JP7752000B2 - 悪臭抑制素材のスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、悪臭抑制素材をスクリーニングする方法に関する。

近年、消費者の嗜好性の多様化や生活環境の多様化に応じて、身の回りの臭気・悪臭に対して敏感な人が増えている。その範囲は、生活空間中のニオイから食品中に含まれるわずかな異臭（オフフレーバー）に至るまで多岐にわたっており、より有効に不快臭を低減・消臭させる技術が、生活の質の向上のために求められている。

生活空間における不快臭の代表的な原因物質として、体臭、糞便臭、腐敗臭などに含まれるスカトールやインドールが挙げられる（特許文献１）。
これらの悪臭物質は、動物性タンパク質由来のトリプトファン代謝産物であり、生体内代謝及び微生物代謝によって生成される。そのため、ヒトの体臭・排泄物中に含まれるだけでなく、乳製品などの動物由来食品にも含まれ、オフフレーバーとして食品の嗜好性を低下させる一因にもなっている（非特許文献１）。

食品中におけるオフフレーバーの原因物質としては多くの成分が知られているが、例えば、柑橘等に由来する劣化臭である、α－ターピネオール、４－ターピネオール又はｐ－メチルアセトフェノンなどが挙げられる（非特許文献２）。

旧来の不快臭の低減・消臭物質の探索法では、匂いの評価の専門家が、膨大な数の候補物質を、一つ一つ官能評価により確認するため、スループット性が低いという問題点があった。一方、近年確立された分子生物学的な手法では、悪臭原因物質に応答する嗅覚受容体を探索し、その嗅覚受容体を用いることで悪臭抑制素材の候補物質を迅速にスクリーニングできる。

ヒトの嗅覚受容体は約４００種類が存在し、一つの匂い物質は、多数の嗅覚受容体に応答するが、応答する受容体の一部はＢｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体と呼ばれる幅広い匂い物質を区別なく認識する受容体である。そのため、悪臭原因物質が応答する数種類の受容体の中でも、どの受容体が不快感に関連性が高いかを知ることは重要である。例えば、非特許文献３では、嗅覚受容体ＯＲ７Ｄ４がアンドロステノン臭の不快感に関連する真に重要な受容体として報告されている。非特許文献４には、ＯＲ２Ｗ１などの香調を問わず広く応答するＢｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体が数多く挙げられている。

特許文献２には、悪臭原因物質であるスカトール又はインドールに応答する嗅覚受容体として、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ５Ｐ３、ＯＲ５Ｋ１、ＯＲ８Ｈ１が開示され、これらの嗅覚受容体の応答を抑制することによって、スカトール臭やインドール臭を抑制できることが記載されている。また、特許文献３には、車両などの輸送用機械への乗客持込み臭物質ｏ－イソプロピルフェノールが、嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３に応答することが開示されている。

特開２００８－０３６４３４号公報 特開２０１２－２５０９５８号公報 特開２０１７－１７６１３４号公報 特開２００８－１３６８４１号公報

Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ２００１， ４９， １０， ４８２５－４８３２ Ｎｉｐｐｏｎ Ｎｏｇｅｉｋａｇａｋｕ Ｋａｉｓｈｉ Ｖｏｌ． ５５， Ｎｏ． １， ｐｐ． ２３－３０， １９８１ Ｎａｔｕｒｅ． ２００７ Ｓｅｐ ２７；４４９（７１６１）：４６８－７２． Ｆｌａｖｏｕｒ Ｆｒａｇｒ． Ｊ． ２０１５， ３０， ３４２－３６１ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０：２０９ （２０１９）

スカトールやインドールへの応答が開示されている嗅覚受容体の多くはＢｒｏａｄｌｙ Ｔｕｎｅｄ嗅覚受容体であり、悪臭認識を特徴づけている嗅覚受容体がどれであるかは不明確であり知られていなかった。また、α－ターピネオール、４－ターピネオール及びｐ－メチルアセトフェノンに明確に応答する嗅覚受容体は、これまでに知られていなかった。このような状況の下、スカトール、インドール、α－ターピネオール、４－ターピネオール及びｐ－メチルアセトフェノンに代表される悪臭原因物質に応答する嗅覚受容体を探索し、該悪臭抑制素材の候補物質を効率的にスクリーニングする方法、該悪臭の不快さを低減する悪臭抑制組成物を提供することが望まれている。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、スカトール、インドール、α－ターピネオール、４－ターピネオール又はｐ－メチルアセトフェノン等に代表されるある種の悪臭原因物質が、嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３に特徴的に応答することを新たに見出した。数百種類もの匂い物質に対するＯＲ２Ｌ３応答結果を集約すると、ＯＲ２Ｌ３に応答する物質には悪臭物質が一定数含まれる新規知見から、ＯＲ２Ｌ３は悪臭認識に重要な嗅覚受容体であると特定した。本発明者はさらに検討を進め、ＯＲ２Ｌ３を用いることで、嗅覚受容体アンタゴニストのマスキング効果による悪臭抑制素材の評価及び選択が可能であることを見出した。

すなわち、本発明は、以下に示すスカトール、インドール、α－ターピネオール、４－ターピネオール、又はｐ－メチルアセトフェノン等に代表されるＯＲ２Ｌ３応答性悪臭の抑制素材候補物質をスクリーニングする方法を提供するものである。

［１］
悪臭抑制素材のスクリーニング方法であって、以下の工程：
ＯＲ２Ｌ３、及びＯＲ２Ｌ３が有するアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ悪臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び悪臭原因物質を添加すること；
悪臭原因物質に対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；
及び、測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質を同定すること、すなわち、測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質が、悪臭抑制素材の候補物質であると同定すること
を含む方法。
［２］
前記の悪臭が、スカトール臭、インドール臭、α－ターピネオール臭、４－ターピネオール臭、又はｐ－メチルアセトフェノン臭である［１］に記載の方法。
［３］
前記の悪臭が、糞便臭、口臭、乳製品類由来の劣化臭、又は柑橘由来の劣化臭である［１］に記載の方法。
［４］
前記の悪臭が、ヒトに不快感を与える化合物、組成物又は混合物による臭いである［１］に記載の方法。
［５］
上記嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上、又は嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で悪臭原因物質に対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
嗅覚受容体の応答を、レポータージーンアッセイあるいはカルシウムイメージングにより測定する、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。

本発明の方法を用いることにより、悪臭原因物質と嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３との結合を阻害しうる悪臭抑制素材の候補物質をスクリーニングすることができる。また、対象となる悪臭が原因物質未特定の混合物であっても、試験物質がＯＲ２Ｌ３に応答する可能性を容易に推測できるため、ＯＲ２Ｌ３の応答確認さえ実施すれば、該悪臭抑制素材のスクリーニング方法を適用することができ、未出の悪臭物質に対する選択的な消臭物質の選定にも有用である。嗅覚受容体として、ＯＲ２Ｌ３が有するアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ悪臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドを用いた場合も、同様の効果が得られるものと予測される。

スカトールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３の応答の測定結果を示す図である。 インドールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３の応答の測定結果を示す図である。 α－ターピネオールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３の応答の測定結果を示す図である。 ４－ターピネオールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３の応答の測定結果を示す図である。 ｐ－メチルアセトフェノンに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３の応答の測定結果を示す図である。 ヘキサン酸シス―３－ヘキセニルの添加による、スカトールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３における応答抑制効果を示す図である。 グアバコア（登録商標）の添加による、スカトールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３の応答抑制効果を示す図である。 デキストランバー（登録商標）の添加による、スカトールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３の応答抑制効果を示す図である。 ヒンジノール（登録商標）の添加による、スカトールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３の応答抑制効果を示す図である。 グアバコア（登録商標）の添加による、インドールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３の応答抑制効果を示す図である。 デキストランバー（登録商標）の添加による、インドールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３の応答抑制効果を示す図である。 ヒンジノール（登録商標）の添加による、インドールに対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３の応答抑制効果を示す図である。

以下、本発明のスクリーニング方法について具体的に説明する。
前述したとおり、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程：
ＯＲ２Ｌ３、及びＯＲ２Ｌ３が有するアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ悪臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び悪臭原因物質を添加すること；
悪臭原因物質に対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び
測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質が、悪臭抑制素材の候補物質であると同定すること、
を含むものである。本発明は、例えば、以下の実施形態にしたがって実施することができる。

一実施形態として、本発明は、悪臭原因物質に対して応答性を示す嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３を用いて、試験物質の中から悪臭抑制素材の候補物質をスクリーニングする方法であって、
（ｉ） ＯＲ２Ｌ３、及びＯＲ２Ｌ３が有するアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ悪臭原因物質に対して応答性を示すタンパク質（ポリペプチド）からなる群より選択される嗅覚受容体（嗅覚受容体ポリペプチド）と悪臭原因物質を接触させ、悪臭原因物質に対する嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉ） 悪臭原因物質の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉｉ） 工程（ｉ）及び（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性の変化値を計算して求める工程と、
（ｉｖ） 工程（ｉ）において悪臭原因物質に試験物質を混合して、工程（ｉｉｉ）と同様に応答性の変化値を計算して求める工程と、
（ｖ） 工程（ｉｉｉ）と比較して工程（ｉｖ）の値が低減した試験物質を、悪臭抑制素材の候補物質として選択する工程と
を含むことを特徴としている。

本発明のスクリーニング方法は、嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３、及びＯＲ２Ｌ３が有するアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ悪臭原因物質に対して応答性を示すタンパク質（ポリペプチド）からなる群より選択される嗅覚受容体に対する試験物質の応答性を指標として、試験物質の中から悪臭抑制素材の候補物質を選択するものである。

一般に、１種類の匂い物質が複数の嗅覚受容体を活性化した結果、好き嫌い、誘引や忌避などの情動や行動が引き起こされることが知られており、非特許文献５によれば、一つ一つの嗅覚受容体には匂いの「質」が規定されていることが示されている。数百種類もの匂い物質に対するＯＲ２Ｌ３応答を測定し、鋭意検討集約したところ、ＯＲ２Ｌ３に応答する物質には悪臭物質が一定数含まれることから、ＯＲ２Ｌ３は嫌いや忌避に相当する悪臭認識と関連付けられた。このことから、該嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３に対する試験物質の応答性を評価することによって、試験物質の中から悪臭原因物質が嗅覚受容体と結合することを妨げることができる候補物質を選択することができる。
なお、本明細書において、「試験物質」とは、特に限定するものではないが、悪臭抑制効果の調査対象をいい、化合物、組成物又は混合物をいうものとする。また、本明細書において「悪臭抑制素材」とは、特に限定するものではないが、悪臭を抑制することができる化合物、組成物又は混合物をいうものとする。以下、本発明のスクリーニング方法の各工程について説明する。

＜工程（ｉ）＞
工程（ｉ）では、ＯＲ２Ｌ３、及びＯＲ２Ｌ３が有するアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ悪臭原因物質に対して応答性を示すタンパク質（ポリペプチド）からなる群より選択される嗅覚受容体と悪臭原因物質を接触させ、悪臭原因物質に対する嗅覚受容体の応答を測定する。

嗅覚受容体としては、ＯＲ２Ｌ３、及びＯＲ２Ｌ３が有するアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ悪臭原因物質に対して応答性を示すタンパク質（ポリペプチド）からなる群より選択される嗅覚受容体が用いられる。
ＯＲ２Ｌ３は、ＧｅｎＢａｎｋにＮМ＿００１００４６８７として登録されており、配列番号１で示される塩基配列のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）からなるタンパク質（ポリペプチド）である。
該嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３は、スカトールに代表されるある種の悪臭物質に選択的に応答することから、ＯＲ２Ｌ３を用いたスクリーニング方法は、悪臭抑制素材の開発に貢献できるものと期待される。

嗅覚受容体として、ＯＲ２Ｌ３が有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ悪臭原因物質に対して応答性を示すタンパク質（ポリペプチド）からなる群より選択される嗅覚受容体を用いてもよい。なお、本明細書においてアミノ酸配列の配列同一性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズム（ＮＣＢＩより公に入手できる）によって算出される。
嗅覚受容体は、一種で用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いてもよい。

本発明において、悪臭原因物質は、スカトール、インドール、α－ターピネオール、４－ターピネオール又はｐ－メチルアセトフェノンに代表される、糞便臭、口臭、乳製品類由来の劣化臭、又は柑橘由来の劣化臭であり、ヒトに不快感を与えるＯＲ２Ｌ３応答性の化合物、組成物又は混合物をいう。

本発明において嗅覚受容体と悪臭原因物質を接触させ、悪臭原因物質に対する嗅覚受容体の応答を測定する方法は特に制限されない。例えば、嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上で悪臭原因物質と接触させ、嗅覚受容体の応答を測定してもよいし、嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で悪臭原因物質と接触させ、嗅覚受容体の応答を測定してもよい。嗅覚受容体と悪臭原因物質を接触させる時間は、悪臭原因物質の濃度や測定方法にも依存するため一概には言えないが、接触させた直後に応答を測定してもよく、通常、レポータージーンアッセイ法においては０～４時間、好ましくは２～４時間、カルシウムイメージング法では数秒から数分程度である。

嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞は、嗅覚受容体をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。

本発明の好ましい態様では、嗅覚受容体と共に、ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込んでもよい。ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込むことにより、嗅覚受容体の細胞膜発現を促進することができる。
ウシロドプシンは、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１０１４８９０として登録されている。ウシロドプシンは、配列番号３で示される塩基配列の第１番目から第１０４７番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号４）からなるタンパク質（ポリペプチド）である。
また、ウシロドプシンに代えて、配列番号４で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ嗅覚受容体の細胞膜発現を促進することができるタンパク質（ポリペプチド）を用いてもよい。
なお、嗅覚受容体の細胞膜発現を促進できるものであれば、ウシロドプシンに限らず、他のタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸残基を用いてもよい。

嗅覚受容体の応答を測定する方法は特に制限されなく、当分野で用いられている任意の方法を用いることができる。例えば、香気化合物が嗅覚受容体へ結合すると、細胞内のＧタンパク質を活性化し、Ｇタンパク質がアデニル酸シクラーゼを活性化して、ＡＴＰを環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）へと変換し、細胞内のｃＡＭＰ量を増加させることが知られている。したがって、ｃＡＭＰ量を測定することで嗅覚受容体の応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ法等が用いられる。中でも、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体の応答を測定することが好ましい。

＜工程（ｉｉ）＞
工程（ｉｉ）では、悪臭原因物質の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する。
嗅覚受容体の応答を測定する方法は、嗅覚受容体と悪臭原因物質を接触させないことを除いて、工程（ｉ）で示した方法と同様の方法を用いることができる。例えば、嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上で嗅覚受容体の応答を測定してもよいし、嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で嗅覚受容体の応答を測定してもよい。工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定結果を適切に比較するために、工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定条件は、悪臭原因物質の接触の有無を除いて、同じであることが好ましい。

＜工程（ｉｉｉ）＞
工程（ｉｉｉ）では、工程（ｉ）及び（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性の変化値を計算して求める。
本発明の一実施態様によれば、応答性の変化は、工程（ｉ）における測定結果を、工程（ｉｉ）における測定結果で割ることで求められるＦｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ値を指標として評価してもよい。例えば、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体の応答を測定する場合、Ｆｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ値が好ましくは２以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは１０以上となる濃度の悪臭原因物質を使用して評価することができる。

＜工程（ｉｖ）＞
工程（ｉｖ）では、工程（ｉ）において悪臭原因物質に試験物質を混合して、工程（ｉｉｉ）と同様に応答性の変化値を計算して求める。

＜工程（ｖ）＞
工程（ｖ）では、工程（ｉｉｉ）と比較して工程（ｉｖ）の値が低減した試験物質を、悪臭抑制素材の候補物質として選択する。
本発明では、工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）における測定結果を比較して応答性の変化値の低減が見られた場合、工程（ｉｖ）で用いた試験物質を、悪臭抑制素材の候補物質として評価することができる。

上記のようにして、試験物質の中から悪臭抑制素材の候補物質をスクリーニングすることができる。本発明によれば、人間の嗅覚によって行う官能評価による嗅覚疲労や個人差などによる問題を生じることなく、多数の試験物質の中から悪臭抑制素材の候補物質を選択することができる。
選択された物質は、悪臭抑制素材の候補物質として用いることができる。選択された物質を基に必要に応じて改変等を行い、最適な匂いのする新規な化合物を開発することもできる。さらには、選択された物質を他の香料素材とブレンドして悪臭を抑制することができ、かつ最適な匂いのする香料素材を開発することも可能である。本発明のスクリーニング方法を用いることにより、悪臭抑制素材の新しい香料素材の開発に貢献することができる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されるものではない。

［実施例１］
嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３が悪臭原因物質に応答することの確認
（１） 嗅覚受容体遺伝子クローニング
ヒト嗅覚受容体遺伝子はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ： Ｆｅｍａｌｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）よりＰＣＲ法にてクローニングすることで得た。ｐＭＥ１８ＳベクターにウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込み、さらにその下流に、得られたヒト嗅覚受容体遺伝子を組み込むことで、ヒト嗅覚受容体遺伝子発現ベクターを得た。
（２） ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での嗅覚受容体遺伝子の発現
ヒト嗅覚受容体遺伝子発現ベクター０．０５μｇ、ＲＴＰ１Ｓベクター０．０１μｇ、ｃＡＭＰ応答配列プロモーターを含むホタルルシフェラーゼベクターｐＧＬ４．２９（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．０１μｇ、及びチミジンキナーゼプロモーターを含むウミシイタケルシフェラーゼベクターｐＧＬ４．７４（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．００５μｇをＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（ｇｉｂｃｏ社）１０μＬに溶解して遺伝子溶液（１穴分）とした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４時間後にコンフルエントに達する細胞数で９６穴プレート（Ｂｉｏｃｏａｔ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１００μＬずつ播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００の使用法に従ってリポフェクション法によって遺伝子溶液を各穴に添加して、細胞に遺伝子導入を行い、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で２４時間培養した。
（３） ルシフェラーゼレポータージーンアッセイ
培養液を除去した後に、検体となる香気化合物を測定する濃度になる様にＣＤ２９３（ｇｉｂｃｏ社）培地（２０μＭ Ｌ－グルタミン添加）で調製したものを５０μＬずつ添加し、３時間の刺激を行った後に、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の使用方法に従ってルシフェラーゼ活性を測定した。嗅覚受容体の応答強度は、香気化合物の刺激によって生じたルシフェラーゼ活性を、香気化合物を含まない試験系で生じたルシフェラーゼ活性で割ることで求められるＦｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ値で表現した。
（４） 悪臭物質に応答する嗅覚受容体の同定
悪臭原因物質の代表例として、スカトール、インドール、α－ターピネオール、４－ターピネオール又はｐ－メチルアセトフェノンの嗅覚受容体ＯＲ２Ｌ３に対する応答を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって様々な濃度で測定した。結果を図１～５にそれぞれ示す。ＯＲ２Ｌ３は各種悪臭原因物質に対して濃度依存的な応答を示した。一方で、Ｍｏｃｋ試験（ＯＲ２Ｌ３を発現させない細胞を使用）では応答が見られなかった。すなわち、ＯＲ２Ｌ３は各種悪臭原因物質に対して、特異的に応答することが示された。

［実施例２］
悪臭抑制素材に対するＯＲ２Ｌ３の応答抑制効果の評価
特許文献４においてスカトール臭をマスキングするスカトール臭抑制素材として知られているヘキサン酸シス―３－ヘキセニルについて、スカトールに対して強い応答を示した該ＯＲ２Ｌ３の応答を抑制する効果を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。ルシフェラーゼレポータージーンアッセイにおいて、検体にスカトールとヘキサン酸シス―３－ヘキセニルを混合して用い、ヘキサン酸シス―３－ヘキセニルを混合しなかった試験でのＦｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ値を１００とした際の、ヘキサン酸シス―３－ヘキセニルを混合した試験でのＦｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ値の割合を求めた。結果を図６に示す。ヘキサン酸シス―３－ヘキセニルの、スカトールに対するＯＲ２Ｌ３の応答を濃度依存的に低減させる効果が示された。

［実施例３］
悪臭抑制素材（候補物質群）に対するＯＲ２Ｌ３の応答抑制効果の評価
表１に示したＡ群を含む悪臭抑制素材（候補物質群）について、悪臭に対して強い応答を示した該ＯＲ２Ｌ３の応答を抑制する効果を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。
ルシフェラーゼレポータージーンアッセイにおいて、検体にスカトールとグアバコア（登録商標）を混合して用い、グアバコアを混合しなかった試験でのＦｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ値を１とした際の、グアバコアを混合した試験でのＦｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ値の割合を求めた。結果を図７に示す。グアバコアの、スカトールに対するＯＲ２Ｌ３の応答を濃度依存的に低減させる効果が示された。
本ＯＲ２Ｌ３の応答抑制効果の評価のグアバコアをデキストランバー（登録商標）に置き換えて同様に試験を実施した。結果を図８に示す。デキストランバーのスカトールに対するＯＲ２Ｌ３の応答を濃度依存的に低減させる効果が示された。同様にグアバコアをヒンジノール（登録商標）に置き換えて試験を実施した。結果を図９に示す。ヒンジノールのスカトールに対するＯＲ２Ｌ３の応答を濃度依存的に低減させる効果が示された。
本ＯＲ２Ｌ３の応答抑制効果の評価の悪臭をスカトールからインドールに置き換えて同様に試験を実施した。Ａ群をそれぞれグアバコア、デキストランバー、又はヒンジノールとしたときの結果をそれぞれ図１０～１２に示した。グアバコア、デキストランバー、及びヒンジノールのインドールに対するＯＲ２Ｌ３の応答を濃度依存的に低減させる効果が示された。
本ＯＲ２Ｌ３の応答抑制効果の評価はグアバコアをその他Ａ群に置き換え、悪臭をスカトールからα－ターピネオール、４－ターピネオール又はｐ－メチルアセトフェノンに置き換えた組み合わせにおいても試験を実施した。いずれもＡ群は各悪臭のＯＲ２Ｌ３の応答を濃度依存的に低減させる効果が示された。

［実施例４］
Ａ群の悪臭抑制能の評価
受容体活動阻害活性を有する試験物質の悪臭抑制能を、官能評価によって確認した。悪臭としてはクエン酸トリエチルで１００倍に希釈したスカトール、又は１００倍に希釈したインドールを各１０μＬ滴下、及び試験物質を１μＬ滴下した綿球をプラスチックボトル（竹本容器製ＯＺＯ－４０）に入れた。ボトルを１時間室温で静置し、匂い分子をボトル中に十分揮発させた。官能評価試験はパネル２０名で行い、悪臭を単独で滴下した場合の匂いの強さを８とし、試験物質を混合した場合の悪臭の強さを０（悪臭を感じない）から１０（非常に強く悪臭を感じる）として評価した。得られた数値より平均値を算出した。結果を表２に示す。
ＯＲ２Ｌ３のスカトール応答を抑制するヒュームスエーテル（登録商標）は、スカトール臭の強度を著しく抑制させた。このスカトールの抑制は、ＯＲ２Ｌ３のスカトール応答を抑制しなかった対照物質（４－ｔ－ブチルシクロヘキサノール、サリチル酸ヘキシル）を用いた場合に比べ、顕著であった。またインドールについて調べた結果、やはりヒュームスエーテルによってインドール臭の強度が抑制された。なお、ＯＲ２Ｌ３の応答を抑制する他の物質（グアバコア、パンプレフィックス、アンブレトン、デキストランバー、ヒンジノール、リンゴノール（いずれも登録商標）、カルダモン油、クラリーセージ油、マンダリン油、スペアミント油）についても悪臭の抑制効果を検証したところ、いずれの物質も各悪臭を抑制することが明らかとなった。

上記のとおり、本発明のスクリーニング方法を用いることにより、多数の試験物質の中から悪臭抑制素材の候補物質を選択することができた。

本発明のスクリーニング方法を用いることにより、多数の試験物質の中から悪臭抑制素材の候補物質を選択することができる。本発明のスクリーニング方法は、悪臭抑制素材の開発に貢献できるものと期待される。

Claims (5)

1. 悪臭抑制素材のスクリーニング方法であって、以下の工程：
   アミノ酸配列（配列番号２）からなる嗅覚受容体ポリペプチドＯＲ２Ｌ３、及びＯＲ２Ｌ３が有するアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ悪臭原因物質に対して応答性を示すポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体ポリペプチドに、試験物質及び悪臭原因物質を添加すること；
   悪臭原因物質に対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定すること；及び
   測定された応答に基づいて前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を抑制する試験物質が、悪臭抑制素材の候補物質であると同定すること、
   を含み、
   前記の悪臭が、スカトール臭、インドール臭、α－ターピネオール臭、４－ターピネオール臭、又はｐ－メチルアセトフェノン臭である、方法。
2. 前記の悪臭が、糞便臭、口臭、乳製品類由来の劣化臭、又は柑橘由来の劣化臭である請求項１記載の方法。
3. 前記の悪臭が、ヒトに不快感を与える化合物、組成物又は混合物による臭いである請求項１記載の方法。
4. 上記嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上、又は嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で悪臭原因物質に対する前記嗅覚受容体ポリペプチドの応答を測定する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 嗅覚受容体の応答を、レポータージーンアッセイあるいはカルシウムイメージングにより測定する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。