JP7728871B2 - ヒスチジンによるフィードバック抑制が減少したａｔｐ－ｐｒｔ変異体およびこれを発現するヒスチジン生産菌株 - Google Patents
ヒスチジンによるフィードバック抑制が減少したａｔｐ－ｐｒｔ変異体およびこれを発現するヒスチジン生産菌株Info
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Description
本発明は、ヒスチジンによるフィードバック抑制が減少したＡＴＰ－ＰＲＴ変異体およびこれを発現するヒスチジン生産菌株に関する。
ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素（ＡＴＰ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、以下、ＡＴＰ－ＰＲＴと称することがある）は、バクテリア、真菌、または植物においてヒスチジンの生合成の第一のステップを触媒する。
Ｌ－ヒスチジンの濃度が一定以上存在する環境において、ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素（ＡＴＰ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の活性はヒスチジンによってフィードバック抑制されるので、ヒスチジン生産量を一定水準以上に増加させることが困難である。
したがって、微生物のヒスチジン生産量増加のためにヒスチジン抵抗性が増加したＡＴＰ－ＰＲＴ変異体が必要である。しかし、大腸菌のｈｉｓＧ遺伝子で発現するＡＴＰ－ＰＲＴのヒスチジンフィードバック抑制を減少させることができる変異体は知られていない。
一具体例によれば、ヒスチジンによるフィードバック抑制が減少したＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素変異体を提供する。
一態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素において、２３２番目に位置したヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、Ｈ）がリシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｋ）またはトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔ）に置換されたＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素変異体を提供する。
前記配列番号１のアミノ酸配列は、大腸菌の野生型ｈｉｓＧから発現したＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素の配列である。ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素は、ＡＴＰ－ＰＲＴと称することがある。ＡＴＰ－ＰＲＴは、ヒスチジン生合成の第一のステップである１－（５－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｄ－ｒｉｂｏｓｙｌ）－ＡＴＰ＋ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ⇔ＡＴＰ＋５－ｐｈｏｓｐｈｏ－ａｌｐｈａ－Ｄ－ｒｉｂｏｓｅ１－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ反応を触媒する。本願において、前記ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素は、「ｈｉｓＧ」と混用される。
前記配列番号１のアミノ酸配列は、大腸菌の野生型ｈｉｓＧから発現したＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素の配列である。ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素は、ＡＴＰ－ＰＲＴと称することがある。ＡＴＰ－ＰＲＴは、ヒスチジン生合成の第一のステップである１－（５－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｄ－ｒｉｂｏｓｙｌ）－ＡＴＰ＋ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ⇔ＡＴＰ＋５－ｐｈｏｓｐｈｏ－ａｌｐｈａ－Ｄ－ｒｉｂｏｓｅ１－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ反応を触媒する。本願において、前記ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素は、「ｈｉｓＧ」と混用される。
一具体例によれば、前記ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｈｉｓＧ遺伝子から発現したものであってもよい。
一具体例によれば、前記変異体は、ヒスチジンによるフィードバック抑制が減少することができる。一実施例によれば、Ｈ２３２ＫまたはＨ２３２Ｔ変異を含むＡＴＰ－ＰＲＴの導入された菌株は、野生型よりヒスチジン生産量が増加した。
一具体例によれば、前記変異体は、（ａ）２５０番目に位置したアルギニンがヒスチジンに置換；（ｂ）２５２番目に位置したトレオニンがアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、またはイソロイシンに置換；（ｃ）２７１番目に位置したグルタミン酸がリシンに置換；（ｄ）２８８番目に位置したセリンがプロリンに置換、のうちの１つ以上をさらに含むことができる。一実施例によれば、２３２番目のヒスチジン変異以外に、前記（ａ）～（ｄ）の変異をさらに含むと、ヒスチジン生産量が増加することを確認した。
前記変異体は、ヒスチジン濃度５ｍＭ～２５ｍＭでも活性を有することができる。
他の態様は、前記ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素変異体を暗号化するポリヌクレオチド、またはこれを含むベクターを提供する。前記ベクターは、プラスミドまたはファージ（ｐｈａｇｅ）であってもよい。
他の態様は、前記ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素変異体を発現する形質転換菌株を提供する。前記形質転換菌株は、ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素変異体を暗号化するポリヌクレオチド、またはこれを含むベクターを導入した菌株であってもよい。前記菌株は、ヒスチジンの濃度が増加してもＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素の活性を維持するので、ヒスチジン生産量が増加することができる。
前記ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素変異体を発現する菌株は、ヒスチジンの生産が約２２～９２％増加することができる。
前記形質転換は、公知の方法で実施することができ、例えば、電気穿孔方法（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５２，５４１－５４５，１９９９）などによって実施可能である。
一具体例によれば、前記菌株は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌株であってもよく、具体的には、エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エシェリヒアアルベルティ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ）、エシェリヒアブラッタエ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ）、エシェリヒアフェルグソニー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｈｅｒｍａｎｎｉｉ）またはエシェリヒアブルネリス（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｖｕｌｎｅｒｉｓ）菌株であってもよい。
さらに他の態様は、前記形質転換菌株を培養するステップを含むヒスチジン生産方法を提供する。前記ヒスチジン生産方法は、前記形質転換菌株を培地で培養するステップと、前記菌株または培地からヒスチジンを回収するステップとを含むことができる。
前記培地は、炭素源、窒素源および無機塩類を含むことができる。前記炭素源は、例えば、ブドウ糖、砂糖、クエン酸塩、果糖、乳糖、麦芽糖または糖蜜のような糖および炭水化物；大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイルおよび脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセロール；エタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸が含まれるが、特に限定されるものではなく、個別的にまたは混合物として使用可能である。好ましくは、前記大腸菌変異株の培地は、ブドウ糖を含むものであってもよい。前記窒素源は、例えば、ペプトン、肉類抽出物、酵母抽出物、乾燥した酵母、トウモロコシ浸漬液、大豆ケーキ、ウレア、チオウレア、アンモニウム塩、硝酸塩およびその他の有機または無機窒素を含む化合物が使用できるが、特に限定されるものではない。また、前記無機塩類は、マグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、鉄、亜鉛、コバルトなどを使用することができ、これに限定されるものではない。
また、培地のｐＨを調節するために、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で使用可能である。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができ、好気状態を維持するために培地内に酸素または酸素－含有気体（例、空気）を注入することができる。
前記培養は、微生物を人工的に調節した環境で生育させることを意味し、当業界にて広く知られた培養方法で行うことができる。培養時の温度は、２０～４５℃であってもよいし、１０～２００時間培養することができるが、これに限定されるものではない。
前記ヒスチジンを回収するステップは、当業界にてよく知られた多様な方法を用いることができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、またはＨＰＬＣを用いることができるが、これに限定されるものではない。
一具体例によるＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素変異体は、高い濃度のヒスチジン環境でも活性を維持することができる。
一具体例によるＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素変異体を発現する菌株は、ヒスチジン生産量を増加させることができる。
以下、一つ以上の具体例を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は一つ以上の具体例を例として説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＴＲＡ（１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌｅ－３－ａｌａｎｉｎｅ）抵抗性を有する突然変異株の選別
Ｌ－ヒスチジンによる負のフィードバックが鈍い変異株を作製するために、化学的突然変異誘導剤であるＮ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－ｎｉｔｒｏ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＮＴＧ）を用いて、Ｌ－ヒスチジンの誘導体である１，２，４－トリアゾール－３－アラニン（ＴＲＡ）に対する耐性変異株を作製した。
Ｌ－ヒスチジンによる負のフィードバックが鈍い変異株を作製するために、化学的突然変異誘導剤であるＮ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－ｎｉｔｒｏ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＮＴＧ）を用いて、Ｌ－ヒスチジンの誘導体である１，２，４－トリアゾール－３－アラニン（ＴＲＡ）に対する耐性変異株を作製した。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（ＫＣＴＣ１４４１９ＢＰ）をＬＢ培地で１６時間培養（３７℃、２００ｒｐｍ）した。培養後、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ｓａｌｉｎｅ／ＴＭ ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。細胞にｂｕｆｆｅｒを入れて再懸濁した後、ＮＴＧ１００μｇ／ｍｌを添加して、３７℃、２００ｒｐｍで３０分間変異を誘導した。
前記変異誘導過程を繰り返した後、細胞を３ｍｌのＤ．Ｗに懸濁し、これを平板培地（ｐｌａｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）（組成：ブドウ糖８％、リン酸一水素ナトリウム０．６％、硫酸アンモニウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０２％、硝酸カルシウム０．００１％、硫酸鉄１０ｐｐｍ、ＴＲＡ１％）に塗抹して、３７℃、２日間１次培養した。単一の群落を形成した菌株を分離し、これをＴＲＡ１％が添加された平板培地で１次培養と同一に２次培養して変異株を選別した。
選別した変異株を０％、０．５％、１．０％、または２．０％ＴＲＡが添加された平板培地での生育度（細胞数の増加）を測定して、ＴＲＡに対する耐性度を比較した。（下記表１参照）
実施例２：ＴＲＡ抵抗性突然変異株のＡＴＰ－ＰＲＴ酵素のアミノ酸配列分析
ＴＲＡに対する耐性が増加した突然変異株Ｈ－１およびＨ－２のＡＴＰ－ＰＲＴ（ＡＴＰ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｈｉｓＧ）酵素のアミノ酸配列を比較分析した。配列分析はマクロジェン（ｍａｃｒｏｇｅｎ）社に依頼して進行させ、下記表２のプライマーを用いて配列を確認した。
ＴＲＡに対する耐性が増加した突然変異株Ｈ－１およびＨ－２のＡＴＰ－ＰＲＴ（ＡＴＰ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｈｉｓＧ）酵素のアミノ酸配列を比較分析した。配列分析はマクロジェン（ｍａｃｒｏｇｅｎ）社に依頼して進行させ、下記表２のプライマーを用いて配列を確認した。
確認の結果、ＡＴＰ－ＰＲＴ酵素のＣ－末端部分に位置したアミノ酸の一部が置換されたことを確認した。
また、分子間結合方式（ｍｏｄｅ）予測プログラムを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ｈｉｓＧ六量体（ｈｅｘａｍｅｒ）のヒスチジン分子とドッキング（ｄｏｃｋｉｎｇ）時の３次元構造を分析し、ドッキング分析の結果に基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｉｓＧから発現したＡＴＰ－ＰＲＴのヒスチジン進入および結合部位に位置するアミノ酸を分析した。シミュレーションの結果、ｈｉｓＧのＨ２３２、Ｓ２８８、Ｔ２５２、Ｒ２５０、Ａ２４８、Ｅ２７１、Ｅ２４０がヒスチジンと相互作用する可能性が高いことが明らかになった。（図２参照）
前記ＴＲＡ耐性増加突然変異株のＡＴＰ－ＰＲＴ（ｈｉｓＧ）アミノ酸変異およびドッキング分析の結果に基づいて、ヒスチジンによる負のフィードバックが減少してヒスチジンの生産が増加する可能性が高いアミノ酸の変異体１４種（Ｈ２３２Ｔ、Ｈ２３２Ｅ、Ｈ２３２Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、Ａ２４８Ｆ、Ｒ２５０Ｈ、Ｒ２５０Ｅ、Ｔ２５２Ａ、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５２Ｐ、Ｔ２５２Ｑ、Ｅ２７１Ｋ、Ｓ２８８Ｋ、およびＳ２８８Ｐ）を候補として選定した。
実施例３：１つの変異を有するＡＴＰ－ＰＲＴ変異体発現菌株の作製およびそのヒスチジン生産性評価
点突然変異が導入されたｈｉｓＧ＿Ｈ２３２ＫをＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株のクロモソームに導入するために、ワンステップ不活性化方法を用いた（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，６：６６４０－６６４５（２０００））。まず、ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎのためのｈｉｓＧ遺伝子の前方および後方断片を得るために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを鋳型として、プライマー対ｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｒ、ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｒを用いてｈｉｓＧ＿ＨＦとｈｉｓＧ＿ＨＲ断片をそれぞれ増幅した。そして、カナマイシン抗生剤マーカーとＦＲＴが含まれたカセットを得るために、ｐＫＤ１３プラスミドからＦＲ（ｈｉｓＧ）－Ｆ／ＦＲ（ｈｉｓＧ）－Ｒを用いて増幅してカセット断片を得た。最後に、ｈｉｓＧ＿Ｈ２３２Ｋを得るために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからｈｉｓＧ＋ＦＲ－Ｆ／２３２Ｋ－Ｒ、２３２Ｋ－Ｆ／ｈｉｓＧ＋ＨＲ－Ｒプライマー対をそれぞれ用いて２つの断片を得た。得られた２つの断片を再びｈｉｓＧ＋ＦＲ－Ｆ／ｈｉｓＧ＋ＨＲ－Ｒプライマーを用いて１つの断片に連結させてｈｉｓＧ＿Ｈ２３２Ｋ断片を得た。最終的に、増幅したこれら４つのＰＣＲ断片を鋳型として用いてｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｒプライマー対でｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲを用いて１つの断片に連結させた。１つに連結されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６プラスミドを有しているＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株に電気穿孔法で導入した。以後、カナマイシン耐性を示す細胞株を対象にｈｉｓＧＷ－ＣＦ／ｈｉｓＧＷ－ＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行って、ｈｉｓＧ＿Ｈ２３２Ｋが導入された菌株を確認した。導入が確認された菌株を対象に抗生剤耐性遺伝子であるカナマイシンマーカーを除去する過程を行った。ｈｉｓＧ＿Ｈ２３２Ｋの導入が確認された菌株にｐＣＰ２０プラスミドを導入してＦＬＰ組換えを誘導した後、抗生剤（カナマイシン）の添加および未添加のＬＢ平板培地でそれぞれ生長するか否かにより抗生剤除去の有無を確認した。抗生剤の除去された菌株はＬＢ平板培地で生長するが、抗生剤（カナマイシン）が添加されたＬＢ平板培地では生長できないことを利用して確認した。そして、最終的に、ｈｉｓＧＷ－ＣＦ／ｈｉｓＧＷ－ＣＲプライマー対を用いて配列を確認した。前記方法と同様の方法により、ｈｉｓＧ＿Ｈ２３２Ｔ、ｈｉｓＧ＿Ｒ２５０Ｈ、ｈｉｓＧ＿Ｔ２５２Ａ、ｈｉｓＧ＿Ｔ２５２Ｌ、ｈｉｓＧ＿Ｅ２７１Ｋ、ｈｉｓＧ＿Ｓ２８８Ｐ、ｈｉｓＧ＿Ｈ２３２Ｅ、ｈｉｓＧ＿２４０Ｋ、ｈｉｓＧ＿Ａ２４８Ｆ、ｈｉｓＧ＿Ｒ２５０Ｅ、ｈｉｓＧ＿Ｔ２５２Ｐ、ｈｉｓＧ＿Ｔ２５２Ｑ、およびｈｉｓＧ＿Ｓ２８８ＫをＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株にそれぞれ導入した。
点突然変異が導入されたｈｉｓＧ＿Ｈ２３２ＫをＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株のクロモソームに導入するために、ワンステップ不活性化方法を用いた（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，６：６６４０－６６４５（２０００））。まず、ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎのためのｈｉｓＧ遺伝子の前方および後方断片を得るために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを鋳型として、プライマー対ｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｒ、ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｒを用いてｈｉｓＧ＿ＨＦとｈｉｓＧ＿ＨＲ断片をそれぞれ増幅した。そして、カナマイシン抗生剤マーカーとＦＲＴが含まれたカセットを得るために、ｐＫＤ１３プラスミドからＦＲ（ｈｉｓＧ）－Ｆ／ＦＲ（ｈｉｓＧ）－Ｒを用いて増幅してカセット断片を得た。最後に、ｈｉｓＧ＿Ｈ２３２Ｋを得るために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからｈｉｓＧ＋ＦＲ－Ｆ／２３２Ｋ－Ｒ、２３２Ｋ－Ｆ／ｈｉｓＧ＋ＨＲ－Ｒプライマー対をそれぞれ用いて２つの断片を得た。得られた２つの断片を再びｈｉｓＧ＋ＦＲ－Ｆ／ｈｉｓＧ＋ＨＲ－Ｒプライマーを用いて１つの断片に連結させてｈｉｓＧ＿Ｈ２３２Ｋ断片を得た。最終的に、増幅したこれら４つのＰＣＲ断片を鋳型として用いてｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｒプライマー対でｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲを用いて１つの断片に連結させた。１つに連結されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６プラスミドを有しているＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株に電気穿孔法で導入した。以後、カナマイシン耐性を示す細胞株を対象にｈｉｓＧＷ－ＣＦ／ｈｉｓＧＷ－ＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行って、ｈｉｓＧ＿Ｈ２３２Ｋが導入された菌株を確認した。導入が確認された菌株を対象に抗生剤耐性遺伝子であるカナマイシンマーカーを除去する過程を行った。ｈｉｓＧ＿Ｈ２３２Ｋの導入が確認された菌株にｐＣＰ２０プラスミドを導入してＦＬＰ組換えを誘導した後、抗生剤（カナマイシン）の添加および未添加のＬＢ平板培地でそれぞれ生長するか否かにより抗生剤除去の有無を確認した。抗生剤の除去された菌株はＬＢ平板培地で生長するが、抗生剤（カナマイシン）が添加されたＬＢ平板培地では生長できないことを利用して確認した。そして、最終的に、ｈｉｓＧＷ－ＣＦ／ｈｉｓＧＷ－ＣＲプライマー対を用いて配列を確認した。前記方法と同様の方法により、ｈｉｓＧ＿Ｈ２３２Ｔ、ｈｉｓＧ＿Ｒ２５０Ｈ、ｈｉｓＧ＿Ｔ２５２Ａ、ｈｉｓＧ＿Ｔ２５２Ｌ、ｈｉｓＧ＿Ｅ２７１Ｋ、ｈｉｓＧ＿Ｓ２８８Ｐ、ｈｉｓＧ＿Ｈ２３２Ｅ、ｈｉｓＧ＿２４０Ｋ、ｈｉｓＧ＿Ａ２４８Ｆ、ｈｉｓＧ＿Ｒ２５０Ｅ、ｈｉｓＧ＿Ｔ２５２Ｐ、ｈｉｓＧ＿Ｔ２５２Ｑ、およびｈｉｓＧ＿Ｓ２８８ＫをＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株にそれぞれ導入した。
前記実験に使用したプライマーは、下記表３の通りである。
下記表４によれば、ｈｉｓＧ＿Ｈ２３２ＫまたはｈｉｓＧ＿Ｈ２３２Ｔを導入した菌株は、対照群よりヒスチジンの生産が約２２％～２６％程度増加した。ｈｉｓＧ＿Ｔ２５２ＡまたはＴ２５２Ｌを導入した菌株は、対照群よりヒスチジンの生産が約３５％～３９％程度増加した。ｈｉｓＧ＿Ｅ２７１Ｋ導入菌株は、対照群よりヒスチジンの生産が約３４％増加した。特に、ｈｉｓＧ＿Ｓ２８８Ｐ導入菌株は、対照群よりヒスチジンの生産が約４６％増加し、ｈｉｓＧ＿Ｒ２５０Ｈ導入菌株は、対照群よりヒスチジンの生産が約６７％増加して最も増加幅が高かった。
しかし、Ｈ２３２Ｅ、Ｅ２４０Ｋ、およびＡ２４８Ｆ変異体は、ヒスチジンの生産量がむしろ減少し、Ｒ２５０Ｅ、Ｔ２５２Ｐ、Ｔ２５２Ｑ、およびＳ２８８Ｋ変異体は、ヒスチジンの生産量が有意に増加しなかった。
前記結果によれば、前記７種（Ｈ２３２Ｔ、Ｈ２３２Ｋ、Ｒ２５０Ｈ、Ｔ２５２Ａ、Ｔ２５２Ｌ、Ｅ２７１Ｋ、およびＳ２８８Ｐ）の変異体は、ヒスチジンの生産が増加し、これはヒスチジンによるフィードバック抑制（ｆｅｅｄｂａｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）が減少するためと考えられる。以下、これらの変異を組み合わせてヒスチジンの生産をさらに向上させることができるかを確認した。
実施例４：ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４（Ｈ２３２Ｋ、Ｔ２５２Ａ、Ｅ２７１Ｋ、およびＳ２８８Ｐ）が導入されたプラスミドの作製
ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲを実施して、大腸菌ｈｉｓＧ由来ＡＴＰ－ＰＲＴ酵素においてＨ２３２Ｋ、Ｔ２５２Ａ、Ｅ２７１Ｋ、およびＳ２８８Ｐのアミノ酸が置換された変異体を発現できるプラスミドを作製した。まず、プライマーｈｉｓＧ－Ｆ／２３２Ｋ－Ｒ、２３２Ｋ－Ｆ／２５２Ａ－Ｒ、２５２Ａ－Ｆ／ｈｉｓＧ－Ｒの３対のプライマーを用いてｐｆｕ ｐｒｅｍｉｘ（ｂｉｏｎｅｅｒ）で遺伝子をそれぞれ増幅した。そして、増幅した３つのｆｒａｇｍｅｎｔをそれぞれｔｅｍｐｌａｔｅとして用いてｈｉｓＧ－Ｆ／ｈｉｓＧ－Ｒプライマー対でもう一度ＰＣＲを進行させて、３つのｆｒａｇｍｅｎｔを１つの断片に連結した（以下、ＳＤＭ３ ｆｒａｇｍｅｎｔと称することがある）。そして、ＳＤＭ３ ｆｒａｇｍｅｎｔおよびｐＴＲＣ９９Ａ ｐｌａｓｍｉｄをそれぞれＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）で制限酵素処理し、Ｔ４ ｌｉｇａｓｅを用いてｐＴＲＣ９９ＡプラスミドにＳＤＭ３ ｆｒａｇｍｅｎｔを導入した。（ｐＴＲＣ９９Ａ－ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ３）ｐＴＲＣ９９Ａ－ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ３ ｔｅｍｐｌａｔｅおよびｈｉｓＧ－Ｆ／２７１Ｋ－Ｒ２プライマー対でＰＣＲを進行させて、Ｈ２３２Ｋ、Ｔ２５２Ａ、Ｅ２７１Ｋ、およびＳ２８８Ｐの４つの変異が導入されたＳＤＭ４ ｆｒａｇｍｅｎｔを取得した。
ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲを実施して、大腸菌ｈｉｓＧ由来ＡＴＰ－ＰＲＴ酵素においてＨ２３２Ｋ、Ｔ２５２Ａ、Ｅ２７１Ｋ、およびＳ２８８Ｐのアミノ酸が置換された変異体を発現できるプラスミドを作製した。まず、プライマーｈｉｓＧ－Ｆ／２３２Ｋ－Ｒ、２３２Ｋ－Ｆ／２５２Ａ－Ｒ、２５２Ａ－Ｆ／ｈｉｓＧ－Ｒの３対のプライマーを用いてｐｆｕ ｐｒｅｍｉｘ（ｂｉｏｎｅｅｒ）で遺伝子をそれぞれ増幅した。そして、増幅した３つのｆｒａｇｍｅｎｔをそれぞれｔｅｍｐｌａｔｅとして用いてｈｉｓＧ－Ｆ／ｈｉｓＧ－Ｒプライマー対でもう一度ＰＣＲを進行させて、３つのｆｒａｇｍｅｎｔを１つの断片に連結した（以下、ＳＤＭ３ ｆｒａｇｍｅｎｔと称することがある）。そして、ＳＤＭ３ ｆｒａｇｍｅｎｔおよびｐＴＲＣ９９Ａ ｐｌａｓｍｉｄをそれぞれＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）で制限酵素処理し、Ｔ４ ｌｉｇａｓｅを用いてｐＴＲＣ９９ＡプラスミドにＳＤＭ３ ｆｒａｇｍｅｎｔを導入した。（ｐＴＲＣ９９Ａ－ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ３）ｐＴＲＣ９９Ａ－ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ３ ｔｅｍｐｌａｔｅおよびｈｉｓＧ－Ｆ／２７１Ｋ－Ｒ２プライマー対でＰＣＲを進行させて、Ｈ２３２Ｋ、Ｔ２５２Ａ、Ｅ２７１Ｋ、およびＳ２８８Ｐの４つの変異が導入されたＳＤＭ４ ｆｒａｇｍｅｎｔを取得した。
そして、ＳＤＭ４ ｆｒａｇｍｅｎｔおよびｐＴＲＣ９９Ａ－ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ３プラスミドをそれぞれＥｃｏＲＩとＡｆｅＩ（ＮＥＢ）で制限酵素処理し、Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を用いてｐＴＲＣ９９Ａ－ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４を構築した。最終的に、ｈｉｓＧ－ＣＦ／ｈｉｓＧ－ＣＲプライマー対を用いて配列を確認した。（下記表５参照）Ｈ２３２Ｋ、Ｔ２５２Ａ、Ｅ２７１Ｋ、およびＳ２８８Ｐ変異を含むＡＴＰ－ＰＲＴ変異体を、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４と名付けた。
実施例５：ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７（Ｈ２３２Ｔ、Ｒ２５０Ｈ、Ｔ２５２Ｌ、Ｅ２７１Ｋ、およびＳ２８８Ｐ）が導入されたプラスミドの作製
ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４酵素のアミノ酸配列の一部を他のアミノ酸に置換したｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７を作製し、これをｐｌａｓｍｉｄに導入した。ｐＴＲＣ９９Ａ－ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４をｔｅｍｐｌａｔｅとして用い、２３２番目のアミノ酸をＴ、２５０番目のアミノ酸をＨ、２５２番目のアミノ酸をＬに置換し、２つの変異（Ｅ２７１ＫおよびＳ２８８Ｐ）はそのまま維持した。（ｈｉｓＧ＿ＷＴと比較すれば、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７の変異の位置はＨ２３２Ｔ、Ｒ２５０Ｈ、Ｔ２５２Ｌ、Ｅ２７１Ｋ、およびＳ２８８Ｐである）
ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４酵素のアミノ酸配列の一部を他のアミノ酸に置換したｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７を作製し、これをｐｌａｓｍｉｄに導入した。ｐＴＲＣ９９Ａ－ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４をｔｅｍｐｌａｔｅとして用い、２３２番目のアミノ酸をＴ、２５０番目のアミノ酸をＨ、２５２番目のアミノ酸をＬに置換し、２つの変異（Ｅ２７１ＫおよびＳ２８８Ｐ）はそのまま維持した。（ｈｉｓＧ＿ＷＴと比較すれば、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７の変異の位置はＨ２３２Ｔ、Ｒ２５０Ｈ、Ｔ２５２Ｌ、Ｅ２７１Ｋ、およびＳ２８８Ｐである）
まず、プライマーｈｉｓＧ－Ｆ／２３２Ｔ－Ｒ、２３２Ｔ－Ｆ／２５０Ｈ＋２５２Ｌ－Ｒ、２５０Ｈ＋２５２Ｌ－Ｆ／ｈｉｓＧ－Ｒの３対のプライマーを用いてｐｆｕ ｐｒｅｍｉｘ（ｂｉｏｎｅｅｒ）で遺伝子をそれぞれ増幅した。そして、増幅した３つのｆｒａｇｍｅｎｔをそれぞれｔｅｍｐｌａｔｅとして用いてｈｉｓＧ－Ｆ／ｈｉｓＧ－Ｒプライマー対でもう一度ＰＣＲを進行させて、３つのｆｒａｇｍｅｎｔを１つの断片に連結させた。そして、ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔとｐＴＲＣ９９Ａ ｐｌａｓｍｉｄをそれぞれＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）で切断し、Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）で連結してｐＴＲＣ９９Ａ－ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７を作製した。最終的に、ｈｉｓＧ－ＣＦ／ｈｉｓＧ－ＣＲプライマーを用いて配列を確認した。（下記表６参照）Ｈ２３２Ｔ、Ｒ２５０Ｈ、Ｔ２５２Ｌ、Ｅ２７１Ｋ、およびＳ２８８Ｐ変異を含むＡＴＰ－ＰＲＴ変異体は、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７と名付けた。
実施例６：ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４またはｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７遺伝子が導入された変異株の作製
６－１．ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４遺伝子が導入された変異株の作製
ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４をＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株のクロモソームに導入するために、ワンステップ不活性化方法を用いた（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，６：６６４０－６６４５（２０００））。まず、ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎのためのｈｉｓＧ遺伝子の前方および後方断片を得るために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを鋳型として、プライマー対ｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｒ、ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｒを用いてｈｉｓＧ＿ＨＦとｈｉｓＧ＿ＨＲ断片をそれぞれ増幅した。そして、カナマイシン抗生剤マーカーとＦＲＴが含まれたカセットを得るために、ｐＫＤ１３プラスミドからＦＲ（ｈｉｓＧ）－Ｆ／ＦＲ（ｈｉｓＧ）－Ｒを用いて増幅してカセット断片を得た。最後に、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４を得るために、ｐＴＲＣ９９Ａ－ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４プラスミドからｈｉｓＧ＋ＦＲ－Ｆ／ｈｉｓＧ＋ＨＲ－Ｒプライマーを用いてｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４断片を得た。最終的に、増幅したこれら４つのＰＣＲ断片を鋳型として用いてｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｒプライマー対でｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲを用いて１つの断片に連結させた。１つに連結されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６プラスミドを有しているＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株に電気穿孔法で導入した。以後、カナマイシン耐性を示す細胞株を対象にｈｉｓＧＷ－ＣＦ／ｈｉｓＧＷ－ＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行って、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４が導入された菌株を確認した。導入が確認された菌株を対象に抗生剤耐性遺伝子であるカナマイシンマーカーを除去する過程を行った。ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４の導入が確認された菌株にｐＣＰ２０プラスミドを導入してＦＬＰ組換えを誘導した後、抗生剤（カナマイシン）の添加および未添加のＬＢ平板培地でそれぞれ生長するか否かにより抗生剤除去の有無を確認した。抗生剤の除去された菌株はＬＢ平板培地で生長するが、抗生剤（カナマイシン）が添加されたＬＢ平板培地では生長できないことを利用して確認した。そして、最終的に、ｈｉｓＧＷ－ＣＦ／ｈｉｓＧＷ－ＣＲプライマー対を用いて配列を確認した。実験に使用されたプライマーは、下記表７に記載されている。
６－１．ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４遺伝子が導入された変異株の作製
ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４をＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株のクロモソームに導入するために、ワンステップ不活性化方法を用いた（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，６：６６４０－６６４５（２０００））。まず、ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎのためのｈｉｓＧ遺伝子の前方および後方断片を得るために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを鋳型として、プライマー対ｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｒ、ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｒを用いてｈｉｓＧ＿ＨＦとｈｉｓＧ＿ＨＲ断片をそれぞれ増幅した。そして、カナマイシン抗生剤マーカーとＦＲＴが含まれたカセットを得るために、ｐＫＤ１３プラスミドからＦＲ（ｈｉｓＧ）－Ｆ／ＦＲ（ｈｉｓＧ）－Ｒを用いて増幅してカセット断片を得た。最後に、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４を得るために、ｐＴＲＣ９９Ａ－ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４プラスミドからｈｉｓＧ＋ＦＲ－Ｆ／ｈｉｓＧ＋ＨＲ－Ｒプライマーを用いてｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４断片を得た。最終的に、増幅したこれら４つのＰＣＲ断片を鋳型として用いてｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｒプライマー対でｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲを用いて１つの断片に連結させた。１つに連結されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６プラスミドを有しているＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株に電気穿孔法で導入した。以後、カナマイシン耐性を示す細胞株を対象にｈｉｓＧＷ－ＣＦ／ｈｉｓＧＷ－ＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行って、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４が導入された菌株を確認した。導入が確認された菌株を対象に抗生剤耐性遺伝子であるカナマイシンマーカーを除去する過程を行った。ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４の導入が確認された菌株にｐＣＰ２０プラスミドを導入してＦＬＰ組換えを誘導した後、抗生剤（カナマイシン）の添加および未添加のＬＢ平板培地でそれぞれ生長するか否かにより抗生剤除去の有無を確認した。抗生剤の除去された菌株はＬＢ平板培地で生長するが、抗生剤（カナマイシン）が添加されたＬＢ平板培地では生長できないことを利用して確認した。そして、最終的に、ｈｉｓＧＷ－ＣＦ／ｈｉｓＧＷ－ＣＲプライマー対を用いて配列を確認した。実験に使用されたプライマーは、下記表７に記載されている。
６－２．ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７遺伝子が導入された変異株の作製
ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７をＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株のクロモソームに導入するために、ワンステップ不活性化方法を用いた（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，６：６６４０－６６４５（２０００））。まず、ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎのためのｈｉｓＧ遺伝子の前方および後方断片を得るために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを鋳型として、プライマー対ｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｒ、ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｒを用いてｈｉｓＧ＿ＨＦとｈｉｓＧ＿ＨＲ断片をそれぞれ増幅した。そして、カナマイシン抗生剤マーカーとＦＲＴが含まれたカセットを得るために、ｐＫＤ１３プラスミドからＦＲ（ｈｉｓＧ）－Ｆ／ＦＲ（ｈｉｓＧ）－Ｒを用いて増幅してカセット断片を得た。最後に、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７を得るために、ｐＴＲＣ９９Ａ－ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７プラスミドからｈｉｓＧ＋ＦＲ－Ｆ／ｈｉｓＧ＋ＨＲ－Ｒプライマーを用いてｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７断片を得た。最終的に、増幅したこれら４つのＰＣＲ断片を鋳型として用いてｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｒプライマー対でｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲを用いて１つの断片に連結させた。１つに連結されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６プラスミドを有しているＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株に電気穿孔法で導入した。以後、カナマイシン耐性を示す細胞株を対象にｈｉｓＧＷ－ＣＦ／ｈｉｓＧＷ－ＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行って、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７が導入された菌株を確認した。導入が確認された菌株を対象に抗生剤耐性遺伝子であるカナマイシンマーカーを除去する過程を行った。ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７の導入が確認された菌株にｐＣＰ２０プラスミドを導入してＦＬＰ組換えを誘導した後、抗生剤（カナマイシン）の添加および未添加のＬＢ平板培地でそれぞれ生長するか否かにより抗生剤除去の有無を確認した。抗生剤の除去された菌株はＬＢ平板培地で生長するが、抗生剤（カナマイシン）が添加されたＬＢ平板培地では生長できないことを利用して確認した。そして、最終的に、ｈｉｓＧＷ－ＣＦ／ｈｉｓＧＷ－ＣＲプライマー対を用いて配列を確認した。ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７遺伝子が導入された変異株の作製に使用されたプライマー配列は、前記表６と同一である。
ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７をＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株のクロモソームに導入するために、ワンステップ不活性化方法を用いた（Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，６：６６４０－６６４５（２０００））。まず、ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎのためのｈｉｓＧ遺伝子の前方および後方断片を得るために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを鋳型として、プライマー対ｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｒ、ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｒを用いてｈｉｓＧ＿ＨＦとｈｉｓＧ＿ＨＲ断片をそれぞれ増幅した。そして、カナマイシン抗生剤マーカーとＦＲＴが含まれたカセットを得るために、ｐＫＤ１３プラスミドからＦＲ（ｈｉｓＧ）－Ｆ／ＦＲ（ｈｉｓＧ）－Ｒを用いて増幅してカセット断片を得た。最後に、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７を得るために、ｐＴＲＣ９９Ａ－ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７プラスミドからｈｉｓＧ＋ＦＲ－Ｆ／ｈｉｓＧ＋ＨＲ－Ｒプライマーを用いてｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７断片を得た。最終的に、増幅したこれら４つのＰＣＲ断片を鋳型として用いてｈｉｓＧ＿ＨＦ－Ｆ／ｈｉｓＧ＿ＨＲ－Ｒプライマー対でｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲを用いて１つの断片に連結させた。１つに連結されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６プラスミドを有しているＥ．ｃｏｌｉ ＤＳ９Ｈ菌株に電気穿孔法で導入した。以後、カナマイシン耐性を示す細胞株を対象にｈｉｓＧＷ－ＣＦ／ｈｉｓＧＷ－ＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行って、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７が導入された菌株を確認した。導入が確認された菌株を対象に抗生剤耐性遺伝子であるカナマイシンマーカーを除去する過程を行った。ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７の導入が確認された菌株にｐＣＰ２０プラスミドを導入してＦＬＰ組換えを誘導した後、抗生剤（カナマイシン）の添加および未添加のＬＢ平板培地でそれぞれ生長するか否かにより抗生剤除去の有無を確認した。抗生剤の除去された菌株はＬＢ平板培地で生長するが、抗生剤（カナマイシン）が添加されたＬＢ平板培地では生長できないことを利用して確認した。そして、最終的に、ｈｉｓＧＷ－ＣＦ／ｈｉｓＧＷ－ＣＲプライマー対を用いて配列を確認した。ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７遺伝子が導入された変異株の作製に使用されたプライマー配列は、前記表６と同一である。
実施例７：ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４またはｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７遺伝子から発現した変異酵素のヒスチジンの負のフィードバック抵抗性の測定
ＡＴＰ－ＰＲＴ野生型（ｈｉｓＧ＿ＷＴ）、ＡＴＰ－ＰＲＴ変異体（ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４およびｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７）のヒスチジンによる負のフィードバック抵抗性を比較した。
ＡＴＰ－ＰＲＴ野生型（ｈｉｓＧ＿ＷＴ）、ＡＴＰ－ＰＲＴ変異体（ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４およびｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７）のヒスチジンによる負のフィードバック抵抗性を比較した。
ＬＢ培地を５００ｍｌのフラスコに５０ｍｌずつ分注し、ＤＳ９Ｈ、ＤＳ９Ｈ＿△ｈｉｓＧ：：ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４、またはＤＳ９Ｈ＿△ｈｉｓＧ：：ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７の３つの菌株を１％ずつ接種した。培養条件は３０℃、１８０ｒｐｍにした。ＯＤ６００が０．６の時、１ｍＭ ＩＰＴＧ（最終濃度）でＡＴＰ－ＰＲＴの発現を誘導し、４時間程度追加培養を実施した。培養後に得られた細胞をｓｏｎｉｃａｔｉｏｎし、遠心分離した。得られた上澄液をＡＴＰ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの活性評価に使用した。酵素活性を評価するための反応条件は、既存の文献を参照して進行させた。（Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２０１８．Ｍａｒ．１７：４２）上層液をタンパク質定量して濃度を一致させ、下記表８の反応組成で反応物を混合した後、酵素活性を測定した。
特に、ヒスチジンによる活性の抑制抵抗性を確認するために、ヒスチジンの濃度をそれぞれ０ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭ、および５０ｍＭの濃度にした。活性測定は３０℃、ＵＶ波長２９０ｎｍで２分間隔で３０分間測定した。
図１によれば、ｈｉｓＧ＿ＷＴ酵素は、ヒスチジン濃度５ｍＭからＡＴＰ－ＰＲＴ活性が急激に低下した。しかし、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４（Ｈ２３２Ｋ、Ｔ２５２Ａ、Ｅ２７１Ｋ、Ｓ２８８Ｐ）は、ヒスチジン濃度２５ｍＭから酵素活性が低下した。また、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７（Ｈ２３２Ｔ、Ｒ２５０Ｈ、Ｔ２５２Ｌ、Ｅ２７１Ｋ、Ｓ２８８Ｐ）は、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４と類似してヒスチジン濃度２５ｍＭから酵素活性が低下したが、それぞれのヒスチジン濃度において酵素活性はｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４より増加した。結果的に、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７がヒスチジンによる活性の抑制に対して抵抗性に最も優れていた。
実施例８：ＡＴＰ－ＰＲＴ変異酵素発現菌株のヒスチジン生産性評価
ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４またはｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７が導入された菌株のヒスチジン生産性を確認した。下記表９の組成による培地をそれぞれのフラスコに１０ｍｌずつ分注し、ＤＳ９Ｈ、ＤＳ９Ｈ＿△ｈｉｓＧ：：ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４、またはＤＳ９Ｈ＿△ｈｉｓＧ：：ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７菌株を１％ずつ接種し、３４℃、２００ｒｐｍの条件で７２時間培養した。培養後、それぞれのフラスコのヒスチジン生産量を比較分析した。
ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４またはｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７が導入された菌株のヒスチジン生産性を確認した。下記表９の組成による培地をそれぞれのフラスコに１０ｍｌずつ分注し、ＤＳ９Ｈ、ＤＳ９Ｈ＿△ｈｉｓＧ：：ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４、またはＤＳ９Ｈ＿△ｈｉｓＧ：：ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７菌株を１％ずつ接種し、３４℃、２００ｒｐｍの条件で７２時間培養した。培養後、それぞれのフラスコのヒスチジン生産量を比較分析した。
ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４発現菌株は、対照群よりヒスチジン生産量が約５３％程度増加し、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７発現菌株は、対照群よりヒスチジン生産量が約９２％程度増加した。（表１０参照）
前記結果によれば、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４またはｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７は、ｈｉｓ＿ＷＴよりヒスチジンによるフィードバック抑制（ｆｅｅｄｂａｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）が減少してヒスチジン生産性が増加したと考えられる。特に、ｈｉｓＧ＿ＳＤＭ４発現菌株よりｈｉｓＧ＿ＳＤＭ７発現菌株のヒスチジン生産性がより高かった。
また、前記表４および表８の結果をまとめると、大腸菌由来ｈｉｓＧの２３２、２５０、２５２、２７１、および２８８番位置のアミノ酸のいずれか１つを変異させる場合、ヒスチジンの生産量が増加し、複数個を変異させる場合、１つを変異させる場合よりヒスチジンの生産量がより増加した。
［受託番号］
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１４４１９ＢＰ
受託日付：２０２０１２２８
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１４４１９ＢＰ
受託日付：２０２０１２２８
Claims (6)
- 配列番号１のアミノ酸配列における、
２３２番目に位置したヒスチジンのリシンもしくはトレオニンへの置換、または
配列番号１のアミノ酸配列における、
２３２番目に位置したヒスチジンのリシンもしくはトレオニンへの置換、および下記の（ａ）～（ｄ）：
（ａ）２５０番目に位置したアルギニンのヒスチジンへの置換；
（ｂ）２５２番目に位置したトレオニンのアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、またはイソロイシンへの置換；
（ｃ）２７１番目に位置したグルタミン酸のリシンへの置換；
（ｄ）２８８番目に位置したセリンのプロリンへの置換
のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つ
を含む、ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素変異体であって、
前記ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素変異体は、配列番号１において、２３２番目に位置したヒスチジンのリシンまたはトレオニンへの置換、２５０番目に位置したアルギニンのヒスチジンへの置換、２５２番目に位置したトレオニンのアラニン、ロイシン、グリシン、バリン、またはイソロイシンへの置換、２７１番目に位置したグルタミン酸のリシンへの置換、および２８８番目に位置したセリンのプロリンへの置換以外の変異を含まない、ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素変異体。 - 前記ＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｈｉｓＧ遺伝子から発現した、請求項１に記載の変異体。
- 前記変異体は、ヒスチジンによるフィードバック抑制が減少する、請求項１に記載の変異体。
- 請求項１に記載のＡＴＰ－ホスホリボシル転移酵素変異体を発現する形質転換菌株。
- 前記菌株は、大腸菌である、請求項４に記載の形質転換菌株。
- 請求項４に記載の菌株を培養するステップを含むヒスチジン生産方法。
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