JP7750839B2 - ピロールイミダゾールポリアミド、ＴＧＦβ遺伝子発現抑制剤、医薬組成物 - Google Patents

ピロールイミダゾールポリアミド、ＴＧＦβ遺伝子発現抑制剤、医薬組成物

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Description

本発明は、ピロールイミダゾールポリアミド、ＴＧＦ－β遺伝子発現抑制剤、医薬組成物、及びピロールイミダゾールポリアミドの製造方法に関する。
本願は、２０２０年７月２０日に、日本に出願された特願２０２０－１２３９８８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
ピロールイミダゾールポリアミド（以下、「ＰＩポリアミド」ともいう）は、２本鎖ＤＮＡのマイナーグルーブに塩基配列特異的に強力に水素結合するマイナーグルーブバインダーである。ＰＩポリアミドを、標的遺伝子のプロモーターの転写制御領域に結合するように設計することにより、ＰＩポリアミドを用いて標的遺伝子の転写を抑制することができる。また、ＰＩポリアミドにアルキル化剤を結合することにより、塩基配列特異的に標的遺伝子発現を抑制することができる。ＰＩポリアミドは、脂質又はウイルスベクター等のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を用いることなく、生体内に分布して細胞に取り込まれ、核に結合し得る。この点で、ＰＩポリアミドは、通常の核酸医薬などのＤＮＡ認識化合物に対して優位性がある。ＰＩポリアミドは、様々な遺伝子をターゲットとして自由に分子設計できる。疾病で活性化した疾患遺伝子の転写活性を特異的に抑制することができるため、副作用が少ない。また、ＰＩポリアミドは、経口投与可能な遺伝子制御薬として使用できる可能性がある。そのため、これまでに、ＰＩポリアミドを用いた多くの創薬研究が行われてきた。
ＴＧＦ－β１は、進行性腎障害、肝硬変症、肺線維症等の線維性疾患の責任因子である。本発明者らは、ＴＧＦ－β１遺伝子プロモーターに結合して、ＴＧＦ－β１遺伝子発現を抑制するＰＩポリアミドを開発している（特許文献１）。
特許第４６８２３１２号公報
従来のＰＩポリアミドは、特定の１種の遺伝子のプロモーターを標的として設計されていた。したがって、従来のＰＩポリアミドは、１種の遺伝子の転写を制御することしかできなかった。しかしながら、例えば、２種以上の標的遺伝子の転写を同時に制御したい場合がある。
そこで、本発明は、２種以上の遺伝子の転写を同時に制御可能な、新規ピロールイミダゾールポリアミド、前記ピロールイミダゾールポリアミドを含む医薬組成物、及びピロールイミダゾールポリアミドの製造方法を提供することを目的とする。また、ＴＧＦ－β関連疾患又は線維性疾患の治療薬として有用な、ＨＧＦの発現を増加してＴＧＦ－βの発現を抑制する、ピロールイミダゾールポリアミド、並びに前記ピロールイミダゾールポリアミドを用いたＴＧＦ－β遺伝子発現抑制剤、及びＴＧＦ－β関連疾患又は線維性疾患を治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］２種以上の遺伝子のプロモーターに結合し、前記２種以上の遺伝子の転写を制御する、ピロールイミダゾールポリアミド。
［２］前記２種以上の遺伝子が、第１の遺伝子及び第２の遺伝子を含み、前記第１の遺伝子が、前記第２の遺伝子の発現制御因子をコードする遺伝子である、［１］に記載のピロールイミダゾールポリアミド。
［３］前記第１の遺伝子のプロモーターに結合し、前記第１の遺伝子のプロモーターへの転写制御因子の結合を阻害する、［２］に記載のピロールイミダゾールポリアミド。
［４］前記２種以上の遺伝子が、ＨＧＦ遺伝子と、ＴＧＦ－β遺伝子とを含む、［１］に記載のピロールイミダゾールポリアミド。
［５］前記ＨＧＦ遺伝子の転写を促進し、且つ前記ＴＧＦ－β遺伝子の転写を阻害する、［４］に記載のピロールイミダゾールポリアミド。
［６］前記ＨＧＦ遺伝子のプロモーターにおける転写抑制領域に結合する、［５］に記載のピロールイミダゾールポリアミド。
［７］前記ＨＧＦ遺伝子のプロモーターにおける、配列番号１に記載の塩基配列の少なくとも一部を含む領域に結合する、［６］に記載のピロールイミダゾールポリアミド。
［８］前記ＨＧＦ遺伝子のプロモーターにおける、下記配列１～３のいずれかを含む領域に結合する、［７］に記載のピロールイミダゾールポリアミド。
配列１：ＡＧＧＴＧＡＣ
配列２：ＡＣＣＴＴＴＴ
配列３：ＣＴＴＴＴＣＴ
［９］前記ＴＧＦ－β遺伝子のプロモーターにおける転写促進領域に結合する、［４］～［８］のいずれか１つに記載のピロールイミダゾールポリアミド。
［１０］下記式（Ｐ－３）、（Ｐ－５）又は（Ｐ－７）で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、１価の有機基を表す。Ｒ１及びＲ２は、相互に連結して２価の有機基を形成してもよい。］
［１１］下記式Ｈｕ－ＨＧＦ－３、Ｈｕ－ＨＧＦ－５又はＨｕ－ＨＧＦ－７で表される、［１０］に記載のピロールイミダゾールポリアミド。
［１２］［４］～［１１］のいずれか１つに記載のピロールイミダゾールポリアミドを含む、ＴＧＦ－β遺伝子発現抑制剤。
［１３］［１］～［１１］のいずれか１つに記載のピロールイミダゾールポリアミドを含む、医薬組成物。
［１４］［４］～［１１］のいずれか１つに記載のピロールイミダゾールポリアミドを含む、ＴＧＦ－β関連疾患を治療するための医薬組成物。
［１５］［４］～［１１］のいずれか１つに記載のピロールイミダゾールポリアミドを含む、線維性疾患を治療するための医薬組成物。
［１６］（ａ）２種以上の遺伝子のプロモーターに結合するピロールイミダゾールポリアミドを設計する工程と、（ｂ）前記ピロールイミダゾールポリアミドを合成する工程と、（ｃ）前記合成されたピロールイミダゾールポリアミドのうち、前記２種以上の遺伝子の転写を制御するピロールイミダゾールポリアミドを選択する工程と、を含む、ピロールイミダゾールポリアミドの製造方法。
本発明によれば、２種以上の遺伝子の転写を同時に制御可能な、新規ピロールイミダゾールポリアミド、前記ピロールイミダゾールポリアミドを含む医薬組成物、及びピロールイミダゾールポリアミドの製造方法が提供される。また、ＴＧＦ－β関連疾患又は線維性疾患の治療薬として有用なＨＧＦの発現を増加してＴＧＦ－βの発現を抑制する、ピロールイミダゾールポリアミド、並びに前記ピロールイミダゾールポリアミドを用いたＴＧＦ－β遺伝子発現抑制剤、及びＴＧＦ－β関連疾患又は線維性疾患を治療するための医薬組成物が提供される。
ＨＧＦとＴＧＦ－βとの関係を説明する図である。 ヒトＨＧＦプロモーターの塩基配列を示す。下線部は、ＣＯＵＰ－ＴＦ１結合サイト（－１０８～－９６）を示す。 ＣＯＵＰ－ＴＦ１結合サイト周辺を標的とする２種のＰＩポリアミド（Ｈｕ－ＨＧＦ－１、Ｈｕ－ＨＧＦ－２）の設計を示す。下線部は、ＣＯＵＰ－ＴＦ１結合サイトを示す。Ｐｙ：Ｎ－メチルピロール単位；Ｉｍ：Ｎ－メチルイミダゾール単位；β：βアラニン単位；Ａｃ：アセチル基；Ｄｐ：ジメチルアミノプロピル基。 ＣＯＵＰ－ＴＦ１結合サイト周辺を標的とする４種のＰＩポリアミド（Ｈｕ－ＨＧＦ－３、Ｈｕ－ＨＧＦ－４、Ｈｕ－ＨＧＦ－５、Ｈｕ－ＨＧＦ－６）の設計を示す。下線部は、ＣＯＵＰ－ＴＦ１結合サイトを示す。 ＣＯＵＰ－ＴＦ１結合サイト周辺を標的とする２種のＰＩポリアミド（Ｈｕ－ＨＧＦ－７、Ｈｕ－ＨＧＦ－８）の設計を示す。下線部は、ＣＯＵＰ－ＴＦ１結合サイトを示す。 Ｈｕ－ＨＧＦ－３の構造を示す。 Ｈｕ－ＨＧＦ－５の構造を示す。 Ｈｕ－ＨＧＦ－７の構造を示す。 ヒトＴＧＦ－β１プロモーターの塩基配列を示す。「＋１」は転写開始点を示す。下線部は転写因子結合サイトを示す。点線部は予想される転写因子結合サイトを示す。実線で囲んだ配列はＨｕ－ＨＧＦ－３の結合サイトを示す。破線で囲んだ配列はＨｕ－ＨＧＦ－７結合サイトを示す。 Ｈｕ－ＨＧＦ－３結合サイト及びＨｕ－ＨＧＦ－７結合サイト周辺のヒトＴＧＦ－β１プロモーターを示す。実線で囲んだ配列はＨｕ－ＨＧＦ－３の結合サイトを示す。破線で囲んだ配列はＨｕ－ＨＧＦ－７結合サイトを示す。破線部は転写因子結合予測サイトを示す。 ＰＩポリアミドのＨＧＦプロモーターに対するゲルシフトアッセイの結果を示す。ＰＩポリアミドとしてＨｕ－ＨＧＦ－１及びＨｕ－ＨＧＦ－２を用いた。 ＰＩポリアミドのＨＧＦプロモーターに対するゲルシフトアッセイの結果を示す。ＰＩポリアミドとしてＨｕ－ＨＧＦ－３及びＨｕ－ＨＧＦ－４を用いた。 ＰＩポリアミドのＨＧＦプロモーターに対するゲルシフトアッセイの結果を示す。ＰＩポリアミドとしてＨｕ－ＨＧＦ－５及びＨｕ－ＨＧＦ－６を用いた。 ＨＧＦ発現量解析及びＴＧＦ－β１発現量解析の試験プロトコールの概要を示す。「ＴＧＦ－β１発現解析の場合」と示す操作は、ＴＧＦ－β１発現解析の場合にのみ行った。 Ｈｕ－ＨＧＦ－３がＨＧＦのｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。 Ｈｕ－ＨＧＦ－５がＨＧＦのｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。 Ｈｕ－ＨＧＦ－７がＨＧＦのｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。 Ｈｕ－ＨＧＦ－３がＴＧＦ－β１のｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。 Ｈｕ－ＨＧＦ－５がＴＧＦ－β１のｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。 Ｈｕ－ＨＧＦ－７がＴＧＦ－β１のｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を示す。ＨＧＦ細胞を用いた。 Ｈｕ－ＨＧＦ－５がＴＧＦ－β１のｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を示す。ＭＣ細胞を用いた。 Ｈｕ－ＨＧＦ－３がＨＧＦタンパク質発現量に及ぼす影響を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。 Ｈｕ－ＨＧＦ－５がＨＧＦタンパク質発現量に及ぼす影響を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。 Ｈｕ－ＨＧＦ－７がＨＧＦタンパク質発現量に及ぼす影響を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。 Ｈｕ－ＨＧＦ－３がＴＧＦ－β１タンパク質発現量に及ぼす影響を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。 Ｈｕ－ＨＧＦ－５がＴＧＦ－β１タンパク質発現量に及ぼす影響を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。 Ｈｕ－ＨＧＦ－７がＴＧＦ－β１タンパク質発現量に及ぼす影響を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。 ＨＧＦ ｓｉＲＮＡの存在下で、Ｈｕ－ＨＧＦ－３がＴＧＦ－β１タンパク質発現量に及ぼす影響を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。＃は、「１ ＤＭＳＯ」に対する有意差検定の結果を示す（＃ ｐ＜０．０５）。＊は、「２ ＤＭＳＯ＋ＰＭＡ＋ＨＧＦ ｓｉＲＮＡ」に対する有意差検定の結果を示す（＊：ｐ＜０．０５）。 ＨＧＦ ｓｉＲＮＡの存在下で、Ｈｕ－ＨＧＦ－６がＴＧＦ－β１タンパク質発現量に及ぼす影響を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。＊＊及び＊＊＊は、「２ ＤＭＳＯ＋ＰＭＡ＋ＨＧＦ ｓｉＲＮＡ」に対する有意差検定の結果を示す（＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。 ミスマッチのＰＩポリアミド（ＨＧＦ ｍｉｓｍａｔｃｈ）を用いたＴＧＦ－β１のｍＲＮＡ発現試験の結果を示す。ＨＤＦ細胞を用いた。
［ピロールイミダゾールポリアミド（ＰＩポリアミド）］
一態様において、本発明は、２種以上の遺伝子のプロモーター領域に結合し、前記２種以上の遺伝子の転写を制御する、ピロールイミダゾールポリアミドを提供する。
ＰＩポリアミドは、Ｎ－メチルピロール単位（Ｐｙ）及びＮ－メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）を有するポリアミドであり、ＰｙとＩｍとはアミド結合（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）で連結される。ＰＩポリアミドは、一般的に、リンカー部分（例えば、γ－アミノ酪酸リンカー）を有し、リンカー部分により全体が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションを取る。Ｕ字型のコンフォメーションにおいては、リンカー部分を挟んでＰｙとＩｍとを含む２本の鎖が並列に並ぶ。この２本鎖における特定の対の組合せがＤＮＡの特定の塩基対に高い親和性で結合する。これにより、ＰＩポリアミドは、ＤＮＡ二本鎖のマイナーグルーブに入り込み、配列特異的にＤＮＡ二本鎖に結合する。
ＰＩポリアミドは、Ｐｙ／Ｉｍ対がＣ－Ｇ塩基対に結合し、Ｉｍ／Ｐｙ対がＧ－Ｃ塩基対に結合し、Ｐｙ／Ｐｙ対がＡ－Ｔ塩基対若しくはＴ－Ａ塩基対に結合する。ＰＩポリアミドは、３－ヒドロキシピロール単位（Ｈｐ）及びβアラニン単位（β）を用いてもよい。Ｈｐ／Ｐｙ対はＴ－Ａ塩基対を認識し、Ｐｙ／Ｈｐ対はＡ－Ｔ塩基対を認識し、β／β対はＴ－Ａ塩基対若しくはＡ－Ｔ塩基対を認識し、β／Ｉｍ対はＣ－Ｇ塩基対を認識し、Ｉｍ／β対はＧ－Ｃ塩基対を認識し、β／Ｐｙ対及びＰｙ／β対はＴ－Ａ塩基対若しくはＡ－Ｔ塩基対を認識する。Ｐｙ、Ｉｍ、β、及びＨｐの組合せにより形成される対の構成、及び順序を適宜変更することにより、ＤＮＡの特定の塩基配列に結合するＰＩポリアミドを設計することができる。
ＰＩポリアミドを構成する、Ｐｙ、Ｉｍ、Ｈｐ及びβの組合せからなる対の数は、２個以上であれば特に限定されないが、３～１２個が好ましく、４～１０個がより好ましく、４～８個がさらに好ましい。ＰＩポリアミドが５個以上の対を有する場合、βを含む対を１個以上有することが好ましい。
Ｐｙ及びＩｍの１位の窒素に結合するメチル基は、水素原子又は炭素原子数２～１０の脂肪族炭化水素基に置換されてもよい。前記脂肪族炭化水素基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。前記脂肪族炭化水素基は、飽和であってもよく、不飽和であってもよい。前記脂肪族炭化水素基としては、アルキル基が好ましく、例えば、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられる。
ＰＩポリアミドのリンカー部分がγアミノ酪酸リンカーである場合、α位又はβ位に置換基を有していてもよい。例えば、α位がアミノ基で置換されたＮ－α－Ｎ－γ－ジアミノ酪酸リンカーであってもよく、β位がアミノ基で置換されたＮ－β－Ｎ－γ－ジアミノ酪酸リンカーであってもよい。前記アミノ基は、蛍光基、ビオチン等の分子で修飾されていてもよい。
ＰＩポリアミドの末端部には、種々の分子が導入されてもよい。ＰＩポリアミドの末端部に導入する分子は、特に限定されない。ＰＩポリアミドの末端部には、例えば、アミド結合を介して様々な分子を導入することができる。そのような分子としては、例えば、蛍光色素、ビオチン、アルキル化剤等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＰＩポリアミドのＮ末端部にはアセチル基が導入されてもよく、Ｃ末端部にはジメチルアミノプロピルアミノ基が導入されてもよい。
ＰＩポリアミドは、公知の方法で合成することができる。ＰＩポリアミドは、例えば、Ｆｍｏｃ（９－フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって製造することができる（国際公開第０３／０００６８３号）。固相Ｆｍｏｃ法によれば、ＰＩポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができる。そのため、種々の官能基を分子末端に導入してＰＩポリアミド誘導体を製造することができる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、及びこれらの誘導体等のＤＮＡに対してアルキル化能を有する化合物を、ＰＩポリアミドの末端に導入することもできる。固相Ｆｍｏｃ法は市販のタンパク（ペプチド）合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体（コンジュゲート）を合成することもできる。また、固相Ｆｍｏｃ法はｔ－ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物（酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む）の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡ若しくはＲＮＡ（又はそれらの誘導体）との共役体を自動的に合成することも可能である。
固相Ｆｍｏｃ法等によれば、末端にカルボキシ基を有するＰＩポリアミドを合成することができる。具体例としては、例えば、末端にβ－アラニン残基（β－アミノプロピオン酸残基）、又はγ－アミノ酪酸残基を有するＰＩポリアミド等が挙げられる。末端にβ－アラニン残基又はγ－アミノ酪酸残基を有するＰＩポリアミドは、例えば、それぞれＦｍｏｃでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β－アラニン又はγ－アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法により合成することができる。
アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、４－アミノ－２－ピロールカルボン酸、４－アミノ－１－メチル－２－ピロールカルボン酸、４－アミノ－１－エチル－２－ピロールカルボン酸、４－アミノ－１－プロピル－２－ピロールカルボン酸、４－アミノ－１－ブチル－２－ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、４－アミノ－２－イミダゾールカルボン酸、４－アミノ－１－メチル－２－イミダゾールカルボン酸、４－アミノ－１－エチル－２－イミダゾールカルボン酸、４－アミノ－１－プロピル－２－イミダゾールカルボン酸、４－アミノ－１－ブチル－２－イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。
固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、ＰＩポリアミドとＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）との共役体を合成することもできる。ＦＩＴＣは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られている。ＰＩポリアミドとＦＩＴＣとの共役体は、当該ＰＩポリアミドが特定のＤＮＡ配列を認識することを証明するために用いることができる。
本態様のＰＩポリアミドは、２種以上の遺伝子のプロモーターに結合し、前記２種以上の遺伝子の転写を制御する。従来、ＰＩポリアミドは、特定の１種の遺伝子の発現を制御することを目的として、前記特定の１種の遺伝子のプロモーターを標的として設計されていた。一方、本態様のＰＩポリアミドは、同時に２種以上の遺伝子の発現を制御するという全く新しいコンセプトに基づき設計される。本態様のＰＩポリアミドは、２種以上の遺伝子のプロモーターに結合するように設計される。２種以上の遺伝子のプロモーターに結合することで、１種類のＰＩポリアミドで、２種以上の遺伝子の転写を制御することが可能となる。本態様のＰＩポリアミドは、好ましくは、２種類の遺伝子のプロモーターにおいて、転写促進領域又は転写抑制領域に結合するように設計される。
本明細書において、「プロモーター」とは、遺伝子の上流に位置し、遺伝子の転写を調節する領域を意味する。
本明細書において、「転写促進領域」とは、遺伝子の上流に位置し、転写因子又は複合タンパク質等が結合することにより、遺伝子の転写が促進される領域を意味する。転写促進領域は、通常、プロモーターに存在し得る。
本明細書において、「転写抑制領域」とは、遺伝子の上流に位置し、転写因子又は複合タンパク質等が結合することにより、遺伝子の転写が抑制される領域を意味する。転写抑制領域は、通常、プロモーターに存在し得る。
本明細書において、転写促進領域及び転写抑制領域をまとめて「転写制御領域」という場合がある。
本明細書において、「転写制御因子」とは、特定の遺伝子の転写促進領域又は転写抑制領域に結合し、当該遺伝子の転写を促進又は抑制するタンパク質（転写因子、複合タンパク質等を含む）を意味する。
本明細書において、「発現制御因子」とは、特定の遺伝子の発現を促進又は抑制するタンパク質（転写因子、複合タンパク質等を含む）を意味する。発現制御因子は、当該タンパク質の存在により、前記特定の遺伝子の発現が上方制御又は下方制御されるタンパク質であればよく、転写制御因子を包含する。
プロモーターにおける転写促進領域に、転写制御因子が結合すると、遺伝子の転写が開始又は促進される。プロモーターにおける転写抑制領域に転写制御因子が結合すると、遺伝子の転写が抑制される。そのため、プロモーターにおける転写促進領域への転写制御因子の結合を阻害することにより、遺伝子の転写を阻害することができる。また、プロモーターにおける転写抑制領域への転写制御因子の結合を阻害することにより、遺伝子の転写を促進することができる。したがって、ＰＩポリアミドが、プロモーターにおける転写促進領域に結合すると、転写促進領域への転写制御因子の結合が阻害され、遺伝子の発現が阻害される。ＰＩポリアミドが、プロモーターにおける転写抑制領域に結合すると、転写抑制領域への転写制御因子の結合が阻害され、遺伝子の発現が開始又は促進される。
本明細書において、「遺伝子の転写を制御する」とは、遺伝子の転写活性を変化させることをいう。転写の制御は、上方制御であってもよく、下方制御であってもよい。ＰＩポリアミドが、プロモーターにおける転写促進領域に結合すると、転写促進領域への転写制御因子の結合が阻害され、遺伝子の発現が下方制御される。ＰＩポリアミドが、プロモーターにおける転写抑制領域に結合すると、転写抑制領域への転写制御因子の結合が阻害され、遺伝子の発現が上方制御される。
２種以上の遺伝子のプロモーターに結合するＰＩポリアミドの設計は、例えば、以下のように行うことができる。
まず、ＰＩポリアミドの標的とする２種以上の遺伝子を選択する。２種以上の遺伝子は、目的に応じて、任意に選択することができる。２種以上の遺伝子としては、例えば、特定疾患において発現亢進又は発現低下する２種以上の遺伝子の組合せ；特定疾患において発現亢進する遺伝子と、前記特定疾患において発現低下する遺伝子との組み合わせ等が挙げられる。
例えば、がんでは、がん特異的に発現亢進するがん遺伝子の存在が知られている。がん特異的に発現亢進する遺伝子としては、例えば、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ８、ＣＬＬ－１、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＡ，ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＨＥＲ２、ＭＡＧＥ、ｐ５３等が挙げられる。ＰＩポリアミドががん治療を目的とする場合、これらがん遺伝子の２種以上を標的遺伝子として選択してもよい。あるいは、免疫チェックポイント分子の遺伝子（ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４等）と、がん遺伝子とを２種以上の標的遺伝子として選択してもよい。
特定疾患において発現亢進する遺伝子と、前記特定疾患において発現低下する遺伝子との組み合わせとしては、例えば、ＴＧＦ－β遺伝子と、ＨＧＦ遺伝子との組合せ等が挙げられる。
次いで、２種以上の標的遺伝子のプロモーター配列を解析し、転写促進領域、及び転写抑制領域を特定する。例えば、発現抑制する遺伝子については、転写促進領域を取得する。発現促進する遺伝子については、転写抑制領域を取得する。
次いで、２種以上の標的遺伝子のうちの１つの標的遺伝子について、取得した転写制御領域中の特定配列に結合するＰＩポリアミドを設計する。次いで、設計したＰＩポリアミドが、残りの標的遺伝子の転写制御領域に結合可能かを確認する。ＰＩポリアミドが、全ての標的遺伝子の転写制御領域に結合可能である場合には、そのＰＩポリアミドを選択する。
転写制御領域に結合可能ではない標的遺伝子が存在する場合、転写制御領域中の他の配列を選択し、ＰＩポリアミドを再設計する。再設計したＰＩポリアミドについて、残りの標的遺伝子の転写制御領域に結合可能かを確認する。以下、全ての標的遺伝子の転写制御領域に結合可能なＰＩポリアミドが取得できるまで、上記のステップを繰り返す。
上記のようにして、２種以上の遺伝子の転写制御領域に結合するＰＩポリアミドを取得することができる。
取得したＰＩポリアミドが、２種以上の遺伝子の転写制御領域に結合し、所望の発現制御機能を発揮することは、取得したＰＩポリアミドの存在下で、標的遺伝子を有する細胞を培養することにより確認することができる。
ＰＩポリアミドの標的遺伝子の数は、特に限定されないが、例えば、２～５個、２～４個、２～３個、又は２個である。
一実施形態において、ＰＩポリアミドは、第１の遺伝子及び第２の遺伝子の両方の遺伝子の転写を制御することができる。一実施形態において、第１の遺伝子は、第２の遺伝子の転写制御因子をコードする遺伝子である。
第１の遺伝子が、第２の遺伝子の発現を抑制する発現制御因子である場合、ＰＩポリアミドにより第１の遺伝子の転写を促進し、且つ第２の遺伝子の転写を阻害することにより、第２の遺伝子の転写をより強力に抑制することができる。この場合、ＰＩポリアミドは、第１の遺伝子のプロモーターにおける転写抑制領域に結合することが好ましい。また、ＰＩポリアミドは、第２の遺伝子のプロモーターにおける転写促進領域に結合することが好ましい。
また、第１の遺伝子が、第２の遺伝子の発現を抑制する発現制御因子である場合、ＰＩポリアミドにより第１の遺伝子の転写を抑制し、且つ第２の遺伝子の転写を促進することにより、より強力に第２の遺伝子の転写を促進することができる。この場合、ＰＩポリアミドは、第１の遺伝子のプロモーターにおける転写促進領域に結合することが好ましい。また、ＰＩポリアミドは、第２の遺伝子のプロモーターにおける転写抑制領域に結合することが好ましい。
第１の遺伝子が、第２の遺伝子の発現を促進する発現制御因子である場合、ＰＩポリアミドにより第１の遺伝子の転写を促進し、且つ第２の遺伝子の転写を促進することにより、第２の遺伝子の転写をより強力に促進することができる。この場合、ＰＩポリアミドは、第１の遺伝子のプロモーターにおける転写抑制領域に結合することが好ましい。また、ＰＩポリアミドは、第２の遺伝子のプロモーターにおける転写抑制領域に結合することが好ましい。
また、第１の遺伝子が、第２の遺伝子の発現を促進する発現制御因子である場合、ＰＩポリアミドにより第１の遺伝子の転写を抑制し、且つ第２の遺伝子の転写を抑制することにより、より強力に第２の遺伝子の転写を抑制することができる。この場合、ＰＩポリアミドは、第１の遺伝子のプロモーターにおける転写促進領域に結合することが好ましい。また、ＰＩポリアミドは、第２の遺伝子のプロモーターにおける転写促進領域に結合することが好ましい。
第１の遺伝子及び第２の遺伝子は特に限定されず、任意のものを用いることができる。第１の遺伝子及び第２の遺伝子の組合せとしては、例えば、上記２種以上の標的遺伝子の組合せとして挙げたものから目的に応じて任意の組合せを選択してもよい。第１の遺伝子としては、例えば、ＨＧＦ遺伝子が挙げられる。第２の遺伝子としては、例えば、ＴＧＦ－β遺伝子が挙げられる。
第１の遺伝子がＨＧＦ遺伝子であり、第２の遺伝子がＴＧＦ－β遺伝子である場合、ＰＩポリアミドは、ＨＧＦ遺伝子の転写を促進し、且つＴＧＦ－β遺伝子の転写を阻害する機能を有することが好ましい。以下、第１の遺伝子がＨＧＦ遺伝子であり、第２の遺伝子がＴＧＦ－βであるＰＩポリアミドを「ＰＩポリアミド（Ｐ）」という場合がある。
図１は、ＨＧＦとＴＧＦ－βとの関係を説明する図である。ＴＧＦ－βは、線維芽細胞活性化、メサンギウム細胞活性化、及び上皮間葉転換等の作用を有し、組織の線維化を進行させる。ＨＧＦは血管新生作用、抗アポトーシス作用、抗線維化作用を示し、ＴＧＦ－βの発現抑制作用を有する。そのため、ＨＧＦの発現量を増加させることにより、ＴＧＦ－βの発現量が抑制され、線維化の進行が抑制される。
ＰＩポリアミド（Ｐ）は、ＨＧＦ遺伝子の転写を促進するとともに、ＴＧＦ－β遺伝子の転写を阻害する。ＨＧＦ遺伝子の転写促進によりＨＧＦ発現量が増加すると、ＨＧＦによるＴＧＦ－βの発現抑制作用が強くなる。さらに、ＰＩポリアミド（Ｐ）は、ＴＧＦ－β遺伝子の転写を直接的に阻害するため、ＨＧＦによるＴＧＦ－β発現抑制作用との相加効果により、ＴＧＦ－βタンパク質発現を強く抑制する。そのため、ＰＩポリアミド（Ｐ）によれば、ＴＧＦ－βによる線維化の進行を効率的に抑制することができる。
ＰＩポリアミド（Ｐ）は、ＨＧＦ遺伝子の転写促進によるＨＧＦを介したＴＧＦ－βの発現抑制機構（以下、「発現抑制機構１」ともいう）、及びＴＧＦ－β遺伝子の転写阻害によるＴＧＦ－βの発現抑制機構（以下、「発現抑制機構２」ともいう）の２通りの発現抑制機構により、ＴＧＦ－βの発現を抑制し得る。そのため、ＰＩポリアミド（Ｐ）は、発現抑制機構２のみでＴＧＦ－β発現を抑制する従来のＰＩポリアミドと比較して、より低濃度でＴＧＦ－βの発現を抑制することが可能である。
ＰＩポリアミド（Ｐ）は、ＨＧＦ遺伝子のプロモーター（以下、「ＨＧＦプロモーター」ともいう）における転写抑制領域に結合することにより、ＨＧＦプロモーターにおける転写抑制領域への転写制御因子の結合を阻害することが好ましい。ＨＧＦプロモーターにおける転写抑制領域に対する転写制御因子の結合を阻害することにより、転写抑制領域への転写制御因子の結合によるＨＧＦ遺伝子の転写抑制が生じない。そのため、ＨＧＦ遺伝子の転写が促進される。
ＰＩポリアミド（Ｐ）は、ＨＧＦプロモーターにおける、配列番号１に記載の塩基配列（ＡＧＧＴＧＡＣＣＴＴＴＴＣ）の少なくとも一部を含む領域に結合することが好ましい。配列番号１に記載の塩基配列は、ヒトＨＧＦプロモーターの解析により、ＣＯＵＰ－ＴＦ１の結合サイトとして予測された配列である。ＣＯＵＰ－ＴＦ１の結合サイトは、多くの場合、転写抑制領域であることが報告されている。ＣＯＵＰ－ＴＦ１は、多くの場合、前記結合サイトへの結合により転写抑制因子として働くことが報告されている。
ＨＧＦプロモーターにおいて、ＰＩポリアミド（Ｐ）が結合する配列の具体例としては、例えば、下記配列１～３のいずれかを含む領域が挙げられる。後述の実施例で示すように、下記配列１～３に結合するように設計されたＰＩポリアミド（Ｈｕ－ＨＧＦ－３、Ｈｕ－ＨＧＦ－５、Ｈｕ－ＨＧＦ－７）は、ＴＧＦ－β１の発現を効果的に抑制することができる。
配列１：ＡＧＧＴＧＡＣ
配列２：ＡＣＣＴＴＴＴ
配列３：ＣＴＴＴＴＣＴ
ＰＩポリアミド（Ｐ）は、ＴＧＦ－β遺伝子のプロモーター（以下、「ＴＧＦ－βプロモーター」という）における転写抑制領域に結合することにより、ＴＧＦ－β遺伝子の転写を阻害することが好ましい。好ましくは、ＰＩポリアミド（Ｐ）は、ＴＧＦ－βプロモーターにおける転写抑制領域への転写制御因子の結合を阻害することにより、ＴＧＦ－β遺伝子の転写を阻害する。ＴＧＦ－βは、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３のいずれであってもよいが、ＴＧＦ－β１であることが好ましい。ＰＩポリアミド（Ｐ）は、ＴＧＦ－βプロモーターの周辺領域に結合することにより、ＴＧＦ－βプロモーターの立体構造を変化させ、ＴＧＦ－βプロモーターにおける転写抑制領域への転写制御因子の結合を阻害するものであってもよい。
ＰＩポリアミド（Ｐ）の好適な例を以下に挙げる。
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、１価の有機基を表す。Ｒ１及びＲ２は、相互に連結して２価の有機基を形成してもよい。］
前記式（Ｐ－３）、（Ｐ－５）及び（Ｐ－７）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、１価の有機基を表す。Ｒ１及びＲ２は、特に限定されず、任意の有機基とすることができる。Ｒ１及びＲ２には、例えば、アミド結合を介して、任意の分子を導入してもよい。導入分子としては、上記ＰＩポリアミド末端への導入分子として挙げたもの等が挙げられる。
Ｒ１は、例えば、－ＮＨＣＯ－Ｒ１１（Ｒ１１は１価の有機基）で表される基であってもよい。Ｒ１１は、特に限定されないが、例えば、脂肪族炭化水素基が挙げられる。前記脂肪族炭化水素基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、環状であってもよい。前記脂肪族炭化水素基は、飽和であってもよく、不飽和であってもよい。前記脂肪族炭化水素基の炭素原子数としては、例えば、炭素原子数１～１０、炭素原子数１～５、炭素原子数１～３、炭素原子数１又は２等が挙げられる。前記Ｒ１１としては、アルキル基が好ましく、例えば、メチル基又はエチル基が挙げられる。
Ｒ２は、例えば、－ＣＯＮＨ－Ｒ２１（Ｒ２１は１価の有機基）で表される基であってもよい。Ｒ２１は、特に限定されないが、例えば、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基が挙げられる。前記脂肪族炭化水素基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、環状であってもよい。前記脂肪族炭化水素基は、飽和であってもよく、不飽和であってもよい。前記脂肪族炭化水素基の炭素原子数としては、例えば、炭素原子数１～１５、炭素原子数１～１０、又は炭素原子数１～６等が挙げられる。前記脂肪族炭化水素基が有していてもよい置換基としては、例えば、アミノ基、ヒドロキシ基、及びカルボキシ基等が挙げられるが、これらに限定されない。前記脂肪族炭化水素基は、炭素鎖を構成する炭素原子の一部が、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－等で置換されたものであってもよい。Ｒ２１は、－β－Ｒ２２（βはβアラニン単位；Ｒ２２は１価の有機基）で表される基であってもよい。Ｒ２２は、特に限定されないが、例えば、置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基が挙げられる。前記置換基を有していてもよい脂肪族炭化水素基としては、Ｒ２１で挙げたものと同様のものが挙げられる。Ｒ２２のとしては、例えば、ジメチルアミノアルキル基、アミノアルキル基等が挙げられる。Ｒ２２の具体例としては、例えば、ジメチルアミノプロピル基、アミノプロピル基等が挙げられる。
Ｒ１及びＲ２は、相互に連結して２価の有機基を形成してもよい。この場合、式（Ｐ－３）、（Ｐ－５）又は（Ｐ－７）で表されるＰＩポリアミドは、環状構造を形成する。環状構造のペプチドは、経口投与に適していることが知られている（舛屋 圭一，日薬理誌，１４８．３２２～３２８（２０１６））。また、ＰＩポリアミドを環状構造としても、ＰＩポリアミドの結合特性は大きく変化しないことが報告されている（David M. Chenoweth, J Am Chem Soc. 2009 May 27; 131(20): 7182-7188.）。そのため、環状構造のＰＩポリアミドは、経口投与薬として有望である。
上記式（Ｐ－３）、（Ｐ－５）、又は（Ｐ－７）で表されるＰＩポリアミド（Ｐ）の具体例を以下に挙げる。
［ＴＧＦ－β遺伝子発現抑制剤］
一態様において、本発明は、ＰＩポリアミド（Ｐ）を含む、ＴＧＦ－β遺伝子発現抑制剤を提供する。
ＰＩポリアミド（Ｐ）は、上記のように、ＴＧＦ－β遺伝子発現を効果的に抑制することができる。そのため、ＰＩポリアミド（Ｐ）は、ＴＧＦ－β遺伝子発現抑制剤として用いることができる。
本明細書において、「遺伝子発現」とは、遺伝子の転写及び翻訳により、当該遺伝子がコードするタンパク質が生成されることを意味する。「遺伝子発現抑制剤」は、当該遺伝子がコードするタンパク質の生成を抑制する作用を有する薬剤を意味する。
本態様のＴＧＦ－β遺伝子発現抑制剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで用いてもよく、ｉｎ ｖｉｖｏで用いてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏで用いる場合、好ましくはヒト細胞又はコモンマーモセット細胞に用いられる。ｉｎ ｖｉｖｏで用いる場合、好ましくは、ヒト又はコモンマーモセットに投与される。ｉｎ ｖｉｖｏで用いる場合、後述の医薬組成物として製剤化してもよい。
［医薬組成物］
一態様において、本発明は、前記ＰＩポリアミドを含む、医薬組成物を提供する。
前記態様のＰＩポリアミドは、２種以上の標的遺伝子の転写を制御することができるため、遺伝子発現異常を伴う疾患を治療するための医薬組成物として用いることができる。２種以上の標的遺伝子は、治療目的とする疾患に応じて、適宜選択することができる。
一態様において、本発明は、ＰＩポリアミド（Ｐ）を含む、ＴＧＦ－β関連疾患を治療するための医薬組成物を提供する。
一態様において、本発明は、ＰＩポリアミド（Ｐ）を含む、線維性疾患を治療するための医薬組成物を提供する。
本明細書において、「ＴＧＦ－β関連疾患」とは、ＴＧＦ－βの増加に起因して生じる疾患を意味する。ＴＧＦ－β関連疾患としては、例えば、線維性疾患、各種腎疾患、及び男性型前頭部脱毛等が挙げられるが、これらに限定されない。「線維性疾患」とは、組織又は器官の線維化に伴って発生する疾患を意味する。線維性疾患は、特に限定されないが、例えば、肝硬変、肺線維症、腎線維症、膵線維症、心筋線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腸間膜線維症、乳腺線維症、嚢胞性線維症、消化管線維症、脂肪組織線維症、全身性強皮症、限局性強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、皮膚創傷後または皮膚潰瘍後の瘢痕、皮膚線維症等が挙げられるが、これらに限定されない。線維性疾患としては、好ましくは、後述の各種肝疾患、各種腎疾患、膵線維症、心筋線維症、各種皮膚繊維化疾患等が挙げられる。
肝臓の繊維化の過程で、肝星細胞は細胞外マトリックス産生において重要な役割を果たしている（Bataller R et al,Gastroenterology 118,1149,2000）。星細胞の活性化はＴＧＦ－β１により行われ、更に活性化星細胞により、傷害肝では炎症細胞からのＴＧＦ－β１の分泌が引き起こされる。同時に活性化星細胞のＴＧＦ－β１受容体発現が亢進し、ＴＧＦ－β１によるオートクライン機序により細胞外基質蛋白を増加させる（渡辺久剛ら、現代医療、第３５巻（第２号）、２００３年）。これらの事実から、上記の各種肝疾患は、ＴＧＦ－β関連疾患として例示できる。
また、ＩｇＡ腎症、巣状糸球体硬化症、半月体形成性腎炎、巣状硬化型ループス腎炎、びまん性増殖性ループス腎炎、糖尿病性腎症、高血圧性腎硬化症等の腎疾患のモデル動物、又は糸球体腎炎や糖尿病性腎症患者の腎生検組織でＴＧＦ－βの発現が細胞外基質と並行して増加している（Yamamoto T et al:Kidney Int 49:461,1996、Border WA et al:Kidney Int 51:1388,1997）。また同時にBorderらは、抗ＴＧＦ－βをＴｈｙ－１腎炎ラットに投与すると、腎糸球体の細胞外基質の蓄積を抑制することを報告した（Border WA et al:Kidney Int 51:1388,1997）。これらの事実から、上記の各種腎疾患は、ＴＧＦ－β関連疾患として例示できる。
また、動物の心筋梗塞モデルにおいては、瘢痕形成期の梗塞巣で、ＴＧＦ－βの発現が持続的に亢進し、心筋繊維化の促進に関与している（Ono et al:Circulation 98:149,1998）。これらの事実から、心筋梗塞後の心筋繊維化は、ＴＧＦ－β関連疾患として例示できる。
また、肺繊維症モデル動物に抗ＴＧＦ－β抗体やＴＧＦ－β可溶性レセプターを投与することにより肺繊維症が改善する（Giri SN al:Thorax 1993）。これらの事実から、肺繊維症は、ＴＧＦ－β関連疾患として例示できる。
また、ヒト慢性膵炎におけるＴＧＦ－β１の高発現については多数報告されているが、再発性急性膵炎のモデル動物に組換えＴＧＦ－βを投与すると、膵の炎症部分の繊維化やフィブロネクチンｍＲＮＡの高発現を引き起こし、逆に膵炎のモデル作製時にＴＧＦ－β１の中和抗体を投与すると、細胞外マトリックスの産生及びＩ・ＩＩＩ型コラーゲンやフィブロネクチンのｍＲＮＡ発現が抑制されることが明らかにされている（槙野 直彦他：現代医療Vol.35,No.2,2003）。これらの事実から、慢性膵炎における線維化は、ＴＧＦ－β関連疾患として例示できる。
また、強皮症の原因としＴＧＦ－βが提唱され、森らは皮膚繊維化モデルマウスにおいて、ＴＧＦ－βが皮膚繊維化を誘導することを報告した（Mori et al:J Cell Physiol 181:153,1999）。これらの事実から、各種皮膚繊維化疾患は、ＴＧＦ－β関連疾患として例示できる。
また、骨髄繊維症の患者の巨核球ではＴＧＦ－β ｍＲＮＡの発現が亢進しており（Reilly J et al:Clin Haematol:11751-767,1998）、血小板内ＴＧＦ－β濃度は高値（Martyre M C et al:Br J Haematol 77:80-86,991）で、患者の血漿中ＴＧＦ－β濃度は有意に高い（Rameshwar P et al:Am J Haematol 59:133-142,1998）と報告されている。Ｒａｍｅｓｈｗａｒらによると骨髄繊維症の患者の単球は粘着によってＮＦ－ｋが活性化してＩＬ－１産生を誘導し、ＩＬ－１はＴＧＦ－β産生を亢進させて骨髄の繊維化を惹起している（Rameshwar et al:J Immunol 165:2271-2277,2000）。これらの事実から、骨髄繊維症は、ＴＧＦ－β関連疾患として例示できる。
また、男性型前頭部脱毛患者の培養細胞系において、男性ホルモンが皮膚乳頭細胞からのＴＧＦ－β１を誘導し、このＴＧＦ－β１が表皮細胞増殖を抑制することが報告されている（Shigeki et al:FASEB J 16:1967-1969,2002）。これらの事実から、男性型前頭部脱毛は、ＴＧＦ－β関連疾患として例示できる。
本態様の医薬組成物の投与対象は、ヒトであることが好ましい。本態様の医薬組成物は、好ましくは、ヒト又はコモンマーモセットに投与される。本態様の医薬組成物をヒトに投与する場合、本態様の医薬組成物の効果は霊長類を用いた動物実験により確認することができる。霊長類としては、コモンマーモセットを好適に用いることができる。
本態様の医薬組成物は、ＰＩポリアミドに加えて、任意成分を含有していてもよい。前記任意成分としては、例えば、薬物的に許容される担体が挙げられる。「薬学的に許容される担体」とは、有効成分の生理活性を阻害せず、且つ、その投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体を意味する。「実質的な毒性を示さない」とは、その成分が通常使用される投与量において、投与対象に対して毒性を示さないことを意味する。本態様の医薬組成物においては、薬学的に許容される担体は、ＰＩポリアミドの標的遺伝子のプロモーターへの結合を阻害せず、且つその投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体である。ＰＩポリアミドがＰＩポリアミド（Ｐ）である場合、薬学的に許容される担体は、ＰＩポリアミド（Ｐ）のＨＧＦ遺伝子転写促進能及びＴＧＦ－β遺伝子転写阻害能を阻害せず、且つその投与対象に対して実質的な毒性を示さない担体である。薬学的に許容される担体は、典型的には非活性成分とみなされる、公知のあらゆる薬学的に許容され得る成分を包含する。薬学的に許容される担体は、特に限定されないが、例えば、溶媒、希釈剤、ビヒクル、賦形剤、流動促進剤、結合剤、造粒剤、分散化剤、懸濁化剤、湿潤剤、滑沢剤、崩壊剤、可溶化剤、安定剤、乳化剤、充填剤、保存剤（例えば、酸化防止剤）、キレート剤、矯味矯臭剤、甘味剤、増粘剤、緩衝剤、着色剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
本態様の医薬組成物は、薬学的に許容される担体以外の任意成分を含んでいてもよい。前記任意の成分は、特に限定されず、医薬分野において常用されるものを特に制限なく使用することができる。また、本態様の医薬組成物は、ＰＩポリアミド以外の活性成分を含んでいてもよい。活性成分としては、例えば、ビタミン類及びその誘導体類、消炎剤、抗炎症剤、血行促進剤、刺激剤、ホルモン類、刺激緩和剤、鎮痛剤、細胞賦活剤、植物・動物・微生物エキス、鎮痒剤、消炎鎮痛剤、抗真菌剤、抗ヒスタミン剤、催眠鎮静剤、精神安定剤、抗高血圧剤、降圧利尿剤、抗生物質、麻酔剤、抗菌性物質、抗てんかん剤、冠血管拡張剤、生薬、止痒剤、角質軟化剥離剤等が挙げられるが、これらに限定されない。他の成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
本態様の医薬組成物の剤型は、特に制限されず、医薬品製剤として一般的に用いられる剤型とすることができる。本態様の医薬組成物は、経口製剤であってもよく、非経口製剤であってもよい。経口製剤としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、細粒剤、液剤、ドロップ愛、乳剤等が例示される。非経口製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、軟膏、スプレー剤、外用液剤、点耳剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤等が例示される。これらの剤型の医薬組成物は、定法（例えば、日本薬局方記載の方法）に従って、製剤化することができる。
本態様の医薬組成物の投与経路は、特に限定されず、経口又は非経口経路で投与することができる。非経口経路は、経口以外の全ての投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、点眼、脳内、直腸内、腟内及び腹腔内等への投与を包含する。投与は、局所投与であっても全身投与であってもよい。本態様の医薬組成物の好ましい投与経路としては、例えば、静脈注射、又は筋肉注射が挙げられる。経口投与を行う場合には、本態様の医薬組成物が含有するＰＩポリアミド（Ｐ）が環状構造であることが好ましい。
本態様の医薬組成物は、ＰＩポリアミドの治療的有効量を投与することができる。「治療的有効量」とは、対象疾患の治療又は予防のために有効な薬剤の量を意味する。例えば、ＰＩポリアミド（Ｐ）の治療的有効量は、ＴＧＦ－β関連疾患又は線維性疾患の発症及び／又は進行を遅らせることができる量であり得る。治療的有効量は、患者の症状、体重、年齢、及び性別等、並びに医薬組成物の剤型、及び投与方法等によって適宜決定すればよい。例えば、本態様の医薬組成物は、ＰＩポリアミドの１回の投与量として、投与対象の体重１ｋｇあたり、０．００１～１０００ｍｇとすることができる。前記投与量は、０．０１～８００ｍｇ／ｋｇであってもよく、０．１～５００ｍｇ／ｋｇであってもよく、１～１００ｍｇ／ｋｇであってもよく、１～５０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
本態様の医薬組成物は、単位投与形態あたり、治療的有効量のＰＩポリアミドを含んでいてもよい。例えば、本態様の医薬組成物におけるＰＩポリアミドの含有量は、０．０１～９０質量％であってもよく、０．１～８０質量％であってもよく、１～５０質量％であってもよい。
本態様の医薬組成物の投与間隔は、患者の症状、体重、年齢、及び性別等、並びに医薬組成物の剤型、及び投与方法等によって適宜決定すればよい。投与間隔は、例えば、数時間毎、１日１回、２～３日に１回、１週間に１回等とすることができる。
本態様の医薬組成物は、他の医薬と併用して用いてもよい。例えば、他の線維性疾患治療薬等と併用して用いることができる。
［ＰＩポリアミドの製造方法］
一態様において、本発明は、ピロールイミダゾールポリアミドの製造方法を提供する。本態様の方法は、（ａ）２種以上の遺伝子のプロモーターに結合するピロールイミダゾールポリアミドを設計する工程と、（ｂ）前記ピロールイミダゾールポリアミドを合成する工程と、（ｃ）前記合成されたピロールイミダゾールポリアミドのうち、前記２種以上の遺伝子の転写を制御するピロールイミダゾールポリアミドを選択する工程と、を含む。
＜工程（ａ）＞
工程（ａ）では、２種以上の遺伝子のプロモーターに結合するＰＩポリアミドを設計する。
工程（ａ）は、例えば、以下の（ｉ）～（ｉｖ）を含んでもよい。
（ｉ）ＰＩポリアミドの標的とする２種以上の遺伝子を選択する。
（ｉｉ）前記２種以上の遺伝子について、転写促進領域又は転写抑制領域を特定する。
（ｉｉｉ）前記２種以上の遺伝子のうち第１の遺伝子について、前記転写促進領域又は転写抑制領域に結合するＰＩポリアミドを設計する。
（ｉｖ）前記設計したＰＩポリアミドから、前記２種以上の遺伝子のうち第１の遺伝子以外の遺伝子の転写促進領域又は転写抑制領域に結合するＰＩポリアミドを選択する。
（ｉ）について：
ＰＩポリアミドの標的とする任意の２種以上の遺伝子を選択する。２種以上の遺伝子の組合せとしては、上記［ピロールイミダゾールポリアミド（ＰＩポリアミド）］の項で挙げた組合せ等が挙げられる。
（ｉｉ）について：
２種以上の遺伝子のそれぞれについて、プロモーター配列を解析し、転写促進領域又は転写抑制領域を特定する。例えば、発現抑制する遺伝子については、転写促進領域を取得する。発現促進する遺伝子については、転写抑制領域を取得する。
次いで、前記２種以上の標的遺伝子のプロモーター配列を解析し、転写促進領域、及び転写抑制領域を特定する。例えば、発現抑制する遺伝子については、転写促進領域を取得する。発現促進する遺伝子については、転写抑制領域を取得する。例えば、第１の遺伝子と第２の遺伝子のプロモーター配列を解析し、第１の遺伝子の転写促進領域若しくは転写抑制領域、及び、第２の遺伝子の転写促進領域若しくは転写抑制領域を特定する。
（ｉｉｉ）について：
前記２種以上の標的遺伝子のうち第１の遺伝子について、転写促進領域又は転写抑制領域に結合するＰＩポリアミドを設計する。第１の遺伝子の発現抑制を目的とする場合には、転写促進領域に結合するＰＩポリアミドを設計する。第１の遺伝子の発現促進を目的とする場合には、転写抑制領域に結合するＰＩポリアミドを設計する。このとき、複数のＰＩポリアミドを設計することが好ましい。複数のＰＩポリアミドを設計する方法としては、複数の転写促進領域又は転写抑制領域に対して、それぞれＰＩポリアミドを設計する方法；１つの転写促進領域又は転写抑制領域に対して、標的配列をずらして複数のＰＩポリアミドを設計する方法；及びこれらの組合せが挙げられる。
（ｉｖ）について：
（ｉｉｉ）で設計したＰＩポリアミドから、前記２種以上の標的遺伝子のうち第１の遺伝子以外の標的遺伝子の転写促進領域又は転写抑制領域に結合するＰＩポリアミドを選択する。例えば、（ｉｉｉ）で設計したＰＩポリアミドが結合し得る配列（以下、「候補ＰＩポリアミド結合配列」ともいう）を取得する。次いで、候補ＰＩポリアミド結合配列をクエリー配列として、第１の遺伝子以外の標的遺伝子の転写促進領域又は転写抑制領域の配列を検索する。その結果、第１の遺伝子以外の全ての標的遺伝子の転写促進領域又は転写抑制領域において、候補ＰＩポリアミド結合配列が存在する場合には、当該候補ＰＩポリアミド結合配列を標的とするＰＩポリアミドを選択する。例えば、（ｉｉｉ）で設計したＰＩポリアミドから、第２の遺伝子の転写促進領域又は転写抑制領域に結合し得るＰＩポリアミドを選択する。
あるいは、工程（ａ）は、例えば、前記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）に替えて以下の（ｉｉｉ’）及び（ｉｖ’）を含んでもよい。
（ｉｉｉ’）前記２種以上の遺伝子の転写促進領域又は転写抑制領域において、同一のＰＩポリアミドが結合し得る標的配列を探索する。
（ｉｖ’）（ｉｉｉ’）により検出された標的配列に結合し得るＰＩポリアミドを設計する。
（ｉｉｉ’）について：
ＰＩポリアミドでは、Ｐｙ／Ｉｍ対がＣ－Ｇ塩基対に結合し、Ｉｍ／Ｐｙ対がＧ－Ｃ塩基対に結合し、Ｐｙ／Ｐｙ対がＡ－Ｔ塩基対若しくはＴ－Ａ塩基対に結合する。Ｈｐ／Ｐｙ対がＴ－Ａ塩基対に結合し、Ｐｙ／Ｈｐ対がＡ－Ｔ塩基対に結合し、β／β対がＴ－Ａ塩基対若しくはＡ－Ｔ塩基対に結合し、β／Ｉｍ対がＣ－Ｇ塩基対に結合し、Ｉｍ／β対がＧ－Ｃ塩基対に結合し、β／Ｐｙ対及びＰｙ／β対がＴ－Ａ塩基対若しくはＡ－Ｔ塩基対に結合する。前記結合法則に基づき、全ての標的遺伝子の転写促進領域又は転写抑制領域において、同一のＰＩポリアミドが結合し得る標的配列を探索する。例えば、第１の遺伝子の転写促進領域若しくは転写抑制領域、及び第２の遺伝子の転写促進領域若しくは転写抑制領域において、同一のＰＩポリアミドが結合し得る標的配列を探索する。
（ｉｖ’）について：
（ｉｉｉ’）により、同一のＰＩポリアミドが結合し得る標的配列が見つかった場合には、当該標的配列に結合し得るＰＩポリアミドを設計する。
＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）では、工程（ａ）で設計したＰＩポリアミドを合成する。
ＰＩポリアミドは、固相Ｆｍｏｃ法等の公知の方法により合成することができる。
＜工程（ｃ）＞
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で合成されたＰＩポリアミドのうち、前記２種以上の遺伝子の転写を制御するＰＩポリアミドを選択する。
工程（ｂ）で合成したＰＩポリアミドの存在下で、全ての標的遺伝子を発現する細胞を培養する。ＰＩポリアミドの非存在下で培養した細胞と比較して、標的遺伝子の発現が促進又は抑制されている場合には、ＰＩポリアミドは、標的遺伝子の転写を制御すると判断することができる。例えば、ＰＩポリアミドが、第１の遺伝子の転写促進領域に結合し、第２の遺伝子の転写抑制領域に結合するように設計されているとする。この場合、ＰＩポリアミドの存在下で培養すると、第１の遺伝子の転写は抑制され、第２の遺伝子の転写は促進される。遺伝子の発現は、ｍＲＮＡで確認してもよく、タンパク質で確認してもよい。ｍＲＮＡの転写量は、例えば、ノーザンブロッティング、ＲＴ－ｑＰＣＲ等により測定することができる。タンパク質の発現量は、例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等により測定することができる。
本態様にかかる方法により、２種以上の遺伝子のプロモーターに結合し、前記２つ以上の遺伝子の転写を制御する、ＰＩポリアミドを製造することができる。本態様にかかる方法により、上記で例示したＰＩポリアミドを製造することができる。
［他の態様］
一態様において、本発明は、ＴＧＦ－β関連疾患又は線維性疾患を治療又は予防するための医薬組成物の製造における、ＰＩポリアミド（Ｐ）の使用を提供する。
一態様において、本発明は、ＴＧＦ－β関連疾患又は線維性疾患を治療又は予防に使用するための、ＰＩポリアミド（Ｐ）を提供する。
一態様において、本発明は、ＰＩポリアミド（Ｐ）を対象（例、ＴＧＦ－β関連疾患又は線維性疾患に罹患している患者など）に投与することを含む、ＴＧＦ－β関連疾患又は線維性疾患の治療方法を提供する。
一態様において、本発明は、ＴＧＦ－β関連疾患又は線維性疾患を治療又は予防するための、ＰＩポリアミド（Ｐ）を提供する。
以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［ＰＩポリアミドの設計］
（ヒトＨＧＦ遺伝子プロモーターの解析）
ヒトＨＧＦ遺伝子のプロモーターを、遺伝子解析ソフトＰＲＯＭＯを用いて解析し、転写制御因子の結合サイトを予測した。その結果、転写制御因子として機能するＣＯＵＰ－ＴＦ１の結合サイト（－１０８～－９６；ＡＧＧＴＧＡＣＣＴＴＴＴＣ：配列番号１）が検出された（図２参照）。このＣＯＵＰ－ＦＴ１結合サイトの周辺領域を標的として、８種類のＰＩポリアミドを設計した（Ｈｕ－ＨＧＦ－１，Ｈｕ－ＨＧＦ－２：図３；Ｈｕ－ＨＧＦ－３，Ｈｕ－ＨＧＦ－４，Ｈｕ－ＨＧＦ－５，Ｈｕ－ＨＧＦ－６：図４；Ｈｕ－ＨＧＦ－７，Ｈｕ－ＨＧＦ－８：図５）。ｉｎ ｖｉｖｏ試験でコモンマーモセットを用いることを想定し、ヒト及びコモンマーモセットで相同な領域をＰＩポリアミドの標的領域として選択した。
Ｈｕ－ＨＧＦ－３、Ｈｕ－ＨＧＦ－５、Ｈｕ－ＨＧＦ－７の構造及び組成を図６～８にそれぞれ示す。Ｈｕ－ＨＧＦ－３、Ｈｕ－ＨＧＦ－５、及びＨｕ－ＨＧＦ－７が結合できる配列を表１に示す。表１中、下線で示す配列は、ＴＧＦ－β１のプロモーターに存在する配列である。
（ヒトＴＧＦ－β１プロモーターの解析）
ヒトＴＧＦ－β１プロモーターの配列を図９に示す。図９中、実線で囲んだ配列は、Ｈｕ－ＨＧＦ－３の結合配列を示し、破線で囲んだ配列は、Ｈｕ－ＨＧＦ－７の結合配列を示す。
図１０に、ＰＩポリアミドの結合領域周辺における転写制御因子の結合予測サイトを示す。Ｈｕ－ＨＧＦ－３及びＨｕ－ＨＧＦ－５の結合領域周辺には、複数の転写制御因子結合予測サイトが存在する。
（ＰＩポリアミドの合成）
上記で設計した８種のＰＩポリアミド（Ｈｕ－ＨＧＦ－１、Ｈｕ－ＨＧＦ－２、Ｈｕ－ＨＧＦ－３、Ｈｕ－ＨＧＦ－４、Ｈｕ－ＨＧＦ－５、Ｈｕ－ＨＧＦ－６、Ｈｕ－ＨＧＦ－７、Ｈｕ－ＨＧＦ－８）を、ペプチド合成機ＰＳＳＭ８（Ｓｈｉｍａｚｕ）を用いてＦｍｏｃ固相合成した。合成した各ＰＩポリアミドをＣ１８ ＨＰＬＣカラムにより精製した。
［ゲルシフトアッセイ］
ヒトＨＧＦプロモーターのオリゴヌクレオチドを合成し、上記で合成した８種のＰＩポリアミドを用いてゲルシフトアッセイを行った。二本鎖ＤＮＡを［γ－３２Ｐ］－ＡＴＰを用いたＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識し、３７℃で１５分間、結合緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．９，２５０ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＥＤＴＡ，２５ｍＭ ＤＴＴ，１００ｍＭ ＫＣｌ）中でＰＩポリアミドとともにインキュベートした。得られた複合体を２０％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、オートラジオグラフィーで可視化した。
ゲルシフトアッセイの結果、いずれのＰＩポリアミドにおいても、ＨＧＦプロモーターの二本鎖ＤＮＡとのインキュベートにより、ゲルシフトが確認された。Ｈｕ－ＨＧＦ－１及びＨｕ－ＨＧＦ－２のゲルシフトアッセイの結果を図１１に示す。Ｈｕ－ＨＧＦ－３及びＨｕ－ＨＧＦ－４のゲルシフトアッセイの結果を図１２に示す。Ｈｕ－ＨＧＦ－５及びＨｕ－ＨＧＦ－６のゲルシフトアッセイの結果を図１３に示す。
ゲルシフトアッセイの結果、８種のＰＩポリアミドはいずれも、ヒトＨＧＦプロモーターに結合することが確認された。
［ＨＧＦ ｍＲＮＡ発現量の評価］
ＰＩポリアミドを添加して細胞を培養し、ＨＧＦ ｍＲＮＡ発現量に及ぼすＰＩポリアミドの影響を評価した。
図１４に、試験プロトコールの概要を示した。ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦ細胞）を１０％ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地で維持した。０．５％ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に培地を交換して、２４時間培養した。１０－１１～１０－７ＭのＰＩポリアミドを添加した。ネガティブコントロールでは、ＰＩポリアミドに替えてＤＭＳＯを添加した。ＰＩポリアミド又はＤＭＳＯの添加後１５時間培養し、細胞を回収した。
回収した細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（タカラバイオ）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを調製した。上記で調製したｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、ＲＴ－ｑＰＣＲを行い、ＨＧＦ ｍＲＮＡを定量した。ＲＴ－ｑＰＣＲには、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム製）を使用した。ＨＧＦ ｍＲＮＡの発現量は、１８ＳｒＲＮＡの発現量により平準化した。
ＲＴ－ｑＰＣＲに用いたプライマーを以下に示す。
ヒトＨＧＦ
フォワード：ＴＧＡＣＣＴＣＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＣＴＡＣＡ（配列番号４）
リバース：ＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＴＡＧ（配列番号５）
ヒト１８ＳｒＲＮＡ
フォワード：ＴＣＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＣＧＧＡＣＧ（配列番号６）
リバース：ＧＧＡＣＡＴＣＴＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡ（配列番号７）
ＰＩポリアミドとしてＨｕ－ＨＧＦ－３、Ｈｕ－ＨＧＦ－５、及びＨｕ－ＨＧＦ－７を用いた結果を図１５～１７にそれぞれ示した。これら３種のいずれにおいても、ネガティブコントロール（ＤＭＳＯ）と比較して、ＨＧＦ ｍＲＮＡ発現量の増加が確認された。いずれのＰＩポリアミドにおいても、低用量（１０－１１～１０－９Ｍ）のときにＨＧＦ ｍＲＮＡの発現量がより増加する傾向がみられた。
［ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡ発現量の評価］
ＰＩポリアミドを添加して細胞を培養し、ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡ発現量に及ぼすＰＩポリアミドの影響を評価した。
図１４に、試験プロトコールの概要を示した。ＰＩポリアミド又はＤＭＳＯの添加から３時間後に、０．１μＭのＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ）を添加したこと以外は、上記と同様に細胞を培養し、細胞を回収した。
上記と同様に、回収した細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡの発現量は、１８ＳｒＲＮＡの発現量により平準化した。
ＲＴ－ｑＰＣＲに用いたプライマーを以下に示す。
ヒトＴＧＦ－β１
フォワード：ＣＴＣＧＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡ（配列番号８）
リバース：ＴＧＴＡＣＡＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣＣＴＴＧ（配列番号９）
ＰＩポリアミドとして、Ｈｕ－ＨＧＦ－３、Ｈｕ－ＨＧＦ－５、及びＨｕ－ＨＧＦ－７を用いた結果を図１８～２０にそれぞれ示した。０．１μＭのＰＭＡの添加により、ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡの発現が誘導された。いずれのＰＩポリアミドを用いた場合も、１０－１２～１０－１０Ｍという極低濃度で、ＰＭＡ刺激によるＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡの発現が抑制された。
図２１は、ＨＤＦ細胞に替えて、ヒト腎メサンジウム（ＭＣ）細胞を用いた場合の結果を示す。ＰＩポリアミドとしては、Ｈｕ－ＨＧＦ－５を用いた。ＭＣ細胞においても、ＰＩポリアミドの添加により、ＰＭＡ刺激によるＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡの発現が抑制されることが確認された。
［ＨＧＦタンパク質発現量の評価］
ＰＩポリアミドを添加して細胞を培養し、ＨＧＦタンパク質発現量に及ぼすＰＩポリアミドの影響を評価した。
［ＨＧＦ ｍＲＮＡ発現量の評価］と同様に細胞を培養し、細胞を回収した。細胞を破砕し、抗ＨＧＦ抗体（Catalog(MAB294), Monoclonal Mouse, R&D System）を用いてウェスタンブロッティングを行った。ＨＧＦタンパク質発現量は、β－アクチンの発現量により平準化した。
ＰＩポリアミドとして、Ｈｕ－ＨＧＦ－３、Ｈｕ－ＨＧＦ－５、及びＨｕ－ＨＧＦ－７を用いた結果を図２２～２４にそれぞれ示した。これら３種のいずれにおいても、ネガティブコントロール（ＤＭＳＯ）と比較して、ＨＧＦタンパク質発現量の増加が確認された。いずれのＰＩポリアミドにおいても、低用量（１０－１１～１０－１０Ｍ）のときにＨＧＦタンパク質発現量がより増加する傾向がみられた。
［ＴＧＦ－β１タンパク質発現量の評価］
ＰＩポリアミドを添加して細胞を培養し、ＴＧＦ－β１タンパク質発現量に及ぼすＰＩポリアミドの影響を評価した。
［ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡ発現量の評価］と同様に細胞を培養し、細胞を回収した。細胞を破砕し、抗ＴＧＦ－β抗体（Catalog(Y241), Polyclonal, Rabbit, (株)ペプチド研究所）を用いてウェスタンブロッティングを行った。ＴＧＦ－βタンパク質発現量は、β－アクチンの発現量により平準化した。
ＰＩポリアミドとして、Ｈｕ－ＨＧＦ－３、Ｈｕ－ＨＧＦ－５、及びＨｕ－ＨＧＦ－７を用いた結果を図２５～２７にそれぞれ示した。０．１μＭのＰＭＡの添加により、ＴＧＦ－β１タンパク質の発現が誘導された。いずれのＰＩポリアミドを用いた場合も、１０－１１Ｍという極低濃度で、ＰＭＡ刺激によるＴＧＦ－β１タンパク質発現を有意に抑制することが確認された。
［ＨＧＦ ｓｉＲＮＡ存在下でのＴＧＦ－β１発現量の評価］
ＰＩポリアミドが、ＴＧＦ－β１発現量を直接的に低下させるかを確認するために、ＨＧＦ ｓｉＲＮＡを用いた試験を行った。ＨＧＦ ｓｉＲＮＡ存在下では、ＨＧＦの発現が抑制される。そのため、ＨＧＦ発現量の増加による影響を排除することができる。したがって、ＨＧＦ ｓｉＲＮＡ存在下で、ＰＩポリアミドを細胞に作用させることにより、ＰＩポリアミドがＴＧＦ－β１の発現を直接的に抑制するかを確認することができる。
ＨＧＦ ｓｉＲＮＡは、ＨＳＳ１７９２１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いた。ＨＧＦ ｓｉＲＮＡは、ＨＧＦ ｍＲＮＡの発現を特異的に抑制することが確認された（データは示さず）。
１０ｎＭのＨＧＦ ｓｉＲＮＡを添加したこと以外は、［ＨＧＦ ｍＲＮＡ発現量の評価］と同様に細胞を培養し、細胞を回収した。細胞を破砕し、抗ＨＧＦ抗体（Catalog(MAB294), Monoclonal Mouse, R&D System）を用いてウェスタンブロッティングを行った。ＨＧＦタンパク質発現量は、β－アクチンの発現量により平準化した。
ＰＩポリアミドとしてＨｕ－ＨＧＦ－３、及びＨｕ－ＨＧＦ－５を用いた結果を図２８～２９にそれぞれ示した。図２８～２９中、横軸の番号は以下を示す。ＰＭＡの濃度は０．１μＭとし、ＨＧＦ ｓｉＲＮＡの濃度は１０ｎＭとした。
１：ＤＭＳＯ
２：ＤＭＳＯ＋ＰＭＡ＋ ＨＧＦ ｓｉＲＮＡ
３：ＤＭＳＯ＋ＰＭＡ＋ ＨＧＦ ｓｉＮＲＡ＋１０－１１Ｍ ＰＩポリアミド
４：ＤＭＳＯ＋ＰＭＡ＋ＨＧＦ ｓｉＮＲＡ＋１０－１０Ｍ ＰＩポリアミド
５：ＤＭＳＯ＋ＰＭＡ＋ＨＧＦ ｓｉＮＲＡ＋１０－９Ｍ ＰＩポリアミド
Ｈｕ－ＨＧＦ－３及びＨｕ－ＨＧＦ－５のいずれも、ＨＧＦ ｓｉＲＮＡの存在下で、ＴＧＦ－βタンパク質発現を有意に抑制することが確認された。これらの結果から、Ｈｕ－ＨＧＦ－３及びＨｕ－ＨＧＦ－５は、ＴＧＦ－βのプロモーター領域に結合し、ＴＧＦ－βの発現を直接的に阻害していると示唆された。
［ミスマッチＰＩポリアミドを用いたＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡ発現量の評価］
ＨＧＦ遺伝子の転写抑制領域及びＴＧＦ－β１遺伝子の転写促進領域に結合するように設定していないミスマッチＰＩポリアミド（ＨＧＦ ｍｉｓｍａｔｃｈ）を合成した。前記ミスマッチＰＩポリアミド用いたこと以外は、［ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡ発現量の評価］と同様に細胞を培養し、ＴＧＦ－β１ ｍＲＮＡ発現量を評価した。ＨＧＦ ｍｉｓｍａｔｃｈの構造を以下に示す。
結果を図３０に示す。ＨＧＦ ｍｉｓｍａｔｃｈは、ＴＧＦβのｍＲＮＡ発現量に影響しなかった。
本発明によれば、２種以上の遺伝子の転写を同時に制御可能な式ピロールイミダゾールポリアミド、及び前記ピロールイミダゾールポリアミドを含む医薬組成物が提供される。また、ＴＧＦ－β関連疾患又は線維性疾患の治療薬として有用なピロールイミダゾールポリアミド、並びに前記ピロールイミダゾールポリアミドを用いたＴＧＦ－β遺伝子発現抑制剤、及びＴＧＦ－β関連疾患又は線維性疾患を治療するための医薬組成物が提供される。

Claims (6)

  1. 下記式（Ｐ－３）、（Ｐ－５）又は（Ｐ－７）で表される、ピロールイミダゾールポリアミド。
    ［式中、Ｒ１は、－ＮＨＣＯ－Ｒ１１（Ｒ１１は炭素原子数１～１０の脂肪族炭化水素基）で表される基を表し、Ｒ２は、－ＣＯＮＨ－Ｒ２１（Ｒ２１は炭素原子数１～１５の置換基を有してもよい脂肪族炭化水素基）で表される基を表す。Ｒ１及びＲ２は、相互に連結して２価の有機基を形成してもよい。］
  2. 下記式Ｈｕ－ＨＧＦ－３、Ｈｕ－ＨＧＦ－５又はＨｕ－ＨＧＦ－７で表される、請求項１に記載のピロールイミダゾールポリアミド。
  3. 請求項１又は２に記載のピロールイミダゾールポリアミドを含む、ＴＧＦ－β遺伝子発現抑制剤。
  4. 請求項１又は２に記載のピロールイミダゾールポリアミドを含む、医薬組成物。
  5. 請求項１又は２に記載のピロールイミダゾールポリアミドを含む、ＴＧＦ－β関連疾患を治療するための医薬組成物。
  6. 請求項１又は２に記載のピロールイミダゾールポリアミドを含む、線維性疾患を治療するための医薬組成物。
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