インテインのアミノ末端断片（N-インテイン）；SEQ ID NO:14をコードするSEQ ID NO:13）であって、（例えば、N-インテインをコードする）スプライスドナー配列が、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、スプライスドナー配列をコードする配列；
- ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；
- 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
を含む第1のヌクレオチド配列を含む、第1のベクター、および
（b）5'から3'の方向に、
- 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
- プロモーター配列；
- プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、シグナル配列（例えば、SEQ ID NO:12をコードするSEQ ID NO:11）；
- スプライスアクセプター配列をコードする配列（例えば、インテインのカルボキシ末端断片（C-インテイン）；SEQ ID NO:22をコードするSEQ ID NO:21）であって、（例えば、C-インテインをコードする）スプライスアクセプター配列が、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、スプライスアクセプター配列をコードする配列；
- 関心対象のタンパク質のカルボキシ末端（C末端）部分をコードする部分コード配列（例えば、STRC；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24）であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、部分コード配列；
- ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；
- 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
を含む第2のヌクレオチド配列を含む、第2のベクター。
もう1つの態様は、第1のベクターが、5'から3'の方向に、SEQ ID NO:5または7の配列を含む第1のヌクレオチド配列を含み得る、二重ベクターシステムに関することができる。例えば、図7A、図7B、図8A、図8B、および図9を参照すること。図7A～7B（SEQ ID NO:5）および図8A～8B（SEQ ID NO:7）は、5'から3'の方向に、開始コドン（ATG、太字）、シグナル配列（斜体、下線付き）（シグナル配列：
）、STRC遺伝子のN末端部分のコード配列（黒）、およびN-インテイン（下線付き）（N-インテイン配列：
）を含むヌクレオチド配列を図示し、ここで、コード配列は、ステレオシリン（STRC）タンパク質をコードする。図9は、ITR、プロモーター、およびポリAテールを含む付加的な要素を示し、ここで、マウス5'STRCは、全長ステレオシリン（STRC）タンパク質のN末端部分（1～746（Ser）アミノ酸；79.7kDa）をコードする。図10および図11は、第1のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示し、ここで、STRCタンパク質のN末端部分を含有するアミノ酸配列（それぞれ、SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8）は、ATGコドンによってコードされるメチオニン（M）（太字）、シグナルペプチド配列（小文字、斜体、下線付き）（シグナルペプチド配列：
）、ステレオシリンタンパク質のN末端部分（黒）、およびN-インテイン（太字、下線付き）
を含む。
さらなる態様は、第2のベクターが、5'から3'の方向に、SEQ ID NO:17または19の配列を含む第2のヌクレオチド配列を含み得る、二重ベクターシステムを提供することができる。例えば、図12A、図12B、図13A、図13B、および図14を参照すること。図12A～12B（SEQ ID NO:17）および図13A～13B（SEQ ID NO:19）は、5'から3'の方向に、開始コドン（太字ATG）、シグナル配列（小文字、斜体、下線付き；それぞれ、SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:11）、C-インテイン配列（太字、下線付き）
、STRC遺伝子のC末端部分のコード配列（黒）（コード配列はステレオシリン（STRC）タンパク質をコードする）、リンカー配列（太字、斜体）
、およびMycタグ配列（小文字）
、および終止コドン（斜体、下線付き）を含むヌクレオチド配列を図示する。図14は、付加的な要素、例えば、ITR、プロモーター、およびポリAテールを示し、ここで、マウス3'-STRCは、全長ステレオシリン（STRC）タンパク質のC末端部分（747（Cys）～1,810アミノ酸；116.7kDa）をコードする。図15および図16は、第2のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示し、ここで、C末端部分のアミノ酸配列（SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:20）は、ATGコドンによってコードされるメチオニン（M）（太字）、シグナルペプチド配列（小文字、斜体、下線付き）（SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:44）、C-インテイン（太字、下線付き）
、ステレオシリンタンパク質のC末端部分（黒）、リンカー配列（太字、斜体）（N-TRTRPL-C；SEQ ID NO:50）、およびMycタグ（小文字）（SEQ ID NO:27）を含む。1つの態様は、ステレオシリンタンパク質のC末端部分がシステイン（C；Cys）、フェニルアラニン（F；Phe）、およびセリン（S；Ser）で始まる、全長STRCタンパク質を提供し得る（図17）。
さらに、さらなる態様において、二重ベクターシステムは、5'から3'の方向に、SEQ ID NO:51の配列を含む第1のヌクレオチド配列を含む第1のベクターを提供しなくてもよい。例えば、図18A、図18B、および図19を参照すること。図18A～18B（SEQ ID NO:51）は、5'から3'の方向に、開始コドン（ATG、太字）、シグナル配列（小文字、斜体、下線付き）（SEQ ID NO:11）、STRC遺伝子のN末端部分のコード配列（黒）、およびN-インテイン（太字、下線付き）（SEQ ID NO:42）（コード配列はステレオシリン（STRC）タンパク質をコードする）、ならびに終止コドン（斜体、下線付き）を含むヌクレオチド配列を図示する。図19は、付加的な要素、例えば、ITR、プロモーター、およびポリAテールを示し、ここで、5'STRCは、全長ステレオシリン（STRC）タンパク質のN末端部分（1～969（Ala）アミノ酸；104.8kDa）をコードする。図20は、第1のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示し、ここで、N末端部分のアミノ酸配列（SEQ ID NO:52）は、ATGコドンによってコードされるメチオニン（M）（太字）、シグナルペプチド配列（小文字、斜体、下線付き）（SEQ ID NO:44）、ステレオシリンタンパク質のN末端部分（黒）、およびN-インテイン（太字、下線付き）（SEQ ID NO:45）を含む。
さらなる態様は、5'から3'の方向に、SEQ ID NO:53の配列を含む第2のヌクレオチド配列を含む第2のベクターを有する二重ベクターシステムを提供しなくてもよい。例えば、図21A、図21B、および図22を参照すること。図21A～21B（SEQ ID NO:53）は、5'から3'の方向に、開始コドン（太字ATG）、シグナル配列（小文字、斜体、下線付き）（SEQ ID NO:11）、C-インテイン配列（太字、下線付き）（SEQ ID NO:21）、STRC遺伝子のC末端部分のコード配列（黒）（コード配列はステレオシリン（STRC）タンパク質をコードする）、リンカー配列（太字、斜体）（SEQ ID NO:47）、Mycタグ配列（小文字）（SEQ ID NO:48）、および終止コドン（斜体、下線付き）を含むヌクレオチド配列を図示する。図22は、ITR、プロモーター、およびポリAテールを含む付加的な要素を示し、ここで、3'-STRCは、全長ステレオシリン（STRC）タンパク質のC末端部分（970（Cys）～1,810アミノ酸；91.6kDa）をコードする。図23は、第2のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示し、ここで、C末端部分のアミノ酸配列（SEQ ID NO:54）は、ATGコドンによってコードされるメチオニン（M）（太字）、シグナルペプチド配列（小文字、斜体、下線付き）（SEQ ID NO:44）、C-インテイン（太字、下線付き）（SEQ ID NO:49）、ステレオシリンタンパク質のC末端部分（黒）、リンカー配列（太字、斜体）（SEQ ID NO:50）、およびMycタグ（小文字）（SEQ ID NO:27）を含む。
二重ベクターシステムの1つの態様は、関心対象のタンパク質（例えば、ステレオシリン）の分割された各部分、即ち、N末端部分およびC末端部分についてのベクターを提供する。関心対象のタンパク質（例えば、ステレオシリン）の分割された部分、および関心対象のタンパク質の制御、産生、または発現のために必要な任意の付加的な領域は、各部分および関連領域が、それぞれのベクター（例えば、ウイルス（例えば、ウイルスベクター、バクテリオファージ、ファージ、レトロウイルス）、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ヒト人工染色体）の積荷容量を超えないようなものである。関心対象の同じタンパク質の分割された部分および付加的な領域は、選択されたベクターの積荷容量を超えるサイズを有してはならない。
本開示の1つの態様は、大きいコード配列、例えば、4kB以上（例えば、4.5kB、5kB、5.5kB、5.8kB、6kB、6.5kB、7kB、7.5kB、8kB、8.5kB、9kB、9.5kB、10kB、11kB、12kB）のものを含む遺伝子を送達するためのベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）を提供する。本開示のベクター（例えば、第1のベクターおよび第2のベクター）は、各々、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスI、ワクシニアウイルス）であってよく、いくつかの態様において、ウイルスベクターは、AAVベクターまたは組換えAAVベクターであってよい。もう1つの態様は、同じ、または異なる血清型（例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、合成血清型）のウイルスベクターを提供し得る。本明細書に記載される開示において有用なAAV血清型には、AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、およびAAV9が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。
1つの態様において、第1および第2のベクターは、ウイルスDNAを欠く、ウイルスベクター、例えば、本明細書において交換可能に使用されるアデノ随伴ウイルス（AAV）または組換えAAV（rAAV）である。二重ベクターシステムの第1のベクターは、5'から3'の方向に、5'末端逆位反復（5'ITR）配列；関心対象の下流ポリヌクレオチド（例えば、STRC）の転写を駆動し得るプロモーター配列；プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にあるシグナル配列；関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のアミノ末端（N末端）部分をコードする部分コード配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある部分コード配列；インテインのアミノ末端断片（N-インテイン）をコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、N-インテインをコードする配列；ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；および3'ITR配列：を含有するヌクレオチド配列を含む。
もう1つの態様において、第2のベクターは、5'から3'の方向に、5'末端逆位反復（5'ITR）配列；関心対象の下流ポリヌクレオチド（例えば、STRC）の転写を駆動し得るプロモーター配列；プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にあるシグナル配列；インテインのカルボキシ末端断片（C-インテイン）をコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、C-インテインをコードする配列；関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のカルボキシ末端（C末端）部分をコードする部分コード配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある部分コード配列；ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；および3'ITR配列を含む。
さらに、さらなる態様において、本開示の第1のベクターおよび第2のベクターが、ウイルス形質導入、塩化カルシウムを使用した細菌形質転換、細菌の交配またはコンジュゲーションによる細菌性の形質転換または形質導入、トランスフェクション（例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム、リポソームベースのトランスフェクション）、遺伝子銃等を含むが、これらに限定されるわけではない任意の手段によって、細胞（例えば、宿主細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞）に挿入される時、ベクターは、N末端からC末端の方向に、C末端においてN-インテインタンパク質配列に融合している関心対象のタンパク質配列（例えば、STRC）のN末端部分に連結されている、シグナルペプチド配列、を含む第1のタンパク質配列；およびN末端からC末端の方向に、関心対象のタンパク質配列（例えば、STRC）のC末端部分のN末端に融合しているC-インテインタンパク質配列に連結されている、シグナルペプチド配列、を含む第2のタンパク質配列をそれぞれ発現する。関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分および関心対象の同じタンパク質（例えば、STRC）のC末端部分のインテイン媒介タンパク質スプライシングは、関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC）の発現をもたらす。
もう1つの態様は、二重ベクターシステムのシグナルペプチド配列であって、二重ベクターシステムによってコードされる各タンパク質配列のN末端に位置し得るシグナルペプチド配列を提供する。関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分を含む第1のタンパク質配列において、シグナルペプチド配列は、関心対象のタンパク質のN末端部分のコード領域およびNインテインの上流にあってよい。関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のC末端部分を含む第2のタンパク質配列において、シグナルペプチド配列は、C-インテインおよび関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のC末端部分のコード領域の上流にあってよい。
本開示のもう1つの態様は、第1のベクターおよび第2のベクターが、細胞において、同じシグナルペプチド配列を各々含有する第1のタンパク質配列および第2のタンパク質配列をそれぞれ発現する、二重ベクターシステムを提供する。従って、同じシグナルペプチド配列は、第1のタンパク質配列および第2のタンパク質配列が同じ細胞コンパートメントに輸送されることを可能にする。異なる態様において、第1および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列は、異なっていてもよいが、これらのシグナルペプチド配列は、それぞれのタンパク質配列を同じ細胞コンパートメントに向ける。第1および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列は、第1のタンパク質配列および第2のタンパク質配列を同じ細胞コンパートメントに輸送するように構成され得る。そのことによって、インテイン媒介タンパク質融合が起こり、それによって、関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC）が形成されるよう、十分に、タンパク質配列の各々が近接することができる。シグナルペプチド配列は、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）に関連したものであり得る。さらなる態様は、関心対象のタンパク質以外のタンパク質に関連するシグナルペプチド配列をコードするシグナル配列を提供することができ、ここで、第1のヌクレオチド配列のシグナル配列および第2のヌクレオチド配列のシグナル配列は、異なり、シグナル配列は、やはり異なるシグナルペプチド配列をコードするが、シグナル配列は、第1のタンパク質配列および第2のタンパク質配列を同じ細胞コンパートメントに輸送するように構成されている。本開示のもう1つの態様は、インテイン媒介トランススプライシングを妨害することなく、2つの断片を同じ細胞コンパートメントまたは細胞内コンパートメントに向けるような、シグナル配列を提供する。シグナル配列は、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分および関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のC末端部分がペプチド結合を通して関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC）を形成することを可能にするため、十分に、第1のタンパク質配列および第2のタンパク質配列が近接することを確実にするために特に有用であり得る。
本開示の1つの態様において、シグナル配列は、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のシグナルペプチド配列をコードするシグナル配列と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含み得る。例えば、シグナル配列は、STRCタンパク質シグナルペプチドをコードする遺伝子配列のSEQ ID NO:11と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含んでいてよく、またはシグナル配列は、例えば、関心対象のタンパク質および関心対象のタンパク質の各部分を同じ細胞コンパートメントに向ける任意のシグナル配列からなる核酸配列を含んでいてよい（例えば、SEQ ID NO:9もしくはSEQ ID NO:11）。もう1つの態様は、関心対象のタンパク質のシグナルペプチド配列（例えば、STRC；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:12）と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチド配列をコードするシグナル配列を提供し得る。例えば、シグナルペプチド配列は、STRCタンパク質シグナルペプチドのSEQ ID NO:10もしくはSEQ ID NO:12と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列を含んでよく、またはシグナルペプチド配列は、SEQ ID NO:10もしくはSEQ ID NO:12からなるアミノ酸配列を含んでよい。
さらに、さらなる態様は、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分をコードする部分コード配列であって、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、STRC；SEQ ID NO:6、8、15、16、25、または26）をコードするコード配列と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含む部分コード配列を提供することができる。例えば、（異なるシグナル配列と交換可能であり得るシグナル配列を含む）STRCタンパク質のN末端部分をコードする部分コード配列は、以下の配列と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含み得る。
ヒトSTRCタンパク質のN末端部分をコードする（開始コドンATG（太字）およびシグナル配列（小文字、斜体、下線付き）を含む）部分コード配列は、以下の通りであり得る：
マウスSTRCタンパク質のN末端部分をコードする（開始コドンATG（太字）およびシグナル配列（小文字、斜体、下線付き）を含む）部分コード配列は、以下の通りであり得る：
、またはSEQ ID NO:55もしくは56からなる核酸配列を含むSTRCタンパク質のN末端部分をコードする部分コード配列。もう1つの態様は、関心対象のタンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:25または26）と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列を有する（開始コドンATGに対応するメチオニンおよびシグナルペプチド配列を含む）関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分を提供することができる。例えば、（開始コドンATGに対応するメチオニンおよび交換可能であり得るSTRCシグナルペプチド配列を含む）STRCタンパク質のN末端部分は、SEQ ID NO:15もしくは16の配列と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:15もしくは16からなるアミノ酸配列を含むSTRCタンパク質のN末端部分を含み得る。第1のベクターの第1のヌクレオチド配列は、自身のシグナル配列（例えば、SEQ ID NO:10または12）あるいは異なるシグナル配列、およびスプライスドナー配列（例えば、N末端インテイン（N-インテイン）；SEQ ID NO:14）を含む、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、STRC；SEQ ID NO:15または16）をコードする部分コード配列を含み得る。
1つの態様において、（開始コドンATGに対応するメチオニンおよび交換可能であり得るシグナル配列を含み；任意で、リンカー配列およびMycタグ配列を含む）関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のC末端部分をコードする部分コード配列であって、関心対象のタンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:18、20、23、24、25、または26）と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含む部分コード配列。例えば、STRCタンパク質のC末端部分をコードする部分コード配列は、以下の配列と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含み得る。
ヒトSTRCタンパク質のC末端部分をコードする部分コード配列は、以下の通りであり得る（即ち、ATG開始コドン、シグナル配列、またはスプライスアクセプター配列を含まない）：
マウスSTRCタンパク質のC末端部分をコードする部分コード配列は、以下の通りであり得る：
、またはSEQ ID NO:57もしくは58からなる核酸配列を含むSTRCタンパク質のC末端部分をコードする部分コード配列。もう1つの態様は、関心対象のタンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:25または26）と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列を有する（開始コドンATGに対応するメチオニン、シグナルペプチド配列を含み；任意で、リンカー配列およびMycタグ配列を含む）関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のC末端部分を提供し得る。例えば、（開始コドンATGに対応するメチオニン、STRCシグナルペプチド配列を含み；任意で、リンカー配列およびMycタグ配列を含む）STRCタンパク質のC末端部分は、SEQ ID NO:23もしくは24の配列と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:23もしくは24からなるアミノ酸配列を含むSTRCタンパク質のC末端部分を含み得る。第2のベクターの第2のヌクレオチド配列は、自身のシグナル配列（例えば、SEQ ID NO:10または12）あるいは異なるシグナル配列およびスプライスアクセプター配列（例えば、C末端インテイン（C-インテイン）；SEQ ID NO:22）を含む、関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、STRC；SEQ ID NO:23または24）をコードする部分コード配列を含み得る。
1つの態様は、SEQ ID NO:42と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含むN-インテイン配列、またはSEQ ID NO:45と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードするN-インテイン配列を提供し得る。他の態様は、SEQ ID NO:42の核酸配列からなるN-インテイン配列、またはSEQ ID NO:45からなるアミノ酸配列をコードするN-インテイン配列に関することができる。
もう1つの態様は、SEQ ID NO:46と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含むC-インテイン配列、またはSEQ ID NO:49と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードするC-インテイン配列を提供する。他の態様は、SEQ ID NO:46の核酸配列からなるC-インテイン配列、またはSEQ ID NO:49からなるアミノ酸配列をコードするC-インテイン配列に関することができる。
さらなる態様において、本開示の二重ベクターシステムは、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、STRC；SEQ ID NO:15または16）をコードする第1のヌクレオチド配列を提供し、ここで、第1のヌクレオチド配列は、以下に限定されるわけではないが、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分の部分コード配列（5'）の一部を形成していてもよいし、またはそれとは別であってもよい、関心対象のタンパク質のシグナル配列、および関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分の部分コード配列の一部を形成していてもよいし、またはそれとは別であってもよい、スプライスドナー配列（例えば、N-インテイン配列）を含み、第1のヌクレオチド配列は、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分をコードするヌクレオチド配列と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含んでよく、以下に限定されるわけではないが、関心対象のタンパク質の内在性シグナル配列または外来性シグナル配列、関心対象のタンパク質のN末端部分の部分コード配列（5'）、およびスプライスドナー配列（例えば、N-インテイン配列）（SEQ ID NO:5または7）を含む。1つの態様は、例えば、SEQ ID NO:5もしくは7と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含む第1のヌクレオチド配列を提供することができ、または第1のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:5もしくは7からなる核酸配列を含んでもよい。
もう1つの態様は、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分を含む配列と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする第1のヌクレオチド配列を提供し、ここで、第1のヌクレオチド配列は、以下に限定されるわけではないが、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分の部分コード配列（5'）の一部を形成していてもよいし、またはそれとは別であってもよい、関心対象のタンパク質の内在性シグナル配列または外来性シグナル配列、および関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分の部分コード配列の一部を形成していてもよいし、またはそれとは別であってもよい、スプライスドナー配列（例えば、N-インテイン配列）を含む。さらなる態様は、例えば、SEQ ID NO:6もしくは8と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする第1のヌクレオチド配列を提供することができ、または第1のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:6もしくは8からなるアミノ酸配列をコードしてもよい。
さらに、本開示の二重ベクターシステムのさらなる態様は、関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、STRC；SEQ ID NO:23または24）をコードする第2のヌクレオチド配列を提供し、ここで、第2のヌクレオチド配列は、以下に限定されるわけではないが、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のC末端部分の部分コード配列（3'）の一部を形成していてもよいし、またはそれとは別であってもよい、関心対象のタンパク質の内在性シグナル配列または外来性シグナル配列、および関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のC末端部分の部分コード配列の一部を形成していてもよいし、またはそれとは別であってもよい、スプライスアクセプター配列（例えば、C-インテイン配列）を含み（第2のヌクレオチド配列は、いくつかの態様において、リンカー配列およびMycタグ配列を任意で含んでよく）、第2のヌクレオチド配列は、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のC末端部分をコードするヌクレオチド配列と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含んでよく、以下に限定されるわけではないが、関心対象のタンパク質の内在性シグナル配列または外来性シグナル配列、関心対象のタンパク質のC末端部分の部分コード配列（3'）、およびスプライスアクセプター配列（例えば、C-インテイン配列）を含む（任意で、リンカー配列およびMycタグ配列を含む）（SEQ ID NO:17または19）。1つの態様は、例えば、SEQ ID NO:17もしくは19と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有する核酸配列を含む第2のヌクレオチド配列を提供することができ、または第2のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:17もしくは19からなる核酸配列を含んでもよい。
もう1つの態様は、以下に限定されるわけではないが、関心対象のタンパク質のシグナル配列、C-インテイン配列、および関心対象のタンパク質のC末端部分の部分コード配列（3'）を含む（任意で、リンカー配列およびMycタグ配列を含む）、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のC末端部分を含む配列と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする第2のヌクレオチド配列を提供する。さらなる態様は、SEQ ID NO:18もしくは20と少なくとも5％（例えば、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする第2のヌクレオチド配列を提供することができ、または第2のヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:18もしくは20からなるアミノ酸配列をコードし得る。
さらなる態様において、本開示の二重ベクターシステムは、5'から3'の方向に、ITR、プロモーター（例えば、CMVプロモーター）、関心対象の部分コード配列（例えば、5'Strc）、スプライスドナー配列（例えば、5'インテイン）、およびITRを有する第1のヌクレオチド配列（例えば、AAVベクター1）；ならびにITR、プロモーター（例えば、CMVプロモーター）、スプライスアクセプター配列（例えば、3'インテイン）、関心対象の部分コード配列（例えば、3'Strc）、およびITRを有する第2のヌクレオチド配列（例えば、AAVベクター2）を提供する（図31A）。翻訳を受けることによって、第1および第2のヌクレオチド配列は、747位および970位にある天然システイン、即ち、SEQ ID NO:26のCys747およびCys970（または709位および934位、即ち、SEQ ID NO:25のCys709およびCys934）を利用してスプライシングされた時に、全長STRCタンパク質ならびにn-インテインおよびc-インテインを含む切り出されたインテインを形成する、複数のバリアントを生成し得る。図31Aは、4つの異なる二重ベクターバリアントを含む8つのAAV2プラスミドを例示する。
例えば、バリアント1は、N末端からC末端の方向に、シグナルペプチド配列、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、およそ80kDのn-STRC）、スプライス部位（例えば、Ser746）、およびスプライスドナー配列（n-インテイン）を含む第1のタンパク質配列；ならびに、N末端からC末端の方向に、スプライスアクセプター配列（c-インテイン）、スプライス部位（例えば、Cys747）、および関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、およそ117kDのc-STRC）を含む第2のタンパク質配列を含む。バリアント2は、例えば、N末端からC末端の方向に、シグナルペプチド配列、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、およそ105kDのn-STRC）、スプライス部位（例えば、Ala969）、およびスプライスドナー配列（n-インテイン）を含む第1のタンパク質配列；ならびに、N末端からC末端の方向に、スプライスアクセプター配列（c-インテイン）、スプライス部位（例えば、Cys970）、および関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、およそ92kDのc-STRC）を含む第2のタンパク質配列を含む。例えば、バリアント3は、N末端からC末端の方向に、シグナルペプチド配列、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、およそ80kDのn-STRC）、スプライス部位（例えば、Ser746）、およびスプライスドナー配列（n-インテイン）を含む第1のタンパク質配列；ならびに、N末端からC末端の方向に、シグナルペプチド配列、スプライスアクセプター配列（c-インテイン）、スプライス部位（例えば、Cys747）、および関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、およそ117kDのc-STRC）を含む第2のタンパク質配列を含む。バリアント4は、例えば、N末端からC末端の方向に、シグナルペプチド配列、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、およそ105kDのn-STRC）、スプライス部位（例えば、Ala969）、およびスプライスドナー配列（n-インテイン）を含む第1のタンパク質配列；ならびに、N末端からC末端の方向に、シグナルペプチド配列、スプライスアクセプター配列（c-インテイン）、スプライス部位（例えば、Cys970）、および関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、およそ92kDのc-STRC）を含む第2のタンパク質配列を含む。
翻訳されたバリアント配列のタンパク質スプライシングによって、関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC）が形成される。例えば、N末端からC末端の方向に、関心対象のタンパク質のN末端部分（n-STRC）は、関心対象のタンパク質のC末端部分（例えば、c-STRC）に連結され得る。N末端およびC末端のスプライシングは、スプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列の切り出しをもたらす。例えば、切り出されたスプライス配列は、全長スプライス配列（例えば、n-インテインおよびc-インテインの切り出されたインテイン）を形成し得る（図31A）。
図31Cは、バリアント3のN末端部分およびC末端部分の両方（c+n）によってトランスフェクトされたHEK細胞が、C末端部分のみ（c）を含むバリアント3、またはバリアント1の単独のC末端部分（c）もしくはC末端部分およびN末端部分（c+n）とは対照的に、全長STRCの発現をもたらしたことを証明している。バリアント1とバリアント3との間の唯一の違いは、C末端部分におけるシグナル配列の存在である。従って、図31Cは、N末端部分およびC末端部分の両方のシグナル配列が、各部分を細胞の同じ細胞コンパートメントに向け、それによって、タンパク質スプライシングによる全長STRCの形成を可能にすることを証明している。
さらなる態様は、第1のベクターおよび第2のベクターを含む本明細書に記載された二重ベクターシステムを含有する細胞（例えば、宿主細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、細菌細胞）を提供する。1つの態様において、細胞は、内耳細胞、内有毛細胞、または外有毛細胞であり得る。いくつかの態様は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、マウス）である細胞に関することができる。他の態様は、耳細胞（例えば、内耳細胞、外耳細胞、内有毛細胞、外有毛細胞）を提供し得る。本開示の細胞は、インビボまたはインビトロであり得る。いくつかの態様において、細胞は、当技術分野において一般的に公知の多数の公知のトランスフェクション技術および形質転換技術のいずれかを使用して、本開示の二重ベクターシステムの第1のベクターおよび第2のベクターによってトランスフェクトまたは形質転換され得る。例えば、全て、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Graham et al.(1973)Virology,52:456、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York、Davis et al.(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier、およびChu et al.(1981)Gene 13:197を参照すること。本開示の二重ベクターシステムの第1のベクターおよび第2のベクターは、以下に限定されるわけではないが、ウイルス形質導入、塩化カルシウムを使用した細菌形質転換、細菌の交配またはコンジュゲーションによる細菌性の形質転換または形質導入、トランスフェクション（例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム、リポソームベースのトランスフェクション）、遺伝子銃等を含む、任意の手段によって、本明細書に記載された細胞に挿入され得る。
さらにもう1つの態様は、本明細書に記載された二重ベクターシステムと、薬学的または生理学的に許容される媒体（例えば、希釈剤、担体、賦形剤）とを含む組成物または薬学的組成物に関することができる。変異に関連した疾患または状態の処置のための本明細書において企図される組成物は、本明細書に記載された二重ベクターシステムを含み得る。治療目的のため、本明細書に開示される方法に従って適切に加工された時に、本明細書に記載されるような疾患もしくは状態（例えば、常染色体劣性DFNB16聴覚消失）を引き起こすか、またはそれらに寄与する変異を含むゲノムにおいて、関心対象の全長タンパク質（例えば、STRCタンパク質）の発現をもたらす、関心対象のポリヌクレオチド（例えば、STRC）またはその断片を含む組成物は、疾患または状態によって影響を受けている身体の領域（例えば、蝸牛、内耳）へ直接投与され得る。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、生理食塩水において製剤化される。非限定的な投与方法には、耳、内耳、蝸牛管、または蝸牛管周囲の外リンパ液で満たされた空間（例えば、鼓室階および前庭階）への注射が含まれる。高カリウムの内リンパ液で満たされた蝸牛管への注射は、有毛細胞への直接アクセスを提供し得る。しかしながら、この繊細な流体環境の改変は、蝸牛内電位を妨害し、注射関連毒性のリスクを高める可能性がある。蝸牛管周囲の外リンパ液で満たされた空間、鼓室階および前庭階は、卵円窓または正円窓のいずれかの膜を通して、中耳からアクセスされ得る。内耳への唯一の非骨性開口部である正円窓膜は、多くの動物モデルにおいて比較的容易にアクセス可能であり、この経路を使用したウイルスベクターの投与は、耐容性が良好である。ヒトにおいて、人工内耳の設置は、ルーチンに、正円窓膜を通した外科的電極挿入に頼っている。
使用方法
1つの態様は、本明細書に記載された二重ベクターシステムの有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む、本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム；カプシド、プラスミド、トランスプライシングプラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルス、AAV、AAVゲノム、レンチウイルス）を使用する方法であって、遺伝子の欠損または変異に起因する疾患、状態、またはそれらの症状を処置し、かつ/または低下させ、かつ/または防止することができる方法を提供し得る。
もう1つの態様は、（例えば、対象の）細胞を、本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）と薬学的または生理学的に許容される媒体（例えば、担体、希釈剤、賦形剤）とを含む組成物と、接触させることを含む方法に関することができる。（例えば、対象の）細胞との接触工程は、例えば、SEQ ID NO:33（図2A～2C）またはSEQ ID NO:38（図4A～4D）を含むベクター（例えば、プラスミド、トランスプライシングプラスミド、ウイルスベクター、アデノウイルス、AAV、AAVゲノム）のヌクレオチド配列の送達をもたらし得、ここで、細胞は、関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC；ヒトSEQ ID NO:2または25；マウスSEQ ID NO:4または26）を発現し得る。対象の細胞との接触工程は、（それぞれ、第1のベクターおよび第2のベクターの）第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列の送達をもたらすことができ、ここで、細胞は、関心対象のタンパク質のN末端部分（例えば、STRC）および関心対象のタンパク質のC末端部分を発現することができ、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分および関心対象のタンパク質のC末端部分は、関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC；ヒトSEQ ID NO:2または25；マウスSEQ ID NO:4または26）が形成されるようペプチド結合によって接続される。
1つの態様は、本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）、または本明細書に記載された組成物、または本開示のベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）もしくは本開示の組成物を含有する細胞、または関心対象のタンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26）をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列（例えば、STRC；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:32）を含むベクターもしくは組成物、または関心対象のタンパク質（例えば、STRC；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26）自体、または関心対象のタンパク質の一部分（例えば、SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18～SEQ ID NO:24）の有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む、対象における常染色体劣性聴覚消失を処置する方法であって、投与が、常染色体劣性聴覚消失またはその症状の低下または回復をもたらし得る、方法を提供することができる。いくつかの態様において、それを必要とする対象は、処置後の対象が、69dB以下（例えば、60dB、55dB、50dB、45dB、40dB、35dB、30dB、26dB、25dB、20dB、15dB、10dB、5dB、0dB）の聴覚レベルを有する場合、成功裏に処置されているであろう。一般に、最重度聴覚消失を有する対象は、95dB未満の音が聞こえず；重度聴覚消失対象は、70dB～94dB未満の音が聞こえず；中等度聴覚消失対象は、40dB～69dB未満の音が聞こえず；軽度聴覚消失対象は、26dB～40dB未満の音が聞こえない。しかしながら、聴覚消失、例えば、常染色体劣性聴覚消失に罹患している対象は、本明細書に記載された方法のいずれかによって処置され得、それによって、聴覚消失もしくはその症状の低下、および/または聴覚（もしくは対象における聴覚機能）の回復もしくは改善、および/または聴覚の維持がもたらされる。正常な聴覚を有する対象は、25dB以下（例えば、20dB、15dB、10dB、5dB、0dB）の音が聞こえることを特徴とし得る。いくつかの態様において、常染色体劣性聴覚消失はDFNB16である。
さらなる態様は、本明細書に記載された二重ベクターシステム、本開示による細胞、または本明細書に記載された組成物もしくは薬学的組成物の有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む、聴覚消失を特徴とする病理または疾患の処置および/または防止の方法を提供し得る。本開示の細胞は、インビボ、インビトロの内耳細胞、内有毛細胞、外有毛細胞等、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
ポリヌクレオチド送達
これらのアプローチにおける治療の成功は、蝸牛のコルチ器内の関連する治療細胞標的への外来性遺伝子構築物の安全かつ効率的な送達に大きく頼る。コルチ器は、音によって運ばれた機械的情報を、ニューロン構造に伝達される電気信号に変換する内有毛細胞、および複雑な聴覚機能のために必要とされる過程である蝸牛反応を増幅し、調整するために役立つ外有毛細胞という2種類の感覚有毛細胞を含む。
核酸を細胞へ送達する方法は、一般に、当技術分野において公知であり、トランスジーンを含有する（ウイルス粒子とも呼ばれる）ウイルスを、インビボの内耳細胞に送達する方法が、本明細書に記載される。本明細書に記載されるように、約108～約1012個のウイルス粒子を対象へ投与することができ、適当な体積（例えば、10μL、50μL、100μL、500μL、または1000μL）の、例えば、人工外リンパ液に、ウイルスを懸濁させることができる。
本明細書に記載される、末端逆位反復（ITR）、プロモーター（例えば、エスピンプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、Myo6プロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、シナプシンプロモーター、GFAPプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、CBHプロモーター、CBAプロモーター、U6プロモーター、およびTMHS（LHFPL5）プロモーター）、シグナル配列、関心対象のタンパク質（例えば、STRCタンパク質）をコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニル化（ポリA）配列を含有し、いくつかの態様において、c-mycタグを連結するためのリンカー配列を含有するウイルスは、多数の手段を使用して内耳細胞（例えば、蝸牛内の細胞）に送達され得る。例えば、本明細書に記載される二重ベクターインテイン媒介タンパク質トランススプライシング系を含有するウイルス粒子を含む組成物は、治療的に有効な量、正円窓もしくは卵円窓、または卵形嚢を通して、典型的には、比較的単純な（例えば、外来の）手技で注射され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載される、二重ベクターインテイン媒介タンパク質トランススプライシング系（例えば、二重AAVインテイン媒介STRCタンパク質系）を含有する、または異なるウイルス粒子の1つもしくは複数のセットを含有する、治療的に有効な数のウイルス粒子を含む組成物は、手術（例えば、蝸牛開窓術またはカナロストミー（canalostomy））中に耳内の適切な位置に送達され得る。
さらに、鼓膜を介した、かつ/または正円窓もしくは卵形嚢を通した薬剤の移入を容易にする送達媒体（例えば、ポリマー）が利用可能であり、任意のそのような送達媒体が、本明細書に記載されたウイルスを送達するために使用され得る。送達媒体については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるArnold et al.,2005,Audiol.Neurootol.,10:53-63を参照すること。
本明細書に記載された組成物および方法は、内耳細胞、例えば、蝸牛細胞への核酸の高効率送達を可能にする。例えば、関心対象のタンパク質（例えば、STRCタンパク質）またはその断片をコードするポリヌクレオチドを、ウイルスベクターにクローニングすることができ、発現は、その内在性プロモーターから、ウイルス末端逆位反復から、または関心対象の標的細胞型に特異的なプロモーターから駆動され得る。使用され得る他のウイルスベクターには、例えば、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはヘルペスウイルス、例えば、エプスタインバーウイルスが含まれる。ウイルスベクターは、臨床現場において使用されている。いくつかの態様において、ウイルスベクター（例えば、rAAV）は、大きい（例えば、Strc遺伝子）ポリヌクレオチドを断片的に投与するために使用され得る。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、Strcポリヌクレオチド断片を身体の特定の領域に投与するために使用され得る。
例えば、本明細書に記載された組成物および方法は、関心対象のポリヌクレオチド（例えば、Strc）の、内有毛細胞および/もしくは外有毛細胞の少なくとも65％以上（例えば、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％）への送達および発現、または外有毛細胞の少なくとも65％以上（例えば、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％）への送達および発現を可能にする。
本明細書に記載された二重ベクターインテイン媒介系を使用して送達されたSTRCポリヌクレオチドの発現は、内有毛細胞および外有毛細胞の構造および機能の改善をもたらし得、その結果、聴覚が長期間（例えば、数日、数週間、数ヶ月、数年、数十年、生涯）にわたって回復する。1つの態様において、聴覚消失は、STRC遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体劣性型の非症候性難聴DFNB16に罹患している対象において回復し得る。STRCおよびステレオシリン（STRC）タンパク質の正常な発現は、聴覚機能に必須である。
本明細書に記載されるように、アデノ随伴ウイルス（AAV）は、核酸（例えば、STRCポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を内耳細胞に送達するために特に効率的である。Anc80ベクターは、内有毛細胞または外有毛細胞の60％以上（例えば、70％、80％、90％、95％、100％）を有利に形質導入した、内耳有毛細胞を標的とするAAVの一例である。1つの態様は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Anc80に関する国際公開番号WO2018/145111（PCT/US2018/017104）に記載されている、Anc80祖先カプシドタンパク質のクラスに属する祖先カプシドタンパク質、例えば、Anc80-0065を利用し得る。参照によりその全体が本明細書に組み入れられるWO2015/054653は、Anc80祖先カプシドタンパク質のクラスに属する多数の付加的な祖先カプシドタンパク質を記載している。
具体的な態様において、アデノ随伴ウイルス（AAV）は、有毛細胞への天然のまたは操作された指向性を有する祖先AAVカプシドタンパク質を含有する。いくつかの態様において、ウイルスは、関心対象のポリペプチド（例えば、STRCタンパク質）をコードする関心対象のポリヌクレオチドを、対象（例えば、DFNB16および/またはSTRC遺伝子の変異に罹患している対象）の内耳に送達する、内耳有毛細胞を標的とするAAVである。いくつかの態様において、ウイルスは、精製されたカプシドポリペプチドを含むAAVである。いくつかの態様において、ウイルスは人工である。いくつかの態様において、ウイルスは、AAV2より低い血清有病率を有するAAVである。いくつかの態様において、ウイルスは、エクソーム関連AAVである。いくつかの態様において、ウイルスは、エクソーム関連AAV1である。いくつかの態様において、ウイルスは、Anc80カプシドタンパク質と少なくとも95％のアミノ酸配列の同一性または相同性を有するカプシドタンパク質を含む。
関心対象のポリヌクレオチド（例えば、STRC）の発現は、異種プロモーター（例えば、CMVプロモーター、エスピンプロモーター、PCDH15プロモーター、PTPRQプロモーター、TMHS（LHFPL5）プロモーター）によって指図され得る。本明細書において使用されるように、「異種プロモーター」とは、その配列の発現を天然には指図しない（即ち、その配列に天然には見出されない）プロモーターをさす。
例えば、Anc80カプシドタンパク質を含有するウイルスにトランスジーンをパッケージングする方法は、当技術分野において公知であり、従来の分子生物学および組換え核酸技術を利用する。1つの態様において、Anc80カプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む構築物、ならびに適当な末端逆位反復（ITR）が隣接するSTRCタンパク質のN末端部分およびC末端部分をコードするポリヌクレオチドの断片を保持する構築物が提供され、それは、Anc80カプシドタンパク質へのパッケージングを可能にする。
関心対象のポリヌクレオチド（例えば、STRC）は、例えば、パッケージング宿主細胞を使用して、Anc80カプシドタンパク質を含有するAAVにパッケージングされ得る。ウイルス粒子の成分（例えば、rep配列、cap配列、末端逆位反復（ITR）配列）は、本明細書に記載される1つまたは複数の構築物を使用して、一過性または安定的にパッケージング宿主細胞に導入され得る。関心対象のポリヌクレオチドは、一般に、分割され、複数のAAVにパッケージングされることを必要とし得る、大きい遺伝子（例えば、4kB以上）であり得る。
いくつかの態様において、AAV9-php.bベクターを含有するAAVは、内耳細胞を効率的に標的とするために使用され得る。AAV9-php.bは、国際公開番号WO2019/173367（PCT/US2019/020794）に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。AAV-PHP.Bは、7残基長配列TLAVPFK（SEQ ID NO:59）をコードし、トランスジーンを蝸牛に効率的に送達し、そこで、内有毛細胞および外有毛細胞における著しく特異的かつロバストな発現を示した。AAV-PHP.Bベクターは、本明細書に記載されたプロモーターのいずれかを含み得るが、それらに限定されるわけではない。
ポリヌクレオチド治療法において使用するためのcDNA発現は、任意の適当なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、サルウイルス40（SV40）プロモーター、またはメタロチオネインプロモーター）から指図され得、任意の適切な哺乳動物制御要素によって制御され得る。例えば、所望により、特定の細胞型における遺伝子発現を優先的に指図することが公知のエンハンサーが、核酸の発現を指図するために使用され得る。使用されるエンハンサーには、非限定的に、組織特異的または細胞特異的なエンハンサーとして特徴付けられるものが含まれ得る。あるいは、ゲノムクローンが治療用構築物として使用される場合、制御は、同族制御配列によって媒介されてもよいし、または、所望により、異種起源に由来する制御配列、例えば、前記のプロモーターもしくは制御要素のいずれかによって媒介されてもよい。
治療法
本開示に含まれるもう1つの治療アプローチは、組換え治療薬（例えば、組換えSTRCタンパク質、バリアント、またはその断片）を、（例えば、任意の従来の組換えタンパク質投与技術によって）疾患に罹患している可能性のある組織もしくは実際に疾患に罹患している組織の部位に直接投与するか、または全身的に投与することを含み得る。投与されるタンパク質の投与量は、個々の患者のサイズおよび健康状態を含む多数の要因に依存する。任意の特定の対象について、具体的な投薬計画は、個々の必要性、および組成物を投与するか、または組成物の投与を監督する者の専門的判断に従って、経時的に調整されるべきである。
本開示のいくつかの態様は、関心対象の全長タンパク質（例えば、STRC）をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターシステム（例えば、二重ベクターインテイン媒介系）を含む薬学的組成物を、治療的に有効な量、（例えば、対象の）細胞へ投与することを含む、それを必要とする対象における疾患および/または障害またはそれらの症状の処置または防止または低下の方法を提供し得、ここで、細胞のゲノムは変異を含み得る。本開示の二重ベクターインテイン媒介系を使用する態様において、それを必要とする対象における疾患および/または障害またはそれらの症状の処置または防止または低下の方法は、関心対象のタンパク質の一部分（例えば、N-STRC）をコードする第1のヌクレオチド配列および関心対象のタンパク質の残りの部分（例えば、C-STRC）をコードする第2のヌクレオチド配列を含む二重ベクターインテイン媒介系を含む薬学的組成物を、治療的に有効な量、それを必要とする対象（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）の、変異を含むゲノムへ投与することを含み得る。従って、1つの態様は、変異に関連した疾患もしくは障害もしくはそれらの症状に罹患しているか、または感受性のある対象を処置する方法である。方法は、本明細書中の組成物を、疾患または障害または症状の処置または防止または低下のために十分な治療的な量、対象へ投与することを含む。いくつかの態様において、変異は劣性変異である。
（予防的処置を含む）本発明の治療方法は、一般に、本明細書中の化合物または組成物、例えば、本明細書中の製剤の化合物を、治療的に有効な量、それを必要とする対象（例えば、動物、ヒト）、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトへ投与することを含む。そのような処置は、疾患、障害、またはそれらの症状に罹患しているか、それを有するか、それに対して感受性があるか、またはそのリスクを有する対象、具体的には、ヒトへ適当に投与されるであろう。「リスクを有する」対象の決定は、診断試験または対象もしくは医療提供者の意見による任意の客観的または主観的な決定（例えば、遺伝子検査、酵素またはタンパク質マーカー、（本明細書において定義される）マーカー、家族歴等）によってなされ得る。
ヒト患者または非ヒト動物の処置は、生理学的に許容される担体の中の治療的に有効な量の組み合わせ治療薬を使用して実施され得る。「薬学的に許容される」という語句は、正当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症がなく、合理的な利益/リスク比に見合った、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するために適当な、本開示の化合物、そのような化合物を含有する組成物、および/または剤形をさす。
組成物は、便利に、単位剤形で提示されてよく、当技術分野において周知の任意の方法によって調製され得る。単一剤形を作製するために担体材料と組み合わせられ得る組成物（例えば、関心対象のタンパク質（例えば、STRC）のN末端部分またはC末端部分をコードする配列を含有するベクター）の量は、処置される宿主、具体的な投与様式に応じて変動する。単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わせられ得る組成物の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量であろう。一般に、100％のうち、この量は、組成物の1％～99％（例えば、5％～70％、10％～30％）の範囲であろう。
組成物は、いくつかのケースにおいて、当業者に公知の診断方法によって決定され得る、疾患または状態の臨床的または生理学的な症状をコントロールする投与量で投与され得る。
治療用組成物および治療的組み合わせは、有効量で投与される。例えば、約108～約1012個のウイルス粒子を対象へ投与することができ、ウイルスを、適切な体積（例えば、10μL、50μL、100μL、500μL、または1000μL）の、例えば、人工外リンパ液に懸濁させることができる。
常染色体劣性聴覚消失を処置する方法
常染色体劣性聴覚消失（例えば、常染色体劣性非症候性難聴16（DFNB16））を処置するための組成物および方法が提供される。
簡単に説明すると、DFNB16は、影響を受けた個体のSTRC遺伝子の変異に関連している。内耳における細胞外構造タンパク質ステレオシリン（STRC）をコードするSTRCの正常な発現は、聴覚機能に必須である。聴覚消失の回復を誘導するため、本明細書に記載されるベクターシステム（例えば、二重AAVインテイン媒介STRCタンパク質トランススプライシング系）を使用して、即ち、全長mRNAおよび全長STRCタンパク質が発現されるよう、野生型STRC遺伝子配列またはその断片をパッケージングすることによって、野生型STRC遺伝子が対象へ投与される。
いくつかの態様において、STRCタンパク質をコードするベクターシステム、例えば、二重AAVインテイン媒介STRCタンパク質トランススプライシングベクターは、ステレオシリン（STRC）タンパク質をコードする少なくとも1つのベクター（例えば、5'STRCベクターおよび3'STRCベクター）を、対象の蝸牛へ直接注射することによって、DFNB16聴覚消失を有する対象へ投与され得る。いくつかの態様において、1つのベクターは、N-STRCタンパク質のみをコードし、1つのベクターは、C-STRCタンパク質のみをコードする。治療目的のため、STRCポリペプチド、またはSTRCポリペプチドをコードするSTRCポリヌクレオチドを含む組成物は、疾患または状態によって影響を受けている身体の領域（例えば、蝸牛）へ直接投与され得、ここで、対象のゲノムは、本明細書に記載される聴覚消失（例えば、DFNB16）を引き起こすか、またはそれに寄与するSTRC変異を含む。
1つの態様は、本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）；本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）を含有する細胞；または本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）と薬学的に許容される媒体とを含む薬学的組成物の有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む、対象における常染色体劣性聴覚消失を処置する方法を提供し得る。いくつかの態様は、DFNB16である常染色体劣性聴覚消失を処置する方法に関することができる。
本開示のもう1つの態様は、対象の細胞を、本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）と薬学的に許容される媒体とを含む組成物と、接触させることを含む方法を提供し、ここで、接触は、タンパク質のN末端部分を発現する第1のヌクレオチド配列およびタンパク質のC末端部分を発現する第2のヌクレオチド配列の細胞への送達をもたらし、細胞は、全長タンパク質が形成されるようペプチド結合によって接続されるタンパク質のN末端部分およびタンパク質のC末端部分を発現する。
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）；本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）を含有する細胞；または本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）と薬学的に許容される媒体とを含む薬学的組成物の有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む、聴覚消失を特徴とする病理または疾患の処置および/または防止の方法を提供し、ここで、投与工程は、対象の少なくとも1つの細胞（例えば、内耳細胞、内有毛細胞、外有毛細胞）において行われる。1つの態様において、有効量の、本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）；本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）を含有する細胞；または本明細書に記載されたベクターシステム（例えば、二重ベクターシステム）と薬学的に許容される媒体とを含む薬学的組成物と、細胞を接触させるか、またはそれらを細胞へ投与する方法は、インビボ、エクスビボ、および/またはインビトロで行われる。もう1つの態様は、本明細書に記載される方法のいずれかであって、対象における聴覚機能を改善するか、または回復させる方法を提供する。
非限定的な投与方法には、蝸牛管または蝸牛管周囲の外リンパ液で満たされた空間（例えば、鼓室階および前庭階）への注射が含まれ得る。高カリウムの内リンパ液で満たされた蝸牛管への注射は、有毛細胞への直接アクセスを提供し得る。しかしながら、この繊細な液体環境の改変は、蝸牛内電位を妨害し、注射関連毒性のリスクを高める可能性がある。蝸牛管周囲の外リンパ液で満たされた空間、鼓室階および前庭階は、卵円窓または正円窓のいずれかの膜を通して、中耳からアクセスされ得る。内耳への唯一の非骨性開口部である正円窓膜は、多くの動物モデルにおいて比較的容易にアクセス可能であり、この経路を使用したウイルスベクターの投与は、耐容性が良好である。ヒトにおいて、人工内耳の設置は、ルーチンに、正円窓膜を通した外科的電極挿入に頼っている。
いくつかの態様において、関心対象のタンパク質（例えば、野生型STRC）の発現は、対象における聴覚機能を回復させ得る。いくつかの態様において、対象に回復される聴覚機能は、10％以上（例えば、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％）；100％以下（例えば、95％、85％、75％、65％、55％、45％、35％、25％、15％）であり得る。
以下の実施例は、本発明の説明の具体的な局面を例示する。実施例は、態様およびその様々な局面の具体的な理解および実施を提供するものに過ぎないため、限定的なものとして解釈されてはならない。
実施例1：インビトロで大きい遺伝子を形質導入する二重ベクターシステム
AAVベクター作製
本明細書に開示される関心対象のタンパク質の送達のための二重ベクターまたは二重トランススプライシング系は、内耳において、例えば、2つの独立したアデノ随伴ウイルス血清型2（AAV2）/アデノ随伴ウイルス血清型9（AAV9）-Php.Bベクターにおいて、STRCコード配列を使用して証明された。STRCコード配列の最初の2,247塩基対（即ち、STRCのN末端部分）の直後に位置し、その後に3'ITRが続く、スプライスドナー配列（例えば、N-インテイン）を有する第1のAAVゲノムを作製した（例えば、AAV2/AAV9-Php.B-STRC-トランス/ドナー）。5'ITRの後に位置し、C末端mycタグを含む残りのSTRCコード配列（即ち、STRCのC末端部分）の直前に位置する、対応するスプライスアクセプター配列を含む第2のAAVゲノムを作製した（例えば、AAV2/AAV9-Php.B-STRC-トランス/アクセプター）。AAV2ゲノムは、ウイルスゲノムの各末端にある末端逆位反復（ITR）によってコンカテマーを形成することが公知であるため、STRCコード配列を2つの断片に分割し、別々のAAVカプシド（例えば、内有毛細胞および外有毛細胞を効率的に形質導入することが示された合成AAV：Anc80）にパッケージングした。
インテイン媒介トランススプライシングおよびプロセシングを確認するため、全長STRCの一部分をコードするAAV2/AAV9-Php.Bベクターを感染させたHEK293細胞（感染5日後）を、ウエスタンブロットによって分析した（図24）。具体的には、図24は、以下のものを示す：レーン1：対照またはトランスフェクトされていないHEK293T細胞；レーン2：全長ステレオシリン（STRC）（196.4kDa）；レーン3：pCFS-＃2、C部分（C部分のみを有する構築物＃2を含むベクター（116.7kDa））；レーン4：pCFS-＃2、N＋C部分（N部分およびC部分を有する構築物＃2を含むベクター）；レーン5：pCFS-＃1、C部分（C部分のみを有する構築物＃1を含むベクター（91.6kDa））；レーン6：pCFS-＃1、N＋C部分（N部分およびC部分を有する構築物＃1を含むベクター）。ウエスタンブロットの右側の矢印は、レーン4の全長STRCタンパク質をさし、STRCのN末端部分およびC末端部分をコードする配列をそれぞれ含有する2つのAAV2/AAV9-Php.BベクターがHEK293細胞にトランスフェクトされた時に、STRCのN末端部分およびC末端部分の両方が形成されたことを証明している。
シグナル配列の有用性を確認するため、さらなるウエスタンブロットを実施した。図25は以下のものを示す：レーン1：全長ステレオシリン（STRC）（196.4kDa）；レーン2：対照またはトランスフェクトされていないHEK293T細胞；レーン3：pCFS-＃2、C部分、（-）シグナル（シグナル配列を含まず、C部分（116.7kDa）のみを有する構築物＃2を含むベクター）；レーン4：pCFS-＃2、N＋C部分、（-）シグナル（シグナル配列を含まず、N部分およびC部分を有する構築物＃2を含むベクター）；レーン5：pCFS-＃2、C部分、（+）シグナル（シグナル配列を含むC部分（91.6kDa）のみを有する構築物＃2を含むベクター）；レーン6：pCFS-＃2、N＋C部分、（+）シグナル（シグナル配列を含むN部分およびC部分を有する構築物＃2を含むベクター）。ウエスタンブロットの右側の矢印は、レーン6の全長STRCタンパク質をさし、全長STRCタンパク質の形成をもたらすためにはシグナル配列が必要であったことを証明している。
AAVベクターは、Boston Children's Hospital Viral Core（Boston,MA,USA）によって作製された。AAV9-php.b-cmvへのパッケージング前に配列決定されたSTRCおよびインテインを含有するプラスミド（MGH DNA Core、完全プラスミド配列決定）。ウイルスの末端逆位反復（AAV2）に特異的なqPCRによって決定されたベクター力価は、4.8×1014gc/mlであった。
実施例2：インビボのStrcノックアウトマウスにおける二重ベクターシステムの分析
動物
全ての動物は、施設において飼育され、収容された。動物を含む全ての研究は、HMS Standing Committee on Animals（プロトコル番号03524）ならびにBoston Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee（プロトコル番号2878および3396）によって承認された。全ての実験が、動物プロトコルに従って実施された。
ステレオシリンが欠損しているヌル対立遺伝子（「ノックアウト」）マウス（STRC-/-；StrcΔ/Δ）を生成し、ステレオシリンタンパク質の欠如または非機能性のステレオシリンタンパク質をもたらすSTRC変異によって引き起こされるヒト聴覚消失DFNB16表現型のマウスモデルとして用いた。Strcホモ接続性変異マウス（STRC＃16ホモ）は、聴性脳幹反応（ABR）によって決定されるように、4週齢までに、重度聴覚消失を示し、6週齢までに、変異マウスは完全に難聴となった。Strcホモ接続性変異マウスは、80dB音圧レベルまでの検出可能な歪成分耳音響放射（DPOAE）も欠いており、このことは、正常な外有毛細胞（OHC）機能の欠如を反映する。
StrcΔ/Δマウスを生成し、図32A～32Gにおいて特徴決定した。関心対象の野生型（WT）タンパク質、例えば、Strcを、Strc遺伝子のエクソン4を標的とする3つのガイドRNA（sgRNA）を設計することによって、CRISPR/Cas9戦略を使用して破壊した。破壊は、249ヌクレオチドの欠失（1509～1758位）ならびに2つの転位および逆位（3'末端に近い947～1139位；5'末端に近い1758～1835位）をもたらした。
内耳注射
Strc-/-またはStrcWT/WTの仔マウスの内耳に、生後1日目（P1）に、1μlのAAV9-php.b-cmv-STRCインテインウイルスを、60nl/分の速度で注射した。2～3分間の氷水での低温曝露を使用して、仔マウスに麻酔をかけた。麻酔時に、耳胞（otic bulla）を露出させ、蝸牛を可視化するため、耳後部切開を行った。ガラス製マイクロピペットによって、手動で、注射を行った。注射後、縫合糸を使用して皮膚切開部を閉じた。次いで、注射されたマウスを、回復のため、42℃の加熱パッドの上に置いた。仔マウスは、およそ10分以内に、完全に回復した後、母親に戻された。標準的な術後ケアを術後に適用した。インビボ研究のサンプルサイズは、サンプルサイズを最適化し、分散を減少させるために、継続的に決定された。P5～P7において、注射された耳からコルチ器を切り出した。コルチ器組織を37℃、5％CO2で8～10日間インキュベートし、電気生理学記録の直前に蓋膜を除去した。
聴覚試験
それぞれ、N-インテインを有するN-STRCおよびC-インテインを有するC-STRCをコードする配列を含むAAVベクターを使用した二重ベクターシステムが、聴覚消失を回復させ得るか否か、およびその回復の程度を決定するため、聴性脳幹反応（ABR）および歪成分耳音響放射（DPOAE）を、ステレオシリンノックアウト（STRC-/-）マウスにおいて測定した。ABRおよびDPOAEの測定値は、EPL Acoustic system（Massachusetts Eye and Ear,Boston）を使用して記録された。音響刺激は、PXI-1042Qシャーシ内の24ビットデジタル入出力カード（National Instruments PXI-4461）によって生成され、SA-1スピーカードライバー（Tucker-Davis Technologies,Inc.）によって増幅され、カスタム音響系の2つの静電ドライバー（CUI CDMG15008-03A）から送達された。小さいプローブ管の端にあるエレクトレットマイクロフォン（Knowles FG-23329-P07）を使用して、外耳道音圧をモニタリングした。ABRおよびDPOAEを、同じセッション中にマウスから記録した。ABR信号は、耳介（活性電極）、頭頂部（参照電極）、および臀部（接地電極）に挿入された皮下針電極を使用して収集された。ABR電位は、Eaton-Peabody Laboratories Cochlear Function Test Suiteからのカスタムデータ取得ソフトウエア（LabVIEW）を使用して、増幅され（10,000×）、パスフィルターに供され（0.3～10kHz）、デジタル化された。音刺激および電極電位は、デジタルI-Oボード（National Instruments）を使用して40μs間隔でサンプリングされ、オフライン分析のために保存された。閾値は、ピーク1が検出され、増加する音強度によって再現され得る最低デシベルレベルとして視覚的に定義された。ABR閾値は、各実験群内で平均化され、統計分析のために使用された。ABRおよびDPOAEの測定は、遺伝子型を知らない研究者によって実施された。
キシラジン（5～10mg/kg）およびケタミン（60～100mg/kg）の腹腔内（i.p.）注射によってマウスに麻酔をかけ、外耳道を露出させるため、耳介の基底部を切り取った。3つの皮下針電極を、（a）2つの耳の間の背側（参照電極）；（b）左耳介の後ろ（記録電極）；（c）動物の臀部の背側（接地電極）において皮膚に挿入した。必要に応じて、麻酔を維持するため、ケタミンの付加的なアリコート（60～100mg/kg i.p.）をセッションを通して与えた。ABR試験の前に、外耳道の入り口における音圧を、個々の各試験対象について、全ての刺激周波数において較正した。ABRおよびDPOAEのデータは、同じ条件で、同じ記録セッション中に収集された。
DPOAEを最初に記録した。2f1-f2においてDPOAEを生成するため、プライマリトーンは、1.2の周波数比（f1とf2のプライマリトーンの周波数比（f2/f1＝1.2））で作製され、各f2/f1対について、f2レベルはf1レベルより10dB低い音圧レベルであった。トーンは、半オクターブ段階で5.6～32.0kHzの間で変動するf2およびL1-L2＝10デシベル音圧レベル（dB SPL）によって提示された。各f2において、L2は10dBずつ10dB～80dBの間で変動した。DPOAE閾値は、平均スペクトルから、ノイズフロアより5dB高い大きさのDPOAEを誘発するL2レベルとして定義された。平均ノイズフロアレベルは、全ての周波数で0dB未満であった。各レベルにおいて、記録された外耳道音圧の信号雑音（s/n）比を増加させるため、波形およびスペクトルの平均化を使用した。2f1-f2におけるDPOAEは、平均化されたスペクトルから抽出された振幅を有し、スペクトル内の隣の点におけるノイズフロアを有していた。音レベルに対するDPOAE振幅のプロットからの内挿は、イソレスポンス（iso-response）曲線をもたらした。閾値は、0dBを超えるDPOAEを生成するために必要とされるf2レベルとして定義された。
次いで、ABR実験を防音チャンバー内で32℃で実施した。聴覚機能を試験するため、全て、5msトーンピップとして提示された、広帯域「クリック」音、および半オクターブ段階の5.6～32.0kHzの純音の刺激をマウスに提示した。反応は、PCベースのデータ取得系（EPL、Cochlear function test suite、MEE、Boston）のアナログデジタル（analog-to-digital）ボードによって、増幅され（10,000倍）、フィルタリングされ（0.1～3kHz）、平均化された。様々な試験において、音レベルを、0から110dB SPLまで、5～10dB段階で上昇させた。各レベルにおいて、512の反応を収集し、「アーティファクト除去」の後、（交互の刺激極性によって）各音圧レベルについて平均化した。バックグラウンドノイズに対するピーク1の出現の目視検査によって、閾値を決定した。データを分析し、Origin-2015（OriginLab Corporation,MA）を使用してプロットした。他に示されない限り、閾値の平均値±標準偏差が提示される。これらの実験の大部分が、盲検条件下では実施されなかった。
NHEJによって媒介されたCas9によって生成された切断によって、Strc遺伝子コード配列を破壊することによって、STRCを欠くノックアウトマウスを生成した。機能性タンパク質の合成を破壊する、STRC遺伝子のエクソン4内のおよそ200塩基対の欠失が生成された。このマウスモデルは、ステレオシリンタンパク質の欠如または非機能性のステレオシリンタンパク質をもたらすSTRC変異によって引き起こされるDFNB16表現型のヒト聴覚消失を正確に再現することが見出された。4週齢STRCホモ接続性変異マウスは、聴性脳幹反応（ABR）に基づき、重度聴覚消失を示し、6週目までに、これらのマウスは、完全に難聴となった。ABR閾値は、明確な反応（CR）が存在する最低レベルであり得る。歪成分耳音響放射（DPOAE）は、外有毛細胞の完全性および蝸牛機能を反映する。これらのSTRCホモ接続性変異マウスは、80デシベル（dB）音圧レベルまでの検出可能なDPOAEを有し、このことは、正常な外有毛細胞（OHC）機能の欠如を反映している。
図3は、ABR波形結果からの音圧レベルを示す。中央および左側の波形は、単独のSTRC-KOマウス、STRC-/-マウス（Strc＃16ホモ）（n＝5）、ならびにシグナル配列、N-インテインまたはC-インテイン、および、それぞれ、STRCタンパク質のN末端部分またはC末端部分をコードする配列を各々含有するAAVベクター（例えば、AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-N；AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-C）を注射されたマウス（n＝9）を示し、右側の波形は、完全なSTRC遺伝子を有する野生型（WT）マウス（STRCWT/WT）（n＝6）を表す。WTマウスは、30dB～100dBの範囲の音圧レベルを示す。中央のSTRC KOマウス（Strc＃16ホモ）は、70dB～120dBの範囲の限定された音圧レベルを示し、このことは、70dB未満の聴覚消失を証明した。しかしながら、左側の波形は、AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-N；AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-Cを注射されたSTRC KOマウスが、WT STRCマウスのレベルに相当するレベルにまで聴覚消失を回復させることができたことを証明している。
平均聴覚閾値またはABRを、4週齢マウスにおいて全ての周波数において試験した。図4AのABRの結果は、シグナル配列、N-インテインまたはC-インテイン、およびSTRCタンパク質のN末端部分またはC末端部分をコードする配列を各々含有するAAVベクター（例えば、AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-N；AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-C）を含む、本明細書に記載された二重ベクターシステムを注射されたSTRCノックアウト（KO）マウス（Strc-/-）（n＝9；中央線）が、それぞれ、聴覚消失の回復を示し、最低ABR閾値がいくつかの周波数で30dBまで低下したことを示した。野生型マウス（n＝6；最も下方の線）からのABR反応は、いくつかの周波数において20dBまで低下する最低ABR閾値を有していた。しかしながら、STRC KOマウス（n＝5；上方の線）は、80dBを超える閾値を有する重度聴覚消失を有していた。
図5Aおよび図6AのABR結果は、STRC KOマウス（n＝5；エラーバー付きの上方の線）が、80dBを超える閾値を有する重度聴覚消失を有していたことを示す。N-STRC（n＝4；AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-N）またはC-STRC（n＝3；AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-C）をコードする野生型STRCのインテインAAVコード部分のいずれかを注射されたSTRC KOマウスは、STRC KOマウスの結果に類似した、即ち、80dBを超える聴覚閾値を示した。しかしながら、野生型マウス（n＝5；最も下方の線）からのABR反応は、いくつかの周波数で20dBまで低下する最低ABR閾値を有していた。
（図45Aにおいて使用されたのと同じSTRC KOマウスを使用した）図4BのDPOAE結果は、シグナル配列、N-インテインまたはC-インテイン、およびSTRCタンパク質のN末端部分またはC末端部分をコードする配列を各々含有するAAVベクター（例えば、それぞれ、AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-N；AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-C；n＝9；中央の線）を含む、本明細書に記載された二重ベクターシステムを注射されたSTRC KOマウスが、いくつかの周波数において30dBまで低下したDPOAE反応によって証明されるように、聴覚消失の回復を示すことを証明した。同様に、野生型マウス（n＝6；最も下方の線）は、最低DPOAE閾値がいくつかの周波数において30dBまで低下したDPOAE反応を示した。しかしながら、STRC KOマウス（n＝5；上方の線）は、試験された条件で（80dBまで）DPOAE反応を示さなかった。
（図5Aおよび図6Aにおいて使用されたのと同じSTRC KOマウスを使用した）図5Bおよび図6BのDPOAE結果は、STRC KOマウス（n＝5；上方の線）が、試験された条件で（80dBまで）DPOAE反応を示さなかったことを証明した。同様に、N-STRC（n＝4；AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-N）またはC-STRC（n＝3；AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-C）をコードする野生型STRCのインテインAAVコード部分のいずれかを注射されたSTRC KOマウスは、DPOAE反応を示さなかった。しかしながら、野生型マウス（n＝5；最も下方の線）は、最低DPOAE閾値がいくつかの周波数において30dBまで低下したDPOAE反応を示した。
図7Aおよび図7Bは、シグナル配列、N-インテインまたはC-インテイン、およびSTRCタンパク質のN末端部分またはC末端部分をコードする配列を各々含有するAAVベクター（例えば、それぞれ、AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-N；AAV2/AAV9-Php.B-Cmv-Strc-C）を含む、本明細書に記載された二重ベクターシステムを注射された3匹のSTRC KOマウスを経時的にモニタリングした結果を示す。各マウスについてのABR反応は、一般に、4週目（実線）のマウスについて、いくつかの周波数において最低閾値を示した。一般に、各マウスについての閾値は、時間の経過と共に、4週目に達成されたものと比較して、6週目（破線）および8週目（破線/点線）に増加した。例えば、図7Aは、4週目（実線）に、マウス＃3が、10kHz未満の周波数において、40dB～55dBの範囲のABR閾値を有し、6週間（破線）に、マウス＃3が、10kHz未満の周波数において、4週目に観察されたものより大きいデシベル、50dB～70dBの範囲のABR閾値を有していたことを示す。DPOAE反応について、時間の経過と共に、低い周波数から高い周波数へのシフトが観察された。図7Bにおいて、最低DPOAE閾値反応（50dB）は、マウス＃3について、4週目には11kHz、6週目には16kHzの周波数において起こった。
実施例3：二重ベクターシステムを使用した形態の回復
二重AAV送達系は、抗STRC抗体とAlex488コンジュゲート二次抗体（緑）およびAlexa546-ファロイジン（赤）とによって染色された蝸牛の目視観察によって証明されるように、STRC発現および毛束形態を回復させた。例えば、図33Aは、野生型（WT）StrcまたはStrcΔ/Δを注射された蝸牛、および二重AAVベクターを注射されたStrcΔ/Δ蝸牛の共焦点画像を提示する。STRCおよびアクチンを染色したところ、両方とも、WT（左上）において観察され、StrcΔ/Δ+二重AAVベクター試料（右上）において部分的に観察されたが、StrcΔ/Δ（上中央）においては破壊されたアクチン外有毛細胞（OHC）束が観察された。WTにおいては、STRC局在が緑色染色によって示され、逆V字形毛束が形成され（左下）、StrcΔ/Δ+二重AAVベクター試料においては、部分的に提示または回復したが（右下）、StrcΔ/Δは、緑色に染色される毛束を示すことができなかった（下中央）。
本開示の二重AAVベクター送達系は、図33Bの毛束形態（下パネル）をほぼWTレベル（上パネル）まで回復させることが、走査型電子顕微鏡像において観察された。StrcΔ/Δを注射された外有毛細胞束は、野生型の組織化されたOHC束とは対照的に、混乱した、または組織化されていないOHC束をもたらす（中央パネル）。
実施例4：二重ベクターシステムを使用した聴覚機能の回復
二重AAVベクターシステムは、10dBから50dBまでの範囲の音圧レベルのDPOAE波形のフーリエ分析によって証明されるように、DPOAEおよびABRの閾値も回復させ、StrcΔ/Δ+二重AAVベクター試料（図34A、右）は、野生型のパターンと類似した聴覚機能パターンを有することが観察された（図34A、左）。DPOAE閾値は、二重AAVベクターを注射されたStrcΔ/Δマウスが聴覚機能を回復させたことを示す（図34B）。野生型（図34C、左）およびStrcΔ/Δ+二重AAVベクター（図34C、右）を注射された蝸牛について記録されたABRトレースは、25dB～110dBの範囲の類似した音圧レベルをもたらしたが、StrcΔ/Δを注射された蝸牛については、70dB～120dBの音圧レベルであった（図34C、中央）。ABR閾値は、5kHz～30kHzの範囲の周波数において、単独のStrcΔ/Δと比較して、StrcΔ/Δ+二重AAVベクターがマウスに注射された時の回復を証明することが示された（図34D）。
具体的な態様
各々、本開示の範囲内にあると見なされる、非限定的な具体的な態様を、以下に記載する。
具体的な態様1. 細胞において関心対象のタンパク質を発現させるための二重ベクターシステムであって、
（a）5'から3'の方向に、
- 関心対象のタンパク質のアミノ末端（N末端）部分をコードする部分コード配列の5'末端にある、シグナル配列；
- 関心対象のタンパク質のN末端部分をコードする部分コード配列；
- 部分コード配列の下流に隣接している、スプライスドナー配列をコードする配列
を含む第1のヌクレオチド配列を含む、第1のベクター、および
（b）5'から3'の方向に、
- 関心対象のタンパク質のカルボキシ末端（C末端）部分をコードする部分コード配列の5'末端にある、シグナル配列；
- スプライスアクセプター配列をコードする配列であって、スプライスアクセプター配列が、シグナル配列と関心対象のタンパク質のC末端部分をコードする部分コード配列とに挟まれている、スプライスアクセプター配列をコードする配列；
- 関心対象のタンパク質のC末端部分をコードする部分コード配列
を含む第2のヌクレオチド配列を含む、第2のベクター
を含む、二重ベクターシステム。
具体的な態様2. 具体的な態様1の二重ベクターシステムであって、
（a）5'から3'の方向に、
- 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
- プロモーター配列；
- プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、シグナル配列；
- 関心対象のタンパク質のアミノ末端（N末端）部分をコードする部分コード配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、部分コード配列；
- インテインのアミノ末端断片（N-インテイン）をコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、N-インテインをコードする配列；
- ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；
- 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
を含む第1のヌクレオチド配列を含む、第1のベクター、および
（b）5'から3'の方向に、
- 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
- プロモーター配列；
- プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、シグナル配列；
- インテインのカルボキシ末端断片（C-インテイン）をコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、C-インテインをコードする配列；
- 関心対象のタンパク質のカルボキシ末端（C末端）部分をコードする部分コード配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、部分コード配列；
- ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；
- 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
を含む第2のヌクレオチド配列を含む、第2のベクター
を含む、二重ベクターシステム。
具体的な態様3. 具体的な態様1または2の二重ベクターシステムであって、第1のベクターおよび第2のベクターが、細胞において、
（a）N末端からC末端の方向に、
- シグナルペプチド配列であって、関心対象のタンパク質配列のN末端部分に連結されており、関心対象のタンパク質配列がそのC末端においてN-インテインタンパク質配列に融合している、シグナルペプチド配列
を含む、第1のタンパク質配列、および
（b）N末端からC末端の方向に、
- シグナルペプチド配列であって、C-インテインタンパク質配列に連結されており、C-インテインタンパク質配列が関心対象のタンパク質配列のC末端部分のN末端に融合している、シグナルペプチド配列
を含む、第2のタンパク質配列
をそれぞれ発現する、二重ベクターシステム。
具体的な態様4. 関心対象のタンパク質のN末端部分および関心対象のタンパク質のC末端部分が、関心対象の全長タンパク質を形成するように構成されている、具体的な態様1～3のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様5. 第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列が同じである、具体的な態様1～4のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様6. 第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列が、第1のタンパク質配列および第2のタンパク質配列を同じ細胞コンパートメントに輸送するように構成されている、具体的な態様1～4のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様7. 第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列が異なり、各シグナルペプチド配列が、それぞれのタンパク質配列を同じ細胞コンパートメントに向ける、具体的な態様1～4のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様8. 第1のベクターおよび第2のベクターが各々ウイルスベクターである、具体的な態様1～7の二重ベクターシステム。
具体的な態様9. ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、具体的な態様8の二重ベクターシステム。
具体的な態様10. ウイルスベクターが同じまたは異なる血清型である、具体的な態様8または具体的な態様9の二重ベクターシステム。
具体的な態様11. N末端部分およびC末端部分がペプチド結合を通して関心対象の全長タンパク質を形成するように構成されている、具体的な態様1～10のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様12. 関心対象のタンパク質がSTRCタンパク質である、具体的な態様1～11のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様13. STRCタンパク質がSTRC遺伝子によってコードされる、具体的な態様12のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様14. シグナル配列がSEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:11と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有する核酸配列を含む、具体的な態様1～13のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様15. シグナル配列が、SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:12と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチド配列をコードする、具体的な態様1～14のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様16. 関心対象のタンパク質のN末端部分が、SEQ ID NO:5もしくはSEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:16をコードする核酸配列と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有する核酸配列を含む、具体的な態様1～15のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様17. 関心対象のタンパク質のN末端部分が、SEQ ID NO:15またはSEQ ID NO:16と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、具体的な態様1～16のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様18. N-インテイン配列が、SEQ ID NO:13と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有する核酸配列を含む、具体的な態様1～17のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様19. N-インテイン配列が、SEQ ID NO:14と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、具体的な態様1～18のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様20. 関心対象のタンパク質のC末端部分が、SEQ ID NO:23またはSEQ ID NO:24をコードする核酸配列と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有する核酸配列を含む、具体的な態様1～19のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様21. 関心対象のタンパク質のC末端部分が、SEQ ID NO:23またはSEQ ID NO:24と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、具体的な態様1～20のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様22. C-インテイン配列が、SEQ ID NO:21またはSEQ ID NO:46と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有する核酸配列を含む、具体的な態様1～21のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様23. C-インテイン配列が、SEQ ID NO:22またはSEQ ID NO:49と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、具体的な態様1～22のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様24. 第1のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:5またはSEQ ID NO:7と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有する核酸配列を含む、具体的な態様1～23のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様25. 第1のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:8と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、具体的な態様1～24のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様26. 第2のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:19と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有する核酸配列を含む、具体的な態様1～25のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様27. 第2のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:18またはSEQ ID NO:20と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、具体的な態様1～26のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様28. 宿主細胞においてSTRC遺伝子のコード配列を発現させるためのベクターシステムであって、コード配列が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、もしくはSEQ ID NO:38のSTRC遺伝子、SEQ ID NO:30もしくはSEQ ID NO:32のmRNA配列、またはそれらの断片を含む少なくとも1つのベクターを含む、ベクターシステム。
具体的な態様29. STRC遺伝子が、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:36、もしくはSEQ ID NO:39、またはこれらの組み合わせのSTRCタンパク質をコードする、具体的な態様28のベクターシステム。
具体的な態様30. 宿主細胞においてSTRC遺伝子のコード配列を発現させるための二重ベクターシステムを含む、具体的な態様28のベクターシステムであって、コード配列が5'末端断片および3'末端断片を含み、二重ベクターシステムが、
（a）5'から3'の方向に、
- 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
- プロモーター配列；
- プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、シグナル配列；
- STRC遺伝子コード配列の5'末端断片であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、5'末端断片；
- インテインのアミノ末端断片（N-インテイン）をコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、N-インテインをコードする配列；
- ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；および
- 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
を含む第1のヌクレオチド配列を含む、第1のベクター、ならびに
（b）5'から3'の方向に、
- 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
- プロモーター配列；
- プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、シグナル配列；
- インテインのカルボキシ末端断片（C-インテイン）をコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、C-インテインをコードする配列；
- STRC遺伝子コード配列の3'末端断片であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、3'末端断片；
- ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；および
- 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
を含む第2のヌクレオチド配列を含む、第2のベクター
を含む、ベクターシステム。
具体的な態様31. 第1のベクターおよび第2のベクターが、細胞において、
（a）N末端からC末端の方向に、
- シグナルペプチド配列であって、STRCタンパク質配列のN末端部分に連結されており、STRCタンパク質配列がそのC末端においてN-インテインタンパク質配列に融合している、シグナルペプチド配列
を含む、第1のタンパク質配列、および
（b）N末端からC末端の方向に、
- シグナルペプチド配列であって、C-インテインタンパク質配列に連結されており、C-インテインタンパク質配列がSTRCタンパク質配列のC末端部分のN末端に融合している、シグナルペプチド配列
を含む、第2のタンパク質配列
をそれぞれ発現する、具体的な態様30の二重ベクターシステム。
具体的な態様32. STRCタンパク質のN末端部分およびSTRCタンパク質のC末端部分が、全長STRCタンパク質を形成する、具体的な態様30～31のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様33. 第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列が同じである、具体的な態様30～32のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様34. 第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列が、第1のタンパク質配列および第2のタンパク質配列を同じ細胞コンパートメントに輸送するように構成されている、具体的な態様30～33のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様35. 第1のタンパク質配列のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質配列のシグナルペプチド配列が異なり、各シグナルペプチド配列が、それぞれのタンパク質配列を同じ細胞コンパートメントに向ける、具体的な態様30～34のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様36. 第1のベクターおよび第2のベクターが各々ウイルスベクターである、具体的な態様30～35のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様37. ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、具体的な態様36の二重ベクターシステム。
具体的な態様38. ウイルスベクターが同じ血清型を有する、具体的な態様36または具体的な態様37の二重ベクターシステム。
具体的な態様39. ウイルスベクターが異なる血清型を有する、具体的な態様36または具体的な態様37の二重ベクターシステム。
具体的な態様40. N末端部分およびC末端部分がペプチド結合を通して全長STRCタンパク質を形成する、具体的な態様30～39のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様41. STRCタンパク質がSTRC遺伝子によってコードされる、具体的な態様30～40のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様42. シグナル配列が、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:11と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有する核酸配列を含む、具体的な態様30～41のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様43. シグナル配列が、SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:12と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、具体的な態様30～42のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様44. STRCタンパク質のN末端部分が、SEQ ID NO:5もしくはSEQ ID NO:7、またはSEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:16をコードする核酸配列と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有する核酸配列を含む、具体的な態様30～43のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様45. STRCタンパク質のN末端部分が、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、具体的な態様30～44のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様46. STRCタンパク質のN末端部分が、全長STRCタンパク質のN末端部分の54％未満（例えば、53.8％、53.6％、53.4％、53.2％、53％、52％、50％、45％）を含む、具体的な態様30～45のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様47. N-インテイン配列が、SEQ ID NO:13と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有する核酸配列を含む、具体的な態様30～46のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様48. N-インテイン配列が、SEQ ID NO:14と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、具体的な態様30～47のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様49. STRCタンパク質のC末端部分が、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、またはSEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、もしくはSEQ ID NO:24をコードする核酸配列と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有する核酸配列を含む、具体的な態様30～48のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様50. STRCタンパク質のC末端部分が、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、またはSEQ ID NO:24と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、具体的な態様30～49のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様51. STRCタンパク質のC末端部分が、全長STRCタンパク質のC末端部分の46％以上（例えば、46.2％、46.4％、46.6％、46.8％、47％、48％、50％、55％）を含む、具体的な態様30～50のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様52. C-インテイン配列が、SEQ ID NO:21と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）同一の核酸配列を含む、具体的な態様30～51のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様53. C-インテイン配列が、SEQ ID NO:22と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）同一のアミノ酸配列をコードする、具体的な態様30～52のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様54. 第1のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:5またはSEQ ID NO:7と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有する核酸配列を含む、具体的な態様30～53のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様55. 第1のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、またはSEQ ID NO:16と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、具体的な態様30～54のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様56. 第2のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:19と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有する核酸配列を含む、具体的な態様30～55のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様57. 第2のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、またはSEQ ID NO:24と少なくとも70％（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、具体的な態様30～56のいずれか1つの二重ベクターシステム。
具体的な態様58. 具体的な態様1～57のいずれか1つのベクターシステムを含有する少なくとも1つの細胞（例えば、10、20、50、100、200、500、1000、または生物学的活性を有する大きいタンパク質を成功裏に発現させるために十分な任意の数の細胞）であって、少なくとも1つの細胞が、対象における聴覚消失を処置するか、阻害するか、または低下させるためのものであってよく、聴覚消失が常染色体劣性聴覚消失であってよい、少なくとも1つの細胞。
具体的な態様59. 対象における聴覚消失を処置するか、阻害するか、または低下させるための、具体的な態様1～57のいずれか1つのベクターシステムと薬学的に許容される媒体とを含む薬学的組成物であって、聴覚消失が常染色体劣性聴覚消失であってよい、薬学的組成物。
具体的な態様60. 対象における常染色体劣性聴覚消失を処置するか、阻害するか、または低下させる方法であって、それを必要とする対象へ具体的な態様1～57のいずれか1つの二重ベクターシステムの有効量を投与することを含む、方法。
具体的な態様61. 対象における常染色体劣性聴覚消失を処置するか、阻害するか、または低下させる方法であって、それを必要とする対象へ具体的な態様58の少なくとも1つの細胞の有効量を投与することを含む、方法。
具体的な態様62. 対象における常染色体劣性聴覚消失を処置するか、阻害するか、または低下させる方法であって、それを必要とする対象へ具体的な態様59の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、方法。
具体的な態様63. 常染色体劣性聴覚消失がDFNB16である、具体的な態様60～62のいずれか1つの方法。
具体的な態様64. 対象の少なくとも1つの細胞を具体的な態様59の薬学的組成物と接触させることを含む方法であって、接触が、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含むベクターシステムを、対象の少なくとも1つの細胞に送達し、接触した少なくとも1つの細胞が、全長タンパク質を形成するようペプチド結合によって接続されるタンパク質のN末端部分およびタンパク質のC末端部分を発現する、方法。
具体的な態様65. 聴覚消失を特徴とする病理または疾患を処置および/または防止するための方法であって、それを必要とする対象へ、具体的な態様1～57のいずれかによるベクターシステム、具体的な態様58による少なくとも1つの細胞、または具体的な態様59による薬学的組成物の有効量を投与することを含む、方法。
具体的な態様66. 少なくとも1つの細胞が内耳細胞である、具体的な態様64～65のいずれか1つの方法。
具体的な態様67. 少なくとも1つの細胞が内有毛細胞または外有毛細胞である、具体的な態様64～66のいずれか1つの方法。
具体的な態様68. 少なくとも1つの細胞がインビボまたはインビトロである、具体的な態様60～67のいずれか1つの方法。
具体的な態様69. 対象における聴覚機能を改善するか、または回復させる、具体的な態様60～68のいずれか1つの方法。
本明細書に記載された発明を、様々な用途および条件に適応させるため、変動および修飾を施すことができることは、以上の説明から、明らかであろう。そのような態様も、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの列挙は、任意の単一の要素、または記載された要素の組み合わせ（もしくは部分的組み合わせ）としての、その変数の定義を含む。本明細書における態様の列挙は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはそれらの一部分と組み合わせられた、その態様を含む。
本明細書において言及された全ての特許および刊行物は、各々の独立した特許および刊行物が、参照により組み入れられると具体的に個々に示されたのと同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

Claims (19)

  1. 細胞においてステレオシリン（STRC）タンパク質を発現させるための二重ベクターシステムであって、
    （a）5'から3'の方向に、
    - STRCタンパク質のアミノ末端（N末端）部分をコードする部分コード配列の5'末端にある、第1のシグナル配列；
    - STRCタンパク質のN末端部分をコードする部分コード配列；および
    - 部分コード配列の下流に隣接している、インテインのアミノ末端断片（N-インテイン）をコードする配列
    を含む第1のヌクレオチド配列を含む、第1のベクター、および
    （b）5'から3'の方向に、
    - 第2のシグナル配列；
    - インテインのカルボキシ末端断片（C-インテイン）をコードする配列であって、第2のシグナル配列とSTRCタンパク質のカルボキシ末端（C末端）部分をコードする部分コード配列とに挟まれており、第2のシグナル配列の下流に隣接している、C-インテインをコードする配列；および
    - STRCタンパク質のC末端部分をコードする部分コード配列
    を含む第2のヌクレオチド配列を含む、第2のベクター
    を含み、
    第1のシグナル配列および第2のシグナル配列が、インテイン媒介STRCタンパク質トランススプライシングのために、第1のベクターによって発現される第1のタンパク質および第2のベクターによって発現される第2のタンパク質を細胞の同じ細胞コンパートメントに輸送するように構成されている、
    二重ベクターシステム。
  2. 二重ベクターシステムであって、
    （a）5'から3'の方向に、
    - 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
    - プロモーター配列；
    - プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、第1のシグナル配列；
    - STRCタンパク質のアミノ末端（N末端）部分をコードする部分コード配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、部分コード配列；
    - スプリットインテイン-Nをコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にあり、かつ、部分コード配列の下流に隣接している、スプリットインテイン-Nをコードする配列；
    - ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；および
    - 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
    を含む第1のヌクレオチド配列を含む、第1のベクター、および
    （b）5'から3'の方向に、
    - 5'末端逆位反復（5'ITR）配列；
    - プロモーター配列；
    - プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、第2のシグナル配列；
    - スプリットインテイン-Cをコードする配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にあり、かつ、第2のシグナル配列の下流に隣接している、スプリットインテイン-Cをコードする配列；
    - STRCタンパク質のカルボキシ末端（C末端）部分をコードする部分コード配列であって、プロモーターに機能的に連結されており、かつプロモーターの調節下にある、部分コード配列；
    - ポリアデニル化（ポリA）シグナル配列；および
    - 3'末端逆位反復（3'ITR）配列
    を含む第2のヌクレオチド配列を含む、第2のベクター
    を含み、
    第1のシグナル配列および第2のシグナル配列が、インテイン媒介STRCタンパク質トランススプライシングのために、第1のベクターによって発現される第1のタンパク質および第2のベクターによって発現される第2のタンパク質を細胞の同じ細胞コンパートメントに輸送するように構成されている、
    二重ベクターシステム。
  3. （a）第1のタンパク質が、N末端からC末端の方向に、
    - シグナルペプチド配列であって、STRCタンパク質配列のN末端部分に連結されており、STRCタンパク質配列がそのC末端においてN-インテインタンパク質配列に融合している、シグナルペプチド配列を含み、および
    （b）第2のタンパク質が、N末端からC末端の方向に、
    - シグナルペプチド配列であって、C-インテインタンパク質配列に連結されており、C-インテインタンパク質配列がSTRCタンパク質配列のC末端部分のN末端に融合している、シグナルペプチド配列を含む、請求項1または2記載の二重ベクターシステム。
  4. STRCタンパク質のN末端部分およびSTRCタンパク質のC末端部分が、STRC全長タンパク質を形成するように構成されている、請求項1～3のいずれか一項記載の二重ベクターシステム。
  5. 第1のベクターおよび第2のベクターが各々ウイルスベクターである；
    シグナル配列が、SEQ ID NO:9もしくはSEQ ID NO:11の核酸配列であるか、または、SEQ ID NO:10もしくはSEQ ID NO:12のアミノ酸配列をコードする；
    STRCタンパク質のN末端部分の配列が、SEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:16のアミノ酸配列である；
    N-インテインをコードする配列が、SEQ ID NO:13の核酸配列であるか、またはSEQ ID NO:14のアミノ酸配列をコードする；
    STRCタンパク質のC末端部分の配列が、SEQ ID NO:23もしくはSEQ ID NO:24のアミノ酸配列である；
    C-インテインをコードする配列が、SEQ ID NO:21もしくはSEQ ID NO:46の核酸配列であるか、またはSEQ ID NO:22もしくはSEQ ID NO:49のアミノ酸配列をコードする；
    第1のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:5もしくはSEQ ID NO:7の核酸配列であるか、またはSEQ ID NO:6もしくはSEQ ID NO:8のアミノ酸配列をコードする；または
    第2のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:17もしくはSEQ ID NO:19の核酸配列であるか、またはSEQ ID NO:18もしくはSEQ ID NO:20のアミノ酸配列をコードする、請求項3または4記載の二重ベクターシステム。
  6. ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターまたはレンチウイルスである、請求項5記載の二重ベクターシステム。
  7. STRCタンパク質がSTRC遺伝子によってコードされ、
    第1のベクターおよび第2のベクターの各々が、STRC遺伝子のコード配列を発現し、
    コード配列が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、またはSEQ ID NO:38の核酸配列を含む、請求項1～6のいずれか一項記載の二重ベクターシステム。
  8. STRC遺伝子が、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:25、またはSEQ ID NO:26のアミノ酸配列のSTRCタンパク質をコードする、請求項7記載の二重ベクターシステム。
  9. 第1のベクターおよび第2のベクターが、細胞において、
    （a）N末端からC末端の方向に、
    - シグナルペプチド配列であって、STRCタンパク質配列のN末端部分に連結されており、STRCタンパク質配列がそのC末端においてN-インテインタンパク質配列に融合している、シグナルペプチド配列
    を含む、第1のタンパク質、および
    （b）N末端からC末端の方向に、
    - シグナルペプチド配列であって、C-インテインタンパク質配列に連結されており、C-インテインタンパク質配列がSTRCタンパク質配列のC末端部分のN末端に融合している、シグナルペプチド配列
    を含む、第2のタンパク質
    をそれぞれ発現する、請求項7または8記載の二重ベクターシステム。
  10. STRCタンパク質のN末端部分およびSTRCタンパク質のC末端部分が、全長STRCタンパク質を形成するように構成されている；
    第1のタンパク質のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質のシグナルペプチド配列が同じである；
    第1のタンパク質のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質のシグナルペプチド配列が、第1のタンパク質および第2のタンパク質を同じ細胞コンパートメントに輸送するように構成されている；
    第1のタンパク質のシグナルペプチド配列および第2のタンパク質のシグナルペプチド配列が異なり、各シグナルペプチド配列が、それぞれのタンパク質を同じ細胞コンパートメントに向ける；
    ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである；
    シグナル配列が、SEQ ID NO:9もしくはSEQ ID NO:11の核酸配列であるか、またはSEQ ID NO:10もしくはSEQ ID NO:12のアミノ酸配列をコードする；
    STRCタンパク質のN末端部分の配列が、SEQ ID NO:15もしくはSEQ ID NO:16のアミノ酸配列である；
    N-インテインをコードする配列が、SEQ ID NO:13の核酸配列であるか、またはSEQ ID NO:14のアミノ酸配列をコードする；
    STRCタンパク質のC末端部分の配列が、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、もしくはSEQ ID NO:24のアミノ酸配列である；
    C-インテインをコードする配列が、SEQ ID NO:21の核酸配列であるか、またはSEQ ID NO:22のアミノ酸配列をコードする；
    第1のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:5もしくはSEQ ID NO:7の核酸配列であるか、またはSEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、もしくはSEQ ID NO:16のアミノ酸配列をコードする；または
    第2のヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:17もしくはSEQ ID NO:19の核酸配列であるか、またはSEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、もしくはSEQ ID NO:24のアミノ酸配列をコードする、請求項7～9のいずれか一項記載の二重ベクターシステム。
  11. 請求項1～10のいずれか一項記載のベクターシステムを含有する細胞であって、インビトロにある細胞。
  12. 請求項1～10のいずれか一項記載のベクターシステムと、薬学的に許容される媒体とを含む、対象における常染色体劣性聴覚消失を処置するための薬学的組成物であって、該ベクターシステムの有効量を含む、薬学的組成物。
  13. 対象における常染色体劣性聴覚消失を処置するための薬学的組成物であって、請求項11記載の細胞を含み、細胞が全長STRCタンパク質を発現する、薬学的組成物。
  14. 常染色体劣性聴覚消失がDFNB16である、請求項12または13記載の薬学的組成物。
  15. 対象の少なくとも1つの細胞を請求項12記載の薬学的組成物と接触させる工程を含むインビトロ方法であって、
    接触が、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含むベクターシステムを、対象の少なくとも1つの細胞に送達し、
    接触した少なくとも1つの細胞が、全長STRCタンパク質を形成するようペプチド結合によって接続されるSTRCタンパク質のN末端部分およびSTRCタンパク質のC末端部分を発現する、インビトロ方法。
  16. 対象における聴覚消失を特徴とする病理または疾患を処置および/または防止するための薬学的組成物であって、請求項1～10のいずれか一項記載のベクターシステム、または請求項11記載の少なくとも1つの細胞の有効量を含む、薬学的組成物。
  17. 内有毛細胞または外有毛細胞である、請求項11記載の細胞。
  18. 細胞が内有毛細胞または外有毛細胞である、請求項13または16記載の薬学的組成物。
  19. 全長STRCタンパク質を発現することによって、対象における聴覚機能を改善するか、または回復させる、請求項12記載の薬学的組成物。
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