JP7809372B2 - アゴニスト抗体の活性を増強する抗体重鎖定常領域配列 - Google Patents

Description

本発明は、バイオ医薬品分野、特にアゴニスト抗体又はアゴニスト分子（重鎖定常領域配列を含む融合タンパク質）の活性を増強できる重鎖定常領域配列と分子、及び当該重鎖定常領域に基づき構築された抗体又は融合タンパク質に関わる。

抗体と重鎖定常領域（Fc断片を含む）に基づく分子標的療法は、抗体と重鎖定常領域融合タンパク質を含み、過去３０年間にバイオ医薬品分野に大きな成功を収めながら、引き続き当該分野の焦点になり、複数の疾患の治療のための新しい方法と可能性を提供する。既に承認された重鎖定常領域に基づく生物治療手段（包括重鎖定常領域融合タンパク質的分子）は、約３０個があり、ただし、臨床試験段階におけるのは３００個超、作用方式より、これらの生物治療は、主に三類に分けられる：標的（分子と細胞）を取り除くエフェクター分子と、標的が関与するシグナル経路を遮断する阻断型分子と、標的の下流シグナル経路を活性化するアゴニスト分子。

近年に、腫瘍の免疫療法が、重大な進展を遂げた。これは、免疫を抑制するノードを遮断することで、免疫細胞の活性を向上する、腫瘍を殺滅する抗体を使用することのかげである。しかしながら、ただいま相変わらず、多くのがん患者は、既存の治療手段に反応しない。そして、一方では、既存の腫瘍免疫療法の手段を最適化する必要があり、他方では、新しい腫瘍免疫療法の薬物を研究開発することは、急務である。特に、「アゴニスト抗体」と呼ばれる腫瘍免疫療法手段は、免疫細胞の表面との結合によって、免疫活性化シグナルの標的分子を転送し、かつそれに制御される重要な免疫活性化シグナル経路を活性化して、さらに抗腫瘍免疫応答を増強して、間接に腫瘍細胞を殺滅できる。しかしながら、アゴニスト腫瘍免疫療法の抗体の大きな可能性は、既に動物モデルに証明され、かつ広くに納得されだけではなく、将来性があるとみられる腫瘍免疫療法構想になるが、これらの抗体の研究開発がまだ成功していない、腫瘍免疫療法の分野における大きな課題です。また、アゴニスト抗体の活性化も、他の生物学過程における肝心なシグナル経路を介入・調整する有利な手段であり、疾患の予防と制御及び治療分野に広い応用見通しがある。たとえば、免疫抑制シグナル経路を活性化すると、炎症と自己免疫症状の軽減に役立つ可能性がある。

発明の内容
本発明が主に解決しようとする技術問題は、バイオ医薬品分野、特にアゴニスト抗体又はアゴニスト分子（重鎖定常領域配列を含む融合タンパク質）の活性を増強できる重鎖定常領域配列と分子、及び当該重鎖定常領域に基づき構築された抗体又は融合タンパク質を提供することである。

上記の技術問題を解決するために、本発明に採用された技術案の一つは：
ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む重鎖定常領域を提供し、上記のＣＨ１ドメインとヒンジ領域の配列は、ヒトＩｇＧ２由来のＣＨ１ドメインとヒンジ領域の配列であり、上記のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの配列は、
ａ） ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの配列、ただし、上記のＣ
Ｈ２ドメインとＣＨ３ドメインが、Ｇ２３７Ｄと、Ｐ２３８Ｄと、Ｐ２７１Ｇと、Ａ３３０Ｒ変異を含む；或いは
ｂ） ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの配列、ただし、上記のＣ
Ｈ２ドメインとＣＨ３ドメインが、Ｇ２３７Ｄと、Ｐ２３８Ｄと、Ｈ２６８Ｄと、Ｐ２７１Ｇと、Ａ３３０Ｒ変異を含む；或いは
ｃ） ヒトＩｇＧ２由来のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの配列、ただし、上記のＣ
Ｈ２ドメインとＣＨ３ドメインが、Ｓ２６７Ｅと、Ｌ３２８Ｆ変異を含む；或いは
ｄ） ヒトＩｇＧ２由来のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの配列、ただし、上記のＣ
Ｈ２ドメインとＣＨ３ドメインが、Ｈ２６８Ｄと、Ｐ２７１Ｇ変異を含む
から選べる。

より好ましいのは、上記の重鎖定常領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるような配列を有し、或いは上記の重鎖定常領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるような配列を有し、或いは上記の重鎖定常領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるような配列を有し、或いは上記の重鎖定常領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるような配列を有する。

なお、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む重鎖定常領域も提供し、上記のＣＨ１ドメインとヒンジ領域の配列は、ヒトＩｇＧ２由来のＣＨ１ドメインとヒンジ領域の配列であり、上記のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの配列は、ヒトＩｇＧ由来のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメイン配列であり、かつ上記の抗体重鎖定常領域のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性は、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性より大きいか等しいであり、上記の抗体重鎖定常領域のＩ／Ａ比率は、ヒトＩｇＧ１のＩ／Ａ比率より大きいか等しいである。

好ましくに、上記の抗体重鎖定常領域のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性は、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性の３．２倍又は以上であり、上記の抗体重鎖定常領域のＩ／Ａ比率は、０．３２より大きいか等しいである；同様に好ましくに、上記の抗体重鎖定常領域のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性は、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性より大きいか等しいであり、上記の抗体重鎖定常領域のＩ／Ａ比率は、１より大きいか等しいである；より好ましくに、上記の抗体重鎖定常領域のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性は、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性の３０倍又は以上であり、上記の抗体重鎖定常領域のＩ／Ａ比率は、１より大きいか等しいである；より好ましくに、上記の抗体重鎖定常領域のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性は、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性の６０倍又は以上であり、上記の抗体重鎖定常領域のＩ／Ａ比率は、４０より大きいか等しいである；特くに好ましくに、上記の抗体重鎖定常領域のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性は、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性の９０倍又は以上であり、上記の抗体重鎖定常領域のＩ／Ａ比率は、１００より大きいか等しいである。

本発明の実施例による重鎖定常領域は、高い阻害型Ｆｃ受容体の親和性を有し、著しくにアゴニスト抗体或いはアゴニスト分子（たとえばアゴニスト融合タンパク質）と阻害性Ｆｃ受容体との架橋を増強でき、そして上記のアゴニスト抗体或いはアゴニスト分子のアゴニスト活性を向上する；同時に、低い活性化型Ｆｃ受容体の親和性も有し、活性化型受容体により結合することによるＡＤＣＣ等の細胞毒性を低減できる。本発明の実施例による重鎖定常領域は、より優れる活性を有するアゴニスト抗体或いはアゴニスト分子の開発に用いられる。

本発明のもう一つは、上記の的重鎖定常領域及び上記の重鎖定常領域のＮ端又はＣ端に位置する抗原結合モジュールを含む融合タンパク質を提供する。
好ましくに、上記の抗原結合モジュールは、抗体の抗原結合断片、ａｄｎｅｃｔｉｎ、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ミニ抗体、アフィボディー（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、ａｆｆｉｌｉｎ、受容体の標的結合領域、細胞接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン又はケモカインから選ばれるいずれか一つである；より好ましくに、上記の抗原結合モ
ジュールは、ナノボディである。

ナノボディは、アルパカの抗体由来の重鎖可変領域であり、当該可変領域は、本発明の重鎖定常領域と融合し、完整なキャメル抗体構造（二つの重鎖からなる）を有するキメラ抗体分子を構築でき、このキメラ抗体分子は、同時にナノボディの高親和性と、高特異性及び本発明の重鎖可変領域のアゴニスト活性の増強された特性を有し、非常に良い開発見通しを持っている。

もう一つの好ましい本発明の抗体の実施例において、上記の抗原結合モジュールは、リガンドであり、上記のリガンドは、免疫共刺激分子であり、上記の免疫共刺激分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２４４、ＣＤ１５０、ＣＤ４８、ＣＤ８４、ＣＤ３１９、Ｌｙ１１８或いはＣＤ２２９から選ばれるいずれか一つである。これらの融合タンパク質は、抗がん薬物として使えられる。

もう一つの好ましい本発明の融合タンパク質の実施例において、上記の抗原結合モジュールが標的にする抗原は、ＣＤ４０、ＤＲ５、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＡＣＩ、ＤＲ４又はＦＡＳから選ばれるいずれか一つである。

本発明によるＣＤ４０に標的するアゴニスト分子（融合タンパク質）は、免疫助成剤として使えられる。当該免疫助成剤は、ワクチン（たとえばＯＶＡ）と共同使用できて、ワクチン組成物にして、腫瘍と感染の予防及び／又は治療に使えられる。

もう一つの好ましい本発明の融合タンパク質の実施例において、上記の抗原結合モジュールが標的にする抗原は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ又はＬＡＧ－３から選ばれるいずれか一つである。これらの標的に用いられ際に、上記の融合タンパク質は、炎症及び／又は自身免疫症状を軽減する薬物、たとえば喘息を治療する薬物の調製に使えられる。

もう一つの好ましい本発明の抗体の実施例において、上記の抗原結合モジュールは、リガンドであり、上記のリガンドは、免疫抑制性リガンドであり、上記の免疫抑制性リガンドは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ４７、ＶＩＳＴＡ、ＨＶＥＭ又はＧＡＬ９から選ばれるいずれか一つである。これらの標的に用いられ際に、上記の抗体は、炎症及び／又は自身免疫症状を軽減する薬物、たとえば喘息を治療する薬物の調製に使えられる。

本発明のもう一つは、本発明の上記の重鎖定常領域を含む抗体を提供する。
好ましくに、上記の抗体は、アゴニスト抗体である。
好ましくに、上記の抗体は、ＩｇＧである。

好ましくに、上記の抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体又はキメラ抗体である。
もう一つの好ましい本発明の抗体の実施例において、上記の抗体が標的にする抗原は、ＣＤ４０、ＤＲ５、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＡＣＩ、ＤＲ４、ＦＡＳから選ばれるいずれか一つである。

さらに、上記の抗体が標的にする抗原はＣＤ４０である。
より好ましくに、上記の抗体の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるような配列を有し、上記の抗体の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるような配列を有する；或いは上記の抗体の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示されるような配列を有し
、上記の抗体の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示されるような配列を有する。

本発明によるＣＤ４０を標的にするアゴニスト抗体は、免疫助成剤として使えられる。当該免疫助成剤は、ワクチン（たとえばＯＶＡ）と共同使用できて、ワクチン組成物にして、腫瘍と感染の予防及び／又は治療に使えられる。

もう一つの好ましい本発明の抗体の実施例において、上記の抗体が標的にする抗原は、免疫抑制性受容体分子であり、かつ上記の免疫抑制性受容体分子は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ－３から選ばれるいずれか一つである。これらの標的に用いられ際に、上記の抗体は、炎症及び／又は自身免疫症状を軽減する薬物、たとえば喘息を治療する薬物の調製に使えられる。

本発明は、さらに抗がん薬物の調製における、本発明の融合タンパク質或いは抗体の応用を提供する。
好ましくに、抗結腸がん薬物或いは抗線維肉腫薬物の調製に使用する。

本発明は、さらに、本発明の融合タンパク質或いは抗体、及び薬学的に許容される薬物担体を含む薬物組成物を提供する。当該薬物組成物は、がんを治療する薬物の調製に使えられる。好ましくに、抗結腸がん薬物或いは抗線維肉腫薬物の調製に使用する。

本発明は、さらに、人体に治療の有効投与量の本発明の融合タンパク質或いは抗体を適用することを含む人の内源性免疫応答を増強する方法を提供する。
本発明は、さらに、人体に治療の有効投与量の本発明の融合タンパク質或いは抗体を適用することを含む免疫治療方法を提供する。

本発明の有益效果は：本発明に提供される重鎖定常領域配列が、アゴニスト抗体又はアゴニスト分子（重鎖定常領域配列を含む融合タンパク質）の活性を著しくに増強でき、報道された類似の分子と比べて、より優れる活性を増強する效果を有する；かつ本発明の重鎖定常領域配列を有するアゴニスト抗体又は融合タンパク質が、より優れる活性を有しながら、より広い有効投与量の範囲及びより良い安全性を有し、重要な市場価値を備える。

図１は、抗体の基本な構造の模式図である。 図２は重鎖定常領域の配列アラインメント図であり、異なる人ＩｇＧサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４）の重鎖定常領域の構造を示す。 図３は、抗原結合活性テストであり、本発明によるアゴニスト抗マウスＣＤ４０と抗ヒトＣＤ４０抗体の実施例には、それぞれにマウスとヒトＣＤ４０抗原を特異性に結合できることを示す。抗ＣＤ４０抗体とＣＤ４０抗原の結合は、ＥＬＩＳＡで分析され、勾配のように希釈された各種の抗体が、コーティングされたマウスＣＤ４０（Ａ）又はヒトＣＤ４０（Ｂ）と結合した後に、抗ヒトＩｇＧに検出されたＥＬＩＳＡシグナル（Ａ６５０）を示す。 図４は、ＯＶＡ特異性ＣＤ８陽性Ｔ細胞増幅モデルにおける各ＩｇＧサブタイプの活性テストであり、アゴニスト抗マウスＣＤ４０抗体の生体内活性は、抑制型Ｆｃγ受容体ＦｃγＲＩＩＢに特異性に依存することを示す。まず、図に示されたマウスは、ＯＶＡ特異性ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞）に養子送達を行われ、１日後、パターン抗原ＯＶＡ（ＤＥＣ－ＯＶＡの形式で、ＯＶＡと抗ＤＥＣ２０５抗体の融合タンパク質であり、ＯＶＡ抗原を有効的に送達する手段である）とコントロール（Ｃｔｌ ＩｇＧ）或いは図に示された抗体定常領域を有する抗ＣＤ４０抗体で、マウスを免疫して、６日後、フロー技術で脾臓におけるＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の増幅状況を分析する。ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の増幅程度が、アゴニスト抗マウスＣＤ４０抗体が、ＯＶＡに免疫されたマウスにおける、ＯＶＡパターン抗原特異性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化・増幅する活性を促進することを反映する。実験に使用された抗マウスＣＤ４０抗体の投与量は、３０μｇ／マウスである。（Ａ）アゴニスト抗ＣＤ４０抗体の活性には、Ｆｃγ受容体の参与と相互作用は必要； （Ｂ）Ｆｃγ受容体と結合する能力を有しないヒトＩｇＧ２（Ｇ２－ＮＡ）抗体は、免疫を活性化する活性がない； （Ｃ）抑制型Ｆｃγ受容体を発現しないマウス（Ｒ２－／－）において、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は活性を有しないが、ヒト化抑制型Ｆｃγ受容体のマウス（Ｒ２－／－ｈＲ２ＢＴｇ）において、抑制型Ｆｃγ受容体は、免疫を活性化する活性を単独に駆動できる。 図５は、マウス脾臓細胞の生体外刺激実験であり、人のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の生体外活性は、抑制型Ｆｃγ受容体に依存することを示す。Ｂ細胞を活性化する活性分析は、アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体の生体内活性が、ヒト抑制型Ｆｃγ受容体の生体内活性の駆動に依存することを示す。図に示された遺伝子型を有するマウス（ｈＣＤ４０^Ｔｇ／ｈＦＣＧＲ^Ｔｇ：同時にヒトＣＤ４０とＦｃγＲｓを発現するもの；ｈＣＤ４０^Ｔｇ／ｈＲ２Ｂ－／－：ヒトＣＤ４０と人のＦｃγ受容体（ＦｃγＲＩＩＢを除く）を発現するもの）から脾臓細胞を分離して、図に示されたコントロール或抗ヒトＣＤ４０抗体を有する培地に、４８時間にかけて培養して、その後、フロー技術でＢ細胞活化標識分子ＣＤ８０、ＣＤ８６の発現水平を分析して、ＣＤ８０とＣＤ８６発現レベルの上昇の程度は、抗ＣＤ４０抗体の活性を反映する。２Ｂ６は、ヒト抑制性Ｆｃγ受容体ＦｃγＲＩＩＢ特異性な遮断抗体である。 図６は、本発明の実施例による重鎖定常領域実施例のＥＬＩＳＡ分析試験であり、異なる重鎖定常領域（ＪＡＣ３とＪＡＣ４を含む）とヒトＦｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ－Ｒ１３１及びＦｃγＲＩＩＢ）の結合特性が異なることを示す。テスト方法はＥＬＩＳＡであり、図に示された組換え抗ヒトＣＤ４０抗体でコーティングして、ビオチンにマークされた図に示されたようなヒトＦｃγ受容体分子と、コーティングされた抗体と、の結合を検出する。 図７は、ＯＶＡ特異性ＣＤ８陽性Ｔ細胞増幅モデルにおける活性テストであり、ＪＡＣ１配列を有する抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＩｇＧ２抗ＣＤ４０抗体の活性より優れることを示す。分析方法は、図４に示されたが、使用されたマウスは、それぞれにｈＦＣＧＲ^Ｔｇマウス（Ａ）とｈＣＤ４０^Ｔｇ／ ｈＦＣＧＲ^Ｔｇマウス（Ｂ）であり、抗ＣＤ４０抗体の投与量は、１０μｇ／マウスである。示されたＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の数量が、抗ＣＤ４０抗体に誘導されたＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の活化と増幅の活性を反映する。 図８は、ＪＡＣ３（ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＳＥＬＦ）とＪＡＣ４（ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＨＤＰＧ）を含む抗ヒトＣＤ４０抗体が、ｈＩｇＧ２より強いアゴニスト活性を有することを示す。図に示された抗ヒトＣＤ４０抗体が、Ｂ細胞を活性化する活性は、それぞれに、ｈＣＤ４０^ＴｇｈＦＣＧＲ^Ｔｇ脾臓細胞（Ａ）とＰＭＢＣ細胞（Ｂ）において、検出された。Ｂ細胞を活性化する活性分析は、ヒトｈＩｇＧ２と比べて、ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＳＥＬＦ、ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＨＤＰＧがアゴニスト抗ＣＤ４０抗体活性をもっとサポートできることを示す。図に示された抗ヒトＣＤ４０抗体が、Ｂ細胞を活性化する活性は、それぞれに、ｈＣＤ４０^ＴｇｈＦＣＧＲ^Ｔｇ脾臓細胞（Ａ）とＰＭＢＣ細胞（Ｂ）において、検出された。図に示された勾配のように希釈された濃度のコントロール或いはアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体を有する培養液で、細胞を４８時間にかけて培養して、その後、フロー技術で、マウスＢ細胞活化標識分子ＣＤ８６の発現レベル（Ａ）或いは人Ｂ細胞活化標識分子ＣＤ５４の発現レベルを分析する。これらの分子の発現レベルの上昇の程度は、抗ＣＤ４０抗体の活性を反映する。 図９は、ｈＩｇＧ３と比べて、ｈＩｇＧ２のＣＨ１－ヒンジ領域が、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体に、強い生体内の免疫を活性化する活性を与えられることを示す。図４と図７と同じ方法で、ｈＦＣＧＲ^Ｔｇマウスには、ＯＶＡワクチンモデルでそれぞれに、図に示された異なる抗マウスＣＤ４０抗体の活性を分析して、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の増幅程度が、抗ＣＤ４０抗体の活性を反映する。抗体の投与量は、１０μｇ／マウスである。（Ａ）４つのｈＩｇＧサブタイプには、ｈＩｇＧ２サブタイプが、かなり強い免疫を活性化する活性を示すが、ほかのｈＩｇＧサブタイプ、すなわちｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ３とｈＩｇＧ４は、基本的に活性を有しない。（Ｂ）コントロールグループと比べて、ｈＩｇＧ２は、明らかな活性を有するが、ｈＩｇＧ２のＣＨ１－ヒンジ領域がｈＩｇＧ３のＣＨ１－ヒンジ領域に置換されたバリアントｈＩｇＧ２（Ｈ３）は、基本的に活性を有しない。 図１０は、ＩｇＧ１とＩｇＧ３のＣＨ１－ヒンジ領域と比べて、ヒトＩｇＧ２のＣＨ１－ヒンジ領域が、ＯＶＡワクチンモデルにおける抗ＣＤ４０抗体の免疫アゴニスト活性をもっとサポートできることを示す。図４と図７と同じ方法で、ｈＦＣＧＲ^Ｔｇマウスには、ＯＶＡワクチンモデルでそれぞれに、図に示された異なる抗マウスＣＤ４０抗体の活性を分析して、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の増幅程度（Ａ）とＣＤ８：ＣＤ４割合（Ｂ）が、抗ＣＤ４０抗体の活性を反映する。抗体の投与量は、１０μｇ／マウスである。 図１１は、ＯＶＡワクチンモデルにおいて、ヒトＩｇＧ２（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２）と、Ｖ１１（Ｈ１）を含む抗マウスＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１（Ｖ１１））と比べて、ＪＡＣ１を含む抗マウスＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１））は、より優れる活性を有することを示す。図４と図７と同じ方法で、ｈＦＣＧＲ^Ｔｇマウスには、ＯＶＡワクチンモデルでそれぞれに、図に示された異なる抗マウスＣＤ４０抗体の活性を分析して、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の増幅程度（Ａ）とＣＤ８：ＣＤ４割合（Ｂ）が、抗ＣＤ４０抗体の活性を反映する。抗体の投与量は、１０μｇ／マウスである。 図１２は、ＰＢＭＣ生体外刺激実験において、ヒトＩｇＧ２（Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２）と、Ｖ１１（Ｈ１）を含む抗ヒトＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ１（Ｖ１１））と比べて、ＪＡＣ１を含む抗ヒトＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１））は、より優れる活性を有することを示す。 図１３は、ＭＣ３８腫瘍成長曲線であり、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、ヒトＩｇＧ２（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２）と、Ｖ１１（Ｈ１）を含む抗マウスＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１（Ｖ１１））と比べて、ＪＡＣ１を含む抗マウスＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１））は、より優れる活性を有することを示す。ｈＦＣＧＲ^Ｔｇマウスは、０日目にＭＣ３８腫瘍細胞を皮下移植され、腫瘍形成後に、７日目と１０日目に、二回に腹腔内注射で図に示された抗体を投与して、治療を行って、投与量は、マウス１匹あたり毎回３１．６μｇであり、その後、腫瘍の体積（Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ）の変化（グループあたりは７匹マウス）を測量する。 図１４は、図１３に示された試験結果の別の表現形式である。 図１５は、ＭＯ４腫瘍成長曲線であり、ＭＯ４マウス線維肉腫モデルにおいて、ヒトＩｇＧ２（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２）と、Ｖ１１（Ｈ１）を含む抗マウスＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１（Ｖ１１））と比べて、ＪＡＣ１を含む抗マウスＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１））は、より優れる活性を有することを示す。ｈＦＣＧＲ^Ｔｇマウスは、０日目にＭＯ４腫瘍細胞を皮下移植され、腫瘍形成後に、７日目に、腹腔内注射で図に示された抗体とパターン抗原ＯＶＡ（ＯＶＡと抗ＤＥＣ２０５抗体の融合タンパク質の形式として）を投与して、治療を行って、投与量は、マウス１匹あたり３１．６ μｇ抗体と、２μｇ ＯＶＡパターン抗原であり、その後、腫瘍の体積を測量する。 図１６は、ＭＣ３８腫瘍成長曲線であり、ＩｇＧ Ｆｃ受容体ノックアウトマウス（ ＦｃγＲ^－／－ ）には、アゴニスト抗マウスＣＤ４０抗体が抗腫瘍活性を有しないことを示す。 図１７は、ＯＶＡワクチンモデルにおいて、低い投与量の、ＪＡＣ１を含む抗マウスＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１））が活性を有することを示す。図４と図７と同じ方法で、ｈＦＣＧＲ^Ｔｇマウスには、ＯＶＡワクチンモデルでそれぞれに、図に示された異なる投与量のコントロールとＪＡＣ１抗マウスＣＤ４０抗体の活性を分析して、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の増幅程度が、抗ＣＤ４０抗体の活性を反映する。 図１８は、ＯＶＡワクチンモデルにおいて、ＪＡＣ４を含む抗マウスＣＤ４０抗体は強いアゴニスト活性を有することを示す。図４と図７と同じ方法で、ｈＦＣＧＲ^Ｔｇマウスには、ＯＶＡワクチンモデルでそれぞれに、図に示された異なる抗マウスＣＤ４０抗体の活性を分析して、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の増幅程度が、抗ＣＤ４０抗体の活性を反映する。 図１９は、ＪＡＣ１を含む抗ＤＲ５抗体は、より強いアポトーシスを促進する能力を有することを示す。抗ＤＲ５抗体活性をサポートする能力は、ヒトＩｇＧ２より優れて、かつヒト抑制性Ｆｃγ受容体に依存する。コントロールと異なる抗マウスＤＲ５抗体が、それぞれに、図に示された遺伝子型マウス脾臓細胞（ＦｃｇＲ－／－或ｈＦＣＧＲ^Ｔｇ）を存在しない又は存在する場合に、及びヒト抑制性Ｆｃγ受容体特異性遮断抗体２Ｂ６存在しない又は存在する場合に、ＭＣ３８細胞を処理して、その後、ＭＣ３８細胞におけるＣａｓｐａｓｅ－３の活化状況（Ａｃｔｉｖｅ ｃａｓｐａｓｅ－３ （％）、抗ＤＲ５抗体が、ＤＲ５下流細胞アポトーシスシグナルの活性を活性化することを反映するもの）を分析する。 図２０は、抗体定常領域と活性化型Ｆｃγ受容体の結合能力の向上（Ｉ／Ａ比率の低下）が、アゴニスト抗ＣＤ４０的活性を低減させることを示す。図において、バリアントａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１－ＳＤＩＥとバリアントａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１－ＧＡＳＤＡＬＩＥは、活性化型Ｆｃγ受容体とのより強い結合能力と、より低いＩ／Ａ比率を有して、その生体内免疫活性化活性は、より高いＩ／Ａ 比率を有する抗体ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－Ｇ１（Ｈ２）より低い、そして、ＯＴ１細胞の割合と、ＯＴ１細胞の絶対数及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合がいずれも著しくに低下することを表して、活性化型Ｆｃγ受容体との結合能力が抗体の活性に重要な影響を有することを示す。

特に記載がない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。また、本明細書に特に限定されていない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含む。一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、およびタンパク質と核酸化学に関わる命名法および技術は、当技術分野において公知なものであり、一般的に用いられている。

本発明の方法および技術は、一般に、当技術分野で公知の従来の方法に従って行われ、特に限定されていない限り、本明細書に列挙された一般的および専門的な参考文献に記載されている。たとえば、ＳａｍｂｒｏｏｋなどのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））及びＡｕｓｕｂｅｌなどのＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ （１９９２）、及びＨａｒｌｏｗとＬａｎｅのＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０））を参照して、その内容は引用の方式で本明細書に取り入られる。酵素反応および精製技術は、製造者の指示に従って行われ、一般に、当該分野で公知の方法または本明細書に記載の方法に従って実施することができる。本明細書に記載される生物学、薬理学、および医学および薬学に関連する命名法、ならびに実験方法と技術は、当技術分野において公知なものであり、一般的に用いられている。化学合成方法、化学分析方法、医薬品製造方法、調製方法および送達方法、および患者の治療方法には、いずれも標準的な技術が用いられる。

特に断りのない限り、以下の用語は以下の定義を有する：
用語「抗体」（「ｍＡｂ」）又は「モノクローナル抗体」とは、単一な分子組成を有する抗体分子（すなわち、一次配列が基本的に同じで、かつ特定なエピトープに対して、単一な結合特異性と、親和性を表す抗体分子）の調製品である。抗体は、ハイブリドーマ、組換え、トランスジーン又は当業者が既知した他の技術より製造できる。

「抗体」が、免疫グロブリン（Ｉｇ）を含むが、それに限定されない。物理化学性質と生物学的な機能によって、抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤの五種類に分けられる。ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４の四つのサブクラスを含む（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ Ｇ， Ｄｅｋｋｅｒｓ Ｇ ａｎｄ Ｒｉｓｐｅｎｓ Ｔ （２０１４） ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ： ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５：５２０）。本発明には、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３とｈＩｇＧ４は、それぞれに、人のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４を表す。

「抗体」が、特異性に抗原と結合し、かつ少なくともジスルフィド結合で互いに連結する二つの重鎖（Ｈ）と二つの軽鎖（Ｌ）を含む。各重鎖が、重鎖可変領域（本明細書には、単にＶＨという）と、重鎖定常領域（本明細書には、単にＣＨという）を含む；各軽鎖が、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。抗体の「重鎖定常領域」は、ＣＨ１、ＣＨ２とＣＨ３の三つのドメイン、及びＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に位置するヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）を含む。図１は、ＩｇＧ抗体の基本構造の模式図を示す。

Ｋａｂａｔなどが、重鎖と軽鎖可変領域の多くの一次配列を集めた。彼らは、配列の保存程度に基づき、各の一次配列をＣＤＲとフレームに分けて、かつそれらのリストを作成する（ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳ Ｔ，第５版， ＮＩＨｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｎｏ． ９１－３２４２， Ｅ． Ａ． Ｋａｂａｔなどを参照して、全てを取り入れて参考になる）。ＩＭＧＴデータには、ヒトＩｇＧの各ドメインのＥＵ指数は整理された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ）。ＩｇＧ抗体の背景において、重鎖定常領域のＣＨ１ドメインとは、ＫａｂａｔのＥＵ指数に基づき番号をつけられたサイト１１８－２１５である；重鎖定常領域のＣＨ２ドメインとは、ＫａｂａｔのＥＵ指数に基づき番号をつけられたサイト２３１－３４０である；重鎖定常領域とＣＨ３ドメインとは、ＫａｂａｔのＥＵ指数に基づき番号をつけられたサイト３４１－４４７である；重鎖定常領域のヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）が、サイト２１６ （ＩｇＧｌ中的Ｅ２１６）－２３０（ＩｇＧｌ中的Ｐ２３０）を含み、ただしＫａｂａｔなどのＥＵ指数に基づき番号をつけられた。図２は、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４の重鎖可変領域の配列アラインメント図を示す。

各軽鎖は、「軽鎖可変領域」（本明細書には、単にＶＬという）と「軽鎖定常領域」を含む。軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬからなるものである。ＶＨとＶＬ領域は、更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高度可変な領域に細かく分かれ、それらの間に、比較的に保存な、フレーム領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在してある。各ＶＨとＶＬは、三つのＣＤＲと四つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並べる。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原と互いに作用する結合ドメインを含む。

「Ｆｃ領域」（結晶化可能領域）又は「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ」とは、抗体の重鎖におけるＣ－末端領域であり、それが、免疫システムの各種の細胞（たとえば、エフェクター細胞）に位置するＦｃ受容体との結合、或いは古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）と
の結合を含む、免疫グロブリンと宿主組織或いは因子との結合を仲介する。ＩｇＧ、ＩｇＡとＩｇＤ抗体のアイソタイプには、Ｆｃ領域は、抗体の二つの重鎖のＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインの二つの同一のタンパク質断片からなる；ＩｇＭとＩｇＥのＦｃ領域は、各ポリペプチド鎖に三つの重鎖恒定ドメイン（ＣＨドメイン２－４）を含む。免疫グロブリンの重鎖のＦｃ領域の限界は変化できるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常に、重鎖のＣ２２６或Ｐ２３０位置のアミノ残基からカルボキシ末端までの配列断片と定義され、ただし、当該番号は、Ｋａｂａｔのように、ＥＵ指数に基づくものである。本明細書に使用されたように、Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃであっても良い、或いはバリアントＦｃであっても良い。

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する受容体である。ＩｇＧ抗体と結合するＦｃＲは、ＦｃγＲファミリーの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子バリアントと選択的スプライシング形式も含む。ヒトＦｃγ受容体ファミリーは、いくつのメンバーを含む： ＦｃγＲＩ （ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ （ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ （ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ （ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ （ＣＤ１６ｂ）。その中、ＦｃγＲＩＩＢは、唯一の抑制性Ｆｃγ受容体であり、他のは、いずれも活化型Ｆｃγ受容体である。大多数の自然エフェクター細胞型が、一種又は多種の活性化性ＦｃγＲと抑制性ＦｃγＲＩＩＢを共発現するが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、選択的に一つの活性化性Ｆｃγ受容体（在マウス中是ＦｃγＲＩＩＩ、在人中是ＦｃγＲＩＩＩＡ）を発現しつつ、マウスとヒトに、抑制性ＦｃγＲＩＩＢを発現しない。これらのＦｃγ受容体の分子構造が異なるから、各ＩｇＧ抗体サブクラスに対する異なる親和性を有する。これらのＦｃγ受容体の中、ＦｃγＲＩは、高親和性の受容体であるが、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲＩＩＩＡは、低親和性の受容体である。遺伝子多型も、これらの異なるＦｃγ受容体に存在しつつ、それらの結合親和性に影響する。最も一般的な遺伝子多型は、ＦｃγＲＩＩＡのＲ１３１／Ｈ１３１と、ＦｃγＲＩＩＩＡのＶ１５８／Ｆ１５８などの多型形式である。これらの多型形式の中、多種の疾患に関係することを見つかれることもあり、一部の特定な治療抗体の效果も、患者が特定なＦｃγ受容体遺伝子多型形式を持つか否かに依存する。

本発明に記載された「配列」は、本発明の配列と実質的に同一の配列を含むと理解され、上記の「実質的に同一の配列」とは、最適化アラインメントされた後に、例えばＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムを採用し、使用デフォルトギャップ値で測定する際に、二種類のペプチド配列の間に、少なくとも７０、７５或８０％の配列同一性を有し、好ましくに、少なくとも９０或９５％の配列同一性を有し、より好ましくに、少なくとも９７、９８或９９％の配列同一性を有する。好ましくに、異なる残基位置の相違は、保存性のアミノ酸置換であるは思わしい。「保存性のアミノ酸置換」とは、その中のアミノ酸残基は、別の化学的な性質（たとえば：電荷又は親水性）が類似する側鎖のＲ基を有するアミノ酸残基で置換されることである。一般的に、保存性のアミノ酸置換は、実質的にタンパク質の機能と性質を変わらない。その中の二種類又は複数種のアミノ酸配列の相違は、保存性の置換である場合に、配列の同一性百分比或いは類似性は向上され、置換作用の保存性を訂正する。たとえば、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：
３０７－３１（１９９４）を参照する。化学的な性質が類似する側鎖を有するアミノ酸基の実例は、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、とイソロイシン；２）脂肪族－ヒドロキシル基側鎖：セリンとトレオニン；３）アミドを含有する側鎖：アスパラギンとグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、とトリプトファン；５）アルカリ側鎖：リシン、アルギニン、とヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸とグルタミン酸；及び７）硫黄を含有する側鎖：システイン与メチオニンを含む。好ましい保存性のアミノ酸置換のグループは、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、及びアスパラギン－グルタミンである。

本発明の抗体及びその断片或いはドメインのアミノ酸のシリアルナンバーは、ＩｇＧ ＥＵ番号（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ）に基づくものである。抗体は、一般的に高親和性でその関連する抗原と特異性に結合し、１０^－５－１０^－１１Ｍ又はより小さい解離定数（ＫＤ）を表す。約１０^－４Ｍ^－１より大きい、任意なＫＤは、一般的に非特異性の結合を指示する。本明細書に使用されたように、抗原と「特異性に結合」する抗体とは、高親和性で、抗原や基本的に同一の抗原と結合する抗体であり、それは、ＫＤは、１０^－７Ｍ又はより小さい、好ましくに１０^－８Ｍ又はより小さい、より好ましくに５× １０^－９Ｍ又はより小さい、最も好ましくに１０^－８－１０^－１０Ｍ又はより小さいことを表すが、高親和性で関係がない抗原と結合しない。抗原が、指定された抗原と、高い配列同一性を表し、たとえば、指定された抗原の配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくに少なくとも９５％、より好ましくに少なくとも９７％、又はより好ましくに少なくとも９９％の配列同一性を表すと、当該抗原は、指定された抗原とは、「基本的に同一」なものである。

本発明に記載された「抑制性Ｆｃγ受容体及び活化性Ｆｃγ受容体に対する親和性の比率」或いは「Ｉ／Ａ比率」とは、タンパク質分子が、抑制性Ｆｃ受容体に対する親和性と、活性化性Ｆｃ受容体に対する親和性との比率であり、本発明には、Ｉ／Ａ比率は、以下のように計算される：Ｉ／Ａ比率＝［ＫＤ（ｈＦｃγＲＩＩＡ）或いはＫＤ（ｈＦｃγＲＩＩＩＡ）の中に比較に低いＫＤ値］／ＫＤ（ｈＦｃγＲＩＩＢ）；ただし、ＫＤ（ｈＦｃγＲＩＩＡ）は、当該分子がｈＦｃγＲＩＩＡ受容体（バリアントｈＦｃγＲＩＩＡ－Ｒ１３１を代表とする）に対する平衡解離定数であり、ＫＤ （ｈＦｃγＲＩＩＩＡ）は、当該分子がｈＦｃγＲＩＩＩＡ受容体（バリアントｈＦｃγＲＩＩＩＡ－Ｆ１５８を代表とする）に対する平衡解離定数であり、ＫＤ（ｈＦｃγＲＩＩＢ）は、当該分子が、ｈＦｃγＲＩＩＢ受容体に対する平衡解離定数である；ｈＦｃγＲＩＩＡとは、ヒトのＦｃγＲＩＩＡ受容体であり、ｈＦｃγＲＩＩＩＡとは、ヒトのＦｃγＲＩＩＩＡ受容体であり、ｈＦｃγＲＩＩＢとは、ヒトのＦｃγＲＩＩＢ受容体である。上記の「親和性」とは、二つの分子の間の結合能の大きさであり、通常に、ＫＤで計測する。

「ＫＤ」とは、二つの分子が（たとえば：特定な抗体と抗原、或いはリガンドと受容体）互いに作用する平衡解離定数である。「抗原結合モジュール」とは、高親和性で特異性に抗原と結合するタンパク質であり、抗体の抗原結合断片、ａｄｎｅｃｔｉｎ、 ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ミニ抗体、アフィボディー（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、ａｆｆｉｌｉｎ、受容体の標的結合領域、細胞接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、とケモカインなどを含むが、それらに限らない。抗原結合モジュールが標的にする抗原は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、免疫抑制性受容体分子などを含むが、それらに限らない。

用語「抗体の抗原結合部分」とは、抗原と結合する責任をもつ抗体のアミノ酸残基である。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書に定義された高度可変領域に属しない、これらの可変領域である。したがって、抗体の軽鎖と重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３とＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原の結合と、抗体の性能を定義することに最も寄与する領域である。ＣＤＲとＦＲは、Ｋａｂａｔなどの、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）の標準定義及び／又は「高度可変環」の残基より確定される。

本発明の「抗体」は、たとえば天然に存在する、或いは天然に存在しない抗体；モノクローナルとポリクローナル抗体；キメラとヒト化抗体；ヒト或いは非ヒト抗体；完全合成抗体を含む。

「ヒト」抗体とは、その可変領域は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列由来のフレーム領域とＣＤＲ領域を有する抗体である。なお、抗体が定常領域を含有すると、定常領域もヒト生殖系免疫グロブリン配列由来のものである。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（たとえば、生体外でのランダムまたは部位特異的突然変異や、生体内での体細胞突然変異によって、導入された突然変異）を含んでも良い。しかしながら、本明細書に使用されたように、用語「ヒト抗体」は、他の哺乳動物種（マウスのような）種系由来のＣＤＲ配列を、ヒトフレーム配列に移植してなる抗体を含むことを意図しない。用語「ヒト」抗体は、「完全ヒト」抗体との同義語として使用される。

「ヒト化」抗体とは、その中の非ヒト抗体ＣＤＲドメインを除く一部、大部分或いは全部のアミノ酸は、ヒト免疫グロブリン由来の相応のアミノ酸に取り替えられる抗体である。ヒト化形式抗体の一つの実施の形態において、ＣＤＲドメインを除く一部、大部分或いは全部のアミノ酸は、ヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸に取り替えられるが、一つ又は以上のＣＤＲ領域のうちの一部、大部分又は全部のアミノ酸は変わらない。抗体が、特定な抗原と結合する能を取り除かない限り、アミノ酸に対する小さい付加、欠失、挿入、置換または修飾は許容される。「ヒト化」抗体は、オリジナル抗体に類似する抗原特異性を保留する。

「キメラ抗体」とは、可変領域と定常領域は、それぞれに異なる種に由来する抗体であり、たとえば可変領域は、マウス抗体に由来するが、定常領域はヒト抗体に由来する抗体である。

「アゴニスト抗体」は、受容体と結合し、かつ受容体を活性化する抗体である。アゴニスト抗体の機能の実例は、１）抗ＤＲ５のアゴニスト抗体が、ＤＲ５と結合し、かつＤＲ５受容体を発現する細胞のアポトーシスを誘導する；２）抗ＣＤ４０のアゴニスト抗体が、免疫細胞の表面と結合することで、免疫活性化シグナルの標的分子を転送し、かつそれに制御された重要な免疫活性化シグナル経路を活性化し、そして抗腫瘍免疫応答を増強し、間接に腫瘍細胞を殺滅できることを含むが、それらに限定されない。

臨床研究段階に入ったアゴニスト抗体の一部の実例を、以下の表1に示す。

上記の表に示されたアゴニスト抗体は、重鎖定常領域を本発明の重鎖定常領域に取り替えることで、より高いアゴニスト活性を得られる。或いは、本発明のアゴニスト抗体は、上記の表に示されたアゴニスト抗体の抗原結合断片を採用し、特定なＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに対する活性を増強されたアゴニスト抗体を構成できる。

「免疫共刺激因子」とは、免疫細胞活化に、第二活化シグナルを提供するリガンド分子である。ＭＨＣ／抗原ペプチド－Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に第一シグナルを提供する以外に、Ｔ細胞の活化には、さらにＢ７／ＣＤ２８、ＩＣＯＳＬ／ＩＣＯＳ、ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０、４－１ＢＢＬ／４－１ＢＢなどを含むものが共刺激シグナルを提供することも必要が有る。Ｂ細胞の活化には、抗原／Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）以外に、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０などが提供する共刺激シグナルも必要が有る。こんなシグナル経路におけるリガンド分子は、免疫共刺激因子である。本発明には、好ましい免疫共刺激因子の実例は、Ｂ７（ＣＤ８０、ＣＤ８６）、ＩＣＯＳＬ、ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ１３４、４－１ＢＢＬ／ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＣＤ３０Ｌ／ＣＤ１５３、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０或いはＳＬＡＭファミリー分子（ＣＤ２４４、ＣＤ１５０、ＣＤ４８、ＣＤ８４、ＣＤ３１９、Ｌｙ１０８、ＣＤ２２９、ＳＬＡＭＦ８）など含むが、それらに限定されない。

本明細書の「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー」或いは「ＴＮＦ受容体スーパーファミリー」とは、ＴＮＦファミリーのサイトカインと結合できる受容体ポリペプチドである。一般的に、これらの受容体は、その細胞外領域に一つ又は以上のシステイン豊富の重複配列を有するＩ型膜貫通受容体である。ＴＮＦ遺伝子ファミリーの中のサイトカインの実例は、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、腫瘍壊死因子－β（ＴＮＦ－β又はリンパ毒素）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ－４０リガンド
、４－１ＢＢリガンド、Ａｐｏ－１リガンド（Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも言う）、Ａｐｏ－２リガンド（ＴＲＡＩＬとも言う）、Ａｐｏ－３リガンド（ＴＷＥＡＫとも言う）、ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ）、ＡＰＲＩＬ、ＲＡＮＫリガンド（ＴＲＡＮＣＥとも言う）、とＴＡＬＬ－１（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも言う）を含む。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの中の受容体の実例は、１型腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ１）、２型腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ２）、ｐ７５神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）、Ｂ細胞表面抗原ＣＤ４０、Ｔ細胞抗原ＯＸ－４０、Ａｐｏ－１受容体（Ｆａｓ又はＣＤ９５）、Ａｐｏ－３受容体（ＤＲ３、ｓｗ１－１、ＴＲＡＭＰとＬＡＲＤとも言う）、「膜貫通型の活性化因子およびCAMLインタラクタ（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）」又は「ＴＡＣＩ」と呼ばれる受容体、ＢＣＭＡタンパク質、ＤＲ４、ＤＲ５（或いは、Ａｐｏ－２；ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ－６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも言う）、ＤＲ６、ＤｃＲ１（ＴＲＩＤ、ＬＩＴ又はＴＲＡＩＬ－Ｒ３とも言う）、ＤｃＲ２（ＴＲＡＩＬ－Ｒ４又はＴＲＵＮＤＤとも言う）、ＯＰＧ、ＤｃＲ３（ＴＲ６又はＭ６８とも言う）、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ（ＡＴＡＲ又はＴＲ２とも言う）、ＧＩＴＲ、ＺＴＮＦＲ－５、ＮＴＲ－１、ＴＮＦＬ１、ＣＤ３０、リンパ毒素β受容体（ＬＴＢｒ）、４－１ＢＢ受容体和ＴＲ９（ＥＰ９８８，３７１ Ａ１）を含む。本発明には、好ましいＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの実例は、ＣＤ４０、ＤＲ５、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＡＣＩ、ＤＲ４或いはＦＡＳなどを含むが、それらに限定されない。

「免疫抑制性受容体」は、膜貫通糖タンパク質の一つであり、免疫細胞内の活化シグナルの伝達を抑制或いは遮断でき、本発明の実施例において、免疫抑制性受容体分子は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ或いはＬＡＧ－３などを含むが、それらに限定されない。

「免疫抑制性リガンド」は、免疫抑制性受容体のリガンドであり、免疫抑制性受容体と結合し、かつその下流の抑制性シグナルを活性化でき、本発明の実施例において、免疫抑制性リガンド分子は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＨＶＥＭ或いはＧＡＬ９のいずれかの一つを含むが、それらに限定されない。

「免疫応答」とは、脊椎動物生体内における、外来の作用媒介に対する生物学応答であり、当該応答が、生物体を、これらの作用媒介或いはそれによる疾患の傷害から保護できる。免疫応答は、免疫システムの細胞（たとえば、Ｔ淋巴細胞、Ｂ淋巴細胞、ナチュラルキラーＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞或好中球）とこれらの細胞のいずれか一つ又は肝臓に産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカインと補体を含む）の作用によるものであり、それが、脊椎動物生命体が病原体、細胞又は病原体に感染される組織、がん細胞或いは他の異常細胞に侵入すること、或いは自己免疫性又は病理学的炎症に、正常のヒト細胞又は組織を選択性に標的、結合、損害、破壊、及び／又は除去することを引く。

「免疫療法」とは、免疫応答を誘導、強化、抑制或いは修飾することを含む方法で、疾患を有し、疾患が発生するリスクがあり、或いは疾患を再発する被験者を治療することである。

「内因性免疫応答を増強」とは、被験者の生体内に既有の免疫応答の有効性又は強度を強化することである。こんな效率と潜在力の強化は、たとえば、内因性の宿主免疫応答に対する抑制を克服する機構で、或いは内因性の宿主免疫応答に対する強化を刺激する機構で達成できる。

薬物又は治療剤（たとえば本発明の融合タンパク質或いは抗体）の「治療有効量」又は
「治療有効投与量」とは、薬物の以下のように記載された任意の量である：当該量の薬物を、単独に使用し、又は別の治療剤と組み合わせて使用する際に、疾患の退行を促進できる；疾患の退行は、疾患の症状の重症度の軽減、疾患の症状がない期間の頻度と期間の増加、或いは疾患による障害又は不自由の防止に表れる。薬物の治療有効量又は投与量は、「予防有効量」又は「予防有効投与量」を含み、「予防有効量」又は「予防有効投与量」とは、薬物の以下のように記載された任意の量である：当該量の薬物を、単独に、又は別の治療剤と組み合わせて、疾患が発生するリスクがあり、或いは疾患を再発する被験者に給与する際に、疾患の発生または再発を阻害できる。治療剤が、疾患の退行を促進する、又は疾患の進展や再発を阻害する能は、当業者が既知の各方法で評価でき、たとえば人被験者の臨床試験において、人における效力を予測する動物モデルシステムに、或いは生体外の測定システムに、試薬の活性を測定できる。

例を挙げると、抗がん剤（治療がんの薬物組成物）が、被験者の生体内の腫瘍の退行を促進する。好ましい実施の形態において、治療有効量の薬物が癌細胞の退行ないしがんの消除を促進する。「がんの退行を促進」とは、単独に、又は抗腫瘍剤（ａｎｔｉ－ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ）と組み合わせて、治療有効量の薬物を投与することで、腫
瘍の成長や大きさの減少、腫瘍の壊死、少なくとも一つの疾患の症状の重症度の軽減、疾患の症状がない期間の頻度と期間の増加、疾患による障害又は不自由の防止を引き、或いは他の方式で患者の疾患の症状を改善することである。また、治療に関する「有効」と「有効性」という用語は、薬理学的な有効性と生理学的な安全性を含む。薬理学的な有効性とは、薬物が、患者がんの退行を促進する能を指す。生理学的な安全性とは、薬物の使用による細胞、器官及び／又は生物体レベルの毒性、或いは他の有害な生理效果（有害作用）のレベルを指す。

腫瘍を治療する例として、治療されていない被験者と比べて、治療有効量又は投与量の薬物は、好ましくに、少なくとも約２０％、より好ましくに少なくとも約４０％、さらに好ましくに少なくとも約６０％、かつもっとより好ましくに少なくとも約８０％ほどに、細胞の成長、又は腫瘍の成長を抑制する。最も好ましい実施の形態において、治療有効量又は投与量の薬物は、完全に細胞の成長又は腫瘍の成長を抑制でき、すなわち、好ましくに、１００％ほど細胞の成長又は腫瘍の成長を抑制する。化合物が、腫瘍の成長を抑制する能を、動物モデルシステムで評価でき、たとえば本明細書に記載されたＭＣ３８結腸腺癌マウス腫瘍モデルは、ヒト腫瘍における效力を予測できる。代わりに、組成物の当該性質は、化合物が細胞の成長を抑制する能を検出ことで評価でき、こんな抑制は、当業者が既知の測定方法で生体外に測量できる。本発明の他の好ましい実施の形態において、腫瘍の退行は、観察されて、かつこんな退行は、少なくとも約２０日、より好ましくに少なくとも約４０日、又はさらに好ましくに少なくとも約６０日にかけて続ける。

被験者に対する「治療」又は「療法」とは、疾患に関する症状、合併症、病気又は生化学的な指標の出現、進展、発展、重症度又は再発を、逆転、緩和、改善、抑制、減速または予防することを目的として、被験者にいずれかタイプの介入又は処理し、或いは活性剤を投与することである。

本発明の免疫治療方法の好ましい実施の形態において、被験者は人である。
「がん」とは、異常な細胞が生体内に制御されなく成長することを特徴とする多様な疾患を指す。制御されない細胞分裂と成長が、悪性腫瘍又は細胞の形成を引き、それらが、近傍の組織に侵入しながら、リンパ系又は血流より、身体の遠位部分に転移する。本発明には、「がんを治療」の別の同等の記述は、「腫瘍を治療」或いは「抗がん」或いは「抗腫瘍」である。

上記に記載されたように、本発明は、本発明の重鎖定常領域配列の抗体又は融合タンパ
ク質が、がんのような増殖性疾患を治療する応用を含む。がんは、身体の器官とシステムの正常機能細胞の成長を、制御されていないに障害する病症である。がんを有する被験者は、がん細胞が、被験者の生物体内に、客観的に測定可能に存在する被験者である。がんが進展する危険がある被験者は、がん（たとえば家族歴、遺伝的素因に基づき）が進展しやすい被験者や、放射線又は他のがんをもたらす試薬を接触する被験者である。元の部位から転移し、かつ重要な器官に接種するがんは、影響された器官の機能の退化で、最終的に被験者の死亡を引き起こす。造血器がん（例えば白血病）が、被験者の正常の造血器との競合に勝ち得り、そして、（貧血、血小板減少症と好中球減少症の形式で）造血不全になり、最終に死亡を引き起こす。

本発明は、以下の内容を含む：多様ながん、又はがんが進展する危険がある被験者を治療するために、本発明の重鎖定常領域配列の抗体又は融合タンパク質を使用すること。こんながんの例としては、乳がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、黒素瘤、結腸がん、胃がん、肝がん、食道がん、腎臓がん、咽喉がん、甲状腺がん、膵臓がん、精巣がん、脳がん、骨がん和血液かん（例えば白血病、慢性リンパ球性白血病）などを含む。一つの実施例において、本発明のワクチン組成物は、免疫反応を刺激するために用いられ、腫瘍の成長の抑制又は遷延や、腫瘍の大きさの減少で、腫瘍を治療する。腫瘍に関する抗原は、主に（それらに限定されない）腫瘍細胞が発現する抗原であっても良い。

他のがんは、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）がん、子宮頸がん、絨毛がん、結腸直腸がん、結合組織がん、消化器系がん、子宮内膜がん、食道がん、目がん、頭頸部がん、胃がん、上皮性腫瘍、腎臓がん、喉がん、肝がん、（小細胞、大細胞）肺がん、リンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含む）；黒素瘤；神経芽細胞腫；口腔がん（たとえば唇、舌、口、及びのど）；卵巣がん；膵臓がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸がん；呼吸器系がん；肉腫；皮膚がん；胃がん；精巣がん；甲状腺がん；子宮がん；泌尿器系がん；及び他のがんと肉腫を含むが、それらに限定されない。

「ワクチン」とは、単独に投与し、又は補助剤と結合して投与する際に、免疫的な抗原特異性効果を引き起こす組成物である。保護を与える予防性ワクチンと、治療性ワクチンを含む。

本発明のワクチン組成物が、治療又は予防できる感染は、バクテリア、ウイルス、真菌又は寄生虫を含む。他の珍しいタイプの感染は、リケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍｓ）と病原体（ａｇｅｎｔｓ）に引かれるスクレイピー（ｓｃｒａｐｉｅ）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）及びプリオン病（たとえばクールー病（ｋｕｒｕ）とクロイツフェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ－Ｊａｃｏｂｄｉｓｅａｓｅ））を含む。人を感染するバクテリア、ウイルス、真菌又は寄生虫の例は、既知されたものである。感染は、急性、亜急性、慢性または潜在的なものであってよい、かつ局所または全身性なものであってよい。また、感染は、宿主における感染性生物因子のライフサイクルの少なくとも一つの段階に、主に細胞内又は細胞外に位置しても良い。

本発明のワクチン組成物と方法で対抗できるバクテリア感染は、グラム陰性とグラム陽性菌を含む。グラム陽性菌の例として、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）種とレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）種を含むが、それらに限定されない。グラム陰性菌の例として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種とサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種を含むが、それらに限定されない。感染性バクテリアの特定の例として、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリ
ア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリア属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）種（たとえばマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｉｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、マイコバクテリウム・ゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｒｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群レンサ球菌属）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群レンサ球菌属）、レンサ球菌属（緑膿菌群）、大便レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、ウシレンサ球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｖｉｓ）、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ａｅｎｏｒｏｂｉｃｓｐｐ．）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター属（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉｅ）、ウエルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、トレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）とアクチノマイセス・イスラエリー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｉｓｒａｅｌｉｉ）を含むが、それらに限定されない。

人の感染を引き起こすウイルスの例として、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（たとえばＨＩＶ－１（ＨＴＬＶ－ＩＩＩとも言う）、ＨＩＶ－ＩＩ、ＬＡＣ或ＩＤＬＶ－ＩＩＩ／ＬＡＶ或ＨＩＶ－ＩＩＩのようなヒト免疫不全ウイルス、及びＨＩＶ－ＬＰのような他の分離株）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（たとえばポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、ヒトコクサッキーウイルス（ｈｕｍａｎＣｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓｅｓ）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）、エコーウイルス（ｅｃｈｏｖｉｒｕｓｅｓ））、カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（たとえば胃腸炎を引き起こす菌株）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（たとえばウマ脳炎ウイルス（ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓｅｓ）、風疹ウイルス（ｒｕｂｅｌｌａｖｉｒｕｓｅｓ））、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（たとえばデング熱ウイルス（ｄｅｎｇｕｅｖｉｒｕｓｅｓ）、脳炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓｅｓ）、黄熱病ウイルス（ｙｅｌｌｏｗｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｅｓ））、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（たとえばコロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ））、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（たとえば水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔａｖｉｒｕｓｅｓ）、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓｅｓ））、フィロウイルス科（Ｆ
ｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（たとえばエボラウイルス（Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓｅｓ））、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（たとえばパラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ）、流行性耳下腺炎ウイルス（ｍｕｍｐｓｖｉｒｕｓｅｓ）、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ））、オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（たとえばインフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ））、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（たとえばハンターンウイルス（Ｈａｔａａｎｖｉｒｕｓｅｓ）、ブニヤウイルス（ｂｕｎｇａｖｉｒｕｓｅｓ）、フレボウイルス（ｐｈｌｅｏｂｏｖｉｒｕｓｅｓ）とナイロウイルス））、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓｅｓ））、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（たとえばレオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ））、オルビウイルス（ｏｒｂｉｖｉｒｕｓｅｓ）、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓ））、ビマウイルス科（Ｂｉｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ））、パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ）、ポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ））、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ））、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｖｉｒｉｄａｅ）（たとえば単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）ＩとＩＩ、水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａｚｏｓｔｅｒｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ））とイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（たとえばアフリカ豚熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ））と未分類ウイルス（たとえば海綿状脳症の病因因子（ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｇｅｎｔｓ）、Ｄ型肝炎ウイルスの因子、非Ａ非Ｂ型肝炎の因子（１類腸管伝染；２類腸管外伝染、例えばＤ型肝炎）；ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）及び相関するウイルスとアストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ））を含むが、それらに限定されない。

真菌の例として、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｏｉｄｅｓｉｍｍｉｔｉｓ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）及び他のカンジダ属種、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）種とニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ）を含む。

寄生虫として、血液感染性及び／又は組織寄生虫を含み、例えばバベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシ・ディベルガンス（Ｂａｂｅｓｉｄｉｖｅｒｇａｎｓ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔｏｍｏｅｂａｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄａｌａｍｂｌｉａ）、リーシュマニア・トロピカ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｔｒｏｐｉｃａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、ブラジルリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｄｏｎｏｖｄｎｉ）、熱帯熱マラリヤ原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｏｖａｌｅ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ）、ガンビアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｇａｍｂｉｅｎｓｅ）、ローデシアトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）（アフリカ睡眠病）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｕｚｉ）（シャーガス病（Ｃｈａ
ｇｕｓ’ｄｉｓｅａｓｅ））とトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ）、ヒラムシ（ｆｌａｔｗｏｒｍｓ）と回虫（ｒｏｕｎｄｗｏｒｍｓ）を含むが、それらに限定されない。

「薬学的に許容される薬物担体」は、生理的に相容するいずれか及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗バクテリア剤と抗真菌剤、等張剤と吸收遅延剤などを含む。好ましい担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄（ｓｐｉｎａｌ）または表皮投与（たとえば注射や輸液の方式）に適用する。

本発明の薬物組成物／ワクチン組成物は、本分野に既知された多種の方法で投与できる。当業者が理解するように、投与経路及び／又は方式は、所望の結果に応じて変化する。ある投与経路で本発明の化合物を投与するために、化合物の失活を防止する材料をそれにコーティングし、又は化合物と共投与することもある。たとえば、被験者に、たとえばリポソームや希釈剤のような適当な担体にある化合物を投与しても良い。薬学的に許容される希釈剤は、塩溶液および水性緩衝液を含む。

薬学的に許容される担体は、無菌水溶液または分散液、ならびに無菌注射用溶液または分散液の一時的調製のための無菌粉末を含む。薬物活性物質におけるこんな媒体と薬剤の応用は、当分野に公知なものである。

以下、添付図面を参照して、本発明の好適な実施の形態を詳細に説明し、本発明の利点および特徴を、当業者により容易に理解させ、本発明の範囲をより明確に定義する。
材料と方法
本発明の具体的な実施例に採用された一部の材料と、試験方法は、以下に示される。本明細書に挙げられた材料と方法における言及されていないもの、及び本明細書に関する他の材料と方法は、いずれも先行技術に一般的な技術手段であり、本分野の当業者が、先行技術に従って得ることができ、ここで詳しくに説明しない。
１、抗体
具体的な実施例には、抗マウスＣＤ４０とＤＲ５抗体の重鎖可変領域と軽鎖配列は、既に前の研究に得られたものである（Ｌｉ Ｆ， Ｒａｖｅｔｃｈ ＪＶ． ２０１１． Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｄｒｉｖｅｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＣＤ４０ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３： １０３０－４；Ｌｉ Ｆ， Ｒａｖｅｔｃｈ ＪＶ． ２０１２． Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９： １０９６６－７１）。抗ヒトＣＤ４０抗体の重鎖可変領域と軽鎖配列は、ＵＳ７３３８６６０に開示された。

本発明のヒトＩｇＧの抗体重鎖定常領域配列（ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４の抗体重鎖定常領域を含む）は、既に前の研究に得られたものである（Ｌｉ Ｆ，
Ｒａｖｅｔｃｈ ＪＶ． ２０１１． Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｄｒｉｖｅｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＣＤ４０ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３： １０３０－４；Ｌｉ Ｆ， Ｒａｖｅｔｃｈ ＪＶ． ２０１２． Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９： １０９６６－
７１）が、無ければ遺伝子で合成する。本発明の抗体重鎖定常領域のバリアントは、上記のヒトＩｇＧの抗体の重鎖定常領域配列に基づき、点突然変異などの方法で構築するものである。用いられる抗体は、いずれもＨＥＫ ２９３Ｔ 細胞の一過性トランスフェクションで発現され、かつｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で上清を精製することで得られる。コントロールマウスとヒトＩｇＧ抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入したものである。
２、マウス
Ｆｃγ受容体欠損マウス、すなわちＦｃγ受容体α鎖欠損マウス（ＦｃｇＲ^－／－）、とＦｃγ受容体ヒト化マウス（ＦｃｇＲ^－／－ｈＦＣＧＲ^Ｔｇ、ｈＦＣＧＲ^Ｔｇとも言う）は、既に文献に述べられた（Ｓｍｉｔｈ Ｐ， ＤｉＬｉｌｌｏ ＤＪ， Ｂｏｕｒｎａｚｏｓ Ｓ， Ｌｉ Ｆ， Ｒａｖｅｔｃｈ ＪＶ． ２０１２． Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９： ６１８１－６）。ＦｃγＩＩ受容体欠損マウスＲ２^－／－（ＦｃｇＲ２ｂ^－／－）とＦｃγＲＩＩＢ受容体ヒト化マウスＲ２^－／－ｈＲ２Ｂ^Ｔｇ（ＦｃｇＲ２ｂ^－／－ ｈＦＣＧＲ２Ｂ^Ｔｇ）は、既に文献に述べられた（Ｌｉ Ｆ， Ｒａｖｅｔｃｈ ＪＶ． ２０１１． Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｄｒｉｖｅｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＣＤ４０ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３： １０３０－４；Ｌｉ Ｆ， Ｒａｖｅｔｃｈ ＪＶ． ２０１２． Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｎｄ
ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９： １０９６６－７１）。ヒトＣＤ４０を発現するトランスジーンマウスは、ヒトＣＤ４０を発現するＢＡＣトランスジーンマウス（ｈＣＤ４０^Ｔｇ）である。ｈＣＤ４０^＋マウスとｈＦＣＧＲ^Ｔｇマウスとの交雑は、ＣＤ４０及びＦｃγ 受容体均ヒト化のマウス（ｈＣＤ４０^Ｔｇ ｈＦＣＧＲ^Ｔｇ）を得られ、同時に、ｈＣＤ４０^＋マウスと、ｈＦＣＧＲ２Ｂ^Ｔｇを除く他のｈＦＣＧＲ^Ｔｇを発現するマウス（ｈＣＤ４０^Ｔｇ ｈＲ２Ｂ^－／－）も得られる。全ての実験用マウスは、上海交通大学医学部動物科学センターに養殖され，全ての実験の開展は、中国法律と各規制に合致しつつ、上海交通大学医学部動物介護と使用委員会の許可を得る上に行われる。
３、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）で抗ＣＤ４０抗体のＣＤ４０と結合する能の測定を分析する
抗ヒトＣＤ４０抗体を分析する際に、組換えヒトＣＤ４０タンパク質（近岸タンパク質科技有限会社）で酵素プレートをコーティングし、常温において一晩し、室温で１％ ＢＳＡで２ｈブロッキングした後に、ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で三回洗浄し、各穴に、１００μＬの勾配のように希釈されたヒトアゴニストＣＤ４０抗体を添加し、室温で１ｈで孵育した後に、ＰＢＳＴで四回洗浄し、濃度１００ｎｇ／ｍｌビオチンでマークされた抗ヒトＩｇκ軽鎖的二抗を添加し、室温で１ｈインキュベートした後に、ＰＢＳＴで四回洗浄し、適当な濃度のＳＡＶ－ＨＲＰを添加し、室温で１ｈインキュベートした後に、発色基質を添加し、５分間後に、６５０ｎｍにおける吸光値を測定した。

抗マウスＣＤ４０抗体を分析する際に、組換えマウスＣＤ４０タンパク質（近岸タンパク質科技有限会社）でコーティングし、ＨＲＰでマークされたヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体を二次抗体として検出を行う以外に、上記の実験方法と同じように行った。
４、ＯＶＡ特異性ＣＤ８陽性Ｔ細胞増幅モデル
２－４月齡のマウスに、尾静脉注射より、２ｘ１０^６個の、２００マイクロリットルの
ＰＢＳに再懸濁されたＯＴ－Ｉ脾臓細胞（ＣＤ４５．１^＋）を養子転移し、その後、腹腔内注射で免疫した。コントロールグループに、２マイクログラムのＤＥＣ－ＯＶＡタンパク質とコントロール抗体（Ｌｉ Ｆ， Ｒａｖｅｔｃｈ ＪＶ． ２０１１． Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｄｒｉｖｅｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＣＤ４０ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３： １０３０－４）を注射し、残るグループに、２マイクログラムのＤＥＣ－ＯＶＡタンパク質と抗ＣＤ４０抗体を注射した。６日後、マウス脾臓細胞を採取し、かつＡＣＫ細胞溶解液で、赤血球を溶解した後に、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳに０．５％ＦＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡと０．１％ＮａＮ３を添加してなるもの）に再懸濁し、単個脾臓細胞の浮遊液を調製した；そして、フロー染色でＯＶＡ特異性ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＯＴ－１）の増幅を分析した。使われた抗体は、蛍光標識された抗マウス ＣＤ４５．１、ＣＤ４、ＣＤ８、とＴＣＲ－Ｖα２抗体を含む。フロー分析には、ＤＡＰＩ染色で、死細胞を取り除き、ＣＤ４５．１^＋／ＣＤ８^＋／ＴＣＲ－Ｖα２^＋は、ＯＴ－１／ＣＤ８^＋ Ｔ細胞に識別された。
５、マウス脾臓細胞の生体外刺激実験
マウス脾臓細胞を採取し、ＡＣＫ細胞溶解液で赤血球を溶解した後に、脾臓細胞培養液（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％ Ｐ／Ｓ二重抗体）に再懸濁し、各穴に２×１０^５細胞を播種し、勾配のように希釈されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体で処理を行い、３７℃で４８時間培養し、そしてＦＡＣＳでマウスＢ細胞表面活化標識分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６）の発現状況を分析した。活化標識分子の発現状況は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に表れ、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体がＢ細胞を活性化する活性と正の相関関係である。
６、ＰＢＭＣ生体外刺激実験
Ｆｉｃｏｌｌ分離で、健康な人の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得、各穴に２×１０^５細胞を播種し、勾配のように希釈されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体で処理し、３７度で４８時間培養し、そしてＦＡＣＳでＰＢＭＣにおけるＢ細胞表面活化標識分子（ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ）の発現状況を分析し、活化標識分子の発現状況は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に表れ、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体がＢ細胞を活性化する活性と正の相関関係である。
７、ＥＬＩＳＡで抗体とＦｃγＲとの結合特性を分析する
酵素プレートに、適当な濃度の１００μＬの抗体を添加し、一晩でコーティングし、上清を捨て、１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで２時間ブロッキングし、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で洗浄し、そして適当な濃度のｂｉｏｔｉｎにマークされたＦｃγＲ細胞外ドメインタンパク質（北京義翹神州生物技術有限会社）を添加し、室温で１時間インキュベートした後に、上清を捨て、ＰＢＳＴで洗浄した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、室温で１時間インキュベートし、ｂｉｏｔｉｎタンパク質を検出し、上清を捨て、発色液を添加し、２０－４０分間発色した後、６５０ｎｍにおける吸光値Ａ６５０を測定した。
８、表面プラズモン共鳴
全ての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析実験に使用された緩衝システムは：１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．４）、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ 界面活性剤 Ｐ２０、実験は、いずれもＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（ＧＥヘルスケア）ＳＰＲシステムに行い、温度を２５℃に設定した。ｐＨ ４．５の条件において、アミンカップリングで、約２０００の応答単位（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｅｓ、ＲＵｓ）密度になるように、Ｈｉｓにマークされた可溶性マウスＦｃγＲ細胞外ドメインタンパク質（北京義翹神州生物技術有限会社）をＣＭ５チップに固定した。二倍に勾配のように希釈された、適当な濃度範囲を有する抗体サンプルを、３０ μＬ／ｍｉｎの速度で移動相に注入し、３分間結合した後に、５分間解離した。各分析サイクル終了の後、一定の濃度のＮａＯＨを、５０ μＬ／ｍｉｎの流速でセンサー表面に３０秒間注入し、それを再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ 分析ソフトウェア（バージョン １．１、ＧＥヘルスケア）に、チャネルが決まらない背景結合シグナルを排除した後、１：１の結
合動力学モードを採用し、フィッティング計算を行い、親和定数ＫＤ値を得た。
９、ＭＣ３８腫瘍モデル
ＭＣ３８は、マウス結腸がん細胞株であり、２～４月齡のｈＦＣＧＲ^Ｔｇマウスに、皮下注射で２×１０^６個のＭＣ３８細胞を接種し、３日ごとに、ノギスで腫瘍の大きさを測量し、かつ公式（Ｌ１^２×Ｌ２）／２で腫瘍の体積を計算した；ただし、Ｌ１は、腫瘍組織の最短直径であり、Ｌ２は、最長直径である。腫瘍細胞を接種した７日後、腫瘍の大きさより、マウスをランダムにグループに分け（０日目）、腹腔内注射で、コントロールグループマウスに、３１．６μｇのアイソタイプコントロールＩｇＧを投与し、残るグループに３１．６ μｇの相応抗体を投与した。３日目、０日目と同じ処理を与え、すなわちコントロールグループマウスにアイソタイプコントロールＩｇＧを投与し、残るグループに相応抗体を投与した。その後、続いて腫瘍の大きさを測量し、腫瘍の体積を計算した。

１０、ＭＯ４腫瘍モデル
ＭＯ４は、マウス線維肉腫細胞株であり、２～４月齡のｈＦＣＧＲ^Ｔｇマウスに、皮下注射で２×１０^６個のＭＯ４細胞を接種し、３日ごとに、ノギスで腫瘍の大きさを測量し、かつ公式（Ｌ１^２×Ｌ２）／２で腫瘍の体積を計算した；ただし、Ｌ１は、腫瘍組織の最長直径であり、Ｌ２は、最短直径である。腫瘍細胞を接種した７日後、腫瘍の大きさより、マウスをランダムにグループに分け（０日目）、腹腔内注射で、コントロールグループマウスに、３１．６μｇのアイソタイプコントロールＩｇＧと２μｇＯＶＡ抗原（ＤＥＣ２０５抗体とＯＶＡ融合タンパク質の形式として）を投与し、残るグループに３１．６ μｇの相応抗体と２μｇＯＶＡ抗原（ＤＥＣ２０５抗体とＯＶＡ融合タンパク質の形式として）を投与した。その後、続いて腫瘍の大きさを測量し、腫瘍の体積を計算した。
１１、抗ＤＲ５抗体のＤＲ５と結合する能を分析する
異なる抗ＤＲ５抗体が、ＤＲ５に対する結合能を分析するために、アイスＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．１％ＮａＮ３）でＭＣ３８細胞を再懸濁し、３．１６倍の勾配のように希釈されたコントロールと抗ＤＲ５抗体を添加し、濃度範囲を２ｎｇ－２０μｇ／ｍＬにし、室温で１５分間インキュベートした後、アイスＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄した；そして、ＦＩＴＣマークされたヤギ抗ヒト抗体（ＶＥＣＴＯＲ ＦＩ－３０８０）でフロー染色し、氷上に、暗所で２５分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、そしてフロー分析を行った。抗体がＤＲ５と結合する能は、ＦＩＴＣ平均蛍光強度（ＭＦＩ）と正の相関関係であり、結果としては、抗ＤＲ５抗体のＤＲ５と結合する能は、同等であることを表す。
１２、抗ＤＲ５抗体が、アポトーシスを促進する活性を分析する
抗ＤＲ５抗体が、アポトーシスを促進する活性を分析するために、ＭＣ３８細胞を、平底９６ウェルプレートに播種し、一晩に培養し、培養液を捨て、各穴に１００μＬの新しい培養液（当該培養液には、それぞれに１０^６個のＦｃｇＲ^－／－、ｈＦＣＧＲ^Ｔｇ遺伝子型（Ｂ６背景）のマウス赤血球を溶解したなる脾臓細胞を含む/含まない）を添加し、
同時に、各穴に別に、１ μｇ／ｍＬ ２Ｂ６抗体を含む/含まない１ μｇ／ｍＬコン
トロール又は抗ＤＲ５抗体を有する１００μＬ新しい培養液を添加し、３７℃で４時間インキュベートした。９６ウェルプレートを取り出し、氷上に置き、静かに上清を吸引して捨て、２００μＬのアイスＰＢＳで洗浄した；１００μＬのトリプシンで３－５分間消化し、等体積の全培養液で終了し、細胞を採取し、４℃、４００×ｇで５分間遠心分離し、収集し、そして、ＣＤ４５抗体（ｃｌｏｎｅ：３０－Ｆ１１； Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で表面分子フロー染色を行い、さらに活性化されたｃａｓｐａｓｅ－３の細胞内染色（抗体ｃｌｏｎｅ Ｃ９２－６０５； ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行い、フロー分析した。ＭＣ３８細胞に、順に前方散乱角ＦＳＣと側散乱角ＳＳＣ、及びＣＤ４５陰性で丸をつけ、活性化されたｃａｓｐａｓｅ－３（活性化型カスパーゼ）の発現を分析した。アポトーシスを促進する能は、活性化されたｃａｓｐａｓｅ－３の染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）と正の相関関係である。
実施例１．本発明の重鎖定常領域、及び本発明の重鎖定常領域配列を含むアゴニスト抗体
上記に言及された遺伝子クローニングと発現精製技術によって、本発明が、一連の異なる重鎖定常領域の具体的な実施例を構築して、これらの重鎖定常領域に基づき、抗ヒトＣＤ４０或いは抗マウスＣＤ４０の抗体、及び抗マウスＤＲ５の抗体を構築した。

要するに、本発明の具体的な実施例において、重鎖定常領域は、ＣＨ１－ヒンジ領域部分及びＣＨ２－ＣＨ３ドメイン部分を含む二つの部分に分けられ、最適化を研究した。上記のＣＨ１－ヒンジ領域部分とは、抗体ＣＨ１ドメインとヒンジ領域からなるセクションであり、ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン部分とは、抗体ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインからなるセクションである。具体的な実施例において、ＣＨ１－ヒンジ領域が、突然変異がないｈＩｇＧ１のＣＨ１－ヒンジ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、或いはｈＩｇＧ２のＣＨ１－ヒンジ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、或いはｈＩｇＧ３のＣＨ１－ヒンジ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、或いはｈＩｇＧ４のＣＨ１－ヒンジ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を採用する；ＣＨ２－ＣＨ３ドメインが、突然変異がないｈＩｇＧ１のＣＨ２－ＣＨ３ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、或いはｈＩｇＧ２のＣＨ２－ＣＨ３ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、或いはｈＩｇＧ３のＣＨ２－ＣＨ３ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、或いはｈＩｇＧ４のＣＨ２－ＣＨ３ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、或いはｈＩｇＧ ＣＨ２－ＣＨ３ドメインに基づきアミノ酸突然変異があるＣＨ２－ＣＨ３ドメインを採用する；ｈＩｇＧ ＣＨ２－ＣＨ３ドメインに基づきアミノ酸突然変異があるＣＨ２－ＣＨ３ドメインとは、たとえば：Ｖ１１突然変異を有するＣＨ２－ＣＨ３ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）は、ｈＩｇＧ１のＣＨ２－ＣＨ３ドメインに基づき、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒが突然変異して得るＣＨ２－ＣＨ３ドメイン；Ｖ９突然変異を有するＣＨ２－ＣＨ３ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）は、ｈＩｇＧ１のＣＨ２－ＣＨ３ドメインに基づきＧ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒが突然変異して得るＣＨ２－ＣＨ３ドメインである。

本発明の重鎖定常領域の実施例において、重鎖定常領域の配列は、相応的なＣＨ１－ヒンジ領域配列及びＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列を組み合わせて得るものである。本発明の重鎖定常領域の実施例の詳しい情報について、表２を参照する。

注意すべきのは、表２に関わる重鎖定常領域の実施例は、いずれもヒトのＩｇＧに基づき構築され、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３とｈＩｇＧ４は、それぞれにヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４を表示する。表２には、一部の配列が、突然変異を有して、具体的な突然変異列は、括弧に記載され、かつ突然変異する具体的なアミノ酸のシリアルナンバーは、ＩｇＧ ＥＵ番号に基づくものである。

以下に、具体的な例を挙げて、表２に記載された重鎖定常領域の構造を説明する。Ｇ１と呼ばれる重鎖定常領域のＣＨ１－ヒンジ領域の由来は、ｈＩｇＧ１であり、ＣＨ２－ＣＨ３ドメインの由来は、ｈＩｇＧ１であり、そして、Ｇ１の配列は、突然変異がないｈＩｇＧ１のＣＨ１－ヒンジ領域の配列と、突然変異がないｈＩｇＧ１ＣＨ２－ＣＨ３ドメインの配列とを寄せ集めてなるものである。Ｖ１１（Ｈ２）と呼ばれる重鎖定常領域（本明細書には、ＪＡＣ１とも言う）のＣＨ１－ヒンジ領域の由来は、ｈＩｇＧ２であり、ＣＨ２－ＣＨ３ドメインの由来は、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ突然変異を有するｈＩｇＧ１であり、そして、Ｖ１１（Ｈ２）の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）は、突然変異がないｈＩｇＧ２のＣＨ１－ヒンジ領域の配列と、Ｇ２３７Ｄ／Ｐ２３８Ｄ／Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ／Ａ３３０Ｒ突然変異を有するｈＩｇＧ１ＣＨ２－ＣＨ３ドメインの配列とを寄せ集めてなるものである。他の重鎖定常領域の実施例の配列は、いずれも表２及び本発明に添付された配列表から得る。

本発明の具体的な実施例に構築された抗体は、いずれもヒト抗体或いはキメラ抗体（全ての抗体定常領域は、ヒト由来であり、抗ヒトＣＤ４０抗体のＣＤＲは、ヒト由来であり、抗マウスＣＤ４０と抗マウスＤＲ５抗体のＣＤＲは、マウス由来である）であり、ただし、ヒト抗ヒトＣＤ４０或いはヒト抗マウスＣＤ４０の抗体及びヒト抗マウスＤＲ５の抗体は、いずれも相応的な本発明の重鎖定常領域に基づくものであり、そして、相応的な番号は、主に異なる重鎖定常領域によって分けられ、本発明の実施例に関わる抗体の具体的な情報は、表３を参照する。本発明の実施例において、同じ抗原に対する抗体は、同じ軽鎖配列及び同じ重鎖可変領域配列を有するが、重鎖定常領域の配列は異なる。たとえば：本発明の実施例において、ヒト抗ヒトＣＤ４０の抗体（Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ）は、同じ軽鎖配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）及び同じ重鎖可変領域配列を有する；実際に、本発明の抗ヒトＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ）の軽鎖配列、重鎖可変領域配列は、アゴニスト抗体ＣＰ－８７０８９３の軽鎖配列、重鎖可変領域配列と同じが、ＣＰ－８７０８９３は、最初にＰｆｉｚｅｒに開発され、ｈＣＤ４０標的に対する全ヒトＩｇＧ２アゴニスト抗体であり、固形腫瘍の免疫療法及びワクチン活性の増強に用いられる。本発明の実施例において、ヒト抗マウスＣＤ４０の抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ）は、同じ軽鎖配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）及び同じ重鎖可変領域配列を有する；本発明の実施例において、ヒト抗マウスＤＲ５の抗体（Ａｎｔｉ－ｍＤＲ５－ｈＩｇＧ）は、同じ軽鎖配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）及び同じ重鎖可変領域配列を有する。

注意すべきのは、本発明の一部の抗体の実施例は、実際に異なる抗体セクションを応用して構築された融合タンパク質と見なされても良い、それは、構造の形式に、抗体の特徴をとどめられるが、具体的な各の機能部分は、異なる抗体ＩｇＧサブタイプ由来のものである可能性があり、一部が、更にアミノ酸突然変異を有する。したがって、本発明の実施例の重鎖定常領域の配列は、さらに他の本発明以外の、上記の実施例に提供されたアゴニスト抗体又は融合タンパク質に応用されたも良いことが理解される。

一つの具体的な実施例において、特異性結合抗原の抗体の重鎖可変領域と軽鎖が、本発明に提供された重鎖定常領域に融合され、效果が増強された他の抗体を得っても良い、たとえば：上記の表１の記載された研究中のアゴニスト抗体の重鎖可変領域と軽鎖が、本発明に提供されたＪＡＣ１と融合して、活性が増強された、異なるＴＮＦＲに対する抗体を得られる。

他の一つの具体的な実施例において、特異性結合抗原の抗原結合モジュールが、本発明に提供された重鎖定常領域と融合して、效果が増強された融合タンパク質を得っても良い、たとえば：ＣＤ４０と特異性に結合するナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）が、本発明に提供されたＪＡＣ１と融合して、活性が増強された融合タンパク質を得られる。

もう一つの実施例において、本発明の抗体は、ヒト抗体であっても良く、キメラ抗体、ヒト化抗体などであっても良い。

上記に言及された酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）方法を応用して、本発明の抗ＣＤ４０抗体の実施例のＣＤ４０と結合する能を測定した。図３に示されたように、抗マウスＣＤ４０の抗体（図３Ａ）及び抗ヒトＣＤの抗体（図３Ｂ）は、いずれもＣＤ４０と結合する能のテストを行った。結果は、本発明の実施例に構築された抗ＣＤ４０の抗体は、いずれもＣＤ４０に対する結合能を有することを示す。注意すべきのは、本実験のＥＬＩＳＡ分析が、他のバリアントと比べて、Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２とＡｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）のｈＣＤ４０に対する結合能は、より低いことを示す。結合能が比較的に低いＡｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）が、生体内外の実験に、いずれも活性に優位を示したことを考慮すると、抗ヒトＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ）のバリアントが、ヒトＣＤ４０に対する結合能には、著しくい格差を有しないと判断した。
実施例２．ヒトＩｇＧアゴニスト抗体の活性が、抗体ＦｃとＦｃγ受容体との互いに作用に依存する
ヒトＩｇＧアゴニスト抗体の活性は、抗体ＦｃとＦｃγ受容体との互いに作用に調節されるかどうかを研究するために、四種のＩｇＧサブタイプ（ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４）のアゴニスト抗マウスＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ３、Ａ
ｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ４）は、モデル抗体（図２Ａ）として、真っ先に、その免疫活性化活性は、Ｆｃγ受容体の発現に影響されるかどうかという研究に用いられる。

アゴニストＣＤ４０が、抗原特異性の細胞活化を促進し、かつ抗原特異性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活化と増幅する免疫活性化活性を有するから、アゴニストヒト抗マウスＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ）が、ＯＶＡ免疫されたマウスに、ＯＶＡパターン抗原特異性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活化と増幅を促進する能は、その免疫活性化活性（Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０１１ Ａμｇ １９；３３３（６０４５）：１０３０－４）の評価に使用された。当該分析において、マウスは、まずＯＶＡ特異性ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＯＴ－Ｉ
Ｔ細胞）に養子送達を行われ、１日後、抗原ＤＥＣ－ＯＶＡ（ＯＶＡと抗ＤＥＣ２０５抗体の融合タンパク質であり、ＯＶＡ抗原を有効的に送達する手段である）と抗ＣＤ４０抗体に免疫され、そして、マウスが免疫された６日後、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞の増幅を分析する。

図４に示されたように、投与量が比較に高い（３０μｇ／マウス）Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ４抗体のいずれかは、Ｆｃγ受容体ヒト化マウス（ｈＦＣＧＲ^Ｔｇ）に活性を有するが、同じ条件において、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ４は、Ｆｃγ受容体欠損マウス（ＦｃｇＲ^－／－）に明らかな活性を見られなかった（図３Ａ）。アゴニストヒトＩｇＧ抗マウスＣＤ４０抗体の活性に対して、Ｆｃγ受容体の発現は必要なものであることを表す。

研究アゴニストヒトＩｇＧ抗マウスＣＤ４０抗体は、Ｆｃγ受容体と結合する能を有する必要が有るかどうかを研究するために、Ｎ２９７のグリコシル化サイトの点突然変異（Ｎ２９７Ａ）は、ヒトＩｇＧ２抗マウスＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２）に導入され、そして、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＮＡを得た。Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＮＡ抗体Ｆｃの、Ｆｃγ受容体と結合する能が失せて（図６）、ＯＶＡワクチンモデルにおける、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＮＡ抗体が誘導する、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を活化と増幅する活性も完全に失せて（図３Ｂ）、ヒトＡｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２抗体の免疫活性化能は、抗体ＦｃのＦｃγ受容体と結合する能に依存することを表す。
実施例３．ヒト抑制性Ｆｃγ受容体（ｈＦｃγＲＩＩＢ）と抗体Ｆｃとの特異性互いに作用がアゴニストヒト抗ＣＤ４０抗体の活性を促進する。

Ｆｃγ受容体ファミリーに、具体的にヒトＩｇＧアゴニスト抗体の活性依存を提供する、Ｆｃ－Ｆｃγ受容体と互いに作用する特定なＦｃγ受容体を分析するために、ヒト抑制性Ｆｃγ受容体ｈＦｃγＲＩＩＢの貢献は、更に分析された。抑制性Ｆｃγ受容体ヒト化マウス（Ｆｃｇｒ２ｂ^－／－ｈＦＣＧＲ２Ｂ^Ｔｇ）とコントロールマウス（Ｆｃｇｒ２ｂ^－／－）において、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２抗体は、Ｆｃｇｒ２ｂ^－／－マウスにおける活性（図４Ｃ）を有しないが、抑制性Ｆｃγ受容体ヒト化マウス（Ｆｃｇｒ２ｂ^－／－ｈＦＣＧＲ２Ｂ^Ｔｇ）における活性（約８０％近いＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋、図４Ｃ）は、全てのヒトＦｃγ受容体を発現するヒト化マウス（ｈＦＣＧＲ^Ｔｇ）における活性（約６０－８０％近いＯＴ－Ｉ ＣＤ８^＋、図４Ａ）と相当する；それは、ヒト抑制性Ｆｃγ受容体は、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２をサポートする活性を十分に提供できることを説明した。

同時に、Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ１、Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２、Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ３、Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ４が、生体外に、マウスＢ細胞促進活化標識分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６）の発現を刺激する際に、異なるＦｃγ受容体環境（ｈＣＤ４０^ＴｇｈＦＣＧＲ^Ｔｇ 、ｈＣＤ４０^ＴｇｈＲ２Ｂ^－／－）は、
抗体の活性に著しくに影響した（図５）。ヒトＡｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ１、Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２及びＡｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ４の活性は、ｈＣＤ４０^Ｔｇ／ ｈＦＣＧＲ^Ｔｇ に良いが、ｈＣＤ４０^Ｔｇ ｈＲ２Ｂ^－／－の環境に弱くて、ほぼ完全に消えた；同時にヒト抑制性Ｆｃγ受容体（ｈＦｃｇＲＩＩＢ）の特異性抗体２Ｂ６も、著しくにＡｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ抗体の活性を抑制でき、ヒト抑制性Ｆｃγ受容体が、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ４）の抗ヒトＣＤ４０抗体の活性に対して、決定的な正の調節作用を有する。これは、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ４）の抗マウスＣＤ４０抗体に基づく研究結果と一致し、ヒト抑制性Ｆｃγ受容体と、ＩｇＧ抗体Ｆｃとの相互作用が、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ４）抗ＣＤ４０抗体活性に正の調節を行うことは、一般的な規則であることを更に説明した。

既存の他の文献が、アゴニスト抗体のアゴニスト活性は、それと抑制性Ｆｃγ受容体との結合に依存することを記載して、かつ本発明の試験は、当該規則を更に検証しただけではなく、かつ同じ重鎖定常領域を移植することで、異なる抗原に対するアゴニスト抗体は、基本的に類似するＦｃγ結合モード及びアゴニスト活性を有させる傾向があることを表す。たとえば：上記の実施例において、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２とＡｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２が、同じ重鎖定常領域を有するが、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２の抗原はｍＣＤ４０で、Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２の抗原はｈＣＤ４０である。ＥＬＩＳＡ、ＯＶＡモデル及びＰＭＢＣ刺激試験が、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２とＡｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２は基本的に類似するＦｃγ結合モード及びアゴニスト活性を有することを示す。そして、重鎖定常領域は、アゴニスト抗体のアゴニスト活性を最適化する要所であり、かつ好ましい重鎖定常領域は、異なる抗原に対するアゴニスト抗体に広くに応用され、類似するＦｃγ結合モード及びアゴニスト活性を得る。そのため、本発明が、重鎖定常領域を選別した。
実施例４． 好ましい、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有するヒトＩｇＧ重鎖定常領域の選択。

より良い活性のアゴニスト抗体は、高いＦｃγＲＩＩＢ受容体親和性を有することを要求する以外に、更に高い抑制性Ｆｃ受容体：活性化性Ｆｃ受容体親和性比率（Ｉ：Ａ比率）を有することも必要とすることを表明した研究は、かなりがある。ヒト抑制性Ｆｃγ受容体とＩｇＧ抗体Ｆｃとの相互作用が、ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ４）抗ＣＤ４０抗体活性に対する正の調節作用は、抗体活性の増強に応用できることを分析するために、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有する重鎖定常領域配列を取捨選択を行う必要が有る。ヒトＩｇＧ１に基づく複数な重鎖定常領域配列バリアントは、既により良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有することを報道されたが、他のＩｇＧサブタイプ（ｈＩｇＧ２、３、４）重鎖定常領域配列に基づく、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有する定常領域配列は、まだ明確されない。そのため、選別と分析する必要が有る。ヒトＩｇＧ重鎖定常領域と抑制性Ｆｃγ受容体の結合能は、親和性で計測するが、抑制性Ｆｃγ受容体の傾向性は、Ｉ／Ａ比率で計測する。より良い抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有するヒトＩｇＧ （ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ４）重鎖定常領域を取捨選択するために、まず、選択されようとする重鎖定常領域或いは定常領域のＦｃ部分が、ヒトＦｃγ受容体（抑制性Ｆｃγ受容体（ヒトＦｃγＲＩＩＢ）と、ならびに活化性Ｆｃγ受容体（ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢを含む）を含む）と結合する能を比較し、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能（結合親和性は、ヒトＩｇＧ１と相当し、或いはより高い）と傾向性（Ｉ／Ａ比率は、ヒトＩｇＧ１より大きいか等しい）を有するヒトＩｇＧ重鎖定常領或いは定常領域のＦｃ部分を選択する。好ましくに、上記の抗体重鎖定常領域のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性は、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性の３．２倍又は以上であり、上記の抗体重鎖定常領域のＩ／Ａ比率は、０．３２より大きいか等しいである；同様に
好ましくに、上記の抗体重鎖定常領域のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性は、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性より大きいか等しいであり、上記の抗体重鎖定常領域のＩ／Ａ比率は、１より大きいか等しいである；より好ましくに、上記の抗体重鎖定常領域のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性は、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性の３０倍又は以上であり、上記の抗体重鎖定常領域のＩ／Ａ比率は、１より大きいか等しいである；より好ましくに、上記の抗体重鎖定常領域のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性は、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性の６０倍又は以上であり、上記の抗体重鎖定常領域のＩ／Ａ比率は、４０より大きいか等しいである；特くに好ましくに、上記の抗体重鎖定常領域のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性は、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃγＲＩＩＢとの親和性の９０倍又は以上であり、上記の抗体重鎖定常領域のＩ／Ａ比率は、１００より大きいか等しいである。

選択されようとする重鎖定常領域配列は、自然の、一つ又は以上の部位特異的突然変異を有する、或いは一つ又は以上のランダム突然変異を有するヒトＩｇＧ重鎖定常領域配列を含む；選択されようとする重鎖定常領域のＦｃ部分は、自然の、一つ又は以上の部位特異的突然変異を有する、或いは一つ又は以上のランダム突然変異を有する各Ｆｃ配列を含む。選択されようとする重鎖定常領域或いは定常領域のＦｃ部分の、Ｆｃγ受容体結合能を分析することで、ヒトＩｇＧ１定常領域のＦｃ部分に基づく突然変異体Ｖ１１、Ｖ９は、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有することは見出され（表４）、これらの重鎖定常領域のＦｃ部分は、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域の他の部分（ＣＨ１－ヒンジ領域）と結合でき、選択されようとするヒトＩｇＧ重鎖定常領域を得る。更に、選択されようとする完全なヒトＩｇＧ重鎖定常領域配列のＦｃγ受容体結合能を分析し、これらの抗体は、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有するか否かを検証し、ＪＡＣ１（Ｖ１１ Ｆｃ配列を有するヒトＩｇＧ２重鎖定常領域）とＪＡＣ２（Ｖ９ Ｆｃ配列を有するヒトＩｇＧ２重鎖定常領域）を有する重鎖定常領域は、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有するヒトＩｇＧ２重鎖定常領域配列（図６）であることを見出した。同時に、選択されようとするヒトＩｇＧ２重鎖定常領域配列には、ＪＡＣ３（Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ点突然変異を有するヒトＩｇＧ２重鎖定常領域配列）和ＪＡＣ４（Ｈ２６８Ｄ／Ｐ２７１Ｇ点突然変異を有するヒトＩｇＧ２重鎖定常領域配列）重鎖定常領域配列も、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有する（図６）ことを見出された。

＊：Ｉ／Ａ比率＝［ＫＤ（ｈＦｃγＲＩＩＡ－Ｒ１３１）或いはＫＤ（ｈＦｃγＲＩＩＩＡ－Ｆ１５８）の中の最小値）］／ＫＤ（ｈＦｃγＲＩＩＢ）。上記の表４の抗体Ｆｃ断片の名称は、表２の重鎖定常領域の名称と相応するもので表示するものであり、相応な名称のＦｃ断片は、表２の相応な名称の重鎖定常領域のＦｃ断片と理解される。

本発明による判断方法を採用すると、その他のＣＨ１－ヒンジ領域及びＣＨ２－ＣＨ３ドメインを取捨選択できて、そして他のより良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有するヒトＩｇＧ （ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ４）重鎖定常領域を得られる。同時に、本発明の好ましい重鎖定常領域は、高いＩ／Ａ比率、即より低い活化型Ｆｃγ受容体の結合力を有するから、本発明の好ましい重鎖定常領域から構築されたアゴニスト抗体は、より低いＡＤＣＣを誘導する活性や、より少ない非特異性細胞毒性を有する可能性がある。
実施例５． より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体（ｈＦｃγＲＩＩＢ）結合能と傾向性を有するヒトＩｇＧ重鎖定常領域が、より強いアゴニスト抗ＣＤ４０抗体活性をサポートする
より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体（ｈＦｃγＲＩＩＢ）結合能と傾向性を有するヒトＩｇＧ （ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ４）重鎖定常領域は、より強いアゴニスト抗ＣＤ４０抗体の活性をサポートできるか否かを分析するために、ＯＶＡワクチンモデルには、ＪＡＣ１重鎖定常領域を有する抗マウスＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１））と抗ヒトＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１））が、ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞活化と増幅を誘導する活性は分析され、結果として、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）は、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２の活性（図７Ａ）より著しくに優れることを表明した；Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）は、Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２の活性より著しくに優れ（図７Ｂ）、刺激免疫システム能力を増強することを表し、ただし、ＯＴ１細胞絶対数とＣＤ８＋Ｔ細胞割合は、いずれも明
らかに向上した。同時に、ＪＡＣ３とＪＡＣ４の抗ヒトＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＳＥＬＦ、Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＨＤＰＧ）を有するＢ細胞活性化活性に対する分析は、Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＳＥＬＦとＡｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＨＤＰＧの活性も明らかにヒトＩｇＧ２抗体より優れる（図８）ことを表明し、これは、刺激マウスＢ細胞に発現されたより高い表面活化分子ＣＤ８６や、ヒトＢ細胞に発現されたより高いレベルの表面活性化分子ｈＣＤ５４に表現された。これらの結果は、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体（ｈＦｃγＲＩＩＢ）結合能と傾向性を有するヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ４）重鎖定常領域が、より強いアゴニスト抗ＣＤ４０抗体活性をサポートすることを証明した
実施例６．ＣＨ１－ヒンジ領域が、アゴニストヒトＩｇＧ抗ＣＤ４０抗体の活性を調節できる
低い投与量のアゴニストヒトＩｇＧ抗ＣＤ４０抗体（１０μｇ／マウス）の活性に対する分析が、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ３とＡｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ４には、Ｆｃγ受容体ヒト化マウス（ｈＦＣＧＲ^Ｔｇ）において、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２の活性は最も高いが、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ３の活性は、最も弱い（図９Ａ）。ヒトＩｇＧ抗体ＣＨ１－ヒンジ領域が、アゴニストヒトＩｇＧ抗ＣＤ４０抗体を調節する活性を有するか否かことを分析するために、ヒトＩｇＧ３のＣＨ１－ヒンジセクション部分は、ヒトＩｇＧ２抗体のＣＨ１－ヒンジ領域を置換するために使用され、置換されたアゴニストヒトＩｇＧ２抗マウスＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｈ３）は、免疫活性化活性を喪失し（図９Ｂ）、ＣＨ１－ヒンジ領域が、アゴニストヒトＩｇＧ抗ＣＤ４０抗体の活性を調節できることを説明する。
実施例７．ＩｇＧ１とＩｇＧ３のヒンジ領域と比べて、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域は、より強いアゴニストヒトＩｇＧ抗ＣＤ４０抗体活性をサポートできる
ヒトＩｇＧ１、２、３のＣＨ１－ヒンジセクションが、アゴニストヒトＩｇＧ抗ＣＤ４０抗体活性をサポートする能を比較するために、同じＦｃと異なるＣＨ１－ヒンジ領域を有する抗ＣＤ４０抗体は、調製された。活性分析より、これらの抗体の活性は、著しくに異なり、ただし、ヒトＩｇＧ２のＣＨ１－ヒンジ領域を有する抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１））の活性は最高であり、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１－ヒンジ領域を有する抗体の活性は、副次なものであるが（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１（Ｖ１１））、ヒトＩｇＧ３のＣＨ１－ヒンジ領域を有するの抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ３（Ｖ１１））の活性は、最低であり（図１０）、ＩｇＧ１とＩｇＧ３のヒンジ領域と比べて、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域は、より強いアゴニストヒトＩｇＧ抗ＣＤ４０抗体活性をサポートできることを説明した。
実施例８．好ましいヒトＩｇＧ２ヒンジ領域と、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有するＦｃとは、相乗的に、より強いアゴニストヒトＩｇＧ抗ＣＤ４０抗体活性を提供できる
ヒトＩｇＧのＦｃとＣＨ１－ヒンジセクションは、いずれもアゴニストヒトＩｇＧ抗ＣＤ４０抗体の活性に影響できるから、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有するＦｃと、より良いＣＨ１－ヒンジ領域との併用が、アゴニストヒトＩｇＧ抗ＣＤ４０抗体の活性を更に向上できるか否かを研究する必要がある。最も良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有するヒトＩｇＧ１抗体バリアント（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１（Ｖ１１）、即ヒトＩｇＧ１のＶ１１バリアント）、最も良いＣＨ１－ヒンジ領域を有するヒトＩｇＧ２抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２）、及びＶ１１のＦｃγ受容体結合能とＩｇＧ２のＣＨ１－ヒンジ領域（ＪＡＣ１）とを結び付けてなる抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１））の活性を比較すると、結果としては、最適化のＦｃと好ましいＣＨ１－ヒンジ領域とを結び付けてなるＡｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）は、明らかにより強い活性を有することを示し、ＯＶＡワクチンモデルにおいて、ＯＴ－Ｉ細胞の絶対数及びＣＤ８^＋ Ｔ細胞の割合は、著しくに向上されたことに表現された（図１１）。同時に、ＰＭＢＣ細胞刺激試験には、Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４
０－ｈＩｇＧ１（Ｖ１１）、Ａｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２及びＡｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）の免疫刺激活性を比較し（図１２）、結果として、同様に、最適化のＦｃと好ましいＣＨ１－ヒンジ領域とを結び付けてなるＡｎｔｉ－ｈＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）は、明らかにより強い活性を有することを示した。

ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）のような、より強い活性は、ｈＩｇＧ１（Ｖ１１）とｈＩｇＧ２の活性の単純な加算を超え、好ましいヒトＩｇＧ２ ＣＨ１－ヒンジ領域と、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有するＦｃは、相乗的に、より強い他のアゴニストヒトＩｇＧ抗体活性を提供できることを説明した。

ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１（Ｖ１１）、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２及びＡｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）の三つの抗体の抗腫瘍活性を更に分析し（試験方法は、上記の「材料と方法」部分を参照）、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）の抗腫瘍活性も、著しくにＡｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１（Ｖ１１）とＡｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２抗体の抗腫瘍活性を超え（図１３、１４）、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）治療グループに、７匹の受試マウスのうち、５匹マウスの生体内の腫瘍は、完全に取り除かられ、優れた腫瘍治療活性を示した。

同様に、ＭＯ４腫瘍モデルにおいて、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１（Ｖ１１）、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２及びＡｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）の三つの抗体の抗腫瘍活性を更に分析し（試験方法は、上記の「材料と方法」部分を参照）、当該モデルには、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）の抗腫瘍活性も、同様に、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１（Ｖ１１）とＡｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２抗体の抗腫瘍活性を著しくに超えた（図１５）。

上記の抗腫瘍活性テストの結果は、ＯＶＡワクチンモデルに基づく分析の結果（図１１）とほぼ一致する。かつＡｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１（Ｖ１１）、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２及びＡｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）の三つの抗体は、Ｆｃ受容体ノックアウトマウス（ＦｃγＲ－／－）のＭＣ３８腫瘍モデルには、抗腫瘍活性を示していない（図１６）。これは、アゴニスト抗体の抗腫瘍活性に対して、Ｆｃγ受容体との結合は、必要なものであることを説明し、本発明の重鎖定常領域、たとえば：Ｇ２（Ｖ１１）（ＪＡＣ１とも言う）は、ヒトＩｇＧ抗体ＣＤ４０抗体の、ワクチンにおける佐剤とする活性を向上できるだけなく、当該抗体の抗腫瘍活性も向上できる。

なお、ＯＶＡワクチンモデル試験は、投与量を３．１６μｇ／マウス及び１μｇ／マウスにする場合に、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２（Ｖ１１）が、著しい活性を有するが（図１７）、投与量を１０μｇ／マウスにする場合に、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ＩｇＧ１抗体は、もう活性を有しない（図９Ａ）ことを表明する。

ＯＶＡワクチンモデルを利用する際に、ＪＡＣ４配列を含む抗ＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＨＤＰＧ）と、突然変異がないＩｇＧ２抗ＣＤ４０抗体（Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２）との免疫アゴニスト活性を比較し、結果として、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２と比べて、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＨＤＰＧは、明らかにより強い活性を有することを示し、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞におけるＯＴ－Ｉ細胞の割合、及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合は著しくに向上したことに表現される（図１８）。同時に、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＨＤＰＧ抗体の活性は、少なくともＡｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１（Ｖ１１）と相当し、或いはより高い（図１８）。

そして、本発明の重鎖定常領域（たとえば：ＪＡＣ１或いはＪＡＣ４）に基づき構築さ
れたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、より良い免疫刺激活性及び抗腫瘍活性を有し、その最小有効投与量は、現在研究されている、ＩｇＧ１に基づくアゴニスト抗体の最小有効投与量の１／１０又はより低い量であるから、より良い活性、より広い有効投与量の範囲、及びより優れる安全性を有し、抗腫瘍薬物として開発されても良く、腫瘍ワクチン或いは感染性疾患に対するワクチンの免疫效果を増強するための免疫助成剤として用いられても良い。
実施例９．好ましいヒトＩｇＧ２ ＣＨ１－ヒンジ領域と、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有するＦｃとは、相乗的に、より強い他のアゴニストヒトＩｇＧ抗体活性を提供できる
Ｆｃγ受容体結合能が、他のヒトアゴニスト抗体活性に対する影響、及び好ましいヒトＩｇＧ２ ＣＨ１－ヒンジ領域とより良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有するＦｃとは、より強い他のアゴニストヒトＩｇＧ抗体活性を相乗に提供できるか否かを研究するために、異なるＣＨ１－ヒンジ領域とＦｃを有するアゴニスト抗ＤＲ５抗体（Ａｎｔｉ－ｍＤＲ５－ＩｇＧ）は調製され、かつ抗ＤＲ５抗体が、ＭＣ３８のプログラム細胞死を誘導する活性を分析した。結果として、ヒトＩｇＧ２抗ＤＲ５抗体（Ａｎｔｉ－ｍＤＲ５－ＩｇＧ２）は、活性を有しない；ＪＡＣ１配列を有する抗ＤＲ５抗体（Ａｎｔｉ－ｍＤＲ５－ＩｇＧ２（Ｖ１１））は、活性を有するが、Ｆｃγ受容体（ｈＦＣＧＲ^Ｔｇ）を発現する環境は必要のものである（図１９）。また、ヒト抑制性Ｆｃγ受容体特異性抗体２Ｂ６が、こんな活性を完全に遮断でき、ＪＡＣ１配列を有する抗ＤＲ５抗体（Ａｎｔｉ－ｍＤＲ５－ＩｇＧ２（Ｖ１１））の活性は、ヒト抑制性Ｆｃγ受容体との相互作用に特異性に調節されることを説明し、アゴニスト抗ＤＲ５抗体活性の調節機構は、抗ＣＤ４０抗体の調節機構と一致することをさらに説明した。そして、好ましいヒトＩｇＧ２ ＣＨ１－ヒンジ領域と、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能と傾向性を有するＦｃとは、より強いアゴニストヒトＩｇＧ抗ＤＲ５抗体活性を提供できる
実施例１０．好ましい抗体定常領域が、好ましいヒトＩｇＧ２ ＣＨ１－ヒンジ領域と良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能のＦｃを有することは十分ではなく、Ｆｃとして、良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合の傾向性、即より高いＩ／Ａ比率も必要とする。

ヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合の傾向性が、増強された抑制性Ｆｃγ受容体結合能を有する抗体重鎖定常領域の活性化活性に対する影響を研究するために、それぞれに、重鎖定常領域Ｇ２－ＳＤＩＥと、Ｇ２－ＧＡＳＤＡＬＩＥと、Ｇ１（Ｈ２）に基づく抗マウスＣＤ４０抗体Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＳＤＩＥと、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＧＡＳＤＡＬＩＥと、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ１（Ｈ２）は構築され、かつＯＶＡワクチンモデルにおいて、異なる抗体を有するものの免疫活性化活性は、比較された。三つの抗体は、いずれも好ましいヒトＩｇＧ２のＣＨ１－ヒンジ領域を有する；Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ ｈＩｇＧ１（Ｈ２）と比べて、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＳＤＩＥとＡｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＧＡＳＤＡＬＩＥは、より良いヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能を有するが（表４）、同時に、より強いヒト活化性Ｆｃγ受容体と結合する能を有し（表４）、そしてより低いＩ／Ａ比率を有する（表４）。ＯＶＡワクチンモデルの分析結果として、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＳＤＩＥとＡｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ｈＩｇＧ２－ＧＡＳＤＡＬＩＥ抗体の活性は、Ａｎｔｉ－ｍＣＤ４０－ ｈＩｇＧ１（Ｈ２）抗体より優れているわけではないが、逆に劣ることを示し（図２０）、好ましい抗体は、増強されたヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合能を必要だけではなく、ヒト抑制性Ｆｃγ受容体結合の傾向性も必要とすることを説明した。こんな傾向性は、より高いＩ／Ａ比率に表現され、例えば０．３２或いはより高い。

本発明に提供された好ましい抗体重鎖定常領域の実施例は、アゴニスト抗ＣＤ４０とＤＲ５抗体の活性の向上に用いられても良いだけではなく、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＡＣＩ、ＤＲ４、ＦＡＳ等のような他のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに対するアゴニスト抗体、ならびに非ＴＮＦ受容体スー
パーファミリーメンバー（ＣＤ２８、ＳＬＡＭファミリー分子）に対するアゴニスト抗体に用いられても良い。免疫活性化を調節するや、プログラム細胞死を誘導する受容体分子に対するアゴニスト抗体だけではなく、他の生物学機能を有する受容体分子に対するアゴニスト抗体に用いられても良い、例えば免疫抑制性受容体分子（免疫チェックポイント）（例えばＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ－３等）に対するアゴニスト抗体。ヒトＩｇＧ抗体に基づくアゴニスト抗体ではなく、他の種の配列を含むキメラ抗体に基づくアゴニスト抗体に用いられても良い。二つの重鎖と二つの軽鎖を有する典型的なＩｇＧアゴニスト抗体だけではなく、重鎖のみ含むＩｇＧアゴニスト抗体、及び他のＩｇＧから誘導したバリアント形式のアゴニスト抗体（例えば、三つ以上の抗原結合サイトを有する抗体、抗体重鎖のＣ端に抗原結合サイトを有する二重特異性抗体或いは多特異性抗体）も含む。抗体配列に基づくアゴニスト抗体ではなく、抗体定常領域配列を有する、標的を活性化する機能を有する融合タンパク質も含む、例えばＣＤ４０Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質、ＯＸ４０Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質、４－１ＢＢＬ－Ｆｃ融合タンパク質、ＣＤ２７Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質、ＣＤ３０Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質、ＣＤ９５Ｌ－Ｆｃ融合タンパク質、ＴＲＡＩＬ－Ｆｃ融合タンパク質、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質等；具体的に、ＣＤ４０Ｌ－ＪＡＣ１、ＣＤ４０Ｌ－ＪＡＣ４、ＯＸ４０Ｌ－ ＪＡＣ１、ＯＸ４０Ｌ－ ＪＡＣ４、ＰＤ－Ｌ１－ＪＡＣ１、ＰＤ－Ｌ１－ＪＡＣ４等にしてもよい。（表５）

以上に、例で説明するために、本発明の詳しい実施形態を説明したが、当業者にとって、特許請求の範囲に記載された本発明から逸脱することなく、詳細に多くの変更を加えることができる。

Claims (21)

1. アゴニスト活性を増強するための重鎖定常領域と、上記重鎖定常領域のＮ末端に抗原結合モジュールとを含む、アゴニスト活性が増強された融合タンパク質であって、上記重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示された配列を有する、融合タンパク質。
2. 上記抗原結合モジュールは、抗体の抗原結合断片、ナノボディ又はリガンドから選ばれる、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 上記抗原結合モジュールは、ナノボディである、請求項１に記載の融合タンパク質。
4. 上記抗原結合モジュールは、リガンドの細胞外ドメインであり、上記リガンドは、免疫共刺激分子であり、上記免疫共刺激分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２４４、ＣＤ１５０、ＣＤ４８、ＣＤ８４、ＣＤ３１９、Ｌｙ１１８、ＣＤ２２９又はＳＬＡＭＦ８からなる群から選ばれる、請求項１に記載の融合タンパク質。
5. 上記抗原結合モジュールは、ＣＤ４０、ＤＲ５、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＡＣＩ、ＤＲ４又はＦＡＳからなる群から選ばれる抗原を標的にする、請求項１に記載の融合タンパク質。
6. 上記抗原結合モジュールは、ＣＤ４０を標的にする、請求項１に記載の融合タンパク質。
7. 上記抗原結合モジュールは、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ又はＬＡＧ－３からなる群から選ばれる抗原を標的にする、請求項１に記載の融合タンパク質。
8. 上記抗原結合モジュールは、リガンドであり、上記リガンドは、免疫抑制性リガンド分子であり、上記免疫抑制性リガンド分子は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ４７、ＶＩＳＴＡ、ＨＶＥＭ及びＧＡＬ９からなる群から選ばれる、請求項１に記載の融合タンパク質。
9. 重鎖定常領域を含むアゴニスト活性が強化された抗体であって、上記重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示された配列を有する、抗体。
10. 上記抗体は、ＣＤ４０、ＤＲ５、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＡＣＩ、ＤＲ４及びＦＡＳからなる群から選ばれる抗原を標的にし、或いは、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ及びＬＡＧ－３からなる群から選ばれる免疫抑制性受容体分子を標的にする、請求項９に記載の抗体。
11. 上記抗体はＣＤ４０を標的にする、請求項９に記載の抗体。
12. 上記抗体の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示された配列を有し、上記抗体の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示された配列を有する、請求項９に記載の抗体。
13. 上記抗体重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示された配列を有する、請求項９に記載の抗体。
14. 上記抗体は、ＣＤ４０及びＤＲ５からなる群から選ばれる抗原を標的にする、請求項９に記載の抗体。
15. 請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項９～１４のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
16. がんを治療するための医薬の調製における、請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項９～１４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
17. ａ）治療有効量の請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項９～１４のいずれか一項に記載の抗体、及びｂ）薬学的に許容される担体を含む増殖性疾患を治療するための薬物組成物。
18. 請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項９～１４のいずれか一項に記載の抗体を有するアジュバンド。
19. ａ）治療有効量の請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項９～１４のいずれか一項に記載の抗体、及びｂ）ワクチンを含むワクチン組成物。
20. 腫瘍の予防及び／又は治療における使用のための請求項１９に記載のワクチン組成物。
21. 炎症及び／又は自己免疫症状を軽減するための医薬の調製における、請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項９～１４のいずれか一項に記載の抗体の使用。