JP7841773B2 - 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムｌｍ１０２０を含む脱毛緩和及び発毛促進用組成物 - Google Patents

Description

KCCM KCCM12918P

本願は、脱毛防止及び発毛促進効果を有する熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０に関し、さらに詳しくは、毛嚢の毛乳頭細胞の増殖を促進して脱毛防止及び発毛促進効果を有する熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０及びそれを含む組成物に関する。

脱毛とは、正常に毛髪が存在すべき部位に毛髪がない状態のことを言い、一般的に頭皮の成毛が抜けることを意味する。過去に脱毛は男性の専有物として認識されたが、現代社会では脱毛で悩む女性も増加しており、脱毛が発生する年齢帯も徐々に若くなっている。このように、脱毛患者が増加するにつれて脱毛の原因と対処方案及び治療剤に対する研究が注目されている。

現在、脱毛を予防又は治療するために最も効果の良い薬物は、ミノキシジル（Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）とプロペシア（Ｐｒｏｐｅｃｉａ）が例として挙げられる。しかし、ミノキシジルは全身の毛にも影響を与え、髪の毛の他にも全身の毛がより濃くて太く育つようになり、血圧を下げる役割をするため、低血圧のある人は使用を慎むべきであり、薬が肝臓で代謝するため、肝臓障害のある人も使用を慎むべきである。また、プロペシアは男性ホルモンであるので、女性が服用することを禁じており、副作用として性欲の喪失や性機能障害などが現われると知られており、最近は、これを投与した患者から鬱病と気分の落ち込みが報告され、注意事項として追加された。よって、ミノキシジル及びプロペシアよりも副作用が少なく、且つ優れた効果のある脱毛治療剤の開発が必要な実情である。

一方、微生物資源は、石油、水などとは異なり再生産できるという点で持続可能な資源に分類され、多様な環境に適応した微生物固有の特性を利用するので、研究及び産業上の適用可能性が非常に高い。特に、熱処理などで不活性化されたものの、健康上の利点を与えることができる菌株由来成分をポストバイオティクスと言い、ポストバイオティクスは、免疫調節、皮膚状態改善、抗酸化及び炎症調節などの機能性を有し、不活性化されているため、プロバイオティクスよりも安定性、安全性、経済性、貯蔵性などに優れた長所がある。

皮膚の表面と毛嚢の開口部は、微生物群集が豊富で強力な免疫活性化が認められた部位であり、毛周期に必須な免疫特権と微生物群集には強力な相関関係がある。毛嚢においてマイクロバイオームの変化又は微生物代謝産物の吸収は、皮膚免疫反応の調節と恒常性など毛嚢の炎症反応と関連しており、毛嚢の炎症が緩和されれば毛髪の再成長可能性が高くなるので、局所部位の頭皮におけるマイクロバイオームの管理は、脱毛及び発毛において非常に重要である。

そこで、微生物を活用して最近急増している脱毛患者に適用するための脱毛防止、発毛／育毛促進、毛髪成長／生長を目的とした製品の開発が行われており、一例として、大韓民国公開特許第１０－２０１７－００３８４６２号などがあるが、まだ毛乳頭細胞による毛髪成長調節の正確な機転や新たな調節物質に関する研究はまだ不備な状態である。

そこで、本発明者らは、毛嚢の毛乳頭細胞（ｈＤＰＣｓ、ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌｓ）の増殖を促進することのできる脱毛防止又は発毛促進用組成物について研究した結果、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０（ＫＣＣＭ１２９１８Ｐ）が毛嚢の毛乳頭細胞の増殖を促進することを確認して、本発明を完成した。

本願は、脱毛防止及び発毛促進効果を有する熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０（ＫＣＣＭ１２９１８Ｐ）を含む組成物を提供することを目的とする。

しかし、本願が解決しようとする課題は、上記したような課題に限定されるものではなく、言及されていない他の課題は、以下の記載から通常の技術者にとって明確に理解できるはずである。

本願の第１の側面は、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０（ＫＣＣＭ１２９１８Ｐ）を有効成分として含む、毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物を提供する。

本願の第２の側面は、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０（ＫＣＣＭ１２９１８Ｐ）を有効成分として含む、毛乳頭細胞増殖用食品組成物を提供する。

本願の第３の側面は、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０（ＫＣＣＭ１２９１８Ｐ）を有効成分として含む、脱毛治療用薬学組成物を提供する。

本願の熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０及びそれを含む組成物は、毛乳頭細胞の増殖を促進し、５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－１の抑制活性に優れており、成長因子の一種であるＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＥＧＦの発現を促進することで、脱毛防止及び発毛促進効果を有する。

熱処理乳酸菌の毛乳頭細胞増殖促進効果を比較した結果を示す図である。 熱処理乳酸菌の毛乳頭細胞成長促進効果を比較した結果を示す図である。 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０の濃度別の毛乳頭細胞増効果を比較した結果を示す図である。 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０処理後に毛乳頭細胞のＣＤＫ２発現量の変化を示す図である。 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０処理後に毛乳頭細胞のＣＤＫ４発現量の変化を示す図である。 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０処理後に毛乳頭細胞のＣＤＫ６発現量の変化を示す図である。 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０処理後に毛乳頭細胞のｃｙｃｌｉｎ Ｂ１発現量の変化を示す図である。 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０処理後に毛乳頭細胞のｃｙｃｌｉｎ Ｄ１発現量の変化を示す図である。 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０処理後に毛乳頭細胞のｃｙｃｌｉｎ Ｅ１発現量の変化を示す図である。 ヒト頭皮組織での熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０の５アルファ還元酵素（５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）の遺伝子発現量を確認した結果を示す図である。 ヒト頭皮組織での熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０のＦＧＦ７（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ７、第７型線維芽細胞成長因子）の遺伝子発現量を確認した結果を示す図である。 ヒト頭皮組織での熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０のＦＧＦ１０（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １０、第１０型線維芽細胞成長因子）の遺伝子発現量を確認した結果を示す図である。 ヒト頭皮組織での熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０のＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、上皮細胞成長因子）の遺伝子発現量を確認した結果を示す図である。 エルメントール、サリチル酸、デクスパンテノール及びこれらの混合物（ＬＳＤ）、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０及び熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０とエルメントール、サリチル酸及びデクスパンテノール複合物の毛乳頭細胞成長促進効果を比較した結果を示す図である。 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０が含有された製品を使用した参加者らの使用前後の頭皮内ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）と乳酸菌（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）の割合変化（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｕｎｉｔ）を示す図である。 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０が含有された製品を使用した参加者らの使用前後の頭皮内ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）と乳酸菌（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）の全マイクロバイオームに対するシャノン指数の変化を示す図である。 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０が含有された製品を使用した参加者らの使用前後の頭皮内ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）と乳酸菌（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）の全乳酸菌（ＬＡＢ；Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）に対するシャノン指数の変化を示す図である。 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０が含有された製品を使用した参加者らの使用前後の頭皮の主要微生物の変化を示す図である。 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０が含有された製品を使用した参加者らの使用前後の頭皮の主要微生物の変化を示す図である。

以下では、添付した図面を参照しながら、本願の属する技術分野において通常の知識を有する者が容易に実施できるように本願の実施例を詳しく説明する。ところが、本願は様々な異なる形態に具現されることができ、ここで説明する実施例に限定されるものではない。そして、図面において、本願を明確に説明するために、説明とは関係ない部分は省略しており、明細書全体に亘って類似した部分に対しては類似した図面符号を付けている。

本願の明細書全体において、ある部材が他の部材の「上に」位置しているという場合、これは、ある部材が他の部材に接している場合だけでなく、両部材の間にまた他の部材が存在する場合も含む。

本願の明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」という場合、これは、特に反対の記載がない限り、他の構成要素を除くのではなく、他の構成要素をさらに含み得ることを意味する。本願の明細書全体において使用される程度の用語「約」、「実質的に」などは、言及された意味に固有の製造及び物質許容誤差が提示される場合、その数値で、又はその数値に近接した意味として使用され、本願の理解を助けるために正確あるいは絶対的な数値が言及された開示内容を非良心的な侵害者が不当に利用することを防止するために使用される。本願の明細書全体において使用される程度の用語「～（する）ステップ」又は「～のステップ」は、「～のためのステップ」を意味するものではない。

本願の明細書全体において、マーカッシュ形式の表現に含まれた「これらの組み合わせ（たち）」の用語は、マーカッシュ形式の表現に記載された構成要素からなる群より選択される１つ以上の混合又は組み合わせを意味するものであり、上記構成要素からなる群より選択される１つ以上を含むことを意味する。

本願の明細書全体において、「Ａ及び／又はＢ」の記載は、「Ａ又はＢ、あるいはＡ及びＢ」を意味する。

以下では、添付した図面を参照しながら本願の具現例及び実施例を詳しく説明する。しかし、本願がこのような具現例及び実施例と図面に限定されるものではない。

本願の第１の側面は、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０（ＫＣＣＭ１２９１８Ｐ）を有効成分として含む、毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物を提供する。

本願の明細書全体において使用される用語「熱処理乳酸菌」は、リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０菌株を加熱処理して不活性化させた死菌体のことを意味する。

本願の明細書全体において使用される用語「死菌体」は、生菌の反対概念であり、発酵により得られた生菌と代謝産物を熱処理などによって菌を成長できなくした形態を意味する。死菌体は、細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）、細胞壁（ｃｅｌｌ ｗａｌｌ）、バクテリオシン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ）などの抗菌活性物質、多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、有機酸などを含んでいても良い。前記死菌体を利用した製品は、生菌製品と比べて安定性が高く、特に耐熱性に優れており、外部環境に対する安定性が高いので、既存の生菌製品よりも保管が容易で、流通期間を延ばすことができるという長所がある。また、抗生剤の使用に対する規制が強化されているため、代替品としての活用性と、まだ死菌体製品の生産に本格的に参入した会社が数えるほどしかないため、市場性と成長可能性が非常に高い。

本願の一具現例において、前記リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０菌株由来成分は、発酵生地から由来したものであっても良いが、これに限定されるものではない。

本願の一具現例において、前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、飽和脂肪酸：不飽和脂肪酸：環状脂肪酸の割合が０．１～２：０．２５～５：０．０３～０．６であっても良く、好ましくは、１：２．５：０．３であっても良いが、これに限定されるものではない。

本願の一具現例において、前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１及びｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現を増加させるものであっても良い。

本願の一具現例において、前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－１遺伝子の発現量を減少させ、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びＥＧＦ遺伝子の発現量を増加させるものであっても良い。

本願の一具現例において、前記毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物は、エルメントール、サリチル酸及びデクスパンテノールをさらに含むものであっても良い。

本願の一具現例において、本願の熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０とエルメントール、サリチル酸及びデクスパンテノール複合物を共に処理する場合、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を単独で使用するよりも毛乳頭細胞の成長促進効果が優秀であった。

本願の一具現例において、前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、１×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬ～１×１０^８ｃｅｌｌ／ｍＬであっても良く、好ましくは、１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬ～１×１０^７ｃｅｌｌ／ｍＬであっても良く、さらに好ましくは、１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬ又は１×１０^７ｃｅｌｌ／ｍＬであっても良いが、これに限定されるものではない。

本願の一具現例において、前記毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物は、精製水、エタノール、アラニン／ヒスチジン／リシンポリペプチド銅ＨＣｌ（Ａｌａｎｉｎｅ／Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ／Ｌｙｓｉｎｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｐｐｅｒ ＨＣｌ）、ポリアクリレートクロスポリマー－６、ココナツ酸、プロリン、ティーツリーオイル、グリセリン、ペプチド、ブチレングリコール、１，２－ヘキサンジオール、緑茶抽出物、ラベンダー花抽出物、カリン抽出物及びエチルヘキサンジオールをさらに含んでいても良く、前記毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物は、頭皮の微生物多様性及び乳酸菌多様性を増加させるものであっても良い。

本願の第２の側面は、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０（ＫＣＣＭ１２９１８Ｐ）を有効成分として含む、毛乳頭細胞増殖用食品組成物を提供する。本願の第１の側面と重複する内容は、本願の第２の側面の食品組成物にも共に適用される。

本願の明細書全体において使用される用語「食品」は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、健康機能食品及び健康食品などがあり、通常の意味での食品を全て含む。

本願の明細書全体において使用される用語「健康機能食品」は、健康機能食品に関する法律第６７２７号による人体に有用な機能性を持つ原料や成分を使用して製造及び加工した食品を意味し、「機能性」というのは、人体の構造及び機能に対し栄養素を調節することや生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。

本願の食品は、当業界において通常使用される方法により製造可能であり、前記製造の 際は、当業界において通常添加する原料及び成分を添加して製造しても良い。また、前記食品の剤形も、食品として認められる剤形であれば制限なしに製造されても良い。本発明の食品用組成物は、様々な形態の剤形に製造されても良く、一般薬品とは異なり食品を原料としているので、薬品の長期服用時に生じ得る副作用などがないという長所があり、携帯性に優れているので、本発明の食品は、腸内環境改善の効果を増進させるための補助剤として攝取可能である。

前記健康食品（ｈｅａｌｔｈ ｆｏｏｄ）は、一般食品に比べて積極的な健康維持や増進効果を有する食品を意味し、健康補助食品（ｈｅａｌｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｆｏｏｄ）は、健康補助目的の食品を意味する。場合によって、健康機能食品、健康食品、健康補助食品の用語は混用され得る。具体的に、前記健康機能食品は、本願の熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を飲料、茶類、香辛料、ガム、菓子類などの食品素材に添加したり、カプセル化、粉末化、懸濁液などに製造した食品であり、これを摂取する場合に健康上特定の効果をもたらすものを意味するが、一般薬品とは異なり食品を原料としているので、薬品の長期服用時に生じ得る副作用がないという長所がある。

本願の食品組成物は、日常的に摂取することが可能なため、鬱病の改善について高い効果が期待できるので、非常に有用に使用されることができる。

前記食品組成物は、生理学的に許容可能な担体をさらに含んでいても良いが、担体の種類は特に限定されるものではなく、当該技術分野において通常使用されている担体であれば何でも使用することができる。

また、前記食品組成物は、食品組成物に通常使用され、匂い、味、視覚などを向上させることのできる追加成分を含んでいても良い。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン（ｎｉａｃｉｎ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）、パントテン酸（ｐａｎｔｈｏｔｅｎｉｃ ａｃｉｄ）などを含んでいても良い。また、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、クロム（Ｃｒ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、銅（Ｃｕ）、クロム（Ｃｒ）などのミネラルを含んでいても良い。また、リジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含んでいても良い。

また、前記食品組成物は、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧグルタミン酸ナトリウムなど）、甘味料（ズルチン、シクラメート、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、Ｄ－酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、被膜剤、ガム基礎剤、泡止め剤、溶剤、改良剤などの食品添加物（ｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）を含んでいても良い。前記添加物は、食品の種類によって選別され、適切な量で使用しても良い。

本願の熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、そのまま添加するか、他の食品又は食品成分と共に使用しても良く、通常の方法により適切に使用しても良い。有効成分の混合量は、その使用目的（予防、健康又は治療的処置）に応じて適合に決定しても良い。一般的に、食品又は飲料の製造時に、本発明の食品組成物は、食品又は飲料に対して５０重量部以下、具体的に、２０重量部以下の量で添加しても良い。しかし、健康及び衛生を目的に長期間摂取する場合は上記範囲以下の含量を含んでいても良く、安全性の面で何の問題もないため、有効成分は上記範囲以上の量で使用しても良い。

本願の食品組成物の一例に、健康飲料組成物として使用しても良く、この場合、通常の飲料のように様々な香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含有していても良い。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド；マルトース、スクロースのようなジサッカライド；デキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド；キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールであっても良い。甘味剤は、ソーマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤；サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使用しても良い。前記天然炭水化物の割合は、本発明の健康飲料組成物１００ｍＬ当たり一般的に約０．０１～０．０４ｇ、具体的に、約０．０２～０．０３ｇであっても良い。

上記した他にも、健康飲料組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸の塩、アルギン酸、アルギン酸の塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール又は炭酸化剤などを含有していても良い。その他に、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、又は野菜飲料を製造するための果肉を含有していても良い。このような成分は、独立に又は混合して使用しても良い。このような添加剤の割合は特に重要ではないが、本発明の健康飲料組成物１００重量部当たり０．０１～０．１重量部の範囲で選択されるのが一般的である。

本願の食品組成物は、脱毛防止及び発毛促進効果を現わすことさえできれば本願の熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を様々な重量％で含んでいても良く、具体的に、本願の熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を食品組成物の総重量に対して０．００００１～１００重量％又は０．０１～８０重量％で含んでいても良いが、これに限定されるものではない。

本願の一具現例において、前記食品組成物は、健康機能食品組成物であっても良い。

本願の第３の側面は、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０（ＫＣＣＭ１２９１８Ｐ）を有効成分として含む、脱毛治療用薬学組成物を提供する。第１の側面及び第２の側面と重複する内容は、本願の第３の側面の薬学組成物にも共に適用される。

本願の一具現例において、前記薬学組成物は、それぞれ通常の方法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤又は滅菌注射溶液の形態に製剤化して使用しても良いが、これに限定されるものではない。

本願の一具現例において、前記薬学組成物を製剤化する場合、一般的に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、又は界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して調剤されても良いか、これに限定されるものではない。

本願の一具現例において、経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、又はカプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記菌株由来成分に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、又はゼラチンなどを交ぜて調剤されても良い。また、例えば、単なる賦形剤の他にも、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤を使用しても良いが、これに限定されるものではない。

本願の一具現例において、経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが当たり、良く使用される単なる希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれても良いが、これに限定されるものではない。

本願の一具現例において、非経口投与のための製剤としては、滅菌済みの水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤が含まれても良いが、これに限定されるものではない。例えば、前記非水性溶剤又は懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されても良いが、これに限定されるものではない。例えば、前記坐剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されても良いが、これに限定されるものではない。

本願の一具現例に係る薬学組成物は、医薬品組成物又は医薬部外品組成物であっても良い。

本願の明細書全体において使用される用語「医薬部外品」は、ヒトや動物の疾病を診断、治療、改善、軽減、処置又は予防する目的で使用される物品のうち、医薬品よりも作用が軽微な物品を意味するものであり、例えば、薬事法によると、医薬部外品とは、医薬品の用途で使用される物品を除くものであり、ヒト・動物の疾病の治療や予防に使用される製品、人体への作用が軽微であるか、直接作用しない製品などが含まれる。

本願の前記医薬部外品組成物は、ボディクレンザー、消毒清潔剤、洗浄剤、キッチン用洗浄剤、掃除用洗浄剤、歯磨き粉、うがい剤、ウェットティッシュ、洗剤、石鹸、ハンドウォッシュ、ヘア洗浄剤、ヘア柔軟剤、加湿器充填剤、マスク、軟膏剤及びフィルタ充填剤からなる群より選択される剤形に製造しても良いが、これに限定されるものではない。

本願の一具現例において、前記薬学組成物は、薬剤学的に有効な量で投与されても良いが、本願の用語「薬剤学的に有効な量」とは、医学的治療又は予防に適用可能な合理的な受恵／危険率で疾患を治療又は予防するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は、疾患の重症度、薬物の活性、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物感受性、使用された本発明の組成物の投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、使用された本発明の組成物と配合又は同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野において良く知られた要素によって決定しても良い。本願の薬学組成物は、単独で投与するか、公知になった腸疾患に対して治療効果を現わすと知られている成分と併用して投与しても良い。上記した要素を全て考慮し、副作用なく最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要である。

本願の一具現例において、前記薬学組成物の投与量は、使用目的、疾患の重症度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分として使用される物質の種類などを考慮して当業者が決定しても良い。例えば、本発明の薬学組成物は、成人１人当たり約０．１ｎｇ～約１，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｎｇ～約１００ｍｇ／ｋｇで投与しても良く、本願の組成物の投与頻度は、特にこれに限定されるものではないが、１日１回投与するか、あるいは用量を分割して数回投与しても良い。前記投与量又は投与回数は、どのような面からも本願の範囲を限定するものではない。

本願の薬学組成物は、特にこれに限定されるものではないが、目的とするところによって腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経皮パッチ投与、経口投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などの経路を介して投与しても良い。但し、経口投与の際は、剤形化されていない形態で投与しても良く、胃酸によって前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０が変性又は分解され得るため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化された形態又は経口用パッチ形態で口腔内に投与しても良い。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与されても良い。

以下、本願の実施例を参照しながら本発明をより詳しく説明するが、下記実施例は本願の理解を助けるために例示するだけであり、本願の内容が下記実施例に限定されるものではない。

実施例１．熱処理乳酸菌の毛乳頭細胞増殖効果の比較
毛乳頭細胞は、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌで購入し、５０００～１００００ｃｅｌｌ／ｃｍ^２の密度でフラスコに接種した上で培養した。毛乳頭細胞は、商業用培地であるｂａｓａｌ ｍｅｄｉａに成長因子（４０μＬ／ｍＬ ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ、４μＬ／ｍＬ ｂｏｖｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ、１ｎｇ／ｍＬ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、５μｇ／ｍＬ ｉｎｓｕｌｉｎ）を添加して調剤した毛乳頭細胞培養培地で培養しており、３７℃で５％のＣＯ_２濃度を保ちながら培養した。毛乳頭細胞は、８０～９０％のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙに到逹すれば継代培養及び実験に使用した。研究に使用した毛乳頭細胞は、２～５世代数まで液体窒素で保管し、実験には最大１０世代まで使用した。

熱処理乳酸菌の毛乳頭細胞増殖促進効果は、ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色を通じてｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌを顕微鏡で観察して確認した。８０～９０％のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙに到逹した毛乳頭細胞を２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにｗｅｌｌ当たり１０００００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度で接種した上で２４時間培養し、その後、１×１０^７ｃｅｌｌ／ｍＬの熱処理乳酸菌を処理して、対照群に比べて増加した細胞数を顕微鏡を通して直接計数することで確認した。毛乳頭細胞増殖促進効果を比較するために使用された熱処理乳酸菌は、ラクチプランチバチルスプランタルムＬＰ１００１、ラクトコッカスラクチスＬＰ１００９、ラクチカゼイバチルスラムノーススＬＰ１０１１、ラクチカゼイバチルスパラカゼイＬＰ１０１４、ビフィドバクテリウムアニマリスラクティスＬＰ１０１７、リモシラクトバチルスファーメンタムＬＰ１０１６、リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０、ラクトバチルスアシドフィルスＬＰ１０６０及びラクトバチルスガセリＬＰ１０６５であった。

比較の結果、全ての熱処理乳酸菌が毛乳頭細胞の増殖を促進することはなかった。９種類の熱処理乳酸菌のうち、ラクチカゼイバチルスパラカゼイＬＰ１０１４、ラクトバチルスアシドフィルスＬＰ１０６０、リモシラクトバチルスファーメンタムＬＰ１０１６とリモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０だけが毛乳頭細胞の成長を促進することができ、他の熱処理乳酸菌はむしろ毛乳頭細胞の成長を阻害することが確認された（図１）。

リモシラクトバチルスファーメンタムＬＰ１０１６とリモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、同属同種であるが、ＬＰ１０１６はキムチから由来したものであり、ＬＭ１０２０は発酵生地から由来したものであるので、各菌株の起源が違うという差異がある。研究の結果、同じ方法で熱処理した場合も、キムチ由来の熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＰ１０１６は毛乳頭細胞の増殖を３．７％向上させたが、発酵生地由来の熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は毛乳頭細胞の増殖を２４．９％向上させるなど、顕著な差異を示した。

実施例２．熱処理乳酸菌の菌体脂肪酸組成
菌体脂肪酸は、細胞膜などを含む細胞内膜性小器官の前駆体であり、菌体内で様々な役割を果たすものと知られている。内部標準物質（ＩＳＴＤ）は、自然界では一般的に存在しないｍｅｔｈｙｌ ｕｎｄｅｃａｎｏａｔｅにて選定しており、ＨＰＬＣ等級のｎ－ヘキサンを溶媒に使用して１００００μｇ／ｍＬの濃度で準備した後、－２０℃で保管しながら必要に応じて希釈しつつ研究に使用した。熱処理乳酸菌の脂肪酸を抽出すべく内部標準物質２５μｌを添加し、クロロホルムとメタノール２：１（ｖ／ｖ）混合溶液２００μｌを加えた。その後、脂肪酸の誘導体化のために０．６Ｍ塩酸メタノール溶液３００μｌを加えてから１２０秒間均質化し、８５℃で６０分間加熱反応させた後、常温で放冷した。再び１ｍＬのｎ－ヘキサンを加えてから１２０秒間均質化し、６０～１２０分間室温に据置きした後、上澄液を分析に使用した。ガスクロマトグラフ／質量分析器電子イオン化分析法で脂肪酸を分析しており、移動相はヘリウムを使用し、カラムはＤＢ－ＦａｓｔＦＡＭＥカラムを使用した。

その結果、同属同種ではあるものの菌株の起源が違う熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＰ１０１６と熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０の菌体脂肪酸の組成は、互いに異なっていることが確認された（表１）。特に、Ｌｉｎｏｌｅａｔｅは、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０のみで存在し、Ｂｅｈｅｎｉｃ ａｃｉｄは、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＰ１０１６のみで存在する特徴があった。脂肪酸のうちＯｌｅａｔｅは、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０に約２．４倍多く、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｃ ａｃｉｄは、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＰ１０１６に約２．１倍多い特徴を示した。

両菌株は、菌体の飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の割合も大きく異なっており、キムチから由来したリモシラクトバチルスファーメンタムＬＰ１０１６は、飽和脂肪酸：不飽和脂肪酸：環状脂肪酸の割合が１：１：０．６であったが、発酵生地から由来したリモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、１：２．５：０．３の割合と表れ、各脂肪酸の組成が異なり、全体脂肪酸の特性も顕著な差異を示すことが確認された。

実施例３．熱処理乳酸菌の毛乳頭細胞成長促進効果の比較
脱毛防止又は発毛促進又は毛髪成長促進に効果があると知られている菌株（ラクチカゼイバチルスパラカゼイＫＣＴＣ１４００４ＢＰとリモシラクトバチルスファーメンタムＫＣＣＭ１１９１０Ｐ）との比較を通じて、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０の毛乳頭細胞増殖効果を検証した（図２）。

比較に使用した菌株は、何れも１２１℃の高温で１５分間加熱処理して不活性化させた。

毛乳頭細胞（１０，０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）に２．５×１０^７ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度の熱処理乳酸菌を処理した後、実施例１のように培養し、毛乳頭細胞の成長促進効果を以下の式を利用して算出した。

毛乳頭細胞のみを培養した際の成長率と熱処理乳酸菌を追加した際の成長率とを比較して、熱処理乳酸菌の毛乳頭細胞成長促進効果を確認した。何も添加せず前記方法で毛乳頭細胞を培養した際の成長率と、熱処理乳酸菌ラクチカゼイバチルスパラカゼイＫＣＴＣ１４００４ＢＰ、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＫＣＣＭ１１９１０Ｐ及び熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を添加した際の毛乳頭細胞の成長率を算出し、熱処理乳酸菌の毛乳頭細胞成長促進効果を以下の式により求めて比較した。全ての試験は３回繰り返して行い、各結果の平均を求めて比較した。

毛乳頭細胞成長促進効果（％）＝（Ｂ－Ａ）÷Ａ×１００
Ａ＝無処理群の毛乳頭細胞成長率
Ｂ＝熱処理乳酸菌を処理した際の毛乳頭細胞の成長率

その結果、２．５×１０^７ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度において、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＫＣＣＭ１１９１０Ｐは、毛乳頭細胞の成長をむしろ阻害し、熱処理乳酸菌ラクチカゼイバチルスパラカゼイＫＣＴＣ１４００４ＢＰは、毛乳頭細胞の成長を促進したが、本発明の熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０よりは２倍以上低い細胞成長率を示した。

実施例４．熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０の濃度別の毛乳頭細胞増殖効果
前記実施例１と２で毛乳頭細胞の成長促進効果が最も優れていた熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０が、成長因子が足りない状況でも毛乳頭細胞の増殖を促進することができるか否かを確認した。９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに毛乳頭細胞を接種して２４時間培養した後、ｗｅｌｌ内の培地をｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒが欠乏した培地に取り替え、２４時間追加培養を行った。その後、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を濃度別に添加し、２４時間後に毛乳頭細胞の成長が促進されたか否かを確認した。毛乳頭細胞の成長促進効果は、０．５ｍｇ／ｍＬのｔｈｉａｚｏｌｙｌ Ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）を添加して３７℃で培養しながら生成されたｆｏｒｍａｚａｎをＤＭＳＯに溶解させた後、５７０ｎｍで吸光を測定して確認した。

その結果、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、毛乳頭細胞成長因子が欠乏した培養条件でも毛乳頭細胞を増殖させることができ、１×１０^３ｃｅｌｌ／ｍＬ～１×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度範囲では濃度依存的に毛乳頭細胞の生育が増加し、１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬ以上の高濃度では毛乳頭細胞増殖効果が濃度とは関係なく類似した傾向を示した。毛乳頭細胞増殖促進効果は、１×１０^７ｃｅｌｌ／ｍＬで最も優れており、無処理群に比べて１５６％の増殖促進効果が確認された（図３）。

実施例５．毛乳頭細胞の増殖と関連したタンパク質発現量の増加
前記実施例１と２で毛乳頭細胞成長促進効果が最も優れていた熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０が毛乳頭細胞の増殖を促進する作用機転を確認すべく、毛乳頭細胞の増殖と関連したタンパク質発現量を測定した。

毛乳頭細胞は、中胚葉由来の線維芽細胞であり、毛乳頭細胞の増殖は、ｃｙｃｌｉｎ、ＣＤＫｓ（ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ）とＣＤＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓのようなｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅタンパク質によって調節される。細胞は休止期か増殖期で存在し、成長する細胞は、Ｇ１期、ＤＮＡ合成期であるＳ期、Ｇ２期、有糸分裂を起こすＭ期の細胞周期を経て、最終的に２つの娘細胞に分裂されて増殖する。

ＣＤＫ２（Ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ２）は、細胞周期調節に関与するｋｉｎａｓｅであり、減数分裂には必須であるものの、有糸分裂には必要ではない。リン酸化によるｃｙｃｌｉｎＢ／ＣＤＫ１の後続活性化を制御して有糸分裂と減数分裂に入る時期を制御する作用機転としてｃｙｃｌｉｎ ＢＣＤＫ１の活性化を調節する。ＣＤＫ２の活性は、細胞分裂のＳ期とＧ２で最大に発現される。ＣＤＫ４（Ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ４）は、細胞周期Ｇ１からＳ期へ移行するのに必要である。ＣＤＫ６（Ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ６）は、Ｇ１／Ｓ転換を促進しつつ、細胞分化の間に細胞周期の開始と維持に関与する。主に細胞増殖を防止し、否定的な細胞分化を調節する機能をする。Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１は、有糸分裂に関与する調節タンパク質であり、細胞周期のＧ２／Ｍ段階の間に発現される細胞周期調節転写体である。

Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１は、細胞が有糸分裂を決定する役割を果たし、活性化されてｃｙｃｌｉｎ Ｂ１－ＣＤＫ１複合体を構成した後、初期有糸分裂などの多様な機転を促進する。

Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１は、毛髪の成長、ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ調節及び細胞増殖などの過程で重要な役割を果たすＷｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎシグナル伝達経路のｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅの一つであり、毛乳頭細胞の細胞分裂周期の全般に亘って細胞分裂に影響を与える。

Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ１は、毛乳頭細胞の細胞分裂周期のうち初期Ｇ１期を誘導しても良い。Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ１は、Ｇ１からＳ期への転換を促進してＤＮＡ合成の開始を誘導する。Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ１は、細胞周期のＧ１／Ｓ段階で最大に発現する。

毛乳頭細胞のタンパク質発現量を測定するために、６－ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに毛乳頭細胞を４×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で注入してから２４時間培養し、その後に基本培地（ｉｎｓｕｌｉｎなど毛乳頭細胞の成長因子を除去した培地）に毛乳頭細胞培養培地を交換した後、２４時間追加培養した。その後、濃度別に熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０（最終濃度：熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０ １×１０^６、１×１０^７及び１×１０^８ｃｅｌｌ／ｍＬ）を処理した培地に毛乳頭細胞培養培地を交換し、濃度別の熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０と毛乳頭細胞を２４時間共に培養しながら毛乳頭細胞の増殖を誘導し、培養が終わった後、Ｐｒｏ－Ｐｒｅｐ^ＴＭ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ （Ｉｎｔｒｏｎ、韓国）で毛乳頭細胞のタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質は、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙを使用してタンパク質量を測定し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ Ｊｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｊｅｓｓ；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ、ＵＳＡ）でウエスタンブロットを実行することでタンパク質発現量を測定した。Ｊｅｓｓのｃａｐｉｌｌａｒｙ ｃａｒｔｒｉｄｇｅを使用し、ｃａｐｉｌｌａｒｙの内部で電気泳動、ｂｌｏｃｋｉｎｇ、１次アンチボディ反応及び２次アンチボディ反応を進行し、ＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを使用して発現量を確認した。

その結果、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、毛乳頭細胞の成長周期に必要なタンパク質であるｃｙｃｌｉｎとＣＤＫタンパク質の発現を増加させ、毛乳頭細胞を成長させることが確認された（図４ａ乃至図４ｆ）。熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０の処理濃度によって毛乳頭細胞の増殖に影響を与えるタンパク質発現の程度は異なるものの、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１とｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現は増加させ、ＣＤＫ６とｃｙｃｌｉｎ Ｅ１は減少する傾向を示した（表２）。

特に、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１の発現量を最大３．９倍増加させており（図４ｄ）、これは、同一な成長時間の間に対照群（無処理）よりも毛乳頭細胞の細胞分裂周期のうちＧ２／Ｍ期に到逹した細胞の数がより多く、ＤＮＡ複製後に分裂中の毛乳頭細胞の数がより多く増加したことを意味する。

また、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を処理する場合、毛乳頭細胞の細胞分裂周期の全般に亘って細胞分裂に影響を与えるｃｙｃｌｉｎ Ｄ１タンパク質の発現は最大２．４倍増加したが（図４ｅ）、これは、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０が毛乳頭細胞内のｃｙｃｌｉｎ Ｄ１－ＣＤＫ４複合体を形成し、細胞分裂Ｇ１期からＤＮＡが複製されるＳ期への転換を誘導して毛乳頭細胞の成長を促進したことを意味する。

一方、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を処理した後、毛乳頭細胞の細胞分裂周期のうち初期Ｇ１期を誘導するｃｙｃｌｉｎ ＥとＣＤＫ６の発現量は若干減少されるか、処理前と類似した水準に維持されたが（図４ｃ、図４ｆ）、これは、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を処理した毛乳頭細胞は細胞分裂周期の初期段階であるＧ１期を経てＧ２／Ｍ期により多く到逹したことを意味する。

実施例６．ヒト由来組織を利用した脱毛防止及び発毛効果の測定
６－１）Ｅｘｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅの培養
研究目的で提供してもらったヒト頭皮組織（ＩＲＢ Ｎｏ．４－２０２１－１５２４；延世大学校医科大学、セブランス医療院生命倫理委員会）は、ＰＢＳで数回洗浄して残余不純物を除去した後、１ｃｍ×１ｃｍで準備した。

熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を頭皮組織専用培地に１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ又は１×１０^９ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、ヒト頭皮組織に５０μＬ塗布し、陰性対照群は、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０の代わりに頭皮組織専用培地５０μＬを塗布した。専用培地において３７℃、５％のＣＯ２条件で培養し、２４時間間隔で専用培地の取り替え及び処理物質の塗布を実施した。塗布７２時間後、各々の組織から皮下組織と表皮及び真皮組織を分離して試験に使用した。

６－２）リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ－ＰＣＲ）
脱毛及び発毛関連因子（５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－１、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ）の遺伝子発現程度をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を利用して確認した。ヒト頭皮組織から分離した皮下組織では５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－１の遺伝子発現量を確認し、表皮及び真皮組織ではＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＥＧＦの遺伝子発現量を確認した。

脱毛関連因子の一つである５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－１は、毛乳頭細胞、皮脂腺、表皮及び毛嚢の角化細胞などに主に分布し、テストステロン（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）と作用して脱毛を引き起こす主要原因であるＤＨＴ（Ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）を生成する役割をする酵素であり、ヒト毛乳頭細胞において５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－１遺伝子発現の減少は脱毛防止に関与すると知られている（Ｈ Ｒａｓｔｅｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

ＦＧＦ７（第７型線維芽細胞成長因子）は、線維芽細胞で生成されて角質細胞に分泌され、上皮及び表皮細胞の増殖を促進する増殖因子であって、毛嚢細胞分化を促進させ、真皮乳頭の血管系の増殖を誘導し、細胞外基質の量を増加させて成長期にある毛嚢を維持させるものと知られており、ＦＧＦ１０（第１０型線維芽細胞成長因子）は、休止期の毛嚢を成長期又は増殖期に誘導して細胞初期形成に寄与し、毛髪成長を促進する因子として知られている（Ｓｏｌｅ Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

ＥＧＦは、毛嚢の成熟に関与する成長因子として良く知られており、ｎｏｔｃｈ機転活性化を通じて毛乳頭細胞の増殖を促進すると研究されたことがある（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

試験が完了した組織をＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を利用して粉砕した後、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用してｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、抽出されたｔｏｔａｌ ＲＮＡは、ＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ ＥｃｏＤｒｙＴＭ Ｐｒｅｍｉｘ（Ｏｌｉｇｏ ｄＴ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を利用してｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡ、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び各ターゲットのＴａｑｍａｎ ｐｒｉｍｅｒ（ＳＲＤ５Ａ１ （５－α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－１）：Ｈｓ００９７１６４５＿ｇ１，ＦＧＦ７：Ｈｓ００９４０２５３＿ｍ１，ＦＧＦ１０：Ｈｓ００６１０２９８＿ｍ１，ＥＧＦ：Ｈｓ０１１００００２＿ｍ１；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を進行しており、各遺伝子の相対的な定量分析は、ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅであるＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用した。

ｃＤＮＡ増幅の際にリアルタイムで増幅量を確認して増幅曲線と閾値線との交差点である閾値サイクル（Ｃт）値を取得し、この値を基に相手定量値（ＲＱ）を求めることで、ターゲット遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を確認することができる。ＲＱは、以下の式によって計算した。

ＲＱ＝２^{－△△Ｃт}
△△Ｃт＝△Ｃт（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）－△Ｃт（ｃｏｎｔｒｏｌ）
△Ｃт＝Ｃт（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）－Ｃт（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）
－Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（実験群）：試験製品処理
－Ｃｏｎｔｒｏｌ（対照群）：陰性対照群
－Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ：ＳＲＤ５Ａ１（５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－１）、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＥＧＦ
－Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ：ＧＡＰＤＨ

６－３）統計分析
統計分析は、ＩＢＭ ＳＰＳＳ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２５．０プログラムを利用して検証しており、実験群と対照群との有意性有無を仮説平均差５％（ｐ＜０．０５）で確認した。正規性の検定後、正規性満足可否によって独立標本Ｔ－検定（パラメトリック手法）を通じて有意性有無を確認した。

６－４）研究結果
脱毛を誘発する原因として知られている５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅは、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０の濃度とは関係なく全ての濃度において有意に減少した（ｐ＜０．０５）。発毛及び毛髪の成長を誘導するＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びＥＧＦは、高濃度処理群である１×１０^９ｃｅｌｌ／ｍＬで有意に増加した（ｐ＜０．０５）。よって、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、脱毛防止及び発毛促進に役立つことが確認された。

実施例７．脱毛症状の緩和に役立つ機能性原料と熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０の脱毛防止効果
脱毛症状の緩和に役立つ機能性化粧品に良く使用される有効成分であるエルメントール、サリチル酸及びデクスパンテノールと熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を共に使用した際に毛乳頭細胞の成長に与えられる影響を確認した。９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに毛乳頭細胞を接種して２４時間培養した後、ｗｅｌｌ内の培地を成長因子が欠乏した培地に取り替えて２４時間追加培養を行った。その後、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０、エルメントール、サリチル酸及びデクスパンテノールを単独又は３：２．６：２の割合で混合し、前記方法で準備した毛乳頭細胞に処理して毛乳頭細胞の成長に与えられる影響を確認した。

毛乳頭細胞のみを培養した際の成長率とエルメントール、サリチル酸、デクスパンテノール及び熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を単独又は混合処理した際の毛乳頭細胞成長率を算出した後、以下の式により各処理物質の毛乳頭細胞成長促進効果を算出し、効果を比較した。全ての試験は３回繰り返して行い、各結果の平均を求めて比較した。

毛乳頭細胞成長促進効果（％）＝（Ｂ－Ａ）÷Ａ×１００
Ａ＝無処理群の毛乳頭細胞成長率
Ｂ＝エルメントール、サリチル酸、デクスパンテノール及び熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を処理した際の毛乳頭細胞の成長率

その結果、脱毛緩和効果があると広く知られているエルメントール、サリチル酸及びデクスパンテノールのうち、エルメントールとサリチル酸は、毛乳頭細胞の成長を阻害すると示された。デクスパンテノールは、毛乳頭細胞の成長は促進できたものの、全ての濃度の熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０よりも毛乳頭細胞成長促進効果が低かった。一方、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０をエルメントール、サリチル酸及びデクスパンテノール複合物と共に処理する場合、複合物の毛乳頭細胞成長阻害効果を克服し、毛乳頭細胞の成長を促進できることが確認された。これらの相乗効果を綿密に把握すべくコルビーの式（Ｃｏｌｂｙ ｆｏｒｍｕｌａ）で予測される効果を算出し、予測値と実測値（測定値）とを比較することで予測値を上回る相乗効果を出すことができるか否かを検証した。

Ｃｏｌｂｙの式
予測値＝（Ａ＋Ｂ）－（Ａ×Ｂ／１００）
（出典：Ｓ．Ｒ．Ｃｏｌｂｙ，「Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｄ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ」，Ｗｅｅｄｓ １９６７，１５，２０－２２）

その結果、エルメントール、サリチル酸及びデクスパンテノールを３：２．６：２の割合で混合した混合物は毛乳頭細胞の成長を阻害したが、前記混合物と熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を共に処理する場合、毛乳頭細胞の成長を促進することができた。また、前記混合物と熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を１×１０^６又は１×１０^７ｃｅｌｌ／ｍＬで処理した際は、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を単独で使用するよりも毛乳頭細胞成長促進効果が優秀であった。

製造例１．熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を含む液剤の開発
前記実施例５で相乗効果が確認された脱毛緩和機能性化粧品の有効成分であるエルメントール、サリチル酸及びデクスパンテノールと熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を含む、頭皮に噴霧して満遍なく塗布できる液剤を開発した。開発された液剤には、エルメントールが０．３％、サリチル酸が０．２６％、デクスパンテノールが０．２％、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０が５％含有されており、その他に、精製水、エタノール、アラニン／ヒスチジン／リシンポリペプチド銅ＨＣｌ（Ａｌａｎｉｎｅ／Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ／Ｌｙｓｉｎｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｐｐｅｒ ＨＣｌ）、ポリアクリレートクロスポリマー－６、ココナツ酸、プロリン、ティーツリーオイル、グリセリン、ペプチド、ブチレングリコール、１，２－ヘキサンジオール、緑茶抽出物、ラベンダー花抽出物、カリン抽出物、エチルヘキサンジオールなどを添加して調剤した。

実施例８．人体適用試験を通じた脱毛緩和効果の検定
人体適用試験は、株式会社グローバル医学研究センターで実施し、研究倫理委員会から人体適用試験の承認を受けて実施した（承認番号：ＧＩＲＢ－２１０２９－ＥＴ）。試験参加者は１８～５４歳の韓国人男性と女性２５名であり、このうち２名が中途脱落した。

全参加者は６ヶ月間、就寝前に頭皮に製造例１の製品を満遍なく塗布し、０、８、１６、２４週間隔で訪問して製品使用順応度、フォトトリコグラムを利用した毛髪密度測定、専門家による肉眼評価、参加者らの有効性アンケート評価（毛髪成長満足度、脱毛緩和満足度及び前髪ヘアライン満足度）などを評価した。

試験対象者の製品使用順応度を調べた結果、使用回数基準に８０％未満使用した試験対象者は「０名」と確認されており、よって、全参加者は、計２４週間の試験期間の間、試験製品を定められた通り１日１回、就寝前、頭皮に塗布して使用した。

試験製品の効能は、毛髪密度測定（フォトトリコグラム）、専門家による写真撮影及び肉眼評価、使用満足感に対する有効性評価を実施して検証した。毛髪の密度を測定するために、評価しようとする脱毛部位を１ｃｍ^２の円形に削毛した後、直径１ｍｍの点を入れ墨し、毛髪密度測定器を使用して撮影した。毛髪密度は計４回に亘って８週間毎に測定しており、入れ墨を基準に１ｃｍ^２の円内の毛髪数を測定した。

その結果、試験参加者らは、試験製品の使用前と比較して持続的に毛髪密度が増加しており、１６週間後には、統計的に有意に使用前よりも毛髪密度が増加した（ｐ＜０．０５）。

専門家による肉眼評価は、試験部位である頭頂（９０゜）及び前髪ヘアライン（４５゜）を撮影して実施した。肉眼評価は２人の専門家が実施し、変化を７点尺度で評価した。その結果、試験参加者らは、試験製品を使用しながら肉眼で確認されるほどに脱毛症状が緩和され、発毛が進行していることが分かった。研究者間の肉眼評価一致度の程度をＩＣＣ（Ｉｎｔｒａｃｌａｓｓ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ）法で確認して研究結果の精密度を検証した結果、研究者間の肉眼評価一致度は、級内相関係数が０．９１６となり、完璧な一致度を表す１に近く示された。

製品の使用後、試験参加者らの有効性アンケート評価は７点尺度で実施した（－３点：非常に悪くなった、－２点：悪くなった、－１点：少し悪くなった、０点：変化なし、１点：少し良くなった、２点：良くなった、３点：非常に良くなった）。その結果、試験製品を計２４週間使用した参加者らは、毛髪成長、脱毛緩和及び前髪ヘアラインに対して満足しており、使用期間が増加するほど満足度が増加する傾向を示した。

実施例９．熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０が含有された製品使用前後の頭皮微生物環境の変化
前記製造例１の製品を使用する前と使用２４週間後の頭皮微生物環境を比較した。頭皮微生物の採取は、滅菌済みのｓｋｉｎ－ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ採取用綿棒（ｓｗａｂ）を使用して行い、採取後直ちにヘキサン輸送培地を使用して低温を保ちながら微生物分析機関に発送した。頭皮微生物の分析は、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ後にｌｉｂｒａｒｙを製作して１６Ｓ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ分析を実施して比較した。

その結果、試験参加者らは、製造例１の製品を使用した後に頭皮乳酸菌が４倍増加した（図７ａ）。また、頭皮微生物の多様性も改善されており、頭皮の総微生物多様性は６０％増加し（図７ｂ）、頭皮の乳酸菌多様性は１７６％増加した（図７ｃ）。製造例１の製品を使用した後は、円形脱毛症の人から減少する微生物であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｒａｅが増加する傾向を示した（図７ｄ、図７ｅ）。よって、熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０を頭皮に塗布する場合、頭皮微生物環境を変化させて脱毛症状を予防することができるということを確認した。

上述した本願の説明は例示のためのものであり、本願の属する技術分野において通常の知識を有する者であれば、本願の技術的思想や必須の特徴を変更せずに他の具体的な形態に容易に変形可能であるということを理解できるはずである。それゆえ、上記した実施例は全ての面において例示的なものであり、限定的なものではないと理解すべきである。例えば、単一型で説明されている各構成要素は分散して実施されても良く、同様に、分散したものと説明されている構成要素も結合された形態で実施されても良い。

Claims (13)

1. 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０（ＫＣＣＭ１２９１８Ｐ）を有効成分として含み、
   エルメントール、サリチル酸及びデクスパンテノールをさらに含む、毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物。
2. 前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、発酵生地から由来したものである、請求項１に記載の毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物。
3. 前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、飽和脂肪酸：不飽和脂肪酸：環状脂肪酸の割合が０．１～２：０．２５～５：０．０３～０．６である、請求項１に記載の毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物。
4. 前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１及びｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現を増加させる、請求項１に記載の毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物。
5. 前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－１遺伝子の発現量を減少させ、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びＥＧＦ遺伝子の発現量を増加させる、請求項１に記載の毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物。
6. 前記毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物における前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０の濃度は、１×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬ又は１×１０^７ｃｅｌｌ／ｍＬである、請求項１に記載の毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物。
7. 前記毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物は、精製水、エタノール、アラニン／ヒスチジン／リシンポリペプチド銅ＨＣｌ（Ａｌａｎｉｎｅ／Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ／Ｌｙｓｉｎｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｐｐｅｒ ＨＣｌ）、ポリアクリレートクロスポリマー－６、ココナツ酸、プロリン、ティーツリーオイル、グリセリン、ペプチド、ブチレングリコール、１，２－ヘキサンジオール、緑茶抽出物、ラベンダー花抽出物、カリン抽出物及びエチルヘキサンジオールをさらに含む、請求項１に記載の毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物。
8. 前記毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物は、頭皮の微生物多様性及び乳酸菌多様性を増加させる、請求項７に記載の毛乳頭細胞増殖用化粧料組成物。
9. 熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０（ＫＣＣＭ１２９１８Ｐ）を有効成分として含み、
   エルメントール、サリチル酸及びデクスパンテノールをさらに含む、脱毛治療用薬学組成物。
10. 前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、発酵生地から由来したものである、請求項９に記載の脱毛治療用薬学組成物。
11. 前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、飽和脂肪酸：不飽和脂肪酸：環状脂肪酸の割合が０．１～２：０．２５～５：０．０３～０．６である、請求項９に記載の脱毛治療用薬学組成物。
12. 前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１及びｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現を増加させる、請求項９に記載の脱毛治療用薬学組成物。
13. 前記熱処理乳酸菌リモシラクトバチルスファーメンタムＬＭ１０２０は、５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－１遺伝子の発現量を減少させ、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びＥＧＦ遺伝子の発現量を増加させる、請求項９に記載の脱毛治療用薬学組成物。