JP7731979B2 - 特異性が増強した二重特異性抗体（ｓｅｂａ） - Google Patents

特異性が増強した二重特異性抗体（ｓｅｂａ）

Info

Publication number
JP7731979B2
JP7731979B2 JP2023518078A JP2023518078A JP7731979B2 JP 7731979 B2 JP7731979 B2 JP 7731979B2 JP 2023518078 A JP2023518078 A JP 2023518078A JP 2023518078 A JP2023518078 A JP 2023518078A JP 7731979 B2 JP7731979 B2 JP 7731979B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
binding
cancer
egfr
her3
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2023518078A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2023542336A (ja
Inventor
アール． ガレット，デニス
ツァイ，ツング－アイ
ジャハン ハリ，
シー アマンダ マック，ガー
ハイ ツー，
イ ツー，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Systimmune Inc
Original Assignee
Systimmune Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Systimmune Inc filed Critical Systimmune Inc
Publication of JP2023542336A publication Critical patent/JP2023542336A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7731979B2 publication Critical patent/JP7731979B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づいて２０２０年９月２１日に出願された米国仮出願第６３／０８１，３１５号及び２０２０年１１月５日に出願された米国仮出願第６３／１０９，８７７号の優先権を主張し、これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、抗体がん治療の技術分野に関し、より具体的には、二重特異性四価抗体に関する。
ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１としても知られる）ファミリーには、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４の４つのメンバーがある。変異、増幅及び過剰発現による各メンバーの規制緩和は、腫瘍形成及び腫瘍転移において重要な役割を果たしている。過剰発現は、多種多様な腫瘍の発生に関連している。受容体の細胞外ドメインのＥＧＦＲ結合部位をブロックするか又は細胞内チロシンキナーゼ活性を阻害することによりＥＧＦＲシグナル伝達を中断することによって、ＥＧＦＲ発現腫瘍の増殖を防ぎ、患者の状態を改善することができる。例えば、ＨＥＲ２の過剰発現は乳がん患者の３０％で発生し、これは疾患の再発の増加と予後不良を示している。過剰発現は、胃、卵巣及び胃のがん、肺の腺がん、侵攻型の子宮がん、及び唾液腺がんでも発生することが知られている。ＨＥＲ２変異は、非小細胞肺がんで発見されている。根底にあるＨＥＲ２変異と増幅は、腫瘍形成につながる下流のシグナル伝達経路を活性化する異常な成長シグナルを産生する。このような場合では、ＨＥＲ２は腫瘍細胞の表面でＨＥＲ３と二量体化し、腫瘍の増殖と生存を促進するＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を活性化する１。
ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に対するいくつかの治療用抗体及び低分子阻害剤は、がんの治療での使用が承認されている２５。セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブなどの治療用抗ＥＧＦＲ抗体は、転移性結腸直腸がん、頭頸部扁平上皮がん、神経膠腫の治療に承認されている２６，２７。ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体は、結腸がん２８、頭頸部の扁平上皮がん２９、乳がん及び胃がん２５において良好な臨床反応を示している。
トラスツズマブ（ハーセプチン）などのＨＥＲ２を標的とする薬剤は、ＨＥＲ２発現乳がんや胃がんの患者に対して抗腫瘍効果を有する。トラスツズマブは、ＨＥＲ２に結合するモノクローナル抗体であり、結合により、細胞増殖を停止させるタンパク質であるｐ２７の活性が増加させる。トラスツズマブは、ＨＥＲ２が過剰発現されているがんにのみ有効である。１年間のトラスツズマブ療法は、化学療法も受けている全てのＨＥＲ２陽性乳がん患者に推奨され、１２か月を超えても追加の利点はない。ペルツズマブは、ＨＥＲ２とＨＥＲ３などの他の受容体との二量体化を阻害できるもう１つのモノクローナル抗体であって、転移性ＨＥＲ２陽性乳がんの治療のための化学療法剤であるトラスツズマブ及びドセタキセルと組み合わせて使用するためのＦＤＡ承認の治療薬である２，４。
これらの成功にもかかわらず、一部の患者では長期的な利益が限られているようである。これらの治療薬に最初に反応する多くの形態の腫瘍は、最終的には薬剤に対する耐性を獲得することにより進行する。薬剤耐性の発生は、これらの治療の有効性を低下させる。ＨＥＲ２標的療法の場合、耐性はＨＥＲ３又はそのリガンドであるＨＲＧのアップレギュレーションを介して発生する可能性がある５。したがって、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３シグナル伝達経路の活性化を阻害することを目的とする現在の治療アプローチは、有意義な臨床的利益をもたらすことができなかった３１，３２。
要約すると、現在臨床使用が承認されているＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３を標的とする単一特異性、二重特異性及び併用抗体療法には、治療に対する応答率が低いか、患者が治療に対する耐性を獲得するという欠点がある。そのため、これらのがんに対するより良い治療法が依然として必要とされている。
本発明は、抗体治療剤の技術分野に関し、より具体的には、ＥＧＦＲファミリーのメンバーに対する二重特異性四価抗体に関する。
一態様において、本発明は、ヒトＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）に対して結合特異性を有する二重特異性四価抗体を提供する。一実施形態において、前記抗体は、Ｎ末端からＣ末端まで、Ｆａｂ領域、Ｆｃドメイン、及びｓｃＦｖドメインを含む。前記Ｆａｂ領域は、ヒトＥＧＦＲに対して第１結合特異性を有する。前記Ｆｃドメインは、ＨＥＲ３に対して第２結合特異性を有する。一実施形態において、前記Ｆａｂ領域は、配列番号１又は３と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する可変領域を含んでもよい。
一実施形態において、前記二重特異性四価抗体は、配列番号１１、１３又はそれらの組み合わせと少なくとも９８％、９５％又は９２％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
一実施形態において、前記第１結合親和性は、前記第２結合親和性よりも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍高くてもよい。一実施形態において、前記第１結合親和性は、２０ｎＭ未満のＫＤを有し、前記第２結合親和性は、約５０ｎＭを超えるＫＤを有する。一実施形態において、前記第１結合親和性は、１０ｎＭ未満なＫＤを有し、第２結合親和性は、約１００ｎＭを超えるＫＤを有する。一実施形態において、前記第１結合親和性は、５ｎＭ未満なＫＤを有し、前記第２結合親和性は、約５０ｎＭを超えるＫＤを有する。
一実施形態において、前記第１結合親和性は、約０．１から約１５０ｎＭ、約０．５から約５０ｎＭ、約１から約１０ｎＭ、約１ｎＭから約２５ｎＭ、約０．１、０．５又は１．０ｎＭから約１０、２５又は５０ｎＭのＫＤを有する。一実施形態において、前記第１結合親和性は、約４．６１ｎＭのＫＤを有する。
一実施形態において、前記第２結合親和性は、約１０から約５００ｎＭ、約１０から２５０ｎＭ、約５０から約２５０ｎＭ、約１０又は５０ｎＭから約２５０又は５００ｎＭのＫＤを有する。一実施形態において、前記第２結合親和性は、約１１７ｎＭのＫＤを有する。
一実施形態において、前記Ｆａｂ領域は、ジスルフィド結合でステープルされてもよい。
一実施形態において、前記四価二重特異性抗体は、単離されたモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は組換え抗体であってもよい。
一実施形態において、前記二重特異性四価抗体は、ヒトフレームワーク領域を含む。
一態様において、本発明は、重鎖、軽鎖又はそれらの組み合わせを提供する。一実施形態において、前記重鎖は、配列番号９、１３又はそれらの組み合わせと少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、前記軽鎖は、配列番号１１と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一態様において、本発明は、本明細書で開示されるアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性ＣＤＲ配列を提供する。
一態様において、本発明は、本明細書で開示される四価二重特異性抗体、軽鎖又は重鎖をコードする単離された核酸を提供する。
一態様において、本発明は、本明細書で開示される単離された核酸を含む発現ベクターを提供する。一実施形態において、前記発現ベクターは、細胞内で発現可能である。
一態様において、本発明は、本明細書で開示される核酸を含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、本明細書で開示される発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であってもよい。
一態様において、本発明は、本明細書で開示される四価二重特異性抗体、軽鎖又は重鎖の製造方法を提供する。一実施形態において、本発明は、前記四価二重特異性抗体、軽鎖、重鎖が産生されるように前記宿主細胞を培養するステップを含む。
一態様において、本発明は、前記四価二重特異性抗体及び細胞毒性剤を含む免疫複合体を提供する。一実施形態において、前記細胞毒性剤は、化学療法剤、増殖抑制剤、毒素、若しくは放射性同位元素、又はそれらの組み合わせであってもよい。
一態様において、本発明は、医薬組成物を提供する。一実施形態において、前記医薬組成物は、前記四価二重特異性抗体又は免疫複合体及び薬学的に許容される担体を含む。
一実施形態において、前記医薬組成物は、放射性同位元素、放射性核種、毒素、治療剤、化学療法剤又はそれらの組み合わせを含む。
一態様において、本発明は、がんを有する対象を治療する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、前記対象に有効量の本明細書で開示される四価二重特異性抗体又は免疫複合体を投与するステップを含む。一実施形態において、前記方法は、有効量の治療剤を共投与するステップをさらに含む。
一実施形態において、前記治療剤は、抗体、化学療法剤、酵素又はそれらの組み合わせであってもよい。一実施形態において、前記治療剤は、例えば、カペシタビン、シスプラチン、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、エキセメスタン、アナストロゾール、アミノグルテチミド、テストラクトン、ボロゾール、ホルメスタン、ファドロゾール、レトロゾール、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、パゾパニブ、ラパチニブ、スニチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、ナブパリタキセル、それらの誘導体又は組み合わせを含んでもよい。
一実施形態において、前記がんは、ＨＥＲ３又はＥＧＦＲを発現する細胞を含む。一実施形態において、前記がんは、例えば、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、前立腺がん、非小細胞肺細胞がん、小細胞肺がん、神経膠腫、食道がん、鼻咽頭がん、腎臓がん、胃がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫を含む。
さらなる態様において、本発明は、四価二重特異性抗体又はその免疫複合体を有する溶液を提供する。一実施形態において、前記溶液は、対象の血漿である。
一実施形態において、前記対象は、哺乳類である。一実施形態において、前記対象は、ヒトである。
本明細書の開示の前述及び他の特徴は、添付の図面と併せて、以下の説明及び添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。図面は、本明細書の開示に従って用意されたいくつかの実施形態のみを示しており、従って、その範囲を限定するものと見なされるべきではなく、本明細書の開示は、添付の図面の使用を通じてさらなる特異性及び詳細が説明され得る。
ＳＩ－１Ｘ６．４とＳＩ－７１Ｘ１４との重鎖（Ａ；全ての違いがＶＨに局在する）、軽鎖（Ｂ；全ての違いがＶＫに局在する）、ＶＨ（Ｃ）及びＶＫ（Ｄ）間の配列アラインメントを示す。
バイオレイヤー干渉法センサーグラムを用いたＨｉｓタグ付きヒトＥＧＦＲ細胞外ドメインに対する二重特異性及び対照抗体の結合動力学（親和性）を示す。
Ｈｉｓタグ付きヒトＨＥＲ３細胞外ドメインに対する結合動力学（親和性）のバイオレイヤー干渉法センサーグラムを示す。タンパク質ＩＤは、各図の上部に表示される。なお、ＡＨＣセンサーを使用して決定された他の全ての測定とは対照的に、ＳＩ－１Ｒ１２はＦｃドメインがないため、ＡＲ２Ｇセンサーでセットアップする必要がある。
バイオレイヤー干渉法センサーグラムを使用してＳＡセンサー上に捕捉されたビオチン化ヒトＥＧＦＲ細胞外ドメインに対する結合動力学（アビディティ）を示す。
動的光散乱を用いた二重特異性抗体の熱安定性（Ａ）、並びにＳＩ－１Ｘ６．４及びＳＩ－７１Ｘ１４のＳＥＣプロファイルを示し、セツキシマブに由来のヒト化ＥＧＦＲ結合ドメインを有するＳＩ－７１Ｘ１４の凝集がより低いことを示している（Ｂ）。
ＥＧＦＲ、続いてＨＥＲ３への二重特異性抗体（ＳＩ－１Ｘ６．４及びＳＩ－７１Ｘ１４）のタンデム結合を示す。
ＨＥＲ３、続いてＥＧＦＲへの二重特異性抗体（ＳＩ－１Ｘ６．４及びＳＩ－７１Ｘ１４）のタンデム結合を示す。
Ｆａｄｕがん細胞表面上のＥＧＦＲファミリーメンバーの発現を示す。
Ｆａｄｕ細胞増殖に対するＳＩ－１Ｘ６．４及びその親抗体であるＳＩ－１Ｃ６の効力を示す。
Ｆａｄｕ細胞増殖に対するＳＩ－７１Ｘ１４及びその親抗体であるＳＩ－７１Ｍ１の効力を示す。
Ｆａｄｕ細胞増殖に対するＳＩ－１Ｘ２及びその親抗体であるＳＩ－１Ｃ３の効力を示す。
Ｆａｄｕ細胞増殖に対するＳＩ－１Ｘ４．２及びその親抗体であるＳＩ－１Ｃ５の効力を示す。
Ｆａｄｕ細胞増殖に対する抗体ＳＩ－１Ｘ６．４、ＳＩ－７１Ｘ１４、ＳＩ－１Ｃ４及びＳＩ－１Ｒ１２の効力の比較を示す。
Ｆａｄｕ細胞増殖に対する抗体ＳＩ－１Ｘ６．４、ＳＩ－７１Ｘ１４、ＳＩ－１Ｃ４、ＳＩ－７１Ｍ１、ＳＩ－１Ｃ６及びＳＩ－１Ｃ７の効力の比較を示す。
本開示は、既知の抗ＥＧＦＲ抗体よりも優れた治療特性又は有効性を有する二重特異性四価抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３を含むがこれらに限定されないＥＧＦＲファミリーのメンバーを標的とする。これらの二重特異性四価抗体は、異なる受容体を介した発がん性シグナル伝達を同時に阻害できるため、ＥＧＦＲ阻害剤又はモノクローナル抗体治療における耐性を克服することができる。
本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、「１つ以上」を意味すると定義され、文脈が不適切でない限り複数形を含む。
本明細書で使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は互換性があり、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸から構成される生体分子を意味すると定義される。
「抗原」という用語は、生物、特に動物、より具体的にはヒトを含む哺乳動物において免疫応答を誘発することができる実体又はその断片を指す。この用語は、抗原性又は抗原決定基に関与する免疫原及びその領域を含む。
「抗原又はエピトープ結合部分もしくは断片」、「可変領域」、「可変領域配列」又は「結合ドメイン」という用語は、抗原（本発明では、例えば、ＥＧＦＲ）に結合することができる抗体の断片を指す。これらの断片は、インタクト抗体の抗原結合機能及び追加機能の能力を有していてもよい。結合断片の例は、合成リンカーによって単一ポリペプチド鎖に接続された抗体の単一アームの可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）ドメインからなる単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＶＬ、定常軽鎖（ＣＬ）、ＶＨ、及び定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片を含むが、これらに限定されない。抗体断片は、さらに小さなサブ断片であってもよく、単一のＣＤＲドメイン、特にＶＬ及び／又はＶＨドメインのいずれかのＣＤＲ３領域と同じくらい小さいドメインで構成されてもよい３３。抗体断片は、当業者に知られている従来の方法により製造される。抗体断片は、インタクト抗体で使用されるのと同じ技術を使用して有用性についてスクリーニングすることができる。
「抗原、エピトープ結合部分又は断片」、「可変領域」、「可変領域配列」又は「結合ドメイン」は、多くの当技術分野で既知の技術によって本開示の抗体から誘導され得る。例えば、抗原結合断片（Ｆａｂ）は、抗原に結合する抗体上の領域（Ｆａｂ領域）である。例えば、精製されたモノクローナル抗体は、ペプシンなどの酵素で切断し、ＨＰＬＣゲル濾過にかけることができる。抗体のパパイン消化により、それぞれが単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片（「Ｆａｂ」断片と呼ばれる）と、その名前が容易に結晶化する能力を反映した残りの「Ｆｃ」フラグメントが産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有するとともに依然として抗原を架橋できるＦ（ａｂ'）２断片が得られる。次に、Ｆａｂ断片を含む適切な画分を収集し、膜濾過などにより濃縮し得る。抗体の活性断片の単離のための一般的な技術のさらなる説明３４，３５。
「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、望ましい生物学的活性を示す限り、単一のモノクローナル抗体及び／又は組換え抗体（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、及びＦｖ）を具体的にカバーする。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、単鎖、多特異性又は多効性、ヒト及びヒト化抗体、並びにその活性断片であってもよい。既知の抗原に結合する分子の活性断片の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ及びＦｖ断片が含まれ、Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーの産物、並びに上記の抗体及び断片のいずれかのエピトープ結合断片を含む。
「Ｆｖ」という用語は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインのダイマーで構成され、非共有結合で緊密に結合している。この構成では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を規定する。集合的に、６つのＣＤＲは抗体に抗原結合特異性を付与する。但し、単一の可変ドメイン（又は、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも、結合部位全体よりも低い親和性でありながら、抗原を認識して結合してもよい。
いくつかの実施形態において、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、即ち抗原に免疫特異的に結合する結合部位を含む分子を含んでいてもよい。典型的な抗体は、典型的には２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を有するヘテロテトラマー蛋白質を指す。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨと略記）及び重鎖定常ドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬと略記）及び軽鎖定常ドメインで構成される。任意の脊椎動物種の抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパとラムダと呼ばれる２つの明確に異なるタイプのいずれかに割り当てることができる。ＶＨ及びＶＬ領域は、超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）のドメインと、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域にさらに細分化してもよい。各可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）は典型的には、次の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される。アミノ末端からカルボキシ末端までがＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。軽鎖及び重鎖の可変領域内には、抗原と相互作用する結合領域がある。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラスがある。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、ＩｇＧ－４、ＩｇＡ－１及びＩｇＡ－２にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、デルタ、イプシロン、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造と三次元配置はよく知られている。
「価数」という用語は、個々の抗体分子が結合できる抗原決定基の数を指す抗体の価数を指す。全ての抗体の価数は少なくとも２であり、「抗体親和性」とは、抗体が抗原の表面の特定のエピトープに結合する傾向、即ち相互作用の強さを指す。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、集団を含む個々の抗体は、少量存在する可能性のある自然発生突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンにコンタミネーションされていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されない。例えば、本明細書の開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ３６によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、又は組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７参照）３７。「組換え」とは、外因性宿主細胞において組換え核酸技術により抗体を生成することを意味する。
モノクローナル抗体は、様々な方法により調製することができる。このような方法は、マウスハイブリドーマ、ファージディスプレイ、組換えＤＮＡ、初代Ｂ細胞から直接抗体の分子クローニング及び抗体発見法３８，３９，４０。モノクローナル抗体は、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と重鎖及び／又は軽鎖の一部が同一又は相同であり、一方、鎖の残りの部分は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来する、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、並びにそのような抗体の断片の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含んでいてもよい４１，４２。
「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するＣＤＲを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分が１つ（又はそれ以上）のヒト免疫グロブリンに由来する操作された抗体のタイプを指す。さらに、フレームワークサポート残基は、結合親和性を保持するために変更されてもよい。「ヒト化抗体」を得る方法は、当業者によく知られている４３，４４。
「単離」又は「精製」とは、それが自然に発生する成分の少なくともいくつかを含まない生体分子を意味する。「単離」又は「精製」とは、本明細書に開示の様々なポリペプチドを説明するために使用される場合、発現元の細胞又は細胞培養物から同定及び分離及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。典型的には、精製されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程により調製される。「単離又は精製された抗体」とは、異なる抗原結合特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。
「免疫原性」という用語は、抗体、Ｔ細胞、又は免疫原性物質に対する他の反応性免疫細胞の産生を誘発又は増強し、ヒト又は動物の免疫応答に寄与する物質を指す。免疫応答は、個体が、治療される障害を緩和又は軽減するために、投与された本発明の免疫原性組成物に対して十分な抗体、Ｔ細胞及び他の反応性免疫細胞を産生するときに起こる。免疫原性応答には一般に、免疫応答の細胞性（Ｔ細胞）と体液性（抗体）の両方のアームが含まれ、治療用タンパク質に対する抗体（抗薬物抗体、ＡＤＡ）は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及び／又はＩｇＡアイソタイプで構成される。
特定の抗原又はエピトープに対する「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「特異的」とは、非特異的相互作用とは明らかに異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を持たない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することにより測定し得る。例えば、特異的結合は、標的に類似した制御分子との競合により決定し得る。
「親和性」という用語は、抗体／抗原、受容体／リガンドなどの２つのポリペプチド間の引力の尺度を指す。２つのポリペプチド間の固有の引力は、特定の相互作用の結合親和性平衡解離定数（ＫＤ）として表すことができる。ＫＤ結合親和性定数は、例えば、バイオレイヤー干渉法によって測定することができる。ここで、ＫＤは、ｋｄｉｓ（解離速度定数）とｋｏｎ（結合速度定数）の比、即ち、ＫＤ＝ｋｄｉｓ／ｋｏｎである。
特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、少なくとも約１０－４Ｍ、少なくとも約１０－５Ｍ、少なくとも約１０－６Ｍ、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、少なくとも約１０－１２Ｍ、又はそれ以上の抗原又はエピトープに対するＫＤを有する抗体によって示され得る。ここで、ＫＤは特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原又はエピトープに対して対照分子の２０～、５０～、１００～、５００～、１０００～、５０００～、１００００～倍、又はより大きいＫＤを有してもよい。
また、特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、対照に対するエピトープについて少なくとも２０～、５０～、１００～、５００～、１０００～、５０００～、１００００～倍、又はより大きい抗原又はエピトープに対するＫＡ又はＫａを有する抗体により示すことができる。ここで、ＫＡ又はＫａは、特定の抗体－抗原相互作用の結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）速度を意味する。
二重特異性抗体は、単剤治療よりも毒性が高いことが多い併用療法よりも有利である可能性がある。本発明の二重特異性抗体などの二重特異性剤は、併用療法と同じ抗原を標的とする単剤として作用できるが、併用療法と比較して、有効性及び応答率が向上し、毒性が低下する。２つのモノクローナル抗体を使用する併用療法と比較して、二重特異性抗体療法は、結合特異性の増加により、患者への毒性が低く、及び／又はより強力である可能性がある。
一態様において、本発明は、Ｎ末端及びＣ末端を有し、少なくとも２つの結合ドメインを含み、前記結合ドメインがＦａｂ領域及びｓｃＦｖドメインを含む二重特異性抗体を提供する。前記ｓｃＦｖドメインは、前記抗体のＮ末端又はＣ末端のいずれかに結合されてもよい。前記Ｆａｂ領域及び前記ｓｃＦｖドメインは、それぞれ独立してＥＧＦＲファミリーにおける異なるタンパク質に対して結合特異性を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｓｃＦｖ分子は、Ｖ領域の方向（ＬＨ又はＨＬ）に関係なく、ＶＨとＶＬとを操作可能に結合させるリンカー（ＧｍＳ）ｎを含む。前記二重特異性抗体における他の部位は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ又はＩｇＧ ｎｕｌｌ Ｆｃ重鎖ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、及びそれに対応するκ又はλ軽鎖ＶＬ－ＣＬから構成されてもよい。これらのｓｃＦｖドメインは、リンカー（ＧｍＳ）ｎを介してＩｇＧ重鎖のＮ末端又はＣ末端に遺伝的に結合して、連続した～７５ｋＤａの重鎖モノマーペプチドを形成する。適切な軽鎖とコトランスフェクションされた場合、最終的な対称二重特異性分子を、ヒトＩｇＧ Ｆｃ（プロテインＡ）により精製し、アッセイ機能活性を評価することができる。
一実施形態において、ＥＧＦＲに対して結合特異性を有する結合ドメインは、セツキシマブ、パニツムマブ及びニモツズマブを含む。セツキシマブは、転移性結腸直腸がん及び頭頸部がんの治療に使用されるＥＧＦＲ阻害薬である。セツキシマブは、静脈内注入によって投与されるマウス／ヒトのキメラモノクローナル抗体である。
一実施形態において、ＨＥＲ３に対して結合特異性を有する結合ドメインは、ＭＭ－１１１（二重特異性ＨＥＲ２及びＨＥＲ３結合タンパク質）を含む。ＭＭ－１１１は、ヒト血清アルブミンタンパク質（ＨＳＡ）に支持された二重特異性抗体断片であり、ＨＥＲ３への１つの治療的結合（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）を含むが、ＨＥＲ２への結合だけでは治療的結合とみなすには不十分である。これに対し、トラスツズマブは、ＨＥＲ２への１つの単一の治療的結合を含む。
本明細書に開示される二重特異性抗体は、単一の薬剤を使用してＥＧＦＲ及びＨＥＲ３の両方に同時に結合する相乗効果を再現するという利点を有する。前記二重特異性四価抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）部分、並びにリンカー（例えば、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎリンカー、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎリンカー又は（ＧｍＳ）ｎリンカー）を介して前記重鎖又は軽鎖のＣ末端若しくはＮ末端に共有結合した２つのｓｃＦｖ部分を含んでもよい。
単一の治療薬は、その結合部分と骨格構造の選択がインビボでの結合効率と患者の治療効果に影響を与える可能性があるため、重大な課題をもたらすことが知られている。例えば、ＡＬＭは、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３を標的とする二重特異性抗体であり、インビボで腫瘍細胞に対する増殖阻害活性を示す。しかし、その循環半減期が短いため、腎クリアランスが急速であることから、候補となる可能性は低くなる３。
セツキシマブ及びパニツムマブの両方は、ＥＧＦＲを標的とするモノクローナル抗体（表１）であり、それらのアイソタイプ（即ち、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２）で異なっている。これは、結合親和性のＫＤ値の違いがＣＤＲ及びＦＲの配列を超えている可能性があることを示している。実際、ＩｇＧ１に対する「２－ｉｎ－１」二価二重特異性抗体の再フォーマットは、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に対する結合親和性のＫＤ値にそれぞれ影響を与える。ＳＩ－１ＸＣ６．４（Ｃ３）（ＷＯ２０１６１０６１５７Ａ１２０；その全体が参照により本明細書に組み込まれる；臨床試験ＮＣＴ０４６０３２８７ではＳＩ－Ｂ００１としても知られている）は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３を標的とする四価二重特異性抗体であり、デュリゴツズマブ（ＷＯ２０１６１０６１５７Ａ１に記載されているように、ＭＥＨＤ７９４５Ａ、「２－ｉｎ－１」抗体、又はＳＩ－１Ｃ４としても知られている２０）と直接比較して改善したＥＣ５０を有する。ＳＩ－１Ｘ６．４（Ｃ３）は、セツキシマブと同じ抗ＥＧＦＲ結合ドメインを含むが、親和性のＫＤ値が異なっている（表１ａ）。ＳＩ－１Ｘ６．４（Ｃ３）は、ＭＭ－１１１と同じ抗ＨＥＲ３結合ドメインを含むが、それらの親和性ＫＤ値が顕著に異なっている（表１ａ）。各二重特異性抗体の構造的構成は、腫瘍細胞を殺す効果の違いに寄与している可能性がある。多くの形態のヒトがんは、ＨＥＲ３ではなく、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２を過剰に発現するため、抗ＨＥＲ３結合ドメインの減少した親和性ＫＤによる予期せぬ利点により、ＳＩ－Ｂ００１は、ＥＧＦＲ陽性腫瘍細胞でのみＨＥＲ３に結合し、ＨＥＲ３陽性正常細胞に結合しない可能性がある。
治療的結合という用語は、安全性のために抗体治療の形で臨床試験で試験された結合ドメインを指す。特異性増強二重特異性抗体（ＳＥＢＡ）の概念は、正常細胞ではなく、同じ腫瘍細胞上の２つの腫瘍抗原への治療的結合の組み合わせを持つように構成された二重特異性抗体を定義する。ＥＧＦＲファミリーを例とする場合、複数の治療的結合ドメインがあり、セツキシマブ、トラスツズマブ、ＭＭ－１１１、及び「２－ｉｎ－１」に由来するものを含み、ＳＥＢＡの目的は、ＥＧＦＲファミリーの２つのメンバー（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３、又はＨＥＲ２／ＨＥＲ３のペア）に対する治療的結合を含む単一の治療薬として二重特異性抗体を開発及び／又は改善することである。各構成は、結合特異性、親和性、結合力、ヘレグリン結合、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３二量体化及び下流シグナル伝達の阻害、そして最終的には患者に対する治療効果と細胞毒性において異なる効果を示す可能性がある。
セツキシマブの潜在的な欠点は、その可変領域がマウス由来であることである。非ヒト配列を保持するキメラ抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体と比較した場合、より高い免疫原性の能力を有する可能性があることが実証されている６。一方、ヒト化は、フレームワーク領域の適合性を高めることにより、抗体の安定性を高めることができる７。もう１つの懸念は、ＶＨ Ｎ８５（Ｋａｂａｔ）のグリカン占有部位であり、Ｆａｂグリコシル化が抗体の生物学的特性に影響を与える可能性があり、製造中に十分に制御する必要があるグリカンの不均質を導入する可能性がある８，９。セツキシマブの免疫原性は、抗セツキシマブＩｇＧ応答の発生率が低い（５％）ことで低いが、過敏症は、よく見られるものであり、ＳＰ２／０細胞で発現されるＶＨを修飾するガラクトース－α－１，３－ガラクトースオリゴ糖に対する既存のＩｇＥ抗体が主な原因である１０。これらの欠点を克服するために、セツキシマブに対してヒト化及び翻訳後修飾部位の除去を行うことにより、抗体を安定化し、ＥＧＦＲに対する高い親和性を維持しながら免疫原性の可能性を減らすことができる。これによって、セツキシマブに由来の治療的結合ドメインを保有するヒト化ＥＧＦＲ結合ドメインは、既存のＳＥＢＡであるＳＩ－Ｂ００１の治療効果を改善することができる。
実施例
以下の実施例は、例示のみを目的として提供されており、限定するためのものではない。当業者は、本質的に同じ又は類似の結果をもたらすために変更又は修正できる様々な重要でないパラメータを容易に認識することができる。
実施例１：二重特異性四価抗ＥＧＦＲｘＨＥＲ３抗体ＳＩ－７１Ｘ１４
セツキシマブのヒト化は、最適な単一変異配列を生成するために、Ｃａｌｃｕｌａｔｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ＥｎｅｒｇｙをＴｒｕｅ（ＣＨＡＲＭｍ力場）に設定した様々な入力モデルを使用して設計された。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＳｔｕｄｉｏのＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｃａｓｃａｄｅによって生成されたセツキシマブモデルを使用した。入力配列は、セツキシマブＶＨ（ＴＶＳＡではなくＴＶＳＳで終わる）及びセツキシマブＶＬであった。ヒトのコンセンサス配列に対するＶＨ Ｃ末端の類似性を高めるために（図１）、又はＶκ Ｃ末端をよりＶλ様にするために、ヒト化は入力配列に変更を組み込んだ。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏでヒト化した後、Ｖκドメインの最後の３つの残基をλＪ遺伝子の対応する残基に変換することにより、ＶＬをさらに修飾した。ｓｃＦｖの安定性と凝集傾向を決定する際の最後のＶＬβ鎖の既知の重要性、及び相互作用を安定させるためのパッキングエネルギーを提供できるＶλ末端のより高い疎水性の性質のため、上記の変更を評価した２２，２３，２４。上位５つのフレームワークテンプレートは、１０の配列類似性カットオフで使用された。ＣＤＲループ定義をＨｏｎｅｇｇｅｒに設定し、ループごとの最大テンプレート数を３に設定し、最適化レベルを高に設定した。ヒト化配列を産生した後、ＶＬの最後の４つの残基をＬＴＶＬに置換してラムダ抗体の安定したＦＲ４を模倣することによりＶＬをさらに修飾した。
ヒト化セツキシマブＳＩ－７１Ｍ１は、セツキシマブの構造解析に基づいて、フレームワーク残基を、インシリコで最も安定した構造を引き起こしたヒト生殖細胞系列で少なくとも５％の頻度で発生する残基に変異させることによりた設計された。このタイプのヒト化のエネルギー分析は入力モデルに依存するため、いくつかの入力構造を調べた。ＳＩ－７１Ｘ１４は、ＭＭ－１１１のＨＥＲ３ ｓｃＦＶを（ＧｍＳ）ｎリンカーを介してＳＩ－７１Ｍ１重鎖のＣ末端に結合させることにより産生される。
したがって、ＳＩ－７１Ｘ１４は、ＳＩ－１Ｘ６．４の修飾であり、セツキシマブマウス可変領域がヒト化セツキシマブ可変領域で置換された。ＳＩ－１Ｘ６．４と異なる一次配列を除いて、ＳＩ－７１Ｘ１４はαＥＧＦＲ及びαＨＥＲ３二重特異性四価抗体でもある。
アミノ酸変化を図１に示す。図１Ａは、重鎖配列の１７個の残基の違いが抗ＥＧＦＲセツキシマブＶＨドメインに局在することを示す。図１Ｂは、軽鎖配列の２２個のアミノ酸の違いが抗ＥＧＦＲセツキシマブＶＫドメインに局在することを示す。図１Ｃは、ＶＨ領域を拡大して重鎖の全てのアミノ酸の違いを示す。図１Ｄは、ＶＫ領域を拡大して軽鎖の全ての違いを示す。
これらの２つの二重特異性タンパク質に加えて、多くの二重特異性及び単一特異性分子について、後続のアッセイで試験され、それらの特性を表１ｂに示す。これにより、異なるＥＧＦＲ及びＨＥＲ３結合ドメイン、ならびに異なるタイプの構造を比較することが可能になった。
タンパク質は、ＳＩ－１Ｃ７及びＳＩ－１Ｒ１２（単一プラスミド）のための発現プラスミドをトランスフェクションするか、ＳＩ－１Ｃ３、ＳＩ－１Ｃ５、ＳＩ－１Ｃ６、ＳＩ－７１Ｍ１、ＳＩ－１Ｘ２、ＳＩ－１Ｘ６．４、ＳＩ－７１Ｘ１４及びＳＩ－１Ｃ４のための重鎖と軽鎖（他の形式の場合）をＥｘｐｉＣＨＯシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でコトランスフェクションすることにより発現される。簡単に言えば、１０μｇの各発現プラスミド（又は２０μｇの非対合プラスミド）をＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ培地で１ｍｌにした。８０μｌのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ試薬を含む１ｍｌのＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ培地をＤＮＡに添加し、室温で２．５分間インキュベートした。次いで、得られた混合物を、１２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中の２５ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯ細胞に６×１０６細胞／ｍｌで添加し、３７℃、５％ＣＯ２、１５０ｒｐｍでインキュベートした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞にＥｘｐｉＣＨＯフィード８．７５ｍｌとＣＨＯエンハンサー１５０μｌを供給し、３２℃、５％ＣＯ２、１５０ｒｐｍに変更した。トランスフェクションの４８時間後に、再び、細胞に８．７５ｍｌのＥｘｐｉＣＨＯフィードを供給した。トランスフェクションの８日後に培養上清を回収し、４５００ｒｐｍで１時間遠心して細胞をペレット化し、０．２ｍｍフィルターに通した。
回収した上清から、１ｍｌのＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＦｃ含有タンパク質を精製した。カラムをリン酸緩衝生理食塩水で平衡化した。次いで、上清を流速２ｍｌ／分でカラムに通した。カラムをＰＢＳ １０ｍｌ＋０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、続いてＰＢＳ １０ｍｌ＋３００ｍＭ ＮａＣｌ、最後にＰＢＳ １０ｍｌで洗浄した。次いで、５ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）をカラムに通してタンパク質を溶出させた。溶出されたタンパク質を、０．５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）を添加して直ちに中和した。
１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ）を使用して、回収した上清からＨｉｓタグ付きｓｃＦｖタンパク質を精製した。カラムを、０．５ＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのイミダゾールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で平衡化した。上清を、０．５ＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのイミダゾールに到達するように１０ｘ結合バッファーでスパイクし、２ｍｌ／分の流速でカラムを通過させた。カラムを、１０カラム容量の０．５Ｍ ＮａＣｌ及び２０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳで洗浄した。次いで、タンパク質を、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び５００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＨｉｓＴｒａｐ）又は５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶出した。
第１段階のプロテインＡ又はＨｉｓタグ精製の直後に、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－ＣｌａｓｓとＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ２００Ａ、４．６ｍｍｘ１５０ｍｍ、１．７μｍカラムを使用して、タンパク質を分析ＳＥＣで分析した。ＰＢＳ（１２５ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８）を移動相として使用し、０．３ｍｌ／ｍｉｎで１０分間実行し、１０μｇのタンパク質を注入した。
セツキシマブは、２つの固有のＮ－グリコシル化部位Ｎ８５（Ｋａｂａｔ）とＮ２９７（Ｅｕ）を有し、それぞれＦａｂとＦｃにある。Ｎ８５位置にある可能な免疫原性Ｎ－グリカンは、薬物動態プロファイルに影響を与え、抗薬物抗体（ＡＤＡ）を生じさせる可能性がある。ヒト化バージョンにおいて、８５位がＮからＤに変異し、これによって、コンセンサスＮ－グリコシル化部位が消失し、発現したタンパク質でグリコシル化が検出されなかった。表２、４に示すように、この戦略はタンパク質の精製と特徴解析に役立ったが、結合親和性には影響を与えなかった。
実施例２：ヒトＥＧＦＲに対する結合動力学
Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４機器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いてバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結合アッセイにより単量体ＥＧＦＲ細胞外ドメイン結合を測定した。１０μｇ／ｍＬのＳＩ－７１Ｘ１４、ＳＩ－７１Ｍ１、ＳＩ－１Ｘ６．４、ＳＩ－１Ｃ３、ＳＩ－１Ｘ２、ＳＩ－１Ｃ６、ＳＩ－１Ｘ４．２、ＳＩ－１Ｃ４又はＳＩ－１Ｃ５をアッセイバッファー（１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で希釈し、抗ｈｕＩｇＧ Ｆｃ（ＡＨＣ）バイオセンサーチップで１８０秒捕捉した。チップをアッセイバッファーで６０秒洗浄し、１００ｎＭから０ｎＭまでの１：２連続希釈でヒトＥＧＦＲ（社内で発現及び精製）サンプルに移した。チップへのＥＧＦＲ細胞外ドメインの結合を、１８０秒の結合時間（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）にわたってバイオレイヤー干渉法シグナル（Δｎｍ）として記録した。チップをアッセイバッファーに移し、解離を４２０秒観察した。１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を用いてセンサーを再生した。動的パラメータｋｏｎ、ｋｄｉｓ及びＫＤを抽出するために、データを各抗体の１：１結合モデルにグローバルフィッティングした（図２、表２）。
特に、全てのセツキシマブベースのタンパク質は、ヒトＥＧＦＲと同様の結合動力学を示した。例えば、ｍＡｂ ＳＩ－１Ｃ６（セツキシマブ）及びＳＩ－７１Ｍ１（ヒト化セツキシマブ）は、それぞれ５．３４及び４．７６ｎＭのＫＤ値を有した。二重特異性（ＥＧＦＲｘＨＥＲ３）分子ＳＩ－１Ｘ６．４（マウスフレームワークを有するセツキシマブ可変領域を含む）及びＳＩ－７１Ｘ１４（ヒト化セツキシマブフレームワーク）は、同様のＥＧＦＲ結合動力学を有し、ＫＤがそれぞれ５．３８及び４．６１ｎＭであった。一方、パニツムマブベースのｍＡｂ（ＳＩ－１Ｃ３）及び二重特異性（ＳＩ－１Ｘ２）タンパク質は、やや高い親和性を有し、ＫＤ値がそれぞれ２．２８及び２．７７ｎＭであり、解離速度がより低かった。ニモツズマブベースのｍＡｂ（ＳＩ－１Ｃ５）及び二重特異性（ＳＩ－１Ｘ４．２）タンパク質は、より遅い結合動力学とより速い解離動力学のため、親和性がより低く、ＫＤ値がそれぞれ１５．８及び１８．８ｎＭであった。２－ｉｎ－１二重特異性抗体デュリゴツズマブ（ＳＩ－１Ｃ４）は、１４．６ｎＭのＥＧＦＲ親和性を有し、解離速度が最も速かった。
実施例３：ヒトＨＥＲ３に対する結合動力学
Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４機器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いてバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結合アッセイにより単量体ＨＥＲ３細胞外ドメイン結合を測定した。１０μｇ／ｍＬのＳＩ－７１Ｘ１４、ＳＩ－１Ｃ７、ＳＩ－１Ｃ４、ＳＩ－１Ｘ６．４、ＳＩ－１Ｘ２又はＳＩ－１Ｘ４．２をアッセイバッファー（１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で希釈し、抗ｈｕＩｇＧ Ｆｃ（ＡＨＣ）バイオセンサーチップで１８０秒捕捉した。チップをアッセイバッファーで６０秒洗浄し、４００ｎＭから０ｎＭまでの１：２連続希釈でヒトＨＥＲ３（Ａｃｒｏ ＥＲ３－Ｈ５２２３）サンプルに移した。チップへのＨＥＲ３細胞外ドメインの結合を、１８０秒の結合時間（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）にわたってバイオレイヤー干渉法シグナル（Δｎｍ）として記録した。チップをアッセイバッファーに移し、解離を４２０秒観察した。１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を用いてセンサーを再生した。動的パラメータｋｏｎ、ｋｄｉｓ及びＫＤを抽出するために、データを各抗体の１：１結合モデルにグローバルフィッティングした（図３、表３）。
特に、抗ＨＥＲ３ドメインがＭＭ－１１１に由来する全てのタンパク質は、ヒトＨＥＲ３に対して同様の結合動力学を有した。例えば、セツキシマブベースの二重特異性タンパク質ＳＩ－１Ｘ６．４（マウスフレームワークを有するセツキシマブ可変領域）及びＳＩ－７１Ｘ１４（ヒト化セツキシマブフレームワーク）は、それぞれ１０７及び１１７ｎＭのＫＤ値を有した。パニツムマブ及びニモツズマブベースの二重特異性抗体ＳＩ－１Ｘ２及びＳＩ－１Ｘ４．２は、それぞれのＨＥＲ３ ＫＤ値が１３１及び１４６ｎＭであった。同じ抗ＨＥＲ３ドメイン（ＳＩ－１Ｃ７）を有する対照Ｆｃ－ｓｃＦｖタンパク質は、同様の結合動力学を有し、ＫＤが１４９ｎＭであった。２－ｉｎ－１二重特異性抗体デュリゴツズマブ（ＳＩ－１Ｃ４）は、他の二重特異性タンパク質と異なる抗ＨＥＲ３可変領域を有し、ＨＥＲ３結合が顕著により強くなり、ＫＤが４．２９ｎＭであった。
Ｆｃドメインがないため、ＡＲ２Ｇセンサーを用いた同じＯｃｔｅｔ機器を使用し、異なるアッセイフォーマットで別の比較二重特異性タンパク質（ＳＩ－１Ｒ１２＝ＭＭ－１１１、ＨＥＲ２ｘＨＥＲ３アルブミン融合）を試験した。２０μｇ／ｍＬのＳＩ－１Ｒ１２を１０ｍＭアセテート（ｐＨ６．０）で希釈し、メーカーの指示に従ってＥＤＣ／ＮＨＳを用いて６００秒のローディングステップで共有結合した。ＳＩ－１Ｒ１２固定化後、チップをアッセイバッファーで１２０秒洗浄し、４００ｎＭから０ｎＭまでの１：２連続希釈でヒトＨＥＲ３（Ａｃｒｏ ＥＲ３－Ｈ５２２３）サンプルに移した。チップへのＨＥＲ３細胞外ドメインの結合を、１８０秒の結合時間（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）にわたってバイオレイヤー干渉法シグナル（Δｎｍ）として記録した。チップをアッセイバッファーに移し、解離を４２０秒観察した。動的パラメータｋｏｎ、ｋｄｉｓ及びＫＤを抽出するために、データを各抗体の１：１結合モデルにグローバルフィッティングした（図３、表３）。ＨＥＲ３に対するＳＩ－１Ｒ１２の結合動力学は、試験された他の二重特異性と同様であり、ＫＤ値が９５．６ｎＭであった。
実施例４：ヒトＥＧＦＲ及びＨＥＲ３への同時結合
ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３細胞外ドメインに対する二重特異性結合は、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４機器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いてサンドイッチ型バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結合アッセイで測定した。アッセイバッファー（１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）における１８０秒のベースラインステップの後、ビオチン化ヒトＥＧＦＲ（Ａｃｒｏ ＥＧＦ－Ｈ８２Ｅ３）アッセイバッファー中５μｇ／ｍｌでＳＡセンサーに２４０秒ロードした。さらなる１８０秒のベースラインステップの後、アッセイバッファー中のＳＩ－１Ｃ７、ＳＩ－１Ｘ２、ＳＩ－１Ｘ４．２、ＳＩ－１Ｘ６．４、ＳＩ－７１Ｍ１又はＳＩ－７１Ｘ１４の２倍連続希釈（０～１００ｎＭ）との結合を２４０秒行い、続いてタンパク質を含まないアッセイバッファー中で６００秒解離させた。抗体結合ステップの直後に、５００ｎＭのＨＥＲ３ ＥＣＤ（社内で発現）との別の結合ステップを実行し、続いて解離ステップを６００秒実行した。１：１結合モデルを使用して各結合／解離イベントを個別にフィットし、二重特異性ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３結合の結合動力学を抽出した。
このアッセイで測定される最初の結合イベントは、固定化ＥＧＦＲに結合する抗体の結合イベントであり、細胞表面で発生する可能性のある相互作用のアビディティを表す。これらのデータを図４に示し、動力学的パラメータを表４に示す。このデータは、ヒト化セツキシマブｍＡｂ（ＳＩ－７１Ｍ１）及び二重特異性セツキシマブｘ抗ＨＥＲ３抗体ＳＩ－１Ｘ６．４（マウスフレームワークを有するセツキシマブ可変領域）及びＳＩ－７１Ｘ１４（ヒト化セツキシマブフレームワーク）を含むセツキシマブベースの抗体は、いずれも固定化ＥＧＦＲに対して非常に高いアビディティを有し、相互作用のＫＤが小さすぎて正確に定量化できなかったが、１ｐＭ未満と推定された。この高いアビディティは、非常に低い解離速度によるものであった。同様に、パニツムマブベースのＥＧＦＲｘＨＥＲ３二重特異性抗体ＳＩ－１Ｘ２も高いアビディティを有し、ＫＤが１ｐＭ未満と推定された。ニモツズマブベースのＥＧＦＲｘＨＥＲ３二重特異性抗体ＳＩ－１Ｘ４．２も強いアビディティを有し、フィッティングしたＫＤ値が３９８ｐＭであった。予想どおり、ＨＥＲ３に特異的なＦｃ－ｓｃＦｖタンパク質であるＳＩ－１Ｃ７は、ＥＧＦＲへの結合を示さなかった。
関心のある２番目のイベントは、溶液中のＨＥＲ３タンパク質に対する捕捉された抗体（その抗ＥＧＦＲドメインを介して既に結合している）の結合である。これらの相互作用の動力学的パラメータを表５に示す。セツキシマブベースのＥＧＦＲｘＨＥＲ３二重特異性抗体ＳＩ－１Ｘ６．４（マウスフレームワークを有するセツキシマブ可変領域）及びＳＩ－７１Ｘ１４（ヒト化セツキシマブフレームワーク）は、ＨＥＲ３ ＫＤ値がそれぞれ６１７及び９２２ｎＭであった。パニツムマブ及びニモツズマブベースのＥＧＦＲｘＨＥＲ３二重特異性抗体ＳＩ－１Ｘ２及びＳＩ－１Ｘ４．２は、同様のＨＥＲ３親和性を有し、それぞれ７７０及び１６５ｎＭであった。特に、ヒト化セツキシマブｍＡｂ（ＳＩ－７１Ｍ１）は、ＨＥＲ３に対する特異性が欠如しているため、このアッセイステップでは結合を示さなかった。ＨＥＲ３を標的とするＦｃ－ｓｃＦｖタンパク質ＳＩ－１Ｃ７は、ＥＧＦＲ結合ステップにローディングがないため、結合応答を示さなかった。したがって、このサンドイッチアッセイは、ＥＧＦＲｘＨＥＲ３二重特異性抗体がＥＧＦＲとＨＥＲ３に同時に結合できることを示しているのに対し、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３のいずれかに対する特異性のみを有するタンパク質はこのアッセイで結合応答を示さなかった。
実施例５：改善された熱安定性
タンパク質の熱安定性分析のために、Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩＩで動的光散乱を実行した。タンパク質を、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、７５ｍＭ塩化ナトリウム、５％（ｗ／ｖ）スクロース（ｐＨ５．５）で３０μｌ／ウェル中で１ｍｇ／ｍｌに希釈した。半径を監視しながら、温度を１．０℃／ｍｉｎで２５℃から８５℃まで上昇させた。異なる形状のアンフォールディング曲線を再現可能にフィッティングするのが困難であるため、半径が１５ｎｍを超えた温度が熱安定性の客観的な測定基準として使用された。サンプルを２回（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）実行し、バッファー単独を陰性対照として実行した。
図５は、ＳＩ－７１Ｘ１４、ＳＩ－７１Ｍ１、ＳＩ－１Ｃ７、ＳＩ－１Ｃ４、ＳＩ－１Ｘ６．４、ＳＩ－１Ｃ６、ＳＩ－１Ｒ１２、ＳＩ－１Ｃ５、ＳＩ－１Ｃ３、ＳＩ－１Ｘ２及びＳＩ－１Ｘ４．２の熱融解曲線を示し、表６は、これらのタンパク質のＴｍ値を示す。ＥＧＦＲ ｍＡｂパニツムマブ（ＳＩ－１Ｃ３）、ニモツズマブ（ＳＩ－１Ｃ５）、セツキシマブ（ＳＩ－１Ｃ６）及びヒト化セツキシマブ（ＳＩ－７１Ｍ１）は、Ｔｍ値がそれぞれ７７．０５、６５．７９、６８．３９及び７７．８０℃であった。したがって、セツキシマブのヒト化により、熱安定性が９℃を超えて上昇しただけでなく、試験した４つの中で最も安定したＥＧＦＲ ｍＡｂが生成された。パニツムマブ（ＳＩ－１Ｘ２）、ニモツズマブ（ＳＩ－１Ｘ４．２）、セツキシマブ（ＳＩ－１Ｘ６．４）及びヒト化セツキシマブ（ＳＩ－７１Ｘ１４）に基づく二重特異性ＥＧＦＲｘＨＥＲ３抗体は、Ｔｍ値がそれぞれ６３．７３、６３．７９、６２．３３及び６４．１０℃であった。したがって、ＥＧＦＲ ｍＡｂのＣ末端への抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖの付加は、熱安定性を基準化して低下させる傾向があった。特に、ヒト化セツキシマブに基づく二重特異性ＥＧＦＲｘＨＥＲ３抗体は、最も高い熱安定性を有し、親セツキシマブタンパク質の安定性を１．７７℃向上させた。抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖ（ＳＩ－１Ｃ７）に融合した抗体Ｆｃに基づく対照タンパク質のＴｍは６３．１７℃であり、この抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖドメインを含む二重特異性分子と同様であった。二重特異性抗体ＳＩ－１Ｃ４のＴｍは６９．８０℃であり、ｍＡｂ様プラットフォームの高い安定性を確認した。最後に、ＭＭ－１１１二重特異性ＨＳＡ融合（ＳＩ－１Ｒ１２）は、熱安定性が最も低く、Ｔｍが６０．４１℃であった。この結果は、他のタンパク質足場と比較して、抗体フォーマットの良好な安定性を示している。
実施例６：ヒトＥＧＦＲ及びＨＥＲ３への順次結合
ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３細胞外ドメインへの二重特異性結合は、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４機器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いてタンデムバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）結合アッセイにより測定した。
一フォーマットにおいて、抗体タンパク質をＡＨＣセンサーに捕捉し、次に、ＥＧＦＲとの第１結合ステップを実行し、さらに、ＨＥＲ３との第２結合ステップを実行し、その後、解離ステップを実行した（図６）。具体的には、アッセイバッファー（１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）における２０秒のベースラインステップの後、１０μｇ／ｍｌの抗体タンパク質を１８０秒ロードした後、６０秒のベースラインステップを行った。次に、１００ｎＭのＥＧＦＲ（社内で精製）で第１結合ステップを７２０秒実行し、１００ｎＭのＥＧＦＲ及び４００ｎＭのＨＥＲ３（Ａｃｒｏ ＥＲ３－Ｈ５２２３）で第２結合ステップを７２０秒実行した。なお、第２ステップにはＨＥＲ３タンパク質が含まれたが、第１ステップと同じ量のＥＧＦＲ（１００ｎＭ）が追加で含まれたため、ＥＧＦＲの解離は第２ステップで観察された反応速度を複雑にすることがなかった。最後に、７２０秒の解離ステップを実行した。
最初にＥＧＦＲ次にＨＥＲ３ステップのアッセイにおいて、対照ＥＧＦＲ ｍＡｂ ＳＩ－１Ｃ６及びＳＩ－７１Ｍ１は、ＥＧＦＲ段階で大きな応答を示し、ＨＥＲ３段階では応答の顕著な増加は見られなかった。これは、第２ステップでＨＥＲ３に結合することではなく、第１ステップでＥＧＦＲに結合することを示している。ＨＥＲ３を標的とする対照Ｆｃ－ｓｃＦｖタンパク質であるＳＩ－１Ｃ７は、第１のＥＧＦＲステップでは結合を示さなかったが、第２のＨＥＲ３ ステップでは大きな応答を示した。２－ｉｎ－１コントロールｍＡｂ ＳＩ－１Ｃ４は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３ステップで結合を示しており、これは、第１のＥＧＦＲステップでは抗体結合を飽和させるのに十分ではなかったため、追加のＨＥＲ３分子が第２のステップで結合できることを示している。二重特異性ＥＧＦＲｘＨＥＲ３抗体であるＳＩ－１Ｘ６．４及びＳＩ－７１Ｘ１４は、ＥＧＦＲとＨＥＲ３ステップの両方では顕著な結合応答を示しており、これらのタンパク質がＥＧＦＲ及びＨＥＲ３分子に同時に結合できることが確認された。
上記のアッセイにおいて、また、ＳＩ－７１Ｘ１４はＳＩ－１Ｘ６．４（Ｙ軸のｎｍ）よりも良好な結合応答を示し、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ３結合ステップで約０．１ｎｍであり、ＳＩ－７１Ｘ１４の結合量がＳＩ－１Ｘ６．４よりも高いことを示している。
別のフォーマットにおいて、抗体タンパク質をＡＨＣセンサーに捕捉し、次に、ＨＥＲ３との第１結合ステップを実行し、さらに、ＥＧＦＲとの第２結合ステップを実行し、その後、解離ステップを実行した（図７）。具体的には、アッセイバッファー（１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）における２０秒のベースラインステップの後、１０μｇ／ｍｌの抗体タンパク質を１８０秒ロードした後、６０秒のベースラインステップを行った。次に、４００ｎＭのＨＥＲ３（Ａｃｒｏ ＥＲ３－Ｈ５２２３）で第１結合ステップを７２０秒実行し、１００ｎＭのＥＧＦＲ（社内で精製）及び４００ｎＭのＨＥＲ３で第２結合ステップを７２０秒実行した。なお、第２ステップにはＥＧＦＲタンパク質が含まれたが、第１ステップと同じ量のＨＥＲ３（４００ｎＭ）が追加で含まれたため、ＨＥＲ３の解離は第２ステップで観察された反応速度を複雑にすることがなかった。最後に、７２０秒の解離ステップを実行した。
最初にＨＥＲ３次にＥＧＦＲステップのアッセイにおいて、対照ＥＧＦＲ ｍＡｂであるＳＩ－１Ｃ６及びＳＩ－７１Ｍ１は、予想どおり、ＨＥＲ３結合ステップでは応答を示さず、その後のＥＧＦＲステップでは大きな応答を示した。ＨＥＲ３を標的とする対照のＦｃ－ｓｃＦｖタンパク質であるＳＩ－１Ｃ７は、予想どおり、第１のＨＥＲ３ステップで結合を示したが、第２のＥＧＦＲステップで結合を示さなかった。２－ｉｎ－１対照ｍＡｂであるＳＩ－１Ｃ４は、第１のＨＥＲ３ステップで顕著な結合を示したが、第２のＥＧＦＲ結合ステップでは追加の結合を示さなかった。その原因は、この抗体の両方のＦａｂ領域が第１のステップでＨＥＲ３に結合したため、第２のステップでＥＧＦＲに結合する自由なＦａｂがなくなったということである。二重特異性ＥＧＦＲｘＨＥＲ３抗体であるＳＩ－１Ｘ６．４及びＳＩ－７１Ｘ１４は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３ステップの両方において顕著な結合応答を示し、これらの分子がＥＧＦＲ及びＨＥＲ３分子に同時に結合可能であることを示している。重要なのは、ＳＩ－１Ｘ６．４及びＳＩ－７１Ｘ１４構造の四価の性質と、各抗原のそれぞの結合ドメインにより、これらの抗体がＥＧＦＲとＨＥＲ３に同時に結合することを可能にしたが、この現象は２－ｉｎ－１対照ｍＡｂであるＳＩ－１Ｃ４では発生できることである。
上記のアッセイにおいて、また、ＳＩ－７１Ｘ１４はＳＩ－１Ｘ６．４（Ｙ軸のｎｍ）よりも良好な結合応答を示し、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ３結合ステップでは約０．１ｎｍであり、ＳＩ－７１Ｘ１４の結合量がＳＩ－１Ｘ６．４よりも高いことを示している。
以上より、結合動力学の特徴解析は、ＳＥＢＡの作用機序、即ち、特異性が強化された二重特異性抗体（例えば、ＳＩ－７１Ｘ１４及びＳＩ－１Ｘ６．４）を示す。インビトロ動態とは異なり、二重特異性抗体治療の反応と有効性はＥＧＦＲとＨＥＲ３の組織分布に依存する可能性がある。様々な形態の固形腫瘍を有する患者では、ＥＧＦＲの発現はデレギュレーションによって調節解除される可能性がある一方、ＨＥＲ３は正常細胞と腫瘍細胞の両方によって発現される可能性がある。ところで、多くの抗ＨＥＲ３抗体療法は安全性の問題により失敗しており、インビボで腫瘍細胞と比べてより多い正常細胞を標的とする可能性があることを示している。本発明において、上記の結果は、ＳＩ－１Ｘ６．４とＳＩ－７１Ｘ１４の両方が連続結合モードを実行できること、及びヒト化ＥＧＦＲ結合ドメインを持つＳＩ－７１Ｘ１４が改善された結合動力学を明らかにすることを示している。ＥＧＦＲ（強）とＨＥＲ３（弱）の異なるＫＤ値は、ＳＩ－７１Ｘ１４とＳＩ－１Ｘ６．４の両方の選択的結合の根底にあり、ＨＥＲ３陽性正常細胞と比較してＥＧＦＲ発現がん細胞への結合に有利である。これに関連して、ＳＥＢＡはインビボでの副作用の軽減を達成するのに役立つ可能性がある。さらに、２つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して異なる結合親和性を有することは、強いＫＤ値と弱いＫＤ値によって測定されるように、がんを引き起こす受容体を標的とするようにＳＥＢＡを設計するための新しい戦略になる可能性がある。
実施例７：腫瘍細胞増殖の阻害
抗体を含む抗ＥＧＦＲドメインの増殖阻害能力を評価するために、セツキシマブ由来のＥＧＦＲドメイン（ｗｔ）とヒト化ＥＧＦＲ結合ドメインの効果を、異なる治療フォーマットで比較した。ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３タンパク質の両方、ならびにＨＥＲ２タンパク質を発現するＦａｄｕ細胞株（下咽頭扁平上皮がん、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－４３）に対して増殖阻害効果を試験した（図８）。Ｆａｄｕ細胞をＥＧＦＲ、ＨＥＲ３又はＨＥＲ２のいずれかに特異的な蛍光結合抗体及びアイソタイプマッチ対照抗体と共にインキュベートすることにより、特異的な抗原提示を決定した。ＦＡＣＳ法（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ）により細胞への抗体結合を定量化した。
細胞株を、１％ＦＢＳを含有する２００μｌのＲＰＭＩ－１６４０培地中、ウェル当たり５０００細胞の密度で、９６ウェル組織培養プレートに播種した。９０ｎＭ～８５．８ｆＭの用量範囲内で処置を加えた。細胞を試験抗体の存在下で３つの重複した（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）プレート中で６３時間培養した。時系列顕微鏡（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｚｏｏｍ）を使用して、Ｆａｄｕ細胞株の核局在蛍光レポータータンパク質ｍＫａｔｅ２の安定発現に基づいて、核数を取得した。データをベースラインで収集し、培養中に間隔を置いて収集した。正規化された増殖は、ウェル播種及び未処理の対照条件に基づいて報告される。ｗｔセツキシマブとヒト化セツキシマブの抗増殖効果の比較効果は、シグモイド、４ＰＬ、最小二乗法を用いた回帰分析に基づいて提供される用量反応曲線及び阻害のＩＣ－５０で表された（Ｘは濃度であり、曲線あてはめは図においてＲ２値として提供される（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９））。
ｗｔセツキシマブドメインを、ＨＥＲ３を有する二重特異性フォーマット（ＳＩ－Ｘ６．４）で利用する場合、ＩＣ－５０は、ＥＧＦＲ ｍＡｂ単独（ＳＩ－１Ｃ６）と比較して３倍減少し、ＨＥＲ３ドメインの追加により、全体的な抗増殖効果が大きくなる（図９）。しかし、ヒト化セツキシマブドメインは、ＨＥＲ３結合ドメイン（ＳＩ－７１Ｘ１４）と組み合わせると、ヒト化セツキシマブｍＡｂ単独（ＳＩ－７１Ｍ１）と比較して抗増殖性ＩＣ－５０を回復し、より高い濃度でより大きな全体的な抗増殖効果を保持する（図１０）。
二重特異性フォーマットでＥＧＦＲ阻害機能を増強するＨＥＲ３の役割と一致して、パニツムマブ（ＳＩ－１Ｃ３）は、ＨＥＲ３ドメインを有する二重特異性フォーマット（ＳＩ－１Ｘ２）にエンジニアされた場合、より高い全体的な抗増殖効果が得られる（図１１）。ＥＧＦＲ抗体ニモツズマブ（ＳＩ－１Ｃ５）は、このアッセイシステムでＦａｄｕ細胞増殖の阻害能力が低いことを示し、二重特異性フォーマット（ＳＩ－１Ｘ４．２）におけるニモツズマブへのＨＥＲ３の追加は利益をもたらすことが観察されない。これは、二重特異性薬物設計において抗増殖効果を促進してＨＥＲ３遮断の利点を達成するＥＧＦＲドメインの重要な要件を証明している（図１２）。
二重特異性フォーマット（ＳＩ－７１Ｘ１４）のＨＥＲ３結合ドメインと組み合わせたヒト化セツキシマブに対するＦａｄｕ応答は、同じフォーマット（ＳＩ－１Ｘ６．４）のｗｔセツキシマブと比較して３倍優れた抗増殖性ＩＣ－５０を達成する。ＳＩ－７１Ｘ１４のヒト化ＥＧＦＲはさらに、高濃度で顕著に高い全体的な抗増殖効果を達成する（図１３）。比較として、ＳＩ－１Ｃ４は、Ｓｃｈａｅｆｅｒによって記述されたツーインワンプラットフォーム上で構築されたＥＧＦＲとＨＥＲ３に対する二重特異性抗体である３０。ＩＣ４は、モノクローナル抗体と類似の構造を有する。この分子は、各Ｆａｂアーム上のＥＧＦＲ又はＨＥＲ３のいずれかに結合できるが、各Ｆａｂアーム上の両方の標的に同時に結合できない。ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３のいずれか、及び両方の受容体を過剰に遮断する場合、２－ｉｎ－１の抗増殖性能は、ＳＩ－７１Ｘ１４及びＳＩ－１Ｘ６．４の二重特異性フォーマットの両方よりも低い（図１４）。比較として、ＳＩ－１Ｒ１２は、抗増殖効果が報告されているＨＥＲ２ＸＨＥＲ３二重特異性抗体ＭＭ－１１１である。しかし、Ｆａｄｕは、ＨＥＲ２とＨＥＲ３の両方を発現するが、阻害は達成されない。これは、この細胞株上のＨＥＲ２及びＨＥＲ３ではなく、ＨＥＲ３遮断による抗増殖効果を促進するＥＧＦＲの重要な組み合わせを証明している（図１３）。
セツキシマブ抗体のリエンジニアリングにより、Ｔ細胞エンゲージャーの二重及び五重特異的構造で示されるように、ｗｔセツキシマブと比較して多重特異性フォーマットでエンジニアリングされた場合、及びＨＥＲ３結合ドメインと組み合わせた場合、抗増殖効力が高くなる。ヒト化セツキシマブドメインは、ｗｔセツキシマブと比較して、ＨＥＲ３結合ドメインと組み合わせた場合、全体的な抗増殖効果も高くなる。
表
表１ａ：ＴＡＡ結合ドメインのＫＤ値は、治療用抗体によって異なる場合がある。
＃Ｆａｄｕ及びＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞のそれぞれを使用したＡＤＣＣ分析の結果
表１ｂ：ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３又はその両方を標的とする治療用結合ドメインを有する抗体
表２：バイオレイヤー干渉法により測定されたＨｉｓタグ付きヒトＥＧＦＲ細胞外ドメインに対する抗ＥＧＦＲタンパク質の結合動力学（親和性）
表３：バイオレイヤー干渉法により測定されたＨｉｓタグ付きヒトＨＥＲ３細胞外ドメインに対する抗ＨＥＲ３タンパク質の結合動力学（親和性）
なお、ＡＨＣセンサーを使用して決定された他の全ての測定と対照的に、ＳＩ－１Ｒ１２はＦｃドメインがないため、ＡＲ２Ｇセンサーでセットアップする必要があった。
表４：バイオレイヤー干渉法により測定されたビオチン化ヒトＥＧＦＲ細胞外ドメインに対する抗ＥＧＦＲタンパク質の結合動力学（アビディティー）
表５：サンドイッチ型Ｏｃｔｅｔアッセイにおけるビオチン化ヒトＥＧＦＲへの結合後の、ヒトＨｉｓタグ付きＨＥＲ３に対する抗ＥＧＦＲｘＨＥＲ３タンパク質及び対照の結合動力学（親和性）
なお、単一特異性抗ＥＧＦＲ（ＳＩ－７１Ｍ１）及び抗ＨＥＲ３（ＳＩ－１Ｃ７）タンパク質は、予想どおり、ＨＥＲ３結合ステップ中に結合シグナルを示さなかった。
表６：バイオレイヤー干渉法により測定されたＨｉｓタグ付きヒトＥＧＦＲ細胞外ドメインに対する抗ＨＥＲ３タンパク質の結合動力学
なお、ＡＨＣセンサーを使用して決定された他の全ての測定と対照的に、ＳＩ－１Ｒ１２はＦｃドメインがないため、ＡＲ２Ｇセンサーでセットアップする必要があった。
配列表
αＥＧＦＲ可変ドメインの配列
モノクローナル抗体及び二重特異性抗体の配列

>Sequence ID 1: SI-71X14 αEGFR VH amino acid sequence
QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS

>Sequence ID 2: SI-71X14 αEGFR VH nucleotide sequence
CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTGAGACACTGTCCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGAGCGTGCGGGCTGATGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCT

>Sequence ID 3: SI-71X14 αEGFR VL amino acid sequence
EIVLTQSPSTLSVSPGERATFSCRASQSIGTNIHWYQQKPGKPPRLLIKYASESISGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYCQQNNNWPTTFGPGTKLTVL

>Sequence ID 4: SI-71X14 αEGFR VL nucleotide sequence
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCACACTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCCATCAGCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGCAGTCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGACCCGGCACCAAGCTGACCGTGCTG

>Sequence ID 5: SI-71X14 αHER3 VH amino acid sequence
QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGVGYFDLWGRGTLVTVSS

>Sequence ID 6: SI-71X14 αHER3 VH nucleotide sequence
CAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCGCGATGGAAGTGCGAGTTACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTGGGGTGGGCTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC

>Sequence ID 7: SI-71X14 αHER3 VL amino acid sequence
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVL

>Sequence ID 8: SI-71X14 αHER3 VL nucleotide sequence
CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATCTATGATGTCAGTGATCGGCCCTCAGGGGTGTCTGATCGCTTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGATCATCTCTGGCCTCCAGGCTGACGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGGGAGCAGCAGCACTCATGTGATTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGACCGTCCTA

>Sequence ID 9: SI-71M1 HC amino acid sequence
QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

>Sequence ID 10: SI-71M1 HC nucleotide sequence
CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTGAGACACTGTCCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGAGCGTGCGGGCTGATGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAG


>Sequence ID 11: SI-71M1 and SI-71X14 LC amino acid sequence
EIVLTQSPSTLSVSPGERATFSCRASQSIGTNIHWYQQKPGKPPRLLIKYASESISGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYCQQNNNWPTTFGPGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

>Sequence ID 12: SI-71M1 and SI-71X14 LC nucleotide sequence
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCACACTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCCATCAGCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGCAGTCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGACCCGGCACCAAGCTGACCGTGCTGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG

>Sequence ID 13: SI-71X14 HC amino acid sequence
QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSQVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGVGYFDLWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQADDEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVL

>Sequence ID 14: SI-71X14 HC nucleotide sequence
CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTGAGACACTGTCCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGAGCGTGCGGGCTGATGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCACAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCGCGATGGAAGTGCGAGTTACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGTGGGGTGGGCTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCCGGCGGTGGCGGCTCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTTTGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATCTATGATGTCAGTGATCGGCCCTCAGGGGTGTCTGATCGCTTCTCCGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGATCATCTCTGGCCTCCAGGCTGACGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGGGAGCAGCAGCACTCATGTGATTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGACCGTCCTATAA

参考文献
1. Diaz-Serrano, A. et al. Genomic Profiling of HER2-Positive Gastric Cancer: PI3K/Akt/mTOR Pathway as Predictor of Outcomes in HER2-Positive Advanced Gastric Cancer Treated with Trastuzumab. Oncologist.23, 1092-1102 (2018).
2. Durkee, BY, et al. Cost-Effectiveness of Pertuzumab in Human Epidermal Growth Factor Receptor 2-Positive Metastatic Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 2016, 34 (9): 902-9.
3. Robinson, Matthew K., et al. "Targeting ErbB2 and ErbB3 with a bispecific single-chain Fv enhances targeting selectivity and induces a therapeutic effect in vitro." British journal of cancer 99.9 (2008): 1415-1425.
4. Goel, S. & Winer, E. P. POINT: HER2-Targeted Combinations in Advanced HER2-Positive Breast Cancer. Oncology (Williston Park). 29, 797-798, 802 (2015).
5. Luque-Cabal, M. et al. Mechanisms Behind the Resistance to Trastuzumab in HER2-Amplified Breast Cancer and Strategies to Overcome It. Clin. Med. Insights Oncol.10, 21-30 (2016).
6. Hwang WYK, Foote J. Immunogenicity of engineered antibodies. Methods 2005; 36:3-10.
7. Park SS, Kim J, Brandts JF, Hong HJ. Stability of murine, chimeric and humanized antibodies against pre-S2 surface antigen of hepatitis B virus. Biologicals 2003; 31:295-302.
8. Ayoub D, Jabs W, Resemann A, Evers W, Evans C, Main L, Baessmann C, Wagner-Rousset E, Suckau D, Beck A. Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques. MAbs 2013; 5:699-710.
9. van de Bovenkamp FS, Hafkenscheid L, Rispens T, Rombouts Y. The Emerging Importance of IgG Fab Glycosylation in Immunity. J Immunol 2016; 196:1435-41.
10. Chung CH, Mirakhur B, Chan E, Le Q-T, Berlin J, Morse M, Murphy BA, Satinover SM, Hosen J, Mauro D, et al. Cetuximab-Induced Anaphylaxis and IgE Specific for Galactose-α-1,3-Galactose. N Engl J Med 2008; 358:1109-17.
11. Cetuximab: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-discussion/erbitux-epar-scientific-discussion_en.pdf
12. Garcia-Foncillas, Jesus, et al. "Distinguishing features of cetuximab and panitumumab in colorectal cancer and other solid tumors." Frontiers in oncology 9 (2019): 849.
13. Tundidor, Yaima, et al. "Affinity-matured variants derived from nimotuzumab keep the original fine specificity and exhibit superior biological activity." Scientific reports 10.1 (2020): 1-14.
14. Lakayan, Dina, et al. "Affinity profiling of monoclonal antibody and antibody-drug-conjugate preparations by coupled liquid chromatography-surface plasmon resonance biosensing." Analytical and bioanalytical chemistry 410.30 (2018): 7837-7848.
15. Pertuzumab:https://www.tga.gov.au/sites/default/files/auspar-pertuzumab-131001.pdf
16. Malm, Magdalena, et al. "Targeting HER3 using mono-and bispecific antibodies or alternative scaffolds." MAbs. Vol. 8. No. 7. Taylor & Francis, 2016.
17. Aurisicchio, Luigi, et al. "The promise of anti-ErbB3 monoclonals as new cancer therapeutics." Oncotarget 3.8 (2012): 744.
18. McDonagh, Charlotte F., et al. "Antitumor activity of a novel bispecific antibody that targets the ErbB2/ErbB3 oncogenic unit and inhibits heregulin-induced activation of ErbB3." Molecular cancer therapeutics 11.3 (2012): 582-593.
19. Schaefer, Gabriele, et al. "A two-in-one antibody against HER3 and EGFR has superior inhibitory activity compared with monospecific antibodies." Cancer cell 20.4 (2011): 472-486.
20. SI-1X6.4(C3): US15/119,694.
21. Liu, Meilin, et al. "Identification and characterization of a fully human antibody directed against epidermal growth factor receptor for cancer therapy." (2004): 163-163.
22. Borras, Leo, et al. "Generic approach for the generation of stable humanized single-chain Fv fragments from rabbit monoclonal antibodies." Journal of Biological Chemistry 285.12 (2010): 9054-9066.
23. Ewert, Stefan, et al. "Biophysical properties of human antibody variable domains." Journal of molecular biology 325.3 (2003): 531-553.
24. Nieba, Lars, et al. "Disrupting the hydrophobic patches at the antibody variable/constant domain interface: improved in vivo folding and physical characterization of an engineered scFv fragment." Protein engineering 10.4 (1997): 435-444.
25. Arteaga, Carlos L., et al. "Treatment of HER2-positive breast cancer: current status and future perspectives." Nature reviews Clinical oncology 9.1 (2012): 16-32.
26. Price, Katharine AR, and Ezra E. Cohen. "Current treatment options for metastatic head and neck cancer." Current treatment options in oncology 13.1 (2012): 35-46.
27. Bode, Udo, et al. "Nimotuzumab treatment of malignant gliomas." Expert opinion on biological therapy 12.12 (2012): 1649-1659.
28. Price, Timothy J., et al. "Panitumumab versus cetuximab in patients with chemotherapy-refractory wild-type KRAS exon 2 metastatic colorectal cancer (ASPECCT): a randomised, multicentre, open-label, non-inferiority phase 3 study." The Lancet Oncology 15.6 (2014): 569-579.
29. Cohen, Roger B. "Current challenges and clinical investigations of epidermal growth factor receptor (EGFR)-and ErbB family-targeted agents in the treatment of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC)." Cancer treatment reviews 40.4 (2014): 567-577.
30. Schaefer, Gabriele, et al. "A two-in-one antibody against HER3 and EGFR has superior inhibitory activity compared with monospecific antibodies." Cancer cell 20.4 (2011): 472-486.
31. Geuijen, Cecile AW, et al. "Unbiased combinatorial screening identifies a bispecific IgG1 that potently inhibits HER3 signaling via HER2-guided ligand blockade." Cancer Cell 33.5 (2018): 922-936.
32. Yu, Shengnan, et al. "A novel asymmetrical anti-HER2/CD3 bispecific antibody exhibits potent cytotoxicity for HER2-positive tumor cells." Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 38.1 (2019): 1-16.
33. Beiboer, Sigrid HW, et al. "Guided selection of a pan carcinoma specific antibody reveals similar binding characteristics yet structural divergence between the original murine antibody and its human equivalent." Journal of molecular biology 296.3 (2000): 833-849.
34. Khaw, Ban An, et al. "Technetium-99m labeling of antibodies to cardiac myosin Fab and to human fibrinogen." Journal of Nuclear Medicine 23.11 (1982): 1011-1019.
35. Rousseaux, J., R. Rousseaux-Prevost, and Herve Bazin. "[63] Optimal conditions for the preparation of proteolytic fragments from monoclonal IgG of different rat IgG subclasses." Methods in enzymology 121 (1986): 663-669.
36. Kohler, Georges, and Cesar Milstein. "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity." nature 256.5517 (1975): 495-497.
37. U.S. Pat. No. 4 ,816,567
38. Siegel, D. L. "Recombinant monoclonal antibody technology." Transfusion clinique et biologique 9.1 (2002): 15-22.
39. Tiller, Thomas. "Single B cell antibody technologies." New biotechnology 28.5 (2011): 453-457.
40. Seeber, Stefan, et al. "A robust high throughput platform to generate functional recombinant monoclonal antibodies using rabbit B cells from peripheral blood." PloS one 9.2 (2014): e86184.
41. U.S. Pat. No. 4,816,567
42. Morrison, Sherie L., et al. "Chimeric human antibody molecules: mouse antigen-binding domains with human constant region domains." Proceedings of the National Academy of Sciences 81.21 (1984): 6851-6855.
43. Queen, Cary, et al. "A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor." Proceedings of the National Academy of Sciences 86.24 (1989): 10029-10033.
44. Hodgson, John. "Making monoclonals in microbes." Bio/technology 9.5 (1991): 421-425.

Claims (26)

  1. ヒトＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）に対して結合特異性を有する二重特異性四価抗体であって、
    Ｎ末端からＣ末端まで、
    ヒトＥＧＦＲに対して第１結合特異性を有し、配列番号１と少なくとも９８％（但し、ＣＤＲ領域は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する可変領域、及び配列番号３と少なくとも９８％（但し、ＣＤＲ領域は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する可変領域を有するＦａｂ領域と、
    Ｆｃドメインと、
    ＨＥＲ３に対して第２結合特異性を有するｓｃＦｖドメインと、
    を含む、二重特異性四価抗体。
  2. 配列番号１１と少なくとも９８％（但し、ＣＤＲ領域は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１３と少なくとも９８％（但し、ＣＤＲ領域は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二重特異性四価抗体。
  3. 前記第１結合親和性は、０．１から５０ｎＭのＫＤを有する、請求項１に記載の二重特異性四価抗体。
  4. 前記第２結合親和性は、１０ｎＭから５００ｎＭのＫＤを有する、請求項１に記載の二重特異性四価抗体。
  5. 前記第１結合親和性は、２０ｎＭ未満のＫＤを有し、前記第２結合親和性は、５０ｎＭを超えるＫＤを有する、請求項１に記載の二重特異性四価抗体。
  6. 前記Ｆａｂ領域は、ジスルフィド結合によりステープルされている、請求項１に記載の二重特異性四価抗体。
  7. 前記二重特異性四価抗体は、単離されたモノクローナル抗体である、請求項１に記載の二重特異性四価抗体。
  8. ヒトフレームワーク領域を含む、請求項１に記載の二重特異性四価抗体。
  9. 前記抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体又は組換え抗体である、請求項１に記載の二重特異性四価抗体。
  10. 前記Ｆａｂ領域は、配列番号１のアミノ酸配列を有する可変領域、及び配列番号３のアミノ酸配列を有する可変領域を有する、請求項1に記載の二重特異性四価抗体。
  11. 請求項１に記載の二重特異性四価抗体をコードする、単離された核酸。
  12. 請求項１１に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。
  13. 請求項１１に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  14. 二重特異性四価抗体が産生されるように請求項１３に記載の宿主細胞を培養することを含む、二重特異性四価抗体の製造方法。
  15. 請求項１に記載の二重特異性四価抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  16. 放射性同位元素、放射性核種、毒素、治療剤、化学療法剤又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 請求項１に記載の二重特異性四価抗体と、細胞毒性剤とを含む、免疫複合体。
  18. 前記細胞毒性剤は、化学療法剤、増殖抑制剤、毒素又は放射性同位元素を含む、請求項１７に記載の免疫複合体。
  19. 請求項１７に記載の免疫複合体と、薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  20. 請求項１に記載の二重特異性四価抗体を含む、がんを有する対象の治療に使用するための医薬組成物であって、
    前記治療は、有効量の請求項１に記載の二重特異性四価抗体を前記対象に投与することを含む、医薬組成物。
  21. 前記がんは、ＨＥＲ３又はＥＧＦＲを発現する細胞を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記がんは、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、前立腺がん、非小細胞肺細胞がん、小細胞肺がん、神経膠腫、食道がん、鼻咽頭がん、腎臓がん、胃がん、肝臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
  23. 前記治療は、有効量の治療剤を共投与することをさらに含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
  24. 前記治療剤は、抗体、化学療法剤、酵素又はそれらの組み合わせを含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 前記治療剤は、カペシタビン、シスプラチン、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、エキセメスタン、アナストロゾール、アミノグルテチミド、テストラクトン、ボロゾール、ホルメスタン、ファドロゾール、レトロゾール、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、パゾパニブ、ラパチニブ、スニチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、ナブパリタキセル、それらの誘導体又はそれらの組み合わせを含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
  26. 前記対象は、ヒトである、請求項２０に記載の医薬組成物。
JP2023518078A 2020-09-21 2021-09-21 特異性が増強した二重特異性抗体（ｓｅｂａ） Active JP7731979B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063081315P 2020-09-21 2020-09-21
US63/081,315 2020-09-21
US202063109877P 2020-11-05 2020-11-05
US63/109,877 2020-11-05
PCT/US2021/051164 WO2022061255A1 (en) 2020-09-21 2021-09-21 Specificity enchanced bispecific antibody (seba)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023542336A JP2023542336A (ja) 2023-10-06
JP7731979B2 true JP7731979B2 (ja) 2025-09-01

Family

ID=80775654

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023518081A Pending JP2023542337A (ja) 2020-09-21 2021-09-21 Ｅｇｆｒ結合複合体、その製造及び使用方法
JP2023518078A Active JP7731979B2 (ja) 2020-09-21 2021-09-21 特異性が増強した二重特異性抗体（ｓｅｂａ）

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023518081A Pending JP2023542337A (ja) 2020-09-21 2021-09-21 Ｅｇｆｒ結合複合体、その製造及び使用方法

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20250353917A1 (ja)
EP (2) EP4214238A4 (ja)
JP (2) JP2023542337A (ja)
KR (2) KR20230117330A (ja)
AU (2) AU2021345349A1 (ja)
BR (2) BR112023005152A2 (ja)
CA (2) CA3196014A1 (ja)
IL (2) IL301472A (ja)
MX (2) MX2023003304A (ja)
TW (2) TW202222824A (ja)
WO (2) WO2022061255A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119143877A (zh) * 2020-03-03 2024-12-17 成都百利多特生物药业有限责任公司 抗cd19抗体及其使用和制备方法
WO2024254562A2 (en) * 2023-06-07 2024-12-12 Synthekine, Inc. Modified immunoglobulin variable heavy domains having reduced immunogenicity
WO2025016453A1 (zh) * 2023-07-19 2025-01-23 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种双特异性抗体、其药物偶联物及其用途
WO2025117872A1 (en) * 2023-11-29 2025-06-05 Systimmune, Inc. Bispecific antibody-like protein and methods of making and using thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016536342A (ja) 2013-09-12 2016-11-24 ハロザイム インコーポレイテッド 修飾抗上皮成長因子受容体抗体およびその使用法
US20170022291A1 (en) 2014-04-01 2017-01-26 Adimab, Llc Multispecific antibody analogs comprising a common light chain, and methods of their preparation and use
JP2017512756A (ja) 2014-02-28 2017-05-25 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ Ｅｇｆｒおよびｅｒｂｂ３に結合する抗体
JP2018509175A (ja) 2014-12-22 2018-04-05 システィミューン， インク．Ｓｙｓｔｉｍｍｕｎｅ， Ｉｎｃ． 二重特異性四価抗体並びにその製作及び使用方法
US20190153471A1 (en) 2016-04-29 2019-05-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9051370B2 (en) * 2010-08-10 2015-06-09 Glycotope Gmbh Humanized EGFR antibodies
DK2603528T3 (en) * 2010-08-10 2016-11-28 Glycotope Gmbh FAB-glycosylated ANTIBODIES
EP2748197A2 (en) * 2011-08-26 2014-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Tandem fc bispecific antibodies
NZ630020A (en) * 2012-03-08 2016-08-26 Halozyme Inc Conditionally active anti-epidermal growth factor receptor antibodies and methods of use thereof
KR102089591B1 (ko) * 2013-07-29 2020-03-18 삼성전자주식회사 항 EGFR scFv 단편 및 이를 포함하는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체
CN109563166B (zh) * 2016-04-28 2022-12-20 拜奥穆尼克斯制药 靶向egfr和her2的双特异性抗体
US11008402B2 (en) * 2016-09-15 2021-05-18 Universitat Stuttgart Antigen binding protein against HER3
CN108003239B (zh) * 2017-12-16 2020-10-23 北京格根生物科技有限公司 一种全人源抗egfr单链抗体及其应用
US20210008113A1 (en) * 2018-03-27 2021-01-14 Systimmune, Inc. Methods of making and using guidance and navigation control proteins
US20230002488A1 (en) * 2019-11-06 2023-01-05 Systimmune, Inc. Guidance and navigation control proteins and method of making and using thereof
TWI874613B (zh) * 2020-03-17 2025-03-01 美商西雅圖免疫公司 微型導引和導航控制(miniGNC)類抗體蛋白及其製造和使用方法
JP7753372B2 (ja) * 2020-10-12 2025-10-14 シーチュアン バイリ ファーム シーオー． エルティーディー 重水素化カンプトテシン系誘導体及びその抗体薬物複合体
AU2021359457A1 (en) * 2020-10-12 2023-05-11 Systimmune, Inc. Camptothecin derivative and its ligand-drug conjugate
EP4434548A1 (en) * 2021-11-15 2024-09-25 Systimmune, Inc. Bispecific antibody-camptothecin drug conjugate and pharmaceutical use thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016536342A (ja) 2013-09-12 2016-11-24 ハロザイム インコーポレイテッド 修飾抗上皮成長因子受容体抗体およびその使用法
JP2017512756A (ja) 2014-02-28 2017-05-25 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ Ｅｇｆｒおよびｅｒｂｂ３に結合する抗体
US20170022291A1 (en) 2014-04-01 2017-01-26 Adimab, Llc Multispecific antibody analogs comprising a common light chain, and methods of their preparation and use
JP2018509175A (ja) 2014-12-22 2018-04-05 システィミューン， インク．Ｓｙｓｔｉｍｍｕｎｅ， Ｉｎｃ． 二重特異性四価抗体並びにその製作及び使用方法
US20190153471A1 (en) 2016-04-29 2019-05-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease

Also Published As

Publication number Publication date
IL301473A (en) 2023-05-01
WO2022061255A1 (en) 2022-03-24
CA3196015A1 (en) 2022-03-24
JP2023542336A (ja) 2023-10-06
TW202222824A (zh) 2022-06-16
EP4213880A4 (en) 2024-10-30
WO2022061256A2 (en) 2022-03-24
US20230374157A1 (en) 2023-11-23
CA3196014A1 (en) 2022-03-24
EP4214238A4 (en) 2025-04-09
AU2021345349A1 (en) 2023-05-11
EP4214238A2 (en) 2023-07-26
MX2023003304A (es) 2023-05-09
US20250353917A1 (en) 2025-11-20
AU2021344531A9 (en) 2025-04-10
AU2021345349A9 (en) 2024-06-13
KR20230117330A (ko) 2023-08-08
BR112023005152A2 (pt) 2023-04-25
MX2023003303A (es) 2023-05-09
AU2021344531A1 (en) 2023-05-18
IL301472A (en) 2023-05-01
TW202300529A (zh) 2023-01-01
BR112023005138A2 (pt) 2023-04-25
KR20230117331A (ko) 2023-08-08
EP4213880A1 (en) 2023-07-26
JP2023542337A (ja) 2023-10-06
WO2022061256A9 (en) 2022-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7731979B2 (ja) 特異性が増強した二重特異性抗体（ｓｅｂａ）
US10047163B2 (en) Multispecific constructs
TWI805121B (zh) 抗ＳＩＲＰα抗體及其用途
JP7611931B2 (ja) ガイダンス及びナビゲーションコントロール（ｇｎｃ）抗体様タンパク質、その製造方法及び使用方法
EP4047018B1 (en) Tetravalent bispecific antibody against pd-1 and vegf, preparation method therefor, and use thereof
JP7720989B2 (ja) Ｅｇｆｒ及びｈｅｒ３を標的とする二重特異性四価抗体
JP2024023598A (ja) Ｅｇｆｒ、ｈｅｒ２及びｈｅｒ３に結合する結合部分の組み合わせ
CN116547303A (zh) Egfr结合复合物及其制备和使用方法
CN116063512B (zh) 多功能重组抗体及其制备方法和应用
TW202540198A (zh) 雙特異性抗體樣蛋白以及彼之製造及使用方法
WO2025117872A1 (en) Bispecific antibody-like protein and methods of making and using thereof
WO2023078450A1 (en) Multispecific antibodies and uses thereof
TW202417506A (zh) 標靶egfr之雙抗原決定四價抗體
TW202540199A (zh) 靶向her2及her3之雙特異性四價抗體
WO2025117871A1 (en) Bispecific tetravalent antibody targeting her2 and her3
HK40089051A (zh) Egfr结合复合物及其制备和使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230511

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20240524

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240604

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240903

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20241101

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20241204

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20250305

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20250603

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20250624

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20250723

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20250820

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7731979

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150