JP7815595B2 - 抗ｍｄｒ１抗体およびその使用 - Google Patents

抗ｍｄｒ１抗体およびその使用

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、2020年1月29日に出願された米国仮特許出願第62/967,470号および2020年9月30日に出願された米国仮特許出願第63/085,818号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらの出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
テキストファイルとして提供される配列表の参照による援用
2021年1月28日に作成され291 KBのサイズを有する「KNJY-003WO SEQ LIST_ST25.txt」というテキストファイルとして、配列表がここに提供される。このテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
薬剤耐性は、疾患が薬剤治療に耐性になるときに生じるよく知られた現象であり、腫瘍学を含め医学の各種分野において主要なかつ増加中の課題である。多くのタイプの癌は、最初は化学療法に感受性であるが、時間の経過とともに、薬物の阻害、分解および排出の増強を促進するDNA突然変異および代謝変化を含む、これらおよび他の機序を介して耐性を発達させ得る。
排出ポンプ（EP：efflux pump）は生細胞で発現するタンパク質であり、細胞から種々の化合物を自然に排出するように進化した。ATP結合カセット (ABC) トランスポーターファミリータンパク質のメンバーは、薬剤排出を可能にするEPの例である。トランスポーターの構造はタンパク質ごとに異なるが（例えば、ヒトのABCファミリーには49の既知メンバーがある）、これらは全て、高度に保存されたヌクレオチド結合ドメインと、より可変性のある膜貫通ドメインという、2つの明確なドメインの存在によって分類される。ATP結合カセットサブファミリーBメンバー1（ABCB1）遺伝子によりコードされる多剤耐性タンパク質1（MDR1：multidrug resistance protein 1）は、これらの中で最初に同定されたものであり、広く研究されている。MDR1発現は、特定の化学療法薬による治療に応答して増加する。
EPは腫瘍が化学療法剤に対する耐性を発達させることを可能にする。このような耐性は、薬物耐性細胞からの化学療法剤の排出の増強としばしば関連する。この化学療法耐性は、複数の化学療法剤に適用される場合、多剤耐性（MDR）と呼ばれる。
したがって、EPの発現のアッセイおよび／またはEPの阻害に使用できる試薬を開発する必要がある。
細胞排出ポンプMDR1を標的とする抗体が提供される。また、そのような抗体を含むかまたはコードする医薬組成物、核酸、組換え発現ベクター、細胞、およびキットも提供される。細胞（例えば腫瘍細胞）におけるMDR1発現の有無、MDR1発現のレベルを検出すること、および／またはMDR1機能を阻害することのために該抗体を使用する方法も開示される。さらに、MDR1および腫瘍関連抗原（TAA：tumor associated antigen）に結合する多特異性抗体が提供される。本明細書に開示される抗MDR1抗体またはMDR1とTAAの両方を標的とする多特異性抗体を対象に投与することを含む、対象を癌について治療する方法も提供される。
図1は、本開示の精製された抗MDR1抗体についてのクロマトグラムを示す。純度92.08%のIgG抗体（MW 171.74 kDa）が得られた。重／軽二量体「HL」（MW 94.88 kDa）および重／重「HH」（MW 126.85 kDa）もごくわずか存在した。 図2A～2Bは、MDR1を過剰発現する293T細胞への抗MDR1抗体の単一点結合を示す。 図3A～3Dは、MDR1に結合する抗MDR1モノクローナル抗体のタイトレーションを示す。 図4A～4Dは、列記された抗MDR1抗体の、ビンクリスチン（Vincristine, Vin）細胞毒性に対する影響を示す。 図5A～5Cは、ヌードマウスにおける薬剤耐性卵巣癌（A2780 ADR）モデルに対する、列記された抗MDR1抗体の有効性を示す。 図6は、ヌードマウスにおける薬剤耐性MES-SA-DX5子宮肉腫モデルに対する、列記された抗MDR1抗体の効力を示す。 図7は、NSGマウスにおける薬剤耐性MES-SA-DX5子宮肉腫モデルに対する抗MDR1抗体B1.223の有効性を示す。 図8は、薬剤耐性腫瘍におけるABCB1ノックアウトがパクリタキセルに対する化学感受性を誘導することを示す。 図9は、ヒトMDR1の種々の領域への、列記された抗体の結合を要約する。 図10A～10Cは、ヒトおよびカニクイザルMDR1に対する、B1.129抗体およびそのヒト化バージョンの結合を示す。 図11は、ヒトおよびカニクイザルMDR1に対する、B1.28抗体およびそのヒト化バージョンの結合を示す。 図12は、ヒトおよびカニクイザルMDR1に対する、B1.261抗体およびそのヒト化バージョンの結合を示す。 図13は、MDR1基質の排出に対する、列記された抗体の影響を要約する。 図14は、C6細胞の表面上に発現されたヒトMDR1に対する、抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体の結合を示す。 図15は、C6細胞の表面上に発現されたカニクイザルおよびヒトCD47に対する、抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体の結合に関するデータを示す。 図16は、DX5 WT、DX5 B1 KO、DX5 CD47 KO細胞株に対する、列記された二重特異性抗体の結合選択性タイトレーションを示す。 図17Aは、ヒトABCB1（hB1）またはヒトCD47（hKT14）またはカニクイザルCD47（cKT14）を過剰発現するC6細胞に対する、ヒト化抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体の結合を示す。図17Bは、ヒトABCB1（hB1）またはヒトCD47（hKT14）またはカニクイザルCD47（cKT14）を過剰発現するC6細胞に対する、ヒト化抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体の結合を示す。 図18A～18Bは、ELISAまたはCD47発現細胞を用いて、およびABCB1発現細胞を用いて、種々の二重特異性抗体のCD47への結合についてアッセイした結果を要約する。N.D.=未決定。 図19は、本開示の特定の実施形態による様々な二重特異性抗体フォーマットを示す。 図20は、scFv-Fab-Fcフォーマットを有する抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体を示す。 図21は、KT14.5F9hu scFv-B1.28.hu13およびKT14.B6H12hu scFv-B1.28.hu13抗体が、C6細胞の表面上に発現されたヒトCD47およびヒトMDR1の両方に結合することを示す。 図22は、KT14.5F9hu scFv-B1.261.hu1およびKT14.B6H12hu scFv-B1.261.hu1抗体が、C6細胞の表面上に発現されたヒトCD47およびヒトMDR1の両方に結合することを示す。 図23A～23Cは、単独で投与されるかまたはパクリタキセルと共投与される場合の、MES-SA-DX5異種移植片モデルにおける腫瘍体積に対する本開示の抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体の効果を示す。 図24は、両方の抗原に結合する組合せを同定するために二重特異性抗体フォーマットで試験された抗MDR1重鎖、抗HER2重鎖、および抗MDR1共通軽鎖の種々の組合せを列記する。 図25は、両方の抗原に結合する組合せを同定するために二重特異性抗体フォーマットで試験された抗MDR1重鎖、抗PDL1重鎖、および抗MDR1共通軽鎖の種々の組合せを列記する。
定義
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、任意のアイソタイプ（isotype）の抗体または免疫グロブリン、抗原への特異的結合を保持する抗体のフラグメント（Fab、Fv、scFv、Fd、Fab'、Fv、F(ab')2を含むがこれらに限定されない）、キメラ抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体（重鎖のみを含む抗体を含む（例えばVHHラクダ抗体）、二重特異性抗体、および抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質とを含む融合タンパク質を含む。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類され得る。免疫グロブリンには、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMという5つの主要なクラスがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（イソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、およびIgA2に分けられ得る。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、特にIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4抗体を含むが、これらに限定されない。抗体は、例えば放射性同位元素、検出可能産物を生成する酵素、蛍光タンパク質等で検出可能に標識され得る。抗体は、例えばビオチン（ビオチン-アビジン特異的結合対のメンバー）のような特異的結合対のメンバーなど、他の部分にさらにコンジュゲートされ得る。抗体はまた、限定されるわけではないが、ポリスチレンプレートまたはビーズなどを含む固体支持体に結合され得る。抗体は、一価または二価であり得る。抗体は、化学療法剤などの毒性部分にコンジュゲートされ得る。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分、例えば、無傷抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片；ジアボディ；リニアー抗体（Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)）；重鎖のみを含む抗体（例えばVHHラクダ抗体）を含む、単鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する「Fab」フラグメントと呼ばれる2つの同一の抗原結合フラグメント、および残りの「Fc」フラグメント（容易に結晶化するその能力を反映した名称である）を生成する。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有しまだ抗原を架橋することができるF(ab')2フラグメントが得られる。
「Fv」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体断片である。この領域は、1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインの、強固に非共有結合的会合をした二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの3つのCDRが相互作用して、VH-VL二量体の表面に抗原結合部位を規定する。集合的に、6つのCDRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（あるいは抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分）であっても、各可変ドメインの3つのCDRを含む完全な結合部位よりは低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
「Fab」フラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1の定常ドメイン（CH1）も含む。Fabフラグメントは、重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端における少数の残基（抗体ヒンジ領域からの1つ以上のシステインを含む）の付加により、Fab'フラグメントとは異なる。Fab'-SHとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するFab'を指す、本明細書における名称である。F(ab')2抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として作製された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
脊椎動物種由来の抗体 (免疫グロブリン) の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパとラムダと呼ばれる2つの明確に区別されるタイプのいずれかに分類することができる。
「単鎖Fv」、「sFv」、または「scFv」抗体フラグメントは、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインが単一ポリペプチド鎖中に存在する。いくつかの実施形態において、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、sFvが抗原結合のための望まれる構造を形成することを可能にする。sFvの総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) を参照のこと。
用語「ジアボディ」とは、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は、重鎖可変ドメイン（VH）が同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（VL）に連結されたもの（VH-VL）を含む。同一鎖上の2つのドメイン間の対合を許容するには短すぎるリンカーを使用することによって、該ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合することを強いられて、2つの抗原結合部位を創出する。ジアボディは、例えばEP 404,097；WO 93/11161；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) に、より詳細に記載されている。
様々な非伝統的抗体の構成を図19に示す。
本明細書中で使用される場合、用語「親和性」は、2つの薬剤の可逆的結合についての平衡定数を指し、解離定数 (Kd) として表される。親和性は、無関係なアミノ酸配列に対する抗体の親和性よりも、少なくとも1倍大きい、少なくとも2倍大きい、少なくとも3倍大きい、少なくとも4倍大きい、少なくとも5倍大きい、少なくとも6倍大きい、少なくとも7倍大きい、少なくとも8倍大きい、少なくとも9倍大きい、少なくとも10倍大きい、少なくとも20倍大きい、少なくとも30倍大きい、少なくとも40倍大きい、少なくとも50倍大きい、少なくとも60倍大きい、少なくとも70倍大きい、少なくとも80倍大きい、少なくとも90倍大きい、少なくとも100倍大きい、もしくは少なくとも1000倍大きい、またはそれ以上であり得る。標的タンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、約100ナノモーラー (nM) ～約0.1 nM、約100 nM～約1ピコモーラー (pM) 、もしくは約100 nM～約1フェムトモーラー (fM) 、またはそれ以上であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「アビディティ」は、2つ以上の剤の複合体の希釈後の解離に対する耐性を指す。用語「免疫反応性」および「優先的に結合する」は、抗体および／または抗原結合フラグメントに関して本明細書において交換可能に使用される。
用語「結合」は、例えば、共有結合、静電的、疎水性、およびイオン結合性および／または水素結合性相互作用（塩橋および水橋などの相互作用を含む）による、2つの分子間の直接的な会合を指す。MDR1特異的抗体は、MDR1ポリペプチド内のエピトープに特異的に結合する。ある態様において、抗MDR1抗体は、MDR1を発現していない細胞には結合しないか、または有意に低い親和性で結合する。エピトープは、アミノ酸の連続した並びによって形成された線形（linear）エピトープ、または非連続的なアミノ酸の並びによって形成された非線形もしくは立体配座エピトープであり得る。非特異的結合とは、約10-7 M未満の親和性での結合、例えば、10-6 M、10-5 M、10-4 Mなどの親和性での結合をいう。
本明細書中で使用する場合、用語「CDR」または「相補性決定領域」は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される不連続な抗原結合部位を意味することが意図される。CDRは超可変領域であり、「フレームワーク領域 (FR)」と呼ばれる、より保存された領域と共に散在する。CDRはKabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991); by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); およびMacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) によって記載されており、そこにおいて定義は、互いに比較された場合にアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体もしくはグラフト化抗体またはそのバリアントのCDRを指すためのいずれの定義の適用も、本明細書において定義および使用される用語の範囲内であることが意図される。上記の引用文献の各々によって定義されるCDRを包含するアミノ酸残基が、比較として以下の表1に記載される。
本明細書中で使用される場合、用語「フレームワーク」は、抗体可変領域に関して使用される場合、抗体の可変領域内の、CDR領域外のすべてのアミノ酸残基を意味することを意図する。可変領域フレームワークは、一般に、長さが約100～120アミノ酸の不連続なアミノ酸配列であるが、CDRの外側のアミノ酸のみを参照することを意図している。本明細書中で使用される場合、用語「フレームワーク領域」は、CDRによって分離されるフレームワークの各ドメインを意味することを意図する。VH鎖は、以下の順序でN末端からC末端へと配列された3つのCDRおよび4つのFRを含み得る：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。同様に、VL鎖は、以下の順序でN末端からC末端へと配列された3つのCDRおよび4つのFRを含み得る：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
本明細書中で使用される場合、抗体という用語は、2つの重鎖および2つの軽鎖の四量体を包含し、ここで、重鎖および軽鎖は、例えばジスルフィド結合によって相互接続される。重鎖定常領域はCH1、CH2及びCH3という3つのドメインから構成される。軽鎖定常領域はCLという1つのドメインから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。抗体の定常領域は、典型的には、宿主の組織および因子（免疫系の種々の細胞および補体系の第1成分を含む）への抗体の結合を媒介する。「抗体」という用語は、IgA、IgG、IgE、IgD、IgMおよびそれらのサブタイプの免疫グロブリンを含む。ある態様において、対象抗体は、IgGアイソタイプ、例えば、IgG1である。
本明細書中で使用される場合、用語「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1以上のポリペプチドを含むタンパク質を指す。認識されたヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ（IgA1およびIgA2）、ガンマ（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子；および多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリン軽鎖（約25 kDまたは214アミノ酸）は、N末端（約110アミノ酸）において可変領域遺伝子およびC末端においてカッパまたはラムダ定常領域によってコードされる。全長免疫グロブリン重鎖（約50 kDまたは446アミノ酸）は、N末端（約116アミノ酸）において可変領域遺伝子およびC末端において前記他の定常領域遺伝子の一つ、例えばガンマ（約330アミノ酸をコードする）によってコードされる。ある態様において、対象抗体は、全長免疫グロブリン重鎖および全長免疫グロブリン軽鎖を含む。
用語「抗原結合断片」は、全長抗体の1つ以上の断片であって抗原に特異的に結合することができるものを指す。結合断片の例としては、以下のものが挙げられる：(i) Fabフラグメント（例えばVL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる、一価フラグメント）；(ii) F(ab')2フラグメント（ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント）；(iii) Fdフラグメント（VHおよびCH1ドメインを含むもの、例えば、それらからなるもの）；(iv) Fvフラグメント（例えば、抗体の単一アームのVHおよびVLドメインを含むもの、例えば、それらからなるもの）；(v) dAbフラグメント（VHドメインを含むもの、例えばVHドメインからなるもの）；(vi) 単離されたCDR；(vii) 単鎖Fv（scFv）（抗体の単一アームのVHおよびVLドメインが組換え手段を用いた合成リンカーによって連結されてVHおよびVLドメインが対になって一価分子を形成するようにしたものを含むもの、例えばそれからなるもの）；(viii) ジアボディー（それらが対をなさないようにVHドメインおよびVLドメインを連結して一価分子を形成した、2つのscFvを含むもの、例えば2つのそのようなscFvからなるもの；scFv対のそれぞれのVHはもう一方のscFvのVLドメインと対を形成し、二価分子を形成する）。
用語「キメラ」抗体とは、重鎖および/または軽鎖のある部分が特定の供給源または種に由来し、重鎖および/または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体をいう。
「ヒト抗体」とは、ヒトまたはヒト細胞によって産生される抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源由来の抗体に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリン可変軽鎖 (VL) または可変重鎖 (VH) フレームワーク配列の選択において最も一般的に起こるアミノ酸残基を表すフレームワーク (FR) である。一般に、ヒト免疫グロブリンのVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループから起こる。一般に、配列のこのサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3におけるもののようなサブグループである。一実施形態では、VLについて、このサブグループは、上記Kabat et al.におけるサブグループカッパIである。一実施形態では、VHについて、このサブグループは、上記Kabat et al.におけるサブグループIIIである。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトCDR由来のアミノ酸残基およびヒトフレームワーク (FR) 由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体をいう。ヒト化抗体定常領域の少なくとも一部は、例えばヒトIgG1などのヒト抗体に由来する。好ましい態様において、本明細書に開示される抗体分子は、本明細書に提供される可変重鎖領域と、UniProt: P01857-1バージョン1に提供されるアミノ酸配列を有するヒトIgG1定常領域とを含む重鎖を含む。好ましい態様において、本明細書に開示される抗体分子は、本明細書に提供される可変軽鎖領域とヒト軽鎖定常領域とを含む軽鎖を含む。好ましい実施形態において、ヒト軽鎖定常領域は、UniProtKB/Swiss-Prot: P01834.2に記載されるアミノ酸を有するヒトカッパ軽鎖定常領域である。特定の態様において、対象抗体に存在するヒトIgG1重鎖定常領域は、例えばFc機能を調節するための置換などの、突然変異を含み得る。例えば、LALAPGエフェクター機能突然変異（L234A、L235A、およびP329G）またはN297A突然変異を導入して、抗体依存性細胞傷害（ADCC）を低下させることができる。置換の番号付けはEU番号付けシステムに基づく。「EU番号付けシステム」または「EUインデックス」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合に使用される（例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) で報告されているEUインデックス）。「KabatにおけるEUインデックス」とは、ヒトIgG1 EU抗体の残基番号付けを指す。
抗体（例えば非ヒト抗体）の「ヒト化形態」とは、ヒト化を受けた抗体をいう。
用語「エピトープ」は、免疫系（例えば抗体、B細胞、またはT細胞）によって認識される抗原の領域を指す。例えば、エピトープは、抗体が結合する抗原の特定の領域である。この用語は特に、線形（連続的）エピトープおよび非線形（立体配座的または不連続的）エピトープを包含する。
「単離された」抗体とは、同定されてその自然の環境における成分から分離および/または回収された抗体である。その自然の環境のコンタミナント成分は、抗体の診断的または治療的使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。いくつかの実施形態において、抗体は、(1) Lowry法によって測定される抗体の重量として90%超、95%超、または98%超、例えば、99重量%超、(2) スピニングカップシークエネーターの使用により、N末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るために十分な程度、または (3) クーマシーブルーまたは銀染色を使用した、還元または非還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって均質になるまで、精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないので、組換え細胞内のin situでの抗体を含む。いくつかの例では、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程によって調製される。
用語「MDR1」および「ABCB1」は、本明細書において交換可能に使用され、ヒトMDR1およびその天然に存在するバリアント（例えば対立遺伝子バリアント）を含め、天然配列の多剤耐性細胞排出ポンプタンパク質を指す。
本明細書で使用される用語「細胞傷害性薬剤」は、細胞機能を阻害または防止し、および/または細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。「化学療法剤」は、「抗腫瘍剤」とも呼ばれ、癌または他の疾患もしくは障害を治療するために使用される細胞毒性剤であり得る。
本明細書中で使用される、「治療」「治療すること」などの用語は、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを意味する。その効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという意味で予防的であり得、および/または、疾患および/またはそれに起因する有害作用の部分的または完全な治癒という意味で治療的であり得る。本明細書中で使用される「治療」とは、ヒトを含む哺乳動物における疾患のあらゆる治療を包含し、以下のことを含む：(a) 疾患の素因を有し得るがまだ疾患を有するとは診断されていない対象において疾患が起こるのを予防すること；(b) 疾患を抑制すること、すなわちその発達を阻止すること；(c) 疾患を軽減すること、すなわち疾患の退行を引き起こすこと。
本明細書で互換的に使用される用語「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」は、限定されるものではないが、ネズミ（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含む哺乳動物を指す。
「治療的有効量」または「有効量」とは、疾患を治療するために哺乳動物または他の対象に投与された場合に、その疾患に関してそのような治療をもたらすために十分な標的特異的抗体の量をいう。「治療的有効量」は、抗体、疾患およびその重症度、ならびに治療対象の年齢、体重等に応じて変化する。
本明細書で使用される用語「治療抵抗性（refractory）」は、治療に応答しない疾患または状態を指す。癌に関して、本明細書において使用される「治療抵抗性癌」は、治療に応答しない癌を指す。治療抵抗性のがんは、治療開始時に抵抗性を示すこともあれば、治療のあいだに抵抗性となることもある。治療抵抗性の癌は、耐性癌とも呼ばれる。
「生物学的試料」は、個体から得られる種々の試料タイプを包含し、診断アッセイまたはモニタリングアッセイにおいて使用され得る。その定義は、血液及び生物学的起源の他の液体試料、生検試料もしくは組織培養物のような固形組織試料、又はそれらから誘導された細胞及びそれらの子孫を包含する。また、その定義は、試薬による処理、可溶化、または、例えばポリヌクレオチドのような特定の成分についての濃縮のような、その調達後に何らかの態様で操作された試料も含む。用語「生物学的試料」は、臨床試料を包含し、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、体液、および組織試料も包含する。
一対の配列間のパーセント同一性は、その対における一致の数に100を掛け、アラインメントされた領域の長さ（ギャップを含む）で割ることによって計算することができる。同一性スコアリングでは完全一致のみがカウントされ、アミノ酸同士の類似性の程度は考慮されない。長さには内部ギャップのみが含まれ、配列終端におけるギャップは含まれない。パーセント同一性＝（一致x 100）／アラインメントされた領域の長さ(ギャップを含める)
「保存的アミノ酸置換」という語句は、以下のグループ内のアミノ酸残基の置換を指す：1) L、I、M、V、F；2) R、K；3) F、Y、H、W、R；4) G、A、T、S；5) Q、N；6) D、E。保存的アミノ酸置換は、タンパク質中のアミノ酸（複数可）を、類似した酸性、塩基性、電荷、極性、またはサイズを有する側鎖を有するアミノ酸で置き換えることによって、タンパク質の活性を保存し得る。
用語「ベクター」は、タンパク質コード情報を宿主細胞に伝達するために使用される任意の分子または実体（例えば核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
用語「発現ベクター」または「発現構築物」とは、宿主細胞の形質転換に適したものであって、作動可能に連結された1つ以上の異種コード領域の発現を（宿主細胞と共に）誘導および/または制御する核酸配列を含有する、ベクターを指す。発現構築物は、作動可能に連結されたコード領域の転写、翻訳、およびイントロンが存在する場合にはRNAスプライシングに影響を及ぼすまたはそれを制御する配列を含み得るが、これらに限定されない。
用語「刺激」は、刺激分子（例えばTCR/CD3複合体またはCAR）とその同族リガンド（あるいはCARの場合は腫瘍抗原）との結合によって誘導される一次応答であって、それによって例えばTCR/CD3複合体を介するシグナル伝達または適切なNK受容体もしくはCARのシグナル伝達ドメインを介するシグナル伝達であるがそれに限定されないシグナル伝達イベントを媒介するものを指す。刺激は特定の分子の発現変化を媒介し得る。
「刺激分子」という用語は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一態様について刺激性の態様で免疫細胞の活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列を提供する、免疫細胞（例えばT細胞、NK細胞、B細胞）によって発現される分子を指す。1つの態様において、シグナルは、例えば、ペプチドを積載したMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって開始される一次シグナルであり、T細胞応答（増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されない）の媒介をもたらす。刺激性態様で作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）またはITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。本発明において特に有用な細胞質シグナル伝達配列を含有するITAMの例としては、CD3ゼータ、共通FcRガンマ（FCER1G）、FcガンマRIIa、FcRベータ（FcイプシロンR1b）、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD79a、CD79b、DAP10、およびDAP12に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによってT細胞による共刺激応答（例えば増殖であるがこれに限定されない）を媒介する、T細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子は、限定されるものではないが、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体、ならびにOX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、ICOS（CD278）、および4-1BB（CD137）を含む。
用語「自家性（autologous）」は、後にその物質が再導入されるその同じ個体に由来する物質を指す。
本明細書で使用される用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、CAR含有細胞（例えばCAR-T細胞）の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えばCAR-T細胞における免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性およびヘルパー活性が含まれ、これはサイトカインの分泌を含む。
本明細書で使用される「免疫エフェクター細胞」という用語は、例えば免疫エフェクター応答の促進において、免疫応答に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例には、T細胞、例えばアルファ/ベータT細胞およびガンマ/デルタT細胞、B細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、ナチュラルキラーT (NKT) 細胞、マスト細胞、および骨髄由来食細胞が含まれる。
置換、挿入または欠失についてのガイダンスは、異なる種由来のタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントに基づくか、または同一もしくは類似の機能を有する複数のタンパク質に基づくコンセンサス配列に由来し得る。
詳細な説明
細胞排出ポンプMDR1を標的とする抗体が提供される。また、そのような抗体を含むかまたはコードする医薬組成物、核酸、組換え発現ベクター、細胞、およびキットも提供される。細胞（例えば腫瘍細胞）におけるMDR1発現の有無、MDR1発現のレベルを検出すること、および／またはMDR1機能を阻害することのために該抗体を使用する方法も開示される。さらに、MDR1およびTAAに結合する多特異性抗体が提供される。また、癌について対象を治療する方法であって、本明細書に開示される抗MDR1抗体、またはMDR1と腫瘍関連抗原との両方を標的とする多特異性抗体を対象に投与することを含む方法も提供される。
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は記述される特定の実施形態に限定されるものではなく、そのような実施形態は当然ながら変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるのであり、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであって、限定することを意図したものではないことを理解されたい。
数値範囲が提供される場合、各介在値は、文脈が別に明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限と、その記載された範囲内の他の記載された又は介在する値との間で、下限の単位の10分の1まで、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内のいずれかの具体的に除外された制限に従うことを条件として、本発明内に包含される。記載された範囲が上下限値の一方又は両方を含む場合、それらのいずれか又は両方を含まない範囲も本発明に含まれる。
特定の範囲は、「約」という用語に続く数値により提示されている。「約」という用語は、本明細書では、その用語の後にくるその正確な数、ならびにその用語の後にくる数に近いかまたはその近似値である数に対する文言的根拠を提供するために使用される。ある数が具体的に記載された数に近い又は近似しているかを決定することにおいて、近い又は近似しているが具体的に記載されてはいない数とは、それが提示されている文脈において、具体的に記載された数と実質的に等価な数とすることができる。
別段の定義がされない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、ここでは、代表的な例示的方法および材料について説明する。
本明細書に引用されている全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、その刊行物が引用されているところに関連する方法および/または材料を開示および記述するために、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物の引用は本出願日前の開示についてのものであり、本発明がそのような刊行物に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される公表日は、独立して確認する必要がある実際の公表日とは異なる場合がある。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。さらに、クレームは任意選択要素を除外するように作成することができることに留意されたい。したがって、この陳述は、クレーム要素の記載に関連して「もっぱら」、「のみ」等の排他的用語の使用、又は「除く」限定の使用についての文言的根拠としての役割を果たすことを意図している。
本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載され図示された個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されまたは組み合わせられ得る別個の構成要素および特徴を有する。記載された方法は、記載された事象の順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
方法及び組成物は、文法的な流れのために機能的な説明を伴って記載されているか又は記載されるであろうが、クレームは、明示的に35 U.S.C.§112(f)に基づいて定式化されていない限り、「手段」又は「ステップ」限定の構成により必ずしも限定されるものと解釈されるべきではなく、均等論の法理下のクレームにより提供される定義の意味及び均等物の完全な範囲を付与されるべきであり、また、クレームが35 U.S.C.§112(f)に基づいて明示的に定式化されている場合は、35 U.S.C.§112(f)に基づく完全な法定均等物を付与されるべきであることが明確に理解されるべきである。
抗体
上記で要約されたように、本開示は、P糖タンパク質1（Pgp）またはABCB1としても知られる、細胞排出ポンプMDR1に結合する抗体を提供する。
MDR1は、P糖タンパク質1（Pgp）またはABCB1としても知られ、ATP結合カセットサブファミリーBメンバー1（ABCB1）遺伝子から発現される、多剤耐性細胞における薬物蓄積の低下に関与するエネルギー依存性排出ポンプである。抗MDR1抗体は、本明細書では、抗Pgp、抗ABCB1、または抗B1抗体とも呼ばれる。
いくつかの態様において、本明細書に開示される抗体は、MDR1の細胞外ドメイン上の1つ以上の部位を含むエピトープに結合する。ある態様において、本開示の抗MDR1抗体は、ヒトMDR1に結合する。ある態様において、本開示の抗MDR1抗体は、ヒト細胞の細胞表面上に発現されたヒトMDR1に結合する。ある態様において、本明細書に開示される抗体は、ヒトMDR1の細胞外ドメイン（ECD）上の1つ以上の部位を含むエピトープに結合し、ここでECDは、以下の配列：
MMLVFGEMTDIFANAGNLEDLMSNITNRSDINDTGFFMNLEEDMTRYAY（配列番号（SEQ ID NO）1）
を含み得、この配列は、アクセッション番号NP_000918を有するヒトMDR1配列のアミノ酸残基68～116に対応する。ある態様において、本明細書に開示される抗体は、ヒトMDR1の細胞外ドメイン (ECD) 上の1つ以上の部位を含むエピトープに結合し、ここでECDは、配列TRGWKL (配列番号2)を含み得、この配列は、アクセッション番号NP_000918を有するヒトMDR1配列のアミノ酸残基209～215に対応する。ある態様において、本明細書に開示される抗体は、ヒトMDR1の細胞外ドメイン (ECD) 上の1つ以上の部位を含むエピトープに結合し、ここでECDは、配列GTTLVLSGEYSIGQ (配列番号3)を含み得、この配列は、アクセッション番号NP_000918を有するヒトMDR1配列のアミノ酸残基317～330に対応する。特定の態様において、本明細書に開示される抗体は、ヒトMDR1の細胞外ドメイン (ECD) 上の1つ以上の部位を含むエピトープに結合し、ここでECDは、配列SKIIGVFTRIDDPETKRQNSNLFS (配列番号4)を含み得、この配列は、アクセッション番号NP_000918を有するヒトMDR1配列のアミノ酸残基733～756に対応する。特定の態様において、本明細書に開示される抗体は、ヒトMDR1の細胞外ドメイン (ECD) 上の1つ以上の部位を含むエピトープに結合し、ここでECDは、配列RFGAYLVAHKLMSFED (配列番号5)を含み得、この配列は、アクセッション番号NP_000918を有するヒトMDR1配列のアミノ酸残基958～973に対応する。
本開示の抗MDR1抗体は、以下の特性のうちの1つまたは複数を有し得る。
i) MDR1からの排出を抑制する；
ii) 化学療法剤による治療に対する癌細胞の感受性を増加させ、それによって化学療法剤のIC50を少なくとも5、10、50、または100倍低下させる；
iii) ヒトおよびカニクイザルのMDR1に結合する；
iv) CD47と交差反応しない；
v) in vitro細胞殺傷アッセイにおいて有効である；
vi) 化学療法の不在下でも腫瘍の増殖を抑制することにおいて有効である；
vii) 開いた立体配置で拘束されたMDR1変異体に優先的に結合する；
viii) 閉鎖立体配置で拘束されたMDR1変異体に優先的に結合する；および
ix) ヒトMDR1の細胞外ループ1の外の領域に優先的に結合するか、またはヒトMDR1の細胞外ループ1および細胞外ループ4に結合する。
特定の態様において、上記の1つ以上の特性i)～ix) を有することに加えて、本開示の抗体は、100 nM以下のEC50、例えば、100 nM～4 nM、80 nM～4 nM、60 nM～4 nM、40 nM～4 nM、30 nM～4 nM、20 nM～4 nM、15 nM～4 nM、または10 nM～4 nMを有することができる。特定の態様において、上記の1つ以上の特性i)～ix) を有することに加えて、本開示の抗体は、15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2などの抗MDR1抗体のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し得る。
試験抗体のEC50は、フローサイトメトリーまたはELISAによって測定され得る。例えば、フローサイトメトリーは、フローサイトメトリー緩衝液中で、MDR1（例えばヒト野生型MDR1または突然変異型MDR1）を発現する細胞を抗体と接触させること（ここで、抗体は段階的に希釈されり）、および、抗体が細胞に結合するのに十分な時間（例えば10分～1時間）に渡り室温または4℃でインキュベートすることを含み得る。インキュベーション後、任意で細胞を洗浄して非特異的に結合した抗体を除去してもよく、および/または、試験抗体に特異的に結合する蛍光標識二次抗体と細胞を接触させてもよい。インキュベーション後、蛍光標識二次抗体を除去して細胞を洗浄してもよい。洗浄された細胞は、フローサイトメトリーによって選別され得、蛍光標識二次抗体に結合された細胞の数が計数され得る。最大反応の半分（例えば、最大蛍光強度の半分）を提供する濃度がEC50として測定される。フローサイトメトリーアッセイのバリエーションにおいて、細胞は、MDR1を過剰発現する293T細胞であり得る。
試験抗体のIC50は、細胞増殖の阻害を測定することによって測定することができる。IC50は、試験抗体を単独で用いて、最大反応の半分を生じた抗体の濃度を決定することによって測定され得る。化学療法剤のIC50は、IC50化学療法剤に対する抗体の影響を決定するために試験抗体の不在下および存在下で測定され得る。化学療法剤はビンクリスチンであってもよい。細胞は、癌細胞株であり得る。癌細胞株は、ヒト急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞株NALM6のドキソルビシン選択B1陽性バリアントであるN6/ADRであり得る。N6/ADR細胞はNALM6/ADR細胞とも呼ばれる。細胞は、抗体のIC50を決定する場合には抗体単独と接触され得、ここで、抗体は連続希釈で試験される。細胞を抗体および化学療法剤と接触させて、該薬剤のIC50に対する該抗体の影響を決定することができ、ここで薬剤は連続希釈で試験される。細胞を37℃で一定時間インキュベートし（例えば24 hr～84 hr）、標準的な試薬および方法を用いて細胞生存率を評価し得る。本明細書に開示される抗体は、化学療法剤を用いた治療に対する癌細胞の感受性を増加させ、それにより、化学療法剤のIC50を少なくとも5倍低下させ得る。癌細胞はN6/ADRであり得る。化学療法剤はビンクリスチンであり得る。ある態様において、本開示の抗体は、N6/ADR癌細胞の増殖を阻害するためのビンクリスチンのIC50を、5倍（by factor of）以上、例えば6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、または10倍以上、例えば5倍～50倍以上、例えば少なくとも60、70、80、90、または100倍だけ低下させ得る。抗MDR1抗体B1-207、B1-223、KB1-225、KB1.116、KB1.80、KB1.261およびKB1.263は、N6/ADR癌細胞の増殖を阻害するためのビンクリスチンのIC50を少なくとも400倍低下させ、すなわち4118 pMから10.3 pMまたはそれ以下に低下させる。図4A～4Dおよび表7参照。
特定の態様において、抗MDR1抗体は、ヒトおよびカニクイザルMDR-1の両方に結合する。この特性は、動物モデルにおいて抗体の安全性を決定することにおいて利用することができる。
特定の態様において、本明細書に開示される抗MDR1抗体は、MDR1に特異的であり、他の抗原への有意な結合を示さない。例えば、本明細書に開示される抗体は、抗MDR1抗体15D3とは対照的に、腫瘍関連抗原CD47と交差反応しない。
特定の態様において、ここで開示される抗体の抗MDR1インビトロ細胞殺傷活性は、15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2について観察されるものより優れたものであり得る。例えば、ここで開示される抗体は、15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2の2倍以上のインビトロ細胞殺傷活性を有し得る。
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、開いた立体配置で拘束されたMDR1変異体に優先的に結合する。MDR1変異体は、置換E556QおよびE1201Qを含むヒトまたはカニクイザルMDR1であり得、ここで、アミノ酸位置の番号付けはヒトMDR1を基準とする。そのような抗体は、野生型MDR1または閉鎖立体配置で拘束されたMDR1変異体と比較して少なくとも2倍（例えば2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、またはそれ以上）の親和性で、開放立体配置で拘束されたMDR1変異体に結合し得る。
特定の態様において、本明細書中で提供される抗体は、閉鎖立体配置で拘束されたMDR1変異体に優先的に結合する。MDR1変異体は、以下の置換を含むヒトまたはカニクイザルMDR1であり得る: (i) K433M, S434A, K1076M, S1077A; (ii) K433M, S434A, Q475A, K1076M, S1077A, Q1118A; および／または (iii) K433M, S434A, Q475A, R588E, K1076M, S1077A, Q1118A, R1233E。ここで、アミノ酸位置の番号付けはヒトMDR1を基準とする。そのような抗体は、野生型MDR1または開放立体配置で拘束されたMDR1変異体と比較して少なくとも2倍（例えば3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、またはそれ以上）の親和性で、閉鎖立体配置で拘束されたMDR1変異体に結合し得る。
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、ECD中のループ1において欠失を含むMDR1変異体に優先的に結合する。欠失は、アミノ酸残基82～99または79～102の欠失を含み得、ここで、アミノ酸位置の番号付けはヒトMDR1を基準とする。そのような抗体は、野生型MDR1または開放もしくは閉鎖立体配置で拘束されたMDR1変異体と比較して少なくとも2倍（例えば3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、またはそれ以上）の親和性で、ループ1における欠失を含むMDR1変異体に結合し得る。
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒトMDR1の細胞外ループ1および細胞外ループ4を含むエピトープに結合する。このような抗体の例としては、表2に記載された抗MDR1抗体B1.228B、B1.198、B1.223、B1.219、B1.184、B1.207、B1.201、B1.129、B1.273、またはB1.236のHCDR 1～3を含むVH鎖およびLCDR 1～3を含むVL鎖を含む抗体が挙げられる。
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、単一特異性二価抗MDR1抗体である。ある態様において、本開示の単一特異性二価抗MDR1抗体は、抗MDR1抗体、15D3、MRK16、MM4、およびUIC2中に存在するHCDR 1～3およびLCDR 1～3のうちの少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、または12個すべてを含まない。
特定の態様において、本開示の抗体は、表2に記載された抗体の可変重鎖 (VH) 領域および可変軽鎖 (VL) 領域の対のそれぞれ重鎖相補性決定領域 (HCDR) および軽鎖CDR (LCDR) を含む抗体と、MDR1への結合について競合する。例えば、1つの態様において、本開示の抗MDR1抗体は、MDR1への結合について、表2に記載されたB1.201抗体と競合する。
ある態様において、抗体は、表2に記載された抗体のVH領域のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む。特定の態様において、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3は、Kabat命名法に従って定義される。例えば、1つの態様において、MDR1との結合について表2に記載されたB1.27抗体と競合する本開示の抗MDR1抗体は、B1.27抗体のVH領域のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む。
MDR1への結合について第1の抗体が第2の抗体と競合するかどうかを決定するための任意の適切なアプローチを使用することができる。化合物への結合について第1の抗体が第2の抗体と「競合する」かどうかは、当技術分野で知られる競合結合アッセイを用いて容易に決定することができる。競合抗体は、例えば、抗体競合アッセイを介して同定することができる。例えば、第1の抗体の試料を固体支持体に結合させ得る。次に、このような第1の抗体と競合できる可能性が疑われる第2の抗体の試料を添加する。2つの抗体のうちの1つは標識される。標識された抗体と標識されていない抗体が該化合物上の別々の部位に結合する場合、標識された抗体は、競合することが疑われた抗体が存在するか否かにかかわらず、同じレベルで結合する。しかし、もし相互作用部位が同一であるかまたは重複しているならば、非標識抗体は競合し、抗原に結合する標識抗体の量は減少する。標識されていない抗体が過剰に存在する場合は、標識された抗体は結合するとしてもごくわずかになる。
本開示の目的では、競合抗体とは、化合物に対する抗体の結合を約30%以上、約40%以上、約50%以上、約60%以上、約70%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、または約99%以上減少させるものである。このような競合アッセイを実施するための手順の詳細は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988, 567-569, 1988, ISBN 0-87969-314-2に見出すことができる。このようなアッセイは、精製された抗体を使用することにより定量的に行うことができる。1つの抗体をそれ自体に対して滴定することによって（すなわち、同じ抗体が標識および競合体の両方に使用される）標準曲線を確立することができる。標識抗体が標的エピトープに結合することを阻害する非標識競合抗体の能力を滴定することができる。結果をプロットし、所望の程度の結合阻害を達成するのに必要な濃度を比較することができる。
特定の態様において、多剤耐性タンパク質1 (MDR1) に結合する抗体分子は、(i) 表2に記載された抗体の可変重鎖 (VH) 領域および可変軽鎖 (VL) 領域のペアのHCDR 1～3および軽鎖CDR (LCDR 1～3)；(ii) 表2に記載された抗体のVH領域のHCDR 1～3；(iii) 表2に記載された抗体のVH領域のLCDR 1～3を含む。HCDRおよびLCDRはKabatの命名法に基づいて定義することができる。
「抗体分子」という用語は、本明細書に定義されるような抗体を包含し、その抗原結合断片を含む。ある態様において、抗体分子は、2つの可変軽(VL)鎖および2つの可変重(VH)鎖を含む。ある態様において、抗体分子は、重鎖および軽鎖の定常領域も含む。重鎖定常領域および軽鎖定常領域は、ヒト抗体、例えばヒトIgG1抗体に由来し得る。ヒトIgG1重鎖 (HC) 定常領域は、抗体依存性細胞傷害性 (ADCC) を低減させる突然変異を含むように改変され得る。それに加えて、またはそれに代えて、2つのVH鎖は、各々、異なるヒトIgG1 HC定常領域に結合されて、個々のヒトIgG1 HC定常領域が、異なるヒトIgG1 HC定常領域間で二量体を形成するのに有利となる置換を有するようにし得る。そのようなHC領域は、本明細書でさらに詳細に説明される。抗体分子が二重特異性抗体分子である特定の態様において、ヒトIgG1 HC定常領域の一方は、正に荷電した側鎖を有する1つ以上のアミノ酸を導入する置換を含み、他方のヒトIgG1 HC定常領域は、負に荷電した側鎖を有する1つ以上のアミノ酸を導入する置換を含み、この2つの異なるHC間の二量体の形成を促進させ得る。
特定の態様において、抗体分子は、表2に記載された抗体の一対のVH領域およびVL領域のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-27抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-28抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-30抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-39抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-85抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-99抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-178抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-179抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-184抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-188抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-193b抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-197抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-198抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-201抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-207抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。1つの態様において、抗体分子は、表2に記載されたB1-223抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。
特定の態様において、抗体は、表2に記載される抗体の対のVH領域およびVL領域のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含み、化学療法剤のIC50を5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、または10倍以上、例えば、5倍～50倍またはそれ以上、例えば、少なくとも60倍、70倍、80倍、90倍、または100倍低下させる。抗MDR1抗体B1-207、B1-223、KB1-225、KB1.116、KB1.80、KB1.261およびKB 1.263は、N6/ADR癌細胞の増殖を阻害するためのビンクリスチンのIC50を少なくとも400倍、すなわち4118 pMから10.3 pMへまたはそれ以下に低下させる。図4A～4Dおよび表7を参照。
EC50は、最大反応の50%（例えば応答は抗原への抗体の結合である）を生じる抗体濃度であり得る。一態様において、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-27抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-28抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-30抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-39抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-85抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-99抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-178抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-179抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-184抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-188抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-193b抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-197抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-198抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-201抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-207抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。一態様では、抗体は、100 nM以下のEC50、および／または、抗MDR1抗体（例えば15D3、MRK16、MM4、および／またはUIC2など）のEC50の少なくとも半分であるEC50を有し、表2に記載されたB1-223抗体のHCDR 1～3および／またはLCDR 1～3を含む。特定の態様において、本開示の抗体は、ヒトMDR1を発現する293T細胞株のFACSを用いて測定した場合、4～10 nMのEC50を有する。特定の態様において、ヒトMDR1を発現する293T細胞株のFACSを用いて測定される4～10 nMのEC50を有する本開示の抗体は、表2に記載されたB1-28抗体、B1-184抗体、B1-197抗体、B1-201抗体、B1-207抗体、B1-223抗体、B1-85抗体、またはB1-30抗体のHCDR 1～3およびLCDR 1～3を含む。例えば図3D参照。
ある態様において、本抗体は、MDR1を発現する細胞に結合すると、細胞MDR1タンパク質の機能を妨げ得る。従って、本開示の抗体は、MDR1タンパク質による排出を阻害することができ、これには、本抗体の非存在下でのMDR1による排出と比較して例えば排出が5%以上減少する場合が含まれ得（例えば10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上または90%以上を含む）。ある実施形態において、本抗体は、MDR1を発現する細胞に結合した場合、他の機序（例えば化学療法剤の取り込みを増強しおよび／または細胞の生存性を低下させ得るMDR1の漏れを起こすこと）によってMDR1の作用を妨げ得る。
ある態様において、本開示の抗体は、B1-28抗体のHCDR 1～3を含むVH鎖、およびB1-28抗体のLCDR 1～3を含むVL鎖を含む。
特定の実施形態において、本開示の抗体は、B1-261抗体のHCDR 1～3を含むVH鎖、およびB1-261抗体のLCDR 1～3を含むVL鎖を含む。
ある態様において、本開示の抗体は、ヒトABCB1およびカニクイザルABCB1の両方に結合する。このような抗体は、B1-28抗体のHCDR 1～3を含むVH鎖、およびB1-28抗体のLCDR 1～3を含むVL鎖、またはB1-261抗体のHCDR 1～3を含むVH鎖、およびB1-261抗体のLCDR 1～3を含むVL鎖を含み得る。特定の実施形態において、抗体は、B1-28抗体のVH鎖およびB1-28抗体のVL鎖、またはB1-261抗体のVH鎖およびB1-261抗体のVL鎖を含み得る。
特定の実施形態において、本開示の抗体は、B1-129抗体のHCDR 1～3を含むVH鎖、およびB1-129抗体のLCDR 1～3を含むVL鎖を含む。
特定の実施形態において、本開示の抗体は、ABCB1のECD中のループ1に結合する。特定の実施形態において、抗体は、B1-129抗体のHCDR 1～3を含むVH鎖、およびB1-129抗体のLCDR 1～3を含むVL鎖を含むことができる。特定の実施形態において、抗体は、B1-129抗体のVH鎖およびB1-129抗体のVL鎖を含み得る。
ある態様において、本開示の抗体は、B1-225抗体のHCDR 1～3を含むVH鎖、およびB1-225抗体のLCDR 1～3を含むVL鎖を含む。
特定の実施形態において、本開示の抗体は、B1-223抗体のHCDR 1～3を含むVH鎖、およびB1-223抗体のLCDR 1～3を含むVL鎖を含む。
ある態様において、ヒトMDR1に特異的に結合する本開示の抗体は、表2に記載された抗体のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3配列、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3配列を含む。ヒトMDR1に結合することに加えて、本明細書中で提供される抗体は、マウス、サル、チンパンジーなどの他の哺乳動物種由来のMDR1に結合し得る。
表２：左から右へ、第1列：抗MDR1抗体名、第2列：VH領域、第3列：HCDR1、第4列：HCDR2、第5列：HCDR3、第6列：VL領域、第7列：LCDR1、第8列：LCDR2、第9列：LCDR3。
表2に挙げた抗体は、マウスまたはラットのいずれかにおいて作製された。
表2に記載された抗MDR1抗体は、本明細書では、抗KPB1またはB1抗体とも呼ばれ、表2に記載された抗体番号によって参照され得、この番号は、抗体がKPB1あるいは「B1」に結合することを示すために、サフィックスB1（例えばB1-28またはB1.28またはKNJY-B1.28）をさらに含み得る。
ある実施形態において、抗体は、別個のポリペプチド中に存在するVL領域およびVH領域を含む；他の実施形態では、VL領域およびVH領域は、単一のポリペプチド内に含まれる。
本開示の抗体は、ヒト化軽鎖、ヒト化重鎖、またはその両方を含み得る。
本開示の抗体は、Igモノマー、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fdフラグメント、scFv、scAb、dAb、およびFvからなる群から選択され得る。
特定の態様において、本抗体は、表2に記載されるVH鎖のHCDRを含むVH鎖と、MRK16抗体、15D3抗体、またはUIC2抗体のLCDRを含むVL鎖とを含み得る。MRK16抗体、15D3抗体、およびUIC2抗体のVL鎖配列は以下の通りである。
MRK16 VL鎖:
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:283)
15D3 VL鎖:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (SEQ ID NO:284)
UIC2 VL鎖:
DVVMTQTPRSLPVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPPWTFGGGTKLDIK (SEQ ID NO:285)
特定の態様において、本抗体は、表2に記載されるVL鎖のLCDRを含むVL鎖と、MRK16抗体、15D3抗体、またはUIC2抗体のHCDRを含むVH鎖とを含み得る。MRK16抗体、15D3抗体、およびUIC2抗体のVH鎖配列は以下の通りである。
MRK16 VH鎖:
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:286)
15D3 VH鎖:
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:287)
UIC2 VH鎖:
AVQLQQSGPELVKTGASVKISCKASGYSFSNYYIHWVKQSHGKSLEWIGFISCYNGATFYNQKFKGKATFTVDTSSSTAYMKFNSLTFEDSAVYYCARLPIQFGNFYPMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:288)
ある種の抗体では、前述の抗体は単特異性二価抗体である。
特定の態様において、本開示の抗体は、2つの異なる標的タンパク質上に存在する少なくとも2つの異なるエピトープに結合することができる多特異性のものである。多特異性抗体によって結合される異なる標的タンパク質ひいては異なるエピトープの数は変動し得、2つ（すなわち二重特異性）、3つ（三重特異性）、4つまたはそれ以上であり得る。
ある態様において、本開示の抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに結合することができる多特異性であり、エピトープの1つはMDR1（例えばヒトMDR1）上にあり、もう1つのエピトープは腫瘍関連抗原（TAA）である。TAAは、癌細胞において過剰発現されることが知られている任意の抗原であり得る。例えば、TAAは、正常細胞においては検出可能なレベルで発現されずに癌細胞において発現される抗原であり得、ここで該正常細胞および癌細胞は同じ細胞型、例えば上皮細胞である。例えば、TAAは、新生抗原（neoantigens）であり得、これは、未変異タンパク質のアミノ酸配列と比較してコードタンパク質のアミノ酸配列を変化させる腫瘍特異的突然変異（複数可）から生じる腫瘍抗原のクラスである。他の態様において、TAAは、正常細胞においても発現されるが癌細胞ではより高いレベルで発現される抗原である。TAAは、哺乳動物癌細胞の細胞表面上に発現され得る。特定の態様において、TAAはCD47、Her2またはPDL1であり得る。
特定の態様において、多特異性抗体は、化学療法剤による治療に対する癌細胞の感受性を増加させ、それにより、抗MDR1単一特異性二価抗体と共投与された場合の該化学療法剤のIC50と比較して、該多特異性抗体と共投与された場合の該化学療法剤のIC50を少なくとも2倍低下させる。IC50は、本明細書に提供される方法によって測定することができる。化学療法剤はビンクリスチンであってもよい。癌細胞は、薬剤耐性癌細胞、N6/ADRであり得る。ある態様において、本開示の多特異性抗体は、化学療法剤のIC50を5倍以上、例えば6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、または10倍以上、例えば5～10倍だけ低下させ得る。
特定の態様において、多特異性抗体は、インビボ細胞殺傷活性を有し得、例えば、ビンクリスチンなどの化学療法剤の投与がなくても腫瘍体積の減少を有し得る。
特定の態様において、多特異性抗体は、多剤耐性タンパク質1 (MDR1) および腫瘍関連抗原 (TAA) に結合する二重特異性抗体分子であり得、該抗体分子は、2つの同一の可変軽(VL)鎖、第1の可変重(VH)鎖、および第2のVH鎖を含み、ここでVL鎖はそれぞれ、MDR1に対する抗原結合部位を含み、第1のVH鎖はMDR1に対する抗原結合部位を含み、第2のVH鎖はTAAに対する抗原結合部位を含み、第2のVH鎖は、軽鎖のうちの1つと対合した場合にTAAに結合する。
特定の態様において、2つのVL鎖の抗原結合部位は、表2に列挙された抗体の軽鎖CDR 1～3 (LCDR 1～3) を含む。特定の態様において、2つのVL鎖の抗原結合部位は、以下のアミノ酸配列：
LWVPGSTGDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:289)
を有するVL鎖を含む抗MDR1抗体V6の軽鎖CDR 1～3 (LCDR 1～3) を含む。ある態様において、LCDR1は、アミノ酸配列RSSQSLVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:290)を含む；LCDR2は、アミノ酸配列KVSNRFS (SEQ ID NO:12)を含む；LCDR3はアミノ酸FQGSHFPRT (SEQ ID NO:42)を含む。
特定の態様において、第1のVH鎖の抗原結合部位は、表2に列挙された抗体の重鎖CDR 1～3 (HCDR 1～3) を含む。
特定の態様において、第1のVH鎖は、表2に列挙された抗体以外の抗MDR1抗体のHCDR 1～3を含み、任意で第1のVH鎖は、表2に列挙された抗体以外の抗MDR1抗体のVH鎖のアミノ酸配列を含む。
ある態様において、抗MDR1抗体は、以下のアミノ酸配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:291)
（ここでX2はN、QまたはSである）；
AVQLQQSGPELVKTGASVKISCKASGYSFSNYYIHWVKQSHGKSLEWIGFISCYNGATFYNQKFKGKATFTVDTSSSTAYMKFNSLTFEDSAVYYCARLPIQFGNFYPMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:288)；または
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:286)
を有するVH鎖を含む。
ある態様において、抗MDR1抗体は、以下のアミノ酸配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:292)
を有するVH鎖を含み、ここでX2はN、QまたはSであり、任意でX2はQまたはSである。
VL鎖（複数可）は、表2に記載されたB1-28抗体のLCDR 1～3を含むことができ、任意でVL鎖は、表2に記載されたB1-28抗体のVL鎖のアミノ酸配列を含む。
特定の態様において、VL鎖は、表2に列挙された抗体以外の抗MDR1抗体のLCDR 1～3を含み得、任意で、可変軽鎖は、表2に列挙された抗体以外の抗体のVL鎖のアミノ酸配列を含む。
特定の態様において、抗MDR1抗体は、以下の軽鎖アミノ酸配列を含む：DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:283);
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (SEQ ID NO:284); または
DVVMTQTPRSLPVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPPWTFGGGTKLDIK (SEQ ID NO:285)。
ある態様において、二重特異性抗体は、MDR1およびTAAに結合し、化学療法剤のIC50を5倍（by factor of）以上低下させ、共通の軽鎖、表2に記載されたVH鎖からのHCDRを含むVH鎖、および抗TAA抗体からのHCDRを含むVH鎖を含む。共通軽鎖は、表2に列挙されたVL鎖（例えば、VH HCDRが由来するところの表2中の抗体のVL）からのLCDR、またはMRK16、15D3、もしくはUIC2などの別の抗MDR1抗体からのLCDRを含み得る。
ある態様において、二重特異性抗体は、化学療法剤による治療に対する癌細胞の感受性を増加させることができ、ここで、抗体と共投与された場合の化学療法剤の半最大阻害濃度 (IC50) は、
以下の配列を有するVH鎖：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:293)；
および以下の配列を有するVL鎖：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK (SEQ ID NO:284)
を含む抗MDR1抗体と共投与された場合の該化学療法剤のIC50より少なくとも5倍低い（例えば、6倍低い、10倍低い、15倍低い、または20倍低い）。
特定の態様において、第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:294)
を含む抗CD47抗体、5F9のVH鎖のHCDR 1～3を含む。
特定の態様において、第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYGMSWVRQTPDKRLEWVATITSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQIDSLKSEDTAIYFCARSLAGNAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:295)
を含む抗CD47抗体、B6H12のVH鎖のHCDR 1～3を含む。
B6H12抗体は、ヒトCD47に結合するマウス抗体であり、以下のアミノ酸配列：
DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQTISDYLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHGFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:296)
を含むVL領域を含む。
B6H12抗体のヒト化バージョンは、以下に示されるようなVH領域およびVL領域を有する：
B6H12ヒト化VH配列:
HCDR 1～3は下線と太字で示されている。
B6H12ヒト化VL配列:
LCDR 1～3は下線と太字で示されている。
ある態様において、二重特異性抗体は、MDR1およびTAAに結合し、化学療法剤のIC50を5倍以上低下させ、表2に列挙されたVL鎖からのLCDRを含む共通の軽鎖、別の抗MDR1抗体（例えばMRK16、15D3、またはUIC2など）からのHCDRまたは表2に列挙されたVH鎖（例えば、VL LCDRが由来するところの表2の抗体のVH）からのHCDRを含むVH鎖、および抗TAA抗体からのHCDRを含むVH鎖を含む。抗TAA抗体は、抗CD47抗体であり得、例えば、マウス抗体5F9もしくはマウス抗体B6H13またはそのヒト化バージョンであり得る。例えば、二重特異性抗体は、以下のものを含む：
抗CD47抗体、5F9のVH領域のHCDR 1～3であって、VH領域が以下のアミノ酸配列を含むもの：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:294)；または
抗CD47抗体、B6H12のVH領域のHCDR 1～3であって、VH領域が以下のアミノ酸配列を含むもの：
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYGMSWVRQTPDKRLEWVATITSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQIDSLKSEDTAIYFCARSLAGNAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:295)。
特定の実施形態において、B6H12抗体のVH領域は、配列GYGMS (配列番号379)を含むHCDR1；配列TITSGGTYTYYPDSVKG (配列番号299) を含むHCDR2；および配列SLAGNAMDY (配列番号300) を含むHCDR3。
特定の実施形態では、二重特異性抗体は、抗CD47マウス抗体B6H12またはそのヒト化バージョンのVH領域を含み、ここで、B6H12抗体のVH領域は、以下のアミノ酸配列を含む:
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYGMSWVRQTPDKRLEWVATITSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQIDSLKSEDTAIYFCARSLAGNAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:295)。
特定の実施形態では、二重特異性抗体は、抗CD47マウス抗体B6H12のヒト化バージョンのVH領域を含み、ここでVH領域は、以下のアミノ酸配列を含む:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGMSWVRQAPGKGLEWVATITSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSLAGNAMDYWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:297)。
ある態様において、二重特異性抗体は、以下のVH領域：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:293)
を有する抗MDR1抗体からのVH領域のHCDRを含むMDR1結合ドメイン、および
TAA結合ドメインであって、任意で以下のVH領域：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:294)
を有する抗CD47抗体からのVH領域のHCDRを含むCD47結合ドメインを含む、TAA結合ドメイン、ならびに
表2に記載のVL鎖からのLCDRを含む共通軽鎖（例えば、抗体B1-28、B1-178、B1-28、B1-184、B1-188、B1-193B、B1-197、B1-198、B1-201、B1-207、B1-223、B1-85、B1-99、B1-27、B1-39、またはB1-30のVL鎖からのLCDRを含むもの）を含む。
特定の態様において、二重特異性抗体は、以下のHCDR配列すなわちHCDR1: RYTMS (SEQ ID NO:301)、HCDR2: TISSGGGNTYYPDSVKG (SEQ ID NO:302)、TISSGGGQTYYPDSVKG (SEQ ID NO:303)、またはTISSGGGSTYYPDSVKG (SEQ ID NO:304)、およびHCDR3: YGAGDAWFAY (SEQ ID NO:305) を有する抗MDR1抗体由来のVH領域のHCDR 1～3と、以下のHCDR配列すなわちHCDR1: NYNMH (SEQ ID NO:306)、HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD (SEQ ID NO:307)、およびHCDR3: GGYRAMDY (SEQ ID NO:308) を有する抗CD47抗体由来のVH領域のHCDRと、抗MDR1抗体B1-28のVL領域のLCDRを含む共通軽鎖とを含み得る。特定の態様において、LCDR配列は、LCDR1: RSSQNIVHSTGNTYLD (SEQ ID NO:11)、LCDR2: KVSNRFS (SEQ ID NO:12)、およびLCDR3: FQGSHIPRT (SEQ ID NO:13)である。
特に明記しない限り、CDRはKabat命名法に従って定義される。
特定の態様において、二重特異性抗体分子の第1のVH鎖は、
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:291)
を含みここでX2はN、QまたはSであるアミノ酸配列を含み、第2のVH鎖は、
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:294)
を含むアミノ酸配列を含み、および／または、2つのVL鎖は、表2に記載されたB1-28抗体のVL鎖を含むアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、二重特異性抗体は、B1.188のVH鎖からのHCDR 1～3を含むVH鎖、抗MDR1抗体MRK16のVL鎖からのLCDR 1～3を含む共通のVL鎖、および抗CD47抗体5F9のVH鎖からのHCDR 1～3を含むVH鎖を含む。B1.188のVH鎖からのHCDR 1～3、MRK16のVL鎖からのLCDR 1～3、および5F9のVH鎖からのHCDR 1～3を表5に記載する。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、B1.188のVH鎖、共通軽鎖としてMRK16のVL鎖、および5F9のVH鎖を含む。
特定の実施形態では、二重特異性抗体は、B1.261のVH鎖からのHCDR 1～3を含むVH鎖、抗MDR1抗体、MRK16のVL鎖からのLCDR 1～3を含む共通のVL鎖、および抗CD47抗体、5F9のVH鎖からのHCDR 1～3を含むVH鎖を含む。B1.261のVH鎖からのHCDR 1～3、MRK16のVL鎖からのLCDR 1～3、および5F9のVH鎖からのHCDR 1～3を表5に記載する。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、B1.261のVH鎖、共通軽鎖としてMRK16のVL鎖、および5F9のVH鎖を含む。
特定の実施形態において、二重特異性抗体は、B1.129のVH鎖からのHCDR 1～3を含むVH鎖、抗MDR1抗体、MRK16のVL鎖からのLCDR 1～3を含む共通のVL鎖、および抗CD47抗体、5F9のVH鎖からのHCDR 1～3を含むVH鎖を含む。B1.129のVH鎖からのHCDR 1～3、MRK16のVL鎖からのLCDR 1～3、および5F9のVH鎖からのHCDR 1～3を表5に記載する。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、B1.129のVH鎖、共通軽鎖としてMRK16のVL鎖、および5F9のVH鎖を含む。
特定の実施形態では、二重特異性抗体は、B1.225のVH鎖からのHCDR 1～3を含むVH鎖、抗MDR1抗体、MRK16のVL鎖からのLCDR 1～3を含む共通のVL鎖、および抗CD47抗体、5F9のVH鎖からのHCDR 1～3を含むVH鎖を含む。B1.225のVH鎖からのHCDR 1～3、MRK16のVL鎖からのLCDR 1～3、および5F9のVH鎖からのHCDR 1～3を表5に記載する。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、B1.225のVH鎖、共通軽鎖としてMRK16のVL鎖、および5F9のVH鎖を含む。
特定の実施形態では、二重特異性抗体は、B1.223のVH鎖からのHCDR 1～3を含むVH鎖、抗MDR1抗体、MRK16のVL鎖からのLCDR 1～3を含む共通のVL鎖、および抗CD47抗体、5F9のVH鎖からのHCDR 1～3を含むVH鎖を含む。B1.223のVH鎖からのHCDR 1～3、MRK16のVL鎖からのLCDR 1～3、および5F9のVH鎖からのHCDR 1～3を表5に記載する。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、B1.223のVH鎖、共通軽鎖としてMRK16のVL鎖、および5F9のVH鎖を含む。
特定の実施形態において、二重特異性抗体は、B1.28のVH鎖からのHCDRs 1～3を含むVH鎖、B1.28のVL鎖からのLCDRs 1～3を含む共通のVL鎖、および抗CD47抗体、5F9のVH鎖からのHCDRs 1～3を含むVH鎖を含む。B1.28のVH鎖からのHCDR 1～3、B1.28のVL鎖からのLCDR 1～3、および5F9のVH鎖からのHCDR 1～3を表5に記載する。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、B1.28のVH鎖、共通軽鎖としてB1.28のVL鎖、および5F9のVH鎖を含む。特定の実施形態では、B1.28のVH鎖、B1.28のVL鎖、および5F9のVH鎖は、ヒト化されて、表5に記載の配列を有し得る。
特定の例において、本開示の第1の抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体は、以下の配列を含む:
15D3抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第1のVH鎖；
5F9抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第2のVH鎖；および
B1.27抗体、B1.VL6.CDR3 mod抗体、B1.225v1抗体、またはB1.89v抗体のVL鎖のLCDR 1～3を含む共通のVL鎖。B1.VL6.CDR3 mod抗体、B1.225v1抗体、およびB1.89v抗体のLCDR 1～3およびVL鎖の配列を表5に記載する。
特定の例において、本開示の第2の抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体は、以下の配列を含む:
B1.188抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第1のVH鎖；
5F9抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第2のVH鎖；および
MRK16抗体のVL鎖のLCDR 1～3を含む共通のVL鎖。
特定の例において、本開示の第3の抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体は、以下の配列を含む:
B1.225抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第1のVH鎖；
5F9抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第2のVH鎖；および
MRK16抗体のVL鎖のLCDR 1～3を含む共通のVL鎖。
特定の例において、本開示の第4の抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体は、以下の配列を含む:
B1.28抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第1のVH鎖；
5F9抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第2のVH鎖；および
B1.28抗体のVL鎖のLCDR 1～3を含む共通のVL鎖。
特定の例では、第1のVH鎖は、B1.28のヒト化VH鎖のアミノ酸配列を含み得る。
特定の例において、本開示の第5の抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体は、以下の配列を含む:
B1.261抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第1のVH鎖；
5F9抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第2のVH鎖；および
MRK16抗体のVL鎖のLCDR 1～3を含む共通のVL鎖。
特定の例において、第1のVH鎖は、B1.261抗体のヒト化VH鎖であり得る。特定の例において、ヒト化バージョンは、B1.261 VH4抗体のVHのアミノ酸配列を含むことができる。特定の例では、共通のVL鎖はMRK16抗体のヒト化VL鎖であり得る。
特定の例において、本開示の第6の抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体は、以下の配列を含む:
B1.261抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第1のVH鎖；
5F9抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第2のVH鎖；および
B1.261抗体のVL鎖のLCDR 1～3を含む共通のVL鎖。
特定の例において、第1のVH鎖は、B1.261抗体のヒト化VH鎖であり得る。特定の例において、ヒト化バージョンは、B1.261 VH4抗体のVHのアミノ酸配列を含むことができる。特定の例において、共通のVL鎖は、B1.261抗体のヒト化VL鎖であり得る。特定の例において、ヒト化バージョンは、B1.261 VH4抗体のVLのアミノ酸配列を含み得る。
以下の二重特異性抗体は、細胞表面上のヒトおよびカニクイザルCD47ならびにヒトABCB1への結合のために特に有用であり得る：15D3DD KT14KK B1.28.huL2 LC; 15D3DD KT14KK B1VL6/CDR3v2 LC; 15D3DD KT14KK MRK16v5 LC; および15D3DD KT14KK B1.89v1 LC（図17A-17B参照）。これらの抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は以下の通りである。
15D3DD重鎖：
KT14KK重鎖：
上記の重鎖配列においてVH領域は太字で示されている。HCDRはイタリック体で下線が引かれている。本発明に包含される二重特異性抗体は、これらの重鎖、またはこれらの重鎖に存在するHCDRのみもしくはVH鎖のみを含み得る。
B1.28.huL2共通軽鎖：
B1VL6/CDR3v2共通軽鎖：
MRK16v5 LC共通軽鎖：
B1.89v1共通軽鎖：
LCDRは太字で示している。本発明に包含される二重特異性抗体は、これらの共通軽鎖の1つを、上記の15D3DD重鎖およびKT14重鎖またはそのHCDRもしくはVH鎖と組み合わせて含むことができる。
特定の例では、TAAはHer2またはPD-L1である。
［抗MDR1および抗PD-L1二重特異性抗体］
特定の態様において、TAAは、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）であり得る。PD-L1は、cluster of differentiation 274（CD 274）またはB7ホモログ1（B7-H1）としても知られている。ある態様において、MDR1およびPD-L1に結合する二重特異性抗体分子は、前のセクションに記載されたように、共通の軽鎖および第1のVH鎖を含み、第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS（配列番号314）
を含むVH鎖のHCDR 1～3を含む。
Kabatの命名法に従って定義されるHCDR 1～3は以下のとおりである。
HCDR1: DSWIH（配列番号315）
HCDR2: WISPYGGSTYYADSVKG（配列番号316）
HCDR3: RHWPGGFDY（配列番号317）
MDR1およびPD-L1に結合する二重特異性抗体の第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS（配列番号314）
に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%の同一性のアミノ酸配列を有し得る。
MDR1およびPD-L1に結合する二重特異性抗体の第2のVH鎖は、以下のアミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号318）
に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%の同一性であるアミノ酸配列を有する重鎖中に存在し得る。
特定の例において、本開示の抗MDR1および抗PDL1二重特異性抗体は、以下の配列を含む：
B1.261抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第1のVH鎖；
アテゾリズマブ抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第2のVH鎖；および
B1.261抗体またはMRK16抗体のVL鎖のLCDR 1～3を含む共通のVL鎖。
特定の例において、抗MDR1および抗PD-L1二重特異性抗体の第1のVH鎖はヒト化され、以下のアミノ酸配列を含む：
B1.261.huH1(VH4):
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSALKSRLTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARHGRWLLQRGGAMDYWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:126)
B1.261.huH2(VH3):
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSALKSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGRWLLQRGGAMDYWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:129)
特定の例では、抗MDR1および抗PDL1二重特異性抗体の共通VL鎖はヒト化され、以下のアミノ酸配列含む：
［抗MDR1および抗HER2二重特異性抗体］
特定の態様において、TAAはHER2であり得る。Erb-B2受容体チロシンキナーゼ2あるいはHER2は、受容体チロシンキナーゼの上皮成長因子 (EGF) 受容体ファミリーのメンバーである。HER2タンパク質はそれ自体はリガンド結合ドメインを持たないため、増殖因子に結合できない。しかしながら、それは他のリガンド結合EGF受容体ファミリーメンバーに強く結合してヘテロ二量体を形成し、リガンド結合を安定化させ、下流シグナル伝達経路のキナーゼ媒介活性化を増強する。HER2をコードする遺伝子の増幅および／または過剰発現が、乳癌および卵巣癌を含む多数の癌において報告されている。
特定の態様において、MDR1およびHER2に結合する二重特異性抗体分子は、先行のセクションで記述した共通軽鎖および第1のVH鎖を含み、第2のVH鎖は、トラスツズマブまたはペルツズマブなどの抗Her2抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む。
トラスツズマブ重鎖配列:
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (SEQ ID NO:320)
VH領域には下線が引かれている。
Kabatの命名法に従って定義されるHCDR 1～3は以下の通りである。
HCDR1: GFNIKDT (SEQ ID NO:321)
HCDR2: YPTNGY (SEQ ID NO:322)
HCDR3: WGGDGFYAMDY (SEQ ID NO:323)
MDR1およびHER2に結合する二重特異性抗体の第2のVH鎖は、トラスツズマブのVH鎖またはトラスツズマブの重鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%の同一性であるアミノ酸配列を有し得る。
ペルツズマブ重鎖の配列:
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftftdytmdwvrqapgkglewvadvnpnsggsiynqrfkgrftlsvdrskntlylqmnslraedtavyycarnlgpsfyfdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg (SEQ ID NO:324)
VH領域には下線が引かれている。
Kabatの命名法に従って定義されるHCDR 1～3は以下の通りである。
HCDR1: GFTFTDY (SEQ ID NO:325)
HCDR2: NPNSGG (SEQ ID NO:326)
HCDR3: NLGPSFYFDY (SEQ ID NO:327)
MDR1およびHER2に結合する二重特異性抗体の第2のVH鎖は、ペルツズマブのVH鎖またはペルツズマブの重鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
特定の例において、本開示の第1の抗MDR1および抗HER2二重特異性抗体は、以下の配列を含む：
B1.129抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第1のVH鎖；
ペルツズマブあるいはペルツズマブ抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第2のVH鎖；および
B1.129抗体のVL鎖のLCDR 1～3を含む共通のVL鎖。
特定の例において、本開示の第2の抗MDR1および抗HER2二重特異性抗体は、以下の配列を含む：
B1.188抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第1のVH鎖；
ペルツズマブあるいはペルツズマブ抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第2のVH鎖；および
B1.188抗体またはMRK16抗体のVL鎖のLCDR 1～3を含む共通のVL鎖。
特定の例において、本開示の第3の抗MDR1および抗HER2二重特異性抗体は、以下の配列を含む：
B1.261抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第1のVH鎖；
ペルツズマブあるいはペルツズマブ抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む第2のVH鎖；および
B1.261抗体またはMRK16抗体のVL鎖のLCDR 1～3を含む共通のVL鎖。
特定の例において、抗MDR1および抗PDL1二重特異性抗体の第1のVH鎖はヒト化され、以下のアミノ酸配列を含む：
B1.261.huH1(VH4):
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSALKSRLTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCARHGRWLLQRGGAMDYWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:126)
B1.261.huH2(VH3):
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSALKSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGRWLLQRGGAMDYWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:129)
特定の例において、抗MDR1および抗PDL1二重特異性抗体の共通VL鎖はヒト化され、以下のアミノ酸配列を含む：
本明細書の別の箇所に記載されているように、VL鎖、第1のVH鎖、および第2のVHのうちの少なくとも1つ、2つ、またはすべてをヒト化することができる。さらに、VH鎖のFc領域は、第1および第2のVH鎖の間のヘテロ二量体化を増大させる置換を含んでもよい。ある態様において、第1の重鎖がヒト化されて荷電対置換K392DおよびK409Dを含み得、そして第2の重鎖が荷電対置換E356KおよびD399Kを含み得る。
特定の実施形態では、VH鎖およびVL鎖のうちの1つ以上は、例えば少なくとも1つ、2つ、3つまたは4つのフレームワーク領域をヒト抗体由来のフレームワーク領域で置き換えることによって、ヒト化され得る。
特定の態様において、二重特異性抗体は、MDR1と腫瘍関連抗原との両方を発現する癌細胞に特異的に結合する。特定の態様において、二重特異性抗体は、MDR1または腫瘍関連抗原のどちらかを発現する細胞へのその結合と比較して、MDR1と腫瘍関連抗原との両方を発現するがん細胞に優先的に結合する。
特定の態様において、二重特異性抗体は、MDR1および腫瘍関連抗原の両方を発現する癌細胞には結合するが、MDR1または関連する腫瘍関連抗原の発現が低いかまたは検出不可能な正常細胞には結合しない（または有意に低い親和性で結合する）。言い換えると、本開示の二重特異性抗体は、MDR1およびTAAの両方を発現しない細胞に結合しない。
ある実施形態において、本開示の多特異性抗体は、共通の軽鎖を含み得る。本明細書で使用される場合、「共通の軽鎖」という用語は、一般的に、多特異性抗体における同じ軽鎖の2つのコピーの使用および組み込みを指す。別の言い方をすれば、構築された多特異性抗体において軽鎖は、MDR1特異的重鎖と会合し、その同じ軽鎖の第2のコピーが、腫瘍関連抗原特異的重鎖と会合する。ある態様では、共通軽鎖は、表2に記載されたVL鎖のLCDRを含むことができる。VH鎖は、表2に記載されたVH鎖のHCDRを含み得る。
本開示によって包含される二重特異性抗体は、MDR-1およびCD47に結合しかつ15D3抗体のVH鎖からのHCDR、5F9抗体のVH鎖からのHCDR、およびMRK16抗体のVL鎖からのLCDRを含む二重特異性抗体は含まない。具体的には、本開示の二重特異性抗体は、以下の組合せを含まない。
以下のVH配列：
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:293)
に存在するHCDRを有するVH鎖；
以下のVH配列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:294)
に存在するHCDRを有するVH鎖；および
以下のVL配列：
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:283)
に存在するLCDRを有する共通の可変軽鎖。
具体的には、本開示の二重特異性抗体は、以下の組合せを含まない。
以下のHCDR配列：HCDR1: RYTMS (SEQ ID NO:301)、HCDR2: TISSGGGNTYYPDSVKG (SEQ ID NO:302)、およびHCDR3: YGAGDAWFAY (SEQ ID NO:305)を有する抗MDR1抗体由来のVH領域のHCDR；
以下のHCDR配列：HCDR1: NYNMH (SEQ ID NO:306)、HCDR2: TIYPGNDDTSYNQKFKD (SEQ ID NO:307)、およびHCDR3: GGYRAMDY (SEQ ID NO:308)を有する抗CD47抗体由来のVH領域のHCDR；および
以下のLCDR配列：LCDR1: RSSQSIVHSTGNTYLE (SEQ ID NO:25)、LCDR2: KISNRFS (SEQ ID NO:328)、およびLCDR3: FQASHFPRT (SEQ ID NO:329)を有する抗MDR1抗体のLCDRを有する共通の軽鎖。
細胞表面上のMDR1およびCD47に結合する特定の二重特異性抗体は、共通軽鎖として抗MDR1抗体、V6のVL鎖のLCDR 1～3を含み得、抗MDR1抗体B1.28、B1.30、B1.89、B1.129、B1.225、B1.261、15D3、またはMRK16のVH鎖のHCDR 1～3、および5F9抗体またはB6H12抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含み得る。細胞表面上のMDR1およびCD47に結合する特定の二重特異性抗体は、共通軽鎖またはそのヒト化バージョンとして抗MDR1抗体、V6のVL鎖またはそのヒト化バージョンを含み得、抗MDR1抗体B1.28、B1.30、B1.89、B1.129、B1.225、B1.261、15D3、またはMRK16のVH鎖またはそのヒト化バージョンおよび5F9抗体のVH鎖またはB6H12抗体のVH鎖またはB6H12抗体もしくは5F9抗体のヒト化バージョンのVH鎖を含み得る。
ある実施形態において、対象抗体は、組換えまたは改変された抗体、例えば、キメラ、ヒト化、脱免疫（deimmunized）またはインビトロ生成抗体である。本明細書で使用される用語「組換え」または「改変」抗体は、組換え手段によって調製され、発現され、作製され、または単離された全ての抗体を含むことが意図され、例えば (i) 宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体；(ii) 組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体；(iii) ヒトの免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックとなった動物（例えばマウス）から単離された抗体；又は (iv) ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列に繋ぎ合わせることを含む他の手段により調製、発現、作製又は単離された抗体を含む。そのような組換え抗体には、ヒト化抗体、CDRグラフト化抗体、キメラ抗体、脱免疫抗体、およびインビトロ生成抗体が含まれ、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の定常領域を任意で含み得る。
改変された抗体は、改変されたドメインを含み得、いずれかの抗体ドメインが天然に存在する形態から改変され得る場合を含む。ある実施形態において、改変された抗体は、改変されたCH2および/または改変されたCH3ドメインを含み、改変されたFcドメインを含み、改変された重鎖を含み得る。いくつかの例では、改変されたFcドメインは、静電ステアリング効果を利用し得、これは、例えばGunasekeran et al, (2010) Journal of Biological Chemistry 285, 19637-19646（その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている手順の使用を通じたものを含むがこれに限定されない。いくつかの例において、二重特異性抗体は、CH3ドメインにおける電荷対置換を介してアセンブルされ、これには例えば、1つの重鎖がK392DおよびK409D置換を含むように改変され、他方の重鎖がE356KおよびD399K置換を含むように改変されたものを含むが、これに限定されない。電荷対置換鎖は優先的に、互いにヘテロ二量体を形成する。アミノ酸置換の番号付けはIg HCについてのEU番号付けシステムによる。
いくつかの例では、本開示の抗体は、電荷対置換を含む。いくつかの例では、本開示の抗体は、電荷対置換を含まない。いくつかの例では、所望の鎖の優先的ヘテロダイマー形成を促進する代替手段が使用され得る。
ある場合には、改変された重鎖は、ノブ-イントゥ-ホール（knob-into-hole）改変を含み得る。「ノブ-イントゥ-ホール」アミノ酸改変は、抗体工学における合理的設計戦略であり、重鎖のヘテロ二量体化、多特異性抗体（二重特異性IgG抗体を含む）の産生に使用される。例えば、異なる特異性を有する2つのモノクローナル抗体から作製される二重特異性抗体にノブ-イントゥ-ホール戦略を組み込む際に、モノクローナル抗体1（mAb1）の重鎖のCH3上に「ノブ」を形成し、モノクローナル抗体2（mAb2）の重鎖のCH3上に「ホール」を形成するために、アミノ酸変化を操作する。ノブは、例えばチロシン (Y) のような大きなアミノ酸で表され得、ホールは、スレオニン (T) のような小さなアミノ酸で表され得る。例えば、ノブ-イントゥ-ホール対改変は、第1のCH3ドメインにおけるT22Y置換およびパートナーCH3ドメインにおけるY86T置換により生成することができる。ノブ-イントゥ-ホール改変の例はCarter, J. Immunol. Methods, 248(1-2):7-15 (2001); Ridgway, J. B. et al. Protein Eng. 9(7):617-2 (1996); and Merchant, A. M. et al. Nat. Biotechnol. 16(7):677-81 (1998) に記載されており、これらの開示はその全体が本明細書に組み込まれる。対になったノブ-イントゥ-ホール改変ドメインから生成された抗体では、二重特異性ヘテロ二量体が概して主要な画分を表すことになる。
上述したように、本発明の抗MDR1抗体は、MDR1の1以上のエピトープに特異的に結合する。したがって、エピトープはMDR1エピトープである。抗MDR1抗体によって結合されるMDR1エピトープのサイズは変動し得、MDR1エピトープが、例えば4 aa、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10 aa、11 aa、12 aa、4 aa～10 aa、5 aa～10 aa、6 aa～10 aa、4 aa～8 aa、5 aa～8 aa、6 aa～8 aaなどを含むがこれらに限定されない、3 aa以下から12 aa以上までの範囲であり得るMDR1配列の連続したストレッチを有するポリペプチドによって形成される場合を含む。
いくつかの実施形態において、MDR1エピトープは、例えば以下のものを含むがこれに限定されないMDR1配列の隣接するストレッチに対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドによって形成され得る：
ヒトMDR1配列
MDLEGDRNGGAKKKNFFKLNNKSEKDKKEKKPTVSVFSMFRYSNWLDKLYMVVGTLAAIIHGAGLPLMMLVFGEMTDIFANAGNLEDLMSNITNRSDINDTGFFMNLEEDMTRYAYYYSGIGAGVLVAAYIQVSFWCLAAGRQIHKIRKQFFHAIMRQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINEGIGDKIGMFFQSMATFFTGFIVGFTRGWKLTLVILAISPVLGLSAAVWAKILSSFTDKELLAYAKAGAVAEEVLAAIRTVIAFGGQKKELERYNKNLEEAKRIGIKKAITANISIGAAFLLIYASYALAFWYGTTLVLSGEYSIGQVLTVFFSVLIGAFSVGQASPSIEAFANARGAAYEIFKIIDNKPSIDSYSKSGHKPDNIKGNLEFRNVHFSYPSRKEVKILKGLNLKVQSGQTVALVGNSGCGKSTTVQLMQRLYDPTEGMVSVDGQDIRTINVRFLREIIGVVSQEPVLFATTIAENIRYGRENVTMDEIEKAVKEANAYDFIMKLPHKFDTLVGERGAQLSGGQKQRIAIARALVRNPKILLLDEATSALDTESEAVVQVALDKARKGRTTIVIAHRLSTVRNADVIAGFDDGVIVEKGNHDELMKEKGIYFKLVTMQTAGNEVELENAADESKSEIDALEMSSNDSRSSLIRKRSTRRSVRGSQAQDRKLSTKEALDESIPPVSFWRIMKLNLTEWPYFVVGVFCAIINGGLQPAFAIIFSKIIGVFTRIDDPETKRQNSNLFSLLFLALGIISFITFFLQGFTFGKAGEILTKRLRYMVFRSMLRQDVSWFDDPKNTTGALTTRLANDAAQVKGAIGSRLAVITQNIANLGTGIIISFIYGWQLTLLLLAIVPIIAIAGVVEMKMLSGQALKDKKELEGSGKIATEAIENFRTVVSLTQEQKFEHMYAQSLQVPYRNSLRKAHIFGITFSFTQAMMYFSYAGCFRFGAYLVAHKLMSFEDVLLVFSAVVFGAMAVGQVSSFAPDYAKAKISAAHIIMIIEKTPLIDSYSTEGLMPNTLEGNVTFGEVVFNYPTRPDIPVLQGLSLEVKKGQTLALVGSSGCGKSTVVQLLERFYDPLAGKVLLDGKEIKRLNVQWLRAHLGIVSQEPILFDCSIAENIAYGDNSRVVSQEEIVRAAKEANIHAFIESLPNKYSTKVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQPHILLLDEATSALDTESEKVVQEALDKAREGRTCIVIAHRLSTIQNADLIVVFQNGRVKEHGTHQQLLAQKGIYFSMVSVQAGTKRQ（配列番号330）；
またはげっ歯類のMDR1配列、例えば以下のマウスMDR1配列またはマウスMDR1b配列：
マウスMDR1a配列：
MELEEDLKGRADKNFSKMGKKSKKEKKEKKPAVSVLTMFRYAGWLDRLYMLVGTLAAIIHGVALPLMMLIFGDMTDSFASVGNVSKNSTNMSEADKRAMFAKLEEEMTTYAYYYTGIGAGVLIVAYIQVSFWCLAAGRQIHKIRQKFFHAIMNQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINEGIGDKIGMFFQAMATFFGGFIIGFTRGWKLTLVILAISPVLGLSAGIWAKILSSFTDKELHAYAKAGAVAEEVLAAIRTVIAFGGQKKELERYNNNLEEAKRLGIKKAITANISMGAAFLLIYASYALAFWYGTSLVISKEYSIGQVLTVFFSVLIGAFSVGQASPNIEAFANARGAAYEVFKIIDNKPSIDSFSKSGHKPDNIQGNLEFKNIHFSYPSRKEVQILKGLNLKVKSGQTVALVGNSGCGKSTTVQLMQRLYDPLDGMVSIDGQDIRTINVRYLREIIGVVSQEPVLFATTIAENIRYGREDVTMDEIEKAVKEANAYDFIMKLPHQFDTLVGERGAQLSGGQKQRIAIARALVRNPKILLLDEATSALDTESEAVVQAALDKAREGRTTIVIAHRLSTVRNADVIAGFDGGVIVEQGNHDELMREKGIYFKLVMTQTAGNEIELGNEACKSKDEIDNLDMSSKDSGSSLIRRRSTRKSICGPHDQDRKLSTKEALDEDVPPASFWRILKLNSTEWPYFVVGIFCAIINGGLQPAFSVIFSKVVGVFTNGGPPETQRQNSNLFSLLFLILGIISFITFFLQGFTFGKAGEILTKRLRYMVFKSMLRQDVSWFDDPKNTTGALTTRLANDAAQVKGATGSRLAVIFQNIANLGTGIIISLIYGWQLTLLLLAIVPIIAIAGVVEMKMLSGQALKDKKELEGSGKIATEAIENFRTVVSLTREQKFETMYAQSLQIPYRNAMKKAHVFGITFSFTQAMMYFSYAACFRFGAYLVTQQLMTFENVLLVFSAIVFGAMAVGQVSSFAPDYAKATVSASHIIRIIEKTPEIDSYSTQGLKPNMLEGNVQFSGVVFNYPTRPSIPVLQGLSLEVKKGQTLALVGSSGCGKSTVVQLLERFYDPMAGSVFLDGKEIKQLNVQWLRAQLGIVSQEPILFDCSIAENIAYGDNSRVVSYEEIVRAAKEANIHQFIDSLPDKYNTRVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQPHILLLDEATSALDTESEKVVQEALDKAREGRTCIVIAHRLSTIQNADLIVVIQNGKVKEHGTHQQLLAQKGIYFSMVSVQAGAKRS (SEQ ID NO:331)

マウスMDR1b配列：
MEFEENLKGRADKNFSKMGKKSKKEKKEKKPAVGVFGMFRYADWLDKLCMILGTLAAIIHGTLLPLLMLVFGNMTDSFTKAEASILPSITNQSGPNSTLIISNSSLEEEMAIYAYYYTGIGAGVLIVAYIQVSLWCLAAGRQIHKIRQKFFHAIMNQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINDGIGDKIGMFFQSITTFLAGFIIGFISGWKLTLVILAVSPLIGLSSALWAKVLTSFTNKELQAYAKAGAVAEEVLAAIRTVIAFGGQQKELERYNKNLEEAKNVGIKKAITASISIGIAYLLVYASYALAFWYGTSLVLSNEYSIGEVLTVFFSILLGTFSIGHLAPNIEAFANARGAAFEIFKIIDNEPSIDSFSTKGYKPDSIMGNLEFKNVHFNYPSRSEVQILKGLNLKVKSGQTVALVGNSGCGKSTTVQLMQRLYDPLEGVVSIDGQDIRTINVRYLREIIGVVSQEPVLFATTIAENIRYGREDVTMDEIEKAVKEANAYDFIMKLPHQFDTLVGERGAQLSGGQKQRIAIARALVRNPKILLLDEATSALDTESEAVVQAALDKAREGRTTIVIAHRLSTVRNADVIAGFDGGVIVEQGNHDELMREKGIYFKLVMTQTRGNEIEPGNNAYGSQSDTDASELTSEESKSPLIRRSIYRSVHRKQDQERRLSMKEAVDEDVPLVSFWRILNLNLSEWPYLLVGVLCAVINGCIQPVFAIVFSRIVGVFSRDDDHETKRQNCNLFSLFFLVMGLISFVTYFFQGFTFGKAGEILTKRVRYMVFKSMLRQDISWFDDHKNSTGSLTTRLASDASSVKGAMGARLAVVTQNVANLGTGVILSLVYGWQLTLLLVVIIPLIVLGGIIEMKLLSGQALKDKKQLEISGKIATEAIENFRTIVSLTREQKFETMYAQSLQVPYRNAMKKAHVFGITFSFTQAMMYFSYAACFRFGAYLVAQQLMTFENVMLVFSAVVFGAMAAGNTSSFAPDYAKAKVSASHIIRIIEKTPEIDSYSTEGLKPTLLEGNVKFNGVQFNYPTRPNIPVLQGLSLEVKKGQTLALVGSSGCGKSTVVQLLERFYDPMAGSVFLDGKEIKQLNVQWLRAHLGIVSQEPILFDCSIAENIAYGDNSRAVSHEEIVRAAKEANIHQFIDSLPDKYNTRVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQPHILLLDEATSALDTESEKVVQEALDKAREGRTCIVIAHRLSTIQNADLIVVIENGKVKEHGTHQQLLAQKGIYFSMVQAGAKRS (SEQ ID NO:332)、または非ヒト霊長類配列、例えば以下のPan troglodytes（チンパンジー）配列：
MDLEGDRNGGAKKKNFFKLNNKSEKDKKEKKPTVSVFSMFRYSNWLDKLYMVVGTLAAIIHGAGLPLMMLVFGEMTDIFANAGNLEDLMSNITNRSDINDTGFFMNLEEDMTRYAYYYSGIGAGVLVAAYIQVSFWCLAAGRQIHKIRKQFFHAIMRQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINEGIGDKIGMFFQSMATFFTGFIVGFTRGWKLTLVILAISPVLGLSAAVWAKILSSFTDKELLAYAKAGAVAEEVLAAIRTVIAFGGQKKELERYNKNLEEAKRIGIKKAITANISIGAAFLLIYASYALAFWYGTTLVLSGEYSIGQVLTVFFSVLIGAFSVGQASPSIEAFANARGAAYEIFKIIDNKPSIDSYSKSGHKPDNIKGNLEFRNVHFSYPSRKQVKILKGLNLKVQSGQTVALVGNSGCGKSTTVQLMQRLYDPTEGMVSVDGQDIRTINVRFLREIIGVVSQEPVLFATTIAENIRYGRENVTMDEIEKAVKEANAYDFIMKLPHKFDTLVGERGAQLSGGQKQRIAIARALVRNPKILLLDEATSALDTESEAVVQVALDKARKGRTTIVIAHRLSTVRNADVIAGFDDGVIVEKGNHDELMKEKGIYFKLVTMQTAGNEVELENAADESKSEIDALEMSSNDSRSSLIRKRSTRRSVRGSQAQDRKLSTKEALDESIPPVSFWRIMKLNLTEWPYFVVGVFCAIINGGLQPAFAIIFSKIIGVFTRIDDPETKRQNSNLFSLLFLVLGIISFITFFLQGFTFGKAGEILTKRLRYMVFRSMLRQDVSWFDDPKNTTGALTTRLANDAAQVKGAIGSRLAVITQNIANLGTGIIISFIYGWQLTLLLLAIVPIIAIAGVVEMKMLSGQALKDKKELEGAGKIASEAIENFRTVVSLTQEQKFEHMYAQSLQVPYRNSLRKAHIFGITFSFTQAMMYFSYAGCFRFGAYLVAHKLMSFEDVLLVFSAVVFGAMAVGQVSSFAPDYAKAKISAAHIIMIIEKTPLIDSYSTEGLTPNTLEGNVTFGEVVFNYPTRPDIPVLQGLSLEVKKGQTLALVGSSGCGKSTVVQLLERFYDPLAGKVLLDGKEIKRLNVQWLRAHLGIVSQEPILFDCSIAENIAYGDNSRVVSQEEIVRAAKEANIHAFIESLPNKYSTRVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQPHILLLDEATSALDTESEKVVQEALDKAREGRTCIVIAHRLSTIQNADLIVVFQNGRVKEHGTHQQLLAQKGIYFSMVSVQAGTKRQ (SEQ ID NO:333)、またはMacaca fascicularis（カニクイザル）配列：
MDLEGDRNGGAEKKNFFKLNNKSKKDKKERKPTVSVFSMFRYSNWLDKLYMVVGTLAAIIHGAGLPLMMLVFGDMTDTFANAGNLGDLGALLFNNTNSSNITDTVPVMNLEEDMTRYAYYYSGIGAGVLVAAYIQVSFWCLAAGRQIHKIRKQFFHAIMRQEIGWFDVHDVGELNTRLTDDVSKINEGIGDKIGMFFQSMATFFTGFIVGFTRGWKLTLVILAISPVLGLSAAVWAKILSSFTDKELLAYAKAGAVAEEVLAAIRTVIAFGGQKKELERYNKNLEEAKRIGIKKAITANISIGAAFLLIYASYALAFWYGTTLVLSKEYSIGQVLTVFFSVLIGAFSVGQASPSIEAFANARGAAFEIFKIIDNKPSIDSYSKSGHKPDNIKGNLEFRNVHFSYPSRKEVKILKGLNLKVQSGQTVALVGNSGCGKSTTVQLMQRLYDPTEGMVSVDGQDIRTINVRFLREIIGVVSQEPVLFATTIAENIRYGREDVTMDEIEKAVKEANAYDFIMKLPQKFDTLVGERGAQLSGGQKQRIAIARALVRNPKILLLDEATSALDTESEAVVQVALDKARKGRTTIVIAHRLSTVRNADVIAGFDDGVIVEKGNHDELMKEKGIYFKLVTMQTAGNEIELENAADESKSEIDTLEMSSHDSGSSLIRKRSTRRSVRGSQGQDRKLSTKEALDESIPPVSFWRIMKLNLTEWPYFVVGVFCAIINGGLQPAFAVIFSKIIGIFTRNDDAETKRQNSNLFSLLFLVLGIVSFITFFLQGFTFGKAGEILTKRLRYMVFRSMLRQDVSWFDDPKNTTGALTTRLANDAAQVKGAIGSRLAIITQNIANLGTGIIISLIYGWQLTLLLLAIVPIIAIAGVVEMKMLSGQALKDKKELEGAGKIATEAIENFRTVVSLTQEQKFEHMYDQSLQVPYRNSLRKAHIFGITFSFTQAMMYFSYAGCFRFGAYLVAHSLMSFEDVLLVFSAVVFGAMAVGQVSSFAPDYAKAKVSAAHIIMIIEKTPLIDSYSTEGLKPNTLEGNVTFNEVVFNYPTRLDIPVLQGLSLEVKKGQTLALVGSSGCGKSTVVQLLERFYDPLAGKVLLDGKEIKQLNVQWLRAHLGIVSQEPILFDCSISENIAYGDNSRVVSQEEIVRAAKEANIHAFIESLPNKYSTRVGDKGTQLSGGQKQRIAIARALVRQPHILLLDEATSALDTESEKVVQEALDKAREGRTCIVIAHRLSTIQNADLIVVFQNGRVKEHGTHQQLLAQKGIYFSMVSVQAGAKRQ (SEQ ID NO:334) 等。
本発明の抗MDR1抗体は、MDR1への高親和性結合を示す。例えば、本発明の抗MDR1抗体は、少なくとも約10-7 M、少なくとも約10-8M、少なくとも約10-9 M、または少なくとも約10-10 Mの親和性でヒトMDR1に結合する。本発明の抗MDR1抗体は、MDR1上に存在するエピトープに、約10-7 M～約10-8 M、約10-8M～約10-9 M、または約10-9 M～約10-10Mの親和性で結合する。
本発明の抗MDR1抗体は、関連するが配列が異なる他のタンパク質、例えば関連するが配列が異なるEP内のアミノ酸によって形成されるエピトープには実質的に結合しない。関連するが配列が異なるタンパク質内のアミノ酸によって形成されるエピトープへの当該抗MDR1抗体の結合は、一般に、MDR1上のエピトープへの該抗MDR1抗体の特異的結合よりも実質的に低い親和性の非特異的結合である。実質的により低い親和性は、一般に、少なくとも2倍、3倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、または1000倍低い親和性である。
本発明の抗MDR1抗体は、MDR1トランスポーター（例えばヒトMDR1）を介する分子の輸送を減少させることができる。例えば、本発明の抗MDR1抗体は、抗MDR1抗体の非存在下での輸送の程度と比較して、輸送を少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、またはそれ以上減少させることができる。
ある態様において、対象抗体は、例えばげっ歯類、非ヒト霊長類、およびヒト配列を含め、哺乳類配列であるFR領域を含む（例えばそれぞれの重鎖FRコード配列によってコードされたもの）。
本抗体は、表2に記載された抗体のVH-VLペアのVH領域についての配列に対して85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上（100%を含む）の同一性であるアミノ酸配列を含む重鎖可変 (VH) 領域を含むことができる。本抗体は、表2に記載された抗体のVH-VL領域ペアのVLについての配列に対して85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上（100%を含む）の同一性であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変 (VL) 領域を含むことができる。
対象抗体の領域および/または鎖は、1以上のリンカー領域によって連結されていても、連結されていなくてもよい。存在する場合、リンカー領域は、長さが約5アミノ酸から約50アミノ酸までであり得、例えば、約5 aa～約10 aa、約10 aa～約15 aa、約15 aa～約20 aa、約20 aa～約25 aa、約25 aa～約30 aa、約30 aa～約35 aa、約35 aa～約40 aa、約40 aa～約45 aa、または約45 aa～約50 aaの長さであり得る。
対象抗体における使用に適したリンカーは、「フレキシブルリンカー」を含む。存在する場合、リンカー分子は、一般に、連結領域間のある程度の柔軟な運動を可能にするのに十分な長さである。リンカー分子は一般に約6～50原子の長さである。リンカー分子は、例えば、アリールアセチレン、2～10モノマー単位を含有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、ジ酸（diacids）、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであってもよい。本開示に照らして、ポリペプチドに結合させることができる他のリンカー分子が使用され得る。
適切なリンカーは容易に選択することができ、種々の長さのうちの適切ないずれのものであってもよく、例えば、1個のアミノ酸（例えばGly）から20個のアミノ酸、2個のアミノ酸から15個のアミノ酸、3個のアミノ酸から12個のアミノ酸、例えば、4個のアミノ酸から10個のアミノ酸、5個のアミノ酸から9個のアミノ酸、6個のアミノ酸から8個のアミノ酸、または7個のアミノ酸から8個のアミノ酸を含み、1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個のアミノ酸であってもよい。
例示的なフレキシブルリンカーとしては、グリシンポリマー (G)n、グリシン-セリンポリマー（例えば、(GS)n、GSGGSn（配列番号335）およびGGGSn（配列番号336）、ここでnは少なくとも1の整数である）、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、および当技術分野で知られる他のフレキシブルリンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン-セリンポリマーは、これらのアミノ酸の両方が比較的非構造性であり、したがって成分間のニュートラルな連結（tether）として作用し得るため、関心を引く。グリシンは、アラニンすらよりもさらに著しくphi-psi空間にアクセスし、より長い側鎖をもつ残基よりもはるかに制限が少ないので、グリシンポリマーは特に関心を引く（Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)）。例示的なフレキシブルリンカーは、限定されるものではないが、GGSG (SEQ ID NO: 337)、GGSGG (SEQ ID NO: 338)、GSGSG (SEQ ID NO: 339)、GSGGG (SEQ ID NO: 340)、GGGSG (SEQ ID NO: 341)、GSSSG (SEQ ID NO: 342)等を含む。当業者であれば、上述のいずれかの要素に結合されたペプチドの設計は、すべてまたは部分的にフレキシブルであるリンカーを含み得、したがってリンカーは、フレキシブルリンカーと、より柔軟性の低い構造を付与する1つ以上の部分とを含むことができることを認識するであろう。
他の例では、アミノ酸C220をセリンまたは任意の他の天然アミノ酸に変異させることによって、C220を除去することによって、完全なヒンジを除去することによって、またはIgG1ヒンジをIgG3ヒンジで置き換えることによって、本開示の抗体のヒンジ領域の柔軟性が減少され得る。軽鎖がそれらのC末端システインを介して連結された抗体が形成され、これはヒトアイソタイプIgA2mに見られる状況に類似している。これにより、Fcと比較してFabの柔軟性が低下し、その結果、架橋能力が低下する。IgG1分子の柔軟性を低下させる別の戦略は、IgG1ヒンジをIgG2ヒンジまたはIgG2様ヒンジで置き換えることである。あるいは、IgG2ヒンジに類似するIgG1ヒンジのバリアントを導入することができる。この変異体（TH7Δ6-9）はT223C変異と2つの欠失（K222とT225）を含有し、追加のシステインを有する短いヒンジを創出する。
マウスCDRをヒト可変ドメインフレームワーク中に置き換えることは、それらの正しい空間的配向の保持をもたらし得、そこでは例えば、ヒト可変ドメインフレームワークが、そのCDRが由来するマウス可変ドメインフレームワークと同一または類似のコンフォメーションを採用する。これは、そのCDRが由来するマウス可変フレームワークドメインと高度な配列同一性を示すフレームワーク配列を有するヒト抗体からヒト可変ドメインを得ることによって達成することができる。重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、同じまたは異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であってもよく、またはいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であってもよい。Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993)参照。
マウスドナー免疫グロブリンの相補性決定領域および適切なヒトアクセプター免疫グロブリンを同定したら、次のステップは、得られるヒト化抗体の特性を最適化するために、これらの成分から置換されるべき残基があるか、いずれの残基であるか、を決定することである。一般に、マウス残基の導入はヒトにおいてその抗体がヒト抗マウス抗体 (HAMA) 反応を誘導するリスクを増加させるので、ヒトアミノ酸残基をマウス残基に置換することは最小限にすべきである。免疫応答を測定するための当技術分野で認識されている方法を実施して、特定の患者においてまたは臨床試験の際にHAMA応答をモニターすることができる。ヒト化抗体を投与された患者は、前記治療の開始時および投与期間中に免疫原性評価を受けることができる。HAMA応答は、例えば表面プラズモン共鳴技術 (BIACORE) および/または固相ELISA分析を含む当業者に公知の方法を用いて、患者からの血清試料中のヒト化治療試薬に対する抗体を検出することによって測定される。多くの実施形態において、対象ヒト化抗体は、ヒト対象においてHAMA応答を実質的に誘導しない。
ヒト可変領域フレームワーク残基からの特定のアミノ酸が、CDRのコンフォメーションおよび/または抗原への結合に対するそれらの可能な影響に基づいて、置換のために選択される。マウスCDR領域とヒト可変フレームワーク領域との不自然な並置は、コンフォメーション制限をもたらし得、これは、特定のアミノ酸残基の置換によって補正されない限り、結合親和性の損失につながる。
置換のためのアミノ酸残基の選択は、部分的にはコンピュータモデリングによって決定され得る。免疫グロブリン分子の三次元画像を作成するためのコンピュータハードウェアおよびソフトウェアは当技術分野で公知である。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖またはそのドメインの解明された（solved）構造から出発して作成される。モデル化する鎖と、解明済み三次元構造の鎖またはドメインとのアミノ酸配列類似性を比較し、配列類似性が最も大きい鎖またはドメインを分子モデル構築の出発点として選択する。少なくとも50%の配列同一性を共有する鎖またはドメインがモデリングのために選択され、好ましくは少なくとも60%、70%、80%、90%の配列同一性またはそれ以上を共有するものがモデリングのために選択される。解明された出発構造は、モデル化される免疫グロブリン鎖またはドメイン中の実際のアミノ酸と出発構造中のアミノ酸との間の差異を許容するように改変される。改変された構造は複合免疫グロブリンへと組み立てられる。最後に、エネルギー最小化により、および、すべての原子が互いから適切な距離にあることと、結合の長さと角度が化学的に許容される範囲内にあることとを検証することにより、モデルを洗練する。
ある態様において、対象抗体は、scFv多量体を含む。例えば、いくつかの実施形態において、対象抗体は、scFv二量体（例えば2つのタンデムscFv（scFv2）を含むもの）、scFv三量体（例えば3つのタンデムscFv（scFv3）を含むもの）、scFv四量体（例えば4つのタンデムscFv（scFv4）を含むもの）、または4より多いscFvの（例えばタンデムでの）多量体である。scFvモノマーは、長さが約2アミノ酸～約15アミノ酸、例えば、長さが2 aa、3 aa、4 aa、5 aa、6 aa、7 aa、8 aa、9 aa、10 aa、11 aa、12 aa、13 aa、14 aa、または15 aaのリンカーを介してタンデムに連結され得る。適切なリンカーは、例えば、(Gly)xを含み、ここでxは2～15の整数である。他の適切なリンカーは、上述のものである。いくつかの実施形態において、対象scFV多量体中のscFvモノマーの各々は、上述のようにヒト化される。特定の態様において、二重特異性抗体は、文献において公知の任意の分子フォーマットであり得る。異なる二重特異性抗体フォーマットおよび作製方法の包括的な概要については、例えばBrinkmann and Kontermann, MAbs. 2017, 9(2):182-212を参照されたい。2017、9 (2) :182-212。例えば、本開示の二重特異性抗体は、Spiess C. et al., Mol Immunol. 2015 Oct; 67(2 Pt A):95-106に記載されている分子フォーマットを有し得る。
ある態様において、対象抗体は、免疫グロブリンの定常領域（例えばFc領域）を含む。Fc領域は、存在する場合、ヒトFc領域であり得る。定常領域が存在する場合、抗体は、軽鎖および重鎖の両方の定常領域を含み得る。適当な重鎖定常領域は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域を含む。本明細書に記載される抗体は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEを含む全てのタイプの定常領域、ならびにIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含むあらゆるアイソタイプを有する抗体を含む。適当な重鎖Fc領域の例は、ヒトのアイソタイプIgG1 Fcである。軽鎖定常領域は、ラムダまたはカッパであり得る。対象抗体（例えば、対象ヒト化抗体）は、複数のクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含み得る。抗体は、2つの軽鎖および2つの重鎖を含有する四量体として、別個の重鎖として、軽鎖として、Fab、Fab'F(ab')2、およびFvとして、または、重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサーを介して連結されている単鎖抗体として発現され得る。
いくつかの実施形態において、対象抗体は、カルボキシル末端に遊離チオール (-SH) 基を含み、この遊離チオール基は、抗体を第2のポリペプチド（例えば、本発明の抗体を含む別の抗体）、足場、担体などに結合させるために使用され得る。
対象抗体は、例えばグルタルアルデヒド、ホモ二官能性架橋剤、またはヘテロ二官能性架橋剤を用いて、第2の部分（例えば脂質、対象抗体以外のポリペプチド、合成ポリマー、炭水化物、毒素など）に共有結合され得る。グルタルアルデヒドはそのアミノ部分を介してポリペプチドを架橋する。ホモ二官能性架橋剤（例えば、ホモ二官能性イミドエステル、ホモ二官能性N-ヒドロキシスクシンイミジル (NHS) エステル、またはホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤）は、2つ以上の同一の反応性部分を含み、架橋されるポリペプチドの混合物を含有する溶液に架橋剤を添加する一段階反応手順において使用することができる。ホモ二官能性NHSエステルおよびイミドエステルは、アミン含有ポリペプチドを架橋する。弱アルカリ性のpHでは、イミドエステルは第一級アミンとのみ反応してイミドアミドを生成し、架橋されたポリペプチドの全体的な電荷は影響を受けない。ホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤はビスマレイミドヘキサン (BMH)、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン (DFDNB)、および1,4-Bis[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン (DPDPB) を含む。
［組成物および製剤］
本開示は、対象抗体を含む組成物を提供する。対象抗体組成物は、対象抗体に加えて、塩、例えば、NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等；緩衝剤、例えばトリス緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)（HEPES）、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（MES）、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩（MES）、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸（MOPS）、N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸（TAPS）等；可溶化剤；洗剤、例えばTween-20等のような非イオン性洗剤；プロテアーゼ阻害剤；グリセロール；などの1つ以上を含むことができる。
本開示の組成物はまた、本明細書に記載の抗体を含む医薬組成物を含む。一般に、製剤は有効量の対象抗体を含む。「有効量」とは、所望の結果、例えば対象の癌の減少、対象の癌の増殖速度の減少、癌の症状の改善などを生じるのに十分な用量を意味する。一般に、所望の結果は、対照と比較して、少なくとも、癌の症状の減少、癌の増殖の減少、癌の大きさの減少などである。対象抗体は、血液脳関門を回避するような態様で送達され得、または製剤化され得る。
いくつかの例では、抗体は、送達エンハンサーを含み得、それはそのようなエンハンサーが血液脳関門の通過、透過性の増加、例えば効率的な経皮送達を可能にすること等を促進し得る場合を含む。
いくつかの例において、本開示の抗体は、送達エンハンサーを伴う製剤では投与されなくてもよい。いくつかの例において、本開示の抗体は、それ自体が、血液脳関門を通る透過性を増強し得る。いくつかの例において、本開示の抗体は、抗腫瘍剤、例えば免疫療法剤または化学療法剤による血液脳関門の通過を促進するための送達エンハンサーとして使用され得る。いくつかの例において、本開示の抗体は、例えば別の抗体または化学療法剤などの活性剤による血液-脳関門、血液-脳脊髄液 (CSF) 関門、血液-精巣関門または血液-胎盤関門の通過を促進するための送達エンハンサーとして使用され得る。
本方法において、本抗体は、所望の治療効果または診断効果をもたらすことができる任意の便宜的な手段を用いて宿主に投与され得る。したがって、薬剤は、治療的投与のための種々の製剤に組み込まれ得る。より詳細には、対象抗体は、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて医薬組成物に製剤化することができ、固体、半固体、液体または気体の形態、例えば錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤およびエアロゾルの調製物に製剤化することができる。
薬学的投薬形態において、対象抗体は、薬学的に許容される賦形剤と一緒に投与され得、または、それらは単独で、または他の薬学的に活性な化合物と適切に関連付けられて、および組み合わせられて、使用され得る。以下の方法および賦形剤は単に例示的なものであり、決して限定的なものではない。
対象抗体は、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールのような水性または非水性溶媒にそれらを溶解、懸濁または乳化することにより、そしてもし望まれれば可溶化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤および保存剤のような従来の添加剤を伴わせて、注射用調製物中に製剤化され得る。
対象抗体を含む医薬組成物は、所望の純度を有する抗体を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤、界面活性剤、緩衝剤および/または張性剤と混合することによって調製される。許容される担体、賦形剤および/または安定化剤は、使用される用量および濃度においてレシピエントに対して毒性がなく、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニンおよびクエン酸を含む抗酸化剤；保存剤（例えばエタノール、ベンジルアルコール、フェノール、m-クレゾール、p-クロロ-m-クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはそれらの組合せなど）；アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンおよびそれらの組合せのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、その他の炭水化物；低分子量 (約10残基未満) ポリペプチド；ゼラチンや血清アルブミンなどのタンパク質；EDTA等のキレート剤；トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、N-メチルグルコサミン、ガラクトサミン、およびノイラミン酸などの糖；および／またはTween、Brij Pluronic、Triton-X、ポリエチレングリコール (PEG) などの非イオン性界面活性剤を含む。
医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であってもよく、ここで、凍結乾燥製剤は、投与前に無菌溶液で再構成される。
本医薬組成物中の例示的な抗体濃度は、約1 mg/mL～約200 mg/mL、または約50 mg/mL～約200 mg/mL、または約150 mg/mL～約200 mg/mLの範囲であり得る。
抗体の水性製剤は、pH緩衝液中で、例えば、約4.0～約7.5、約5.0～約6.0、あるい約5.5の範囲のpHで調製され得る。この範囲内のpHに適した緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液および他の有機酸緩衝液が挙げられる。緩衝液濃度は、例えば、緩衝液および製剤の所望の張度に応じて、約1 mM～約100 mM、または約5 mM～約50 mMであり得る。
いくつかの態様において、水性製剤は等張であるが、高張または低張溶液も適切であり得る。「等張の」という用語は、それが比較される他の溶液（例えば生理的塩溶液または血清）と同じ張性を有する溶液を意味する。張性剤は、約5 mM～約350 mMの量、例えば100 mM～350 nMの量で使用され得る。
製剤化された抗体の凝集を低減し、および/または製剤中の粒子の形成を最小限化し、および/または吸着を低減させるために、界面活性剤も抗体処方に添加され得る。界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tween) 、ポリオキシエチレンアルキルエーテル (Brij) 、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル (Triton-X) 、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン共重合体（ポロキサマー、プルロニック）、およびドデシル硫酸ナトリウム (SDS) が挙げられる。界面活性剤の例示的濃度は、約0.001%～約1% w/vの範囲であり得る。
凍結乾燥工程中の不安定化条件から不安定な活性成分（例えばタンパク質）を保護するために、凍結乾燥保護剤（lyoprotectant）を添加してもよい。例えば、既知の凍結乾燥保護剤には、糖（グルコースおよびスクロースを含む）；ポリオール類（マンニトール、ソルビトール及びグリセロールを含む）；およびアミノ酸（アラニン、グリシン、グルタミン酸を含む）が含まれる。凍結乾燥保護剤は、約10 mM～500 nMの量で含まれ得る。
ある態様において、対象製剤は、対象抗体、および1種以上の上記同定された物質（例えば、界面活性剤、緩衝剤、安定化剤、張性剤）を含み、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、m-クレゾール、p-クロロ-m-クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、およびそれらの組み合わせのような1種以上の保存剤を本質的に含まない。他の態様では、保存剤が、例えば、約0.001～約2% (w/v) の範囲の濃度で製剤中に含まれる。
例えば、対象の製剤は、非経口投与に適した液体または凍結乾燥製剤であり得、約1 mg/mL～約200 mg/mLの対象抗体；約0.001%～約1%の少なくとも1つの界面活性剤；約1 mM～約100 mMの緩衝剤；任意で約10 mM～約500 mMの安定化剤；および約5 mM～約305 mMの張性剤を含むことができ、約4.0から約7.0のpHを有する。
本発明の抗体は、吸入により投与されるエアロゾル製剤に利用することができる。対象抗体は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な噴射剤に製剤化することができる。
本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒトおよび動物対象のための単一用量として適した物理的に別個な単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルを伴う、所望の効果を生じるのに十分な量で計算された本発明の所定量の化合物を含む。対象抗体の仕様は、使用される特定の抗体、達成される効果、および宿主における各抗体に関連する薬物動態に依存し得る。
対象抗体は、注射製剤として投与することができる。典型的には、注射用組成物は、液体溶液または懸濁液として調製される；注射前に液体ビヒクル中に溶解または懸濁することに適した固体形態を調製することもできる。調製物はまた、乳化されてもよく、またはリポソーム担体に抗体を封入しもよい。
適切な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、ビヒクルは、湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝剤などの少量の補助物質を含有してもよい。このような投薬形態を調製する実際の方法は、当業者には公知であるか、または明らかであろう。
ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤のような薬学的に許容される賦形剤は、一般に容易に入手可能である。さらに、pH調整剤および緩衝剤、張度調整剤、安定化剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質も一般に容易に入手可能である。
いくつかの態様において、対象抗体は、放出制御製剤に製剤化される。徐放性調製物は、当技術分野でよく知られた方法を用いて調製することができる。
［用法・用量］
適切な投与量は、様々な臨床的因子に基づいて、主治医または他の資格のある医療従事者によって決定され得る。医学分野でよく知られているように、1人の患者に対する投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、患者の性別、時間および投与経路、全般的な健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含む、多くの因子に依存する。対象抗体は、1 ng/kg体重から20 mg/kg体重/回、例えば0.1 mg/kg体重から10 mg/kg体重、例えば0.5 mg/kg体重から5 mg/kg体重の間の量で投与され得る；しかし、特に前述の要因を考慮して、この例示的な範囲より下または上の用量も想定される。レジメンが連続的注入である場合、1μg～10 mg/kg体重/分の範囲であってもよい。
当業者は、用量レベルが、特定の抗体、症状の重篤度、および副作用に対する対象の感受性の関数として変化し得ることを容易に理解するであろう。所与の化合物の好ましい投与量は、様々な手段によって当業者によって容易に決定され得る。
身体サイズに基づく投与スケジュールに加えて、モノクローナル抗体の分布および排泄に対しては身体サイズの影響は比較的小さいことを考慮して、対象抗体の固定用量投与も企図される。例えばHendrikx et al, Oncologist 2017, 22(10):1212-1221を参照されたい。
［投与経路］
対象抗体は、薬物送達に適した任意の利用可能な方法および経路を用いて個体に投与され、それは例えばin vivoおよびex vivoの方法、ならびに全身経路および局所経路の投与を含む。
従来型の投与経路および薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、動脈内、直腸、鼻、経口、ならびに他の経腸および非経口投与経路が含まれる。投与経路は、所望であれば組み合わせてもよく、または抗体および/または所望の効果に応じて調節され得る。対象抗体組成物は、単回投与または複数回投与され得る。ある態様において、対象抗体組成物は経口投与される。ある態様において、対象抗体組成物は、吸入経路を介して投与される。ある態様において、対象抗体組成物は鼻腔内投与される。ある態様において、対象抗体組成物を局所的に投与される。ある態様において、対象抗体組成物は、頭蓋内に投与される。ある態様において、対象抗体組成物は、静脈内投与される。
薬剤は、全身経路または局所経路を含む、従来の薬剤の送達に適した任意の利用可能な従来の方法および経路を用いて、宿主に投与され得る。一般に、本発明により意図される投与経路は、必ずしも限定されないが、経腸、非経口、または吸入経路を含む。
吸入投与以外の非経口投与経路には、必ずしも限定されるものではないが、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、脊髄内、胸骨内、および静脈内経路、すなわち、消化管を介する以外の任意の投与経路が含まれる。非経口投与は、対象抗体の全身的または局所的送達を行うために行われ得る。全身送達が望まれる場合、投与は、典型的には、侵襲的であるかまたは全身的に吸収される医薬調製物の局所または粘膜投与を含む。
対象抗体はまた、経腸投与によって対象に送達され得る。経腸投与経路には、必ずしも限定されないが、経口および直腸（例えば坐薬を使用をした）送達が含まれる。
対象抗体は、通常、非経口的（静脈内、皮下、筋肉内または皮内）注射による静脈内注入、好ましくは静脈内注入もしくは注射、または皮下注射によって投与される。特に、長期間にわたって投与を受けている患者では、皮下投与が著しい有益さを提供する。このような有益さとしては、患者にとっての利便性、短い送達時間、および専用の注入設備の必要性の欠如などがある。従って、皮下の製剤および送達は、患者にとっての利便性および生活の質を改善させ、ヘルスケアシステムにコスト節減を提供し得る。皮下投与は、例えば、同じ製剤中に共製剤化された2つ以上の活性分子を含有する皮下固定用量の組合せを使用した、併用療法において特に有益となり得る。あるいは、マルチチャンバー装置が、複数の製品を連続的に注射するか、または皮下注射の前にそれらを直接プレミックスすることができる。さらなる詳細については、例えばBittner et al, BioDrugs 2018, 32:425-440; およびViola et al, J Control Release 2018, 286:301-314参照。
治療とは、宿主を苦しめる病理学的状態に関連する症状の少なくとも改善を意味し、ここで改善とは、癌および/または癌の増殖ならびにそれらに伴う痛みなど、治療される病理学的状態に関連するパラメータ（例えば症状）の大きさの少なくとも減少を表すために広義に使用される。このようなものとして、治療は、宿主がもはや病理学的状態または少なくともそれを特徴づける症状を患わないように、その病理学的状態または少なくともそれに関連する症状が完全に抑制され、例えば起こることが防止され、または停止され、例えば終結される状況を含む。
種々の対象（ここで、用語「対象」は、本明細書において用語「個体」および「患者」と交換可能に使用される）が、本願で開示される方法に従って治療可能である。一般に、そのような対象は、「哺乳動物」または「哺乳類」であり、ここで、これらの用語は、肉食動物目（例えば犬や猫）、げっ歯目（例えばマウス、モルモット、ラット）、および霊長類（例えばヒト、チンパンジー、およびサル）を含む、哺乳綱に属する生物を記述するために広く使用される。ある態様において、宿主はヒトである。
対象抗体の単位用量 (例えば経口または注射用量) を有するキットが提供される。いくつかの態様において、単位用量を含有する容器に加えて、関心のある病理学的状態を治療することにおける抗体の使用および付随する利点を記載する情報添付文書がある。
［核酸］
本開示は、対象抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。対象抗体をコードするヌクレオチド配列は、意図された標的細胞（例えば、コードされた抗体を合成および/または分泌するように遺伝子組換えされた細胞）において該ヌクレオチド配列の発現を可能にする、プロモーターおよびエンハンサーなどの1以上の調節エレメントに作動可能に連結され得る。
適切なプロモーターおよびエンハンサーエレメントは、当技術分野において公知である。細菌細胞における発現のための適切なプロモーターとしては、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPおよびtrcが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞における発現のためには、適切なプロモーターとしては、限定されるものではないが、軽鎖および/または重鎖免疫グロブリン遺伝子のプロモーターおよびエンハンサーエレメント；サイトメガロウイルス前初期プロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター；初期および後期のSV40プロモーター；レトロウイルスの長い末端反復配列に存在するプロモーター；マウスメタロチオネイン-Iプロモーター；および当技術分野で知られている種々の組織特異的プロモーターが挙げられる。
対象抗体をコードするヌクレオチド配列は、発現ベクターおよび/またはクローニングベクター中に存在し得る。対象抗体が2つ以上の別個のポリペプチドを含む場合、その2つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、同一または別個のベクター中にクローニングすることができる。別個のポリペプチドは、様々な戦略を用いて単一の核酸または単一のベクターから発現され得、それらの戦略としては、別個のプロモーター、1つまたは複数の内部リボソーム進入部位 (IRES) 、1つまたは複数の自己切断配列（例えば2A切断配列、例えば、P2A、T2A、E2A、およびF2A）、それらの組合せなどがある。発現ベクターは、選択マーカー、複製起点、およびベクターの複製および/または維持を提供する他の特徴を含むことができる。
多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に知られている；その多くは、対象の組換え構築物を作製するために市販されている。例として以下のベクターを提供する。細菌：pbs、ファージスクリプト、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（Stratagene, La Jolla, Calif., USA）；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540およびpRIT5（Pharmacia, Uppsala, Sweden）。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG (Stratagene) pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL (Pharmacia) 。
発現ベクターは、一般に、異種性タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有する。発現宿主において作用する選択マーカーが存在してもよい。適切な発現ベクターは、限定されるものではないが、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；SV40；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス；レトロウイルスベクター（例えばマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、および、ラウス肉腫ウイルス、ハーヴェイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳がんウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）；などが含まれる。
例えば本明細書に記載されるような核酸は、いくつかの例において、例えば細胞をその核酸と接触させることによって、細胞に導入され得る。導入された核酸を有する細胞は、本明細書中では一般に遺伝子組換え細胞と称される。核酸送達の種々の方法を使用することができ、これには、例えば、裸の核酸送達、ウイルス送達、化学的トランスフェクション、遺伝子銃的方法などが含まれるが、これらに限定されない。
［細胞］
本開示は、対象核酸で遺伝子改変された、単離された遺伝子組換え細胞（例えばin vitro細胞、ex vivo細胞、培養細胞など）を提供する。ある態様において、該単離遺伝子組換え細胞は、対象抗体を産生し得る。場合によっては、遺伝子組換え細胞は、例えば、それを必要とする対象に抗体を送達することができる。場合によっては、遺伝子組換え細胞は、多特異性抗体の産生、スクリーニング、および/または発見において使用され得る。
適切な細胞には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞などの真核細胞、および細菌細胞のような原核細胞も含まれる。宿主細胞への対象核酸の導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、または他の公知の方法によって行うことができる。
適切な哺乳動物細胞には、一次細胞および不死化細胞株が含まれる。適切な哺乳動物細胞株には、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、齧歯類（例えばマウス、ラット）細胞株などが含まれる。適切な哺乳動物細胞株としては、HeLa細胞、CHO細胞、293細胞、3T3細胞、Vero細胞、Huh-7細胞、BHK細胞、PC12細胞、COS細胞、COS-7細胞、RAT1細胞、マウスL細胞、ヒト胚腎臓 (HEK) 細胞、HLHepG2細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの例において、有用な哺乳動物細胞は、哺乳動物の組織または器官に由来する細胞を含み得る。いくつかの例において、使用される細胞は、例えば、HEK 293T細胞のような確立された腎臓細胞株の腎臓細胞を含む、腎臓細胞である。
いくつかの例では、本開示の細胞は免疫細胞であり得る。本明細書で使用される「免疫細胞」という用語は、一般的に、骨髄で産生される造血幹細胞 (HSC) に由来する白血球細胞（leukocytes）を含む。「免疫細胞」には、例えば、リンパ球（T細胞、B細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞）および骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。「T細胞」は、ヘルパーT細胞 (CD4+細胞) 、細胞傷害性T細胞 (CD8+細胞) 、制御性T細胞 (Treg) およびガンマ-デルタT細胞を含む、CD3を発現する全てのタイプの免疫細胞を含む。「細胞傷害性細胞」は、細胞傷害性応答を媒介することができるCD8+T細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、および好中球を含む。
いくつかの例において、本開示の多特異性抗体のような抗体を発現する有用な細胞は、産生（producer）T細胞を含み得る。本開示の抗体をコードする核酸配列を含むように操作された産生T細胞は、いくつかの例において、それを必要とする対象に抗体を送達するために使用され得る。
いくつかの例において、本開示の免疫細胞は、MDR1結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体 (CAR) を含む免疫エフェクター細胞を含み、ここで、MDR1結合ドメインは、表2に列挙された抗体の一対の可変重鎖 (VH) 領域および可変軽鎖 (VL) 領域の重鎖相補性決定領域 (HCDR) および軽鎖CDR (LCDR) を含む。1つの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも1つの共刺激分子（例えば4-1BB（すなわちCD137）、CD27および／またはCD28）に由来する1つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを含み得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含み得る。
免疫エフェクター細胞はT細胞であり得る。免疫エフェクター細胞は、自己（autologous）細胞であり得る。
［方法］
上記で要約されたように、本開示の方法は、本開示の抗体に細胞を接触させる方法、本開示の抗体を対象に投与することを含む方法に従って対象を治療する方法、本出願に記載の要素（例えば抗体、多特異性抗体、二重特性抗体分子、組成物および製剤、核酸、発現ベクター、細胞などを含む）を作製する方法を含む。
上記で要約されたように、本開示の方法は、例えば癌細胞上のMDR1の発現の存在を検出するため、癌細胞上のMDR1の発現のレベルを測定するため、または癌細胞の殺傷を促進および／または増強するために、本開示の抗体に癌細胞を接触させることを含む。いくつかの例では、癌細胞の殺傷は、抗体に結合された癌細胞に作用する免疫応答または免疫細胞によって媒介される。いくつかの例では、癌細胞の殺傷は、例えば抗体によるMDR1阻害の結果としての、癌細胞の細胞排出の阻害によって媒介される。いくつかの例において、癌細胞の殺傷は、癌細胞の細胞排出の阻害プラス免疫媒介応答（例えば抗体のFc領域を介するもの）の組合せによって媒介される。場合によっては、多特異性抗体と接触される細胞は、多剤耐性癌細胞であり得る。癌細胞を本開示の抗体と接触させることを含む方法は、例えば、化学療法、免疫療法、放射線療法などを含む追加の療法または活性剤と癌細胞とを接触させることを含んでもよいし含まなくてもよい。
癌細胞を本開示の多特異性抗体と接触させることは、一般に、癌細胞の殺傷を増強する（例えば、多特異性抗体の非存在下での癌細胞の殺傷レベルと比較して）。いくつかの例では、追加の活性剤が使用される場合において、その追加の活性剤単独を使用して観察される殺傷のレベルと比較して、癌細胞の殺傷の増強が見られ得る。多特異性抗体に起因する癌細胞殺傷の増強の量は様々であり、癌細胞殺傷における少なくとも5%の増加から少なくとも90%以上の増加までの範囲であり得、例えば少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%等を含むがこれらに限定されない。このような増加は、1つ以上の追加の活性剤との単独接触と比較したものであり得る。
癌細胞の増強された殺傷は、例えば、観察研究、インビトロ細胞に基づく細胞毒性アッセイ、フローサイトメトリー、細胞生存性標識（例えば、1つ以上の細胞生存性染色を用いるもの）などを含むがこれらに限定されない種々の手段によって評価され得る。
［治療方法］
本開示は、癌（特に、MDR1発現癌またはMRD 過剰発現癌）を治療する方法を提供し、その方法は一般的に、それを必要とする個体（例えば、そのような癌を有する個体）に、本明細書に提供される抗体の有効量を、単独で（例えば単剤療法で）、または1つ以上の追加の治療剤と組み合わせて（例えば併用療法で）投与することを含む。本開示の抗体の投与は、任意の簡便かつ適切な送達経路によって行うことができる。
したがって、投与することには、例えば、注射による抗体の送達、注入による抗体の送達、抗体をコードする核酸または発現ベクターの送達、抗体を発現し分泌する細胞を対象に投与することによる抗体の送達、MDR1結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体 (CAR) を細胞表面上に発現する免疫エフェクター細胞（例えばCAR-T細胞）の送達（ここで、MDR1結合ドメインは、表2に列挙された抗体のVH領域およびVL領域の対のHCDRおよびLCDRを含む）等が含まれるが、これらに限定されない。薬剤、薬剤をコードする核酸、薬剤を発現する細胞などの投与は、薬剤と接触させること、核酸と接触させること、細胞と接触させること等を含み得る。
いくつかの実施形態において、対象抗体の有効量は、1つまたは複数の用量で単独で（例えば単剤療法で）または1つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて（例えば併用療法で）投与された場合に、該抗体による治療の非存在下での有害症状の重症度と比較して、癌の有害症状を少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、またはそれ以上減少させるのに有効な量である。
ある態様において、対象抗体の有効量は、1つまたは複数の用量で単独で（例えば単剤療法で）または1以上のさらなる治療剤と組み合わせて（例えば併用療法で）投与された場合に、治療される個体において癌を改善すること（例えば癌の成長を遅らせること、癌の成長を止めること、癌の成長を逆転させること、癌細胞（腫瘍細胞等を含む）を殺すこと）のために有効な量である。例えば、対象抗体の有効量は、抗体による治療の非存在下と比較して、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、またはそれ以上、個体における癌増殖速度を低下させるか、または癌の大きさを減少させることができる。
いくつかの例において、対象は、1つ以上の追加の試薬を伴って、または伴わずに、対象抗体を用いることを含めて全身的に処置され得る。本明細書で使用される「全身的処置」とは、特定の腫瘍（例えば、原発腫瘍または規定された二次腫瘍など）または特定の癌含有組織（例えば、肝臓がんの場合は肝臓、血液がんの場合は血液、等）のみを標的とするものではない処置を意味する。全身的処置は、一般に、対象の身体全体に向けられ、例えば、全身放射線療法、全身化学療法、全身免疫療法、これらの組み合わせなどを含み得るが、これらに限定されない。
いくつかの例において、対象は、1つ以上のさらなる試薬を伴って、または伴わずに、対象抗体を用いることを含めて局所的に処置され得る。本明細書で使用される「局所的処置」とは、腫瘍（例えば、原発腫瘍または規定された二次腫瘍など）の位置に特異的に向けられた処置、または癌含有組織（例えば、肝臓がんの場合は肝臓、血液がんの場合は血液、等）に特異的に向けられた処置を意味する。いくつかの例では、局所的処置はまた、腫瘍を取り囲む環境（例えば腫瘍を取り囲む組織、例えば腫瘍にすぐ隣接する組織）に影響を及ぼすような態様で投与され得る。局所的処置は、一般に、腫瘍（例えば原発腫瘍）の部位を含む癌の部位から離れた組織には影響を及ぼさないか、またはそこには標的化されない。対象抗体に加えて、またはそれと組み合わせて投与され得る有用な局所的処置としては、例えば、手術、局所放射線療法、局所凍結療法、局所レーザー療法、局所外用療法、それらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。
ある態様において、対象治療方法は、対象抗体および1つ以上のさらなる治療剤を投与することを含む。適切な追加の治療剤としては、化学療法剤、放射線療法試薬、免疫療法試薬、他の抗体または多特異性抗体剤などが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の多特異性抗体を投与する前、あいだ、または後に対象に投与され得るさらなる処置は、例えば、癌のタイプ、対象の病歴、全般的な健康状態および/または共存症などを含む多数の因子に応じて変化する。有用な癌治療には、例えば、放射線療法、化学療法、免疫療法などが含まれるが、これらに限定されない。
放射線療法は、限定されるものではないが、ビームのような外部から適用される線源から、または小さな放射性線源の移植によって送達されるX線またはガンマ線を含む。
癌治療に使用するのに適した抗体としては、裸の抗体、例えば、トラスツズマブ (ハーセプチン) 、ベバシズマブ(Avastin（商標）) 、セツキシマブ (Erbitux（商標）) 、パニツムマブ (Vectibix（商標）) 、イピリムマブ (Yervoy（商標）) 、リツキシマブ (Rituxan) 、アレムツズマブ(Lemtrada（商標）) 、オファツムマブ (Arzerra（商標）) 、オレゴボマブ (OvaRex（商標）) 、ランブロリズマブ (MK-3475) 、ペルツズマブ(Perjeta（商標）) 、ラニビズマブ (Lucentis（商標）) およびコンジュゲート化抗体、例えばゲムツズマブオゾガマイシン（Mylortarg（商標））、ブレンツキシマブベドチン（Adcetris（商標））、90Y-標識イブリツモマブチウキセタン（(Zevalin（商標））、131I-標識トシツモマ（Bexxar（商標））等が含まれるが、これらに限定されない。
癌治療に使用するのに適した抗体には、腫瘍関連抗原に対して産生された抗体も含まれるが、これらに限定されない。そのような抗原としては、CD20、CD30、CD33、CD52、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えばGD2、GD3、GM2など）、Ley、VEGF、VEGFR、インテグリンアルファ-V-ベータ-3、インテグリンアルファ-5-ベータ-1、EGFR、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、テネイシン、プログラム細胞死1リガンド1 (PD-L1) 、アンドロゲン受容体 (AR) 、Brutonチロシンキナーゼ (BTK) 、BCR-Abl、c-kit、PIK3CA、EML4-ALK、KRAS、ALK、ROS1、AKT1、BRAF、MEKJ、MEK2、NRAS、RAC1、ESR1、CTLA-4、LAG-3およびTIM-3等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体は、本明細書で提供される抗MDR1抗体との併用療法として、またはこれらの抗体のうちの1つの少なくとも抗原結合部分と本明細書で提供される抗MDR1抗体の抗原結合部分とを含む多特異性抗体として投与され得る。
従来型の癌療法には、癌についての標的化療法も含まれ、それには例えば以下のものが含まれるがこれらに限定されない：HER 2 (ERBB2/neu) を標的とするAdo-トラスツズマブエムタンシン (カドサイラ) (乳癌への使用が認可されている) ；EGFR (HER1/ERBB1) 、HER 2 (ERBB 2/neu)を標的とするアファチニブ(Gilotrif) (非小細胞肺癌への使用が認可されている)；標的化するアルデスロイキン（Proleukin）（腎細胞がん、メラノーマへの使用が認可されている)；ALKを標的とするアレクチニブ (アレセンサ) (非小細胞肺癌への使用が認可されている)；CD52を標的とするアレムツズマブ (キャンパス) (B細胞慢性リンパ性白血病への使用が認可されている)；PD-L1を標的とするアテゾリズマブ（テセントリク）(尿路上皮がん、非小細胞肺がんへの使用が認可されている)；PD-L1を標的とするアベルマブ (バベンシオ) (メルケル細胞癌への使用について認可されている)；KIT、PDGFRβ、VEGFR1/2/3を標的とするアキシチニブ (インライタ) (腎細胞癌への使用が認可されている)；BAFFを標的とするベリムマブ（ベンリスタ）（紅斑性狼瘡における使用が認可されている）；HDACを標的とするベリノスタット（Beleodaq）（末梢性T細胞リンパ腫における使用が認可されている）；VEGFリガンドを標的とするベバシズマブ（アバスチン）（子宮頸癌、結腸直腸癌、卵管癌、神経膠芽腫、非小細胞肺癌；卵巣癌、腹膜癌、腎細胞癌における使用が認可されている）；CD19/CD3を標的とするブリナツモマブ（ビーリンサイト）（急性リンパ芽球性白血病（前駆B細胞）における使用が認可されている）；プロテアソームを標的とするボルテゾミブ（ベルケイド）（多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫における使用が認可されている）；ABLを標的とするボスチニブ（ボシュリフ）（慢性骨髄性白血病における使用が認可されている）；CD30を標的とするブレンツキシマブベドチン（アドセトリス）（ホジキンリンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫における使用が認可されている）；ALKを標的とするブリグチニブ（アルンブリグ）（非小細胞肺癌(ALK+)における使用が認可されている）；FLT3、KIT、MET、RET、VEGFR2を標的とするカボザンチニブ（カボメティクス、Cometriq）（甲状腺髄様癌、腎細胞癌における使用が認可されている）；プロテアソームを標的とするカルフィルゾミブ（カイプロリス）（多発性骨髄腫における使用が認可されている）；ALKを標的とするセリチニブ（ジカディア）（非小細胞肺癌における使用が認可されている）；EGFR (HER1/ERBB1) を標的とするセツキシマブ（アービタックス）（結腸直腸癌、頭および首の扁平上皮癌における使用が認可されている）；MEKを標的とするコビメチニブ（Cotellic）（メラノーマにおける使用が認可されている）；ALK、MET、ROS1を標的とするクリゾチニブ（ザーコリ）（非小細胞肺癌における使用が認可されている）；BRAFを標的とするダブラフェニブ（タフィンラー）（メラノーマ、非小細胞肺癌における使用が認可されている）；CD38を標的とするダラツムマブ（ダラザレックス）（多発性骨髄腫における使用が認可されている）；ABLを標的とするダサチニブ（スプリセル）（慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病における使用が認可されている）；RANKLを標的とするデノスマブ（Xgeva）（骨の巨細胞腫瘍における使用が認可されている）；B4GALNT1 (GD2) を標的とするジヌツキシマブ（Unituxin）（小児神経芽細胞腫における使用が認可されている）；PD-L1を標的とするデュルバルマブ（イミフィンジ）（尿路上皮癌における使用が認可されている）；SLAMF7 (CS1/CD319/CRACC) を標的とするエロツズマブ（エムプリシティ）（多発性骨髄腫における使用が認可されている）；IDH2を標的とするエナシデニブ（Idhifa）（急性骨髄性白血病における使用が認可されている）；EGFR (HER1/ERBB1) を標的とするエルロチニブ（タルセバ）（非小細胞肺癌、膵臓癌における使用が認可されている）；mTORを標的とするエベロリムス（アフィニトール）（膵臓、胃腸管または肺起源の神経内分泌腫瘍、腎細胞癌、切除不能上衣下巨細胞性星状細胞腫、乳癌における使用が認可されている）；EGFR (HER1/ERBB1) を標的とするゲフィチニブ（イレッサ）（非小細胞肺癌における使用が認可されている）；CD20を標的とするイブリツモマブチウキセタン（ゼヴァリン）（非ホジキンリンパ腫における使用が認可されている）；BTKを標的とするイブルチニブ（イムブルビカ）（マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症における使用が認可されている）；PI3Kδを標的とするイデラリシブ（Zydelig）（慢性リンパ性白血病、濾胞B細胞非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫における使用が認可されている）；KIT、PDGFR、ABLを標的とするイマチニブ（グリベック（GI間質性腫瘍(KIT+)、隆起性皮膚線維肉腫、多発性血液系腫瘍における使用が認可されている）；CTLA-4を標的とするイピリムマブ（ヤーボイ）（メラノーマにおける使用が認可されている）；プロテアソームを標的とするイキサゾミブ（ニンラーロ）（多発性骨髄腫における使用が認可されている）； HER2 (ERBB2/neu)、EGFR (HER1/ERBB1)を標的とするラパチニブ（タイケルブ）（乳癌(HER2+)における使用が認可されている）；VEGFR2を標的とするレンバチニブ（レンビマ）（腎細胞癌、甲状腺癌における使用が認可されている）；FLT3を標的とするミドスタウリン（Rydapt）（急性骨髄性白血病(FLT3+)における使用が認可されている）；EGFR (HER1/ERBB1) を標的とするネシツムマブ（ポートラーザ）（扁平上皮非小細胞肺癌における使用が認可されている）；HER2 (ERBB2/neu) を標的とするネラチニブ（Nerlynx）（乳癌における使用が認可されている）；ABLを標的とするニロチニブ（タシグナ）（慢性骨髄性白血病における使用が認可されている）；PARPを標的とするニラパリブ（ゼジューラ）（卵巣癌、卵管癌、腹膜癌における使用が認可されている）；PD-1を標的とするニボルマブ（オプジーボ）（結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌、ホジキンリンパ腫、メラノーマ、非小細胞肺癌、腎細胞癌、尿路上皮癌における使用が認可されている）；CD20を標的とするオビヌツズマブ（ガザイバ）（慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫における使用が認可されている）；CD20を標的とするオファツムマブ（アーゼラ、HuMax-CD20）（慢性リンパ性白血病における使用が認可されている）；PARPを標的とするオラパリブ（リムパーザ）（卵巣癌における使用が認可されている）；PDGFRαを標的とするオララツマブ（Lartruvo）（軟部組織肉腫における使用が認可されている）；EGFRを標的とするオシメルチニブ（タグリッソ）（非小細胞肺癌における使用が認可されている）；CDK4、CDK6を標的とするパルボシクリブ（イブランス）（乳癌における使用が認可されている）；EGFR (HER1/ERBB1) を標的とするパニツムマブ（ベクティビックス）（結腸直腸癌における使用が認可されている）；HDACを標的とするパノビノスタット（ファリーダック）（多発性骨髄腫における使用が認可されている）；VEGFR、PDGFR、KITを標的とするパゾパニブ（ヴォトリエント）（腎細胞癌における使用が認可されている）；PD-1を標的とするペムブロリズマブ（キイトルーダ）（古典的ホジキンリンパ腫、メラノーマ、非小細胞肺癌(PD-L1+)、頭頸部扁平上皮癌、充実性腫瘍(MSI-H) における使用が認可されている）；HER2 (ERBB2/neu) を標的とするペルツズマブ（パージェタ）（乳癌(HER2+)における使用が認可されている）；ABL、FGFR1-3、FLT3、VEGFR2を標的とするポナチニブ（アイクルシグ）（慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病における使用が認可されている）；VEGFR2を標的とするラムシルマブ（サイラムザ）（結腸直腸癌、胃癌または食道胃接合部(GEJ) 腺癌、非小細胞肺癌における使用が認可されている）；KIT、PDGFRβ、RAF、RET、VEGFR1/2/3を標的とするレゴラフェニブ（スチバーガ）（結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、肝細胞癌における使用が認可されている）；CDK4、CDK6を標的とするリボシクリブ（Kisqali）（乳癌(HR+, HER2-)における使用が認可されている）；CD20を標的とするリツキシマブ（リツキサン、マブセラ）（非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、関節リウマチ、多発血管炎性肉芽腫症における使用が認可されている）；CD20を標的とするリツキシマブ／ヒアルロニダーゼ、ヒト（リツキサンHycela）（慢性リンパ性白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫における使用が認可されている）；HDACを標的とするロミデプシン（イストダックス）（皮膚T細胞リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫における使用が認可されている）；PARPを標的とするルカパリブ（Rubraca）（卵巣癌における使用が認可されている）；JAK1/2を標的とするルキソリチニブ（Jakafi）（骨髄線維症における使用が認可されている）；IL-6を標的とするシルツキシマブ（Sylvant）（多中心性キャッスルマン病における使用が認可されている）；標的化シプロイセルT（プロベンジ）（前立腺癌における使用が認可されている）；スムーズンドを標的とするソニデギブ（Odomzo）（基底細胞癌における使用が認可されている）；VEGFR、PDGFR、KIT、RAFを標的とするソラフェニブ（ネクサバール）（肝細胞癌、腎細胞癌、甲状腺癌における使用が認可されている）；mTORを標的とするテムシロリムス（トーリセル）（腎細胞癌における使用が認可されている）；CD20を標的とするトシツモマブ（ベキサール）（非ホジキンリンパ腫における使用が認可されている）；MEKを標的とするトラメチニブ（メキニスト）（メラノーマ、非小細胞肺癌における使用が認可されている）；HER2 (ERBB2/neu) を標的とするトラスツズマブ（ハーセプチン）（乳癌(HER2+)、胃癌(HER2+)における使用が認可されている）；EGFR (HER1/ERBB1)、RET、VEGFR2を標的とするバンデタニブ（カプレルサ）（甲状腺髄様癌における使用が認可されている）；BRAFを標的とするベムラフェニブ（ゼルボラフ）（メラノーマにおける使用が認可されている）；BCL2を標的とするベネトクラクス（ベネクレクスタ）（慢性リンパ性白血病における使用が認可されている）；PTCH、スムーズンドを標的とするビスモデギブ（エリベッジ）（基底細胞癌における使用が認可されている）；HDACを標的とするボリノスタット（ゾリンザ）（皮膚T細胞リンパ腫における使用が認可されている）；PIGF、VEGFA/Bを標的とするZiv-アフリベルセプト（ザルトラップ）（結腸直腸癌における使用が認可されている）；等。これらの抗体は、本明細書で提供される抗MDR1抗体との併用療法として投与され得る。
本開示の方法に関連して使用するのに適した生物学的応答調節剤は、限定されるものではないが、 (1) チロシンキナーゼ (RTK) 活性の阻害剤；(2) セリン/トレオニンキナーゼ活性阻害剤；(3) 腫瘍抗原に特異的に結合する抗体などの、腫瘍関連抗原アンタゴニスト；(4) アポトーシス受容体アゴニスト；(5) インターロイキン-2；(6) インターフェロン-α；(7) インターフェロン-γ；(8) コロニー刺激因子；(9) 血管新生阻害剤；および (10) 腫瘍壊死因子のアンタゴニストを含む。
化学療法剤または抗悪性腫瘍薬は、癌細胞の増殖を低減させる非ペプチド性（すなわち非タンパク質性）化合物であり、細胞毒性剤および細胞増殖抑制剤を包含する。化学療法剤の非限定的な例には、アルキル化剤（例えばニトロソ尿素）、抗代謝薬（例えばメトトレキサート）、抗腫瘍抗生物質（例えばアントラサイクリン）、植物アルカロイド（例えばビンカアルカロイド、タキサン等）、トポイソメラーゼ阻害剤、およびステロイドホルモンが含まれる。
細胞増殖を減少させるように作用する薬剤は当技術分野で公知であり、広く使用されている。そのような薬剤としては、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、およびトリアゼンなどのアルキル化剤が挙げられ、これらに限定されるものではないが、メクロレタミン、シクロホスファミド (シトキサン (商標) ) 、メルファラン (L-サルコリシン) 、カルムスチン (BCNU) 、ロムスチン (CCNU) 、セムスチン (メチル-CCNU) 、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、ダカルバジン、およびテモゾロミドが挙げられる。
抗代謝薬には、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤が含まれ、これらに限定されるわけではないが、シタラビン(CYTOSAR-U) 、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル (5-FU) 、フロクスウリジン (FudR) 、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン (6-MP) 、ペントスタチン、5-フルオロウラシル (5-FU) 、メトトレキサート、10-プロパルギル-5,8-ジデアザホレート（PDDF、CB3717）、5,8-ジデアザテトラヒドロ葉酸 (DDATHF) 、ロイコボリン、フルダラビンリン酸、ペントスタチン、およびゲムシタビンが挙げられる。
適切な天然産物およびその誘導体（例えばビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン、エピポドフィロトキシン）としては、Ara-C、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン-C、L-アスパラギナーゼ、アザチオプリン；ブレキナル；例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシンなどのアルカロイド；ポドフィロトキシン、例えばエトポシド、テニポシドなど；抗生物質、例えばアントラサイクリン、塩酸ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン）、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン及びモルホリノ誘導体等；フェノキシゾンビシクロペプチド、例えばダクチノマイシン；ブレオマイシンなどの塩基性糖ペプチド；アントラキノン配糖体、例えばプリカマイシン（ミスラマイシン）；アントラセンジオン、例えばミトキサントロン；マイトマイシンなどのアジリノピロロインドールジオン；シクロスポリン、FK-506 (タクロリムス、プログラフ)、ラパマイシン等の大環状免疫抑制剤；等が挙げられるがこれらに限定されない。。
他の抗増殖性の細胞毒性剤は、ナベルベン、CPT-11、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびドロロキサフィンである。
抗増殖活性を有する微小管作用剤も使用に適しており、これらに限定されるものではないが、アロコルヒチン (NSC 406042) 、ハリコンドリンB (NSC 609395) 、コルヒチン (NSC 757) 、コルヒチン誘導体（例えばNSC 33410）、ドルスタチン10 (NSC 376128) 、メイタンシン (NSC 153858) 、リゾキシン (NSC 332598) 、パクリタキセル (タキソール（登録商標）) 、タキソール（登録商標）誘導体、ドセタキセル (タキソテール（登録商標）) 、チオコルヒチン (NSC 361792) 、トリチルシステリン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、例えばエオプチロンA、エポチロンB、ジスコデルモリドを含むがこれらに限定されない、天然および合成エポチロン；エストラムスチン、ノコダゾール等を含む。
使用に適したホルモン調節剤およびステロイド (合成アナログを含む) としては、副腎皮質ステロイド、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン；エストロゲンおよびプレゲスチン、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェンなど；および副腎皮質抑制薬、例えばアミノグルテチミド；17α-エチニルエストラジオール；ジエチルスチルベストロール、テストステロン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド (ドロゲニル) 、トレミフェン (ファレストン) 、およびゾラデックスなどが挙げられるが、これらに限定されない。エストロゲンは増殖と分化を刺激するため、エストロゲン受容体に結合する化合物がこの活性を遮断するために用いられる。コルチコステロイドはT細胞の増殖を阻害し得る。
他の化学療法剤には、金属錯体、例えばシスプラチン (シス-DDP) 、カルボプラチンなど；尿素、例えばヒドロキシ尿素；およびN-メチルヒドラジンなどのヒドラジン；エピドフィロトキシン；トポイソメラーゼ阻害薬；プロカルバジン；ミトキサントロン；ロイコボリン；テガフール等が含まれる。その他の増殖抑制剤には、免疫抑制剤、例えばミコフェノール酸、サリドマイド、デオキシスペルグアリン、アザスポリン、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン (SKF 105685) 等；イレッサ（登録商標）（ZD 1839, 4-(3-クロロ-4-フルオロフェニルアミノ)-7-メトキシ-6-(3-(4-モルホリニル)プロポキシ)キナゾリン)；等が含まれる。
「タキサン」には、パクリタキセルのほか、活性なタキサンの誘導体またはプロドラッグが含まれる。「パクリタキセル」（例えば、ドセタキセル、タキソール (商標)、タキソテール (商標)（ドセタキセルの製剤）、パクリタキセルの10-デスアセチル類似体およびパクリタキセルの3'N-デスベンゾイル-3'N-t-ブトキシカルボニル類似体などの類似体、製剤および誘導体を含むと本明細書では理解されるべきである）は、当業者に知られた技術を使用して容易に調製することができ（WO 94/07882、WO 94/07881、WO 94/07880、WO 94/07876、WO 93/23555、WO 93/10076；米国特許第5,294,637号；5,283,253号；5,279,949号；5,274,137号；5,202,448号；5,200,534号；5,229,529号；およびEP 590,267も参照）、または、例えば、ミズーリ州セントルイスのSigma Chemical社のような様々な販売会社から入手することができる（Taxus brevifolia由来のT7402；またはTaxus yannanensis由来のT-1912）。
パクリタキセルとは、パクリタキセルの一般的な化学的に利用可能な形態だけでなく、類似体および誘導体（例えば上記のタキソテール(商標)ドセタキセル）およびパクリタキセルコンジュゲート（例えばアブラキサン（アルブミン結合）、パクリタキセル-PEG、パクリタキセル-デキストラン、またはパクリタキセル-キシロース）も指すものと理解されるべきである。
また、用語「タキサン」には、親水性誘導体および疎水性誘導体の両方を含む種々の公知の誘導体が含まれる。タキサン誘導体としては、国際特許出願WO 99/18113に記載されているガラクトースおよびマンノース誘導体；WO 99/14209に記載されているピペラジノおよび他の誘導体；WO 99/09021、WO 98/22451および米国特許第5,869,680号に記載されているタキサン誘導体；WO 98/28288に記載されている6-チオ誘導体；米国特許第5,821,263号に記載のスルフェンアミド誘導体；および米国特許第5,415,869号に記載されたタキソール誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、WO 98/58927；WO 98/13059；および米国特許第5,824,701号に記載されているものを含むパクリタキセルのプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。
有用な免疫療法としては、以下のものが挙げられる：抗PD-1/PD-L1免疫療法、および/または治療方法において標的化され得る他の免疫療法標的、例えば、CTLA-4、LAG-3およびTIM-3などの免疫チェックポイントマーカーなど。抗PD-1/PD-L1免疫療法には、例えば、限定されるものではないが、有効量の1つ以上の抗PD-1/PD-L1治療アンタゴニストを被験者に投与することを含む療法が含まれ、そのようなアンタゴニストには例えばオプジーボ（登録商標）（ニボルマブ）、キイトルーダ（登録商標） (ペムブロリズマブ) 、テセントリック（商標） (アテゾリズマブ) 、デュルバルマブ (MEDI4736) 、アベルマブ (MSB0010718 C) 、BMS-936559 (MDX-1105) 、CA-170、BMS-202、BMS-8、BMS-37、BMS-242などが含まれるが、これらに限定されない。これらの抗体は、本明細書で提供される抗MDR1抗体との併用療法として投与され得る。
CTLA-4はCD152としても知られており、CD80とCD86に結合する。CTLA-4に対する抗体は、一部の種類のがんに対する治療薬として承認されている。CTLA-4と他の免疫療法との共阻害効果により、CTLA-4は、特定の癌を治療するために他の免疫療法と組み合わせて使用するための良好な候補となる。TIM-3もまた、いくつかの癌タイプに対する免疫療法のために標的化され得る。
LAG-3は癌治療について臨床治験中である。抗LAG-3免疫療法には、（LAG-3を下方調節して、事前活性化されたLAG-3+細胞にするシグナルを阻害することによって）Tエフェクター細胞を活性化すると同時に、誘導された（すなわち抗原特異的な）Treg抑制性活性を阻害し得る、アンタゴニストLAG-3抗体を用いるものが含まれる。有用なLAG-3アンタゴニスト抗体としては、relatlimab（BMS-986016；Bristol-Myers Squibbによって開発された）、IMP701（Immutepによって開発された）、TSR-033（抗LAG-3 mAb；TESARO, Inc.によって開発された）などが挙げられる。
免疫療法には、例えば養子細胞療法 (ACT) やキメラ抗原受容体 (CAR) T細胞療法などのT細胞ベースの免疫療法も含まれる。例えば、対象には、その対象の癌によって発現される抗原を標的とするように操作されたCAR T細胞の集団が投与され得る。T細胞ベースの療法は、いくつかの例では、血液試料または腫瘍生検などの細胞試料を対象から得て、その試料からの免疫細胞をex vivoで培養すること（培養免疫細胞の遺伝子改変を伴うまたは伴わない）を含むことができる。一例として、免疫細胞は、対象から得られ、ex vivoで培養され、癌によって発現される抗原に特異的なCARを用いて改変されて、CAR T細胞集団を産生し得る。次に、CAR T細胞を対象に再導入して、癌を標的とすることができる。T細胞に基づく免疫療法は、治療される特定の癌に応じて、種々の方法、例えば、種々の抗原を標的とすること、種々の細胞型を収集/培養することなどによって構成され得る。さらに、T細胞に基づく免疫療法は、全身的に（例えば静脈内注射によって）、または局所的に（例えば注入（例えば、腹腔内注入、胸腔カテーテル注入など）、直接注射など）に投与され得る。
いくつかの例では、本明細書に記載される治療方法は、多剤耐性トランスポーターの1つ以上の阻害剤を対象に投与することを含み得、それは、限定されるものではないが、例えば、MDR1以外の多剤耐性トランスポーターを含む。多剤耐性トランスポーターの有用な阻害剤としては、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、天然産物、マイクロRNA、および低分子阻害剤が含まれる。多剤耐性トランスポーターの阻害剤には、ABCトランスポーター阻害剤が含まれる。
本開示の方法を用いた治療に適した個体には、癌を有する個体；癌と診断された個体；化学療法、放射線療法、抗体療法、手術等による癌治療を受けている個体；癌治療（例えば化学療法、放射線療法、抗体療法、手術等のうちの1つ以上によるもの）を受けてきたが治療に応答しなかった個体；癌治療（例えば化学療法、放射線療法、抗体療法、手術等のうちの1つ以上によるもの）を受け、最初は治療に応答したが、その後再発した、すなわち癌が再発した個体が含まれる。
本開示の方法は、例えば、原発癌、二次癌、再増殖癌、再発癌、難治性癌などを含む種々の癌を標的化し、治療するために使用され得る。例えば、いくつかの例において、本開示の方法は、対象において同定された原発癌の初期治療として使用され得る。いくつかの例において、本開示の方法は、非一次（例えば二次またはそれ以降の）治療として、例えば、前の治療に応答しない癌を有する対象において、前の治療後に再増殖している癌を有する対象において、前の治療に対する混合反応（例えば、対象における少なくとも1つの腫瘍に対するポジティブな反応および対象における少なくとも1つの第2の腫瘍に対するネガティブまたはニュートラルな反応）を有する対象において、使用され得る。
いくつかの例において、本開示の方法は、多剤耐性癌などの薬剤耐性癌を有する対象を治療するために使用され得る。多剤耐性 (MDR) は、多くの癌が化学療法薬に対する耐性を発生させる機序であり、細胞死を最小限に抑え、薬剤耐性腫瘍を拡大させる。MDR癌には、限定されるものではないが、例えば、排出ポンプの発現の増加、薬物の吸収の減少、細胞死またはアポトーシスの阻害、薬物代謝の調節などを含む、1つ以上の耐性機序が関わり得る。いくつかの例では、本開示の方法は、MDRを防止し、逆転させ、または回避することができる。
いくつかの例では、本開示の方法は、第1の薬剤に耐性である癌を有する対象を、有効量の本明細書に記載の抗体で、第1の薬剤とは異なる第2の薬剤と組み合わせて治療することを含み得る。例えば、いくつかの例では、対象の癌は、第1の化学療法に抵抗性であり得、対象は、本明細書に記載される有効量の抗体を、第1のものとは異なる第2の化学療法剤と併用して投与することによって治療され得る。例えば、治療される癌のタイプ、抵抗性を発生する可能性の高さ等に応じて、様々な第1および第2の化学療法剤の組合せが使用され得る。
多数の癌が、薬剤耐性を発生させることが知られている。このことおよび他の理由のために、本開示の方法は、以下のものを含むがこれらに限定されない様々な癌を治療することに用途を見出し得る：例えば、
急性リンパ性白血病 (ALL)、急性骨髄性白血病 (AML)、副腎皮質細胞腫、AIDS関連癌 (例えばカポジ肉腫、リンパ腫等)、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍、基底細胞腫、胆管癌 (肝外)、膀胱癌、骨癌 (例えばEwing肉腫、骨肉腫および悪性線維性組織球腫等)、脳幹神経膠腫、脳腫瘍 (例えば星状細胞腫、中枢神経系胚性腫瘍、中枢神経系生殖細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、等)、乳癌 (例えば女性乳癌、男性乳癌、小児乳癌、等)、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍 (例えば小児期、胃腸管系、等)、原発不明細胞腫、心（心臓）腫瘍、中枢神経系 (例えば非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍、胚性腫瘍、生殖細胞腫瘍、リンパ腫、等)、頸部癌、小児癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病 (CLL)、慢性骨髄性白血病 (CML)、慢性骨髄性腫瘍、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚性T細胞リンパ腫、管 (例えば胆管、肝外、等)、非浸潤性乳管癌 (DCIS)、胎児性腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、Ewing肉腫、頭蓋外生殖細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌 (例えば眼球内メラノーマ、網膜芽細胞腫、等)、骨の線維性組織球腫(例えば悪性、骨肉腫、等)、胆嚢癌、胃癌、胃腸管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍 (GIST)、生殖細胞腫瘍 (例えば頭蓋外、性腺外、卵巣、精巣、等)、妊娠性絨毛疾患、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞性 (肝臓) 癌、組織球症 (例えばランゲルハンス細胞、等)、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内メラノーマ、島細胞腫瘍 (例えば膵神経内分泌腫瘍、等)、カポジ肉腫、腎臓癌 (例えば腎細胞、Wilms腫瘍、小児期腎腫瘍、等)、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病 (例えば急性リンパ性白血病 (ALL)、急性骨髄性白血病 (AML)、慢性リンパ性白血病 (CLL)、慢性骨髄性白血病 (CML)、有毛細胞、等)、口唇・口腔癌、肝臓癌 (原発)、非浸潤性小葉癌 (LCIS)、肺癌 (例えば非小細胞、小細胞、等)、リンパ腫 (例えば AIDS関連、バーキット、皮膚T細胞、ホジキン、非ホジキン、原発性中枢神経系 (CNS)、等)、マクログロブリン血症 (例えばワルデンストレーム、等)、男性乳癌、悪性の骨線維性組織球腫および骨肉腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、中皮腫、原発不明の転移性扁平上皮頸部癌、NUT遺伝子が関わる正中線癌、口癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成/骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病 (例えば慢性 (CML)、等)、骨髄球性白血病 (例えば急性 (AML)、等)、骨髄増殖性腫瘍 (例えば慢性、等)、鼻腔および副鼻洞癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口部癌、口腔癌 (例えば唇部等)、口咽頭癌、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌 (例えば上皮性、生殖細胞腫瘍、低悪性度腫瘍、等)、膵臓癌、膵神経内分泌腫瘍 (島細胞腫瘍)、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻洞および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽細胞腫、原発性中枢神経系(CNS) リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞 (腎臓) 癌、腎盂・尿管、移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫 (例えばEwing、Kaposi、骨肉腫、横紋筋肉腫、軟部組織、子宮、等)、セザリー症候群、皮膚癌 (例えば小児期、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、非メラノーマ、等)、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織、扁平上皮細胞癌腫、扁平上皮頸部癌 (例えば原発不明性、転移性、等)、胃癌、T-細胞リンパ腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫および胸腺細胞腫、甲状腺癌、腎盂・尿管の移行細胞癌、尿管・腎盂癌、尿道癌、子宮癌 (例えば子宮内膜、等)、子宮肉腫、腟癌、外陰部癌、ワルデンストレームマクロマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、等。
本明細書に記載される治療方法は、いくつかの例において、1つ以上の従来型治療を以前に受けた対象において実施され得る。例えば、腫瘍科の場合、ここに記載される方法は、いくつかの例において、従来型の癌治療（例えば、限定されるものではないが、従来型の化学療法、従来型の放射線療法、従来型の免疫療法、手術等を含む）の後に実施され得る。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、対象が従来型の治療に応答しなかったか、または難治性である場合に使用され得る。いくつかの例では、本明細書に記載される方法は、対象が従来型の治療に応答した場合に使用され得る。
いくつかの例では、本開示の方法は、先行する癌治療後に残存する微小残存病変 (MRD) について対象を標的化し、治療し、または一掃するために使用され得る。MRDの標的化、治療および/またはクリアランスは、MRDが前治療に対して不応性であるかまたは不応性と判定されたか否かにかかわらず、本方法を用いて追求することができる。いくつかの例では、本開示の方法は、先行治療、または本明細書に記載の多特異性抗体を使用するもの以外の1つ以上の利用可能な治療選択肢に対してMRDが難治性であるという決定の後、MRDについて対象を標的化し、治療し、および/または一掃するために使用され得る。
特定の実施形態では、本明細書中の抗体は、MDR1発現またはMDR1過剰発現血液癌および固形腫瘍の治療において使用され得、それには非限定的に、1つ以上の化学療法剤および／または生物学的薬剤に応答しないか、または応答が乏しいか、または耐性もしくは抵抗性である癌が含まれ、多剤耐性癌が含まれる。特定の実施形態では、本発明の抗体によって治療される癌は、4-1BB (すなわちCD137)、CD27および／またはCD28などの別の補助刺激分子をさらに発現または過剰発現するものである。
好ましくは、本発明の抗MDR1抗体によって治療され得る癌は、CD47をさらに過剰発現し、これはヒト悪性腫瘍において免疫調節的役割を果たすこと、ならびに腫瘍浸潤および転移におけるその関与が知られている細胞表面分子である。MDR1およびCD47の両方を発現する癌の治療に使用される抗MDR1抗体は、好ましくは、MDR1およびCD47の両方に対する結合親和性を有する多特異性（例えば二重特異性）である。
本明細書に開示される抗体は、単一の薬剤 (単剤療法) として、または他の治療様式と組み合わせて、そのような癌を治療するために使用され得る。他の治療様式には、例えば、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、またはそれらの組み合わせなどの少なくとも1つの追加の活性剤の投与が含まれる。該治療は、化学療法薬および／または生物学的製剤の有効量の減少、副作用の軽減または回避、および／または難治性または薬物耐性 (多剤耐性を含む) 癌を有する患者の治療反応の改善を含め、他の治療選択肢に対する腫瘍反応を改善させ得る。標的腫瘍は、限定されるものではないが、急性骨髄性白血病 (AML) および急性リンパ芽球性白血病 (ALL) のような白血病、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、乳癌、尿路上皮癌、腎臓癌、および肺癌を含む。1つの実施形態において、本明細書における抗MDR1抗体の投与は、パクリタキセルおよび／またはドセタキセルなどのタキサン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、またはイダルビシンなどのアントラサイクリン、特にドキソルビシン、および／またはビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、またはビノレルビンなどのビンカアルカロイド、特にビンブラスチンまたはビンクリスチンによる治療に対する患者の応答を改善させる。
いくつかの例において、本発明の方法は、監視のために予防的に使用することができる。例えば、それを必要とする対象は、検出可能な疾患を有していないが再発癌（例えば薬剤耐性癌を含む）を発症するリスクがある場合に、本明細書に記載の単特性または多特異性抗体の1つ以上を含む治療の投与を受け得る。いくつかの例では、対象が、薬剤耐性であると予測されるかまたは薬剤耐性になると予測される原発癌を発症する特に高いリスクを有する場合に、予防的アプローチが使用され得る。場合によっては、対象が以前に癌の治療を受けており、再発または薬剤耐性の発現のリスクがある場合に、予防的アプローチが採用され得る。
いくつかの例では、本開示の方法は、1以上のマーカーまたは治療標的の発現について癌を分析することを含み得る。例えば、いくつかの例において、方法は、対象からの癌の試料を分析して、癌が所定の閾値を超えるMDR1、所定の閾値を超える癌関連抗原、またはその両方を発現するか否かを決定することを含み得る。
いくつかの例において、対象が本開示の抗体で治療されるかどうかは、MDR1発現の評価の結果、癌関連抗原発現の評価の結果、またはその両方に依存し得る。例えば、いくつかの例では、もし癌が所定の閾値以上でMDR1を発現する場合には対象が本開示の抗MDR1抗体または本開示の多特性抗体で処置され、もし癌が所定の閾値未満でMDR1を発現する場合には、対象は抗MDR1抗体で処理されないが本開示の多特性抗体で処置されるようにしてもよい。
MDR1および/または癌関連抗原のレベルを分析するために、任意の簡便なアッセイを使用することができ、これには、例えば、フローサイトメトリー、核酸に基づくアッセイ（例えば増幅、配列決定等）、細胞サイトメトリー、免疫組織化学などが含まれるが、これらに限定されない。任意の簡便な生物学的試料を使用することができ、これには、例えば、癌生検試料が含まれるが、これに限定されない。1つ以上のマーカーおよび/または標的の発現を評価するための有用な所定の閾値は、測定された発現レベルと対応する対照との比較を含め、任意の簡便かつ適切な方法によって決定することができる。例えば、いくつかの例において、試料においてアッセイされるMDR1および/または癌関連抗原のレベルについての有用な所定の閾値は、健常/正常細胞などの参照細胞において測定されるMDR1および/または癌関連抗原のレベルに対応し得る。
［製造の方法］
上記に要約されたように、本開示の方法は、本明細書に記載された抗体を作製および/または同定するための方法も含む。対象抗体は、公知の方法、例えば、タンパク質合成のための従来の合成方法；組換えDNA法；等によって作製され得る。
対象抗体が単鎖ポリペプチドである場合、それは、標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて合成することができる。ポリペプチドが化学的に合成される場合、合成は液相または固相を介して進行し得る。固相ポリペプチド合成 (SPPS) は、対象抗体の化学合成のための適切な方法の一例であり、そこでは配列のC末端アミノ酸が不溶性支持体に結合され、続いて配列中の残りのアミノ酸が連続的に付加される。FmocおよびBocなどの様々な形態のSPPSが、対象抗体を合成するために利用可能である。
対象抗体の産生には、標準的な組換え方法を用いることができる。例えば、（場合により定常領域に連結された）軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸を発現ベクターに挿入する。軽鎖および重鎖は、同一または異なる発現ベクター中にクローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードするDNAセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター（複数可）中の制御配列に作動可能に連結される。発現制御配列は、限定されるものではないが、プロモーター（例えば、自然界で付随するプロモーターまたは異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント、および転写終結配列を含む。発現制御配列は、真核生物宿主細胞（例えば、COSまたはCHO細胞）を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクターにおける真核生物プロモーター系であり得る。一旦ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、そのヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに抗体の収集および精製に適した条件下で維持される。
遺伝コードの縮重のために、種々の核酸配列が各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードすることができる。所望の核酸配列は、デノボの固相DNA合成によって、または所望のポリヌクレオチドの以前に調製されたバリアントのポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 突然変異誘発によって生成され得る。オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は、標的ポリペプチドDNAの置換、欠失および挿入バリアントを調製するための適切な方法の一例である。Adelman et al., DNA 2:183 (1983) を参照されたい。簡単に説明すると、標的ポリペプチドDNAは、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを一本鎖DNA鋳型にハイブリダイズさせることによって改変される。ハイブリダイゼーション後、DNAポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込み標的ポリペプチドDNAにおいて選択された改変をコードする、鋳型の第2の相補鎖全体を合成する。
適切な発現ベクターは、典型的には、宿主生物においてエピソームとして、または宿主染色体DNAの一体化部分として複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のDNA配列で形質転換された細胞の検出を可能にする選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含む。
Escherichia coliは、対象抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングするために使用することができる原核生物宿主細胞の例である。使用に適した他の微生物宿主には、Bacillus subtilisのような桿菌、およびSalmonella、Serratia、および様々なPseudomonas種のような他の腸内細菌科が含まれる。
酵母のような他の微生物も発現に有用である。Saccharomyces（例えばS. cerevisiae）およびPichiaは、適切な酵母宿主細胞の例であり、適切なベクターは、発現制御配列（例えばプロモーター）、複製起点、終結配列などを必要に応じて有する。典型的なプロモーターとしては、3-ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖系酵素が挙げられる。誘導可能な酵母プロモーターには、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムC、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素からのプロモーターが含まれる。
微生物に加えて、哺乳動物細胞（例えば、in vitro細胞培養で増殖させた哺乳動物細胞）を用いて本発明のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンまたはその断片をコードするポリヌクレオチド）を発現および生産することもできる。Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987) 参照。適切な哺乳動物宿主細胞としては、CHO細胞株、種々のCos細胞株、HeLa細胞、HEK細胞、骨髄腫細胞株、および癌化B細胞またはハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)）、ならびにリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。適切な発現制御配列の例は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターである。Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)参照。
（化学的にまたは組み換え技術によって）一旦合成されると、全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または対象抗体の他の形態（例えばscFv等）は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 精製、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる（一般的にはScopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)参照）。対象抗体は、実質的に純粋であり得、例えば、少なくとも約80%～85%純粋、少なくとも約85%～90%純粋、少なくとも約90%～95%純粋、もしくは98%～99%、またはそれ以上純粋であり得、例えば、細胞残渣、対象抗体以外の巨大分子などの混入物を含まない。
いくつかの態様において、本開示の多特異性抗体を作製する方法は、候補抗体の作製および活性についてのスクリーニングを含み得る。このような方法は、一連の工程の使用を通じて、MDR1および癌関連抗原の両方を発現する細胞に特異的に結合する多特異性抗体を生成し得る。このような方法の工程は、多特異性抗体、あるいはそれぞれがMDR1結合ドメインと癌関連抗原結合ドメインとを含むかまたは含むと予想される複数の抗体を産生すること；MDR1および癌関連抗原を発現する第1の試験細胞を上記多特異性抗体あるいは複数の抗体と接触させること；MDR1または癌関連抗原のいずれかを発現する第2の細胞を上記多特異性抗体あるいは複数の抗体と接触させること；第1の細胞への上記多特異性抗体の結合を、第2の細胞への多特異性抗体の結合と比較して、結合特異性比を決定すること；そしてその比が所定の閾値を超える場合に、上記多特異性抗体あるいは複数の抗体のうちの1つまたは複数を、MDR1および癌関連抗原の両方を発現する細胞に対して特異的であるとして同定することを含む。比較結合のためのそのような閾値が使用される場合において、閾値は変動し得、1.5:1以上の範囲であり得、例えば、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、50:1、100:1等を含むが、これらに限定されない。
このような方法では、例えば本明細書に記載された細胞を含むがこれに限定されない種々の細胞を使用することができる。いくつかの例では、MDR1のみを発現する細胞および癌関連抗原のみを発現する細胞の両方に対して抗体の結合が実施され得る。例えば、いくつかの例では、この方法は、上述した工程に関連して、第2の細胞がMDR1を発現するが癌関連抗原を発現しない場合において、さらに、癌関連抗原を発現するがMDR1を発現しない第3の細胞に多特異性抗体を接触させることを含む。
いくつかの例では、そのような方法は、例えば、対照細胞、対照試薬等を含むがこれらに限定されない、1つ以上の対照を使用し得る。有用な対照細胞としては、1つ以上の関連遺伝子またはタンパク質の発現が既知であるか、またはその発現欠如が既知であるものが挙げられる。有用な対照試薬は、限定されるものではないが、例えば、既知の標的に対する単一特異性抗体などの対照抗体を含み得る。例えば、いくつかの例では、本開示のそのような方法は、第1の細胞、第2の細胞、および/または第3の細胞を、単一特異性抗MDR1抗体および単一特異性抗癌関連抗原抗体から選択される対照抗体と接触させることをさらに含み得る。使用される特定の方法に応じて、必要に応じて、種々の他の又は追加の対照が使用され得る。
［キット］
本開示の態様は、キットも含む。キットは、例えば、本明細書に記載の抗体、多特異性抗体、試薬、組成物、製剤、細胞、核酸、発現ベクター等の任意の組み合わせを含み得る。対象キットは、当該抗体、それをコードする核酸、または当該核酸を含む細胞のうちの1つ以上を含むことができる。キットは、例えば、治療キット（例えば、キットが抗MDR1抗体または多特異性抗体および例えば化学療法剤等の1つ以上のさらなる活性剤を含み得る場合）、抗体を産生するためのキット、抗体をスクリーニングするためのキット等を含む、様々な目的のために構成され得る。
キットのオプション的構成要素は様々であり、例えば以下のものを含むことができる：緩衝液；プロテアーゼ阻害剤；等。例えば、対象キットが対象核酸を含む場合、その核酸は制限部位、複数のクローニング部位、プライマー部位等を有していてもよい。キットの種々の構成要素は、別々の容器に存在していてもよいし、あるいは特定の適合する構成要素は、所望により、単一の容器中に予め組み合わされていてもよい。
上記の構成要素に加えて、本キットは、本方法を実施するためにキットの構成要素を使用することについての指示書を含むことができる。対象方法を実施するための指示書は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷されてもよい。そのようなものとして、指示書は、パッケージインサートとして、キットまたはその構成要素の容器のラベルにおいて（すなわち、包装又は小分け包装に付随して）存在してもよい。他の実施形態では、指示書は、適切なコンピュータ読み取り可能記憶媒体、例えばコンパクトディスク読み取り専用メモリ(CD-ROM) 、デジタル多用途ディスク (DVD) 、ディスケットなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示書はキット中には存在しないが、例えばインターネットを介して遠隔ソースから指示書を得るための手段が提供される。この実施形態の一例は、指示書を見ることおよび/またはダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示書の場合と同様に、指示書を得るためのこの手段は、適切な基材上に記録される。
［本開示の非限定的な態様の例］
上述した本主題の態様 (実施形態を含む) は、単独で、または1つ以上の他の態様もしくは実施形態と組み合わせて有益となり得る。前述の説明を限定することなく、本開示の特定の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読めば当業者には明らかなように、個々に番号付けされた態様の各々は、先行または後続の個々に番号付けされた態様のいずれかと一緒に使用または組み合わせられ得る。これは、複数の態様のそのようなすべての組合せについてのサポートを提供することを意図しており、以下に明示的に提供される態様の組合せに限定されない。本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を行うことができることは、当業者には明らかであろう。
１．
多剤耐性タンパク質1（MDR1）に特異的に結合する抗体であって、表2に記載された抗体の可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域の対の重鎖相補性決定領域1～3（HCDR 1～3）および軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）を含む抗体と、MDR1への結合について競合する、抗体。
２．
表2に記載された抗体の可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）領域の対を含む抗体と、MDR1への結合について競合する、態様１に記載の抗体。
３．
表2に記載された抗体B1.28、B1.261、B1.129、B1.225、およびB1.223からなる群より選択される抗体と、MDR1への結合について競合する、態様１に記載の抗体。
４．
表2に記載された抗体のVH領域のHCDRを含む、態様１に記載の抗体。
５．
表2に記載された抗体のVL領域のLCDRを含む、態様１または２に記載の抗体。
６．
表2に記載された抗体の可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域の対の重鎖相補性決定領域（HCDR）および軽鎖CDR（LCDR）を含む、態様１に記載の抗体。
７．
多剤耐性タンパク質1（MDR1）に特異的に結合する抗体分子であって、前記抗体分子の抗原結合部位が、
表2に記載された抗体の可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域の対の重鎖相補性決定領域1～3（HCDR 1～3）および軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）；
表2に記載された抗体のVH領域のHCDR 1～3；または
表2に記載された抗体のVL領域のLCDR 1～3
を含む、抗体分子。
８．
表2に記載された抗体のVH領域およびVL領域の対のHCDR 1～3およびLCDR 1～3を含む、態様７に記載の抗体分子。
９．
表2に記載された第1の抗体のVH領域のHCDR 1～3を含む、態様７に記載の抗体。
１０．
表2中の第2の抗体のVL領域のLCDR 1～3を含む、態様７に記載の抗体分子。
１１．
表2に記載された抗体の可変軽（VL）鎖および／または可変重（VH）鎖を含む、態様７に記載の抗体分子。
１２．
(i) B1.28抗体のVH領域のHCDR 1～3およびB1.28抗体のVL領域のLCDR 1～3;
(ii) B1.261抗体のVH領域のHCDR 1～3およびB1.261抗体のVL領域のLCDR 1～3;
(iii) B1.129抗体のVH領域のHCDR 1～3およびB1.129抗体のVL領域のLCDR 1～3;
(iv) B1.225抗体のVH領域のHCDR 1～3およびB1.225抗体のVL領域のLCDR 1～3;
(v) B1.188抗体のVH領域のHCDR 1～3およびB1.188抗体のVL領域のLCDR 1～3;
(vi) B1.27抗体のVH領域のHCDR 1～3およびB1.27抗体のVL領域のLCDR 1～3;
または
(vii) B1.223抗体のVH領域のHCDR 1～3およびB1.223抗体のVL領域のLCDR 1～3
を含み、ここで、前記VHおよびVL領域は表2に記載されたものである、
態様８に記載の抗体分子
１３．
ヒトMDR1およびカニクイザルMDR1に結合する、態様７～１２のいずれか一項に記載の抗体分子。
１４．
B1.129抗体のVH領域のHCDR 1～3およびB1.129抗体のVL領域のLCDR 1～3、B1.28抗体のVH領域のHCDR 1～3およびB1.28抗体のVL領域のLCDR 1～3を含むか、または、B1.261抗体のVH領域のHCDR 1～3およびB1.261抗体のVL領域のLCDR 1～3を含む、態様１３に記載の抗体分子。
１５．
MDR1の細胞外ドメインにおけるループ1に結合する、態様７～１４のいずれか一項に記載の抗体分子。
１６．
B1.129抗体のVH領域のHCDR 1～3およびVL領域のLCDR 1～3、またはB1.223抗体のVH領域のHCDR 1～3およびVL領域のLCDR 1～3を含む、態様１５に記載の抗体分子。
１７．
癌細胞による、カルセイン、ダウノルビシン（Dioc2）、およびローダミンのうちの1つ以上の排出を阻害する、態様７～１６のいずれか一項に記載の抗体分子。
１８．
前記癌細胞が、MDR1を過剰発現する293T細胞である、態様１７に記載の抗体分子。
１９．
前記癌細胞がMES-SA-DX5癌細胞である、態様１７に記載の抗体分子。
２０．
B1.129抗体のVH領域のHCDR 1～3およびVL領域のLCDR 1～3を含む、態様１７～２０のいずれか一項に記載の抗体分子。
２１．
細胞表面上に発現されたMDR1に特異的に結合する抗体分子であって、以下のいずれかを含む、抗体分子：
(i) アミノ酸配列GFTFSRY（配列番号343）を含む重鎖相補性決定領域（HCDR）1と；アミノ酸配列SSGGGN（配列番号344）を含むHCDR2と；アミノ酸配列GAGDAWFAY（配列番号345）を含むHCDR3とを含む、可変重（VH）鎖；および、アミノ酸配列RSSQNIVHSTGNTYLD（配列番号11）を含む軽鎖相補性決定領域（LCDR）1と；アミノ酸配列KVSNRFS（配列番号12）を含むLCDR2と；アミノ酸配列FQGSHIPRT（配列番号13）を含むLCDR3とを含む、可変軽（VL）鎖；
(ii)アミノ酸配列
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号287）
を含むVH鎖；および、アミノ酸配列
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQNIVHSTGNTYLDWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCFQGSHIPRTFGQGTKLEIK（配列番号20）
を含むVL鎖；
(iii) アミノ酸配列
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号309）
を含む重鎖；および、アミノ酸配列
DVVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHSTGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPRTFGQGTKLEIK（配列番号21）
を含む軽鎖；
(iv) アミノ酸配列GYTFTNY（配列番号346）を含むHCDR1と；アミノ酸配列YPGNDD（配列番号347）を含むHCDR2と；アミノ酸配列GGYRAMDY（配列番号308）を含むHCDR3とを含む、VH鎖；および、アミノ酸配列RSSQNIVHSTGNTYLD（配列番号11）を含むLCDR1と；アミノ酸配列KVSNRFS（配列番号12）を含むLCDR2と；アミノ酸配列FQGSHIPRT（配列番号13）を含むLCDR3とを含む、VL鎖；
(v) アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS（配列番号294）
を含むVH鎖およびアミノ酸配列
DVVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHSTGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPRTFGQGTKLEIK（配列番号21）
を含む軽鎖；
(vi) アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号310）
を含む重鎖およびアミノ酸配列
DVVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHSTGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPRTFGQGTKLEIK（配列番号21）
を含む軽鎖；
(vii) アミノ酸配列GFTFSRY（配列番号343）を含むHCDR1と；アミノ酸配列SSGGGN（配列番号344）を含むHCDR2と；アミノ酸配列GAGDAWFAY（配列番号345）を含むHCDR3とを含む、VH鎖；および、アミノ酸配列RSSQSLVHSNGNTYLE（配列番号290）を含むLCDR1と；アミノ酸配列KVSNRFS（配列番号12）を含むLCDR2と；アミノ酸配列QGSHFPRT（配列番号348）を含むLCDR3とを含む、VL鎖；
(viii) アミノ酸配列
evkvvesggvlvrpggslklscaasgftfsrytmswvrqtpekrlewvatissgggntyypdsvkgrftvsrdnamsslylqmsslrsedtalyycarygagdawfaywgqgtlvtvss（配列番号287）
を含むVH鎖；およびアミノ酸配列
DIVMTQSPLSLPVSLGDPASISCRSSQSLVHSNGNTYLEYYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号311）
を含むVL鎖；
(ix) アミノ酸配列
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号309）
を含む重鎖およびアミノ酸配列
DIVMTQSPLSLPVSLGDPASISCRSSQSLVHSNGNTYLEYYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号311）
を含む軽鎖；
(x) アミノ酸配列GYTFTNY（配列番号346）を含むHCDR1と；アミノ酸配列YPGNDD（配列番号347）を含むHCDR2と；アミノ酸配列GGYRAMDY（配列番号308）を含むHCDR3とを含む、VH鎖；および、アミノ酸配列RSSQSLVHSNGNTYLE（配列番号290）を含むLCDR1と；アミノ酸配列KVSNRFS（配列番号12）を含むLCDR2と；アミノ酸配列QGSHFPRT（配列番号348）を含むLCDR3とを含む、VL鎖；
(xi) アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS（配列番号294）を含むVH鎖およびアミノ酸配列
DIVMTQSPLSLPVSLGDPASISCRSSQSLVHSNGNTYLEYYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号311）
を含む軽鎖；
(xii) アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号310）
を含む重鎖およびアミノ酸配列
DIVMTQSPLSLPVSLGDPASISCRSSQSLVHSNGNTYLEYYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号311）
を含む軽鎖；
(xiii) アミノ酸配列GFTFSRY（配列番号343）を含むHCDR1と；アミノ酸配列SSGGGN（配列番号344）を含むHCDR2と；アミノ酸配列GAGDAWFAY（配列番号345）を含むHCDR3とを含む、VH鎖；および、アミノ酸配列RSSQTIVHSNGNTYLE（配列番号39）を含むLCDR1と；アミノ酸配列KVSKRFS（配列番号40）を含むLCDR2と；アミノ酸配列FQASHFPRT（配列番号329）を含むLCDR3とを含む、VL鎖；
(xiv) アミノ酸配列
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号287）
を含むVH鎖；およびアミノ酸配列
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号313）
を含むVL鎖；
(xv) アミノ酸配列
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号309）
を含む重鎖およびアミノ酸配列
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号313）
を含むVL鎖；
(xvi) アミノ酸配列GYTFTNY（配列番号346）を含むHCDR1と；アミノ酸配列YPGNDD（配列番号347）を含むHCDR2と；アミノ酸配列GGYRAMDY（配列番号308）を含むHCDR3とを含む、VH鎖；および、アミノ酸配列RSSQTIVHSNGNTYLE（配列番号39）を含むLCDR1と；アミノ酸配列KVSKRFS（配列番号40）を含むLCDR2と；アミノ酸配列FQASHFPRT（配列番号329）を含むLCDR3とを含む、VL鎖；CDR 5F9/ VL B1-89v1
(xvii) アミノ酸配列
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftnynmhwvrqapgqrlewmgtiypgnddtsynqkfkdrvtitadtsastaymelsslrsedtavyycarggyramdywgqgtlvtvss（配列番号294）
を含むVH鎖およびアミノ酸配列
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号313）
を含む軽鎖；または、
(xviii) アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号310）
を含む重鎖およびアミノ酸配列
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号313）
を含む軽鎖。
２２．
多剤耐性タンパク質1（MDR1）および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する二重特異性抗体分子であって、2つの同一の可変軽（VL）鎖、第1の可変重（VH）鎖、および第2のVH鎖を含み、ここで、前記VL鎖はそれぞれMDR1に対する抗原結合部位を含み、前記第1のVH鎖はMDR1に対する抗原結合部位を含み、そして前記第2のVH鎖はTAAに対する抗原結合部位を含み、前記第2のVH鎖は前記軽鎖の1つと対合した場合にTAAに結合する、二重特異性抗体分子。
２３．
前記2つのVL鎖の抗原結合部位が、表2に記載された抗体の軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）を含む、態様２２に記載の二重特異性抗体分子。
２４．
前記第1のVH鎖の抗原結合部位が、表2に記載された抗体の重鎖CDR 1～3（HCDR 1～3）を含む、態様２２または２３に記載の二重特異性抗体分子。
２５．
前記第1のVH鎖が、表2に記載された抗体以外の抗MDR1抗体のHCDR 1～3を含み、任意で、前記第1のVH鎖は、表2に記載された抗体以外の抗MDR1抗体のVH鎖のアミノ酸配列を含む、態様２２または２３に記載の二重特異性抗体分子。
２６．
前記抗MDR1抗体が、以下のものを含む、態様２５に記載の二重特異性抗体分子：
アミノ酸配列
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA（配列番号293）
を有する15D3抗体のVH鎖；
アミノ酸配列
AVQLQQSGPELVKTGASVKISCKASGYSFSNYYIHWVKQSHGKSLEWIGFISCYNGATFYNQKFKGKATFTVDTSSSTAYMKFNSLTFEDSAVYYCARLPIQFGNFYPMDYWGQGTSVTVSS（配列番号288）
を有するUIC2抗体のVH鎖；または
アミノ酸配列
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARYYRYEAWFASWGQGTLVTVSA（配列番号286）
を有するMRK16抗体のVH鎖。
２７．
前記抗MDR1抗体が、アミノ酸配列
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号292）
を有するVH鎖を含み、ここでX2はN、QまたはSであり、任意でX2はQまたはSである、態様２６に記載の二重特異性抗体分子。
２８．
VL鎖が、表2に記載されたB1-28抗体のLCDR 1～3を含み、
任意で、前記VL鎖は表2に記載されたB1-28抗体のVL鎖のアミノ酸配列を含むか、または、
VL鎖が、アミノ酸配列
LWVPGSTGDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号289）を含むVL鎖を有する抗MDR1 V6抗体のLCDR 1～3を含み、
任意で、前記VL鎖は前記V6抗体のVL鎖のアミノ酸配列を含む、
態様２２～２７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
２９．
VL鎖が、表2に記載された抗体以外の抗MDR1抗体のLCDR 1～3を含み、任意で、軽鎖は、表2に記載された抗体以外の抗体のVL鎖のアミノ酸配列を含む、態様２２または２４に記載の二重特異性抗体分子。
３０．
前記抗MDR1抗体が、
アミノ酸配列
DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK（配列番号283）
を含むMRK16抗体の可変軽鎖；
アミノ酸配列
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK（配列番号284）
を含む15D3抗体の可変軽鎖；または
アミノ酸配列
DVVMTQTPRSLPVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPPWTFGGGTKLDIK（配列番号285）
を含むUIC2抗体の可変軽鎖
のLCDR 1～3を含む、態様２９に記載の二重特異性抗体分子。
３１．
前記抗体が、MDR1を発現する細胞に結合したときに、MDR1による排出を阻害する、前記態様のいずれかに記載の抗体分子または二重特異性抗体分子。
３２．
前記抗体が、化学療法剤による治療に対する癌細胞の感受性を増大させることができ、ここで、前記抗体と共投与された場合の前記化学療法剤の半最大阻害濃度（IC50）が、
以下の配列
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSA（配列番号293）
を有するVH鎖、および
以下の配列
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTRLEIK（配列番号284）
を有するVL鎖
を含む抗MDR1抗体と共投与された場合の前記化学療法剤のIC50より少なくとも5倍低い、態様２２～３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
３３．
前記TAAがCD47である、態様２２～３２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子。
３４．
前記二重特異性抗体は、抗CD47抗体5F9のVH領域のHCDR 1～3を含み、前記VH領域が以下のアミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS（配列番号294）
を含むか、または、
前記二重特異性抗体は、抗CD47抗体B6H12のVH領域のHCDR 1～3を含み、前記VH領域が以下のアミノ酸配列
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYGMSWVRQTPDKRLEWVATITSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQIDSLKSEDTAIYFCARSLAGNAMDYWGQGTSVTVSS（配列番号295）
を含む、態様３３に記載の二重特異性抗体分子。
３５．
前記第1のVH鎖が、以下のHCDR配列を有する抗MDR1抗体由来のVH鎖のHCDR 1～3を含み：HCDR1: RYTMS（配列番号301）、HCDR2: TISSGGGNTYYPDSVKG（配列番号302）、TISSGGGQTYYPDSVKG（配列番号303）、またはTISSGGGSTYYPDSVKG（配列番号304）、およびHCDR3: ARYGAGDAWFAY（配列番号349）；
VL鎖が、それぞれ、表2に記載されたB1-28抗体のVL領域のLCDR 1～3を含み、ここでLCDR配列は、LCDR1: RSSQNIVHSTGNTYLD（配列番号11）、LCDR2: KVSNRFS（配列番号12）、およびLCDR3: FQGSHIPRT（配列番号13）である、
態様３４に記載の二重特異性抗体分子。
３６．
前記第1のVH鎖が、
EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS（配列番号291）
を含むアミノ酸配列を含み、ここでX2はN、QまたはSであり、
前記第2のVH鎖が、
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS（配列番号294）
を含むアミノ酸配列を含み、
2つのVL鎖は、表2に記載されたB1-28抗体のVL領域鎖を含むアミノ酸配列を含む、
態様３５に記載の二重特異性抗体分子。
３７．
前記第1のVH鎖は、表2に記載の(i) B1.28抗体；(ii) B1.30抗体；(iii) B1.89抗体；(iv) B1.129抗体；(v) B1.225；(vi) B1.261抗体のVH鎖のHCDR 1～3；または、15D3もしくはMRK16抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含み；
前記同一のVL鎖はそれぞれ、(i) MRK16抗体のVL鎖のLCDR 1～3、または (ii) V6抗体のVL鎖のLCDR 1～3を含み；かつ
前記第2のVH鎖は、5F9抗体またはB6H12抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む、
態様２２に記載の二重特異性抗体分子。
３８．
前記第1のVH鎖は、表2に記載の(i) B1.188抗体；(ii) B1.28抗体；(iii) B1.261抗体；(iv) B1.129抗体；または(v) B1.223抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含み、前記同一のVL鎖はそれぞれMRK16抗体のVL鎖のLCDR 1～3を含み；かつ前記第2のVH鎖は、5F9抗体またはB6H12抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む、態様２２に記載の二重特異性抗体分子。
３９．
前記第1のVH鎖は、表2に記載の(i) B1.188抗体；(ii) B1.28抗体；(iii) B1.261抗体；(iv) B1.129抗体；または (v) B1.223抗体のVH鎖を含み、前記同一のVL鎖はそれぞれMRK16抗体のVL鎖を含み、前記第2のVH鎖は、5F9抗体またはB6H12抗体のVH鎖を含む、態様３８に記載の二重特異性抗体分子。
４０．
前記第1のVH鎖が、表2に記載のB1.225抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含み、前記同一のVL鎖はそれぞれMRK16抗体のVL鎖のLCDR 1～3を含み、前記第2のVH鎖は、5F9抗体またはB6H12抗体のVH鎖のHCDR 1～3を含む、態様２７に記載の二重特異性抗体分子。
４１．
前記第1のVH鎖が、表2に記載のB1.225抗体のVH鎖を含み、前記同一のVL鎖はそれぞれMRK16抗体のVL鎖を含み、前記第2のVH鎖は5F9抗体のVH鎖を含む、態様４０に記載の二重特異性抗体分子。
４２．
前記抗体がヒト化軽鎖を含む、前記態様のいずれかに記載の抗体分子または二重特異性抗体分子。
４３．
前記抗体がヒト化重鎖を含む、前記態様のいずれかに記載の抗体分子または二重特異性抗体分子。
４４．
対象における癌を治療する方法における使用のための、前記態様のいずれか一項に記載の抗体分子または二重特異性抗体分子であって、前記方法は、前記抗体を前記対象に投与することを含む、抗体分子または二重特異性抗体分子。
４５．
前記方法は、少なくとも一つの追加の活性剤と組み合わせて前記抗体を投与することを含み、前記少なくとも一つの追加の活性剤が、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、またはそれらの組合せを含む、態様４４に記載の抗体分子または二重特異性抗体分子。
４６．
前記少なくとも一つの追加の活性剤が化学療法剤であり、任意で、前記化学療法剤はタキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである、態様４５に記載の抗体分子または二重特異性抗体分子。
４７．
治療される対象が、前記化学療法剤による治療に耐性であると決定された癌を有する、態様４６に記載の抗体分子または二重特異性抗体分子。
４８．
態様１～２１のいずれか一項に記載の抗体分子または態様２２～４３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子の治療有効量を対象に投与することを含む、癌について対象を治療する方法。
４９．
前記方法は、少なくとも一つの追加の活性剤と組み合わせて前記抗体分子または二重特異性抗体分子を投与することを含み、前記少なくとも一つの追加の活性剤が、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、またはそれらの組合せを含む、態様４８に記載の方法。
５０．
前記少なくとも一つの追加の活性剤が化学療法剤であり、任意で、前記化学療法剤はタキソール、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンである、態様４９に記載の方法。
５１．
治療される対象が、前記化学療法剤に対して耐性であると分類される癌を有する、態様５０に記載の方法。
５２．
態様１～２１のいずれか一項に記載の抗体分子または態様２２～４３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子をコードする一つ以上の配列を含む、一つまたは複数の核酸。
５３．
態様５２に記載の一つまたは複数の核酸を含む、一つまたは複数の組換え発現ベクター。
５４．
態様５２に記載の一つまたは複数の組換え発現ベクターで遺伝子改変された、宿主細胞。
５５．
MDR1結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）を含む、免疫エフェクター細胞であって、前記MDR1結合ドメインが、表2に記載された抗体の可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域の対の重鎖相補性決定領域（HCDR）および／または軽鎖CDR（LCDR）を含む、免疫エフェクター細胞。
５６．
生細胞によって発現されるMDR1の排出活性を阻害する方法であって、前記細胞を、態様１～２１のいずれか一項に記載の抗体分子または態様２２～４３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子に接触させることを含む、方法。
５７．
前記細胞をMDR1媒介排出の阻害剤に接触させることをさらに含む、態様５６記載の方法。
５８．
前記細胞を化学療法剤に接触させることをさらに含む、態様５６または５７に記載の方法。
５９．
前記細胞が癌細胞である、態様５６～５８のいずれか一項に記載の方法。
６０．
前記癌細胞が多剤耐性癌細胞である、態様５９記載の方法。
６１．
細胞の細胞表面上のMDR1の発現をアッセイする方法であって、前記細胞を、態様1～４７のいずれか一項に記載の抗体分子に接触させることを含む、方法。
６２．
前記抗体が検出可能に標識される、態様６１記載の方法。
６３．
対象におけるMDR1発現に関連する疾患または状態を診断するための方法であって、前記対象由来の組織試料または細胞試料を、態様１～４７のいずれか一項に記載の抗体分子に接触させることを含む、方法。
６４．
前記抗体分子が、図19における抗体分子について示されているVH鎖およびVL鎖の構成を含む、態様６３に記載の方法。
６５．
医薬としての使用のための、多剤耐性タンパク質1（MDR1）に特異的に結合する抗体であって、表2に記載された抗体の可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域の対の重鎖相補性決定領域1～3（HCDR 1～3）および軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）を含む抗体と、MDR1への結合について競合する、抗体。
６６．
癌の治療用の医薬の製造のための、多剤耐性タンパク質1（MDR1）に特異的に結合する抗体の使用であって、前記抗体は、表2に記載された抗体の可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域の対の重鎖相補性決定領域1-3（HCDR 1～3）および軽鎖CDR 1-3（LCDR 1～3）を含む抗体と、MDR1への結合について競合する、使用。
６７．
対象における癌を治療する方法における使用のための、多剤耐性タンパク質1（MDR1）に特異的に結合する抗体を含む医薬組成物であって、前記抗体は、表2に記載された抗体の可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域の対の重鎖相補性決定領域1～3（HCDR 1～3）および軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）を含む抗体と、MDR1への結合について競合し、前記方法は前記抗体を前記対象に投与することを含む、医薬組成物。
６８．
医薬としての使用のための、多剤耐性タンパク質1（MDR1）に特異的に結合する抗体分子であって、前記抗体分子の抗原結合部位は、
表2に記載された抗体の可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域の対の重鎖相補性決定領域1～3（HCDR 1～3）および軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）；
表2に記載された抗体のVH領域のHCDR 1～3；または
表2に記載された抗体のVL領域のLCDR 1～3
を含む、
抗体分子。
６９．
癌の治療用の医薬の製造のための、多剤耐性タンパク質1（MDR1）に特異的に結合する抗体分子の使用であって、前記抗体分子の抗原結合部位は、
表2に記載された抗体の可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域の対の重鎖相補性決定領域1～3（HCDR 1～3）および軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）；表2に記載された抗体のVH領域のHCDR 1～3；または表2に記載された抗体のVL領域のLCDR 1～3を含む、
使用。
７０．
対象における癌を治療する方法における使用のための、多剤耐性タンパク質1（MDR1）に特異的に結合する抗体を含む医薬組成物であって、前記抗体分子の抗原結合部位は、
表2に記載された抗体の可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域の対の重鎖相補性決定領域1～3（HCDR 1～3）および軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）；表2に記載された抗体のVH領域のHCDR 1～3；または表2に記載された抗体のVL領域のLCDR 1～3を含み、
前記方法は、前記抗体を前記対象に投与することを含む、
医薬組成物。
７１．
医薬として使用するための、態様２１に記載の抗体分子。
７２．
癌の治療用の医薬の製造のための、態様２１に記載の抗体分子の使用。
７３．
対象における癌を治療する方法における使用のための、態様２１に記載の抗体分子を含む医薬組成物であって、前記方法は、前記抗体を前記対象に投与することを含む、医薬組成物。
７４．
医薬としての使用のための、多剤耐性タンパク質1（MDR1）および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する二重特異性抗体分子であって、2つの同一の可変軽（VL）鎖、第1の可変重（VH）鎖、および第2のVH鎖を含み、前記VL鎖はそれぞれMDR1に対する抗原結合部位を含み、前記第1のVH鎖はMDR1に対する抗原結合部位を含み、前記第2のVH鎖はTAAに対する抗原結合部位を含み、前記第2のVH鎖は、前記軽鎖のうちの1つと対合した場合に前記TAAに結合する、二重特異性抗体分子。
７５．
癌の治療用の医薬の製造のための、多剤耐性タンパク質1（MDR1）および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する二重特異性抗体分子の使用であって、前記抗体分子は、2つの同一の可変軽（VL）鎖、第1の可変重（VH）鎖、および第2のVH鎖を含み、前記VL鎖はそれぞれMDR1に対する抗原結合部位を含み、前記第1のVH鎖はMDR1に対する抗原結合部位を含み、前記第2のVH鎖は前記TAAに対する抗原結合部位を含み、前記第2のVH鎖は、前記軽鎖のうちの1つと対合した場合に前記TAAに結合する、使用。
７６．
対象における癌を治療する方法における使用のための、多剤耐性タンパク質1（MDR1）および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する二重特異性抗体分子を含む医薬組成物であって、前記抗体分子は、2つの同一の可変軽（VL）鎖、第1の可変重（VH）鎖、および第2のVH鎖を含み、前記VL鎖はそれぞれMDR1に対する抗原結合部位を含み、前記第1のVH鎖はMDR1に対する抗原結合部位を含み、前記第2のVH鎖は前記TAAに対する抗原結合部位を含み、前記第2のVH鎖は、前記軽鎖のうちの1つと対合した場合に前記TAAに結合し、前記方法は、前記抗体を前記対象に投与することを含む、医薬組成物。
７７．
前記二重特異性分子が、表2に記載の抗体のVL領域のLCDR 1～3を含む、態様７４に記載の二重特異性分子、態様７５に記載の使用、または態様７６に記載の医薬組成物。
以下の実施例は、説明のために提供されるものであり、限定のためのものではない。
以下の実施例は、当業者に本発明の製造方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するために記載されており、発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が、行われた全てまたは唯一の実験であることを示すことを意図するものでもない。使用する数値（例えば、量、温度等）の正確性を確保するための努力がなされたが、いくらかの実験誤差や偏差を考慮に入れるべきである。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は℃であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
分子および細胞生化学の一般的な方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); および Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)などの標準的な教科書に見出すことができ、これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。本開示で言及または関係する方法のための試薬、クローニングベクター、細胞、およびキットは、BioRad、Agilent Technologies、Thermo Fisher Scientific、Sigma-Aldrich、New England Biolabs (NEB)、Takara Bio USA, Inc.等の販売会社から、ならびに、例えばAddgene, Inc.、American Type Culture Collection (ATCC)等のリポジトリから入手可能である。
［実施例１：高レベルのPgp（MDR1）を発現する細胞に特異的に結合するが、MDR1の発現が減少または欠如した細胞への結合は著しく少ないかまたは全く無い抗体の生成］
［材料と方法］
抗体産生
免疫化のために、野生型 (WT) と変異型MDR1を用いた。ポンプを開放配置で拘束する突然変異を含む変異型MDR1、および、ポンプを閉鎖配置で拘束する突然変異を含む別のMDR1変異体が生成された。開放配置で拘束されるMDR1変異体を生成する、ヒトおよびMacaca fascicularis MDR1における突然変異は、E556QおよびE1201Qである。閉鎖配置に拘束されるMDR1変異体を生成するためのヒトMDR1における突然変異は、以下の通りである：(i) K433M, S434A, K1076M, S1077A; (ii) K433M, S434A, Q475A, K1076M, S1077A, Q1118A; および／または (iii) K433M, S434A, Q475A, R588E, K1076M, S1077A, Q1118A, R1233E。追加のMDR1変異体は、アミノ酸残基82～99または79～102の欠失を伴う、ヒトMDR1のループ1における欠失を含んでいた。置換された位置についてのアミノ酸残基の番号付けは、ヒトMDR1の配列を参照する番号付けである。
野生型 (WT) と変異MDR1を3T3細胞において発現させた。様々なプライム・ブースト戦略を用いて8週間に渡り、MDR1（野生型または変異型）DNAおよび／またはMDR1（野生型または変異型）発現細胞で雌マウスを免疫化した。いくつかの例では、生成される抗体の多様性を増加させるために、複数の抗原（WTまたは変異MDR1のうちの1つ以上）が免疫化のために使用された。脾臓およびリンパ節の細胞をSP2/0骨髄腫細胞と融合させた。フローサイトメトリーにより抗ABCB1抗体の存在について、次いで細胞殺傷アッセイにおける機能活性について、ハイブリドーマ（hybridoma）をスクリーニングした。選択されたマウスIgGからのCDRを、哺乳動物IgG1骨格発現ベクター中にクローニングし、HEK 293哺乳動物細胞株中にトランスフェクトして、全長IgG1抗体を発現させた。
DNA配列決定
DNA配列は二本鎖配列決定により決定した。
DNAおよびタンパク質の配列解析および配列データ管理
ベクターNTI (ThermoFisher) ソフトウェアパッケージを、配列のマッピング、解析、注釈、および図示のために使用した。
細胞培養と抗体産生
Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J. S., Dasso, M., Harford, J. B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K. M. (eds.), John Wiley & Sons, Incに記載されているように、標準的な細胞培養技術が使用される。
発現ベクター
抗体発現ベクターの生成のために、重鎖および軽鎖DNA配列の可変領域を、哺乳動物細胞株における発現のために最適化された、対応する汎用レシピエント発現ベクターに予め挿入されたヒトIgG1定常重鎖またはヒトIgG1κ定常軽鎖のいずれかと共にインフレームでサブクローニングした。発現されるべき遺伝子を、高レベル遺伝子発現のための完全長ヒトサイトメガロウイルス (CMV) 即時初期プロモーターを用いるpCI-neo哺乳動物発現ベクター (Promega) にクローニングした。2つの抗体鎖を2つの異なるベクターにクローニングした。
マウスIgG重鎖とκ軽鎖からのN末端シグナル配列を、それぞれ重鎖と軽鎖の分泌発現のために用いた。シグナルペプチドは発現の際に切断され、無傷のN末端を残した。Fab構築物では、CH1 IgG1定常領域のC末端を、精製のための6×Hisタグと融合させた。
Pgpに対して産生されたモノクローナル抗体を、組換え操作抗体としてヒトIgG1/κ発現ベクター中にクローニングした。
マウスハイブリドーマ配列から可変重鎖および軽鎖フラグメントを得て、リーダー配列および定常領域の同じバックグラウンド中にクローニングした
mAb、Fab’2、Fabおよび二重特異性mAbの製造
メーカーの推奨に従った、懸濁液中で増殖するExpi293細胞（A14527、サーモフィッシャー）細胞の哺乳動物発現ベクターでのポリマーベース共トランスフェクションを用いて、抗体構築物が発現された。
トランスフェクションの約6日後に、細胞を遠心分離によって回収した。詳細には、トランスフェクトされた培養物1 ml当たり1 ugの総コードDNAをOpti-MEM（登録商標）培地（Life Technologies）中に希釈し、同じ培地中のExpifectamine試薬（Life Technologies）と共に20分間インキュベートした。次いで、この混合物を、37℃で空気中8%のCO2で覆われて250万細胞/mlでExpi293（登録商標）発現培地（Life Technologies）中懸濁物として増殖するExpi 293（登録商標）細胞中に添加した。6日後、抗体構築物を含有する培地を遠心分離によって回収した。
mAbの精製
Fcを含有する抗体フォーマットを精製するために、上清1 ml当たり10μlのMabSelectTMSuReTM (GE Healthcare) を、収穫した培地に添加し、4℃で一晩撹拌し続けた。翌日、真空マニホールドユニット（Pall Lifesciences、米国）を用いて、24ウェルフィルタープレート中でタンパク質A樹脂を適用した。樹脂をPBSで洗浄し、抗体を50 mMリン酸塩pH 3で溶出し、10×PBS pH 13で中和した。
Fabは、Niセファロース6 Fast Flowヒスチジンタグタンパク質精製樹脂 (GEヘルスケア) を用いた同じ手順に従って精製された。ビーズをPBSで洗浄した後、20 mMイミダゾールが補足された25 mMリン酸緩衝液pH 7.4、150 mM NaClで洗浄した。この複合体を、2容量の、500 mMイミダゾールが補足された25 mMリン酸緩衝液pH 7.4、150 mM NaClで溶出した。最後に、精製FabをPBSにバッファー交換した。抗Pgpモノクローナル抗体のクロマトグラムを図1に示す。
mAbの分析試験（GXII還元および非還元）
最終的なタンパク質調製物の純度およびモノマー含量は、製造会社によって記載されているようにProtein Express LabChip Kit (Perkin-Elmer) を用いたCaliperのLabChip GXIIでのハイスループット分析によって決定された。チップは、装置上で、0.2% SDSおよび蛍光染色色素を含有するポリマー溶液で自動的にプライミングされた。脱染チャネルはSDSと色素を含まないポリマー溶液で充填した。簡単に述べると、DDTを伴うまたは伴わないcaliperサンプルバッファーと少量の試料（2～5μL）を混合することによって、還元および非還元条件のタンパク質を調製した。試料を75℃で5分間変性させ、2000 gで3分間遠心分離し、次いで泳動させた。LabChip GXII Touchソフトウェア (Perkin Elmer) により電気泳動図を作成した。
結合、親和性、排出遮断、化学療法剤に対する細胞感作を試験するために使用された試薬細胞株
ヒト胚性腎臓 (HEK) 細胞株HEK 293FT (Life Technologies) を、10%ウシ胎児血清 (HyClone) 、2 mM GlutaMAX (Life Technologies) 、100 U/mLペニシリン、および100 g/mLストレプトマイシンを添加したDulbeccoの改変イーグル培地 (DMEM) 中37℃での5% CO2インキュベーションで維持した。
最適化されたPEIProTMトランスフェクションプロトコール (Polyplus) を用いて、pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puroプラスミド中のヒトP糖タンパク質タグ化ORFクローンで293T細胞を一時的にトランスフェクトした。DNAおよびJetPEI（登録商標）をそれぞれ培養培地中で希釈した後に、約10分間穏やかに混合した。この混合によりトランスフェクション複合体が形成され、それが細胞培養物に直接添加された。排出遮断は、製造会社のプロトコールに従って多剤耐性Direct Dye排出アッセイ（Chemicon）を用いて測定した。
ABCB1特異的結合の検出
mAb、FabおよびFab’2抗体の結合特異性は、Pgpを天然に発現する293T細胞株、ヒトPgp標的を過剰発現する293Tナイーブ細胞、Pgpノックダウン293T細胞（レンチウイルスiRNA処理後）を用いて、FACSによって試験された。簡単に述べると、異なる細胞株を、種々の量のmAbもしくは二重特異性mAb、またはヒトIgG1アイソタイプ（Isotype）対照抗体と共に氷上で1時間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液（0.5% BSAを含有するPBS）で3回洗浄した。Alexa647標識ヤギ抗ヒト抗体を二次抗体として添加し、試料を氷上でさらに1時間インキュベートした。試料を洗浄し、BD FACSCanto (BD Biosciences) を用いて分析した。
MDR1過剰発現細胞株の生成
哺乳動物発現ベクター中のヒトMDR1 cDNAを用いたトランスフェクションの後に、0.2 mg/mlまたは0.5 mg/mlでのハイグロマイシンに対する耐性についてトランスフェクタントを多段階セレクションすることにより、MDR1を過剰発現するHEK 293T細胞またはC6細胞を作製した。検出抗体MRK16-PEとのインキュベーション後、FACS Ariaを用いてMDR1高発現クローンを単離した。
排出遮断実験の手順
ヒトMDR1を発現するHEK 293T細胞またはヒトMDR1を発現するMES-SA/DX5細胞を数回洗浄し、フェノールレッドを含まないDMEM中1×10e6細胞/mlの細胞密度で、96ウェルプレートに50μlアリコート／ウェルとして分注した。細胞を、300 nM～1 nMの抗体と混合し、37℃で1時間インキュベートした。排出遮断を測定するために、細胞を、以下のようにB1蛍光基質の存在下でインキュベートした：0.6μMローダミン；5μMダウノルビシン（DiOC2(3)）または0.6μMカルセインAMで37℃で1.5時間。次いで細胞を二回洗浄し、最終的に200 ml PBSに再懸濁した。ローダミン、DiOC2(3)またはカルセインAMの蛍光をフローサイトメトリーで測定した。
細胞結合アッセイ
細胞への抗体結合をフローサイトメトリーにより評価した。ヒトABCB1を発現するように安定的にトランスフェクトされた293T細胞（293T_KPB1_OX）を、フローサイトメトリー緩衝液（PBS+2% FBS+0.02%アジ化ナトリウム）中で一度洗浄し、フローサイトメトリー緩衝液中で2×10^6細胞/mLで再懸濁し、0.1 mL/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレートに分注した。図中、「B1」はABCB1（MDR1またはPgpとしても知られる）を表す。組換え抗体は最初の結合確認のために5 ug/mLで細胞に添加するか、またはフローサイトメトリー緩衝液中で100 ug/mLから連続的に希釈した。細胞を氷上で30分間インキュベートした後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液で二回洗浄した。結合抗体をPE標識F(ab’)2断片ヤギ抗ヒトIgG (Jackson ImmunoResearch) で検出し、Attune NxTフローサイトメーター上で評価した。
KPB1に結合するモノクローナル抗体のタイトレーション（Titration）
ABCB1トランスフェクタントに対する組換え抗体の結合タイトレーションを、666.7 nMからの抗体の三倍連続希釈によって実施した。フローサイトメトリー緩衝液中で希釈された抗体を細胞と氷上で30分間インキュベートした。フローサイトメトリー緩衝液で2回洗浄した後、結合した抗体を、フローサイトメトリー緩衝液中で1:200希釈したPE標識F(ab’)2断片ヤギ抗ヒトIgG (Jackson ImmunoResearch) で検出し、氷上で20分間細胞とインキュベートした。フローサイトメトリー緩衝液で2回洗浄した後、Attune NxTフローサイトメーターで蛍光を測定した。データをGraphPad Prism 8.0ソフトウェアで分析してEC50を決定した。
細胞毒性アッセイ
ビンクリスチン細胞毒性に対する抗体の効果を、ヒト急性リンパ芽球性白血病（ALL）細胞株であるNALM6のドキソルビシン選別・ABCB1陽性バリアント、N6/ADRにおいて評価した。白色平坦底96ウェル組織培養プレートにおいて、5000細胞/ウェルで、0.05 mLのアッセイ培地（RPMI-1640+10% FBS）中の細胞をプレーティングした。100μg/mL（2×最終濃度）での試験抗体もしくは対照抗体、または7μM（2×最終濃度）での小分子KPB1阻害剤バルスポダールを含有するアッセイ培地中、200μMからの連続希釈により、ビンクリスチンを2×最終アッセイ濃度で調製した。等体積 (0.05 mL) のビンクリスチン／抗体混合物を、96ウェルプレート中のN6/ADR細胞に添加した。次いで、プレートを37℃、5% CO2中でインキュベートした。72時間後、プレートを室温に平衡化し、製造会社の推奨プロトコールに従ってPromega（登録商標）CellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生存率アッセイを用いて細胞生存率を評価した。発光はMolecular Devices（登録商標）FlexStation（登録商標）3マルチモードマイクロプレートリーダー上で測定し、データはGraphPad Prism 8.0ソフトウェアを用いて分析した。
［実施例２：抗ABCB1モノクローナル抗体のインビボ有効性］
抗ABCB1抗体B1.129、B1.261、B1.223、B1.225、B1.188、B1.28およびB1.226を、免疫不全マウスにおける腫瘍の増殖に対する作用について試験した。腫瘍モデルを作製するために以下の癌細胞株を用いた。
MES-SA DX5：
多剤耐性細胞株MES-SA/DX5（Sigma. 95051031）は、元々は56歳白人女性から子宮摘出時に得られた腫瘍からのヒト子宮肉腫細胞株MES-SA（Sigmaカタログ番号95051030）に由来するものである。このDX5バリアントはドキソルビシンに対して100倍の抵抗性を示し、倍加時間は30時間と報告されている。MES-SA/Dx-5細胞は、多くの化学療法薬（ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ビンクリスチン、タキソール、コルヒチンなど）に対して顕著な交差耐性を示し、マイトマイシンCおよびメルファランに対して中等度の交差耐性を示す。ブレオマイシン、シスプラチン、カルムスチン、5-フルオロウラシルまたはメトトレキセートに対する交差耐性は観察されなかった。
A2780 ADR：
アドリアマイシン耐性細胞株A2780ADRは、親のA2780細胞株（Sigmaカタログ番号93112519）をアドリアマイシンに曝露することにより開発された。A2780ADRはメルファランおよびビンブラスチンに対して交差耐性である。耐性を維持するためには、培地にアドリアマイシンを添加する必要がある。この細胞は単層およびスピナー懸濁液中培養において増殖し、免疫不全マウスにおいて腫瘍形成性である。シスプラチン耐性バリアントA2780cisと共に、これらの株は単一薬物への曝露においてのみ異なり、ヒト卵巣癌における多面的薬物耐性の発現に関与する分子的変化の探索を促進すると考えられる。
MES-SA DX5およびA2780 ADR細胞は、排出ポンプABCB1および腫瘍標的CD47を発現する。15D3VH:MRK16VL::MRK16VL:5F9VH鎖を含む二重特異性抗体（KB1-1401）は、MES-SA DX5およびA2780ADRの両方への結合を示す。KB1-1401二重特異性抗体は、in vivo試験において、MES-SA DX5およびA2780ADR腫瘍をパクリタキセルに対して感作する。KB1-1401二重特異性抗体は、KNJY Bis P1.1またはKBis1.1とも呼ばれる。
卵巣癌腫
ヌードマウスにA2780 ADR細胞を移植して卵巣癌腫をモデル化した。抗B1モノクローナル（monoclonal）抗体はヌードマウスのA2780 ADR卵巣癌腫モデルにおいて効力を有する。抗ABCB1抗体B1.28、B1.261、B1.129、B1.226、B1.223、B1.225、B1.188は、単剤として、およびパクリタキセル（Paclitaxel）との併用で、卵巣癌腫 (A2780 ADR) のマウスモデルにおいて腫瘍体積（Tumor volume）を減少させた。図5A～5C参照。
子宮肉腫
ヌードマウスにMES-SA DX5細胞を移植し、子宮肉腫をモデル化した。抗B1モノクローナル抗体はヌードマウスのMES-SADX5子宮肉腫モデルにおいて効力を有する。抗ABCB1抗体B1.261、B1.129、およびB1.223は、単剤として、およびパクリタキセルとの併用で、マウス子宮肉腫モデル (MES-SADX5) において腫瘍体積を減少させた。図6参照。
図5C。KPA02は、MRK16として知られる抗ABCB1抗体である。KPA08は、MRK16および15D3という2つの抗ABCB1抗体を組み合わせることにより生成された抗ABCB1抗体である。KPA08抗体は、15D3由来の2つの重鎖とMRK16由来の2つの軽鎖を含む。KPA01は15D3として知られる抗ABCB1抗体である。KPA06は抗CD47抗体5F9である。
15D3抗体（KPA01）はMES-SA DX5子宮肉腫をパクリタキセルに対して感作しなかった。B1.129抗体は、単剤としておよびパクリタキセルとの併用で、腫瘍増殖を阻害することにおいて15D3抗体（KPA01）よりも有効であった。B1.261とB.223はいずれも、MES-SADX5子宮肉腫をパクリタキセルに感作した。図6参照。
NSGマウスにMES-SA DX5細胞を移植し、子宮肉腫をモデル化した。抗B1モノクローナル抗体はNSGマウスのMES-SADX5子宮肉腫モデルにおいて効力を有する。図7は、B1.223がMES-SA DX5子宮肉腫をパクリタキセルに対して感作することを示す。
図8は、パクリタキセルに対するMES-SADX5子宮肉腫の耐性にはABCB1発現が必要であることを示す。ABCB1発現を欠くMES-SADX5細胞（DX5-B1 KO）を用いて形成されたMES-SADX5子宮肉腫はパクリタキセルに感受性である。
［実施例３：抗MDR1抗体のエピトープマッピング］
表2に列挙した抗MDR1 mAbの、MDR1の2つの主要な細胞外ループ1および4への結合を決定するために、種々の突然変異を構築してこれらの2つのループを改変または置換した。カニクイザル細胞外ループへの結合を調べるために、標準的な技術を用いて、カニクイザルMDR1の細胞外ループ1および／またはループ4を、ヒトMDR1におけるヒトループに置き換えてグラフトした（C末端FLAGタグを伴わせた）。正常ヒトループへの結合依存性を調べるために、ループ1における欠失79～102および欠失82～99を有するMDR1バリアントも作製した。ループ1はECD1とも呼ばれる。ループ4はECD4とも呼ばれる。これらの変異体MDR1排出ポンプバリアントを、標準的な方法を用いて293T細胞上に発現させて、種々の抗MDR1 mAbの結合を区別するために使用することができる細胞を作製した。異なる細胞を異なる抗MDR1 mAbと共に4℃で約1時間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液 (0.5% BSAを含有するPBS) で2回洗浄した。Alexa647標識ヤギ抗ヒト抗体を二次抗体として添加し、試料を氷上でさらに1時間インキュベートした。試料を再度洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
図9は、変異体ヒトMDR1を用いた予備的なエピトープマッピングからの知見を要約する。「+」は、列挙されたECDが、抗体結合にとって必要であったことを示す（WTヒトABCB1と比較してECDを欠く変異体ABCB1への結合の有意な減少に基づく）。「-」は、列挙されたECDが、抗体結合にとって必要でなかったことを示す（WTヒトABCB1と比較してECDを欠く変異体ABCB1への結合における有意な変化の欠如に基づく）。例えば、抗MDR1 mAb B1.129は、ヒトMDR1に結合するためにECD1およびECD4を必要とする。全ての抗MDR1抗体は、ECD4と接触する。KPA01およびKPA08抗体は、ABCB1への結合にECD1を必要としない。このデータは、図9にリストされた抗B1抗体の多くが、ECD1およびECD4の両方の結合について「+」で示されるように、ECD1およびECD4に存在する配列を含むエピトープに結合することを示唆する。対照的に、KPA01およびKPA08抗体は、ECD1配列ではなくECD4配列を含むエピトープに結合する。ECD1は、ヒトABCB1の第1の細胞外ドメインを指し、ECD4は、ヒトABCB1の第4の細胞外ドメインを指し、「その他」は、ヒトABCB1の残りの細胞外ドメイン2～3および5～6を指す。ECD1およびECD4への結合のみが試験された。
［実施例４：抗MDR1抗体の特徴解析］
抗MDR1 mAb B1.129およびそのヒト化バージョンを、ヒトMDR1を過剰発現する293T細胞株またはカニクイザルMDR1でトランスフェクトされた293T細胞への結合について評価した。図10A～10Bは、B1.129 mAbがヒト（hB1、図10A）およびカニクイザル（cB1、図10B）MDR1の両方に結合することを示す。B1.129.hz1はhB1とcB1の両方により低い親和性で結合したが、B1.129.hz2はhB1とcB1のどちらにも有意な結合を示さなかった。B1.129.hz1およびB1.129.hz2抗体は、それぞれ、表2に記載されたヒト化バージョンB1.129.huH1-huL1（KV3）およびB1.129.huH1-huL1（KV1）と同じである。図10Cは、B1.129抗体の結合データを要約する。
抗MDR1 mAb B1.28およびそのヒト化バージョンを、ヒトMDR1を過剰発現する293T細胞株またはカニクイザルMDR1でトランスフェクトされた293T細胞への結合について評価した。図11は、B1.28 mAbが、hB1およびcB1の両方に結合することを示す。B1.28 hz1 mAbは、B1.28 mAbと比較してより低い親和性でhB1とcB1の両方に結合した。B1.28.hz1抗体は、表2に記載されたヒト化バージョンB1.28 human1と同じである。
図12は、抗MDR1 mAb B1.261の結合を示し、その2つのヒト化バージョンはhB1およびcB1に結合する。
MDR1基質カルセイン（Calcein）、DIOC2、およびローダミン（Rhodamine）の排出に対する抗MDR1抗体の作用を、排出遮断実験手順において記載されているように評価した。データを図13に要約する。
図13に見られるように、B1.129 mAbは、抗MDR1抗体15D3よりも大きな程度においてカルセインの排出を阻害した。B1.129 mAbはまた、2つの異なるhB1発現細胞株においてDIOC2およびローダミンの排出を阻害した。対照的に、15D3は両細胞系においてDIOC2排出に対して観察可能な効果を示さず(-)、293T.hB1細胞系においてローダミン排出の低い阻害を示したが(+/-)、MES-SA/DX5細胞においてはローダミン排出に対して効果を示さなかった。
［実施例５：抗MDR1抗体による癌細胞の化学増感］
表2に列挙した抗MDR1抗体を、N6ADR細胞に対するビンクリスチン（Vincristine）の化学毒性に対する作用について試験した。図4A～4D参照。表7は、多くの抗MDR1 mAbが、ビンクリスチンの細胞毒性を、別の細胞毒性剤であるバルスポダール（Valspodar）を用いて達成されるのと同等またはそれを上回りさえするレベルまで増加させたことを示す。表2に示された抗MDR1抗体の多くは、ビンクリスチンの化学毒性を40倍以上増強させた。これらの抗体は表7にイタリック体で示している。
［実施例６：MDR1とCD47に結合する二重特異性抗体の生成］
15D3VH:B1-28VL:: B1-28VL:5F9VH二重特異性抗体
抗MDR1抗体15D3の可変重鎖 (VH) 、抗CD47抗体5F9の可変重鎖、および抗MDR1抗体「B1-28」からの共通可変軽鎖を有する二重特異性抗体（表2参照）を作製した。15D3のVH鎖のヒト化バージョンが生成され、これはヒトIGHV3グループからのフレームワーク領域を含み、15D3 CDR H2中にN56Q/N56S置換を含んだ。これらの可変重鎖 (HC) は本明細書で15D3 Hz0（ヒト化15D3 HC）；15D3 Hz1（ヒト化15D3 HC+ CDR H2におけるN56Q置換）；および15D3 Hz2（ヒト化15D3 HC+CDR H2におけるN56S置換）と呼ばれ、以下のアミノ酸配列を有する。
15D3 Hz0:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:350)
15D3 Hz1:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGQTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:351)

15D3 Hz2:
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGSTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:352)
5F9抗体可変重鎖の配列は以下の通りである：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:294)

ヒト化B1-28 VL鎖の配列は以下の通りである：
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQNIVHSTGNTYLDWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCFQGSHIPRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:20)

ヒト化B1-28 VH鎖の配列は以下の通りである：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFGLYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGSNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYRYDAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:19)
二重特異性抗体は、15D3Hz1または15D3Hz2可変領域のいずれかを含んでいた。15D3可変重鎖領域は、荷電対置換K392DおよびK409Dを伴ってヒトIgG1 Fc領域に融合され、5F9可変重鎖領域は、荷電対置換E356KおよびD399Kを伴ってヒトIgG1 Fc領域に融合される。
二重特異性抗体は結合力価測定と化学毒性アッセイにより特性解析された。
細胞結合アッセイ
細胞への抗体結合をフローサイトメトリーにより評価した。ヒトABCB1を発現するように安定的にトランスフェクトされた293T細胞（293T_ABCB1_OX）を、フローサイトメトリー緩衝液（PBS+2% FBS+0.02%アジ化ナトリウム）中で1回洗浄し、フローサイトメトリー緩衝液中に2×10^6細胞/mLで再懸濁し、96ウェルのマイクロタイタープレートに0.1 mL/ウェルで分注した。組換え抗体を、最初の結合確認のために5 ug/mLで細胞に添加するか、またはフローサイトメトリー緩衝液中で100 ug/mLから連続的に希釈した。細胞を氷上で30分間インキュベートした後、フローサイトメトリー緩衝液で二回洗浄した。結合された抗体を、PE標識F(ab’)2断片ヤギ抗ヒトIgG（Jackson ImmunoResearch）で検出し、Attune NxTフローサイトメーターで評価した。EC50は、最大応答の半分を与える抗体の濃度として計算される。
細胞毒性アッセイ
ビンクリスチン細胞毒性に対する抗体の効果を、N6/ADR（ヒト急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞株NALM6の、ドキソルビシン選別、B1陽性バリアント）で評価した。細胞を、白色平坦底96ウェル組織培養プレートにおいて、0.05 mLのアッセイ培地（RPMI-1640+10% FBS）中に5000細胞/ウェルでプレーティングした。ビンクリスチンは、100μg/mL（2×最終濃度）の試験抗体もしくは対照抗体または7μM（2×最終濃度）の小分子B1阻害剤バルスポダールを含有するアッセイ培地中、200μMからの連続希釈により、2×最終アッセイ濃度で調製した。等体積（0.05 mL）のビンクリスチン／抗体混合物を、96ウェルプレート中のN6/ADR細胞に加えた。次いで、プレートを5% CO2中37℃でインキュベートした。72時間後、プレートを室温に平衡化し、製造会社の推奨プロトコールに従ってPromega（登録商標）CellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生存率アッセイを用いて細胞生存率を評価した。発光をMolecular Devices（登録商標）FlexStation（登録商標）3マルチモードマイクロプレートリーダーで測定し、GraphPad Prism 8.0ソフトウェアを用いてデータを分析した。半最大阻害濃度 (IC50) は、反応（細胞増殖）が50%低下するところの薬剤（ビンクリスチンまたは他の化学療法細胞毒性剤）の濃度である。
二重特異性抗体（BisAb-1およびBisAb-2）の293T_ABCB1_OX細胞への細胞結合を表3に要約する。
KT14はCD47を指す。表3中のKT14抗体 (Ab) は、抗CD47抗体5F9である（アミノ酸配列については表5参照）。BisAb-1とBisAb-2の両方において、抗CD47抗体5F9からのHCが使用された。
ビンクリスチンの細胞毒性に対する抗体の作用を表4に要約する。hIgG1、15D3およびMRK16抗体はビンクリスチン媒介細胞毒性を増強させなかったが、Bis-Ab-1及びBisAb-2抗体はビンクリスチンの細胞毒性を増加させた。
表6は、図面中のデータを生成することに使用された抗体について用いられる命名法を要約する。
抗MDR1抗体15D3の重鎖を、抗CD47抗体5F9の重鎖および抗MDR1抗体からの異なる軽鎖と組み合わせた。ヒトB1を過剰発現するC6細胞に対するこれらの二重特異性抗体の結合に関するデータを図14に示す。
ラット線維芽C6細胞をトランスフェクトすることにより、hABCB1またはhKT14を安定な細胞系統で発現する細胞を作製した。5F9および抗ABCB1抗体は、それぞれマウスのKT14またはABCB1に対してほとんど親和性を有さないので、C6細胞株を用いて、それに発現されるヒト標的に対する親和性を測定した。KT14/Fc/KT14 Abは、5F9のシングルアーム（Single Arm）フォーマット、すなわち、1つの重鎖および1つの軽鎖のみのものを指す。
図15は、カニクイザルCD47 (cKT14) またはヒトCD47 (hKT14) を過剰発現するC6細胞に対するこれらの二重特異性抗体（bispecific antibodies）の結合を示す。結合はフローサイトメトリーにより、組換タンパク質はバイオレイヤー干渉法 (BLI) により評価した。Octet KD－は、ForteBio Octetを用いて、バイオレイヤー干渉法 (BLI) により組換えヒトCD47 (rhCD47) への抗体結合を測定することにより算出された。センサーは、抗体をロードしてから、300 nM、100 nM、および33 nMのrhCD47と作用させた。各分析物の会合および解離について結合定数を計算した。1:1カーブフィットが適用され、グローバルフィットが生成された。BsAbの結合は大きな量のB1を必要とすると見られる一方、CD47の量を増加させても結合親和性は増加しない。したがって、BsAbはB1を過剰発現する細胞に特異的であると予想される。CD47は多くの正常細胞に発現されるので、CD47に対する低い親和性はオフターゲット効果を減少させることにおいて有利となる。
B1+/CD47+ MES-SA-DX5細胞（以後、DX5WT細胞と呼ぶ）、DX5WT細胞に由来するB1遺伝子ノックアウトおよびCD47遺伝子ノックアウト細胞株（以後、それぞれDX5 B1 KO（B1-/CD47+）およびDX5 CD47 KO（B1+/CD47-）細胞と呼ぶ）を用いて、抗MDR1および抗CD47の二重特異性抗体の結合選択性を評価した。
抗体の添加に先立って、DX5 WT細胞およびDX5 CD47 KO細胞をそれぞれCellTraceTMバイオレットおよびCellTraceTMファーレッド（Life Technologies, NY）で染色し、DX5 B1 KO細胞は未染色のままとした。細胞を、6×106細胞/ml（2×106細胞/mlの各細胞集団）の最終濃度でFACS緩衝液中で1:1:1比で混合した。次いで、3×105細胞/ウェルを、連続希釈した抗体と共に室温で1時間インキュベートした。次いで、細胞をFACS緩衝液で3回洗浄し、細胞結合抗体をPEコンジュゲート化ヤギ抗ヒトIgG Fcγ特異的抗体（Jackson ImmunoResearch）で検出した。
Attune NXT（Thermo Fisher Scientific）でフローサイトメトリーを行い、トレーサー色素の発現または排除に基づいて個々の細胞集団をゲーティングし、物理的散乱特性によってダブレットを排除した。抗体結合は平均蛍光強度 (MFI) により測定した。
図16は、DX5 WT、DX5 B1 KO、DX5 CD47 KO細胞株に対する、列挙された二重特異性抗体の結合選択性タイトレーションを示す。
図17Aおよび17Bは、HCおよびLCをヒト化した後の、ヒトおよびカニクイザルMDR1発現細胞に対する抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体の結合を示す。ヒト化HCおよびLCのアミノ酸配列は以下の通りである。
15D3 hmz DD IgG1 (HC):
EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGGNTYYPDSVKGRFTVSRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:350)
B1.28.huL1 (LC):
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQNIVHSTGNTYLDWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCFQGSHIPRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:20)
B1.28.huL2 (LC):
DVVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHSTGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:21)
B1.28.huL3 (LC):
EVVLTQSPATLSLSPGERATLSCRSSQNIVHSTGNTYLDWYQQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCFQGSHIPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:22)
B1V6.CDRv1.hmzLC:
DIVMTQTPLSLPVTLGDPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:367)
B1V6.CDRv2.hmzLC:
DIVMTQSPLSLPVSLGDPASISCRSSQSLVHSNGNTYLEYYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:311)
B1V6.CDRv3.hmzLC:
DIVLTQTPLSLPVSLGDPASISCRSSQSLVHSSGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:368)
最適な二重特異性抗体を見出すために、表2に列挙した抗MDR1抗体の重鎖の多くを、抗CD47抗体5F9の重鎖および抗MDR1抗体からの異なる軽鎖と組み合わせた。LCのいくつかは、表2に列挙された抗MDR1抗体に由来した。
ELISAまたはCD47発現細胞を用いてCD47に対して、およびABCB1発現細胞を用いて、これらの種々の二重特異性抗体の結合についてアッセイした結果を、図18Aおよび18Bに示す。
KPB1 VL/CDR3 LCは、KJB1-6軽鎖抗体から、VH CDR3に変異を導入して作製した。
KPB1-6 LC配列:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:369)
VL CDR1: RSSQSLVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:290)
VL CDR2: KVSNRFS (SEQ ID NO:12)
VL CDR3: QGSHVPFT (SEQ ID NO:370)
KPB1 VL/CDR3 LC配列:
DIVMTQSPLSLPVSLGDPASISCRSSQSLVHSNGNTYLEYYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:311)
VL CDR1: RSSQSLVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:290)
VL CDR2: KVSNRFS (SEQ ID NO:12)
VL CDR3: QGSHFPRT (SEQ ID NO:348)
特に明記されない限り、本明細書に開示される二重特異性抗体の全ては、抗MDR1抗体に由来するHC、抗腫瘍関連抗原抗体（例えば抗CD47抗体）に由来するHC、および抗MDR1抗体に由来する共通軽鎖を含む。これらの抗体は、VH/VH/VLまたはVH:VL::VL:VHの形式で一覧表示される。
［実施例７：HCおよびLCの非伝統的配置を有する二重特異性抗体の生成］
本明細書に開示される単一特異性抗体および二重特異的抗体は、図19に示されるフォーマットにおける重鎖および軽鎖を含み得る。
抗MDR1および抗CD47の二重特異性抗体を、図20に示すようにscFv-Fab-Fcフォーマットで生成した。二重特異性抗体の抗CD47アームのFc領域は、アミノ酸置換によって創出された「穴（hole）」を有するものとして示され、抗MDR-1アームのFc領域は、アミノ酸置換によって創出された「ノブ（knob）」を含む。しかしながら、抗CD47アームがノブを含み抗MDR1アームが穴を含むように、ノブおよび穴の変異を逆転させてもよい。4つの二重特異性抗体を作製した。
KT14.5F9hu scFv-B1.28.hu13
KT14.B6H12hu scFv-B1.28.hu13
KT14.5F9hu scFv-B1.261.hu1
KT14.B6H12hu scFv-B1.261.hu1
KT14.5F9hu scFvおよびKT14.B6H12hu scFvは、「ノブ」突然変異を伴うヒトIgG1 Fc領域を含んで、「穴」突然変異を含む抗MDR1抗体のFc領域との対形成を容易にする。
KT14.5F9hu scFv-hIgG1_knobは以下のアミノ酸配列を有する。
HCDR 1～3は太字で示されている。LCDR 1～3は太字で下線が付されている。
KT14.B6H12hu scFv-hIgG1_knobは以下のアミノ酸配列を有する。
HCDR 1～3は太字で示されている。LCDR 1～3は太字で下線が付されている。
B1.28.hu13-hIgG1_holeは、以下のアミノ酸配列を有する。
HCDR 1～3は太字で示されている。
使用されたB1.28.LCは以下のアミノ酸配列を有する。
LCDR 1～3は太字で表示され、下線が付されている。
B1.261.huH1.hIgG1_holeは、以下のアミノ酸配列を有する。
HCDR 1～3は太字で示されている。
B1.261.huL1は、以下のアミノ酸配列を有する。
LCDR 1～3は太字で表示され、下線が付されている。
図21は、KT14.5F9hu scFv-B1.28.hu13およびKT14.B6H12hu scFv-B1.28.hu13抗体が、C6細胞の表面上に発現されたヒトCD47およびヒトMDR1の両方に結合することを示す。
図22は、KT14.5F9hu scFv-B1.261.hu1およびKT14.B6H12hu scFv-B1.261.hu1抗体が、C6細胞の表面上に発現されたヒトCD47およびヒトMDR1の両方に結合することを示す。
［実施例８：抗MDR1および抗CD47抗体のインビボ有効性］
図23A～23Cは、MES-SA-DX5モデルにおいて腫瘍体積を減少させることにおける抗MDR1および抗CD47二重特異性抗体のインビボ有効性を示す。図23Aは、B1-188 VH:MRK16LC::MRK16LC:5F9 HC抗体（B1-188/KT14/MRK16）およびB1-225 VH:MRK16 LC::MRK16 LC:5F9 HC抗体（B1-225/KT14/MRK16）が、単独でおよびパクリタキセル治療との併用で腫瘍体積を減少させたことを示す。B1-225/KT14/MRK16は、15D3 VH:MRK16LC::MRK16LC:5F9 HC抗体（15D3/KT14/MRK16）含むKBisP1.1抗体と同様の効力を有する。
図23Bは、二重特異性抗体の各々が、単一の薬剤として、およびパクリタキセルとの併用で、パクリタキセルおよび陰性対照抗体で観察されるレベルよりも低いレベルまで腫瘍体積を減少させることを示す。
図23Cは、MRK16 LCを、抗MDR1抗体B1.VL6、B1.225v1、またはB1.27由来のLCに置き換えることにより、単剤として、またはパクリタキセルとの併用で、二重特異性抗体の効力が増強されることを示す。
［実施例９：MDR-1およびHer2に結合する二重特異性抗体の生成］
表2に示した抗MDR1抗体の重鎖を、抗Her2抗体であるトラスツズマブまたはペルツズマブの重鎖と組み合わせた。
トラスツズマブ軽鎖配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:376)
トラスツズマブ重鎖配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:320)
ペルツズマブ重鎖配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:324)
ペルツズマブ軽鎖配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:377)
本明細書において、「KT-1」という表記は、トラスツズマブ抗体を表すために使用される。本明細書において、「KT-1-2」という表記は、ペルツズマブ抗体を表すために使用される。図24は、両方の抗原に結合する組合せを同定するために二重特異性抗体フォーマットで試験された抗MDR1重鎖、抗HER2重鎖、および抗MDR1共通軽鎖の種々の組合せを列記している。HER2への結合は、HER2を発現するSKBR細胞株を用いて決定された。
［実施例１０：MDR-1およびPDL1に結合する二重特異性抗体の生成］
表2に列挙した抗MDR1抗体の重鎖を、抗PDL1抗体アテゾリズマブの重鎖と組み合わせた。
アテゾリズマブ軽鎖配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:378)
アテゾリズマブ重鎖配列:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:318)
図25は、両方の抗原に結合する組合せを同定するために二重特異性抗体フォーマットで試験された抗MDR1重鎖、抗PDL1重鎖、および抗MDR1共通軽鎖の種々の組合せを列記している。
上述の発明は、理解の明確さのために、図示および例によってある程度詳細に説明されてきたが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく特定の変更および修正がなされ得ることは、当業者には容易に明らかになる。
従って、上記は単に発明の原理を例示するに過ぎない。本明細書に明示的には記載または図示されていないが本発明の原理を具現化しその趣旨および範囲の内に含まれる様々な構成を当業者が工夫することができることが理解されるであろう。さらに、本明細書に記載されているすべての例および条件的言語は、主に、本発明の原理および本技術分野を発展させるために発明者によって貢献された概念を読者が理解するのを助けることを意図しており、そのような具体的に記載された例および条件に限定されないものとして解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態ならびにそれらの具体例を記載する本明細書のすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図している。さらに、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を実行する任意の開発された要素を含むことが意図される。さらに、本明細書に開示されているものは、そのような開示が特許請求の範囲に明示的に記載されているか否かにかかわらず、公衆に開放されることを意図してはいない。
したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され説明される例示的な実施形態に限定されることは意図しない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。特許請求の範囲において、35 U.S.C.§112 (f) または35 U.S.C.§112 (6) は、「means for」または「step for」という正確なフレーズが当該クレームにおける当該限定の冒頭に記載されている場合にのみ、当該クレームにおける限定について適用されるものとして明確に定義される。そのような正確なフレーズがクレームの限定に使用されていない場合には、35 U.S.C.§112 (f) または35 U.S.C.§112 (6) は適用されない。

Claims (16)

  1. 多剤耐性タンパク質1（MDR1）および腫瘍関連抗原（TAA）に結合する二重特異性抗体分子であって、2つの同一の可変軽（VL）鎖、第1の可変重（VH）鎖、および第2のVH鎖を含み、ここで、前記VL鎖はそれぞれMDR1に対する抗原結合部位を含み、前記第1のVH鎖はMDR1に対する抗原結合部位を含み、そして前記第2のVH鎖はTAAに対する抗原結合部位を含み、前記第2のVH鎖は前記軽鎖の1つと対合した場合にTAAに結合し、前記二重特異性抗体分子は、MDR1またはTAAのどちらかを発現する細胞へのその結合と比較して、MDR1とTAAとの両方を発現する細胞に優先的に結合する、二重特異性抗体分子。（但し、前記第1のVH鎖の抗原結合部位が、以下の配列：EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX2TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
    を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3（HCDR 1～3）を含み、ここでX2はN、QまたはSであり、
    前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS
    を有するVH鎖のHCDR 1～3を含み、
    前記二重特異性抗体分子は、MDR1とCD47の両方を発現する癌細胞に結合するが、MDR1および/またはCD47を発現する非癌細胞には低減された結合を示し、
    前記2つのVL鎖の抗原結合部位が、以下の配列：DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX1TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
    を有するVL鎖の軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）を含み、ここでX1はN、QまたはSであり、
    ここでCDRはKabat、Chothia、またはMacCallumの定義によるCDRである前記二重特異性抗体分子；
    前記第1のVH鎖の前記抗原結合部位が、以下の配列：
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX 2 TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
    を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3（HCDR 1～3）を含み、ここでX 2 はN、QまたはSであり、
    前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS
    を含むVH鎖のHCDR 1～3を含み、
    前記2つのVL鎖の抗原結合部位が、以下の配列：
    DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX 1 TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
    を有するVL鎖の軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）を含み、ここでX 1 はN、QまたはSであり、
    ここでCDRはKabat、Chothia、またはMacCallumの定義によるCDRである、前記二重特異性抗体分子；および
    前記第1のVH鎖の前記抗原結合部位が、以下の配列：
    EVKVVESGGVLVRPGGSLKLSCAASGFTFSRYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGX 2 TYYPDSVKGRFTVSRDNAMSSLYLQMSSLRSEDTALYYCARYGAGDAWFAYWGQGTLVTVSS
    を有するVH鎖の重鎖CDR 1～3（HCDR 1～3）を含み、ここでX 2 はN、QまたはSであり、
    前記第2のVH鎖の抗原結合部位が、以下のアミノ酸配列：
    QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGDYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCARVSIFGVGTFDYWGQGTLVTVSS
    を含むVH鎖のHCDR 1～3を含み、
    前記2つのVL鎖の抗原結合部位が、以下の配列：
    DVLMTQTPVSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGX 1 TYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASHFPRTFGGGTKLEIK
    を有するVL鎖の軽鎖CDR 1～3（LCDR 1～3）を含み、ここでX 1 はN、QまたはSであり、
    ここでCDRはKabat、Chothia、またはMacCallumの定義によるCDRである、前記二重特異性抗体分子を除く。）
  2. 前記TAAがEGFRである、請求項１に記載の二重特異性抗体分子。
  3. 前記TAAがCD47、PDL-1、またはHER2である、請求項１に記載の二重特異性抗体分子。
  4. 前記TAAがCD47である、請求項３に記載の二重特異性抗体分子。
  5. 薬剤耐性癌を治療する方法における使用のための、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体分子を含む医薬組成物。
  6. 前記薬剤耐性癌は多剤耐性癌である、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 前記薬剤耐性癌は血液癌または固形癌である、請求項５または６に記載の医薬組成物。
  8. 前記血液癌が白血病であり、前記白血病は急性骨髄性白血病（AML）または急性リンパ芽球性白血病（ALL）であってもよい、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 前記血液癌が多発性骨髄腫（MM）である、請求項７に記載の医薬組成物。
  10. 前記固形癌が卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、乳癌、尿路上皮癌、腎臓癌、または肺癌である、請求項７に記載の医薬組成物。
  11. 前記固形癌が副腎皮質細胞腫、膵臓癌、または肝臓癌である、請求項７に記載の医薬組成物。
  12. 前記二重特異性抗体分子が単剤として使用される、請求項５～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. 前記二重特異性抗体分子は、少なくとも一つの追加の活性剤と組み合わせて使用され、前記少なくとも一つの追加の活性剤が、化学療法剤、多剤耐性トランスポーターの阻害剤、免疫療法剤、またはそれらの組合せを含み、任意で前記免疫療法剤は免疫チェックポイントマーカーであってもよい、請求項５～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  14. 前記少なくとも一つの追加の活性剤が化学療法剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 前記化学療法剤がアルキル化剤、抗代謝薬、抗腫瘍抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、またはステロイドホルモンであり、任意で前記化学療法剤はタキサン、ビンカアルカロイド、またはアントラサイクリンであってもよい、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記化学療法剤がニラパリブ、オラパリブ、またはルカパリブである、請求項１４に記載の医薬組成物。
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