JP7745858B2

JP7745858B2 - ポリペプチドおよびｃｃｋ受容体アゴニスト／アンタゴニストとしてのその使用

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Publication number: JP7745858B2
Application number: JP2024547806A
Authority: JP
Inventors: ダニエルトルトレッラ，ミッキー; 菊方賀
Original assignee: Centre For Regenerative Medicine And Health Hong Kong Institute Of Science & Innovation Chinese Academy Of Sciences; City University of Hong Kong CityU
Current assignee: Centre For Regenerative Medicine And Health Hong Kong Institute Of Science & Innovation Chinese Academy Of Sciences; City University of Hong Kong CityU
Priority date: 2021-10-20
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2025-09-30
Anticipated expiration: 2042-06-30
Also published as: AU2022370113B2; CN113929737A; KR102902210B1; ZA202402706B; EP4421082A1; JP2024541119A; KR20240090590A; CN113929737B; US20240415918A1; AU2022370113A1; CA3224247A1; WO2023065716A1

Description

本発明は、化学技術および製薬技術の分野、特にポリペプチドおよびCCK受容体アゴニスト／アンタゴニストとしてのその使用に関する。

コレシストキニン(CCK)は、十二指腸細胞および空腸細胞によって合成および分泌される液性調節因子であり、33アミノ酸からなるポリペプチドである。脳、特に皮質、線条体、海馬、大脳視蓋前域、横隔膜、および視床下部に広く分布し、小腸を通って末梢にも分泌され、神経伝達物質または神経調節物質として重要な役割を果たしている。その主な生理学的効果は、胆嚢の収縮、膵臓酵素の分泌の刺激、インスリンの放出の増加、肝胆汁の分泌の増加、胃内容排出の遅延、粘液腺の分泌の刺激、小腸の蠕動運動の強化、およびカリウム、ナトリウム、塩素、および空腸と回腸による液体の吸収の阻害などである。場合によっては、動脈圧に影響を与えることができ、免疫系に影響を及ぼすことができる。一部の中枢神経細胞では、CCKは、ドーパミンと共存する。それは、アセチルコリン、γ-アミノ酪酸、セロトニン、アヘン剤、成長ホルモン抑制、サブスタンスPおよびイオンチャネルなどのメカニズムにおいて重要な役割を果たす。CCKを摂取すると、生理学的変化、眼瞼下垂、低体温症、高血糖および頑固さ、ならびに何らかの行動の変化、運動不足、攻撃性の低下、痛みの欠如、知識の学習への影響、性的行動の変化、食事時の満腹感を引き起こしうる。

CCKがその生物学的役割を果たすためには、まず標的細胞の表面に存在する CCK受容体に結合する必要がある。CCK受容体は、Gタンパク質共役受容体に属し、インビボで広く分布する。CCK受容体として、内因性リガンドに対する親和性に基づいて2つのサブタイプ、すなわちCCK-A受容体とCCK-B受容体が挙げられる。末梢神経系と中枢神経系の両方において2つのサブタイプが特定されている。実験では、CCK受容体アゴニストとアンタゴニストが、規定食、肥満、胆嚢がん、膵臓がん、てんかん、うつ病、および過剰な胃酸によって引き起こされる消化器疾患の治療に使用することができることが示されている。しかしながら、CCK受容体アゴニストによる健忘症および認知症の治療は報告されていない。

現時点では、既存のペプチドCCK受容体アゴニストおよびアンタゴニストは半減期が短く、経口投与または注射ではインビボで長期間効果を発揮することができないため、薬学的意義はあまりない。したがって、新しいCCK受容体アゴニストの開発は、関連疾患の治療に応用する重要性が非常に高いと考えられる。

発明の概略
これを考慮して、本発明は、ポリペプチドおよびCCK受容体アゴニスト／アンタゴニストとしてのその使用を提供する。このポリペプチドは、CCK受容体に対して高いアゴニスト／アンタゴニスト活性を有する。CCK4と比較して、本発明によるポリペプチドは、インビボでの半減期および有効期間が長く、記憶障害のある老齢マウス、およびアルツハイマー病マウスの空間記憶障害を改善する。

上記の発明の目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決を提供する：

本発明は、式(I)：
式(I)
[式中、
Xは、アミド結合または単結合である；
対応する位置のアミノ酸はD型またはL型アミノ酸となる；

R₁、R₂、R₃およびR₄は独立して、以下：
からなる群から選択され、およびR_I、R_II、R_IIIおよびR_IVは独立して、ハロゲン、ニトロ、C₁-C₄アルキル、アジド N₃およびシアノからなる群から選択される；
R₅およびR₆は独立して、H、および置換または非置換C₁-C₄アルキルからなる群から選択される；
R₇は、以下の構造：
ビオチン、AC、Fmoc、Cbz、PEG100、PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG1500、PEG2000、
からなる群から選択される]
で示される構造を有するポリペプチド、またはその立体異性体、プロドラッグ、薬学的に許容される溶媒和物もしくは塩を提供する。

好ましくは、R₁は、以下の構造：
からなる群から選択される；
R₂は、以下の構造：
からなる群から選択される；
R₃は、以下の構造：
からなる群から選択される；
R₄は、以下の構造：
からなる群から選択される；
R_I、R_II、R_IIIおよびR_IVは独立して、ハロゲン、ニトロ、C₁-C₄アルキル、アジドおよびシアノからなる群から選択される。

好ましくは、ポリペプチドは、式(II)：
式(II)
で示される構造を有する。

好ましくは、式(II)で示されるポリペプチドにおいて、R₁は、以下の構造：
からなる群から選択される；
R₂は、以下の構造：
からなる群から選択される；
R₃は、以下の構造：
からなる群から選択される；
R₄は、以下の構造：
からなる群から選択される；
R₅は、HおよびCH₃からなる群から選択される。

好ましくは、ポリペプチドは、式(III)または(IV)：
式(III)
式(IV)
[式中、
R_I、R_II、R_IIIおよびR_IVは独立して、ハロゲン、ニトロ、C₁-C₄アルキル、アジド N₃およびシアノからなる群から選択され、およびR_Vは、炭素またはイオウ原子である]
で示される構造を有する。

好ましくは、式(III)で示されるポリペプチドにおいて、R_I、R_II、R_IIIおよびR_IVは独立して、H、F、Cl、Br、I、CN、N₃、MeまたはNO₂からなる群から選択される。

特に、本発明が提供するポリペプチドは、表1のいずれかの構造を有する。

好ましくは、ポリペプチドは、化合物1～4の構造を有する：
(1) Ac-(D-Trp)-Met-Asp-Phe(3-Br)-NH₂
1
(2) Ac-Trp-Nle-Asp-Phe(3-Br)-NH₂
2
(3) Ac-(D-Trp)-Nle-Asp-Phe(3-Br)-NH₂
3
(4) Fmoc-(N-Me-Trp)-Nle-Asp-Phe(3-Br)-NH₂
4

本発明のポリペプチドは、アミノ酸および修飾アミノ酸を原料として縮合反応により製造される。本発明においては、合成方法に特に制限はなく、固相合成または液相合成を使用することができる。本発明は、縮合反応の特定の工程および使用される試薬に関して特別な制限はなく、これらは一般に使用されているか、または当技術分野でよく知られている。

別の態様では、本発明は、本発明に記載のポリペプチド、その薬学的に許容される塩、立体異性体またはプロドラッグ分子、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。

「薬学的に許容される賦形剤」には、薬学的に許容される担体、希釈剤、保存剤、可溶化剤、安定剤、崩壊剤、接着剤、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、香料、塩、緩衝剤、コーティング剤および酸化防止剤が含まれ得る。当業者は、医薬組成物を製剤するための適切な賦形剤および技術を知っている。

本発明では、化合物に関するインビトロCCK-B受容体アゴニズムおよびアンタゴニズム実験を実施した。実験により、上記の化合物はCCK-B受容体に対して良好なアゴニストまたはアンタゴニスト効果を有し、完全または部分的なアゴニズムまたはアンタゴニズムによるコレシストキニン受容体の刺激を必要とする肥満、うつ病、健忘症、または老人性認知症などの疾患の治療および予防に使用できることが示されている。したがって、本発明はまた、CCK受容体アゴニストもしくはアンタゴニストとして、またはCCK受容体関連疾患を治療もしくは予防するための薬剤の調製における、式(I)、(II)、(III)または(IV)で示されるいずれかの構造のポリペプチドの使用にも関する。

本発明において、CCK受容体関連疾患には、健忘症、認知症、てんかん、うつ病、肥満、胆嚢がん、膵臓がん、および消化器系疾患のうちの少なくとも1つが含まれる。

これらのうち健忘症には前向性健忘と逆向性健忘があり、認知症にはアルツハイマー病(老人性認知症)、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、プリオン病(クロイツフェルト・ヤコブ病)、レビー小体型認知症、ハンチントン病などが含まれる。健忘症または認知症の「治療または予防」には、特に、健忘症の改善または部分的改善、学習プロセスの改善、記憶能力の改善、健忘症エピソードの予防または逆転、不安、うつ病、過敏症、興味の喪失、社会的離脱などの健忘症または認知症の合併症の改善または予防が含まれるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態では、式(I)の構造を有するポリペプチドを対象に投与すると、対象の学習能力が大幅に向上し、対象の記憶障害が改善され、長期的な効果が得られる。

「有効量」という表現は通常、治療上望ましい結果を生み出すのに十分な量を意味するが、結果の正確な性質は治療される特定の状態によって異なる。式(I)の構造を有する本発明のポリペプチドは、組成物、特に医薬組成物中に、有効量、すなわち、対象、特に哺乳類の健忘症または認知症の治療または予防に適した量で含まれてもよい。

対象は、ヒトまたは動物であり得るが、特に哺乳類、好ましくはヒトである。したがって、対象は、記憶喪失または認知症のヒトであることが好ましい。式(I)の構造を有する本発明のポリペプチドの有効量は、対象の種、体重、年齢および個々の状態に依存し、実験動物などの標準的な方法によって決定され得る。

当業者は、素因に基づいて、対象が健忘症または認知症の治療を受ける必要があるかどうかを本発明に従って決定することができる。健忘症または認知症の素因として、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、プリオン病(クロイツフェルト・ヤコブ病)、レビー小体型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病などの変性疾患といったような、中枢神経系の変性疾患、ならびに血管性認知症、空間占有病変(腫瘍、慢性硬膜下血腫、慢性脳膿瘍)、感染症(髄膜脳炎、神経梅毒、エイズ認知症、プリオン病)、外傷性脳認知症、正常頭蓋内圧水頭症、内分泌代謝障害、中毒、低酸素症および腫瘍随伴症候群などの非変性疾患といったような、中枢神経系の非変性疾患を含む、中枢神経系(CNS)に対するあらゆる種類の損傷または外傷が挙げられ得るが、これらに限定されない。

式(I)の構造を有する本発明によるポリペプチドは、経口、注射、直腸、局所、非経口、経皮、または吸入によって対象に投与され得る。対象がマウスである実施形態では、式(I)の構造を有するポリペプチドが注射によって対象に投与される。注射という用語には、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、および皮内投与が含まれる。

従来技術と比較して、本発明のポリペプチドは生体内半減期が長く、有効期間が長い。実験では、このポリペプチドが老齢マウスモデルおよび記憶障害マウスモデルの記憶力を大幅に改善することが示されており、応用の可能性が大きい。

図1は、CHO-CCK細胞に対するCCK8の効果を示すグラフである。図2は、異なる治療群における後部視覚野の蛍光シグナル観察結果を示す。Aは化合物HT-177を注射しないブランク対照群の結果、Bは化合物HT-177を腹腔内注射した場合の結果である。図3は、CCK4の腹腔内注射がモリス水迷路試験における老齢マウスの行動能力を改善することを示す。(A)測位ナビゲーション実験における投与群と対照群のマウスの日常学習成績；(B)空間探索実験における投与群と対照群のマウスの追跡図。図4は、CCK4と化合物HT-267の腹腔内注射が、モリス水迷路試験におけるアルツハイマー病マウスの行動能力を改善することを示す。(A)測位ナビゲーション実験におけるCCK4投与群と対照群のマウスの日常学習成績；(B)空間探索実験におけるCCK4投与群と対照群のマウスの追跡ヒートマップであり、点線の円は元のプラットフォームの位置を示す；(C)空間探索実験におけるCCK4投与群と対照群のマウスの標的四分円探索時間の割合；(D)測位ナビゲーション実験におけるHT-267投与群と対照群のマウスの日常学習成績；(E)空間探索実験におけるHT-267投与群と対照群のマウスの追跡ヒートマップであり、点線の円は元のプラットフォームの位置を示す；(F)空間探索実験におけるHT-267投与群と対照群のマウスの標的四分円探索時間の割合。図5は、CCK4と化合物HT-267、HT-177およびHT-178の腹腔内注射が、モリス水迷路試験における記憶障害マウスの行動能力を改善することを示す。(A)空間探索実験におけるCCK4投与群と対照群のマウスの標的四分円探索時間の割合；空間探索実験における化合物HT-267、HT-177およびHT-178投与群と対照群のマウスの標的四分円探索時間の割合。図6は、化合物HT-267の腹腔内注射が、新規物体認識実験におけるアルツハイマー病マウスの行動能力を改善することを示す。(A)慣れと試験期間中のマウスの追跡例であり、青い四角は古い物体を表し、黄色の三角形は新しい物体を表す；(B)投与群と対照群のマウスによる新規物体の認識指数。新規物体認識実験における投与群と対照群のマウスによる新規物体の認識指数を図７に示す。化合物HT-267(投与群1)、HT-177(投与群2)、およびHT-178(投与群3)を腹腔内注射すると、新規物体認識実験における記憶障害マウスの行動能力が改善される。図8は、老齢マウスの皮質に対する化合物HT-267(投与群)の長期増強効果を示す。時点0の左側は、投与前の基礎フィールド電位レベル、時点0の右側は投与後のフィールド電位記録である。図9は、アルツハイマーマウスの皮質に対する化合物HT-267(投与群)の長期増強効果を示す。時点0の左側は、投与前の基礎フィールド電位レベル、時点0の右側は投与後のフィールド電位記録である。図10は、記憶障害マウスの皮質に対する化合物HT-267(投与群1)、化合物HT-177(投与群2)、および化合物HT-178(投与群3)の長期増強効果を示す。100%は正規化後の投与前の基礎フィールド電位レベル、投与後のフィールド電位レベルを示す。

詳細な記載
本発明は、ポリペプチド、およびCCK受容体アゴニスト／アンタゴニストとしてのその使用を提供する。当業者は、本出願の開示を参照して、プロセスパラメータを適切に改善することができる。特に、同様の置換および修正はすべて当業者には明らかであり、それらは本発明に含まれるとみなされる。本発明の方法および使用を好ましい実施形態によって説明してきたが、当業者であれば、本発明の開示、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書の方法および使用を修正または適切に変更し、組み合わせて、実現し、適用し得ることは明らかである。

本発明で使用される材料はいずれも市販品であり、市場で購入することができる。

本発明を実施例と併せて以下にさらに説明する：

本発明のポリペプチド化合物の構造とCCK受容体のアゴニスト活性との関係
アミノ酸および修飾アミノ酸を原料として使用し、縮合反応によりポリペプチド類似化合物を生成し、以下のプロセスに従ってポリペプチドの活性を測定し、その構造と活性を表1に示す。

(1)試薬および原料：
細胞株：CHO-CCKモデル細胞
検出試薬：Fluo-8 No Washカルシウムアッセイキット(AAT Bioquest、#36316)
陽性対照：CCK8
(2)試験：
CCK-B受容体(CHO-CCK)を含むモデル細胞に化合物が作用した後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化を検出する。
(3)化合物の製造方法：
1．化合物を、DMSOを用いて10mM母液に配合し、3倍勾配で一連の9濃度に希釈して1000×ストック溶液を形成した。
2．1 アゴニスト
化合物のストック溶液をHHBS緩衝液で200倍に希釈して、5倍の希釈標準溶液を作成した。
2．2 アンタゴニスト
まず、CCK8を最終濃度50nMになるようにHHBS緩衝液に添加し、その後、化合物を得られたHHBS緩衝液で200倍に希釈して、5×希釈標準溶液とした。

(4)試験スキーム：
1．CHO-CCK細胞を、30,000細胞/ウェル/100μLで、1%FBSを含む培地を含む96ウェルプレートに播種し、37℃にて一晩インキュベートする。
2．1×Fluo-8分析緩衝液を調製する：9mLのHHBS、1mLの10×Pluronic F127 Plus、および20μLのFluo-8を後での使用のために完全に混合する。
3．Fluo-8色素希釈標準溶液を細胞プレートに100μL/ウェルで加える。まず37℃のインキュベーター内で30分間インキュベートし、その後、取り出して室温、暗所で30分間インキュベートする。
4．細胞を培養する過程において、検出対象の化合物をHHBSで調製した。
5．96ウェルCHO-CCK細胞プレートに化合物を1ラインずつ、50μL/ウェルにて添加し、その後すぐにマイクロプレートリーダーに入れて、Ex/Em=490nm/520nmの動的蛍光シグナル変化を1ラインずつ検出する。
(5)試験結果および分析方法：
1．CHO-CCK細胞に対するCCK8の効果を図1に示す。

結果は、陽性対照としてのCCK8が最も強いアゴニスト活性を持っていると考えられ、その高濃度効果は細胞の飽和状態であることを示した。CCK8の濃度効果曲線を解析し、そのアゴニスト効果が90%飽和に達する濃度、すなわち、EC₉₀が約10nMと算出されたため、アンタゴニストスクリーニング法におけるCCK8の濃度を10nMであると設定された。結果を分析する際に、10nM CCK8単独の細胞群のシグナルに占める、化合物と10nM CCK8を同時に作用させた細胞群のシグナルの割合を計算した。

20nMでのCCK8のアゴニスト効果は実質的な飽和に達したため、この濃度に対応する蛍光強度をアゴニストスクリーニング結果の分析における100%対照として使用した。結果を分析する際に、20nM CCK8単独の細胞群のシグナルに占める、化合物単独の細胞群のシグナルの割合を計算した。

化合物のアゴニズム／アンタゴニズムEC₅₀は、アゴニズム／アンタゴニズムのパーセンテージをY軸、化合物の濃度をX軸としてフィッティングカーブをプロットすることにより得られる。

表1：ポリペプチドの構造および活性

注：「NA」は、「未検出」を示す。

表1の活性データから、第1のアミノ酸であるトリプトファンは、D型またはL型であるが、L型の活性の方が強く、2～4位のアミノ酸は、それぞれメチオニン／n-ロイシン、アスパラギン酸およびフェニルアラニンであることが分かる。2～4位のアミノ酸は、L型アミノ酸であり、ポリペプチド類似体の活性に必要である。R₂がn-ロイシンの側鎖であり、R₄が3-ブロモフェニルアラニンの側鎖である場合、化合物の活性はより高くなる。R₇がアセチル基の場合、HT-177およびHT-267などの化合物が、より活性が高くなる。

実施例では、KMマウス(雄)におけるHT-267、HT-177およびCCK4(HT-9)の静脈内投与後の薬物動態特性を測定した(n=4)。具体的には、上記3つのポリペプチドをそれぞれ5%DMSOおよび95%二次脱イオン水の溶液に溶解し、それぞれ1mg/kgの用量でKMマウスの尾静脈に注射した。単回投与後、異なる時点で眼窩静脈から全血(100μL)を採取し、全血サンプルをヘパリン添加チューブに収集した。遠心分離によって血漿成分を直ちに分離し、対応する濃度をLC/MS/MSによって分析した。

表2
注：「～」は、「未検出」を示す。

結果は、尾静脈注射後の血液サンプルにはCCK4の存在を検出することができないことを示し、おそらく静脈内注射後のCCK4の急速な分解により、その濃度が検出限界(50 ng/ml)よりも低いことを示した。化合物HT-267とHT-177は両方とも、それぞれ、1.601時間と0.721時間という良好な半減期を示した。同時に、Tmaxの時間はそれぞれ、0.033時間と0.25時間であった。また、最大濃度(Cmax)に関しても良好な結果を示し、特にHT-267は、1929.095μg/Lに達した。

100mg/kgの用量のペントバルビタールで麻酔した後、成体(8週齢)野生型マウス(C57BL/6)を、マウス頭部を介してデジタル脳定位固定装置(RWD Life Science、中国)にそっと固定し、皮質表面領域の複数の部位(250nl/部位)にAAV9-hsyn-cck-2.0-GFPウイルス(3.2×10¹² vg/ml)を注射した(DV=300μm)。皮質造影のために、3mm×3mmの長方形の開頭術が実行され、観察窓としてカバースリップが埋め込まれ、硬膜は除去されなかった。ウイルス注射から2週間後、緑色の蛍光をもつCCK-B受容体が発現した。リガンドがこの人工受容体に結合すると、図2に示すように緑色の蛍光シグナルが観察され、これを広視野蛍光顕微鏡で観察した。

結果は、上記のウイルスを注射されたマウスに化合物HT-177溶液を腹腔内注射した後、緑色の蛍光シグナルが観察され(図2B)、これは、HT-177薬剤が血液脳関門を通過して、ウイルスによって発現されるCCK-B受容体に結合したことを示した。

成体野生型マウス(C57BL/6)を餌と水を自由に摂取できる標準条件下で飼育した。モリス水迷路は、1981年にイギリスの心理学者モリスによって考案され、脳の学習と記憶メカニズムの研究に応用された実験手法であり、学習と記憶、老人性認知症、知能と老化、新薬開発／スクリーニング/評価およびその他の分野における科学研究に広く使用されている。マウスの空間記憶能力を試験するためのモリス水迷路実験は、主に測位ナビゲーション実験と空間探索実験の2つの部分で構成された。測位ナビゲーション実験は10日間続き、マウスをプール壁に面した4つの進入ポイントから1日4回水中に入れ、水面下の隠れたプラットフォームを見つけるのに費やした時間(回避潜時)を記録した。空間探索実験は、測位ナビゲーション実験の24時間後にプラットフォームを撤去し、次に、マウスをプールに入れ、1分間以内に泳いだ軌跡を記録し、元のプラットフォーム上のマウスの記憶を調査し、元のプラットフォームがあった四分円(標的四分円)におけるマウスの探索時間の割合を計算する。

モリス水迷路実験を使用して、老齢野生型マウスの空間記憶能力を試験し、CCK4(HT-9)治療を行った。老齢マウスをランダムに2つのグループに分け、一方にはCCK4溶液を腹腔内注射し、他方には対照として薬物の溶媒を腹腔内注射した。図3Aに示すように、測位ナビゲーション実験では、数日間の訓練後、投与群の回避潜時が対照群よりも短く、投与群が対照群よりも優れた学習能力を示したことが示された。図3Bは、空間探索実験における2つのマウスのグループの軌跡図であり、投与群はプラットフォームの元の位置でより多くの空間探索軌跡を示し、これは、マウスがプラットフォームの位置へのより良い記憶遡行能力を持っていたことを示す。この実験は、CCK4が老齢マウスの空間記憶障害を改善することを示した。

成体雄性トリトランスジェニックアルツハイマー病マウス(3xTg-AD)を、餌と水を自由に摂取できる標準条件下で飼育した。アルツハイマー病マウスを試験するためのモリス水迷路実験は、主に測位ナビゲーション実験と空間探索実験の2つの部分で構成された。測位ナビゲーション実験は8～10日間続き、マウスをプールの壁に面した4つの進入ポイントから1日4回水中に入れ、水面下の隠れたプラットフォームを見つけるのに費やした時間(回避潜時)を記録した。空間探索実験は、測位ナビゲーション実験後にプラットフォームを撤去し、次に、マウスをプールに入れ、1分間以内に泳いだ軌跡を記録し、元のプラットフォーム上のマウスの記憶を調査し、元のプラットフォームがあった四分円(標的四分円)におけるマウスの探索時間の割合を計算する。アルツハイマー病マウスはモリス水迷路実験で記憶障害があることが確認され、これは、測位ナビゲーション実験では隠れたプラットフォームの位置を測る際の回避潜時が長くなるだけでなく、空間探索実験では記憶の遡行能力が低下することを示す。

アルツハイマー病マウスをランダムに4つのグループに分け、第1のグループにはCCK4溶液を腹腔内注射し、第2のグループには対照としてCCK4溶液の溶媒を腹腔内注射し、第3のグループには化合物HT-267溶液を腹腔内注射し、第4のグループには対照としてHT-267溶液の溶媒を腹腔内注射した。CCK4治療実験の測位ナビゲーション訓練では、CCK4の半減期が短すぎる(5分未満)ため、毎回の訓練前に薬剤を腹腔内注射し、1日4回の治療を行い、そして訓練は1日4回、計10日間実施した。図4Aに示すように、10日間の訓練後、同じ作業においてCCK4投与群の回避潜時は対照群よりも短く、投与群が対照群よりも優れた学習能力を示したことが示された。図4Bは、下のマップでは、CCK4投与群はプラットフォームの元の位置でより多くの空間探索軌跡を示し、これは、該マウスのプラットフォーム位置への記憶遡行能力が優れていることを示す。図4Cは、2つのマウスグループ間の標的四分円における探索時間の割合を比較したものであり、CCK4投与群が対照群よりも有意に高かった。

化合物HT-267治療実験の測位ナビゲーション訓練では、HT-267の半減期が最大1.601時間であるため、1日1回の腹腔内注射のみ必要であり、4回の訓練で作用できるため、治療は1日1回、訓練は1日4回、計8日間実施された。図4Dに示すように、8日間の訓練後、同じ作業においてHT-267投与群の回避潜時は対照群よりも短く、投与群が対照群よりも優れた学習能力を示したことが示された。図4Eは、空間探索実験における2つのマウスのグループの追跡ヒートマップであり、下のマップでは、HT-267投与群は、プラットフォームの元の位置でより多くの空間探索軌跡を示し、これは、該マウスのプラットフォーム位置への記憶遡行能力が優れていることを示す。図4Fは、2つのマウスグループ間の標的四分円における探索時間の割合を比較したものであり、HT-267投与群が対照群よりも有意に高かった。図4Fと図4Cを比較すると、HT-267投与群がCCK4投与群よりもわずかに優れた成績を示していることがわかり、また、HT-267はCCK4よりも治療回数と治療日数が少ないことを考慮すると、HT-267がCCK4よりも優れた効果があったと考えられた。

この実験では、CCK4と化合物HT-267の両方がアルツハイマー病マウスの空間記憶障害を改善し、HT-267の方が、有効性が高いことが示された。

成体記憶障害マウスを、餌と水を自由に摂取できる標準条件下で飼育した。記憶障害マウスを試験するためのモリス水迷路実験は、主に測位ナビゲーション実験と空間探索実験の2つの部分で構成された。実験方法は実施例５と同様である。

記憶障害マウスをランダムに6つのグループに分け、第1グループにはCCK4溶液を腹腔内注射し、第2グループには対照としてCCK4溶液の溶媒を腹腔内注射し、第3グループには化合物HT-267溶液を腹腔内注射し、第4グループには化合物HT-177溶液を腹腔内注射し、第5グループには化合物HT-178溶液を腹腔内注射し、第6グループには対照として化合物溶液の溶媒を腹腔内注射した。測位ナビゲーション実験では、第1グループと第2グループの治療と訓練方法は実施例5の第1および第2グループの治療と訓練方法と同じであり、すなわち、1日4回の治療、1日4回の訓練、合計10日間の訓練である。第3～第6グループの治療と訓練方法は、実施例5の第3および第4グループと同じであり、すなわち、1日4回の治療、1日4回の訓練、合計10日間の訓練である。空間探索実験では、マウスの空間記憶能力をグループごとに同様に試験した。

図5Aは、空間探索実験の標的四分円におけるマウスの各グループの探索時間の割合を比較したものであり、図5Aから、CCK4治療群の探索時間の割合が対照群よりも有意に高かったことがわかり、これは、このグループは、CCK4が記憶障害マウスの空間記憶障害を改善したことを示す。図5Bからわかるように、HT-267、HT-177、HT-178治療群の探索期間の割合は対照群よりも有意に高く、これは、化合物HT-267、HT-177、HT-178が、記憶障害マウスの空間記憶障害を改善し、HT-267治療群が最も優れた効果を有することを示す。化合物HT-267、HT-177およびHT-178はCCK4と同等の治療効果を有するが、CCK4よりも治療回数と治療日数が少ないことを考慮すると、化合物HT-267、HT-177およびHT-178はCCK4よりも優れた治療可能性を有すると考えられる。

この実験は、CCK4と化合物HT-267、HT-177およびHT-178が記憶障害マウスの空間記憶障害を改善し、化合物HT-267、HT-177およびHT-178がCCK4よりも優れた治療可能性を有することを示した。

新規物体認識実験は、げっ歯類の新しい環境への探索特性に基づいてEnnaceur & Delacour(1988)によって設計された認知記憶の高度に検証された方法であり、このモデルは、動物が環境内で見たことのある馴染んだ物体と見たことのない新規物体を探索することに費やす時間の長さに基づいて、試験された動物の記憶機能を評価する。試験された動物が環境内で馴染んだ物体を忘れていない場合、見たことのない新規物体を探索するためにより多くの時間を費やすと思われる；見たことのある馴染んだ物体が忘れられた場合、動物は環境内の新規物体と見たことのある馴染んだ物体を探索するのに本質的に同じ時間を費やさなければならない。実験は通常、次の3つの段階に分けられる：1．適応期間：動物を実験環境に慣れさせ、実験箱には物体を置かない；2．慣れ期間：2つの同一の物体を実験箱に置き、マウスを10分間自由に探索させる；3．試験期間：実験ボックスに新規物体を入れて古い物体の1つを置き換え、物体の位置は変えない。マウスの探索をビデオで記録し、マウスが新旧の物体を探索するのに費やした時間を分析し、試験期間中にマウスが新規物体の探索に費やした時間が、物体の総探索時間に占める割合、すなわち、新規物体の認識指数を計算した。

成体雄性トリトランスジェニックアルツハイマー病マウス(3xTg-AD)を、餌と水を自由に摂取できる標準条件下で飼育した。新規物体の認識実験では、アルツハイマー病マウスは記憶障害を有し、新規物体を認識する能力が低下していることが示された。アルツハイマー病マウスをランダムに2つのグループに分け、一方は化合物HT-267溶液を腹腔内注射し、他方は対照として薬物の溶媒を腹腔内注射した。図6Bに示すように、投与群の新規物体の認識指数は対照群よりも有意に高く、これは、投与によりマウスの認識記憶が改善されたことが示す。

成体記憶障害マウスを、餌と水を自由に摂取できる標準的な条件下で飼育した。記憶障害マウスを試験するための新しい物体認識実験には、主に適応期間、慣れ期間、および試験期間が含まれた。実験方法は実施例１２と同様である。

記憶障害マウスをランダムに4つのグループに分け、1つの群には対照群として薬物の溶媒を腹腔内注射し、投与群1には化合物HT-267溶液を腹腔内注射し、投与群2には化合物HT-177溶液を腹腔内注射し、そして投与群3には化合物HT-178溶液を腹腔内注射した。適応および慣れ期間の訓練の後、試験期間実験においていくつかのマウスのグループの認識記憶を試験した。図7は、試験期間中の4つのマウス群の新規物体の認識指数を比較したものであり、図7から3つの投与群の新規物体の認識指数が対照群よりも有意に高かったことが分かる。

この実験は、化合物HT-267、HT-177およびHT-178が記憶障害マウスの認識記憶障害を改善することを示した。

長期増強(LTP)は、研究者によって記憶メカニズムの1つであると考えられている。我々は、インビトロ電気生理学的電気信号記録法を使用して、化合物HT-267が老齢マウスの新皮質で長期増強を誘導できるかどうかを調査した。

MED64低ノイズ多電極記録システムを使用して、インビトロで培養された脳スライスの電気信号を記録した。興奮性シナプス後フィールド電位を少なくとも15分間安定して記録した後、化合物HT-267を脳スライスに5分間注射し、図8に示されるように、基底フィールド電位が増強され、その増強が1時間以上持続することが分かった。この実験は、化合物HT-267が老齢マウスの皮質において長期的な増強を誘導できることを示した。

インビトロ電気生理学的電気信号記録法を使用して、化合物HT-267がアルツハイマー病マウスの新皮質で長期増強を誘導できるかどうかを調査した。MED64低ノイズ多電極記録システムを使用して、インビトロで培養された脳スライスの電気信号を記録した。興奮性シナプス後フィールド電位を少なくとも15分間安定して記録した後、化合物HT-267を脳スライスに5分間注射し、図9に示されるように、基底フィールド電位が増強され、その増強が1時間以上持続することが分かった。化合物HT-267がアルツハイマー病マウスの新皮質において長期増強を誘導できることが示された。

インビトロ電気生理学的電気信号記録法を使用して、化合物HT-267、化合物HT-177、および化合物HT-178が記憶障害マウスの新皮質で長期増強を誘導できるかどうかを調査した。MED64低ノイズ多電極記録システムを使用して、インビトロで培養された脳スライスの電気信号を記録した。興奮性シナプス後フィールド電位を少なくとも15分間安定して記録した後、化合物HT-267(投与群1)、化合物HT-177(投与群2)、および化合物HT-178(投与群3)をそれぞれ、脳スライスに5分間注射し、図10に示されるように、脳スライスの各グループの基底フィールド電位が増強され、その増強が1時間以上持続することが分かった。投与前の基礎フィールド電位に正規化した後、3つの投与群のフィールド電位は120～140%に大幅に増強された。この実験は、化合物HT-267、化合物HT-177、および化合物HT-178が、記憶障害マウスの新皮質において長期的な増強を誘導できることを示した。

上記は本発明の好ましい実施形態にすぎず、当業者であれば、本発明の原理から逸脱することなく、多くの改良および修正を行うことができること、およびこれらの改良および修正も本発明の保護の範囲内であるとみなされるべきであることに留意されたい。

Claims

下記：

に列挙する、HT－１７７、HT－１７８、HT－１９３、HT－１９９、HT－２０２、HT－２３０、HT－２４９、HT－２５１、HT－２５５、HT－２５６、HT－２５７、HT－２５８、HT－２６７、HT－２６８の化合物のいずれか１つであるポリペプチド。
請求項１に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
CCK受容体関連疾患を治療もしくは予防するための薬剤の調製における、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項２に記載の医薬組成物の使用であって、前記CCK受容体関連疾患が健忘症、認知症、てんかん、うつ病、肥満、胆嚢がん、および膵臓がんから選択される、使用。