JP7802012B2 - 超音波が介在する治療の改善 - Google Patents

Description

本発明は概して、ガス充填微小胞と組み合わせた、超音波が介在する治療的処置の分野に関する。

具体的には、ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた治療的処置の有効性を高めるのに使用するための血管痙攣阻害剤に関する。さらに、ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた治療的処置の有効性を高めるための方法に関する。

ガス充填微小胞（ＭＶ）は音響共振子であり、音場に置かれた場合に、受け取った音響エネルギーを、（ｉ）ガス充填微小胞に音響的および機械的特性を与える、キャビテーションとも呼ばれる振動、および（ｉｉ）加熱などの種々のプロセスを通して散乱させる。

この数十年で、ガス充填微小胞の音響的特性は、主にコントラスト増強超音波イメージング（ＣＥＵＳ）に利用されている。しかしながら、ガス充填微小胞の機械的および加熱特性は現在のところ、超音波介在療法、例えば、医薬（参考文献１）または遺伝子の送達の促進／増加、血栓破壊の補助（参考文献２）、血液脳関門の開放（参考文献３）、免疫調節（参考文献４）、神経調節（参考文献５）、放射線増感（参考文献６）、ＭＶ増強型の熱的アブレーション（参考文献７）、温熱療法（参考文献８）、または非熱的組織アブレーションの補助（参考文献９）における適用について評価中である。

治療的超音波（ＵＳ）は通常、高強度超音波からなり、高い機械的インデックスおよび長いパルス持続時間を特徴とし、一般に、診断イメージングには適さない。

超音波が介在する治療におけるガス充填微小胞の適用の数は増えているにもかかわらず、本出願人は、これらの組み合わせた治療的処置は特定の超音波照射条件下で有効性が低下し得ることを観察した。

本出願人は予期せず、ガス充填微小胞および超音波が介在する治療の使用と組み合わせて血管痙攣阻害剤（ＶＩ）を使用することにより、処置の全体的な有効性を改善することができることを見いだした。

実際に、本出願人は、そのような治療的処置における有効性の（実質的な）低下が、超音波／ガス充填微小胞を曝露した際に対象において生じる一過的な血管運動反応と関連し得ることを観察した。「血管痙攣」としても知られるそのような現象は、文献において説明されているが（例えば参考文献１０を参照）、本出願人が知る限り、ガス充填微小胞および超音波の併用に基づく治療的処置の有効性の低下に関連付けられることは決してなかった。

有利に、本出願人が提案する解決策は、上述の治療的有効性の低下を実質的に制限または回避することを可能にし、一方で、前記有効性は、血管痙攣阻害剤の不存在下で行なわれる組み合わせの微小胞／超音波が介在する処置に関して特に高められる。別の観点からは、そのような血管痙攣阻害剤の使用は、組み合わせの微小胞／超音波が介在する処置の許容できるレベルの治療的有効性を維持することが可能である。

超音波と組み合わせた血管痙攣阻害剤およびガス充填微小胞の使用は、診断イメージングの分野において知られている。

例えば、参考文献１１は、患者に造影剤および冠動脈血管拡張薬を投与することを含む、診断イメージングのための改善された方法を扱っている。

参考文献１２は、増強された画像を生成するために用いられる注入可能な水性ガス分散物および血管拡張薬、すなわちアデノシンを含む組み合わせ製剤を扱っている。

参考文献１３は、局所的な血管拡張を必要とする患者において局所的な血管拡張を促進するための、封入された生体活性ガスを含む、ガスが封入された音響応答性の安定化微小気泡に関し、前記封入された生物活性剤を放出することによって局所的な血管拡張が促進される。

したがって、本出願人の知識によれば、治療的処置における超音波およびガス充填微小胞の併用の治療的有効性の低下を制限または回避するための血管痙攣阻害剤の使用は、決して説明されていない。

本発明の一態様は、ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた治療的処置の有効性を高めるのに使用するための血管痙攣阻害剤（ＶＩ）に関する。

一実施形態では、前記血管痙攣阻害剤は、ジヒドロピリジンカルシウム遮断薬、α遮断薬およびニトロ血管拡張剤からなる群から選択される。

さらなる実施形態では、前記血管痙攣阻害剤は、好ましくは、ニモジピン、ニフェジピン、マグネシウム、プラゾシンおよびニトログリセリンからなる群から選択され；さらにより好ましくは、前記血管痙攣阻害剤はニモジピンである。

前記血管痙攣阻害剤は、ガス充填微小胞の懸濁液と同時または連続して投与することができる。

ＶＩがガス充填微小胞の懸濁液と同時に投与される場合、ＶＩを含む微小胞の懸濁液として、または共投与される２つの別個の溶液として、共投与することができる。

ＶＩがガス充填微小胞の懸濁液に連続して投与される場合、好ましくは、ガス充填微小胞の懸濁液に先立って、例えば１秒～１５分前、好ましくは５秒～１２分前、より好ましくは少なくとも１０分前に投与される。

本発明の別の態様は、ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた治療的処置の方法に関し、前記方法は、
ａ）対象の血管系に血管痙攣阻害剤を投与する工程；
ｂ）対象の血管系にガス充填微小胞の懸濁液を投与する工程；
ｃ）対象の関心領域に治療用超音波を適用する工程
を含む。

特に、前記方法における血管痙攣阻害剤の使用は、前記組み合わせた治療的処置の有効性を高めることができる。

一実施形態では、本発明の薬物輸送プロトコルは、ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた治療的処置の方法に関し、前記方法は、
ａ’）対象の血管系に生物活性剤を投与する工程；
ａ）対象の血管系に血管痙攣阻害剤を投与する工程；
ｂ）対象の血管系にガス充填微小胞の懸濁液を投与する工程；
ｃ）対象の関心領域に治療用超音波を適用する工程
を含む。

特に、前記方法における血管痙攣阻害剤の使用は、前記組み合わせた治療的処置の有効性を高めることができる。

本発明の一実施形態では、開示される方法の工程ａ’）および工程ａ）は、同時または連続して行われる。

ＵＳ＋ＶＩによる処置中の腫瘤灌流の定量化。上パネル：ＶＩ事前処置なし；下パネル：ＶＩ事前処置。

本出願人は、超音波療法においてガス充填微小胞とともに血管痙攣阻害剤（ＶＩ）を投与することにより、治療的処置の有効性を改善することができることを見いだした。

本明細書において用いられる用語「有効性」は、治療的超音波およびガス充填微小胞の組み合わせ（ＵＳ－ＭＶ）が有益な治療的効果を提供する能力を指す。

例えば、薬物輸送のためのＵＳ－ＭＶの併用の有効性は、標的領域の血管区画における生体活性分子（例えば治療剤または造影剤）の濃度を高める能力；血管を通る溢出の程度および／または細胞内送達の程度によって評価することができる。

超音波血栓溶解療法（ｓｏｎｏｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ）（すなわち血栓の破壊）のためのＵＳ－ＭＶの併用において、処置の有効性は、例えばイメージング追跡による（例えば血管造影、コンピューター断層撮影、レーザードップラー、コントラスト増強超音波イメージングまたは磁気共鳴イメージングによる）直接的な方法、または、例えば血液サンプルの生物学的分析；心電図変化；および／または臨床改善（単数または複数）（例えば神経機能または心機能）の評価による間接的な方法のいずれかで、例えば、灌流を高める能力または血管の血流再開を誘導する能力によって評価することができる。

ＭＶ増強型の熱的アブレーションのためのＵＳ－ＭＶの併用の有効性は、例えば、特定の体積の組織の温度上昇を測定することにより、および、この温度に到達するのに要する超音波処理時間の減少により；熱上昇に到達するのに要する音響エネルギーまたはパワーの減少により、または、イメージングによる組織損傷の追跡により、評価することができる。

ＭＶ増強型の温熱療法のためのＵＳ－ＭＶの併用の有効性は、例えば、特定の体積の組織における温度上昇（例えば、磁気共鳴温度測定、または熱電対による）を測定することにより；温熱療法を達成するのに要する音響エネルギーまたはパワーの減少により；処置領域における血流の増加により（例えば、血管造影、磁気共鳴イメージング、コンピューター断層撮影、レーザードップラー、コントラスト増強超音波イメージングによる）、薬物送達の追跡により、および／または、以下に「薬物輸送」について記載するのと同様の評価により、評価することができる。

ＢＢＢ開放のためのＵＳ－ＭＶの併用の有効性は、例えば、血管を通る生体活性分子（例えば、治療剤または造影剤）の血管から脳内への溢出を増強する能力により、評価することができる。

ＵＳ＋ＭＶによって誘導される神経調節、すなわちニューロン機能の調節は、ＵＳ－ＭＶの併用が適用される別の治療的適用分野である。この場合では、組み合わせたＵＳ－ＭＶ処置の有効性は、例えば、ニューロンの電気的活性の変動によって評価することができる。

放射線増感、すなわち、ＵＳおよびＭＶを用いて放射線療法（ＲＴ）の効果を高めることによる腫瘍の処置における適用のためのＵＳ－ＭＶの併用の有効性は、例えば、以下：組織血行力学の変化；ＵＳ＋ＲＴに曝露された細胞における細胞死およびアポトーシスのレベルの増加；腫瘍増殖の減少および／または週にわたる生存の増加のいずれかによって強調される、処置によって誘導される病変の存在を検出することによって評価することができる。

非熱的アブレーションにおける適用のためのＵＳ－ＭＶの併用の有効性は、例えば血流の減少によって強調される、および／または超音波処理した組織におけるネクローシスおよびアポトーシスの追跡によって強調される、処置によって誘導される病変（単数または複数）の存在などを検出することによって評価することができる。

ＵＳ－ＭＶの併用はまた、抗腫瘍療法においても適用することができ、免疫調節、すなわち抗腫瘍免疫応答の刺激によって抗腫瘍効果を発揮する。ＵＳ－ＭＶによって誘導される免疫調節は、熱的アブレーション、穏やかな温熱療法、機械的破壊、または免疫療法薬物（例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ、薬物または抗体）の送達のための血管透過化などの種々のメカニズムを通して達成することができるので、これらのメカニズムを改善することは、免疫調節効果を改善し得ると期待される。免疫調節における適用のためのＵＳ－ＭＶの併用の有効性は、例えば、免疫応答の誘導または改変；免疫療法に対する応答の改変および／または生物学的応答（例えば腫瘍増殖）の改変によって評価することができる。

本説明および特許請求の範囲において、「治療用超音波およびガス充填微小胞の懸濁液の併用」という表現（短縮して「ＵＳ－ＭＶの併用」）は、ガス充填微小胞の懸濁液と組み合わせた治療的超音波の使用に基づく任意の治療的処置を指す。

上述したように、これらの治療的処置は、例えば、血管透過化を増加させるため、例えば医薬または遺伝子の送達を促進／増加させるため、血栓の破壊を補助するため、血液脳関門の開放のため、免疫調節のため、神経調節のため、放射線増感のため、または、温熱療法を補助するため、ＭＶ増強型の熱的アブレーション、および非熱的組織アブレーションにおいて用いられ得る。

本明細書において用いられる「治療用超音波」という表現は、対象における疾患または障害を処置することを目的として生物学的効果を達成するための超音波の使用を示す。本説明および特許請求の範囲において、「治療用ＵＳ」または「治療的ＵＳ」という表現は、交換可能に用いられる。

治療用超音波は、種々のタイプのトランスデューサーによって産生され得る。治療用超音波のためのトランスデューサーの適切な例は、単一または複数の圧電素子を備えた集束トランスデューサーまたは非集束トランスデューサーである。

通常、治療用超音波は、専用のプラットフォーム（例えばＭＲＩスキャナと連結されている）および臨床音波検査プラットフォームが備わっている。

生物学的効果を達成するために、治療用超音波のいくつかのパラメーターを考慮しなければならない。

治療用超音波は一般に、好ましくは数秒（すなわち１秒）～１７０分に含まれる処置持続時間を特徴とする。本明細書において用いられる「処置持続時間」という表現は、関心領域における超音波適用の発生からその終了までの間の期間全体を示す。処置持続時間の単位は時間（ｔｉｍｅ）である。

治療用超音波を特徴付けるパルス長は、一般に、５μｓ～６０ｓに含まれ、好ましくは５μｓ～１０ｓに含まれ、よりより好ましくは、パルス長は、１００μｓ～５ｍｓに含まれる。「パルス長」という表現は、パルスの開始（「オン」）から、そのパルスの終了（「オフ」）までの時間を指し、パルスが「オン」である実際の時間を示している。パルス長の単位は時間（例えば、数マイクロ秒～数秒）である。

治療用超音波の周波数は一般に、２０ｋＨｚ～７０ＭＨｚ、好ましくは０．１０ＭＨｚ～５０ＭＨｚ、さらにより好ましくは約０．１５～約２ＭＨｚに含まれる。用語「周波数」は、特定の時間の持続時間中に生じる特定の事象の数を示す。周波数の単位はＨｅｒｔｚ（すなわち１／ｓ）である。

治療用超音波の音圧は一般に、１０ｋＰａ～１００ＭＰａに含まれ、好ましくは２０ｋＰａ～５０ＭＰａに含まれ、さらにより好ましくは５０ｋＰａ～２５ＭＰａに含まれる。

治療用超音波の音響強度（ｗａｔｔ／ｃｍ^２またはＷ／ｃｍ^２）は一般に、０．１～９９０Ｗ／ｃｍ^２に含まれ、好ましくは１．３Ｗ／ｃｍ^２～２１．５Ｗ／ｃｍ^２に含まれ、さらにより好ましくは１．３～５Ｗ／ｃｍ^２に含まれる。「音響強度」という表現は、音波ビームにおける単位領域あたりの音波によって運搬されるパワーを指す。音響強度の単位はｗａｔｔｓ／ｃｍ^２である。

治療的超音波は、ほとんどの場合において、診断超音波とは異なる周波数で行なわれる。具体的には、低い減衰を達成するために、より低い周波数で治療的超音波を行なうことが望ましいが、診断超音波では、より良好な解像度を得るために、より高い周波数が用いられる（参考文献１４）。

治療用超音波はまた、生物学的効果を（ＭＶと組み合わせて、または組み合わせずに）誘導する能力に起因して、診断超音波と区別することができる。

治療のために、超音波は、熱的メカニズムだけでなく、音響キャビテーション、放射線力、剪断応力および音響のストリーミング／マイクロストリーミング、衝撃波または他の未決定の非熱的プロセスを含む非熱的メカニズムを通して、効果を誘導することができる。熱的効果および音響キャビテーションは、最も重大な効果であり、それらの作用機序および生物学的効果は当該分野で周知である。本明細書において用いられるように、治療用ＵＳは、治療的超音波処置を受けている対象に対して、例えば、局所温度上昇、血管透過化、血管破裂（ｖｅｓｓｅｌ ｒｕｐｔｕｒｅ）および／または剪断応力を含む生物学的効果を誘導することが可能な超音波を指す。

熱的効果は、処置の温度および持続時間に依存する。例えば、低い温度上昇（例えば＞４３°Ｃ、１時間）は、組織を化学療法または放射線療法に対して感作させ、一方で、より高い温度上昇（例えば５６°Ｃ、１秒）は、熱凝固および細胞死などの不可逆な損傷を引き起こす。

治療用ＵＳの音響キャビテーションおよび機械的効果は、重度の機械的および熱的効果ならびに化学的および光学的効果を引き起こし、局所温度上昇、血管透過化、血管破裂、細胞死および剪断応力などの様々な生物学的効果をもたらす。

一実施形態では、治療用ＵＳは、血管透過化を誘導することが可能なＵＳを示す。

治療用超音波は、症候性の子宮筋腫、がん（例えば乳がんおよび肝臓前立腺がん）、疼痛および神経障害などの様々なタイプの病理における組織熱的アブレーションのために広く用いられるが、超音波血栓溶解療法（ｓｏｎｏｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ）および組織破砕にも用いられる。

治療用超音波と組み合わせたＭＶの使用は、音響キャビテーションが関与することが知られている多くの異なる治療的応答の効果を高める。実際に、注入されるとＭＶはキャビテーション核として作用し、音響キャビテーションの閾値を下げる。ＵＳ条件を調整することにより、ＭＶのキャビテーションレジメンを制御することが可能であり、振動の安定レジメン（安定キャビテーション）から、より高いエネルギーのための激しい崩壊に移行する。このキャビテーションレジメンは、熱的アブレーション（ＭＶ増強型の熱的アブレーション）を改善するため、血栓を溶解するため（超音波血栓溶解療法（Ｓｏｎｏｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ））、血管を透過化するため（血液脳関門の開放）、特定の薬物または遺伝子の送達を達成するため、免疫調節、神経調節、放射線増感、温熱療法の補助、および組織の非熱的アブレーションのために、選択的に用いることができる。

本明細書において用いられる用語「ガス充填微小胞」は、安定化材料のエンベロープまたは層（フィルム形状の層を含む）によって囲まれたマイクロメートルまたはナノメートルのサイズのガスの気泡を含む任意の構造を含む。その用語は、ガス充填リポソーム、微小気泡、マイクロスフェア、マイクロバルーンまたはマイクロカプセルとして当技術分野で知られているものを含む。安定化材料は、例えば、界面活性剤、脂質、スフィンゴ脂質、オリゴ脂質、糖脂質、リン脂質、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、および合成または天然の高分子材料を含む、典型的に当技術分野で知られている任意の材料であってよい。

ガス充填微小胞の「前駆体」という用語は、ガスの存在下で水性担体を用いて再構成した際にガス充填微小胞の懸濁液を産生する任意の組成物を含む。前記組成物は典型的に、ガスの存在下でその水性懸濁液を振とうした際にガス充填微小胞を形成することが可能な、乾燥粉末化形態（例えば凍結乾燥または噴霧乾燥）での任意の上記の安定化材料を含む。

用語「微小気泡」は、ガスの気泡が、ガス／液体界面において、ガスと液体の界面に置かれた安定化両親媒性材料を含む非常に薄いエンベロープ（フィルム）によって境界が作られている水性懸濁液を含む。微小気泡懸濁液は、適切なその前駆体、例えば粉末化された両親媒性材料（例えば凍結乾燥された事前形成リポソームまたは凍結乾燥もしくは噴霧乾燥されたリン脂質溶液）を、攪拌しながら、空気または他のガスと接触させ、次いで水性担体と接触させて、微小気泡懸濁液を産生することによって調製することができ、次いでそれを、好ましくはその調製直後に投与することができる。

ガス充填微小気泡は一般に、１つまたは複数の両親媒性構成要素によって安定化される。微小気泡の安定化エンベロープを形成するのに適切な両親媒性構成要素は、例えば、リン脂質；リゾリン脂質；脂肪酸類、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸またはオレイン酸；ポリマー、例えば、キチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を保有する脂質（「ペグ化脂質」とも呼ばれる）；スルホン化モノ－ ジ－、オリゴ－または多糖類を保有する脂質；コレステロール、コレステロール硫酸またはヘミこはく酸コレステロール；ヘミこはく酸トコフェロール；エーテルを含む脂質またはエステル結合脂肪酸；重合脂質；リン酸ジアセチル；リン酸ジセチル；セラミド類；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸ステアリン酸）、ポリオキシエチレン脂肪族アルコール類、ポリオキシエチレン脂肪族アルコールエーテル類、ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル類、グリセロールポリエチレングリコールリシノール酸、エトキシ化大豆ステロール類、エトキシ化ヒマシ油またはエチレンオキシド（ＥＯ）およびプロピレンオキシド（ＰＯ）ブロック共重合体；酪酸コレステロール、イソ酪酸コレステロール、パルミチン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール、酢酸ラノステロール、パルミチン酸エルゴステロール、またはｎ－酪酸植物ステロールを含む、ステロール脂肪酸エステル；コレステロールグルクロニド、ラノステロールグルクロニド、７－デヒドロコレステロールグルクロニド、エルゴステロールグルクロニド、コレステロールグルコン酸、ラノステロールグルコン酸、またはエルゴステロールグルコン酸を含む、糖酸類のステロールエステル類；ラウリルグルクロニド、ステアロイルグルクロニド、ミリストイルグルクロニド、ラウリルグルコン酸、ミリストイルグルコン酸、またはステアロイルグルコン酸を含む、アルコール類および糖酸類のエステル；スクロースラウリン酸、フルクトースラウリン酸、スクロースパルミチン酸、スクロースステアリン酸、グルクロン酸、グルコン酸またはポリウロン酸を含む、脂肪酸類と糖類のエステル類；サルササポゲニン、スミラゲニン、ヘデラゲニン、オレアノール酸、またはジギトキシゲニンを含む、サポニン類；グリセロール、または、グリセロールトリパルミテート、グリセロールジステアレート、グリセロールトリステアレート、グリセロールジミリステート、グリセロールトリミリステート、グリセロールジラウレート、グリセロールトリラウレート、グリセロールジパルミテートを含む、グリセロールエステル；Ｎ－スクシニルジオレイルホスファチジルエタノールアミン；１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロール；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－３－スクシニルグリセロール；１，３－ジパルミトイル－２－スクシニルグリセロール；１－ヘキサデシル－２－パルミトイルグリセロホスホエタノールアミンまたはパルミトイルホモシステイン；アルキルアミン類またはアルキルアンモニウム塩類、以下を含む：少なくとも１つの（Ｃ_１０－Ｃ_２０）、好ましくは（Ｃ_１４－Ｃ_１８）アルキル鎖、例えば、Ｎ－ステアリルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジステアリルアミン、Ｎ－ヘキサデシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジヘキサデシルアミン、Ｎ－ステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’－ジステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ－ヘキサデシルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’－ジヘキサデシルアンモニウム塩化物、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）；第３級または第４級アンモニウム塩類、以下を含む：１つまたは好ましくは２つの（Ｃ_１０－Ｃ_２０）、好ましくは（Ｃ_１４－Ｃ_１８）アシル鎖（（Ｃ_３－Ｃ_６）アルキレン橋を通してＮ原子に連結される）、例えば、１，２－ジステアロイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２－オレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＳＤＡＰ）；およびそれらの混合物または組み合わせを含む。

本明細書において用いられる「リン脂質」という用語は、任意の両親媒性のリン脂質化合物を包含することを意図し、その分子は、最終微小気泡懸濁液中で、ガスと水の境界界面において材料の安定化フィルムを（典型的に単分子層の形態で）形成することが可能である。したがって、これらの材料は、当該分野において「フィルム形成リン脂質」とも呼ばれる。

リン脂質は典型的に、少なくとも１つのリン酸基および少なくとも１つ、好ましくは２つの親油性長鎖炭化水素基を含む。

適切なリン脂質の例は、１つまたは好ましくは２つの（等しい、または異なる）脂肪酸残基およびリン酸とグリセロールのエステルを含み、ここで、リン酸残基は次いで、例えば、コリン（ホスファチジルコリン－ＰＣ）、セリン（ホスファチジルセリン－ＰＳ）、グリセロール（ホスファチジルグリセロール－ＰＧ）、エタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン－ＰＥ）、イノシトール（ホスファチジルイノシトール－ＰＩ）などの親水性基に結合される。ただ１つの脂肪酸残基とリン脂質のエステルは、一般に、当該分野において、リン脂質の「リゾ」形態または「リゾリン脂質」と呼ばれる。リン脂質内に存在する脂肪酸残基は一般に、典型的に１２～２４個の炭素原子、好ましくは１４～２２個を含む長鎖脂肪酸類であり；脂肪族鎖は、１つまたは複数の不飽和を含んでよく、または、好ましくは完全に飽和である。リン脂質に含まれる適切な脂肪酸の例は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。好ましくは、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸のような飽和脂肪酸が用いられる。

リン脂質のさらなる例は、ホスファチジン酸類、すなわち、脂肪酸とグリセロール－リン酸のジエステル類；スフィンゴミエリン類のようなスフィンゴ脂質類、すなわち、脂肪酸とのグリセロールジエステルの残基がセラミド鎖によって置換されているホスファチジルコリン類似体；カルジオリピン類、すなわち、脂肪酸と１，３－ジホスファチジルグリセロールのエステル類；糖脂質類、例えば、ガングリオシドＧＭ１（またはＧＭ２）またはセレブロシド類；糖脂質；スルファチド類およびグリコスフィンゴリピド類である。

本明細書において用いられる、用語「リン脂質」は、単独または混合物としてのいずれかで用いられ得る、天然起源、半合成または合成のいずれかで調製された生成物を含む。

天然起源のリン脂質の例は、天然レシチン類（ホスファチジルコリン（ＰＣ）誘導体）、例えば、典型的に、大豆または卵黄レシチン類である。

半合成リン脂質の例は、天然起源レシチン類の部分的または完全に水素化された誘導体である。好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリン、エチルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールまたはスフィンゴミエリンの脂肪酸ジエステルである。

リン脂質の具体例は、例えば、ジラウロイル－ホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイル－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイル－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイル－ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジステアロイル－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイル－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（エチル－ＤＳＰＣ）、ジペンタデカノイル－ホスファチジルコリン（ＤＰＤＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイル－ホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイル－ホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイル－ホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイル－ホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルコリン（ＯＰＰＣ）、ジラウロイル－ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジアラキドイルホスファチジル－グリセロール（ＤＡＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジオレオイル－ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジアラキドイルホスファチジン酸（ＤＡＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレイルホスファチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジアラキドイルホスファチジル－エタノールアミン（ＤＡＰＥ）、ジリノレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（ＤＡＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＰ）、およびジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＰ）、ジラウロイル－ホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（ＤＡＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイル－ホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）である。具体的には、ＤＡＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳ、エチル－ＤＳＰＣ、エチル－ＤＰＰＣまたはそれらの混合物から選択されるリン脂質を用いることができ、より具体的には、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＳおよびＤＳＰＣである。リン脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のような親水性ポリマーが、それに結合することによって改変されたリン脂質をさらに含んでよい。好ましいポリマー改変リン脂質は、「ペグ化リン脂質」、すなわち、ＰＥＧポリマーに結合したリン脂質を含む。ペグ化リン脂質の例は、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン類（短縮して「ＰＥ－ＰＥＧ」）、すなわち、親水性エタノールアミン部分が可変分子量（例えば３００～２００００ダルトン、好ましくは５００～５０００ダルトン）のＰＥＧ分子に結合されたホスファチジルエタノールアミン類、例えば、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ（またはＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ、ＤＡＰＥ－ＰＥＧまたはＤＯＰＥ－ＰＥＧ）である。例えば、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００は、約２０００の平均分子量を有するＰＥＧポリマーが付着したＤＰＰＥを指す。典型的なペグ化リン脂質の例には、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００が含まれる。

ホスファチジルエタノールアミンのペグ化誘導体、具体的には、ＤＰＰＥ－ＰＥＧおよび／またはＤＳＰＥ－ＰＥＧが典型的に、任意の上述のリン脂質との混合において用いられる。

典型的に、リン脂質は、微小気泡の安定化エンベロープの主な構成要素であり、ガス充填微小気泡のエンベロープを形成する構成要素の合計量の少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも７５％になる。好ましい実施形態のいくつかでは、エンベロープの実質的に全体（すなわち少なくとも９０％ｗ／ｗ）がリン脂質で形成され得る。

リン脂質は、任意の上記に挙げた両親媒性化合物との混合で好適に用いることができる。したがって、例えば、コレステロール、エルゴステロール、植物ステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、没食子酸プロピルまたはパルミチン酸アスコルビルのような脂質類、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸およびそれらの誘導体のような脂肪酸、またはブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または他の非リン脂質化合物は、前述のリン脂質の１つまたは複数に、例えば、好ましくは０～５０重量％の範囲、より好ましくは２５％までの比率で、任意に添加されてもよい。特に好ましいものはパルミチン酸である。

他の賦形剤または添加剤は、微小気泡の乾燥製剤中に存在してもよく、または、微小気泡の安定化エンベロープの形成に必ずしも関与せずに（または部分的にのみ関与して）、その再構成に用いられる水性担体と一緒に添加されてもよい。これらは、ｐＨ調節剤、浸透圧調整剤、粘性増強剤、乳化剤、充填剤などを含み、従来の量で用いられ得る。例えば、ポリオキシプロピレングリコールおよびポリオキシエチレングリコールのような化合物ならびにそれらの共重合体を用いることができる。粘性増強剤または安定剤の例は、線状および架橋のポリ－およびオリゴ－サッカライド、糖類および親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコールから選択される化合物である。

ガス充填微小気泡の調製は、凍結乾燥または噴霧乾燥の工程を含み得るので、製剤中に、凍結乾燥添加剤、例えば、凍結保護および／または溶解保護（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）効果を有する薬剤、および／または充填剤、例えばグリシンもしくはヒスチジンなどのアミノ酸；炭水化物、例えば、スクロース、マンニトール、マルトース、トレハロース、グルコース、ラクトースもしくはシクロデキストリンなどの単糖、またはデキストラン、キトサンおよびその誘導体などの多糖類（例えば：カルボキシメチルキトサン、トリメチルキトサン）；またはポリエチレングリコールなどのポリオキシアルキレングリコールを含むことが有利であり得る。

微小気泡は、当該分野における任意の公知の方法に従って産生することができる。典型的に、製造方法は、好ましくは前記材料を含む水性または有機懸濁液の凍結乾燥（フリーズドライ）による、上記の両親媒性材料を含む凍結粉末化材料の調製を含む。微小気泡およびその前駆体の調製例は、例えば参考文献１５または参考文献１６に開示されている。この後者の製造手順によれば、リン脂質（および他の任意のフィルム形成材料）、溶解保護（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）剤および他の任意の添加剤を、水および水非混和性有機溶媒の混合物中に撹拌下で分散させて、マイクロエマルションを形成することができる。次いで、リン脂質（および任意に、他の両親媒性フィルム形成化合物および／または添加剤）によって囲まれて安定化された溶媒の微小滴を含む、得られたマイクロエマルションを、従来の技術に従って凍結乾燥し、凍結乾燥された材料を得て、それを（例えば適切なガスの存在下でバイアル中に）保管し、水性担体を用いて再構成して、最終的に、ガス充填微小気泡懸濁液を得ることができる。

あるいは、キャリブレーションされたガス充填微小気泡を、例えば参考文献１７に開示されるフローフォーカシング装置を用いることによって調製することができる。

凍結乾燥された生成物は一般に粉末またはケークの形状であり、所望のガスと接触して（例えばバイアル中に）保管することができる。生成物は、典型的に注入可能な適切な生理的に許容できる水性液体担体中に容易に再構成可能であり、懸濁液を穏やかに撹拌した際にガス充填微小気泡が形成される。適切な生理的に許容できる液体担体は、滅菌水、食塩水などの水溶液（注入のための最終製品が低張でないように有利に平衡化されてよい）、または、１もしくは複数の浸透圧調節物質、例えば塩類または糖類、糖アルコール類、グリコール類または他の非イオン性ポリオール材料（例えば、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）、キトサン誘導体、例えば、カルボキシメチルキトサン、トリメチルキトサンまたはゲル化化合物、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルデンプンまたはデキストランの溶液である。

他の適切なガス充填微小胞は、当該分野において、「マイクロバルーン」、「マイクロカプセル」または「マイクロスフェア」と呼ばれる。これらのガス充填微小胞は、ガスの気泡が、例えば高分子（天然または合成）、タンパク質性、水不溶性脂質またはそれらの任意の組み合わせであり得る固体材料エンベロープによって囲まれている懸濁液を含む。高分子材料で作られたマイクロバルーンの例は、例えば参考文献１８に開示されている。不溶性脂質（例えばトリパルミチンまたはトリステアリン）で作られたマイクロカプセルの例は、例えば参考文献１９に開示されている。タンパク質性エンベロープ（例えばアルブミンなどの天然タンパク質）を有するマイクロスフェアは、例えば参考文献２０に開示されている。

任意の生体適合性ガス、ガス前駆体またはそれらの混合物を用いて上記微小胞を充填してよい（以降、「微小胞形成ガス」とも呼ぶ）。

ガスは、例えば、空気；窒素；酸素；二酸化炭素；水素；亜酸化窒素；希ガスまたは不活性ガス、例えばヘリウム、アルゴン、キセノンもしくはクリプトン；低分子量炭化水素（例えば７個までの炭素原子を含む）、例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタンもしくはイソペンタンなどのアルカン、シクロブタンもしくはシクロペンタンなどのシクロアルカン、プロペン、ブテンもしくはイソブテンなどのアルケン、または、アセチレンなどのアルキン；エーテル；ケトン；エステル；ハロゲン化ガス、好ましくはフッ素化ガス、例えばまたは、ハロゲン化、フッ素化もしくはパーフルオロ化低分子量炭化水素類（例えば７個までの炭素原子を含む）；または前述のいずれかの混合物を含んでよい。ハロゲン化炭化水素が用いられる場合、前記化合物におけるハロゲン原子の好ましくは少なくとも一部、より好ましくは全てがフッ素原子である。

フッ素化ガスが好ましく、特にパーフルオロ化ガスが好ましい。フッ素化ガスは、少なくとも１つのフッ素原子を含む材料、例えば、フッ素化炭化水素（１つまたは複数の炭素原子およびフッ素を含む有機化合物）；六フッ化硫黄；フッ素化、好ましくはパーフルオロ化ケトン類、例えばパーフルオロアセトン；およびフッ素化、好ましくはパーフルオロ化エーテル類、例えばパーフルオロジエチルエーテルを含む。好ましい化合物は、パーフルオロ化ガス、例えばＳＦ_６またはパーフルオロカーボン（パーフルオロ化炭化水素）、すなわち、全ての水素原子がフッ素原子によって置換されている炭化水素類であり、特に安定した微小気泡懸濁液を形成することが知られている。用語「パーフルオロカーボン」は、飽和、不飽和、および環状パーフルオロカーボンを含む。生体適合性の、生理的に許容できるパーフルオロカーボンの例は以下である：パーフルオロアルカン類、例えば、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン（例えばパーフルオロ－ｎ－ブタン、他の異性体、例えばパーフルオロ－イソブタンとの混合であってもよい）、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサンまたはパーフルオロヘプタン；パーフルオロアルケン類、例えば、パーフルオロプロペン、パーフルオロブテン（例えばパーフルオロブト－２エン）またはパーフルオロブタジエン；パーフルオロアルキン類（例えばパーフルオロブト－２－イン）；およびパーフルオロシクロアルカン類（例えばパーフルオロシクロブタン、パーフルオロメチルシクロブタン、パーフルオロジメチルシクロブタン、パーフルオロトリメチルブタン、パーフルオロシクロペンタン、パーフルオロメチルシクロペンタン、パーフルオロジメチルシクロペンタン、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロメチルシクロヘキサンおよびパーフルオロシクロヘプタン）。好ましい飽和パーフルオロカーボンは、例えば、ＣＦ_４、Ｃ_２Ｆ_６、Ｃ_３Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_１０、Ｃ_５Ｆ_１２およびＣ_６Ｆ_１４含む。

任意の比で任意の上記のガスの混合物を用いることも有利であり得る。例えば、混合物は、従来のガス、例えば、窒素、空気または二酸化炭素、および、安定した微小気泡懸濁液を形成するガス、例えば、六フッ化硫黄または上記に示されたパーフルオロカーボンを含んでよい。適切なガス混合物の例は、例えば、参照により本明細書中に援用される参考文献２１に見ることができる。以下の組み合わせが特に好ましい：ガス（Ａ）および（Ｂ）の混合物であって、ガス（Ｂ）が前に例示されたものの中から選択されるフッ素化ガスであり、その混合物を含み、（Ａ）が、空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物から選択される。ガス（Ｂ）の量は、合計の混合物の約０．５％～約９５％ｖ／ｖ、好ましくは約５％～８０％を示すことができる。

特に好ましいガスは、ＳＦ_６、Ｃ_３Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_１０またはそれらの混合物であり、空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはこれらの混合物との混合であってもよい。

特定の状況において、ガス状物質の前駆体（すなわちインビボでガスに変換されることが可能な材料）を含むことが望ましくあり得る。好ましくは、ガス状前駆体およびそれから得られるガスは、生理的に許容できる。ガス状前駆体は、ｐＨ活性化、光活性化、温度活性化などがされてもよい。例えば、特定のペルフルオロカーボンは、温度活性化ガス状前駆体として用いられ得る。これらのペルフルオロカーボン、例えばパーフルオロペンタンまたはパーフルオロヘキサンは、室温（または薬剤が生産および／または保管される温度）よりも高いが体温よりも低い液体／ガス相転移温度を有しており；したがって、液体／ガス相転移を受け、ヒト体内でガスに変換される。

ＳｏｎｏＶｕｅ（登録商標）／Ｌｕｍａｓｏｎ（Ｂｒａｃｃｏ）Ｄｅｆｉｎｉｔｙ／Ｌｕｍｉｎｉｔｙ（Ｌａｎｔｈｅｕｓ）またはＯｐｔｉｓｏｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの市販のガス充填微小胞は診断用途にのみ承認されているが、治療的適用におけるそれらの適応外使用が当該分野において記載されている（例えば参考文献２２および参考文献２３を参照）。

本出願人は、治療用超音波およびガス充填微小胞（ＵＳ－ＭＶ）の併用に基づく治療的方法の有効性が低下し得ることを観察した。

特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本出願人は、そのような有効性の低下が、対象において、具体的には、ＵＳ／ガス充填微小胞の曝露後の処置下領域において生じる、一過的な血管運動反応（「血管痙攣」としても知られる）にある程度関連し得ることを観察した。

血管痙攣
本説明および特許請求の範囲において、「血管痙攣」という表現は、治療用超音波とガス充填微小胞の懸濁液との併用によって誘導される強い血管運動反応を示す。

この（一過的な）血管運動反応の発生および効果は、例えば参考文献１０に記載されている。

特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ガス充填微小胞および超音波が介在する治療の組み合わせた処置の有効性の低下は、対象において、具体的には、ＵＳ／ガス充填微小胞の曝露後の処置下領域において生じる、この一過的な血管運動反応にある程度関連し得る。

本出願人は、予期せずに、ガス充填微小胞および超音波が介在する治療の組み合わせた処置の全体的な有効性が、血管痙攣阻害剤（ＶＩ）の使用により改善され得ることを見いだした。

ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせによって誘導される血管痙攣は、主に、一過的な血流低下、すなわち血管収縮による血流の減少をもたらす。実際に、血管の収縮によって生じる血流減少は、音場を通したガス充填微小胞の連続的な輸送にも影響する場合があり、限局性領域におけるガス充填微小胞の不足をもたらし、超音波パルスの効果を実質的に低下させ、または実質的に効果をなくさせる。

有利に、本出願人が提案する解決策は、上述した治療的有効性の低下を実質的に制限または回避することを可能にし、一方で、前記有効性は、血管痙攣阻害剤の不存在下で行なわれる組み合わせの微小胞／超音波が介在する処置と比べて特に高められる。別の観点からは、そのような血管痙攣阻害剤の使用は、組み合わせの微小胞／超音波が介在する処置の許容できるレベルの治療的有効性を維持することが可能である。

血管痙攣阻害剤
本明細書において用いられる、「血管痙攣阻害剤」（ＶＩ）という表現は、特に、ＵＳ－ＭＶ処置によって引き起こされる血管痙攣の発生を実質的に減少または回避することによって、ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた処置の全体的な有効性を高めることが可能な物質を指す。

血管痙攣阻害剤は、例えば、細胞内カルシウム濃度の減少およびミオシンの脱リン酸化（ＡＤＰのためのＡＴＰの真の（ｒｅａｌｌｙ）置換）の誘導に主に基づく種々のメカニズムを通して血管の平滑筋細胞の弛緩を誘導することができる。

血管痙攣阻害剤として作用することが知られる全ての化合物の中で、本出願人は、驚くべきことに、ジヒドロピリジンカルシウムチャネル遮断薬、α－アドレナリン受容体拮抗薬およびニトロ血管拡張剤のクラスに分類される血管痙攣阻害剤が特に、ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた処置の全体的な有効性を高めることが可能であることを見いだした。

カルシウム遮断薬（またはカルシウム拮抗薬またはカルシウムチャネル遮断薬）として分類される血管痙攣阻害剤は、カルシウムによって誘導される血管の平滑筋の収縮を、血管の平滑筋細胞内に流入するカルシウムイオンを遮断することによって阻害する。

好ましいカルシウム遮断薬ＶＩは、ジヒドロピリジンカルシウム遮断薬であり得る。

ジヒドロピリジンカルシウム遮断薬の例には、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、エホニジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピンおよびプラニジピンが含まれ、特に好ましいものはニフェジピジン（ｎｉｆｅｄｉｐｉｄｉｎｅ）およびニモジピンである。

好ましくは、ＶＩは、ニフェジピンまたはニモジピンであり、より好ましくはニモジピンである。

マグネシウムもまた、カルシウム拮抗薬と同様の特性を有しており、生理学的カルシウム遮断薬であると考えられ、ＶＩとして用いることができる。

α－アドレナリン受容体拮抗薬（またはα遮断薬）として分類される血管痙攣阻害剤は、血管の平滑筋におけるα－１－アドレナリン受容体の効果をロックし、血管拡張を生じさせる。α－アドレナリン受容体拮抗薬の例には、アルフゾシン、ドキサゾシン、プラゾシンシロドシン、タムスロシンおよびテラゾシンが含まれ、特に好ましいものはプラゾシンである。

血管痙攣阻害剤はまた、ニトロ血管拡張剤として分類することもできる。用語「ニトロ血管拡張剤」は、通常、生物学的活性のある一酸化窒素へ代謝的に変換され得る有機硝酸血管拡張薬としての、一酸化窒素の薬理学的由来を示す。通常は外因的に投与されるニトロ血管拡張剤の適切な例は、ジエチレングリコールジニトラート、グリセリルトリニトラート（ニトログリセリン）、イソソルビドモノニトラートおよびジニトラート、イトラミントシレート、ペンタエリスリルテトラニトラート、プロパチルニトラート、サイニトロジル（ｓｉｎｉｔｒｏｄｉｌ）、テニトラミンおよびトロールニトラートであり、特に好ましいものはニトログリセリンである。

一酸化窒素は、可溶性グアニル酸シクラーゼの刺激によって血管の平滑筋を弛緩させ、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の細胞内レベルを増加させる。

一実施形態では、前記血管痙攣阻害剤は、ジヒドロピリジンカルシウム遮断薬、α遮断薬およびニトロ血管拡張剤からなる群から選択される。

本発明のさらなる実施形態では、前記血管痙攣阻害剤は、好ましくは、ニモジピン、ニフェジピン、マグネシウム、プラゾシンおよびニトログリセリンからなる群から選択され；さらにより好ましくは、前記血管痙攣阻害剤はニモジピンである。

一般に、血管痙攣阻害剤は、ガス充填微小胞に実質的に結合されない。

用語「結合されない」とは、血管痙攣阻害剤が、ガス充填微小胞との物理的または化学的相互作用を実質的に有していないことを示し；より具体的には、ＶＩが、共有結合または非共有結合（例えば物理的および／または静電気相互作用）のいずれかを介してガス充填微小胞に結合されないことを示す。

一実施形態では、ＶＩは、別個の医薬組成物内に、ガス充填微小胞懸濁液と物理的に関連せずに含まれている。

血管痙攣阻害剤を含む別個の医薬組成物の例は、入手可能な市販の製剤、例えば、伝統的および／または制御放出の両方についての経口剤形および非経口剤形を含む。

血管痙攣阻害剤は、ガス充填微小胞の懸濁液と同時または連続して投与することができる。

本明細書において用いられる「同時の投与」という表現は、同じ時点または実質的に同じ時点でのＶＩおよびガス充填微小胞の投与を示し、投与経路は同一または異なる。

本発明によれば、「連続的な投与」という表現は、異なる時点でのＶＩおよびガス充填微小胞の投与を示し、投与経路は同一または異なる。

本発明の一実施形態では、ＶＩは、ガス充填微小胞の懸濁液と同時に投与される。

例えば、前記ＶＩは、投与直前に凍結乾燥ガス充填微小胞の懸濁液へ直接添加することができる。あるいは、ＶＩは、凍結乾燥ガス充填微小胞の再構成に用いられる生理的に許容できる水性担体（例えば食塩水）に添加することができる。

本発明の一実施形態では、前記血管痙攣阻害剤はマグネシウムである。

さらなる実施形態では、マグネシウムは、ガス充填微小胞の懸濁液の投与と同時に（かかる微小胞をマグネシウム溶液中に希釈することによって）投与される。

本発明の代替の実施形態では、ＶＩは、ガス充填微小胞の懸濁液に連続して投与される。

好ましい一実施形態では、ＶＩは、ガス充填微小胞の懸濁液の１秒～１５分前、好ましくは５秒～１２分前、さらにより好ましくは少なくとも１０分前に投与される。

ガス充填微小胞の懸濁液およびＶＩは、静脈内注入によって同時または連続して投与することができる。あるいは、ガス充填微小胞の懸濁液を静脈内注入によって投与することができ、ＶＩは経口で同時または連続して投与される。

ＶＩは、好ましくは、典型的に承認された治療的用量で静脈内注入によって投与される。

「承認された治療的用量」という表現は、規制当局（例えばＦＤＡおよびＥＭＡ）によって使用について承認されている血管痙攣阻害剤の用量を指す。例えば、承認された治療的使用は、処置される対象の体重あたりのＶＩ用量（ｍｇ／ｋｇ）によって、または１日あたりのＶＩ用量（ｍｇ／日）によって、または時間単位当たりのＶＩ重量（ｍｇ／時間）によって表すことができる。

本発明によれば、ガス充填微小胞の懸濁液は、懸濁液の連続的なインフュージョンを用いて、または特定容量の懸濁液の少なくとも１回のボーラスを対象に注入することによって、投与することができる。

例えば、懸濁液の各注入容量のための微小胞の合計量は、６×１０^５～１５×１０^９微小胞／患者のｋｇ、好ましくは１×１０^７～１２×１０^９微小胞／ｋｇ、さらにより好ましくは２×１０^７～１０×１０^９微小胞／ｋｇに変化し得る。それぞれの注入ボーラスの容量は、注入される微小胞の必要とされる合計量に適合され（通常、行なわれる特定の処置に依存する）、注入懸濁液中の微小胞の濃度および患者の体重を考慮する。全般的なルールとして、約１×１０^８～約３×１０^９個の微小胞／ｍＬの懸濁液中の微小胞の濃度について、ボーラス容量は、０．０１～１２０ｍＬ、好ましくは０．２～６０ｍＬ、さらにより好ましくは０．４～２０ｍＬに変化し得る。

本説明および特許請求の範囲において、「インフュージョン投与」という表現は、例えば、重力（例えば食塩水インフュージョンバッグ）または専用のデバイス、例えば制御された容量を放出する（回転）シリンジを含む、任意の適切な連続的投与手段によって行なわれ得る投与手順を示す。

「ボーラス投与」という表現は、例えば末梢静脈に配置されたカテーテルおよびシリンジを用いた、ガス充填微小胞の特定の容量の懸濁液の単回の血管内注入を指す。ボーラスの投与は一般に、数秒以内（例えば５～１２０秒、好ましくは６０秒以内）に行なわれる。

本発明の一実施形態では、ガス充填微小胞の前記懸濁液の投与は、少なくとも１回のボーラスとして、好ましくは少なくとも１回のボーラスおよび４回までのボーラスとして、例えば５分ごとに、患者へ投与される。

本発明のさらなる実施形態では、ガス充填微小胞の前記懸濁液の投与は、有効量のガス充填微小胞の投与を含む。

この限りにおいて、および他に規定がない限り、本明細書において用いられる用語「効果的な用量」または「有効量」は、その意図する治療的目的（単数または複数）：例えば、関心領域における治療的薬剤の薬物輸送を改善することを満たすのに十分な本発明によるガス充填微小胞の懸濁液の任意の量を指す。

関心領域に対する治療的超音波の適用は、ガス充填微小胞の投与前、投与中、または投与後の任意の時点で行なうことができる。一般に、ＶＩの投与後に超音波照射を開始することが好ましい。ある特定の実施形態では、ＶＩおよび微小胞が連続して投与される場合（例えば最初にＶＩが投与され、次いでＭＶが投与される）、関心領域の超音波照射は、微小胞の投与時または投与直後に開始することができる。あるいは、ＶＩおよびＭＶが同時に投与される場合は、関心領域の超音波照射は、同時の投与時または投与直後に開始することができる。ある特定の実施形態では、関心領域における微小胞の到達を、（例えば生理学的パラメーターを介して、または関心領域のコントラスト超音波検査イメージングを介して）判定することができ、所望の量の微小胞が関心領域に到達したときに超音波照射を開始することができる。

本明細書において用いられる「関心領域」という表現は、本発明による治療的処置を受ける対象の体の部位、臓器または組織を示す。

本説明および特許請求の範囲によれば、用語「対象」または「患者」は、生きているヒトまたは動物患者を指し、好ましくは本発明の超音波が介在する治療を受けているヒトを指す。

本発明の一態様は、ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた治療的処置の有効性を高めるための方法に関し、前記方法は、
ａ）対象の血管系に血管痙攣阻害剤を投与する工程；
ｂ）対象の血管系にガス充填微小胞の懸濁液を投与する工程；
ｃ）対象の関心領域に治療用超音波を適用する工程
を含む。

前記血管痙攣阻害剤は、好ましくは、ジヒドロピリジンカルシウム遮断薬、α遮断薬およびニトロ血管拡張剤からなる群から選択され；より好ましくは、ニモジピン、ニフェジピン、マグネシウム、プラゾシンおよびニトログリセリンからなる群から選択され；さらにより好ましくは、前記血管痙攣阻害剤はニモジピンである。

血管痙攣阻害剤は、好ましくは、例えば、静脈内注入によって対象の血管系内に、承認された治療的投薬量で投与される。

ガス充填微小胞の懸濁液は、連続的なインフュージョンを用いて、または、特定の容量の懸濁液の少なくとも１回のボーラスを注入することによって対象に投与することができ；より好ましくは、ガス充填微小胞の前記懸濁液は、少なくとも１回のボーラスとして対象に投与される。

ガス充填微小胞の懸濁液は、効果的な用量で対象に投与される。

本発明の一実施形態では、本開示の工程ａ）および工程ｂ）は、同時または連続して行われる。

好ましい実施形態では、工程ａ）は、工程ｂ）と同時に行なわれる。

代替の実施形態では、工程ａ）は、工程ｂ）に連続して行われる。好ましくは、工程ａ）は、工程ｂ）の１秒～１５分前、より好ましくは５秒～１２分前、さらにより好ましくは少なくとも１０分前に行なわれる。

さらなる一実施形態では、工程ｂ）は、工程ａ）に連続して行われる。

音響パラメーター、例えば、音圧、音響強度およびパルス長は、上述したものである。

特に、本発明の方法の工程ｃ）において、治療用超音波は、１００ｋＰａ～９００ｋＰａに含まれる音圧、好ましくは２００ｋＰａ～８００ｋＰａに含まれる音圧を有する。

さらなる一実施形態では、本発明の方法の工程ｃ）において、治療用超音波は、０．１～９９０Ｗ／ｃｍ^２に含まれる、好ましくは１．３Ｗ／ｃｍ^２～２１．５Ｗ／ｃｍ^２に含まれる音響強度を有する。

本発明のさらなる一実施形態では、工程ｃ）において、前記治療用超音波は、５μｓ～６０ｓ、好ましくは５μｓ １０ｓの間に含まれるパルス長を有し、さらにより好ましくは、パルス長は１ｍｓである。

さらに、さらなる一実施形態では、工程ｃ）において、前記治療用超音波は、１ｓ～１７０分、好ましくは２～１０分に含まれる時間のあいだ、適用される。

さらに、さらなる一実施形態では、工程ｃ）において、前記治療用超音波は、２０ｋＨｚ～７０ＭＨｚに含まれる周波数を有する。

一実施形態によれば、工程ｃ）は、工程ｂ）の後（例えば微小胞の投与から数秒以内）に行なわれる。

あるいは、工程ｃ）は、工程ａ）と工程ｂ）の間に行なうことができる。例えば、超音波処理は、ＶＩの投与後（例えば１～１５分）、ガス充填微小胞の注入前または注入と同時に開始することができる。

一般的な一実施形態では、血管痙攣阻害剤は、ガス充填微小胞および超音波の組み合わせた治療的処置において（その有効性を高めるために）用いられ、ここで前記組み合わせた治療的処置は、例えば、生物活性剤の溢出を可能にするため、または高めるために、血管透過化を誘導する。特定の一実施形態では、前記組み合わせた治療的処置は、例えば生物活性剤の送達と組み合わせて、血液脳関門の開放または破壊（ＢＢＢ開放／破壊）を誘導する。別の特定の実施形態では、前記組み合わせた治療的処置は、例えば生物活性剤の送達のために、腫瘍灌流を誘導する。

別の実施形態では、血管痙攣阻害剤は、ガス充填微小胞および超音波の組み合わせた治療的処置において（その有効性を高めるために）、血栓を溶解するために用いられる（超音波血栓溶解療法（ｓｏｎｏｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ））。

さらなる一実施形態では、血管痙攣阻害剤は、ガス充填微小胞および超音波の組み合わせた治療的処置において、熱的アブレーションを改善するために用いられる（ＭＶ増強型の熱的アブレーション）。

さらに、さらなる実施形態では、血管痙攣阻害剤は、免疫調節、神経調節、放射線増感、温熱療法の補助または組織の非熱的アブレーションのために、ガス充填微小胞および超音波の組み合わせた治療的処置の有効性を高めるために用いることができる。

本出願人が示したように、ＶＩの投与は、組み合わせた治療的処置ＵＳ－ＭＶの薬物輸送有効性を高めることができる。ある特定の実施形態では、ＶＩの使用により、ＶＩを用いずに組み合わせのＵＳ－ＭＶ処置のみ用いて得られる溢出と比較して、周辺腫瘍組織における生物活性剤の溢出がほぼ２倍に増加した。

本発明において、「薬物輸送」という表現は、少なくとも生物活性剤を投与することを含む治療的プロトコルを示し、前記生物活性剤は血管痙攣阻害剤とは異なる。

生物活性剤は、ガス充填微小胞と組み合わせた超音波が介在する治療的処置において用いることのできる任意の分子、化合物、製剤または材料を含み、これらは、処置される領域または臓器に対して生物学的または治療的に活性の効果をもたらすことができる。

生物活性剤の例には、抗悪性腫瘍剤、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ブスルファン、クロラムブシル、スピロプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキサート、アドリアマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトプリン、ミトタン、プロカルバジン、ダクチノマイシン（アンチノマイシン（ａｎｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）Ｄ）、ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、タキソール、プリカマイシン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、フルタミド、リュープロリド、酢酸メゲストロール、タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン（ｍ－ＡＭＳＡ）、アスパラギナーゼ（Ｌ－アスパラギナーゼ）、エトポシド、インターフェロンａ－２ａおよび２ｂ、血液製剤、例えばヘマトポルフィリンまたは前述の誘導体；生物学的応答調節剤、例えば、ムラミルペプチド；抗真菌剤、例えば、ケトコナゾール、ナイスタチン、グリセオフルビン、フルシトシン、ミコナゾールまたはアンホテリシンＢ；ホルモンまたはホルモン類似体、例えば、成長ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ベクロメタゾンジプロピオネート、ベタメタゾン、コーチゾンアセテート、デキサメタゾン、フルニソリド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニソロン、パラメタゾンアセテート、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンまたはフルドロコルチゾンアセテート；ビタミン類、例えば、シアノコバラミンまたはレチノイド類；酵素、例えば、アルカリフォスファターゼまたはマンガンスーパーオキシドジスムターゼ；抗アレルギー剤、例えばアンレキサノクス（ａｍｅｌｅｘａｎｏｘ）；抗凝固剤、例えば、ワルファリン、フェンプロクモンまたはヘパリン；抗血栓剤；循環器系作用薬、例えばプロプラノロール；代謝増強剤、例えばグルタチオン；抗結核剤、例えばｐ－アミノサリチル酸、イソニアジド、カプレオマイシンサルフェート、サイクロセリン（ｃｙｃｌｏｓｅｘｉｎｅ）、エタンブトール、エチオナミド、ピラジナミド、リファンピンまたはストレプトマイシンサルフェート；抗ウイルス剤、例えば、アシクロビル、アマンタジン、アジドチミジン、リバビリンまたはビダラビン；血管拡張剤、例えば、ジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、エリトリトールテトラニトラート、イソソルビドジニトラート、ニトログリセリンまたはペンタエリスリトールテトラニトラート；抗生物質、例えば、ダプソン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セフラジン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、ジクロキサシリン、シクラシリン、ピクロキサシリン（ｐｉｃｌｏｘａｃｉｌｌｉｎ）、ヘタシリン、メチシリン、ナフシリン、ペニシリンまたはテトラサイクリン；抗炎症剤、例えば、ジフルニサル、イブプロフェン、インドメタシン、メクロフェナム酸（ｍｅｃｌｅｆｅｎａｍａｔｅ）、メフェナム酸、ナプロキセン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、トルメチン、アスピリンまたはサリチル酸；抗原虫剤、例えば、クロロキン、メトロニダゾール、キニンまたはメグルミンアンチモネート；抗リウマチ剤、例えばペニシラミン；麻薬、例えばパレゴリック；アヘン剤、例えば、コデイン、モルヒネまたはアヘン；強心配糖体、例えば、デスラノシド（ｄｅｓｌａｎｅｓｉｄｅ）、ジギトキシン、ジゴキシン、ジギタリンまたはジギタリス；神経筋遮断薬、例えば、メシル酸アトラクリウム、ガラミントリエチオジド、臭化ヘキサフルオレニウム、ヨウ化メトクリン、臭化パンクロニウム、塩化サクシニルコリン、塩化ツボクラリンまたは臭化ベクロニウム；鎮静剤、例えば、アモバルビタール、アモバルビタールナトリウム、アプロバルビタール（ａｐｒｏｐｂａｒｂｉｔａｌ）、ブタバルビタールナトリウム、抱水クロラール、エトクロルビノール、エチナメート、塩酸フルラゼパム、グルテチミド、塩酸メトトリメプラジン、メチプリロン、塩酸ミダゾラム、パラアルデヒド、ペントバルビタール、セコバルビタールナトリウム、タルブタール、テマゼパムまたはトリアゾラム；局部麻酔薬、例えば、ブピバカイン、クロロプロカイン、エチドカイン、リドカイン、メピバカイン、プロカインまたはテトラカイン；一般的な麻酔薬、例えば、ドロペリドール、エトミデート、ドロペリドールを含むクエン酸フェンタニル、塩酸ケタミン、メトヘキシタールナトリウムまたはチオペンタールおよびそれらの薬学的に許容できる塩（例えば酸付加塩、例えば、塩酸塩または臭化水素酸塩または塩基性塩、例えばナトリウム塩、カルシウム塩またはマグネシウム塩）または誘導体（例えば酢酸塩）；および放射化学物（例えば、α－、β－、またはγ－放射体、例えば、１７７Ｌｕ、９０Ｙまたは１３１Ｉを含む）が含まれる。特定の重要なものは、抗血栓剤、例えばヘパリン、およびヘパリン様活性を有する薬剤、例えば、アンチトロンビンＩＩＩ、ダルテパリンおよびエノキサパリン；血小板凝集抑制剤、例えば、チクロピジン、アスピリン、ジピリダモール、イロプロストおよびアブシキシマブ；および血栓溶解酵素、例えば、ストレプトキナーゼおよびプラスミノゲン活性化剤；鎮痛剤、例えば、コデイン、フェンタニル、Ｈｙｄｒｏｃｏｎｅ、アセトアミノフェン、オキシコドン；中枢または末梢神経系に作用する薬物、例えば、抗てんかん薬、抗パーキンソン病薬、精神安定薬または精神賦活薬；ホルモンである。生物活性剤の他の例には、抗体、例えば、アダリムマブ、アベルマブ、デュルバルマブ インフリキシマブ、アテゾリズマブ、ニボルマブ、ベバシズマブ、ペンブロリズマブ、ラムシルマブ、トラスツズマブ ペルツズマブ、イピリムマブ、パニツムマブ、ナタリズマブ、セツキシマブ、または抗体のフラグメントが含まれる。生物活性剤の他の例には、ナノ製剤化（ｎａｎｏｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）薬物、例えば、ポラクタント・アルファ、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注入剤、リポソーム・アンホテリシンＢ脂質複合体、リポソーム・アンホテリシンＢ、リポソーム・モルヒネ硫酸塩、リポソーム・シタラビン、リポソーム・ビンクリスチン、リポソーム・イリノテカン、リポソーム・ベルテポルフィン、リポソーム・ダウノルビシンおよびシタラビン、アルブミン結合パクリタキセルが含まれる。生物活性剤の他の例はまた、組み換えＲＮＡおよびＤＮＡを含む天然または合成の起源の核酸、ＲＮＡ、およびＤＮＡなどの遺伝物質を含む。ＤＮＡがコードする特定のタンパク質が多くの種々のタイプの疾患の処置に用いられ得る。例えば、腫瘍壊死因子またはインターロイキン－２は、進行性がんを処置するために提供され；チミジンキナーゼは、卵巣がんまたは脳腫瘍を処置するために提供され；インターロイキン－２は、神経芽細胞腫、悪性メラノーマまたは腎がんを処置するために提供され；インターロイキン－４は、がんを処置するために提供され得る。診断薬は、磁気共鳴イメージング、Ｘ線、特にコンピューター断層撮影、光学イメージング、核イメージングまたは分子イメージングを含む診断技術に関してイメージング増強を可能にし得る任意の化合物、組成物または粒子である。

適切な診断薬の例は、例えば、マグネタイトナノ粒子、ヨウ素化化合物、例えば、イオメプロール（登録商標）、または常磁性イオン錯体、例えば、疎水性ガドリニウム錯体である。

本発明によれば、血管痙攣阻害剤（ＶＩ）の投与は、治療的処置ＵＳ－ＭＶと組み合わせて投与される前記生物活性剤の治療的／診断効果を高めることができる。

生物活性剤の治療的／診断効果の増強は、上述のように、種々のメカニズムを介して血管痙攣阻害剤によってもたらされる。例えば、血管痙攣阻害剤は、（１）標的領域の血管区画内の生物活性剤（例えば、治療剤または造影剤）の濃度、（２）血管を通したその溢出、（３）その細胞内送達、および／または（４）血液灌流を高め得る。

前記生物活性剤は、ガス充填微小胞とは別個の製剤として投与することができ、および／または、ガス充填微小胞の構造内に含まれる。

前者の場合、生物活性剤は、例えば注入によって、組み合わせのＵＳ－ＭＶ治療的処置と同時または連続して投与される。

生物活性剤は、生体活性分子（または生体活性分子の混合物）であってよく、または、生体活性分子（単数または複数）を含む適切な医薬組成物、例えば、市販される製剤の形態、または、生体活性分子を適切な水性担体（好ましくは生理的に許容でき、水（好ましくは滅菌水）、食塩水などの水溶液（注入のための最終製品が低張でないように有利に平衡化されてよい）、または１つまたは複数の浸透圧調節物質の溶液を含む）と混合することによって得られる即座の製剤であってよい。浸透圧調節物質は、塩類または糖類、糖アルコール類、グリコール類または他の非イオン性ポリオール材料（例えばグルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）、キトサン誘導体、例えば、カルボキシメチルキトサン、トリメチルキトサンまたはゲル化化合物、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルデンプンまたはデキストランを含む。

生物活性剤は、効果的な用量で対象に投与され、前記効果的な用量は、生物活性剤の治療的効果を発揮するのに適切な用量である。

生物活性剤は、連続的なインフュージョンを用いて、または、特定の容量の懸濁液の少なくとも１回のボーラスを注入することにより、対象に投与することができ；より好ましくは、ガス充填微小胞の前記懸濁液は、少なくとも１回のボーラスとして対象に投与される。

一実施形態では、本発明の薬物輸送プロトコルは、ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた治療的処置の有効性を高める方法に関し、前記方法は、
ａ’）対象の血管系に生物活性剤を投与する工程；
ａ）対象の血管系に血管痙攣阻害剤を投与する工程；
ｂ）対象の血管系にガス充填微小胞の懸濁液を投与する工程；
ｃ）対象の関心領域に治療用超音波を適用する工程
を含む。

本発明の一実施形態では、開示される方法の工程ａ’）および工程ａ）は、同時または連続して行われる。

一実施形態では、工程ａ’）および工程ａ）は同時に行なわれる。

別の実施形態では、工程ａ’）および工程ａ）は連続して行なわれる。

原理的に、工程ａ）、ａ’）および／またはｂ）は、特定の処置およびプロトコルに応じて、同時または連続して、任意の順序で行なうことができ、投与の同時（上記工程の２つのみ）および連続的プロトコルの組み合わせを含む。

例えば、工程ａ）および／またはａ’）は、工程ｂ）と同時または連続して行なうことができる。

一実施形態では、工程ａ）および／または工程ａ’）は、工程ｂ）と同時に行なわれる。

代替の一実施形態では、工程ａ）および／または工程ａ’）は、工程ｂ）に連続して行われる。例えば、工程ａ）／ａ’）は、（同時または互いに連続して）、工程ｂ）の１秒～１５分前、より好ましくは５秒～１２分前、さらにより好ましくは少なくとも１０分前に行なわれる。

さらなる一実施形態では、工程ａ’）およびｂ）は、同時に行なうことができる。例えば、微小胞の懸濁液は生物活性剤を含んでよく；前記懸濁液は、ＶＩと同時に、または連続して、例えばＶＩの投与後に投与することができる。

さらなる一実施形態では、生物活性剤は、種々のメカニズムを介してガス充填微小胞の構造内に含まれ得る：ｉ）ガス充填微小胞の両親媒性分子に共有結合を介して結合することができる；ｉｉ）物理的および／または静電気相互作用を介してガス充填微小胞に適切に関連付けられてもよい、および、ｉｉｉ）ガス充填微小胞を形成する構成要素と混合される化合物であることができ、最終的にガス充填微小胞構造に組み込まれる。

さらなる一実施形態では、本発明の薬物輸送プロトコルは、ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた治療的処置の有効性を高める方法に関し、前記方法は、
ａ）対象の血管系に血管痙攣阻害剤を投与する工程；
ｂ）生物活性剤を含むガス充填微小胞の懸濁液であって前記生物活性剤が前記ガス充填微小胞の構造内に含まれている懸濁液を、対象の血管系に投与する工程；
ｃ）対象の関心領域に治療用超音波を適用する工程
を含む。

本発明の一実施形態では、開示される方法の工程ａ）および工程ｂ）は、同時または連続して行われる。

一実施形態では、工程ａ）は、工程ｂ）と同時に行なわれる。

代替の一実施形態では、工程ａ）は工程ｂ）に連続して行われる。好ましくは、工程ａ）は、工程ｂ）の１秒～１５分前、より好ましくは５秒～１２分前、さらにより好ましくは少なくとも１０分前に行なわれる。

生物活性剤を含むガス充填微小胞の懸濁液は、連続的なインフュージョンを用いて、または、特定の容量の懸濁液の少なくとも１回のボーラスを注入することにより対象に投与することができ；より好ましくは、ガス充填微小胞の前記懸濁液は、少なくとも１回のボーラスとして対象に投与される。

生物活性剤を含むガス充填微小胞の懸濁液は、効果的な用量で対象に投与され、ここで前記効果的な用量とは、構造内に含まれるガス充填微小胞および生物活性剤の両方が、それらの治療的効果を発揮するのに適切な用量で投与される用量である。

以下の実施例は、本発明をさらに説明するのを助けるであろう。

［材料および方法］
製剤Ｐ０１の調製
製剤Ｐ０１を、参考文献１７（実施例２を参照）に記載される手順に従って調製した。製剤中の両親媒性材料はＤＳＰＣ：ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００（モル比９：１）であった。溶液中のＭＶの濃度をＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ方法によって評価した（例えばＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３ソフトウェアを備えるＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３）。

製剤Ｐ０２の調製
参考文献１６の実施例に示されている手順を製剤（Ｐ０２）の調製に用いた。
簡潔には、約９０ｍｇ／ＬのＤＳＰＣ、７ｍｇ／Ｌのパルミチン酸、６０ｍｇ／ＬのＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００および１００ｇ／ＬのＰＥＧ４０００を含むシクロオクタンおよび水（約１．５／１００ｖ／ｖ）のエマルションを調製し（Ｍｅｇａｔｒｏｎ ＭＴ３０００、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ；１０’０００ｒｐｍ）、ＤＩＮ８Ｒバイアルにサンプリングした（約１ｍＬ／バイアル）。

バイアルを－５０°Ｃで真空下にて冷却し、次いで凍結乾燥に供し、その後、水および溶媒の完全な除去（０．５重量％未満）まで、室温よりも高い温度で二次乾燥した。凍結乾燥プロセスの最後に、バイアルのヘッドスペースをＣ４Ｆ１０／Ｎ２の３５／６５混合物で飽和させ、バイアルに栓をして密封した。凍結乾燥された製剤（１５ｍｇ／ｍＬの濃度）を、ガス存在下で穏やかに撹拌しながらＮａＣｌ溶液（０．９％）中で再構成することによって、微小胞溶液を得た。再構成の容量は、動物の体重に関する注入の適切な容量が得られるように適合される。

Ｄｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）／Ｌｕｍｉｎｉｔｙ（登録商標）の調製
微小胞を製造元の推奨に従って活性化した。微小胞の濃度は、Ｃｏｕｌｔｅｒ ｃｏｕｎｔｅｒ方法によって定義した（例えば、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３ソフトウェアを備えるＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３）。

投与
微小胞懸濁液の容量は、必要に応じて、ラットについては２００～５００μＬ、マウスについては５０～２００μＬを含むボーラスを得るように希釈される。各注入の後に食塩水フラッシュを行なう。

ボーラスは、処置の持続時間が２０分である場合は５分の間隔をあけた。

微小胞の用量は、プロトコル、モデルおよび種によって、ｋｇあたりの微小胞の合計数で表される。プロトコルによって、全用量をいくつかのボーラスに分割することができる。

［実施例１］
ガス充填微小胞および超音波の組み合わせた治療的処置の有効性の増強
モデルおよび動物の準備
使用したモデルはＮＭＵラット腫瘍モデルであった。思春期前のラット（雌、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）に、５０ｍｇ／ｋｇのＮＭＵ（Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｓｉｇｍａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の単回の腹膜内注入を与えた。腫瘍が発達したラットをプロトコルに登録した。ＮＭＵモデルでは、動物はいくつかの腫瘍が発達するので、同じ動物において、微小胞および治療用超音波を受ける腫瘍；および超音波照射なしの腫瘍（未処置と呼ばれる）とすることができる。ラットを麻酔し、背部臥位で置いた。カテーテルを尾静脈内に配置して薬物および微小胞を注入した。ＵＳ処置トランスデューサーを腫瘍の５ｃｍの位置に置いた（水タンクで間隔をあけた）。灌流後、４０～４５度の角度で腫瘍付近に置いたコントラスト超音波検査（Ｃ１０－３ｖプローブ、ＥｐｉＱ ７Ｇ，Ｐｈｉｌｉｐｓ）を行なった。

分子溢出の効率を評価するために、Ｃｙ（ｃ）５．５フルオロフォアで標識した１５０ｋＤａ－デキストランを、超音波および微小胞を用いた治療的処置の直前に注入した。

５つの実験的条件を試験した：
ｉ）第１の群のラット（未処置）は、ＵＳ－ＭＶに曝露しなかった（ＣＹ５．５ｈの基礎溢出）；
ｉｉ）腫瘍の第２の群は、ＭＶのみ投与した；
ｉｉｉ）第３の群は、血管痙攣阻害剤で事前に処置して、次いで、ＭＶを投与した；
ｉｖ）第４の群のラットは、ＵＳ－ＭＶ処置を行なった；および
ｖ）第５の群は、血管痙攣阻害剤で事前に処置して、次いで、ＵＳ－ＭＶ処置を行なった。

ＵＳ＋ＭＶ処置のために、治療用ＵＳを、音圧６００ｋＰａ、パルススキーム１ｍｓオン／１０ｓオフ、持続時間２０分で適用した。

試験のために、２つのＭＶ製剤、すなわちＰ０２（材料および方法に従って調製）またはＤｅｆｉｎｉｔｙを、８μｌのガス／ｋｇの用量で、４回のボーラスに分割して各々５分の間隔をあけて投与した。ＭＶの数に関して、このガス容量の同等物は、Ｐ０２製剤について１．２×１０^８／ｋｇおよびＤｅｆｉｎｉｔｙについて５．２×１０^９／ｋｇに相当する。

血管痙攣阻害剤による事前処置のために、ニモジピン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）粉末を最初にＤＭＳＯ（４０ｍｇ／ｍｌ）中に希釈し；注入用量（１．４ｍｇ／ｋｇ）をＮａＣｌ ０．９％中に即座に調製し、処置の１０分前に注入した。

次いで、屠殺した動物から腫瘍を採取し；蛍光を、エクスビボで得た画像上で定量化した（Ｆｌｕｏｂｅａｍ（登録商標）７００）。蛍光をＩｍａｇｅＪソフトウェアによって定量化した。

結果
結果は、ニモジピンの投与が、組み合わせた治療的処置ＵＳ－ＭＶの薬物輸送の有効性を高めることができることを示した。ＭＶ－ＵＳの併用前のＶＩによる事前処置は、腫瘍組織におけるＣｙ（登録商標）５．５色素の溢出を、他の条件において得られた溢出と比較してほぼ２倍に増加させた。特に、第１の群（ＣＹ５．５ｈのみ）における平均蛍光シグナルは、１０２０ＲＦＵ／ｐｘ／ｍｓであり、第２の群（ＭＶのみ）では９３０ＲＦＵ／ｐｘ／ｍｓであり、第３の群（ＶＩ＋ＭＶ）では１０３０ＲＦＵ／ｐｘ／ｍｓであり、第４の群（ＵＳ－ＭＶ）では９９０ＲＦＵ／ｐｘ／ｍｓであることが分かった。驚くべきことに、第５の群では、ＶＩの事前投与に続いてＵＳ－ＭＶを投与した後に評価した平均蛍光値は２０６０ＲＦＵ／ｐｘ／ｍｓであることが分かり、すなわち、他の群に対して２倍の蛍光値であった。

［実施例２］
血管痙攣の誘導における種々のＵＳパラメーターの評価
モデルおよび動物の準備
これらの実験に用いたモデルは、腸間膜ラットの微小循環であった。簡潔には、麻酔をした動物を準備し、腸内ループを可視化した。注入は尾静脈において行なった。

ラットを、Ｘ２０対物（ｍａｇ最終：２００）を備えた倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（登録商標）Ｘ２）の下に置いた。オープンソースのソフトウェアによって駆動される数値カメラは、プロトコルに従って、必要な各時点で３０秒の動画を取得し記録した。

この試験には製剤０１を投与した。

ＵＳ処置を、実験用単一素子トランスデューサー（非焦点、平面、１．５ＭＨｚ）によって送達した。表１は、各プロトコルについて、パルススキーム、音圧およびＵＳ適用の持続時間を含む、試験したＵＳパラメーターを報告する。トランスデューサーは、光学対物レンズに焦点を合わせ、５ｃｍの作業距離を保つように配置した。

処置前、処置中、および処置後の画像シーケンスを取得した。ＵＳ曝露の開始後４０分まで、５分ごとに追加の取得を行なって、血管痙攣の解決を監視することができた。血管痙攣は、微小血管（すなわち細静脈、小動脈または毛管）の内腔の減少、および／または、血流の減少および／または血流の停止（コントロール条件と比較）が観察された場合に確証される。

結果：
表１に報告されるように、結果から、血管痙攣は、任意の試験した音圧で、すべての研究した処置の持続時間（２、５および２０分）、微小胞用量および投与モード（１回または複数回のボーラス）について、最初の超音波パルスの直後に生じることが確認された。「超音波パルス」という表現は、超音波トランスデューサーによって伝達され、媒体内を伝播する多周期の超音波を示す。それは、「タイム・オン」と呼ばれる持続時間（例えば１ｍｓオン）、周波数、振幅によって特徴付けられる。

［実施例３］
血管痙攣の誘導における種々のタイプのガス充填微小胞の評価
モデルおよび動物の準備
これらの実験に用いたモデルは、腸間膜ラットの微小循環であった。モデルおよび動物の準備は実施例２に記載した。
この試験は、血管痙攣の誘導における、種々のタイプのガス充填微小胞の評価を目的とした。この目的のために、種々の微小胞製剤、すなわち製剤Ｐ０２およびＬｕｍｉｎｉｔｙ（登録商標）（Ｌａｎｔｈｅｕｓ）を、種々の音圧で調べた（４００ｋＰａから８００ｋＰａまで）。表２は、調べた実験的条件を報告する。

結果
表２から明らかなように、結果から、任意の試験した音圧および任意の調べたガス充填製剤で、最初の超音波パルスの直後に血管痙攣が生じることが確認された。

［実施例４］
非腫瘍モデルにおける、カルシウムチャネル遮断薬が介在する血管痙攣阻害の試験
モデルおよび動物の準備
これらの実験に用いたモデルは、腸間膜ラットの微小循環であった。モデルおよび動物の準備は実施例２に記載した。

この試験は、血管痙攣阻害剤化合物、具体的にはジヒドロピリジンカルシウムチャネル遮断薬ニモジピンによって誘導される血管痙攣の阻害の評価を目的とした。

この目的のために、ラットは、ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた処置の１０分前に、ニモジピンによる事前処置を受けた。

ニモジピン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）粉末を最初にＤＭＳＯ（４０ｍｇ／ｍｌ）中に希釈し；注入用量（１．４ｍｇ／ｋｇ）をＮａＣｌ ０．９％中に即座に調製し、処置の１０分前に注入した。

処置パラメーターは、血管痙攣の発生を得るための以前の試験に従って選択した。この試験にはＰ０１製剤を投与した。

結果：
表３は、ＶＩを用いた事前処置により、治療用超音波およびガス充填微小胞の懸濁液の併用に供された動物の１００％において血管痙攣の発生を阻害することができたことを示す。

［実施例５］
ガス充填微小胞と組み合わせたＵＳが介在する治療の腫瘍灌流に対する効果（ＤＡ３腫瘍モデル）。
動物モデルおよび製剤
マウスＤＡ３腫瘍モデルをこれらの試験に用いた。ＵＳ処置をＶｅｒａｓｏｎｉｃ（登録商標）システム（プローブＰ４－２）によって送達した。プローブを腫瘍から５ｃｍの位置に置いた（脱気水で満たした水タンクによって間隔をあけた）。

次いで、ガス充填微小胞（Ｐ０１）の一続きのボーラス注入を行ない、腫瘍を治療的超音波照射に供した（周波数、音圧およびパルスの特徴は表４に規定のとおり）。各腫瘍の灌流を微小胞の超音波検査シグナルにより追跡した（Ｖｅｒａｓｏｎｉｃ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍ）。シグナルを記録し、Ｖｕｅｂｏｘ（登録商標）ソフトウェアを用いて事後分析した。血管痙攣の発生は、灌流の減少（すなわち、コントロール条件と比較した、微小胞シグナル強度の低減および／またはＵＳパルス後の補充時間の増大）によって実証された。

「補充時間」という表現は、各ＵＳパルスに起因するＭＶの実質的な破壊後に、血管のある超音波ビーム下の領域に新鮮なガス充填微小胞を供給するのに要する時間を示す。

「ＭＶ破壊」という表現は、ＵＳによるＭＶの音響活性化に起因するＭＶの完全性または構造の喪失に相当する。これは、例えばＭＶ崩壊またはガス溶解によって引き起こされ得、音響シグナルの追跡によってモニターされる。

微小胞および超音波処置に関する全てのパラメーターを固定した（表４を参照）。治療的超音波照射パラメーターを以前の試験に従って選択し、ＤＡ３腫瘍における血管透過化を得た。Ｐ０１用量を選択して腫瘍の安定な灌流を可能にした（１．３Ｅ＋０９微小胞／ｋｇ；４回のボーラスに分割し、６分ごとに注入した）。２つの群の動物を試験した：１つの群をＶＩで事前処置し（ニモジピン、１．４ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ、ストック溶液由来、処置の１０分前）、ＮａＣｌ ０．９％のみを投与した群と比較した）。

結果
各ＵＳパルス間の灌流の低減が、生理食塩水で処置した動物の１００％において観察された。ＶＩによる事前処置後、腫瘍灌流は試験した動物の１００％において安定であり、血管痙攣の阻害が示唆された。結果を表４に要約する。

さらに、図１は、ＶＩ事前処置なしで得られた結果（上パネル）をＶＩ事前処置あり（ニモジピン１．４ｍｇ／ｋｇＩＶ）で得られた結果（下パネル）と比較する、ＵＳ＋ＭＶによる処置中の腫瘤灌流の定量化を報告する。結果から、ＶＩ投与後に得られた腫瘍灌流の改善が確認された。実際に、ＶＩによる事前処置は、事前処置なしで得られた場合よりも、ＵＳパルスによる破壊後の微小胞の絶え間ない補充を確実にすることができた。

［実施例６］
ガス充填微小胞と組み合わせた、ＵＳが介在する治療の腫瘍灌流に対する効果（ＮＭＵ腫瘍モデル）。
モデルおよび動物の調製
思春期前のラット（雌、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）に、５０ｍｇ／ｋｇのＮＭＵ（Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｓｉｇｍａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を単回の腹膜内注入を与えた。モデルについては実施例１に記載されている。

ガス充填微小胞の一連のボーラス注入（表５に規定のとおり）を行ない、腫瘍を治療的超音波照射に供した（周波数、音圧およびパルスの特徴は以下の実施例に規定のとおりである）。

処置中の腫瘍の灌流を、実施例５で説明したとおりに評価した。

微小胞および超音波処置に関する全てのパラメーターを固定した（表５を参照）。治療的超音波照射パラメーターを以前の試験に従って選択し、ＮＭＵ腫瘍における血管透過化を得た。Ｐ０２用量を選択して腫瘍の安定な灌流を可能にした（すなわち１．２Ｅ＋０９微小胞／ｋｇ、４回のボーラスに分割；１回のボーラスは５分ごと）。

動物をニモジピンで事前処置し（１．４ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ、ストック溶液由来、処置の１０分前、実施例３に詳述したとおり）、ＮａＣｌ ０．９％の注入と比較した。

結果
１回目のＵＳパルス後のコントラストシグナルの低減が観察された。全ての腫瘍が、１回目のパルス後に灌流の損失を示した。
それにもかかわらず、ジヒドロピリジンカルシウムチャネル遮断薬ニモジピンで事前処置（１．４ｍｇ／ｋｇ、１０分前）したラットは、処置にわたって安定な腫瘍灌流を示し、血管痙攣の阻害が示唆された。

［実施例７］
血管痙攣の誘導における、種々の薬理学的クラスの血管痙攣阻害剤の評価
モデルおよび動物の準備
これらの実験に用いたモデルは、腸間膜ラットの微小循環であった。モデルおよび動物の準備は実施例２に記載した。

この試験は、血管痙攣阻害に対して診療所で現在使用されている種々の薬理学的クラスの血管痙攣阻害薬の有効性を評価することを目的とした。
微小胞および超音波処置に関する全てのパラメーターを、表６に示したとおりに固定した。選択した血管痙攣阻害薬およびそれらに関する用量を表６に報告する。事前処置と超音波処置および微小胞の注入との間の持続時間は、各薬物の薬物動態学および薬力学に従った。

結果
表６に報告するように、結果は、ジヒドロピリジンカルシウム遮断薬、例えば、ニモジピンおよびニフェジピン、マグネシウムおよびニトロ血管拡張剤、例えば、トリニトリン（ｔｒｉｎｉｔｒｉｎｅ）が、血管痙攣を阻害する良好な能力を提示することを示した。α－アドレナリン受容体拮抗薬プラゾシンは、より低い能力を示したが、非ジヒドロピリジンカルシウム遮断薬ジルチアゼムおよびＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）阻害剤カプトプリルは、血管痙攣の発生に対する関連のある阻害活性を何ら示さなかった。

［実施例８］
ガス充填微小胞および超音波の組み合わせた治療的処置の高い有効性を示すさらなる実験
８．１血栓の破壊
使用したモデルは、片方の脳半球の中大脳動脈を閉塞させた健常ラットである。この閉塞は、コンピューター断層撮影によって測定される血管総容積におけるスロップ（ｓｌｏｐ）によって特徴付けられるように対応する半球における血液灌流の低減をもたらす。血栓破壊に関するＵＳ－ＭＶの効率を評価するために、ＵＳ－ＭＶ処置後の血管総容積を、参考値（すなわちＭＣＡ閉塞前後の血管総容積）と比較する。

６つの実験的条件を試験する：
ｖｉ）第１の群のラット（未処置）は、ＵＳに曝露される（凝血溶解に対するＵＳの基礎効果）；
ｖｉｉ）第２の群のラットは、血管痙攣阻害剤で事前処置され、ＵＳに曝露される；
ｖｉｉｉ）第３の群のラットは、ＭＶのみが投与される；
ｉｘ）第４の群は、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＭＶが投与される；
ｘ）第５の群のラットは、ＵＳ－ＭＶ処置が行われる、および
ｘｉ）第６の群は、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＵＳ－ＭＶ処置が行われる。

ＵＳ療法は、閉塞ＭＣＡに対して、周波数約０，２５～２ＭＨｚ（例えば１ＭＨｚ）および約０．４～１．５ＭＰａの音圧（例えば０．６ＭＰａ）、パルス長およそ数ｍｓ～数秒までのオン（例えば１０ｍｓ）で適用される。

血管痙攣阻害剤を用いた事前処置のために、血管痙攣阻害剤（例えばニモジピン、約４０ｍｇ／ｋｇ）を、手順の前、例えばＭＶの投与の５分前に投与する。

ＭＶ製剤を、約０，１～５０μｌのガス／ｋｇ（例えば１μｌのガス／ｋｇ、２．１０^８ＭＶ／ｋｇ））の用量で投与する。ＭＶの数に関して、このガス容量の同等物は、約２×１０^７／ｋｇ～１０×１０^９ＭＶ／ｋｇに相当する。

上記に例示した血管痙攣阻害剤の投与は、組み合わせた治療的処置ＵＳ－ＭＶによって誘導される再灌流の有効性を高めることができる。実際に、ＭＶ－ＵＳの併用前のＶＩを用いた事前処置は、他の条件と比較して血管総容積の有意な増加を可能にする。再灌流は、ＵＳ＋ＭＶのみで処置した動物ではより少ない程度で観察することができ、ＵＳまたはＵＳ＋ＶＩで処置した動物についてはさらにいっそう低い程度である。群ＵＳおよびＵＳ＋ＶＩは同様の再灌流が得られる。他の群：ＭＶのみまたはＭＶ＋ＶＩにおいては再灌流に対する実質的な効果は観察されない。

８．２ ＢＢＢ開放
使用したモデルは、健常ラットまたは脳腫瘍保有ラットである。ＢＢＢ開放に対するＵＳ＋ＭＶの有効性を評価するために、全ての動物に、超音波処置を受ける前にエバンスブルー色素溶液を注入した。脳内の溢出した色素の量は、血液脳関門の透過性の増大（ＢＢＢ開放）と相関する。

６つの実験的条件を試験する：
ｉ）第１の群のラット（未処置）は、ＵＳに曝露される（ＢＢＢＯに対するＵＳの基礎効果）；
ｉｉ）第２の群のラットは、血管痙攣阻害剤で事前処置され、ＵＳに曝露される；
ｉｉｉ）第３の群のラットは、ＭＶのみが投与される；
ｉｖ）第４の群は、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＭＶが投与される；
ｖ）第５の群のラットは、ＵＳ－ＭＶ処置が行われる、および
ｖｉ）第６の群は、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＵＳ－ＭＶ処置が行われる。

血管痙攣阻害剤を用いた事前処置のために、血管痙攣阻害剤（例えばニモジピン、約４０ｍｇ／ｋｇ）を、手順の前、例えばＭＶの投与の５分前に投与する。

ＭＶ製剤（約０．１～５０μｌのガス／ｋｇ；例えば１μｌのガス／ｋｇ）を、ＵＳ適用の直前に投与する。ＭＶの数に関して、このガス容量の同等物は、約２×１０^７／ｋｇ～１０×１０^９ＭＶ／ｋｇ（例えば２．１０^８ＭＶ／ｋｇ）に相当する。

ＵＳ療法を、音圧範囲約１５０ｋＰａ～１．８ＭＰａ（例えば４００ｋＰａ）およびパルス長およそ数μｓ～数十ｍｓのオン（例えば１０ｍｓオン）で、頭蓋骨を通して適用する（約０．２ＭＨｚ～２ＭＨｚ、例えば０．２５ＭＨｚ）。

他の条件と比較して、ＵＳ＋ＭＶ処置と組み合わせた血管痙攣阻害剤の投与は、脳実質組織において溢出するエバンスブルーの量を増加させ、血液脳関門のより高度の開放を反映する。ＢＢＢＯは、ＵＳ＋ＭＶで処置した動物ではより低い程度で観察することができ、他の群：ＵＳまたはＭＶのみ；血管痙攣阻害剤と組み合わせたＵＳまたはＭＶでは、ＢＢＢＯは観察されなかった。

８．３ ＭＶは、熱的アブレーションを高めた
モデルは健常ウサギである。熱的アブレーションの有効性は、超音波に曝露されたときの後肢筋肉の温度上昇および解剖後のこの組織内の熱的病変の観察によって強調される。手順中に上昇する温度を、筋束の超音波処理領域内に挿入した熱電対プローブを用いて追跡する。

６つの実験的条件を試験する：
ｉ）第１の群のウサギ（未処置）は、ＵＳに曝露される（熱的アブレーションに対するＵＳの基礎効果）；
ｉｉ）第２の群のウサギは、血管痙攣阻害剤で事前処置され、ＵＳに曝露される
ｉｉｉ）第３の群のウサギは、ＭＶのみ投与される；
ｉｖ）第４の群のウサギは、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＭＶが投与される；
ｖ）第５の群のウサギは、ＵＳ－ＭＶ処置が行われる、および
ｖｉ）第６の群は、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＵＳ－ＭＶ処置が行われる。

血管痙攣阻害剤を用いた事前処置のために、血管痙攣阻害剤（例えばニモジピン約４０ｍｇ／ｋｇ）を手順前（５分）に投与する。

ＭＶ製剤（約０．１～５０μｌのガス／ｋｇ、例えば５μｌのガス／ｋｇ）を、ＵＳ適用の直前に投与する。ＭＶの数に関して、このガス容量の同等物は、約２×１０^７／ｋｇ～１０×１０^９ＭＶ／ｋｇ（例えば１０×１０^８ＭＶ／ｋｇ）に相当する。

ＵＳ療法を、音圧範囲およそ数百ｋＰａ～数ＭＰａ（例えば２．，７ＭＰａ）およびパルス長およそ数ｍｓ～数秒のオン（例えば１５ｓ）で、筋組織に適用する（約０．２５ＭＨｚ～２ＭＨｚ、例えば０．５ＭＨｚ）。

熱的病変を引き起こす温度上昇は、ＵＳまたはＵＳ＋ＶＩまたはＵＳ＋ＭＶまたはＵＳ＋ＭＶ＋ＶＩを用いて得られる。２つの群ＵＳおよびＵＳ＋ＶＩの間で違いは観察されない。しかしながら、ＵＳまたはＵＳ＋ＶＩと比較して、ＵＳ＋ＭＶの使用は、より高くより早い温度上昇を可能にし、そのような温度上昇を達成してそのような熱的病変を誘導するのに要するエネルギーレベルを低減させる。この観察された効果は、他の全ての群と比較して、血管痙攣阻害剤がＵＳ＋ＭＶと組み合わせて投与された場合に高い。他の群：ＭＶのみまたは血管痙攣阻害剤と組み合わせたＭＶでは、熱的病変は観察されない。

８．４神経調節
使用した動物モデルはラットである。ＵＳ＋ＭＶによって誘導されるニューロン機能の調節を、体性感覚脳皮質内に位置するニューロンの電気的活性の変化を測定することにより評価する。用いた方法は、刺激駆動の体性感覚誘発電位（ＳＳＥＰ）と呼ばれる。この方法は、前肢の電気的刺激によって誘発されるＳＳＥＰ波形（振幅および待機時間）を測定して脳ニューロンの応答を評価する。我々はここでは、ＵＳ＋ＭＶによって誘導される波形の変化を比較する。

６つの実験的条件を試験する：
ｉ）第１の群のラット（未処置）は、ニューロンの応答に対するＵＳの効果を評価するためにＵＳに曝露される；
ｉｉ）第２の群のラットは、血管痙攣阻害剤で事前処置され、ＵＳに曝露される；
ｉｉｉ）第３の群のラットは、ＭＶのみが投与される；
ｉｖ）第４の群は、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＭＶが投与される；
ｖ）第５の群のラットは、ＵＳ－ＭＶ処置が行われる、および
ｖｉ）第６の群のラットは、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＵＳ－ＭＶ処置が行われる。

全ての実験について、刺激によって誘導される波形の変化を評価するために、手順の前にベースラインのシグナルを記録する。

血管痙攣阻害剤を用いた事前処置のために、血管痙攣阻害剤（例えばニモジピン約４０ｍｇ／ｋｇ）を、手順の前（例えば５分）に投与する。

ＭＶ製剤（約μｌのガス／ｋｇ、例えば１μｌのガス／ｋｇ）を、ＵＳ適用の直前に投与する。ＭＶの数に関して、このガス容量の同等物は、約２×１０^７／ｋｇ～１０×１０^９ＭＶ／ｋｇ、例えば２．１０^８ＭＶ／ｋｇに相当する。

ＵＳ療法を、音圧範囲およそ数百ｋＰａ～数ＭＰａ（例えば０．４ＭＰａ）およびパルス長およそ数ｍｓ～数秒のオン（例えば１０ｍｓ）で、脳に適用する（約０．２５ＭＨｚ～２ＭＨＺ、例えば０．５ＭＨｚ）。

ＵＳ＋ＭＶによる体性感覚皮質の刺激は、ベースラインシグナルと比較して、ＳＥＰＰシグナル振幅の低減および待機時間の増加を誘導する。ＵＳ＋ＭＶ刺激と組み合わせたＶＩの投与は、ＵＳ＋ＭＶと比較して、ＳＥＰＰ振幅のより高い低減およびシグナル待機時間のより高い増加を誘導する。そのようなシグナル変化を誘導するために要するエネルギーレベルもまた、他の群と比較して、ＵＳ＋ＭＶ＋ＶＩで処置した群において、より低い。ＵＳまたはＵＳ＋ＶＩまたはＭＶまたはＵＳ＋ＶＩについては、波形の変化は観察されない。

８．５ 非熱的アブレーション
モデルは、健常ラットまたは脳腫瘍を保有するラットである。組織を切除するために脳をＵＳに曝露する。手順の有効性は、ｉ）組織血行力学の変化、ｉｉ）標的組織におけるネクローシスおよびアポトーシスのレベルの増加、およびｉｉｉ）週にわたる腫瘍増殖の減少によって強調されるような、処置によって誘導される病変の存在を検出することによって評価される。

６つの実験的条件を試験する：
ｉ）第１の群のラット（未処置）は、ＵＳに曝露される（非熱的アブレーションに対するＵＳの基礎効果）；
ｉｉ）第２の群のラットは、血管痙攣阻害剤で事前処置され、ＵＳに曝露される；
ｉｉｉ）第３の群のラットは、ＭＶのみが投与される；
ｉｖ）第４の群のラットは、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＭＶが投与される；
ｖ）第５の群のラットは、ＵＳ－ＭＶ処置が行われる、および
ｖｉ）第６の群は、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＵＳ－ＭＶ処置が行われる。

血管痙攣阻害剤を用いた事前処置のために、血管痙攣阻害剤（例えばニモジピン約４０ｍｇ／ｋｇ）を、手順の前（例えば５分）に投与する。

ＭＶ製剤（約０，１～５０μｌのガス／ｋｇ、例えば１μｌのガス／ｋｇ）を、ＵＳ適用の直前に投与する。ＭＶの数に関して、このガス容量の同等物は、約２×１０^７ＭＶ／ｋｇ～１０×１０^９ＭＶ／ｋｇ（例えば２．１０^８ＭＶ／ｋｇ）に相当する。

ＵＳ療法を、音圧範囲およそ数百ｋＰａ～数ＭＰａ（例えば１ＭＰａ）およびパルス長および数ｍｓ～数秒のオン（例えば２０ｍｓ）で、組織に適用する（約０．２５ＭＨｚ～２ＭＨｚ、例えば１ＭＨｚ）。

他の全ての条件と比較して、ＵＳ＋ＭＶと組み合わせた血管痙攣阻害剤の投与は、処置した組織における血流のより高い減少およびネクローシスおよびアポトーシスのより高いレベルを可能にする。これは、他の全ての群と比較した、週にわたる腫瘍増殖のより高い減少に換算される。同様の効果が、ＵＳ＋ＭＶで処置した動物において、より低い程度で観察される。群：ＵＳまたはＵＳ＋ＶＩまたはＭＶまたはＭＶ＋ＶＩでは、病変は観察されない。

８．６放射線増感
モデルは、腫瘍を保有するラットである。ＵＳ＋ＭＶを用いて放射線療法（ＲＴ）の効果を高める腫瘍の処置が目的である。手順の有効性は、ｉ）組織血行力学の変化、ｉｉ）ＵＳ＋ＲＴに曝露された組織における細胞死およびアポトーシスのレベルの増加、およびｉｉｉ）週にわたる腫瘍増殖の減少および生存の増加によって強調されるような、処置によって誘導される病変の存在を検出することによって評価される。

１０個の実験的条件を試験する：
ｉ）第１の群のラットは、処置単独の効果を評価するためにＲＴに曝露される；
ｉｉ）第２の群のラットは、ＲＴおよび血管痙攣阻害剤に曝露される；
ｉｉｉ）第３の群のラットは、ＵＳに曝露される；
ｉｖ）第４の群は、ＵＳおよび血管痙攣阻害剤に曝露される；
ｖ）第５の（ｆｉｆｔｈ ｔｈｉｒｄ）群のラットは、ＭＶのみが投与される；
ｖｉ）第６の群は、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＭＶが投与される；
ｖｉｉ）第７の群のラットは、ＵＳ－ＭＶ処置が行われる；
ｖｉｉｉ）第８の群は、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＵＳ－ＭＶ処置が行われる；
ｉｘ）第９の群は、ＵＳ－ＭＶおよびＲＴ処置が行われる；
ｘ）第１０の群は、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＵＳ－ＭＶおよびＲＴ処置が行われる。

事前処置のために、血管痙攣阻害剤（例えばニモジピン約４０ｍｇ／ｋｇ）を、手順の前（例えば５分）に投与する。

ＭＶ製剤（約０．１～５０μｌのガス／ｋｇ、例えば１μｌ～ガス／ｋｇ）を、ＵＳ適用の直前に投与する。ＭＶの数に関して、このガス容量の同等物は、約２×１０^７／ｋｇ～１０×１０^９ＭＶ／ｋｇ（例えば２．１０^８ＭＶ／ｋｇ）に相当する。

ＵＳ療法を、腫瘍に適用する（約０．２５ＭＨｚ～２ＭＨｚ、例えば０．２５ＭＨｚ）。ＵＳ療法は、音圧およそ数百ｋＰａ～数ＭＰａ（例えば６００ｋＰａ）、数ｍｓ～数秒（例えば１０ｍｓ）のパルス長で、組織に適用される。

放射線療法は、ＵＳ処置後に同じ組織に適用される。

他の条件と比較して、ＲＴ＋ＵＳ＋ＭＶの前に血管痙攣阻害剤を投与することは、血流のより高い減少および処置された組織における細胞死およびアポトーシスのより高いレベルを可能にする。これは、他の群と比較した、腫瘍増殖の減少およびより高い生存率に換算される。より低いレベルで、ＭＶ＋ＵＳ＋ＲＴまたはＭＶ＋ＵＳ＋／－ＶＩまたはＲＴ＋／－ＶＩもまた、血流を低減させ、腫瘍組織における細胞死およびアポトーシスを誘導し、腫瘍増殖を低減させる。この効果は、ＭＶ＋ＵＳと比較して、ＭＶ＋ＵＳ＋ＶＩで処置した群で優れている。ＲＴまたはＲＴ＋ＶＩの間で違いは観察されない。ＭＶまたはＭＶ＋ＶＩまたはＵＳまたはＵＳ＋ＶＩで処置した群では効果が観察されない。

８．７温熱療法
モデルは、腫瘍を保有するウサギである。目的は、蛍光－細胞傷害薬により腫瘍を処置すること、および、ＵＳ温熱療法で誘導される方法によって薬物輸送を高めることである。

温熱療法は、処置領域における温度マップを可能にするＭＲ温度測定方法によって腫瘍内の温度をモニターすることによって評価される。薬物輸送の有効性は、蛍光分析法によって得られる腫瘍内の蛍光蓄積の定量化により評価される。

７つのセットの実験的条件を試験する。全ての群に細胞傷害薬を投与する。
ｉ）第１の群は、細胞傷害薬のみが投与される（腫瘍における蛍光シグナルの基礎蓄積）；
ｉｉ）第２の群のウサギは、ＵＳ＋／－細胞傷害薬を用いて処置される；
ｉｉｉ）第３の群のウサギは、血管痙攣阻害剤で事前処置され、ＵＳ＋／－細胞傷害薬に曝露される；
ｉｖ）第４の群のウサギは、ＭＶ＋／－細胞傷害薬が投与される；
ｖ）第５の群のウサギは、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＭＶ＋／－細胞傷害薬が投与される；
ｖｉ）第６の群のウサギは、ＵＳ－ＭＶ処置＋／－細胞傷害薬に曝露される、および
ｘｖｉｉ）第７の群は、血管痙攣阻害剤で事前処置され、次いで、ＵＳ－ＭＶ処置＋／－細胞傷害薬に曝露される。

血管痙攣阻害剤を用いた事前処置のために、血管痙攣阻害剤（例えばニモジピン約４０ｍｇ／ｋｇ）を、処置の前（例えば５分）に投与する。

ＭＶ製剤（例えば、約０．１～５０μｌのガス／ｋｇ）を、ＵＳ適用の直前に投与する。ＭＶの数に関して、このガス容量の同等物は、約２×１０^７／ｋｇ～１０×１０^９ＭＶ／ｋｇ（例えば２．１０^８ＭＶ／ｋｇ）に相当する。

ＵＳ療法を、音圧範囲およそ２００ｋＰａ～１ＭＰａ（例えば５００ｋＰａ）およびパルス長およそ１ｍｓ～１０秒のオン（例えば１０ｍｓ）で、腫瘍に適用する（約０．２５ＭＨｚ～２ＭＨｚ、例えば０．５ＭＨｚ）。

温度の実質的な上昇は、群ＶＩまたはＭＶについて観察されず、ＭＶ＋ＶＩでも観察されない。温熱療法は、ＵＳまたはＵＳ＋ＶＩまたはＵＳ＋ＭＶまたはＵＳ＋ＭＶ＋ＶＩを用いて得られる。温熱療法に到達および維持するのに要するエネルギーレベルは、群ＭＶ＋ＵＳにおいて減少し、群ＵＳ＋ＭＶ＋ＶＩでは、より高い程度に減少する。

温熱療法が効果的である全ての群について、蛍光シグナルの蓄積の増加が測定される。この効果は、ＭＶ＋ＵＳと比較してＵＳ＋ＭＶ＋ＶＩでより顕著であり、ＵＳ－ＭＶおよびＶＩの併用による細胞傷害薬のより高い送達を反映している。

Claims (13)

1. ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた治療的処置によって生じる血管痙攣を処置するための、血管痙攣阻害剤を含む医薬組成物であって、
   前記血管痙攣阻害剤が、ニモジピン、ニフェジピン、マグネシウム、プラゾシンおよびニトログリセリンからなる群から選択される、
   医薬組成物。
2. 前記血管痙攣阻害剤が、ガス充填微小胞の懸濁液の投与と同時または連続して投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記血管痙攣阻害剤が、ガス充填微小胞の懸濁液の投与の１秒～１５分前に先立って投与される、請求項２に記載の医薬組成物。
4. ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた治療的処置によって生じる血管痙攣を処置するための、血管痙攣阻害剤を含む医薬組成物であって、
   前記医薬組成物は、
   ａ）対象の血管系に血管痙攣阻害剤を投与する工程；
   ｂ）前記対象の血管系にガス充填微小胞の懸濁液を投与する工程；
   ｃ）前記対象の関心領域に治療用超音波を適用する工程
   を含む、方法において使用され、
   前記血管痙攣阻害剤が、ニモジピン、ニフェジピン、マグネシウム、プラゾシンおよびニトログリセリンからなる群から選択される、
   医薬組成物。
5. ガス充填微小胞の前記懸濁液が、連続的なインフュージョンで、または少なくとも１回のボーラスを注入することによって投与される、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 前記方法の工程ａ）および工程ｂ）が、同時または連続して行われる、請求項４または５に記載の医薬組成物。
7. 工程ａ）が工程ｂ）の１秒～１５分前に行なわれる、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 前記治療用超音波が、１００～９００ｋＰａに含まれる音圧を有する、請求項４～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
9. 前記治療用超音波が、５μｓ～６０ｓに含まれるパルス長を有する、請求項４～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
10. 前記治療用超音波が、１秒～１７０分に含まれる時間のあいだ適用される、請求項４～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
11. 前記治療用超音波が、２０ｋＨｚ～７０ＭＨｚに含まれる周波数を有する、請求項４～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
12. ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた治療的処置によって生じる血管痙攣を処置するための、血管痙攣阻害剤を含む医薬組成物であって、
    前記医薬組成物は、
    ａ’）対象の血管系に生物活性剤を投与する工程；
    ａ）対象の血管系にニモジピン、ニフェジピン、マグネシウム、プラゾシンおよびニトログリセリンからなる群から選択される血管痙攣阻害剤を投与する工程；
    ｂ）前記対象の血管系にガス充填微小胞の懸濁液を投与する工程；
    ｃ）前記対象の関心領域に治療用超音波を適用する工程
    を含む、方法において使用される、
    医薬組成物。
13. ガス充填微小胞および治療用超音波の組み合わせた治療的処置によって生じる血管痙攣を処置するための、血管痙攣阻害剤を含む医薬組成物であって、
    前記医薬組成物は、
    ａ）対象の血管系にニモジピン、ニフェジピン、マグネシウム、プラゾシンおよびニトログリセリンからなる群から選択される血管痙攣阻害剤を投与する工程；
    ｂ）生物活性剤を含むガス充填微小胞の懸濁液であって前記生物活性剤が前記ガス充填微小胞の構造内に含まれている懸濁液を、前記対象の血管系に投与する工程；
    ｃ）前記対象の関心領域に治療用超音波を適用する工程
    を含む、方法において使用される、
    医薬組成物。