JP7658946B2 - カザール型抗セリンプロテアーゼ阻害因子（ｓｐｉｋ）抗体、免疫複合体、及び使用方法 - Google Patents

カザール型抗セリンプロテアーゼ阻害因子（ｓｐｉｋ）抗体、免疫複合体、及び使用方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月８日出願の米国仮特許出願第６２／８７１，５６５号の出願日の優先権を主張し、上記出願の開示はその全体が本明細書に援用される。
政府の権利の表示
本発明は、中小企業革新研究（ＳＢＩＲ）プログラムの下、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された助成金第２Ｒ４４ＣＡ１６５３１４－０２Ａ１号及びＦＡＩＮ第Ｒ４４ＣＡ１６５３１４号の下で、政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体が、かかる抗体の製造方法、かかる抗体を含む医薬組成物を始めとする組成物、ならびにＡＳ－ＳＰＩＫの発現を特徴とする障害（例えば肝臓癌）を診断及び／または治療するためのそれらの使用と共に開示される。上記抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体を含む診断方法及び該抗体を備えるキットも開示される。
肝臓は体内で最大の臓器の１つである。肝臓には、食物の消化に必要な酵素や胆汁の産生、グリコーゲン貯蔵の調節、血漿タンパク質の合成、ホルモンの産生、様々な代謝産物の解毒を含む多くの機能がある。肝障害としては、肝細胞癌（ＨＣＣ）及び肝内胆管癌（ＩＣＣ）などの肝臓癌、ウイルス性感染症、肝硬変、及びその他の肝臓の炎症性障害が挙げられ、世界中で何百万人もの人々が肝障害に罹患している。例えば、米国では５００万人以上、世界中では４億５，０００万人以上が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症を患っており、これらの感染者の３０％以上が肝臓癌を発症する危険性が高い。Ｋｅｗ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ－ｂｉｏｌｏｇｉｅ ２０１０；５８（４）：２７３－２７７；Ｓａｒａｓｗａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ． ２０１５；２２ Ｓｕｐｐｌ １：６－２５；Ｅｌ－Ｓｅｒａｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１４；６０（５）：１７６７－１７７５；Ｋａｎｗａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１５；１３（４）：８０５－８０７。診断及び治療の進歩にもかかわらず、肝臓癌は依然として罹患状態及び死亡の両方の重大な原因である。Ｅｌ－Ｓｅｒａｇ， Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；３６５（１２）：１１１８－１１２７。原発性肝臓癌、すなわち肝臓で最初に生じる癌の５年生存率は１０％未満である。但し、肝臓癌が早期に発見され、最も治療可能な段階にある場合、生存率はほぼ４０％に増加する。Ｅｌ－Ｓｅｒａｇ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１１；４（１）： ５－１０。早期肝臓癌の患者は症状がほとんどないか、またはまったくない場合がある。血清学的方法、超音波、コンピューター断層撮影（ＣＴ）走査、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）、及び血管造影などの現在の検出方法は、感度が低いこと及び技師の誤りの可能性に起因して信頼性がない場合がある。画像診断技法は、費用がかかり、より小さな早期の腫瘍の検出には正確性に劣る場合がある。Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１１；９ （２）：１６１－１６７；Ｂｒｕｉｘ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１１；５３（３）： １０２０－１０２２。肝生検は、良性腫瘍と悪性腫瘍を区別するための最も信頼できる方法と今でも考えられているが、侵襲的であり、外科的処置を要する。Ｌｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００１；１２２ （７）：２０９２－２０９３。特に肝硬変、肝臓のウイルス性感染症、及び炎症性障害の患者にとって、肝臓癌を診断及び治療するための新たな方法が引き続き必要とされている。
本発明の態様は、
（ａ）重鎖可変領域であって、
（ｉ）配列番号２１～３０のアミノ酸配列のいずれかに有する置換が２つ以下であるＣＤＲＨ１、及び／または
（ｉｉ）配列番号３１～４０のアミノ酸配列のいずれかに有する置換が２つ以下であるＣＤＲＨ２、及び／または
（ｉｉｉ）配列番号４１～５０のアミノ酸配列のいずれかに有する置換が２つ以下であるＣＤＲＨ３
を含む上記重鎖可変領域と、
（ｂ）軽鎖可変領域であって、
（ｉ）配列番号５１～６０のアミノ酸配列のいずれかに有する置換が２つ以下であるＣＤＲＬ１、及び／または
（ｉｉ）配列番号６１～７０のアミノ酸配列のいずれかに有する置換が２つ以下であるＣＤＲＬ２、及び／または
（ｉｉｉ）配列番号７１～８０のアミノ酸配列のいずれかに有する置換が２つ以下であるＣＤＲＬ３
を含む上記軽鎖可変領域と
を含む、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＤＲＨ１配列、ＣＤＲＨ２配列、及びＣＤＲＨ３配列はフレームワーク配列内に存在し、且つ上記ＣＤＲＬ１配列、ＣＤＲＬ２配列、及びＣＤＲＬ３配列はフレームワーク配列内に存在する。いくつかの実施形態において、上記フレームワーク配列の少なくとも一部はヒトコンセンサスフレームワーク配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、
（ａ）配列番号２１～３０からなる群より選択されるＣＤＲＨ１配列、及び／または
（ｂ）配列番号３１～４０からなる群より選択されるＣＤＲＨ２配列、及び／または
（ｃ）配列番号４１～５０からなる群より選択されるＣＤＲＨ３配列、及び／または
（ｄ）配列番号５１～６０からなる群より選択されるＣＤＲＬ１配列、及び／または
（ｅ）配列番号６１～７０からなる群より選択されるＣＤＲＬ２配列、及び／または
（ｆ）配列番号７１～８０からなる群より選択されるＣＤＲＬ３配列
を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、
（ａ）配列番号２１～３０からなる群より選択されるＣＤＲＨ１配列と、
（ｂ）配列番号３１～４０からなる群より選択されるＣＤＲＨ２配列と、
（ｃ）配列番号４１～５０からなる群より選択されるＣＤＲＨ３配列と、
（ｄ）配列番号５１～６０からなる群より選択されるＣＤＲＬ１配列と、
（ｅ）配列番号６１～７０からなる群より選択されるＣＤＲＬ２配列と、
（ｆ）配列番号７１～８０からなる群より選択されるＣＤＲＬ３配列と
を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、
（ａ）配列番号２１のＣＤＲＨ１配列、配列番号３１のＣＤＲＨ２配列、配列番号４１のＣＤＲＨ３配列、配列番号５１のＣＤＲＬ１配列、配列番号６１のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７１のＣＤＲＬ３配列、または
（ｂ）配列番号２２のＣＤＲＨ１配列、配列番号３２のＣＤＲＨ２配列、配列番号４２のＣＤＲＨ３配列、配列番号５２のＣＤＲＬ１配列、配列番号６２のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７２のＣＤＲＬ３配列、または
（ｃ）配列番号２３のＣＤＲＨ１配列、配列番号３３のＣＤＲＨ２配列、配列番号４３のＣＤＲＨ３配列、配列番号５３のＣＤＲＬ１配列、配列番号６３のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７３のＣＤＲＬ３配列、または
（ｄ）配列番号２４のＣＤＲＨ１配列、配列番号３４のＣＤＲＨ２配列、配列番号４４のＣＤＲＨ３配列、配列番号５４のＣＤＲＬ１配列、配列番号６４のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７４のＣＤＲＬ３配列、または
（ｅ）配列番号２５のＣＤＲＨ１配列、配列番号３５のＣＤＲＨ２配列、配列番号４５のＣＤＲＨ３配列、配列番号５５のＣＤＲＬ１配列、配列番号６５のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７５のＣＤＲＬ３配列、または
（ｆ）配列番号２６のＣＤＲＨ１配列、配列番号３６のＣＤＲＨ２配列、配列番号４６のＣＤＲＨ３配列、配列番号５６のＣＤＲＬ１配列、配列番号６６のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７６のＣＤＲＬ３配列、または
（ｇ）配列番号２７のＣＤＲＨ１配列、配列番号３７のＣＤＲＨ２配列、配列番号４７のＣＤＲＨ３配列、配列番号５７のＣＤＲＬ１配列、配列番号６７のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７７のＣＤＲＬ３配列、または
（ｈ）配列番号２８のＣＤＲＨ１配列、配列番号３８のＣＤＲＨ２配列、配列番号４８のＣＤＲＨ３配列、配列番号５８のＣＤＲＬ１配列、配列番号６８のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７８のＣＤＲＬ３配列、または
（ｉ）配列番号２９のＣＤＲＨ１配列、配列番号３９のＣＤＲＨ２配列、配列番号４９のＣＤＲＨ３配列、配列番号５９のＣＤＲＬ１配列、配列番号６９のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７９のＣＤＲＬ３配列、または
（ｊ）配列番号３０のＣＤＲＨ１配列、配列番号４０のＣＤＲＨ２配列、配列番号５０のＣＤＲＨ３配列、配列番号６０のＣＤＲＬ１配列、配列番号７０のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号８０のＣＤＲＬ３配列
を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１～１０の配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域及び／または配列番号１１～２０の配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号１～１０からなる群より選択される重鎖可変領域配列及び／または配列番号１１～２０からなる群より選択される軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、
（ａ）配列番号１の重鎖可変領域配列及び配列番号１１の軽鎖可変領域配列、または
（ｂ）配列番号２の重鎖可変領域配列及び配列番号１２の軽鎖可変領域配列、または
（ｃ）配列番号３の重鎖可変領域配列及び配列番号１３の軽鎖可変領域配列、または
（ｄ）配列番号４の重鎖可変領域配列及び配列番号１４の軽鎖可変領域配列、または
（ｅ）配列番号５の重鎖可変領域配列及び配列番号１５の軽鎖可変領域配列、または
（ｆ）配列番号６の重鎖可変領域配列及び配列番号１６の軽鎖可変領域配列、または
（ｇ）配列番号７の重鎖可変領域配列及び配列番号１７の軽鎖可変領域配列、または
（ｈ）配列番号８の重鎖可変領域配列及び配列番号１８の軽鎖可変領域配列、または
（ｉ）配列番号９の重鎖可変領域配列及び配列番号１９の軽鎖可変領域配列、または
（ｊ）配列番号１０の重鎖可変領域配列及び配列番号２０の軽鎖可変領域配列
を含む。
本発明の態様は、
（ａ）ヒトＶＨフレームワーク中にＣＤＲＨ１配列、ＣＤＲＨ２配列、及びＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域であって、ＣＤＲＨ配列が、配列番号２１～５０からなる群より選択されるＣＤＲ配列中に有する置換が２つ以下である配列である上記重鎖可変領域と、
（ｂ）ヒトＶＬフレームワーク中にＣＤＲＬ１配列、ＣＤＲＬ２配列、及びＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域であって、ＣＤＲＬ配列が、配列番号５１～８０からなる群より選択されるＣＤＲ配列中に有する置換が２つ以下である配列である上記軽鎖可変領域と
を含む、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的に結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない、単離された抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、
（ａ）ヒトＶＨフレームワーク中にＣＤＲＨ１配列、ＣＤＲＨ２配列、及びＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域であって、ＣＤＲＨ配列が配列番号２１～５０からなる群より選択される上記重鎖可変領域と、
（ｂ）ヒトＶＬフレームワーク中にＣＤＲＬ１配列、ＣＤＲＬ２配列、及びＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域であって、ＣＤＲＬ配列が配列番号５１～８０からなる群より選択される上記軽鎖可変領域と
を含む。
本発明の態様は、
（ａ）ヒトＶＨフレームワーク中の配列番号２１のＣＤＲＨ１配列、配列番号３１のＣＤＲＨ２配列、及び配列番号４１のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中の配列番号５１のＣＤＲＬ１配列、配列番号６１のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７１のＣＤＲＬ３配列、または
（ｂ）ヒトＶＨフレームワーク中の配列番号２２のＣＤＲＨ１配列、配列番号３２のＣＤＲＨ２配列、及び配列番号４２のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中の配列番号５２のＣＤＲＬ１配列、配列番号６２のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７２のＣＤＲＬ３配列、または
（ｃ）ヒトＶＨフレームワーク中の配列番号２３のＣＤＲＨ１配列、配列番号３３のＣＤＲＨ２配列、及び配列番号４３のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中の配列番号５３のＣＤＲＬ１配列、配列番号６３のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７３のＣＤＲＬ３配列、または
（ｄ）ヒトＶＨフレームワーク中の配列番号２４のＣＤＲＨ１配列、配列番号３４のＣＤＲＨ２配列、及び配列番号４４のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中の配列番号５４のＣＤＲＬ１配列、配列番号６４のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７４のＣＤＲＬ３配列、または
（ｅ）ヒトＶＨフレームワーク中の配列番号２５のＣＤＲＨ１配列、配列番号３５のＣＤＲＨ２配列、及び配列番号４５のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中の配列番号５５のＣＤＲＬ１配列、配列番号６５のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７５のＣＤＲＬ３配列、または
（ｆ）ヒトＶＨフレームワーク中の配列番号２６のＣＤＲＨ１配列、配列番号３６のＣＤＲＨ２配列、及び配列番号４６のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中の配列番号５６のＣＤＲＬ１配列、配列番号６６のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７６のＣＤＲＬ３配列、または
（ｇ）ヒトＶＨフレームワーク中の配列番号２７のＣＤＲＨ１配列、配列番号３７のＣＤＲＨ２配列、及び配列番号４７のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中の配列番号５７のＣＤＲＬ１配列、配列番号６７のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７７のＣＤＲＬ３配列、または
（ｈ）ヒトＶＨフレームワーク中の配列番号２８のＣＤＲＨ１配列、配列番号３８のＣＤＲＨ２配列、及び配列番号４８のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中の配列番号５８のＣＤＲＬ１配列、配列番号６８のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７８のＣＤＲＬ３配列、または
（ｉ）ヒトＶＨフレームワーク中の配列番号２９のＣＤＲＨ１配列、配列番号３９のＣＤＲＨ２配列、及び配列番号４９のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中の配列番号５９のＣＤＲＬ１配列、配列番号６９のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７９のＣＤＲＬ３配列、または
（ｊ）ヒトＶＨフレームワーク中の配列番号３０のＣＤＲＨ１配列、配列番号４０のＣＤＲＨ２配列、及び配列番号５０のＣＤＲＨ３配列、ならびにヒトＶＬフレームワーク中の配列番号６０のＣＤＲＬ１配列、配列番号７０のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号８０のＣＤＲＬ３配列
を含む、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的に結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない、単離された抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体、またはその抗原結合フラグメントを含む。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは多重特異性である。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは二重特異性である。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントはエフェクター細胞に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントはＴ細胞抗原に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントはＣＤ３に対する結合親和性を有する。
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントはモノクローナルである。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントはＣＡＲ－Ｔフォーマットである。
本発明の態様は、細胞傷害性薬剤に共有結合している、本明細書に記載の抗体を含む免疫複合体を含む。いくつかの実施形態において、上記細胞傷害性薬剤は、毒素、化学療法剤、薬物部分、抗生物質、放射性同位体、及び核酸分解酵素からなる群より選択される。
本発明の態様は、式Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）ｐ（式中、
（ａ）Ａｂは本明細書に記載の抗体であり、
（ｂ）Ｌはリンカーであり、
（ｃ）Ｄは薬物部分であり、
（ｄ）ｐは１～８の範囲の整数である）
を有する免疫複合体を含む。いくつかの実施形態において、Ｄは、メイタンシノイド、オーリスタチン、及びドロスタチンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、Ｌは、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、バリン－シトルリン（ｖａｌ－ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｌａ－ｐｈｅ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、４－（２－ピリジルチオ）ペンタン酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＰＰ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）、４－（２－ピリジルジチオ）酪酸 Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＢ）、及び（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸Ｎ－スクシンイミジル（ＳＩＡＢ）からなる群より選択される１種以上のリンカーを含む。
本発明の態様は、本明細書に記載の抗体、抗原結合フラグメント、または免疫複合体を含む医薬組成物を含む。
本発明の態様は、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現を特徴とする障害の治療方法であって、上記障害を有する対象に、本明細書に記載の抗体、抗原結合フラグメント、もしくは免疫複合体、または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む上記方法を含む。
本発明の態様は、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現を特徴とする障害の治療のための薬剤の製造における、本明細書に記載の抗体、抗原結合フラグメント、または免疫複合体の使用を含む。本発明の態様は、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現を特徴とする障害の治療における使用のための、本明細書に記載の抗体、抗原結合フラグメント、または免疫複合体を含む。
いくつかの実施形態において、上記障害は肝障害である。いくつかの実施形態において、上記肝障害は肝細胞癌である。いくつかの実施形態において、上記肝障害は肝内胆管癌である。いくつかの実施形態において、上記肝障害はウイルス性感染症である。いくつかの実施形態において、上記肝障害は炎症性肝障害である。いくつかの実施形態において、上記炎症性肝障害は肝硬変である。
本発明の態様は、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、または上記ベクターを含む宿主細胞を含む。
本発明の態様は、本明細書に記載の抗体、抗原結合フラグメント、または免疫複合体の製造方法であって、上記抗体または抗原結合フラグメントの発現を許容する条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養すること、及び上記抗体または抗原結合フラグメントを上記細胞から単離することを含む上記方法を含む。
本発明の態様は、対象がＡＳ－ＳＰＩＫの発現を特徴とする障害を有するかまたは上記障害を発症する危険性があるかどうかを判定するための診断方法であって、
（ａ）上記対象由来の生物学的検査試料を本明細書に記載のＡＳ－ＳＰＩＫ抗体または抗原結合フラグメントと接触させて、ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体を生成させることと、
（ｂ）上記生物学的検査試料中のＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を検出することと、
（ｃ）上記ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を基準値と比較して、上記対象が上記障害を有しているか、または上記障害を発症する危険性があるかどうかを判定することと
を含む上記方法を含む。
本発明の態様は、対象がＡＳ－ＳＰＩＫの発現を特徴とする障害を有するかまたは上記障害を発症する危険性があるかどうかを判定するための診断方法であって、
（ａ）上記対象由来の生物学的検査試料をＳＰＩＫに特異的に結合する第１の抗体または抗原結合フラグメントと接触させて、ＳＰＩＫ－抗体複合体を形成させることと、
（ｂ）上記ＳＰＩＫ－抗体複合体を本明細書に記載のＡＳ－ＳＰＩＫ抗体または抗原結合フラグメントと接触させて、ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体を生成させることと、
（ｃ）上記生物学的検査試料中のＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を検出することと、
（ｄ）上記ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を基準値と比較して、上記対象が上記障害を有しているか、または上記障害を発症する危険性があるかどうかを判定することと
を含む上記方法を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗体または抗原結合フラグメントは検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態において、上記障害は肝臓障害である。いくつかの実施形態において、上記肝障害は、肝細胞癌、肝内胆管癌、ウイルス性肝感染症、炎症性肝障害、及び肝硬変からなる群から選択される。
本発明の態様は、本明細書に記載の抗体、抗原結合フラグメント、または免疫複合体を備えるキットを含む。いくつかの実施形態において、上記キットはＳＰＩＫに特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントをさらに備える。
ＡＳ－ＳＰＩＫ及びＮＳ－ＳＰＩＫに対する様々なモノクローナル抗体の相対的結合活性を示すＥＬＩＳＡの結果を示す図である。 抗体ＩＭ－Ｅ２を含む試料中の抗体－抗原複合体の検出の結果を示す図である。 １０種の抗体、すなわち、ＩＭ－Ａ１、ＩＭ－Ａ６、ＩＭ－Ｂ１０、ＩＭ－Ｃ６、ＩＭ－Ｄ３、ＩＭ－Ｄ５、ＩＭ－Ｅ２、ＩＭ－Ｆ５、ＩＭ－Ｇ６、及びＩＭ－Ｇ７のＶＨ領域のアラインメントを示す図である。すべての抗体のコンセンサス配列が掲載されている。本明細書で提供される抗体は、ＩＭ－Ａ１、ＩＭ－Ａ６等々の文字「ＩＭ」を含む長い名称で呼ばれるか、または「ＩＭ」を使用しないことによる略称、例えばＡ１またはＡ６等々で呼ばれる場合がある。 １０種の抗体Ａ１、Ａ６、Ｂ１０、Ｃ６、Ｄ３、Ｄ５、Ｅ２、Ｆ５、Ｇ６、及びＧ７のＶＬ領域のアラインメントを示す図である。すべての抗体のコンセンサス配列が掲載されている。 １０種の抗体Ａ１、Ａ６、Ｂ１０、Ｃ６、Ｄ３、Ｄ５、Ｅ２、Ｆ５、Ｇ６、及びＧ７のＶＨ ＣＤＲのアラインメントを示す図である。各ＣＤＲのコンセンサス配列が掲載されている。 １０種の抗体Ａ１、Ａ６、Ｂ１０、Ｃ６、Ｄ３、Ｄ５、Ｅ２、Ｆ５、Ｇ６、及びＧ７のＶＬ ＣＤＲのアラインメントを示す図である。各ＣＤＲのコンセンサス配列が掲載されている。 アミノ酸配列及び核酸配列の情報を示す図である。
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内である、分子生物学（組換え技術を始めとする）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を使用する。かかる技法は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” （Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ， ｅｄ．， １９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” （Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ．， １９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” （Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８７， ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；“ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”， （Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄ．， １９９４）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ” （Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．， １９８８）；“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” （Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．， ２００１）；Ｈａｒｌｏｗ， Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ， Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ： Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ． Ｉ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９９８）；及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）などの文献において詳細に説明されている。
値の範囲が与えられている場合、当該範囲の上限と下限との間に挟まれた、文脈による明確な別段の指示がない限り最下の位の１０分の１までのそれぞれの値、及び当該の記載された範囲中の任意の他の記載されたまたは挟まれた値は本発明に包含されると理解されるべきものである。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、当該の記載された範囲においていずれかの限界が具体的に排除されることを条件として、独立に上記より小さな範囲に含まれてもよく、また本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を排除する範囲もまた本発明に包含される。
別段の明示がない限り、本明細書の抗体残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））。
以下の説明では、本発明をより完全に理解できるように、多くの特定の詳細が示されている。しかしながら、当業者には、これらの特定の詳細の１つ以上がなくとも本発明を実施することができることは明らかであろう。他の例において、当業者に周知の特徴及び周知の手順は、本発明を不明瞭になることを回避するために記載されていない。
特許出願及び刊行物を含む、本開示を通して引用されるすべての参照文献は、それらの全体が本明細書に援用される。
用語の定義
本明細書の理解を目的に以下の定義が適用され、適当である場合は常に、単数形で使用される用語は複数形も含むこととなり、その逆も同様である。記載されるいずれかの定義が本明細書に援用されるいずれかの文書と矛盾する場合には、以下に記載されている定義が優先するものとする。
「エピトープ」は、単一の抗体分子が結合する抗原分子の表面上の部位である。一般に、抗原はいくつかまたは多くの異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。この用語は、詳細には線状エピトープ及び配座エピトープを包含する。この用語は、抗体に特異的に結合することができる任意の分子決定因子を包含する。特定の実施形態において、エピトープ決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面グループを包含し、特定の実施形態において、特定の三次元構造特性、及び／または特定の電荷特性を有する場合がある。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。「結合領域」は、結合分子によって結合される結合標的上の領域である。
「エピトープマッピング」は、標的抗原上の抗体の結合部位、すなわちエピトープを特定するプロセスである。抗体エピトープは、線状エピトープまたは配座エピトープであってよい。線状エピトープはタンパク質中のアミノ酸の連続した配列によって形成される。配座エピトープは、タンパク質配列中では不連続であるが、該タンパク質がその三次元構造に折り畳まれると一体となるアミノ酸から形成される。
本明細書で定義される「エピトープビニング」とは、抗体の分類プロセスであって、上記抗体が認識するエピトープに基づく上記プロセスである。より詳細には、エピトープビニングは、抗体をそれらのエピトープ認識特性に基づいてクラスター化し、別個の結合特異性を有する抗体を識別するための計算プロセスと組み合わせた、異なる抗体のエピトープ認識特性を区別するための方法及びシステムを包含する。
２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合、上記抗体は基準の抗体と「本質的に同一のエピトープ」と結合する。２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープに結合するかどうかを判定するために最も広く使用され且つ迅速な方法は、標識抗原または標識抗体のいずれかを使用して、任意の数の異なる方式で構成することができる競合アッセイである。通常、上記抗原が９６ウェルプレート上に固定化されており、放射標識または酵素標識を使用し、非標識抗体が標識抗体の結合を遮断する能力を測定する。
本明細書では、アミノ酸残基／位置の「修飾」とは、当初のアミノ酸配列と比較した一次アミノ酸配列の変化であって、上記アミノ酸残基／位置が関与する配列変化に起因する上記変化をいう。例えば、一般的な修飾としては、残基（または上記位置における）の別のアミノ酸による置換（例えば、保存的または非保存的置換）、上記残基／位置に隣接する１つ以上（一般に５または３未満）のアミノ酸の挿入、及び上記残基／位置の欠失が挙げられる。「アミノ酸置換」またはその変化形は、所定の（当初の）アミノ酸配列中の既存のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することをいう。一般的に且つ好ましくは、修飾によって、当初の（または「野生型」の）アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較して、変異体ポリペプチドの少なくとも１つの物理的または生化学的活性が変化する。例えば、抗体の場合、変化する物理的または生化学的活性は、標的分子に対する結合親和性、結合能力、及び／または結合効果であってよい。
用語「抗体」は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を含む）、一本鎖分子、ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）を包含する。本明細書では、用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は「抗体」と同義で使用される。基本的な４本鎖抗体単位は、２本の同一の軽（Ｌ）鎖と２本の同一の重鎖（Ｈ）とから構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。別段の特記がない限り、用語「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用され、詳細には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体及びにそれらのフラグメント、好ましくは抗原結合フラグメントを含む、抗体のすべてのイソ型、サブクラス、ならびに形態を含む。
別段の明示がない限り、用語「抗体」は、詳細には、天然に存在する変異体を含む、天然のヒト及び非ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ）、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＭ抗体を含む。
本明細書では、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、少量存在する場合がある、可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である上記集団を構成する個々の抗体をいう。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位を指向する。さらに、通常は種々の決定基（エピトープ）を指向する種々の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示すものであり、いずれかの特定の方法によって該抗体を産生することを要すると解釈されるべきでものはない。例えば本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に報告されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製されてもよい。上記「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８；及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１－５９７に記載される技法を使用してファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
本明細書におけるモノクローナル抗体としては、特に、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同である一方、鎖（複数可）の残余の部分が別の種に由来する抗体、ならびに（所望の生物学的活性を示す限り）かかる抗体のフラグメント中の対応する配列と同一であるかまたは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５）が挙げられる。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、該ヒト免疫グロブリン中の上記レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長動物などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換されている上記ヒト免疫グロブリンである。場合によっては、上記ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基も、対応する非ヒト残基に置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中には存在しない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の性能をさらに改良するために行われる。一般に、上記ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むこととなり、上記可変ドメイン中で、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのループに対応し、且つ上記ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。上記ヒト化抗体は任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的にはヒト免疫グロブリンの定常領域も含むこととなる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９；及びＰｒｅｓｔａ （１９９２） Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５９３－５９６を参照されたい。
基準ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）表示アミノ酸配列同一性」とは、候補配列中のアミノ酸残基の百分率であって、上記両配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大のパーセント表示配列同一性を達成させた後の、基準ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一であり、上記配列同一性の一部としての保存的置換を考慮しない上記百分率として定義される。パーセント表示アミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野の技術の範囲内である様々な方法で実現することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアラインメントを実現するために必要な、いずれかのアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適宜のパラメータを決定することができる。但し、本明細書の目的のためには、％表示アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して得る。
本明細書では、用語「パーセント表示配列相同性」とは、任意の所与のクエリ配列とサブジェクト配列との間の相同性の程度をいう。例えば、天然に存在するＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドをクエリ配列としてもよく、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドのフラグメントをサブジェクト配列としてもよい。同様に、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドのフラグメントをクエリ配列としてもよく、その生物学的に活性な変異体をサブジェクト配列としてもよい。
本明細書では、用語「コンセンサス配列」とは、当該配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大の配列一致を実現した後の、配列アラインメント中の各位置に存在する最も頻度の高い残基を示すアミノ酸残基配列またはヌクレオチド残基配列であって、配列同一性の一部としてのいずれの保存的置換を考慮していない上記配列を意味する。
本明細書における「単離された」抗体とは、組換え宿主細胞における該抗体の天然の環境の成分から識別及び分離され、及び／または回収された抗体である。上記抗体の天然の環境の汚染成分は、上記抗体の診断上または治療上の使用を妨げることとなる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性または非タンパク性の溶質、ならびに産生の望ましくない副生物を含む場合がある。好ましい実施形態において、本明細書における単離された抗体は、（１）ＳＤＳ－ＰＡＧＥもしくはＳＥＣ－ＨＰＬＣ法によって測定して、９５重量％を超える、または９８重量％を超える、または９９重量％を超えるまで、（２）アミノ酸シーケンサーの使用による少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、あるいは（３）クマシーブルー染色、好ましくは銀染色を使用した還元または非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一とされるまで精製されることとなる。通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されることとなる。
ＩｇＧの場合、上記４本鎖単位は一般に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つのジスルフィド共有結合によってＨ鎖と連結される一方、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖のイソ型に応じて、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。各Ｈ鎖及びＬ鎖は、規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖はＮ末端に可変ドメイン（ＶＨ）、それに続いてα鎖及びγ鎖のそれぞれに３つの定常ドメイン（ＣＨ）、ならびにμ及びεイソ型に４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖はＮ末端に可変ドメイン（ＶＬ）、それに続いてその他端に定常ドメインを有する。上記ＶＬは上記ＶＨと整列し、上記ＣＬは上記重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。特定のアミノ酸残基が、上記軽鎖と重鎖の可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬとの互いの対合によって単一の抗原結合部位が形成される。
本明細書において用語「ポリペプチド」は最も広い意味で使用され、ペプチド配列を包含する。用語「ペプチド」は概括的に、ペプチド結合によって共有結合された最大約６０個、好ましくは最大約３０個のアミノ酸を含むアミノ酸の線状分子鎖を表す。
用語「特異的結合」または「～に対して特異的に結合する」または「～に対して特異的」であるとは、標的抗原、例えば、特定のポリペプチド、ペプチド、または他の標的（例えば糖タンパク質標的）上のエピトープに対する抗体の結合をいい、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する（例えば、非特異的相互作用はウシ血清アルブミンまたはカゼインに対する結合であってよい）。特異的結合は、例えば、対照分子への結合と比較した、標的分子への抗体の結合を測定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似する対照分子、例えば、過剰の非標識標的との競合によって判定することができる。この場合、プローブに対する標識標的の結合が過剰の非標識標的によって競合的に阻害されれば、特異的結合であることが示される。例えば、少なくとも約２００ｎＭ、あるいは少なくとも約１５０ｎＭ、あるいは少なくとも約１００ｎＭ、あるいは少なくとも約６０ｎＭ、あるいは少なくとも約５０ｎＭ、あるいは少なくとも約４０ｎＭ、あるいは少なくとも約３０ｎＭ、あるいは少なくとも約２０ｎＭ、あるいは少なくとも約１０ｎＭ、あるいは少なくとも約８ｎＭ、あるいは少なくとも約６ｎＭ、あるいは少なくとも約４ｎＭ、あるいは少なくとも約２ｎＭ、あるいは少なくとも約１ｎＭ、またはそれを超える標的に対するＫｄを有する分子が、本明細書で使用される上記用語、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に対する特異的結合」または上記「に対して特異的に結合する」または上記「に対して特異的」であることを示すことができる。特定の場合において、用語「特異的結合」とは、分子がいずれの他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合をいう。
「結合親和性」とは、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば抗原）との間の非共有結合的相互作用の総和の強さをいう。別段の指示がない限り、本明細書では、「結合親和性」とは、結合対の構成員（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性をいう。分子Ｘの相手Ｙに対する親和性は、概括的には解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。例えば、上記Ｋｄは、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭであるか、またはそれより強くてもよい。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般に抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向がある一方、高親和性抗体は一般に抗原により速く結合し、より長く結合した状態を維持する傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で公知である。
本明細書では、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」とは、抗体と標的との対に適した技法によって、例えば表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を使用して、２５℃で固定化抗原ＣＭ５チップを用い、約１０レスポンスユニット（ＲＵ）で測定される解離定数をいう。
本明細書では、用語「価」とは、抗体における特定の数の結合部位の存在を意味する。したがって、用語「二価」とは２つの結合部位の存在を意味する。
「ポリエピトープ特異性」とは、同一のまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力をいう。「単一特異性の」とは、１つのエピトープのみに結合する能力をいう。いくつかの実施形態において、抗体は、少なくとも１０－７Ｍ、もしくは１０－８Ｍまたはそれよりも良好な親和性で各エピトープに結合する。
用語「標的」または「結合標的」は最も広い意味で使用され、詳細には、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、細胞、及び他の分子であって、該分子が天然に存在する場合に生物学的機能を伴うまたは伴わない上記分子を包含するが、これらに限定はされない。
用語「抗原」とは、抗体に結合するか、または細胞性免疫応答を誘発することができる実体またはそのフラグメントをいう。免疫原とは、生物、特に動物、より詳細にはヒトを始めとする哺乳動物において免疫応答を誘発することができる抗原をいう。用語、抗原は、上記で定義されたように、抗原決定基すなわちエピトープとして知られている領域を包含する。
本明細書では、用語「免疫原性」とは、抗体の産生を誘発し、及び／または免疫原の抗原に指向するＴ細胞及び／または他の反応性免疫細胞を活性化する物質をいう。
本発明の抗体の「抗原結合部位」または「抗原結合領域」は、通常は、抗原に対する結合部位の親和性に様々な程度で寄与する６つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。本明細書では、用語「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」は、用語「超可変領域」すなわち「ＨＶＲ」と同義で使用される。３つの重鎖可変ドメインＨＶＲ（ＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２、及びＨＶＲ－Ｈ３）ならびに３つの軽鎖可変ドメインＨＶＲ（ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２、及びＨＶＲ－Ｌ３）が存在する。ＨＶＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、配列間の変動性及び／または抗体／抗原複合体からの構造情報に従ってこれらの領域が定義されているアミノ酸配列のコンパイル済みデータベースとの比較によって決定される。また、より少ないＨＶＲから構成される機能的抗原結合部位（すなわち、結合特異性が３つ、４つ、または５つのＨＶＲによって決定される場合）も、本発明の範囲内に含まれる。一部の結合標的に結合するには、６つのＨＶＲの完全なセット未満で十分な場合がある。したがって、場合によっては、ＶＨまたはＶＬドメインのＨＶＲだけで十分となる。さらに、特定の抗体は、抗原に対して非ＨＶＲ関連の結合部位を有する可能性がある。かかる結合部位は明確に本定義内に包含される。
本明細書の目的のための「ｎａｋｅｄ抗体」は、細胞傷害性部分または放射標識と複合体化されていない抗体である。
「抗体薬物複合体」（ＡＤＣ）または免疫複合体とは、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性複合体）などの細胞傷害性薬剤と複合体化された抗体あるいはその抗原結合フラグメントを意味する。
本明細書では、用語「宿主細胞」とは、本発明にかかる抗体を生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を意味する。一実施形態において、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が宿主細胞として使用される。
本明細書では、表現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は同義で使用され、かかる呼称はすべて後代を含む。したがって、語「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、移入の数に関係なく、初代の対象細胞及び該細胞に由来する培養物を含む。また、意図したまたは不注意による変異に起因して、すべての後代のＤＮＡの内容が正確に同一であるとは限らないことも理解されよう。当初形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同一の機能または生物学的活性を有する変異体の後代が包含される。
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合に、「作動可能に連結」されている。例えば、前駆配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、上記ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合、上記配列に作動可能に連結されており；または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合は、隣接し且つリーディングフレーム中にあることを意味する。但し、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。連結は、都合のよい制限酵素認識部位におけるライゲーションによって生じる。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の慣行に従って使用される。
用語「抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体」、「ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体」、または「ＡＳ－ＳＰＩＫに結合する抗体」はすべて、抗体が以下のように十分な親和性でＡＳ－ＳＰＩＫに結合することができる抗体をいい、その結果、上記抗体はＡＳ－ＳＰＩＫを標的とする診断薬及び／または治療薬として有用である。
一実施形態において、本明細書では、「ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体」は、（ｉ）配列番号１～１０のいずれか１つにおいて示す重鎖可変ドメイン配列及び／または配列番号１１～２０のいずれか１つにおいて示す軽鎖可変ドメイン配列を含む；または（ｉｉ）配列番号２１～８０において示すＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つを含む抗ＡＳ－ＳＰＩＫモノクローナル抗体を特に指すために使用される。
用語「可変」とは、可変ドメインの特定のセグメントの配列が、抗体間で広範囲にわたって異なるという事実をいう。「可変」すなわち「Ｖ」ドメインは抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。但し、上記の変動性は可変ドメインの１１０アミノ酸の範囲全体にわたって均等に分布しているわけではない。それよりも、Ｖ領域は、それぞれが９～１２アミノ酸長の「超可変領域」と呼ばれる極端な変動性のより短い領域で区切られた、１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチで構成される。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主にβシート構成をとっており、上記βシート構造を接続し、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって接続される４つのＦＲを含む。それぞれの鎖中の超可変領域は、ＦＲによって、他の鎖の超可変領域と共に近接して保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ．（１９９１）を参照のこと）。
「インタクトな」抗体とは、特定の抗体クラスの抗原結合部位ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び少なくとも重鎖定常ドメインを含む抗体である。例えば、インタクトなＩｇＧ抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＨ１（Ｃγ１）、ＣＨ２（Ｃγ２）、及びＣＨ３（Ｃγ３）を含む。インタクトなＩｇＭ抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＭ１（Ｃμ１）、ＣＭ２（Ｃμ２）、ＣＭ３（Ｃμ３）、及びＣＭ４（Ｃμ４）を含む。インタクトなＩｇＡ抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＡ１（Ｃα１）、ＣＡ２（Ｃα２）、及びＣＡ３（Ｃα３）を含む。インタクトなＩｇＤ抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＤ１（Ｃδ１）、ＣＤ２（Ｃδ２）、及びＣＤ３（Ｃδ３）を含む。インタクトなＩｇＥ抗体は、抗原結合部位、軽鎖定常ドメインＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＥ１（Ｃε１）、ＣＥ２（Ｃε２）、ＣＥ３（Ｃε３）、及びＣＥ４（Ｃε４）を含む。上記定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。インタクトな抗体は１種以上のエフェクター機能を有することが好ましい。
抗体の「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」は、インタクトな抗体の一部分、好ましくは上記インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）： １０５７－１０６２ （１９９５）を参照のこと）；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。一実施形態において、抗体フラグメントは、インタクトな抗体の抗原結合部位を含み、したがって抗原に結合する能力を保持する。当業者であれば、抗体フラグメントは、任意のインタクトな抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体から、当該の抗体の少なくとも抗原結合部分を、該抗体の軽鎖及び重鎖から分離して、抗原結合フラグメントを作製することによって生成させることができることを理解しよう。特定の実施形態において、抗体フラグメントは、抗体の抗原結合領域、ならびに該抗体の軽鎖及び／または重鎖の１つ以上のさらなるドメインを含んでいてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、ＶＨ及びＶＬドメイン、軽鎖定常ドメインＣＬ、ならびに１つ以上の重鎖定常ドメイン、例えば、ＣＨ１（Ｃγ１）ドメイン、ＣＭ１（Ｃμ１）ドメイン、ＣＡ１（Ｃα１）ドメイン、ＣＤ１（Ｃδ１）ドメイン、またはＣＥ１（Ｃε１）ドメインを含む抗原結合領域を含んでいてもよい。
ＩｇＧ抗体フラグメントの場合、パパイン消化により、２つの同一の「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる抗原結合フラグメントと、残余部分の、名称が容易に結晶化する能力を反映している「Ｆｃ」フラグメントとが生成する。上記Ｆａｂフラグメントは、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、及び一方の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と共に、Ｌ鎖全体から構成される。それぞれのＦａｂフラグメントは抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有している。ＩｇＧ抗体のペプシン処理により、二価の抗原結合活性をもち、なおも抗原を架橋する能力を有する、ジスルフィド結合した２つのＦａｂフラグメントに略相当する、単一の大きなＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成する。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にさらにいくつかの残基を有するという点でＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する本明細書における呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは当初、Ｆａｂ’フラグメントの対であって、該対の間にヒンジシステインを有する上記対として生成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。
ＩｇＧ抗体のＦｃフラグメントは、ジスルフィドによって結合された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決定され、この領域は、特定の種類の細胞上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
「天然配列Ｆｃ領域」は、自然界に存在するＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域としては、例えば、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）；。天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；及び天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ならびにそれらの天然に存在する変異体が挙げられる。
「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾、好ましくは１つ以上のアミノ酸置換（複数可）によって、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。変異型Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域中または親ポリペプチドのＦｃ領域中に、約１～約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１～約５個のアミノ酸置換を有することが好ましい。本明細書における変異型Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは上記Ｆｃ領域と少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。
ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ第Ｐ０１８５７号（その全体が本明細書に援用される）によって示される。ヒトＩｇＧ２アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ第Ｐ０１８５９号（その全体が本明細書に援用される）によって示される。ヒトＩｇＧ３アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ第Ｐ０１８６０号（その全体が本明細書に援用される）によって提供される。ヒトＩｇＧ４アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ第Ｐ０１８６１号（その全体が本明細書に援用される）によって示される。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは、緊密に非共有により会合している１つの重鎖可変領域ドメイン及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体から構成される。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種においては、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインを柔軟なペプチドリンカーによって共有結合させることができ、その結果、軽鎖と重鎖は、二本鎖Ｆｖ種における構造と類似した「二量体」構造に会合することができる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、且つこの抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が発出する。但し、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有している。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖へと結合されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、上記ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それにより該ｓＦｖは抗原結合にとって望ましい構造を形成することが可能になる。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９－３１５ （１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ １９９５， ｉｎｆｒａを参照されたい。
用語「キメラ抗原受容体」すなわち「ＣＡＲ」は、本明細書において最も広い意味で使用され、所望の結合特異性（例えば、モノクローナル抗体または他のリガンドの抗原結合領域）を膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに融合する、操作された受容体をいう。通常、上記受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞上に融合して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製するために使用される（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ， ２０１６；１０８（７）：ｄｊｖ４３９；及びＪａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ２０１６；１３：３７０－３８３．）。
本明細書では、用語「エフェクター細胞」とは、免疫応答の認知段階及び活性化段階に対する、免疫応答のエフェクター段階に関与する免疫細胞をいう。一部のエフェクター細胞は特定のＦｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を果たす。いくつかの実施形態において、ナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力がある。例えば、ＦｃＲを発現する単球及びマクロファージは、標的細胞の特異的殺滅及び免疫系の他の構成要素に対する抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食する場合がある。
「ヒトエフェクター細胞」は、Ｔ細胞受容体またはＦｃＲなどの受容体を発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。上記細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たすことが好ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられ、ＮＫ細胞が好ましい。上記エフェクター細胞は、それらの天然の供給源、例えば、血液または本明細書で説明されるＰＢＭＣから単離することができる。
用語「免疫細胞」は、本明細書において最も広い意味で使用され、骨髄またはリンパ起源の細胞、例えばリンパ球（細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を始めとするＢ細胞及びＴ細胞など）；キラー細胞；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；マクロファージ；単球；好酸球；好中球、顆粒球、肥満細胞、及び好塩基球などの多形核細胞が挙げられるが、これらに限定はされない。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性をいう。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存細胞傷害性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。
「抗体依存性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて該標的細胞を溶解する細胞媒介反応をいう。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２ （１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されるようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または上記に加えて、対象となる分子のＡＤＣＣ活性を、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ９５：６５２－６５６ （１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価してもよい。
「補体依存性細胞傷害性」すなわち「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力をいう。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分が同起源の抗原と複合体を形成した分子（例えば抗体）に結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３ （１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイを行ってもよい。
「遮断」抗体または「拮抗剤」抗体または「拮抗性」抗体は、上記抗体が結合する抗原の生物学的活性を阻害または低下させる抗体である。好ましい遮断抗体または拮抗剤抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する能力を有する。
対象となる抗原、例えば、ＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドに「結合する」抗体とは、上記抗原に十分な親和性で結合し、その結果、上記抗原を発現する細胞または組織を標的化する上で治療剤として有用であり、且つ他のタンパク質と有意に交差反応しない抗体である。抗体の標的分子への結合に関して、用語、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープへの「特異的結合」または上記に「特異的に結合する」または上記に「特異的に」とは、非特異的相互作用と測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、ある分子の結合を対照分子の結合と比較して測定することによって測定することが可能であり、上記対照分子は一般に、結合活性をもたない類似の構造の分子である。例えば、特異的結合は、標的と類似する対照分子、例えば、過剰の標識していない標的との競合によって測定することができる。この場合、プローブへの標識された標的の結合が過剰の標識していない標的によって競合的に阻害される場合、特異的結合であることが示される。一実施形態において、用語「特異的結合」とは、ある分子が他のいずれのポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合をいう。
用語「がん」及び「がん性の」とは一般に、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態をいうまたは記述する。「腫瘍」は、１種以上のがん性細胞を含む。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定はされない。かかるがんのより詳細な例としては、扁平上皮癌（例えば上皮性扁平上皮癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、消化管癌を含む胃癌または胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（例えば膵管腺癌）、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌（例えば高悪性度漿液性卵巣癌）、肝臓癌（例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝内胆管癌（ＩＣＣ））、膀胱癌（例えば尿路上皮性膀胱癌）、精巣癌（胚細胞腫瘍）、肝細胞癌、乳癌、脳癌（例えば星状細胞腫）、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）または腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）（例えば、腎細胞癌、腎芽細胞腫、もしくはウィルムス腫瘍）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が挙げられる。がんのさらなる例としては、網膜芽細胞腫、卵胞膜細胞腫、男性化細胞腫、肝細胞癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫、及び急性血液悪性腫瘍を含む血液悪性腫瘍、子宮内膜癌または子宮癌、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、唾液腺癌、外陰癌、甲状腺癌、食道癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌、シュワン腫、乏突起神経膠腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、及び尿路癌が挙げられるが、これらに限定はされない。
用語「転移癌」とは、原発の組織のがん細胞が、血管またはリンパ管によって原発部位から体内の他の１つ以上の部位に移動し、原発の組織以外の１つ以上の臓器に１つ以上の続発性腫瘍を形成するがんの状態を意味する。
本明細書では、「ＡＳ－ＳＰＩＫの発現を特徴とする障害」の「ＡＳ－ＳＰＩＫ関連障害」とは、ＡＳ－ＳＰＩＫ遺伝子もしくは遺伝子産物（ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチド）の発現または過剰発現に関連する障害であり、該障害は、適宜の対照細胞と比較して、正常なまたは高いレベルのＡＳ－ＳＰＩＫを発現する細胞を特徴とする任意の障害であってよい。適宜の対照細胞は、ＡＳ－ＳＰＩＫを発現するもしくは過剰発現する癌に罹患していない個体由来の細胞であるか、または必要とするいずれかの対象由来の非癌性細胞であるか、またはＡＳ－ＳＰＩＫを発現するもしくは過剰発現する癌に罹患している別の個体由来の非がん性細胞であってよい。ＡＳ－ＳＰＩＫ関連障害の１つの顕著な例は肝臓癌である。
用語「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」とは、何らかの程度の異常な細胞増殖に関連する障害をいう。一実施形態において、上記細胞増殖性障害はがんである。
本明細書では、「腫瘍」とは、悪性または良性を問わず、すべての新生物性の細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）及び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、ならびにすべての前がん性及びがん性の細胞及び組織をいう。
本明細書では、用語「予測される」及び「予知される」も、予測方法または予知方法によって、該方法を実施する人が、（通常は治療の前に、但し必ずしもそうである必要はない）抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体を含む抗がん剤による治療に対して反応する可能性がより高いと考えられる患者を選択することが可能になるという意味で同義である。
本明細書では、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療」、または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、治療的処置及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいい、後者の目的は、標的とされる病的状態または障害を予防または減速（低減）することである。治療を必要とする対象としては、既に特定の疾病または障害に罹患している対象、ならびに当該障害に罹患しやすいまたは当該対象における障害を予防すべき対象が挙げられる。
発明の詳細な説明
本発明は、特定の障害が特有の形態のカザール型セリンプロテアーゼ阻害因子（ＳＰＩＫ）の発現を特徴とするという発見に、少なくとも部分的に基づいている。顕著な例が、肝細胞癌（ＨＣＣ）及び肝内胆管癌（ＩＣＣ）を含むが、これらに限定はされない肝臓癌であれば。より詳細には、本発明者らは、肝臓癌などの特定の癌が、分泌されたＳＰＩＫポリペプチドのＮ末端にさらなる２３アミノ酸を含むＳＰＩＫの形態を発現することを見出した。この２３アミノ酸セグメント（配列番号８１）は、膵細胞などの正常な細胞から分泌されるＳＰＩＫポリペプチド中には存在しない。このことは、この２３アミノ酸セグメントの最初の９アミノ酸が、肝臓癌細胞株によって分泌される未処理のＳＰＩＫ中に存在する可能性があるという本発明者らの既報と一致する。Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１３４（４）：３９８－４０８。この長い形態のＳＰＩＫをＡＳ－ＳＰＩＫ、すなわち異常な分泌ＳＰＩＫ（Ａｂｎｏｒｍａｌ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＳＰＩＫ）と呼ぶ場合がある。また、肝臓癌細胞によって産生されるＡＳ－ＳＰＩＫをＬＣ－ＳＰＩＫ、すなわち肝臓癌分泌ＳＰＩＫ（Ｌｉｖｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＳＰＩＫ）と呼ぶ場合もある。用語ＡＳ－ＳＰＩＫ及びＬＣ－ＳＰＩＫは本明細書において同義で使用される。例示的なＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドは、配列番号８２のアミノ酸配列を有する場合がある。本発明者らは、膵細胞などの正常な細胞によって分泌される形態のＳＰＩＫを、ＮＳ－ＳＰＩＫ、すなわち正常分泌ＳＰＩＫ（Ｎｏｒｍａｌ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ＳＰＩＫ）と呼ぶ場合がある。例示的なＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドは、配列番号８３のアミノ酸配列を有する場合がある。本発明者らはまた、ＡＳ－ＳＰＩＫの配座（例えば３Ｄ構造）が、ＮＳ－ＳＰＩＫの配座と異なることも見出した。
したがって、本発明の態様は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的にまたは優先的に結合し、ＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない抗体などの組成物を含む。ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体も提供される。本発明の実施形態にかかるＡＳ－ＳＰＩＫ複合体は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的にまたは優先的に結合する抗体、及びＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチド、またはそのフラグメントを含む。
本発明の態様は、本明細書に記載の抗体（Ａｂ）、リンカー（Ｌ）、及び薬物部分（Ｄ）を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＣは式Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）ｐ（式中、ｐは１～８の範囲の整数である）を有する。
本発明の態様はまた、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現を特徴とする障害、例えば、肝臓癌、例えば、ＨＣＣまたはＩＣＣなどの肝障害の検出のための、本主題の抗体の使用方法も含む。
本発明者らは、本発明者らが、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現の際に発生する特定の事象を理解していると考えているが、本発明の組成物及び方法は、いずれかの特定の細胞機序に影響を与えることによって機能する組成物及び方法には限定されない。本発明者らは、理論に拘束されるものではないが、ＳＰＩＫはプロテアーゼ阻害因子であるため、癌細胞におけるＳＰＩＫの過剰発現は、一種のプロテアーゼであるシグナルペプチドペプチダーゼの活性を抑制し、その結果、癌細胞から非弱毒化完全長タンパク質が分泌されるとの仮説を立てている。
組成物
本明細書で提供される組成物は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的にまたは優先的に結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない抗体を含む。
ＳＰＩＮＫ１、ＰＳＴＩ、及びＴＡＴＩとしても知られるカザール型セリンプロテアーゼ阻害因子（ＳＰＩＫ）は、トリプシン様プロテアーゼ及びキモトリプシン様プロテアーゼなどの多くの細胞プロテアーゼの活性を広く調節することが明らかになっている小タンパク質である。Ｇｒｅｅｎｅ， ＬＪ， Ｊ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ． １９７５；７（２）：１５１－１５４；Ｈｏｒｉｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １９８７；１４９（２）：６３５－６４１；Ｓｔｅｎｍａｎ， ＵＨ， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ． ２００２；４８（８）：１２０６－１２０９。ＳＰＩＫはアポトーシスの阻害の役割も担っている可能性がある。Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１３４（４）：３９８－４０８。例示的なヒトＳＰＩＫアミノ酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ１１９４９、ＧＩ番号：１９０６８７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００３１２２、ＧＩ：６５７９４０８８７；及びＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号：ＢＣ０２５７９０、ＧＩ：１９３４３６０７が挙げられる。
抗体
本明細書で提供される抗体は、配列番号８２のアミノ酸１～２３内のエピトープ、もしくはこの領域内の少なくとも１つのアミノ酸を含むエピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体を含んでいてもよい。上記エピトープは配座エピトープ（配座特異的エピトープ）または線状エピトープであってよい。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号８１に示されるＡＳ－ＳＰＩＫタンパク質配列中のエピトープに特異的にまたは優先的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号８１の少なくとも１つのアミノ酸を含む配座特異的エピトープに特異的にまたは優先的に結合する。
本発明の実施形態に係る抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、特にはモノクローナルであってよく、ヒト、マウス、ウサギ、ヒツジ、もしくはヤギの細胞によって、またはこれらの細胞に由来するハイブリドーマによって産生することができる。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化抗体またはキメラ抗体であってもよい。
本発明の実施形態に係る抗体は様々な立体配置をとることができ、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１種以上のポリペプチドからなるタンパク質を包含することができる。インタクトな抗体、抗体多量体、または抗体フラグメントもしくはそれらの他の変異体であって、上記抗体の機能的な、抗原結合領域を含む上記抗体フラグメントもしくはそれらの他の変異体を含む、様々な抗体構造のいずれか１つを使用することができる。用語「免疫グロブリン」は「抗体」と同義で使用することができる。上記抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル由来であってよい。上記抗体の出処にかかわらず、好適な抗体としては、インタクトな抗体、例えば、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を有するＩｇＧ四量体、一本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体、ならびに抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、及びかかるフラグメントに由来する組換え抗体、例えば、キャメルボディー（ｃａｍｅｌｂｏｄｉｅｓ）、マイクロ抗体、ダイアボディ、及び二重特異性抗体が挙げられる。
インタクトな抗体とは、抗原結合可変領域（ＶＨ及びＶＬ）ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む抗体である。上記定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であってよい。当技術分野で周知のように、上記ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が点在する「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化される。抗体の上記ＣＤＲは通常、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を共に規定するアミノ酸配列を含む。
抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、任意のクラスの免疫グロブリン、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそれらのサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４））に由来していてもよく、上記免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ型またはラムダ型であってよい。認識されているヒト免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。
用語、免疫グロブリンまたは抗体の「抗原結合部分」とは一般に、標的、この場合、ＡＳ－ＳＰＩＫ上の、但しＮＳ－ＳＰＩＫ上にはないアミノ酸残基（配列番号８１）を含むエピトープに特異的にまたは優先的に結合する免疫グロブリンの部分をいう。したがって、免疫グロブリンの抗原結合部分は、分子であって、その中の１つ以上の免疫グロブリン鎖が完全長ではないが、細胞標的に特異的にまたは優先的に結合する上記分子である。抗原結合部分またはフラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬＣ、ＶＨＣ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）抗体のシングルアームのＶＬＣ及びＶＨＣドメインからなるＦｖフラグメント；ならびに（ｖ）特異的にまたは優先的に結合するのに十分なフレームワークを有する単離されたＣＤＲ、例えば、可変領域の抗原結合部分が挙げられる。軽鎖可変領域の抗原結合部分及び重鎖可変領域の抗原結合部分、例えば、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬＣ及びＶＨＣは、組換え法を使用して、ＶＬＣとＶＨＣを、該ＶＬＣ領域とＶＨＣ領域が対合して一価の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する単一タンパク質鎖とすることができる合成リンカーによって結合することができる。かかるｓｃＦｖは、用語、抗体の「抗原結合部分」に包含される。
「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、緊密に共有結合した１本の重鎖可変ドメインと１本の軽鎖可変ドメインの二量体から構成されている。この構成では、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を画成する。６つの超可変領域が抗原結合特異性を付与するが、単一の可変ドメイン（すなわち、抗原に対して特異的な３つの超可変領域のみしか含まないＦｖの半分）でも、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。安定性を向上させるために、ＶＨ－ＶＬドメインを、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３などの柔軟なペプチドリンカーによって接続して、単鎖ＦｖすなわちｓｃＦＶ抗体フラグメントを形成してもよく、またはフレームワーク領域中に２つのシステイン残基を導入することによってジスルフィド結合を形成するように操作して、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）を生成させてもよい。
抗体のフラグメントは、該フラグメントが全長抗体の所望の特異性及び／またはＡＳ－ＳＰＩＫに結合し且つＮＳ－ＳＰＩＫに結合しないための十分な特異性を保持する限り、提供される方法における使用に適する。
本明細書に記載の抗体の抗原結合ドメインは、Ｔ細胞誘導分子（例えば、二重特異性Ｔ細胞誘導、別名ＢｉＴＥ分子）ならびにＣＡＲ－Ｔ構造の産生に利用することができる。Ｔ細胞誘導分子は、例えば、Ｈｕｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５ Ｍａｒ；９３（３）：２９０－２９６に記載される。結合（標的）ドメインとして単一ドメイン抗体を含むＣＡＲ－Ｔ構造は、例えば、Ｉｒｉ－Ｓｏｆｌａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１７：２６３０－２６４１及びＪａｍｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １８４０：３７８－３８６に記載される。
抗体フラグメントを調製するための方法は、生化学的方法（例えば、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、及びそれに続く化学的架橋）ならびに免疫グロブリン配列を所望のフラグメントの合成を指示するように遺伝子操作する組換えＤＮＡに基づく方法の両方を包含する。抗体フラグメントは、非特異的チオールプロテアーゼであるパパインによる全免疫グロブリンのタンパク質分解によって得ることができる。パパイン消化により、「Ｆａｂフラグメント」と呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントであって、それぞれが単一の抗原結合部位を有する上記フラグメントと、残余の「Ｆｃフラグメント」とが生成する。様々な画分をプロテインＡ－セファロースまたはイオン交換クロマトグラフィーによって分離することができる。ウサギ及びヒト由来のＩｇＧからＦ（ａｂ’）２フラグメントを調製するための通常の手順は、酵素ペプシンによる制限タンパク質分解である。インタクトな抗体のペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、なおも抗原を架橋する能力を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントが生成する。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステイン（複数可）を含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に、少数の残基が付加されている点でＦａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは当初、ヒンジシステインをそれらの間に有するＦａｂ’フラグメントの対として生成した。
抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の製造方法も本発明の範囲内である。例えば、ＰＣＲ変異誘発法を使用して免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡ配列を改変することで（例えば、ヒト化免疫グロブリンを生成するために使用される方法を使用して）、可変領域を構築することができる。
モノクローナル抗体は、抗体産生細胞の単一クローンによって産生される同一の抗原特異性の均一な抗体であり、ポリクローナル抗体は一般に、同一の抗原上の異なるエピトープを認識し、抗体産生細胞の複数のクローンによって産生される。それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。修飾語、モノクローナルとは、当該の抗体の性格が、実質的に均一な抗体の集団から得られるものであることを示すのであって、当該の抗体がいずれかの特定の方法によって産生されることを要すると解釈されるべきものではではない。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、キメラ抗体、すなわち、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である重鎖及び／または軽鎖の一部を通常有し、上記鎖（複数可）の残余の部分が、別の種に由来する、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である抗体、ならびに、所望の生物学的活性を示す限りにおけるかかる抗体のフラグメントを含んでいてもよい。対象となるキメラ抗体としては、非ヒト霊長動物（例えば、類人猿、旧世界ザル、新世界ザル、原猿）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む霊長動物化抗体が挙げられる。
マウスまたはウサギのモノクローナル抗体は、ＮＳ－ＳＰＩＫ中には存在せず、ＡＳ－ＳＰＩＫ中に、ＮＳ－ＳＰＩＫ中及びＡＳ－ＳＰＩＫ中の両方に存在するアミノ酸配列である共通領域（配列番号８３）に加えて存在する、追加の２３アミノ酸配列（配列番号８１）を有する特別に設計された組換えタンパク質でマウスまたはウサギを免疫することによって生成させた。いくつかの実施形態において、上記組換えタンパク質は、ＡＳ－ＳＰＩＫにのみ結合し、ＮＳ－ＳＰＩＫには結合しないことに有効な抗体を生成させるためには、２３アミノ酸配列全体（配列番号８１）を有する必要はない場合がある。ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的にまたは優先的に結合する抗体をスクリーニング及び選択するための方法は、実施例１に記載されている。
図１にモノクローナル抗体の試験結果を示しており、これらの結果は、本発明の抗体がＡＳ－ＳＰＩＫを特異的にまたは優先的に認識することができるが、ＮＳ－ＳＰＩＫを認識することはできないことを示しており、これらの抗体には、ＩＭ－Ａ１、ＩＭ－Ａ６、ＩＭ－Ｂ１０、ＩＭ－Ｃ６、ＩＭ－Ｄ３、ＩＭ－Ｄ５、ＩＭ－Ｅ２、ＩＭ－Ｆ５、ＩＭ－Ｇ６、及びＩＭ－Ｇ７が含まれるが、これらに限定はされない。試験の説明については実施例１を参照されたい。
ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的にまたは優先的に結合する（且つＮＳ－ＳＰＩＫには結合しない）モノクローナル抗体の軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の可変領域の配列を決定した（配列番号１～２０）。これらの抗体のすべてのＣＤＲも決定した（配列番号２１～８０）。図３～６はこれらの領域のコンセンサスアミノ酸配列を示す。表１～３は、１０種の本発明の例示的な抗体の様々なＶＨ及びＶＬ領域の配列番号を示す。
例えば、ＩＭ－Ａ１抗体は配列番号１に示すＶＨ領域を有し、配列番号１１に示すＶＬ領域を有する。上記ＶＨ領域は配列番号２１、３１、及び４１に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。上記ＶＬ領域は配列番号５１、６１、及び７１に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。
ＩＭ－Ａ６抗体は配列番号２に示すＶＨ領域を有し、配列番号１２に示すＶＬ領域を有する。上記ＶＨ領域は配列番号２２、３２、及び４２に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。上記ＶＬ領域は配列番号５２、６２、及び７２に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。
ＩＭ－Ｂ１０抗体は配列番号３に示すＶＨ領域を有し、配列番号１３に示すＶＬ領域を有する。上記ＶＨ領域は配列番号２３、３３、及び４３に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。上記ＶＬ領域は配列番号５３、６３、及び７３に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。
ＩＭ－Ｃ６抗体は配列番号４に示すＶＨ領域を有し、配列番号１４に示すＶＬ領域を有する。上記ＶＨ領域は配列番号２４、３４、及び４４に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。上記ＶＬ領域は配列番号５４、６４、及び７４に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。
ＩＭ－Ｄ３抗体は配列番号５に示すＶＨ領域を有し、配列番号１５に示すＶＬ領域を有する。上記ＶＨ領域は配列番号２５、３５、及び４５に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。上記ＶＬ領域は配列番号５５、６５、及び７５に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。
ＩＭ－Ｄ５抗体は配列番号６に示すＶＨ領域を有し、配列番号１６に示すＶＬ領域を有する。上記ＶＨ領域は配列番号２６、３６、及び４６に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。上記ＶＬ領域は配列番号５６、６６、及び７６に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。
ＩＭ－Ｅ２抗体は配列番号７に示すＶＨ領域を有し、配列番号１７に示すＶＬ領域を有する。上記ＶＨ領域は配列番号２７、３７、及び４７に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。上記ＶＬ領域は配列番号５７、６７、及び７７に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。
ＩＭ－Ｆ５抗体は配列番号８に示すＶＨ領域を有し、配列番号１８に示すＶＬ領域を有する。上記ＶＨ領域は配列番号２８、３８、及び４８に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。上記ＶＬ領域は配列番号５８、６８、及び７８に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。
ＩＭ－Ｇ６抗体は配列番号９に示すＶＨ領域を有し、配列番号１９に示すＶＬ領域を有する。上記ＶＨ領域は配列番号２９、３９、及び４９に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。上記ＶＬ領域は配列番号５９、６９、及び７９に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。
ＩＭ－Ｇ７抗体は配列番号１０に示すＶＨ領域を有し、配列番号２０に示すＶＬ領域を有する。上記ＶＨ領域は配列番号３０、４０、及び５０に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。上記ＶＬ領域は配列番号６０、７０、及び８０に対応する３つのＣＤＲ領域を有する。
さらに、本発明の実施形態にかかる抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的にまたは優先的に結合し、ＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない任意の天然に存在しない（人工の）抗体であってもよい。
いくつかの実施形態において、抗体は、得られる抗体または抗原結合フラグメントが特異的にまたは優先的にＡＳ－ＳＰＩＫに結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫには結合しないとの条件で、配列番号１～１０のいずれか１つに示す配列を有するＶＨ領域を含むか、または配列番号１～１０のいずれか１つの重鎖可変領域配列に対する少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＶＨ領域を有する。
いくつかの実施形態において、抗体は、得られる抗体または抗原結合フラグメントが特異的にまたは優先的にＡＳ－ＳＰＩＫに結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫには結合しないとの条件で、配列番号１１～２０のいずれか１つに示す配列を有するＶＬ領域を含むか、または配列番号１１～２０のいずれか１つの重鎖可変領域配列に対する少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＶＬを有する。
いくつかの実施形態において、抗体は、得られる抗体が特異的にまたは優先的にＡＳ－ＳＰＩＫに結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫには結合しない限り、配列番号２１～３０のいずれか１つに示す配列を有するか、または配列番号２１～３０のいずれか１つに含むアミノ酸変異が２つ以下のＶＨ ＣＤＲ１領域を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ１領域は以下の構造式を含んでいてもよく、式中、Ｘは可変アミノ酸を示し、これは同定されたアミノ酸：Ｓ Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ Ｘ４ Ｓ（配列番号１０７）のいずれかであってよく、式中、Ｘ１はＳまたはＡであり、Ｘ２はＹまたはＮであり、Ｘ３はＡ、Ｇ、Ｐ、またはＶであり、Ｘ４はＩまたはＶである。
いくつかの実施形態において、抗体は、得られる抗体が特異的にまたは優先的にＡＳ－ＳＰＩＫに結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫには結合しない限り、配列番号３１～４０のいずれか１つに示す配列を有するか、または配列番号３１～４０のいずれか１つに含むアミノ酸変異が２つ以下のＶＨ ＣＤＲ２領域を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ２領域は以下の構造式を含んでいてもよく、式中、Ｘは可変アミノ酸を示し、これは同定されたアミノ酸：Ｘ５ Ｉ Ｘ６ Ｘ７ Ｘ８ Ｇ Ｘ９ Ｘ１０ Ｘ１１ Ｙ Ａ Ｓ Ｗ Ａ Ｋ Ｓ（配列番号１０８）のいずれかであってよく、式中、Ｘ８はＳ、Ｇ、またはＹであり、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ９、Ｘ１０、及びＸ１１は任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態において、抗体は、得られる抗体が特異的にまたは優先的にＡＳ－ＳＰＩＫに結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫには結合しない限り、配列番号４１～５０のいずれか１つに示す配列を有するか、または配列番号４１～５０のいずれか１つに含むアミノ酸変異が２つ以下のＶＨ ＣＤＲ３領域を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ ＣＤＲ３領域は以下の構造式を含んでいてもよく、式中、Ｘは可変アミノ酸を示し、これは同定されたアミノ酸：Ｒ Ｘ１２ Ｘ１３ Ｘ１４ Ｘ１５ Ｘ１６ Ｘ１７ Ｘ１８ Ｘ１９ Ｘ２０ Ｘ２１（配列番号１０９）のいずれかであってよく、式中、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２０、及びＸ２１は任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態において、抗体は、得られる抗体が特異的にまたは優先的にＡＳ－ＳＰＩＫに結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫには結合しない限り、配列番号５１～６０のいずれか１つに示す配列を有するか、または配列番号５１～６０のいずれか１つに含むアミノ酸変異が２つ以下のＶＬ ＣＤＲ１領域を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ ＣＤＲ１領域は以下の構造式を含んでいてもよく、式中、Ｘは可変アミノ酸を示し、これは同定されたアミノ酸：Ｑ Ａ Ｓ Ｘ２２ Ｘ２３ Ｉ Ｘ２４ Ｘ２５ Ｘ２６ Ｌ Ｘ２７（配列番号１１０）のいずれかであってよく、式中、Ｘ２２はＱまたはＥであり、Ｘ２３はＳ、Ｇ、Ｄ、またはＮであり、Ｘ２４はＳ、Ｎ、Ｅ、またはＧであり、Ｘ２５は任意のアミノ酸であり、Ｘ２６はＹまたはＡであり、Ｘ２７は任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態において、抗体は、得られる抗体が特異的にまたは優先的にＡＳ－ＳＰＩＫに結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫには結合しない限り、配列番号６１～７０のいずれか１つに示す配列を有するか、または配列番号６１～７０のいずれか１つに含むアミノ酸変異が２つ以下のＶＬ ＣＤＲ２領域を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ ＣＤＲ２領域は以下の構造式を含んでいてもよく、式中、Ｘは可変アミノ酸を示し、これは同定されたアミノ酸：Ｘ２８ Ａ Ｘ２９ Ｘ３０ Ｌ Ｘ３１ Ｓ（配列番号１１１）のいずれかであってよく、式中、Ｘ２８は任意のアミノ酸であり、Ｘ２９はＳまたはＴであり、Ｘ３０はＴ、Ｙ、またはＫであり、Ｘ３１はＡ、Ｐ、またはＶである。
いくつかの実施形態において、抗体は、得られる抗体が特異的にまたは優先的にＡＳ－ＳＰＩＫに結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫには結合しない限り、配列番号７１～８０のいずれか１つに示す配列を有するか、または配列番号７１～８０のいずれか１つに含むアミノ酸変異が２つ以下のＶＬ ＣＤＲ３領域を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬ ＣＤＲ３領域は以下の構造式を含んでいてもよく、式中、Ｘは可変アミノ酸を示し、これは同定されたアミノ酸：Ｘ３２ Ｑ Ｘ３３ Ｙ Ｘ３４ Ｘ３５ Ｘ３６ Ｘ３７ Ｘ３８ Ｘ３９ Ｘ４０ Ｘ４１（配列番号１１２）のいずれかであってよく、式中、Ｘ３２はＱまたはＨであり、Ｘ３３はＧまたはＤであり、Ｘ３４は任意のアミノ酸であり、Ｘ３５は任意のアミノ酸であり、Ｘ３６はＳまたはＮであり、Ｘ３７はＮ、Ｄ、Ｖ、またはＧであり、Ｘ３８はＶ、Ｄ、またはＩであり、Ｘ３９はＤ、Ｇ、またはＮであり、Ｘ４０はＮまたはＶであり、Ｘ４１は任意のアミノ酸である。
本発明の実施形態にかかる抗体は、該抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫには結合しない限り、前述の相同性またはパーセント表示同一性を有する配列を始めとする、本明細書に記載のＶＨ、ＶＬ、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、もしくはＶＨ ＣＤＲ３、またはＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、もしくはＶＬ ＣＤＲ３領域、あるいはこれらの領域の任意の組み合わせのいずれかを含んでいてもよい。
本明細書に記載の構造式及びコンセンサス配列は、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって開発されたソフトウェアプログラム「ＢｉｏＥｄｉｔ」を使用して決定した。
これらすべての抗体のＡＳ－ＳＰＩＫに対する高い結合活性を検討した。その結果を実施例１に示す。
モノクローナル抗体の産生方法は精製ステップを含んでいてもよい。例えば、本抗体を、一般に、例えば、ろ過、遠心分離、及びＨＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー法を使用してさらに精製してもよく、これらのすべては当業者に周知の技法である。これらの精製技法はそれぞれ、混合物の他の成分から所望の抗体を分離するための分画を含む。抗体の調製に特に適した分析方法としては、例えば、プロテインＡ－セファロース及び／またはプロテインＧ－セファロースクロマトグラフィーが挙げられる。
本発明の抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、ヒトまたは非ヒト由来のＣＤＲを含んでいてもよい。「ヒト化」抗体は一般に、ヒトの定常領域ドメイン及び／または可変領域ドメインまたは特定の変更を有する、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはその他の種由来のキメラあるいは変異モノクローナル抗体である。免疫グロブリンのフレームワークは、ヒト、ヒト化、もしくは非ヒトフレームワーク（例えば、ヒトにおける抗原性を低減するように修飾されたマウスフレームワーク）、または合成フレームワーク（例えばコンセンサス配列）であってよい。ヒト化免疫グロブリンは、フレームワーク残基がヒト生殖細胞系配列に対応し、ＣＤＲがＶ（Ｄ）Ｊ組換え及び体細胞変異に由来する免疫グロブリンである。但し、ヒト化免疫グロブリンは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン核酸配列にコードされていないアミノ酸残基も含む場合がある（例えば、エクスビボでのランダムまたは部位特異的変異誘発によって導入される変異）。生殖細胞系配列に基づくが、例えば、インビボの体細胞変異プロセスによって導入されたフレームワーク変異を有する抗体可変ドメイン遺伝子は「ヒト」と呼ばれる。
ヒト化抗体は、例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク及び定常領域上に移植すること（当技術分野ではヒト化と呼ばれるプロセス）、あるいは（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植する、但し、表面残基の置換によって上記ドメインにヒト様表面を与えること（当技術分野ではベニアリングと呼ばれるプロセス）を含む、当技術分野で公知の様々な方法によって操作してもよい。ヒト化抗体にはヒト化抗体及びベニヤ化抗体（ｖｅｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の両方を含めてもよい。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作製することができる。負荷を行うとヒト抗体の産生が観測され、この産生は、遺伝子再配列、アセンブリ、抗体レパートリーを含むあらゆる点で、ヒトにおいて見られる産生と酷似している。
キメラ抗体及びヒト化抗体に加えて、完全ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから誘導することができる。いくつかの実施形態において、抗体は、ｓｃＦｖ－ファージディスプレイライブラリーによって産生及び同定することができる。
本抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体を、該抗体の抗原結合親和性、該抗体のエフェクター機能、または該抗体の薬物動態を調節するように修飾することもできる。特に、上記ＣＤＲ中でランダム変異を行い、産生物をスクリーニングして、より高い親和性及び／またはより高い特異性を有する抗体を識別してもよい。通常、上記ＣＤＲは１つまたは２つのアミノ酸が異なっていればよい。
ＣＤＲシャッフリング及び移植技術を、例えば、本明細書で提供される抗体と共に使用してもよい。ＣＤＲシャッフリングは、ＣＤＲ配列を特定のフレームワーク領域に挿入する。ＣＤＲ移植技法により、ＣＤＲ配列をランダムに組み合わせて単一のマスターフレームワークにすることができる。かかる技法を使用して、例えば、本抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体のＣＤＲ配列を変異誘発に供して複数の異なる配列を生成させ、これを足場配列中に組み込み、得られた抗体変異体を所望の特性、例えばより高い親和性に関してスクリーニングしてもよい。
本発明者らによるＳＰＩＫの機能の検討により、ＳＰＩＫがグランザイムＡ（ＧｚｍＡ）に結合し、グランザイムＡがアポトーシスを誘導するのを阻害することができることが明らかになっている。Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１３４（４）：３９８－４０８。ＧｚｍＡは活性化されたＣＴＬ及びＮＫ細胞によって分泌される細胞傷害性セリンプロテアーゼであり、免疫監視の間に標的細胞を殺滅する。腫瘍前駆体／腫瘍生殖細胞などの悪性細胞の除去におけるＧｚｍＡ誘導アポトーシスの役割が確認されている。Ｐａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；３２（１０）：２８８１－２８８７。したがって、肝臓癌細胞におけるＡＳ－ＳＰＩＫの過剰発現によって、上記細胞が、免疫クリアランスの間にＧｚｍＡによって誘導されるアポトーシスに対して耐性になる可能性がある。これにより、これらの癌細胞は免疫経路による殺滅から逃れる。Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１３４（４）：３９８－４０８。この仮説に基づき、理論に拘束されるものではないが、上記ＡＳ－ＳＰＩＫの過剰発現を抑制すること、または過剰発現されたＡＳ－ＳＰＩＫの活性を阻害することにより、人体の免疫クリアランスの間にＧｚｍＡによって誘導される癌細胞の免疫殺滅が回復する可能性があると結論付けている。
本発明の実施形態にかかる抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／２０９９９号（該出願の開示はその全体が本明細書に援用される）の開示によって示されるように、ＡＳ－ＳＰＩＫの活性を阻害することができる。したがって、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体を使用して、ＡＳ－ＳＰＩＫのＧｚｍＡとの結合を遮断し、ＧｚｍＡを解放し、免疫クリアランスを介したこれらの癌細胞のアポトーシスによる殺滅を回復させることが可能である。この目的のために、抗ＳＰＩＫ抗体を、がん、ウイルス感染症、及び炎症を含む、但しこれらに限定されないＡＳ－ＳＰＩＫの発現を特徴とする障害の治療に使用することができる。
抗体の１つの治療上の使用はヒト化を介する。ヒト化モノクローナル抗体による治療は急速に発展している領域であり、上記抗体の特異性及び効力は十分に研究されている。Ｒｏｔｈｅｒｎｂｅｒｇ， ＭＥ， Ｃｅｌｌ ２０１６；１６５（３）：５０９。ＩＭ－Ａ１、ＩＭ－Ａ６、ＩＭ－Ｂ１０、ＩＭ－Ｃ６、ＩＭ－Ｄ３、ＩＭ－Ｄ５、ＩＭ－Ｅ２、ＩＭ－Ｆ５、ＩＭ－Ｇ６、及びＩＭ－Ｇ７、ならびにＳＰＩＫの活性を阻害することができる本発明の他の抗体を含む、但しこれらに限定されない、本主題の抗ＡＳ－ＳＰＩＫモノクローナル抗体もヒト化され、疾患の治療に使用することができる。
例えば、ファージミド技術を使用する組換え技術によって、様々な抗体をコードする組換え遺伝子由来の、所望の特異性を有する抗体の調製が可能になっている。特定の組換え技術は、免疫動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調製されたコンビナトリアル免疫グロブリンファージ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングによる抗体遺伝子の単離を含む。かかる方法では、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーを、免疫動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調製することができ、抗原を発現する細胞及び対照細胞を使用したパニングにより、適当な抗体を発現するファージミドを選択することができる。
上記に開示したコンビナトリアル免疫グロブリンファージ発現ライブラリーに加えて、１つの分子クローニングによるアプローチは、ヒト抗体ライブラリーを含むトランスジェニックマウスから抗体を調製することである。かかるトランスジェニック動物を使用して、単一のイソ型、より詳細には、ＩｇＭ及びおそらくＩｇＤなどの、Ｂ細胞成熟に必須であるイソ型のヒト抗体を産生することができる。
本抗ＡＳ－ＳＰＩＫ免疫グロブリンは、グリコシル化を低減または消失させるように修飾することができる。グリコシル化が欠如する免疫グロブリンは、全くグリコシル化されていない、完全にはグリコシル化されていない、または変則的にグリコシル化された（すなわち、上記変異体のグリコシル化パターンは、対応する野生型免疫グロブリンのグリコシル化パターンと異なる）免疫グロブリンであってもよい。上記ＩｇＧポリペプチドは、グリコシル化を減弱する、１つ以上（例えば、１つ、２つ、または３つ以上）の変異、すなわち、グリコシル化が欠如する、または完全にはグリコシル化されていない、または変則的にグリコシル化されたＩｇＧ ＣＨ２ドメインを生じる変異を含む。オリゴ糖構造も、例えば、Ｎ－結合型グリカンからフコース部分を除去することによって、修飾されていてもよい。
抗体はまた、非タンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコールなどと複合体化することにより、インビボでの安定性及び／または溶解性を高めるように修飾することもできる。本抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに選択的に結合し、ＮＳ－ＳＰＩＫには結合しない能力を保持している限り、任意のＰＥＧ化法を使用することができる。
得られるポリペプチドが、標的、すなわちＡＳ－ＳＰＩＫに特異的な少なくとも１つの結合領域を含む限り、多種多様の抗体／免疫グロブリンフレームワークまたは足場を使用することができる。かかるフレームワークまたは足場としては、ヒト免疫グロブリンの５つの主要なイディオタイプ、またはそれらのフラグメント（本明細書の他の所に開示されているものなど）が挙げられ、また他の動物種の、好ましくはヒト化された状況を有する免疫グロブリンが挙げられる。ラクダ科動物において同定されたものなどの単一重鎖抗体はこの点で特に興味深い。
本発明の抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫ上のエピトープに特異的にまたは優先的に結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫ上のエピトープには結合しない。エピトープとは、パラトープ、すなわち抗体の結合部位によって特異的に結合される標的上の抗原決定基をいう。エピトープ決定基（ｅｐｉｔｏｐｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）は通常、アミノ酸または糖側鎖などの、分子の化学的に活性な表面グループで構成され、通常、特定の３次元構造上の特徴、ならびに特定の電荷の特徴を有している。エピトープは一般に、約４～約１０個、好ましくは４～８個の隣接アミノ酸（線形または連続エピトープ）を有するか、あるいは特定の構造を画成する非隣接アミノ酸のセット（例えば、配座エピトープ）であってもよい。したがって、エピトープは、少なくとも４個、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、及び少なくとも１２個のかかるアミノ酸から構成されてもよい。アミノ酸の空間的配座の決定方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴、及びＣＬＩＰＳ（足場上に化学的に連結されたペプチド（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ））ペプチドアレイを用いた精密エピトープマッピング（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ， Ｐｕｉｊｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ， ２０（５）， ２８３－２９９， （２００７））が挙げられる。
抗体が結合することができる他の潜在的なエピトープを予測する方法としては、Ｋｙｔｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ解析（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５７：１０５－１３２ （１９８２））， Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ解析（Ｈｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：３８２４－３８２８ （１９８１）；Ｈｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０：４８３－４８９ （１９８３）；Ｈｏｐｐ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８８：１－１８ （１９８６））， Ｊａｍｅｓｏｎ－Ｗｏｌｆ解析（Ｊａｍｅｓｏｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆ， Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． ４：１８１－１８６ （１９８８）），及びＥｍｉｎｉ解析（Ｅｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４０：１３－２０ （１９８５））， Ｃｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ解析（Ｐｏｎｏｍａｒｅｎｋｏ ＆ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ２００９）， Ｋａｒｐｌｕｓ－Ｓｃｈｕｌｚ解析（Ｋｏｌａｓｋａｒ ａｎｄ Ｔｏｎｇａｏｎｋａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｏｌａｓｋａｒ ＆ Ｔｏｎｇａｏｎｋａｒ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １７２－１７４ （１９９０）），ならびにＰａｒｋｅｒ解析を挙げることができる。いくつかの実施形態において、潜在的なエピトープは、他の研究からの既知の抗原部位との相関によって決定され、これらの予測技法は、Ｘ線結晶学的データなどの構造データと組み合わせることができる。エピトープの予測としては、連続エピトープ及び不連続エピトープの両方を予測する技法も挙げることができる。不連続エピトープを予測する方法としては、以下、すなわち、ＤｉｓｃｏＴｏｐｅ、ＢＥｐｒｏ、ＥｌｌｉＰｒｏ、ＳＥＰＰＡ、ＥＰＩＴＯＰＩＡ、ＥＰＣＥＳ、Ｂｐｒｅｄｉｃｔｏｒ、及びＥＰＭｅｔａ（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．， ＰＬＯＳ ＯＮＥ， （２０１３））が挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態において、潜在的なエピトープは、理論上の細胞外ドメインを決定することによって識別される。ＴＭｐｒｅｄなどの解析アルゴリズム（Ｈｏｆｍａｎｎ ａｎｄ Ｓｔｏｆｆｅｌ， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３７４：１６６ （１９９３））またはＴＭＨＭＭ （Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３０５（３）：５６７－５８０ （２００１）を参照のこと）を使用して、かかる予測を行うことができる。ＳｉｇｎａｌＰ ３．０ （Ｂｅｄｎｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３４０（４）：７８３－７９５ （２００４））などの他のアルゴリズムを使用して、シグナルペプチドの存在を予測し、それらのペプチドが完全長タンパク質から切断される箇所を予測することができる。細胞の外側にあるタンパク質の部分は、抗体相互作用の標的として機能することができる。
本発明の組成物は、（１）閾値レベルの結合活性を示す；（２）公知の関連ポリペプチド分子と有意に交差反応しない；（３）ＡＳ－ＳＰＩＫに結合し、且つ（４）ＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない、本明細書に記載の抗体を含む。抗体の結合親和性は、当業者により、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ， Ｓｃｉ． ５１：６６０－６７２ （１９４９））によって容易に測定することができる。
いくつかの実施形態において、本抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、それらの標的エピトープまたは模倣デコイに対して、ＡＳ－ＳＰＩＫに対してある程度の相同性を有することが予測される他のタンパク質、例えばＮＳ－ＳＰＩＫに対するよりも、標的ＡＳ－ＳＰＩＫに対して、少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、またはそれ以上結合することができる。
いくつかの実施形態において、本抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、１０－４Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－９Ｍ以下の高親和性、またはナノモル以下の親和性（０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｎＭまたはそれ以下）で結合する。いくつかの実施形態において、本抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の、該抗体のそれぞれの標的に対する結合親和性は、少なくとも１×１０６Ｋａである。いくつかの実施形態において、本抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体のＡＳ－ＳＰＩＫに対する結合親和性は、少なくとも５×ｌ０６Ｋａ、少なくとも１×１０７Ｋａ、少なくとも２×ｌ０７Ｋａ、少なくとも１×１０８Ｋａ、またはそれ以上である。抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫへの結合親和性の観点から説明または特定することもできる。いくつかの実施形態において、結合親和性としては、Ｋｄが５×１０－２Ｍ、１０－２Ｍ、５×１０－３Ｍ、１０－３Ｍ、５×１０－３Ｍ、１０－４Ｍ、５×１０－５Ｍ、１０－５Ｍ、５×１０－６Ｍ、１０－６Ｍ、５×１０－７Ｍ、１０－７Ｍ、５×１０－８Ｍ、１０－８Ｍ、５×１０－９Ｍ、１０－９Ｍ、５×１０－１０Ｍ、１０－１０Ｍ、５×１０－１１Ｍ、１０－１１Ｍ、５×１０－１２Ｍ、１０－１２Ｍ、５×１０－１３Ｍ、１０－１３Ｍ、５×１０－１４Ｍ、１０－１４Ｍ、５×１０－１５Ｍ、もしくは１０－１５Ｍ、またはそれ未満である結合親和性が挙げられる。すなわち、本明細書では、用語、例えばＡＳ－ＳＰＩＫに対する／対して、「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」、または「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ）」とは、ＡＳ－ＳＰＩＫに結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫには結合しない抗体をいう。理論に拘束されるものではないが、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的に結合する本発明の抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫ中には存在するがＮＳ－ＳＰＩＫ中には存在しない最初の１～２３アミノ酸（配列番号８２）内にのみ存在するエピトープに結合すると考えられる。本発明の抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫの１～２３アミノ酸に跨るだけでなく、共通領域（配列番号８３）中のいくつかのアミノ酸も含むエピトープに結合する可能性がある。または、本抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫの最初の１～２３アミノ酸（配列番号８２）中の少なくとも１つのアミノ酸に結合するだけでなく、共通領域（配列番号８３）中の少なくとも１つのアミノ酸にも結合する可能性がある。これらの場合、本抗体はＮＳ－ＳＰＩＫにも結合する可能性があるが、結合のレベルはバックグラウンドレベル以下である。これは本明細書では、「優先的に結合する」または「優先的な結合」と呼ばれる。アッセイは結合のバックグラウンドレベルを「ノイズ」として差し引くように発展させることができることから、ＡＳ－ＳＰＩＫに優先的に結合する抗体は診断方法においてなおも有用である。したがって、上記アッセイは、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現を特徴とする障害、例えば肝臓癌などの肝障害を有する患者の診断を下すためには、特定のレベルの結合（特定の閾値レベルを超え、且つバックグラウンドノイズを超える）のみが許容されることになることを示す。
本発明の抗体は、１０－４Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－９Ｍ以下の親和性で、またはナノモル以下の親和性（０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｎＭ、またはそれ未満）で結合することができる。いくつかの実施形態において、本抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の該抗体のそれぞれの標的に対する結合親和性は少なくとも１×１０６Ｋａである。いくつかの実施形態において、本抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体のＡＳ－ＳＰＩＫに対する結合親和性は、少なくとも５×１０６Ｋａ、少なくとも１×１０７Ｋａ、少なくとも２×１０７Ｋａ、少なくとも１×１０８Ｋａ、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、上記結合親和性としては、Ｋｄが５×１０－２Ｍ、１０－２Ｍ、５×１０－３Ｍ、１０－３Ｍ、５×１０－３Ｍ、１０－４Ｍ、５×１０－５Ｍ、１０－５Ｍ、５×１０－６Ｍ、１０－６Ｍ、５×１０－７Ｍ、１０－７Ｍ、５×１０－８Ｍ、１０－８Ｍ、５×１０－９Ｍ、５×１０－１０Ｍ、１０－１０Ｍ、５×１０－１１Ｍ、１０－１１Ｍ、５×１０－１２Ｍ、１０－１２Ｍ、５×１０－１３Ｍ、１０－１３Ｍ、５×１０－１４Ｍ、１０－１４Ｍ、５×１０－１５Ｍ、もしくは１０－１５Ｍ未満、またはそれ未満である親和性が挙げられる。それとは対照的に、本明細書では、用語、例えばＮＳ－ＳＰＩＫに対して、「非特異的に結合する」とは、「特異的結合」について測定された、例えばＡＳ－ＳＰＩＫに対する結合親和性よりも１／１．５、１／２、５、１／１０、１／１００、１／１０３、１／１０４、１／１０５、１／１０６以下の、またはそれ未満の小さい結合親和性をいう。Ｋｄなどの親和性は、対象となる抗体のＦａｂ版及びその抗原を使用して実施される放射標識抗原結合アッセイ（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）によって測定することができる。別の実施形態によれば、Ｋｄは、固定化された抗原を用いた表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定することができる。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫには特異的にまたは優先的に結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫには特異的に結合せず、本抗体のＡＳ－ＳＰＩＫに対する親和性は、ＮＳ－ＳＰＩＫに対するよりも、少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、または１０６倍大きい。
いくつかの実施形態において、本抗体は、公知の関連するポリペプチド分子に結合せず、例えば、本抗体はＡＳ－ＳＰＩＫに結合するが、公知の関連ポリペプチド、例えば、ＮＳ－ＳＰＩＫには結合しない。公知の関連するポリペプチドに対して抗体をスクリーニングして、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的にまたは優先的に結合する抗体集団を単離してもよい。例えば、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的な抗体は、適宜の緩衝液条件下で、不溶性マトリクスに付着させたＮＳ－ＳＰＩＫを含むカラムを通過することになる。かかるスクリーニングによって、密接に関連するポリペプチドに対して非交差反応性のポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の単離が可能になる。特異的な抗体のスクリーニング及び単離の他の方法としては、例えば、同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、放射免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットまたはウエスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、及びサンドウィッチアッセイが挙げられるが、これらに限定はされない。
本発明の実施形態にかかる抗体は、レポーター（例えば、検出可能なレポーター）と呼ばれる場合もある検出可能な標識を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、タグ付きペプチドの発現もしくは活性の定性的及び／または定量的評価を可能にする、抗体（例えば抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体）またはその生物学的に活性なフラグメントに共有結合している任意の分子であってよい。上記活性としては、生物学的活性、物理化学的活性、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。当該標識抗体が生物学的活性を保持している限り、上記検出可能な標識の形態及び位置の両方共に変化してよい。多くの異なる標識を使用することができ、特定の標識の選択は、所望の用途に依存することとなる。標識抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体は、例えば、生物学的試料、例えば、尿、唾液、脳脊髄液、血液、または生検試料中のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルを評価するために使用することができる。
検出可能な標識としては、酵素、光親和性リガンド、放射性同位元素、及び蛍光または化学発光化合物を挙げることができる。例示的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、及びウレアーゼを挙げることができる。酵素に対する抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の共有結合は、種々の方法、例えば、遊離アミノ基を介したグルタルアルデヒドとの結合によって実施することができる。あるいは、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体を、糖残基を介して上記酵素に結合することができる。炭水化物を含む他の酵素もこの方法で抗体に結合することができる。酵素の結合は、６－（Ｎ－マレイミド）ヘキサン酸スクシンイミジルなどのヘテロ二官能性リンカーを使用して、抗体のアミノ基をβ－ガラクトシダーゼなどの酵素の遊離チオール基と連結することによっても実施することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、発色基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と共に使用することができ、ＴＭＢは、過酸化水素の存在下で、４５０ｎｍにおいて検出可能な可溶性生成物を生成する。アルカリホスファターゼ検出システムは、例えば、発色基質であるリン酸ｐ－ニトロフェニルと共に使用することができ、リン酸ｐ－ニトロフェニルは４０５ｎｍで容易に検出可能な可溶性生成物を生成する。同様に、β－ガラクトシダーゼ検出システムは、発色基質であるｏ－ニトロフェニル－Ｐ－Ｄ－ガラクトピラノキシド（ＯＮＰＧ）と共に使用することができ、ＯＮＰＧは、４１０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を生成する。ウレアーゼ検出システムは、尿素－ブロモクレゾールパープルなどの基質と共に使用することができる。
検出可能な標識は、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ－フタルアルデヒド、及びフルオレスカミンを含む、但しこれらに限定されない蛍光標識；ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、及びシュウ酸エステルからなる群から選択される化学発光化合物；リポソームもしくはデキストラン；または、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びエクオリンなどの生物発光化合物であってもよい。あるいは、またはそれらに加えて、検出可能な標識としては、バリウム、ジアトリゾ酸塩、エチオジド化油、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメチン酸、イオタスル、イオテトル酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポダート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾ酸塩、プロピリオドン、及び塩化第一タリウムなどの放射線不透剤または造影剤が挙げられるが、これらに限定はされない。
標識は、合成中または合成後に付加することができる。組換え抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体またはそれらの生物学的に活性な変異体も、形質転換された細胞が増殖する培養培地への標識前駆体（例えば放射標識アミノ酸）の添加によって標識することができる。いくつかの実施形態において、検出可能なマーカーの組み込みを容易にするために、ペプチドの類似体または変異体を使用してもよい。例えば、Ｎ末端フェニルアラニン残基を、１２５Ｉで容易に標識することができる、チロシンなどの密接に関連する芳香族アミノ酸で置換してもよい。いくつかの実施形態において、効果的な標識化を支援するさらなる官能基を、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体またはその生物学的に活性な変異体のフラグメントに付加してもよい。例えば、３－トリブチルスズベンゾイル基を天然構造のＮ末端に付加してもよく、その後トリブチルスズ基を１２５Ｉで置換することにより、放射標識ヨードベンゾイル基が生成することとなる。
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）
本発明の態様は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性複合体）などの細胞傷害性薬剤と複合体化された抗体を含む、免疫複合体、あるいは抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）を含む。別の態様において、本発明は、免疫複合体の使用方法をさらに提供する。一態様において、免疫複合体は、細胞傷害性薬剤または検出可能な薬剤に共有結合している上記抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体のいずれかを含む。ＡＤＣは、例えば、米国特許第８，３６２，２１３号に記載されており、その開示はその全体が本明細書に援用される。
細胞傷害性薬剤または細胞増殖抑制剤、すなわち、がんの治療において腫瘍細胞を殺滅するまたは阻害する薬物の局所送達のためのＡＤＣの使用（Ｌａｍｂｅｒｔ， Ｊ． （２００５） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５：５４３－５４９；Ｗｕ ｅｔ ａｌ （２００５） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１３７－１１４６；Ｐａｙｎｅ， Ｇ． （２００３） Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７－２１２；Ｓｙｒｉｇｏｓ ａｎｄ Ｅｐｅｎｅｔｏｓ （１９９９） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：６０５－６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ－Ｄｕｖａｚ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ （１９９７） Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ． ２６：１５１－１７２；米国特許第４，９７５，２７８号）によって、腫瘍への薬物部分の標的化された送達、及び腫瘍中での細胞内蓄積が可能になる一方で、これらの非結合薬物剤の全身投与では、排除しようとする腫瘍細胞のみならず、正常な細胞に対しても許容できないレベルの毒性を生じる場合がある（Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ （１９８６） Ｌａｎｃｅｔ ｐｐ． （Ｍａｒ． １５， １９８６）：６０３－０５；Ｔｈｏｒｐｅ， （１９８５） “Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａ． Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ （ｅｄ．ｓ）， ｐｐ． ４７５－５０６）。治療指数を改善する（すなわち、ＡＤＣの最大の効力と最小の毒性）ための努力の焦点は、ポリクローナル抗体（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ （１９８６） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ２１：１８３－８７）及びモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の選択性、ならびに薬物の結合及び薬物の放出の特性（Ｌａｍｂｅｒｔ， Ｊ． （２００５） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５：５４３－５４９）に絞ってきた。ＡＤＣで使用される薬物部分としては、ジフテリア毒素などの細菌タンパク質毒素、リシンなどの植物タンパク質毒素、オーリスタチン、ゲルダナマイシンなどの小分子（Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ （２０００） Ｊ． ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９２（１９）：１５７３－１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ （２０００） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １０：１０２５－１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ （２００２） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １３：７８６－７９１）、メイタンシノイド（ＥＰ １３９１２１３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：８６１８－８６２３）、カリケアマイシン（Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：３３３６－３３４２）、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンデシン（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ （１９８６） ｓｕｐｒａ）が挙げられる。上記薬物部分は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む細胞傷害性及び細胞増殖抑制機序に影響を与える場合がある。一部の細胞傷害性薬剤は、大きな抗体またはタンパク質受容体リガンドと複合体化すると、不活性になるまたは低活性になる傾向がある。
ドーラスタチンの合成類似体であるオーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）、及びモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）（ＷＯ０２／０８８１７２）が、薬物部分として、（ｉ）キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌腫上のルイスＹに特異的）；（ｉｉ）血液悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的なｃＡＣ１０（Ｋｌｕｓｓｍａｎ， ｅｔ ａｌ （２００４）， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５（４）：７６５－７７３；Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ （２００３） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（７）：７７８－７８４；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ （２００３） Ｂｌｏｏｄ １０２（４）：１４５８－１４６５；ＵＳ ２００４／００１８１９４；（ｉｉｉ）ＣＤ２０発現癌及び免疫障害の治療のためのリツキサン（ＷＯ０４／０３２８２８）などの抗ＣＤ２０抗体；（ｉｖ）結腸直腸癌の治療のための抗ＥｐｈＢ２Ｒ抗体２Ｈ９（Ｍａｏ ｅｔ ａｌ （２００４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４（３）：７８１－７８８）；（ｖ）Ｅ－セレクチン抗体（Ｂｈａｓｋａｒ ｅｔ ａｌ （２００３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６３：６３８７－６３９４）；（ｖｉ）トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ＵＳ２００５／０２３８６４９）；ならびに（ｖｉｉ）抗ＣＤ３０抗体（ＷＯ０３／０４３５８３）と複合体化されている。オーリスタチンＥの変異体が米国特許第５，７６７，２３７号及び米国特許第６，１２４，４３１号に開示される。モノクローナル抗体に複合体化されたモノメチルオーリスタチンＥが、Ｓｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ４５， Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６２３， ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ Ｍａｒ． ２８， ２００４に開示される。オーリスタチン類似体ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦが様々な抗体に複合体化されている（ＵＳ２００５／０２３８６４９）。
薬物部分を抗体に結合する、すなわち共有結合を介して結合する従来の手段では一般に、薬物部分が抗体上のいくつかの部位に結合した分子の不均一な混合物が生じる。例えば、細胞傷害性薬剤は通常、多くの場合多数の抗体のリシン残基を介して抗体に結合し、不均一な抗体－薬物複合体混合物が生成する。反応条件に応じて、上記不均一な混合物は、通常０～約８個、またはそれ以上の結合した薬物部分を有する分布をもった抗体を含む。さらに、抗体に対する薬物部分の特定の整数比を有する複合体の各下位群内に、薬物部分が抗体の様々な部位に結合している潜在的に不均一な混合物がある。分析及び調製方法は、複合体化反応から生じる上記不均一な混合物内の抗体－薬物複合体種分子を分離及びキャラクタライズするには不十分である可能性がある。抗体は大きく、複雑で、且つ構造的に多様な生体分子であり、多くの場合、多くの反応性官能基を有している。上記官能基のリンカー反応剤及び薬物－リンカー中間体との反応性は、ｐＨ、濃度、塩濃度、及び共溶媒などの因子に依存する。さらに、上記多段階複合体化プロセスは、反応条件の制御及び反応剤及び中間体のキャラクタライズが困難なため、再現性がない場合がある。
システインチオールは、ｐＨ７付近ではプロトン化されて求核性が低いほとんどのアミンとは異なり、中性ｐＨで反応性がある。遊離チオール（ＲＳＨ、スルフヒドリル）基は比較的反応性が高いため、システイン残基を有するタンパク質は多くの場合、ジスルフィド結合したオリゴマーとしての酸化された形態で存在するか、または内部で架橋したジスルフィド基を有する。細胞外タンパク質は一般に遊離チオールを有していない（Ｇａｒｍａｎ， １９９７， Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， ａｔ ｐａｇｅ ５５）。抗体のシステインチオール基は一般に、抗体のアミンまたはヒドロキシル基よりも求電子性複合体化反応剤に対してより反応性が高い、すなわち求核性が高い。リガンドとの共有結合を形成するため、または新たな分子内ジスルフィド結合を形成するために、システイン残基が遺伝子工学技法によってタンパク質中に導入されている（Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １３：９６４４－９６５０；Ｂｅｒｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：１２６－１３２；Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １：２４７－２５５；Ｔｕ ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：４８６２－４８６７；Ｋａｎｎｏ ｅｔ ａｌ （２０００） Ｊ． ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ７６：２０７－２１４；Ｃｈｍｕｒａ ｅｔ ａｌ （２００１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８（１５）：８４８０－８４８４；米国特許第６，２４８，５６４号）。しかしながら、タンパク質の様々なアミノ酸残基をシステインアミノ酸に変異させることによるシステインチオール基の操作は、特に対合していない（遊離Ｃｙｓ）残基、または反応もしくは酸化を起こしやすい残基の場合、潜在的に問題がある。タンパク質の濃縮溶液においては、Ｅ． ｃｏｌｉのペリプラズム、培養液上清、または部分的にもしくは完全に精製されたタンパク質のいずれにおいても、タンパク質の表面上の対合していないＣｙｓ残基が対合し、酸化して分子間ジスルフィド、よってタンパク質二量体または多量体を形成する。ジスルフィド二量体の形成により新たに導入されたＣｙｓは、薬物、リガンド、または他の標識との複合体化に対して非反応性になる。さらに、タンパク質が新たに操作されたＣｙｓと既存のＣｙｓ残基の間に分子内ジスルフィド結合を酸化的に形成する場合、両方のＣｙｓチオール基は活性部位の関与及び相互作用に利用不可となる。さらに、タンパク質は、誤った折り畳みまたは三次元構造の喪失によって、不活性または非特異的になる可能性がある（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ （２００２） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３１１：１－９）。
システインを操作した抗体がＦＡＢ抗体フラグメント（チオＦａｂ）として設計されており、完全長のＩｇＧモノクローナル（チオＭａｂ）抗体として発現している（Ｊｕｎｕｔｕｌａ， Ｊ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３２：４１－５２；ＵＳ２００７／００９２９４０、それらの内容は援用される）。チオＦａｂ及びチオＭａｂ抗体を、チオール反応性リンカー反応剤及び薬物－リンカー反応剤によって、新たに導入されたシステインチオールの位置で、リンカーを介して複合体化し、抗体薬物複合体（チオＡＤＣ）を調製した。
特許出願及び刊行物を含む、本明細書で引用されるすべての参照文献は、それらの全体が援用される。
ポリペプチド
本発明の態様は、ＳＰＩＫポリペプチド、例えば、配列番号１０４及び１０５の核酸配列のいずれか１つによってコードされるＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドを含む組成物を含む。本明細書では、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は同義で使用されるが、一般的には、上記用語は様々なサイズのペプチド配列をいう。本発明者らは、アミノ酸に基づく本発明の組成物を「ポリペプチド」と呼び、該組成物がアミノ酸残基の線状ポリマーであることを伝え、該組成物を完全長タンパク質と区別するのに役立てる場合がある。本発明の実施形態にかかるポリペプチドは、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドのフラグメントを「構成する」または「含む」場合があり、本発明は、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドの生物学的に活性な変異体を構成するまたは含むポリペプチドを包含する。したがって、上記ポリペプチドは、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドもしくはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチド（またはその生物学的に活性な変異体）のフラグメントのみを含む場合もあるが、その上追加の残基を含んでいてもよいことが理解されよう。生物学的に活性な変異体は、プロテアーゼを阻害するのに十分な活性を保持する。
上記アミノ酸残基間の結合は、従来のペプチド結合または別の共有結合（エステルまたはエーテル結合など）であってもよく、上記ポリペプチドは、アミド化、リン酸化、またはグリコシル化によって修飾されていてもよい。修飾はポリペプチド骨格及び／または１つ以上の側鎖に影響を与える可能性がある。化学的修飾は、当該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳に続いてインビボで行われる天然に存在する修飾（例えば、細菌宿主におけるグリコシル化）、またはインビトロで行われる合成的修飾であってよい。ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、天然に存在する（すなわち、インビボで天然に行われる）と合成的修飾（すなわち、インビトロで行われる天然に存在するまたは非天然で生じる修飾）の任意の組み合わせに由来する１つ以上の構造的修飾を含んでいてもよい。修飾の例としては、アミド化（例えば、Ｃ末端の遊離カルボキシル基のアミノ基による置換）；ビオチン化（例えば、ビオチン分子によるリシンまたは他の反応性アミノ酸残基のアシル化）；グリコシル化（例えば、アスパラギン、ヒドロキシリシン、セリン、もしくはスレオニン残基のいずれかへのグリコシル基の付加による、糖タンパク質または糖ペプチドの生成）；アセチル化（例えば、通常はポリペプチドのＮ末端におけるアセチル基の付加）；アルキル化（例えばアルキル基の付加）；イソプレニル化（例えばイソプレノイド基の付加）；リポイル化（例えばリポ酸部分の結合）；及びリン酸化（例えば、セリン、チロシン、スレオニン、またはヒスチジンへのリン酸基の付加）が挙げられるが、これらに限定はされない。
生物学的に活性な変異体中の上記アミノ酸残基の１つ以上は、天然に存在しないアミノ酸残基であってもよい。天然に存在するアミノ酸残基には、遺伝子コードによって天然にコードされているアミノ酸残基、ならびに非標準アミノ酸（例えば、Ｌ－配置の代わりにＤ－配置を有するアミノ酸）が含まれる。本発明のペプチドはまた、標準的な残基の修飾バージョンであるアミノ酸残基も含んでいてよい（例えば、リシンの代わりにピロリシンを使用してもよく、システインの代わりにセレノシステインを使用してもよい）。天然に存在しないアミノ酸残基は、自然界では発見されていないが、アミノ酸の基本的な式に適合し、ペプチド中に組み込むことができるアミノ酸残基である。天然に存在しないアミノ酸残基としては、Ｄ－アロイソロイシン（２Ｒ，３Ｓ）－２－アミノ－３－メチルペンタン酸及びＬ－シクロペンチルグリシン（Ｓ）－２－アミノ－２－シクロペンチル酢酸が挙げられる。他の例については、教科書またはワールドワイドウェブ（サイトは現在Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって維持されており、機能性タンパク質中に組み込むことに成功した非天然アミノ酸の構造を表示している）を参照することができる。
あるいは、または上記に加えて、生物学的に活性な変異体中の上記アミノ酸残基の１つ以上は、野生型配列中の対応する位置に存在する天然に存在する残基とは異なる天然に存在する残基であってもよい。換言すれば、生物学的に活性な変異体は、１つ以上、特に１つまたは２つのアミノ酸置換を含んでいてもよい。本発明者らは、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失を野生型配列の変異と呼ぶ場合がある。前述のように、置換は、天然に存在するアミノ酸残基を、天然に存在しない残基または単に天然に存在する異なる残基で置き換える場合がある。さらに、置換は、保存的置換または非保存的置換を構成する場合がある。保存的アミノ酸置換としては、通常次の群、すなわち、グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン、及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、及びスレオニン；リシン、ヒスチジン、及びアルギニン；ならびにフェニルアラニン及びチロシン内の置換が挙げられる。
ＡＳ－ＳＰＩＫの生物学的に活性な変異体であるポリペプチドは、それらの配列が対応する野生型ポリペプチドに類似するまたは相同である程度の観点からキャラクタライズすることができる。例えば、生物学的に活性な変異体の配列は、野生型ポリペプチド中の対応する残基と少なくとも８０％もしくは約８０％相同（または同一）であってよい。例えば、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、ＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチド（配列番号８１、８２、８３）またはそのホモログまたはオルソログに対して、少なくとも８０％もしくは約８０％の配列相同性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のまたは約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％の配列相同性）（あるいは列挙されるパーセント表示同一性）を有するアミノ酸配列を有していてもよい。
ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、本発明の方法に有用であるために十分な生物学的活性を保持することとなる。上記生物学的に活性な変異体は、プロテアーゼ活性の阻害剤として機能するために十分な活性を保持することとなる。上記生物学的活性は当業者に公知の方法で評価することができ、インビトロ切断アッセイまたは機能アッセイが挙げられるが、これらに限定はされない。
ポリペプチドは、例えば、組換え技法または化学合成を含む様々な方法によって生成させることができる。ポリペプチドが生成したところで、これらを単離し、任意且つ所望の程度まで精製してもよい。例えば、逆相（好ましくは）もしくは順相ＨＰＬＣ、またはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５などの多糖ゲル媒体上でのサイズ排除もしくは分配クロマトグラフィー、続いて凍結乾燥を使用してもよい。最終的なポリペプチドの組成は、標準的な手段によるペプチドの分解後の、アミノ酸配列決定によるまたはＦＡＢ－ＭＳ技法によるアミノ酸分析によって確認することができる。ポリペプチドのアミノ基の、酸性塩を含む塩、エステル、アミド、及びＮ－アシル誘導体は、当技術分野で公知の方法を使用して調製することができ、かかるペプチドは本発明の文脈において有用である。
ＡＳ－ＳＰＩＫ複合体も提供される。本発明の実施形態にかかるＡＳ－ＳＰＩＫ複合体は、ＡＳ－ＳＰＩＫ、及びＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドもしくはそのフラグメントに特異的にまたは優先的に結合する、本明細書に記載の本発明の抗体を含む。上記フラグメントは特に、少なくとも２３アミノ酸（配列番号８１）、好ましくは少なくとも１０アミノ酸の長さを有し、より好ましくは、配列番号８１のアミノ酸の少なくとも７番目～２３番目のアミノ酸（両端を含む）を有し、さらにより好ましくは、配列番号８１の少なくとも８番目～１７番目のアミノ酸（両端を含む）を有する。上記抗体は前述の抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体のいずれかであってよい。上記ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはそのフラグメントは、前述のＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはそのフラグメントであってよい。いくつかの実施形態において、上記抗体は、抗ＡＳ－ＳＰＩＫモノクローナル抗体、ＩＭ－Ａ１、ＩＭ－Ａ６、ＩＭ－Ｂ１０、ＩＭ－Ｃ６、ＩＭ－Ｄ３、ＩＭ－Ｄ５、ＩＭ－Ｅ２、ＩＭ－Ｆ５、ＩＭ－Ｇ６、及びＩＭ－Ｇ７（配列データに掲載のＶＬ及びＶＨ配列）である。いくつかの実施形態において、上記ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドは、配列番号８２または配列番号８１のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の相同性（または同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、上記ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドは、配列番号８２のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
ＩＭ－Ａ１、ＩＭ－Ａ６、ＩＭ－Ｂ１０、ＩＭ－Ｃ６、ＩＭ－Ｄ３、ＩＭ－Ｄ５、ＩＭ－Ｅ２、ＩＭ－Ｆ５、ＩＭ－Ｇ６、及びＩＭ－Ｇ７などの抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体の特異的結合は、特定の条件下でＡＳ－ＳＰＩＫまたはＡＳ－ＳＰＩＫペプチドと免疫複合体を形成する場合がある。上記複合体を、例えばサンドウィッチＥＬＩＳＡ試験でさらに分析するために溶液から沈殿させてもよい。担体としての第２の抗ＳＰＩＫ抗体を固定化した９６ウェルプレートを使用して、上記免疫複合体をプレートによって捕捉することができる。上記複合体中の抗体が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）などのレポーターで標識されている場合、形成されたＡＳ－ＳＰＩＫ免疫複合体の量を測定することができる。上記ＡＳ－ＳＰＩＫ免疫複合体は、ウエスタンブロット分析のために、プロテインＡまたはＧと結合したアガロースビーズによっても捕捉することができる。
核酸
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書において同義で使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び核酸類似体を含むＤＮＡ（またはＲＮＡ）を含むＲＮＡ及びＤＮＡの両方をいい、これらのいずれも本発明のポリペプチドをコードしていてもよく、且つそれらのすべてが本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、本質的に任意の三次元構造を有していてもよい。核酸は二本鎖または一本鎖（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖）であってよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及びその部分、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー、ならびに核酸類似体が挙げられる。本発明の文脈において、核酸は、天然に存在するＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドもしくはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な変異体のフラグメントをコードしていてもよい。本発明の実施形態にかかる核酸配列の非限定的な例としては、配列番号１０４、１０５、及び１０６、またはそれらの生物学的に活性なフラグメントもしくは変異体が挙げられる。いくつかの実施形態において、フラグメントは、少なくとも約６６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５４ヌクレオチドの長さを有していてもよい。１つの好ましい実施形態において、核酸配列は、配列番号１０５のヌクレオチド残基２８～１０５を含む。１つの好ましい実施形態において、核酸配列は、配列番号１０５のヌクレオチド残基４９～１０５を含む。Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；１３４（４）：３９８－４０８。
「単離された」核酸は、例えば、天然に存在するＤＮＡ分子またはそのフラグメントであって、天然に存在するゲノムにおいて当該ＤＮＡ分子に隣接して通常存在する核酸配列の少なくとも１つが除去されているかまたは存在しないことを条件とする、上記ＤＮＡ分子またはそのフラグメントであってよい。したがって、単離された核酸としては、他の配列とは独立して別個の分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学的に合成された核酸、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメント）が挙げられるが、これらに限定はされない。単離された核酸とは、ベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス中、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれたＤＮＡ分子も指す。さらに、単離された核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸の一部であるＤＮＡ分子などの操作された核酸を含む場合もある。例えば、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含むゲルスライス内の他の核酸の多く（例えば、数十、または数百～数百万）の中に存在する核酸は、単離された核酸ではない。
単離された核酸分子は、例えば、本明細書に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む単離された核酸を得るために使用することができるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法によって生成させることができる。ＰＣＲは、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ由来の配列を含む、ＤＮＡならびにＲＮＡ由来の特定の配列を増幅するために使用することができる。一般に、目的の領域またはそれ以降の末端からの配列情報を使用して、増幅されるテンプレートの反対の鎖と配列が同一または類似であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。部位特異的ヌクレオチド配列修飾をテンプレート核酸中に導入することができる様々なＰＣＲ戦略も利用可能である。
単離された核酸は、単一の核酸分子として（例えば、ホスホルアミダイト技法を使用する、３’から５’方向への自動化されたＤＮＡ合成を使用して）、または一連のオリゴヌクレオチドとしてのいずれかで、化学的に合成することもできる。例えば、オリゴヌクレオチド対がアニーリングされた際に二重鎖が形成されるような、それぞれの対が相補性の短いセグメント（例えば約１５ヌクレオチド）を含む所望の配列を含む、１つ以上の長いオリゴヌクレオチド（例えば＞５０～１００ヌクレオチド）の対を合成することができる。ＤＮＡポリメラーゼを使用して上記オリゴヌクレオチドを伸長し、オリゴヌクレオチド対毎に単一の二本鎖核酸分子を生成させ、これをベクターにライゲーションしてもよい。本発明の単離された核酸はまた、例えば、ＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫをコードするＤＮＡの天然に存在する部分の変異誘発によって得ることもできる（例えば、前述の製法により）。
上記の２つの核酸または該核酸がコードするポリペプチドは、互いにある程度の相同性または同一性を有すると記載することができる。例えば、ＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチド及びそれらの生物学的に活性な変異体は、ある程度の相同性または同一性を示すと記載することができる。短いＡＳ－ＳＰＩＫポリペプチドまたはＮＳ－ＳＰＩＫポリペプチド配列をＰｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＰＩＲ）サイト（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｒ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ）に配置し、続いてＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）上の「短鎖のほぼ同一の配列（ｓｈｏｒｔ ｎｅａｒｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを用いて解析することにより、アラインメントを集めることができる。
配列の相同性または同一性を決定するために、例えばＢｉｏＥｄｉｔ（バージョン４．８．５、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（ＢｉｏＥｄｉｔでは、核酸配列またはタンパク質配列のアラインメントを、それらの配列の全長にわたって実施することができる（グローバルアラインメント））、または前述のＡＬＩＧＮ－２などのコンピュータプログラムを使用して、クエリ核酸配列またはクエリアミノ酸配列を、それぞれ１つ以上のサブジェクト核酸配列またはサブジェクトアミノ酸配列に対してアラインメントを行ってもよい。
ＢｉｏＥｄｉｔは、クエリ配列と１つ以上のサブジェクト配列との間の最適な一致を計算し、上記配列のアラインメントを行い、その結果、同一性、類似性、及び相違性を決定することができる。１つ以上の残基のギャップをクエリ配列、サブジェクト配列、またはそれらの両方に挿入して、配列アラインメントを最大化することができる。核酸配列のペアワイズアラインメントを高速化するために、以下のデフォルトパラメータが使用される。すなわち、ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；スコアリング方法：百分率；トップダイアゴナル数：４；及びギャップペナルティ：５である。核酸配列のマルチプルアラインメントには、以下のパラメータが使用される。すなわち、ギャップ開始ペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：５．０；及び重量トランジション：有りである。タンパク質配列のペアワイズアラインメントを高速化するために、以下のパラメータが使用される。すなわち、ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；スコアリング方法：百分率；トップダイアゴナル数：５；ギャップペナルティ：３である。タンパク質配列のマルチプルアラインメントには、以下のパラメータが使用される。すなわち、重み付けマトリクス：ｂｌｏｓｕｍ；ギャップ開始ペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；残基特異的ギャップペナルティ：オンである。出力は配列間の関係を反映する配列アラインメントである。
クエリ配列とサブジェクト配列との間のパーセント表示相同性を決定するために、ＢｉｏＥｄｉｔで、最適なアラインメントの同一性の数値を、比較される残基の数（ギャップ位置は除外）で除し、その結果に１００を乗じる。この出力がクエリ配列に対するサブジェクト配列のパーセント表示相同性である。このパーセント表示相同性の値は、最も近い小数点以下１桁に丸めてもよいことに留意されたい。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、及び７８．１４は７８．１に切り捨て、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、及び７８．１９は７８．２に切り上げる。
本明細書に記載の核酸及びポリペプチドは、「外因性」と呼ばれることがある。用語「外因性」とは、当該核酸またはポリペプチドが、組換え核酸構築物の一部であるか、もしくは該構築物によってコードされているか、またはその自然環境にないことを示す。例えば、外因性核酸は、ある種から別の種に導入された配列、すなわち異種核酸であってもよい。通常、かかる外因性核酸は、組換え核酸構築物を介して他の種に導入される。外因性核酸は、ある生物に本来的に備わっているものであり、当該生物の細胞中に再導入された配列であってもよい。天然配列を含む外因性核酸は、当該外因性核酸に連結された非天然配列、例えば、組換え核酸構築物中の天然配列に隣接する非天然調節配列が存在することによって、天然に存在する配列と区別することできることが多い。さらに、安定した状態で形質転換された外因性核酸は通常、天然配列が存在する位置以外の位置に組み込まれる。
本明細書では組換え構築物も提供され、これを使用して、ＡＳ－ＳＰＩＫを発現させるために細胞を形質転換してもよい。組換え核酸構築物は、特定の細胞においてＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫを発現するのに適した調節領域に作動可能に連結されたＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫ配列をコードする核酸を含む。複数の核酸が特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができることが理解されよう。遺伝子コードの縮退は当技術分野において周知である。多くのアミノ酸について、当該アミノ酸のコドンとして機能する複数のヌクレオチドトリプレットが存在する。例えば、ＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫのコード配列中のコドンを、その生物の適切なコドンバイアステーブルを使用して、特定の生物に最適な発現が得られるように変更することができる。
本明細書に記載の核酸などの核酸を含むベクターも提供される。「ベクター」は、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンであり、該レプリコン中に別のＤＮＡセグメントを挿入し、該挿入されたセグメントを複製するようにすることができる。一般に、ベクターは、適宜の制御要素に関連付けられている場合に複製する能力を有する。好適なベクターの骨格としては、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣ、またはＰＡＣなどの当技術分野で慣用的に使用される骨格が挙げられる。用語「ベクター」としては、クローニングベクター及び発現ベクター、ならびにウイルスベクター及び組み込みベクターが挙げられる。「発現ベクター」は調節領域を含むベクターである。多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせを使用して、本明細書に記載の核酸配列を発現させることができる。好適な発現ベクターとしては、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、及びレトロウイルスに由来するプラスミド及びウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定はされない。
本明細書で提供されるベクターは、例えば、複製起点、足場付着領域（ＳＡＲ）、及び／またはマーカーを含んでいてもよい。マーカー遺伝子は、宿主細胞に選択可能な表現型を与えることができる。例えば、マーカーは、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはハイグロマイシン）に対する耐性などの殺生物剤耐性を付与することができる。上記のように、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を容易にするように設計されたタグ配列を含んでいてもよい。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、血球凝集素、またはＦｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴ）などのタグ配列は通常、コードされたポリペプチドとの融合体として発現される。かかるタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含む、当該ポリペプチド内の何れの位置にも挿入することができる。
さらなる発現ベクターは、例えば、染色体の、非染色体の、及び合成のＤＮＡ配列のセグメントを含んでいてもよい。好適なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体及び公知の細菌プラスミド、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドであるｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ－Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９、及びそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、多数のファージ１の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、及び他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３及び繊維状一本鎖ファージＤＮＡ；２μプラスミドまたはその誘導体などの酵母プラスミド、昆虫または哺乳動物細胞中で有用なベクターなどの、真核細胞中で有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を使用するように修飾されたプラスミドなどの、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクターが挙げられる。
上記ベクターは調節領域も含んでいてよい。用語「調節領域」とは、転写または翻訳の開始及び速度、ならびに転写産物もしくは翻訳産物の安定性及び／または移動度に影響を与えるヌクレオチド配列をいう。調節領域としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導性要素、タンパク質結合配列、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、停止配列、ポリアデニル化配列、核局在化シグナル、及びイントロンが挙げられるが、これらに限定はされない。
本明細書では、用語「作動可能に連結された」とは、かかる配列の転写または翻訳に影響を与えるような、調節領域及び転写されるべき配列の核酸中での配置をいう。例えば、コード配列をプロモーターの制御下に置くために、当該ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は通常、プロモーターの１～約５０ヌクレオチド下流の間に配置される。しかしながら、プロモーターは、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドもの上流、または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流に配置してもよい。プロモーターは通常、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。プロモーターは、エンハンサー配列、上流要素、または上流活性化領域（ＵＡＲ）などの少なくとも１つの制御要素を含んでいてもよい。含まれるプロモーターの選択は、効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、及び細胞または組織優先的発現を含む、但しこれらに限定されないいくつかの因子に依存する。コード配列に対してプロモーター及び他の調節領域を適宜に選択及び配置することによってコード配列の発現を調節することは、当業者にとって慣用的な事項である。
ＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫ核酸配列を含むベクターは、細胞、すなわち、原核生物または真核生物の細胞、例えば、哺乳動物細胞による取り込みを促進するような方法で構築することができる。有用なベクターシステム及び構築は上記のとおりである。いくつかの実施形態において、上記ベクターは、上記組成物を特定の細胞型に送達してもよい。但し、本発明はそのように限定されるものではなく、例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポソーム、リポプレックス、界面活性剤、及び全フッ素置換化学液体を使用する化学的トランスフェクションなどの他のＤＮＡ送達方法も企図され、電気穿孔、微量注入、弾道粒子（、及び「遺伝子銃」システムなどの物理的送達方法も同様である。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドはまた、カチオン性リポソーム、他の脂質含有複合体、及び宿主細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介する能力を有する他の高分子複合体などの微小送達ビヒクルと共に使用してもよい。別の送達方法は、発現された産物を細胞内で産生することができる一本鎖ＤＮＡ産生ベクターを使用することである。
使用方法
本明細書に開示の組成物は、一般的に且つ多様に、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現を特徴とする障害の診断及び／または治療に有用である。かかる障害としては、がん、ウイルス感染症、及び炎症性障害が挙げられるが、これらに限定はされない。１つの顕著な例は肝臓癌である。他の非限定的な例としては、用語「がん」の定義に関連して本明細書に記載されるがんが挙げられる。したがって、本発明の態様は、上記がんを有する対象、または上記がんを発症する危険性がある対象におけるがん（例えば肝臓癌）を診断及び／または治療する方法を含む。用語「対象」、「患者」、及び「個体」は、本明細書では同義で使用される。
いくつかの実施形態において、上記方法は、対象由来の生物学的検査試料をＡＳ－ＳＰＩＫ抗体または抗原結合フラグメントと接触させて、ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体を生成させることと；上記生物学的検査試料中の上記ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を検出することと；上記ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を基準値と比較して、上記対象が上記障害を発症しているか、または上記障害を発症する危険性があるかどうかを判定することとを含む。特定の実施形態において、本方法は、生物学的検査試料を、ＳＰＩＫと結合してＳＰＩＫ－抗体複合体を生成する第１の抗体または抗原結合フラグメントに接触させることと；上記ＳＰＩＫ－抗体複合体をＡＳ－ＳＰＩＫ抗体または抗原結合フラグメントと接触させて、上記生物学的検査試料中にＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体を生成させることと；上記ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を基準値と比較して、上記対象が上記障害を発症しているか、または上記障害を発症する危険性があるかどうかを判定することとを含む。かかる方法において利用することができる抗体のいくつかの非限定的な例が本明細書に記載される。
いくつかの実施形態において、本方法は、治療有効量の、本明細書に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメント、または抗体－薬物複合体を、ＡＳ－ＳＰＩＫの発現を特徴とする疾患または障害に罹患している患者に投与することを含む。
肝臓癌
ＡＳ－ＳＰＩＫの発現を特徴とする障害の１つの顕著な例は肝臓癌である。肝臓癌は、肝臓に対する損傷及び肝機能障害を引き起こす広範な疾病を包含する。肝臓癌は、例えば、感染因子、疾患、外傷、もしくは遺伝性疾病、または感染因子、疾患、外傷、及び遺伝性疾病の組み合わせに起因する場合がある。
肝臓癌としては、原発性肝臓癌、例えば、肝細胞癌、胆管癌、血管肉腫、及び肝芽腫などの異常な細胞増殖を伴う疾患を挙げることができる。かかる癌としては、非常に初期のＨＣＣ（バルセロナ臨床肝癌病期分類システム（ＢＣＬＣ）の病期０及び腫瘍サイズ＜２ｃｍ）、初期（ＢＣＬＣ病期Ａ、腫瘍サイズ２ｃｍ～５ｃｍ）、中期（ＢＣＬＣ病期Ｂ、中腫瘍サイズ＞５ｃｍ）、後期（ＢＣＬＣ病期Ｃ及びＤ、進行期）、または転移期（Ｐｏｎｓ ｅｔ ａｌ．， ＨＰＢ ２００５；７（１）：３５－４１）、ならびにＩＣＣの初期のＩＣＣ（病期Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩａ、腫瘍サイズ＜２ｃｍ）、中期（病期ＩＩＩｂ及びＩＩＩｃ、腫瘍サイズ≧２ｃｍ）、及び後期（病期ＩＶ）（Ｆａｒｇｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ ２０１１；１１７（１０）：２１７０－２１７７）などの、疾患進行の任意の病期の癌を挙げることができる。
肝臓癌は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎などのウイルスによって引き起こされる感染症によっても誘発される場合もある。特定の肝炎ウイルスを問わず、かかる感染症は急性または慢性のいずれの場合もあり得る。
肝臓癌は肝損傷、例えば、肝硬変からも発生する場合がある。肝硬変は、肝臓の後期の瘢痕化または線維化であり、様々な形態の肝疾患及び疾病によって引き起こされる場合がある。肝硬変は遺伝性疾病、例えば、ヘモクロマトーシス、嚢胞性線維症、ウィルソン病、及び自己免疫疾患の結果として発生する場合がある。肝硬変は、肝炎ウイルス感染症及びアルコール消費に起因する場合もある。
肝臓癌は、アルコール性肝疾患；脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪症、及び肝線維症などの肝臓の異常な脂肪含有量に関連する障害を含む、但しこれらに限定されない他の疾患によっても発生する場合がある。
生物学的試料
「生物学的試料」、「検査試料」、または「試料」とは、患者から得られた、または患者に由来する試料をいう。上記試料は、例えば体液試料であってよい。例示的な体液試料としては、血液、血清、血漿、尿、唾液、精液、便、喀痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は組織試料であってよい。例示的な組織試料としては、肝生検標本などの生検標本、または患者の細胞から調製された初代細胞培養標本、または初代培養物の上清が挙げられる。
イムノアッセイ
本発明の態様は、診断アッセイ法、例えば、診断イムノアッセイを含み、診断イムノアッセイは検査試料中のＡＳ－ＳＰＩＫの有無を検出するために使用することができる。ＡＳ－ＳＰＩＫの検出に使用されるイムノアッセイ方式は、様々な形態で構成することができる。上記イムノアッセイとしては、同種及び異種アッセイ、競合的及び非競合的アッセイ、直接及び間接アッセイの両方、ならびに「サンドウィッチ」アッセイを挙げることができる。有用な方式としては、酵素イムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ（ＣＬＩＡ）、電気化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光法、蛍光偏光測定法、免疫沈降法、平衡透析法、免疫拡散法、免疫ブロット法、凝集、ルミネッセントプロキシミティアッセイ、及び比濁分析が挙げられるが、これらに限定はされない。
方式は問わず、上記生物学的試料を本発明の抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体と接触させる。いくつかの実施形態において、上記生物学的試料を固体支持体上に固定化してもよい。いくつかの実施形態において、上記生物学的試料を、固体支持体上に固定化された本発明の抗ＳＰＩＫ抗体と接触させる。上記固体支持体は、例えば、プラスチック表面、ガラス表面、紙もしくは繊維の表面、または粒子表面であってよい。より詳細には、上記支持体としては、マイクロプレート、ビーズ、ポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、多孔質膜、非多孔質膜を挙げることができる。基材の組成は変えることができる。例えば、基材または支持体は、ガラス、セルロース系材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、またはポリエステルなどの熱可塑性ポリマー、粒子状物質（例えば、ガラスまたは様々な熱可塑性ポリマー）からなる焼結構造体、またはニトロセルロース、ナイロン、もしくはポリスルホンからなる流下膜（ｃａｓｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ）フィルムを含んでいてもよい。一般的な実施形態において、上記基材は、１種以上の固体支持体（例えば、スライドガラスもしくはコーティングされたプレートなどのガラス、シリカ、プラスチックもしくは誘導体化されたプラスチック、常磁性もしくは非磁性金属）、半固体支持体（例えば、高分子材料、ゲル、アガロース、もしくは他のマトリクス）、及び／または多孔質支持体（例えば、フィルター、ナイロンもしくはニトロセルロース膜または他の膜）を含む、その上に抗体またはポリペプチドを固定化することができる任意の表面あるいは支持体であってよい。いくつかの実施形態において、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメタクリル酸グリシジル、アミノ化もしくはカルボキシル化ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアミド、及びポリ塩化ビニルを含む合成ポリマーを基材として使用してもよい。
いくつかの実施形態において、上記イムノアッセイ方式は、２抗体「サンドウィッチ」アッセイであってよい。上記生物学的試料を、固体支持体、例えばマイクロタイタープレート上に固定化された本発明の抗ＳＰＩＫ抗体と接触させる。上記試料及び第１の抗体を、特異的結合及びＳＰＩＫ－抗体複合体の形成に有利な条件下でインキュベートする。上記接触ステップに続いて、上記生物学的試料の未結合成分を除去する。次いで、上記複合体を第２の抗ＳＰＩＫ抗体と接触させる。第２の抗体は、第１の抗体が結合したエピトープとは異なるＳＰＩＫエピトープと結合する。したがって、第１及び第２の抗体は、ＳＰＩＫへの結合に関して互いに競合的に阻害することはない。いくつかの実施形態において、第１の抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫ及びＮＳ－ＳＰＩＫの両方に存在するエピトープ、すなわち抗原決定基を認識することができる。本発明者らはかかる抗体を「汎ＳＰＩＫ」抗体と呼ぶ場合がある。あるいは、第１の抗体はＡＳ－ＳＰＩＫ上にのみ存在するエピトープを認識することができる。いくつかの実施形態において、第２の抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫ及びＮＳ－ＳＰＩＫの両方に存在するエピトープ、すなわち、抗原決定基を認識することができる。あるいは、第２の抗体は、ＡＳ－ＳＰＩＫまたはＮＳ－ＳＰＩＫ上にのみ存在するエピトープを認識することができる。したがって、上記サンドウィッチアッセイは、第１の抗体が汎ＳＰＩＫ抗体であり、第２の抗体がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的にまたは優先的に結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫには特異的に結合しないように構成することができる。あるいは、上記サンドウィッチアッセイは、第１の抗体及び第２の抗体の両方がＡＳ－ＳＰＩＫに特異的にまたは優先的に結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫには特異的に結合しないように構成することができる。
抗体結合は様々な方法で測定することができる。例えば、検出可能な標識によって発生したシグナルを分析してもよく、該当する場合には、光学走査機または他の画像取得装置及び、複合体形成に関連するシグナル、例えば、蛍光シグナル、発光シグナル、もしくはリン光シグナル、または放射性シグナルの測定を可能にするソフトウェアを使用して定量化してもよい。検出可能なシグナルを測定するための例示的な機器としては、マイクロプレートリーダー、蛍光光度計、分光光度計、及びガンマカウンターを挙げることができるが、これらに限定はされない。
基準試料
生物学的試料中のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルを基準試料のレベルと比較してもよい。標準的な基準レベルは、通常、個体の集団に由来する平均ＡＳ－ＳＰＩＫレベルに当たる。上記基準母集団は、対象である個体と類似の年齢、体の大きさ、民族的背景、または全般的な健康状態の個体を含んでいてよい。したがって、患者の試料中のＡＳ－ＳＰＩＫレベルを、１）肝臓癌があることが判明しており、ＡＳ－ＳＰＩＫを発現し、体液にＡＳ－ＳＰＩＫが含まれている個体；２）肝臓癌のない、体液に低レベルのＡＳ－ＳＰＩＫが含まれている個体由来の値と比較してもよい。
一般に、ＡＳ－ＳＰＩＫの高いレベルは、対照試料中に存在するＡＳ－ＳＰＩＫのレベル、または肝臓癌のない正常で健康な個体の集団由来の試料中に存在するＡＳ－ＳＰＩＫの平均レベル（基準値）のいずれかよりも大きい、好ましくは少なくとも１、２、３、４、または５％大きい、より好ましくは少なくとも５％大きい、任意のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルであってよい。ＡＳ－ＳＰＩＫの低いレベルは、対照試料中に存在するＡＳ－ＳＰＩＫのレベル、または肝臓癌がある個体の集団由来の試料中に存在するＡＳ－ＳＰＩＫの平均レベルのいずれかよりも小さい、任意のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルであってよい。任意の母集団サイズを使用して、正常で健康な個体の集団由来の試料中に存在するＡＳ－ＳＰＩＫの平均レベルを測定することができる。例えば、２～２５０の個体、例えば２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０以上の個体の集団を使用して、正常で健康な個体の集団由来の試料中のＡＳ－ＳＰＩＫの平均レベルを測定することができ、試料集団が大きいほど、測定の精度が高くなる。
いくつかの実施形態において、基準チャートを使用して、試料中のＡＳ－ＳＰＩＫの特定のレベルが、対照試料またはより大きな集団と比較して上昇しているかどうかを判定することができる。例えば、基準チャートは、対象である個体と同様の年齢、民族的背景、または全般的な健康状態の健康な個体中に存在するＡＳ－ＳＰＩＫの正常な範囲を含んでいてもよい。この基準チャートを使用して、試料中で測定されたＡＳ－ＳＰＩＫの任意のレベルを、対照試料と比較して、またはより大きな集団に由来する平均値と比較して、低い、正常、または高いとして分類してもよい。用語「高いレベル」とは、基準レベルよりも高い、好ましくは少なくとも２％高い、より好ましくは少なくとも５％高いレベルとして定義される。
あるいは、または上記に加えて、生物学的試料中のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルを、１つ以上のさらなる生物学的マーカー、例えば、その発現がＡＳ－ＳＰＩＫの発現とは独立である別のマーカーのレベルに対して「正規化」してもよい。すなわち、上記さらなるマーカーのレベルは、ＡＳ－ＳＰＩＫのレベルと、同時にまたは別個の機会にのいずれかで、並行して評価することができる。上記さらなるマーカーは、試料調製、取扱い、保管、及び日毎のアッセイの変動性の内部対照としての役割を果たすことができる。ＡＳ－ＳＰＩＫ及び上記さらなるマーカーのレベルの値は比率として表してもよく、その比率は、基準試料または集団について得られた同様の比率と比較することができる。有用な第２のマーカーはα－フェトプロテインである。
いくつかの実施形態において、上記方法は、標準的な基準セットの使用を含んでいてもよい。上記基準セットは、精製ＳＰＩＫポリペプチドまたはそのフラグメントの１つ以上の試料を含んでいてもよい。複数の試料を使用する場合、これらの試料は異なる濃度の試料であってよい。一実施形態において、上記基準セットは、５０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、及び０ｎｇ／ｍｌのＡＳ－ＳＰＩＫの濃度の組換えＡＳ－ＳＰＩＫの６種の試料を含んでいてもよい。上記組換えＡＳ－ＳＰＩＫは、ＩＭ－ＣＡ２２などの抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体または抗タグ抗体のいずれかを使用したアフィニティークロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製してもよい。血液またその他の体液における基準値は変化する可能性がある。但し、当業者は、それぞれの集団の異なる体液中のＡＳ－ＳＰＩＫの平均レベルを決定し、それぞれの基準値を決定する立場にあり、このことにより、判定される肝臓癌を有する患者におけるＡＳ－ＳＰＩＫのレベルが上記基準値を十分に上回る一方、検出される肝臓癌に罹患していない患者または健康な個体におけるレベルがそれぞれの基準値を十分に下回ることが確実になる。好ましい実施形態において、上記基準値は、正常で健康な個体の集団由来の試料中に存在するＡＳ－ＳＰＩＫの平均レベルよりも約５％、より好ましくは約７％、さらにより好ましくは約１０％高い。上記生物学的試料及び対照試料中のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルは同一の方法で測定され、その結果、比較可能であることに留意されたい。例えばＡＳ－ＳＰＩＫレベルの絶対値は、上記の組換えＡＳ－ＳＰＩＫを使用した検量線を介して測定することができる。
対照試料
いくつかの実施形態において、陽性対照は、真核細胞または細胞株によって産生されたＡＳ－ＳＰＩＫの試料を含んでいてもよい。例えば、有用な対照は、安定した細胞株Ｓ２－３由来の１００ｎｇ／ｍｌのＡＳ－ＳＰＩＫを含む培地であってよい。これは、ＡＳ－ＳＰＩＫを過剰発現する人工プロモーターの制御下で、ＡＳ－ＳＰＩＫのＤＮＡ配列をＨＣＣ細胞の染色体に挿入することにより、本発明者らによって作成された。
本明細書に開示される方法は、肝臓癌を有することが疑われるまたは肝臓癌の危険性がある患者における肝臓癌の検出に有用である。この方法はまた、肝臓癌、例えば肝細胞癌の治療を受けた患者由来の試料の、該患者の肝細胞癌が寛解する危険性があるかどうかを判定するための分析にも使用することができる。本方法は、治療、例えば、小分子薬物または治療用抗体などの治療薬による治療、化学療法、放射線療法、または手術の過程を監視して、治療の有効性を判定し、管理臨床医が必要に応じて治療法を変更することを可能にするためにも使用することができる。この方法はまた、転形、例えば、生物学的試料、例えば、患者から得られた血液または血清試料中のＡＳ－ＳＰＩＫのレベルの増加に関連するいずれかの障害に罹患している、もしくは該障害の危険性を有する患者の検出、監視、または分析にも使用することができる。
本明細書に開示される方法は、他の標準的な診断方法、例えば、肝酵素またはα－フェトプロテインの血清学的分析、超音波（超音波検査）、コンピューター断層撮影（ＣＴスキャン）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、血管造影、腹腔鏡検査、または生検と併用してもよい。
製品
本明細書に記載の組成物は、例えば、生物学的試料中のＡＳ－ＳＰＩＫの検出、同定、及び定量化用であることが表示された適宜の容器中に包装されていてもよい。「キット」とも呼ばれる上記製品は、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、及び／または本発明の抗体－薬物複合体、培地、陽性対照として使用するための抗原の精製試料、またはそれらの任意の組み合わせを備えていてもよい。本キットが備える容器は、ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的にまたは優先的に結合するが、ＮＳ－ＳＰＩＫには結合しない本発明の抗体を含む組成物を備えていてもよい。キットは、ＡＳ－ＳＰＩＫとＮＳ－ＳＰＩＫの両方に結合する抗体を備えていてもよい。検査試料及び抗体を希釈または再構成するための適宜の緩衝液を提供してもよい。一部の構成要素は乾燥形態で提供されてもよく、再構成が必要になる場合がある。上記抗ＳＰＩＫ抗体は、アッセイ機器、例えば、マイクロプレートに事前に結合させてもよい。したがって、一実施形態において、ＡＳ－ＳＰＩＫの検出、同定、及び定量化のためのキットは、抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体及び汎ＳＰＩＫ抗体を備える。本キットは、任意選択で、検出可能な標識を備えていてもよい。
したがって、包装された製品（例えば、貯蔵、輸送、もしくは販売のために、濃縮されたまたはそのまま使用できる濃度で包装された、１種以上の本明細書に記載の組成物を収納する滅菌容器）、及び少なくとも１種の本発明の組成物、例えば抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体を備えるキットも、本発明の範囲内である。製品は、１種以上の本発明の組成物を収納した容器（例えば、バイアル、広口瓶、瓶、袋など）を備えていてもよい。また、製品は、例えば、包装材、使用説明書、注射器、送達装置、緩衝液、または診断もしくは治療が必要とされる疾病を治療または監視するための他の対照試薬をさらに備えていてもよい。
本発明のキット中には、特定のタイプのアッセイ用の試薬が提供されていてもよい。したがって、本キットは、一群のビーズ（例えば、凝集アッセイまたはラテラルフローアッセイに適する）、またはプレート（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに適するプレート）を備えていてもよい。他の実施形態において、本キットは、ラテラルフローイムノアッセイ装置、分析用回転子、または電気化学的、光学的、もしくは光電子的センサーなどの装置を備える。上記一群のビーズ、上記プレート、及び上記装置は、イムノアッセイを実施するのに有用である。例えば、それらは、第１の薬剤－分析対象物－第２の薬剤複合体の形成を検出するのに有用である場合がある。
さらに、本キットは、様々な希釈剤及び緩衝液、特異的に結合した抗原もしくは抗体を検出するための標識複合体または他の薬剤、ならびに酵素基質、補因子、色素原などの他のシグナル発生試薬を備えていてもよい。本キットは、様々な濃度の１種以上の基準試料、例えば、精製組換えＡＳ－ＳＰＩＫを備えていてもよい。本キットは、陽性対照、例えば、ＡＳ－ＳＰＩＫを過剰発現する細胞株由来の細胞上清も備えていてよい。キットの他の構成要素としては、コーティング試薬、被験抗原もしくは分析対象物に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル捕捉抗体、または２種以上の抗体のカクテル、標準としてのこれらの抗原の精製または半精製抽出物、モノクローナル抗体検出抗体、抗マウス、抗イヌ、抗ニワトリ、または抗ヒト抗体であって、該抗体に複合体化したインジケーター分子を有する上記抗体、比色分析による比較のための指示色図、使い捨て手袋、除染手順説明書、塗布棒または塗布容器、試料準備用カップなどが挙げられる。一実施形態において、キットは、ペプチド－抗体複合体の形成を可能にする反応媒体を構成するのに適当な緩衝液または他の試薬を備える。
かかるキットは、臨床医が、対象に肝臓癌があるかまたはその危険性があるかどうかを判定するための簡便で効率的な方法を提供する。したがって、特定の実施形態において、本キットは、使用説明書をさらに備える。本製品は、説明文（例えば、印刷されたラベルもしく添付文書、または製品の使用法を説明するその他の媒体（例えば、音声テープもしくはビデオテープ））を備えていてもよい。上記説明文は上記容器に付帯されていてもよく（例えば、上記容器に貼付される）、アッセイを実施する際に従うべき方法、キットの適応症、及びその他の用途を説明するものであってもよい。
以下の実施例は例示のみを目的として提示するものであり、本発明の範囲を限定することを何ら意図するものではない。本開示においてはいくつかの実施形態が提示されるが、開示される組成物及び方法は、本開示の趣旨または範囲から逸脱することがなければ、他の多くの特定の形態で実施することができることを理解されたい。本実施例は、例示的であり且つ限定的ではないと考える必要があり、その意図は、本明細書に提示した詳細に限定されるべきものではない。変更、置き換え、及び改変の様々な例は、当業者であれば確認可能であり、本明細書に開示される趣旨及び範囲から逸脱することなくこれらを行うことができる。
実施例１：ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的なウサギモノクローナル抗体の産生
ここに記載の１０種のモノクローナル抗体はウサギから生成させた。簡単に説明すれば、ウサギを、２３の追加のアミノ酸（配列番号８１）の異なるサブセットを含む組換えＡＳ－ＳＰＩＫで免疫した。３回または４回のｉｍｂｕｒｓｅｍｅｎｔ後に、血液をＥＬＩＳＡによって検査した。簡単に説明すれば、免疫化したウサギ由来の血液を、組換えＡＳ－ＳＰＩＫでコーティングしたプレートと反応させた。洗浄後に、このプレートをＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識した抗ウサギ抗体と共にインキュベートすることにより発色させ、基質ＴＭＢとの反応させた後に光学密度を測定した。検査において陽性であった（産生された抗体）ウサギを屠殺した。次いでモノクローナル抗体を確立し、Ｓ２－３細胞（組み込まれた全ＳＰＩＫ遺伝子によって多量のＡＳ－ＳＰＩＫを発現する細胞株、Ｌｕ ｅｔ．ａｌ Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＰＩＫ／ＴＡＴＩ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ， Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ， ２００８ １３（４）， ４８３－４９４）由来の部分的に精製したＡＳ－ＳＰＩＫ、及び膵細胞由来のＮＳ－ＳＰＩＫを固定化したプレートを使用したＥＬＩＳＡによってさらにスクリーニングした。最後に、ＡＳ－ＳＰＩＫに強く結合するがＮＳ－ＳＰＩＫには結合しない１０種のモノクローナル抗体を選択した。図１は、ＩＭ－Ａ１、ＩＭ－Ａ６、ＩＭ－Ｂ１０、ＩＭ－Ｃ６、ＩＭ－Ｄ３、ＩＭ－Ｄ５、ＩＭ－Ｅ２、ＩＭ－Ｆ５、ＩＭ－Ｇ６、及びＩＭ－Ｇ７と命名した１０種のクローンが、ＡＳ－ＳＰＩＫに対して高い結合活性を示す一方、ＮＳ－ＳＰＩＫに対する結合活性は、陰性対照としてのバックグラウンドレベル（図１陰性対照）に過ぎないことを示す。このデータは、本明細書で同定されたウサギモノクローナル抗体はＡＳ－ＳＰＩＫのみを認識することを示唆する。さらに、１０種の抗体のすべてがＡＳ－ＳＰＩＫに強く結合することができ、ＡＳ－ＳＰＩＫに対して類似の結合親和性を有する。
実施例２：ＩＭ－Ｅ２を含む試料における抗体－抗原複合体の検出
Ｓ２－３の培地、ＰａｎＣ１の培地、ＨＣＣ患者の血清、及び健常者の血清中で、抗体ＩＭ－Ａ１、ＩＭ－Ａ６、ＩＭ－Ｂ１０、ＩＭ－Ｃ６、ＩＭ－Ｄ３、ＩＭ－Ｄ５、ＩＭ－Ｅ２、ＩＭ－Ｆ５、ＩＭ－Ｇ６、及びＩＭ－Ｇ７とＡＳ－ＳＰＩＫから形成される複合体を、サンドウィッチＥＬＩＳＡで測定する。簡単に説明すれば、異なる試料中の抗体とＡＳ－ＳＰＩＫとの免疫複合体は、抗体を上記試料と共に３７℃で０．５時間インキュベートすることによって形成させた。次いで、この混合物を、ポリクローナル抗ＳＰＩＫ抗体を固定化した９６ウェルプレートと３７℃で１時間反応させた。次に、このプレートを、ＨＲＰで標識した抗ウサギ抗体と共に３７℃で４５分間インキュベートした。抗体－抗原複合体の量を、基質ＴＭＢとの反応後の光学密度によって測定した。図２はＩＭ－Ｅ２の試験結果を示す。他の抗体からも同様の結果が得られた。これらの結果は、ＩＭ－Ｅ２はＡＳ－ＳＰＩＫと抗体－抗原複合体を形成することができる（図２；Ｓ２－３：ＯＤ（１．３８９））が、ＮＳ－ＳＰＩＫとは複合体を形成しない（図２、ＰａｎＣ１：ＯＤ（０．０６１））ことを明確に示している。高いＯＤ（１．４７７）はＨＣＣの患者の血清中でも見られる、健康な人では見られず（健康：ＯＤ（０．１０６））、このことは、ここに記載のＩＭ－Ｅ２などの抗体を、血清ＡＳ－ＳＰＩＫの検出に使用することができることを示唆している。
実施例３：抗体の可変重鎖及び可変軽鎖ならびにそれらのＣＤＲの配列
１０種すべての抗体の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）の配列を決定した。次に、上記抗体のＣＤＲを同定する。表１は、１０種の抗体、すなわち、ＩＭ－Ａ１、ＩＭ－Ａ６、ＩＭ－Ｂ１０、ＩＭ－Ｃ６、ＩＭ－Ｄ３、ＩＭ－Ｄ５、ＩＭ－Ｅ２、ＩＭ－Ｆ５、ＩＭ－Ｇ６、及びＩＭ－Ｇ７のＶＨならびにＶＬの配列番号を示す。表２は、これら１０種の抗体のＶＨ ＣＤＲの配列番号を示し、表３は、これら１０種の抗体のＶＬ ＣＤＲの配列番号を示す。
Figure 0007658946000001
Figure 0007658946000002
Figure 0007658946000003
実施例４：ＶＨ及びＶＬ配列のコンセンサス
ＢｉｏＥｄｉｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｅｄｉｔｏｒ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙと名付けたプログラムを使用して、１０種の抗体のＶＨ及びＶＬの全配列のアラインメントにより、配列のコンセンサスを決定した。図３及び図４の最下行は、ＶＨまたはＶＬのいずれかにおけるこれらの１０種の抗体の配列同一性を示す。明らかに、これら１０種の抗体には、ＶＨ及びＶＬにおける配列の高い類似性が存在する。上記１０種の抗体の配列同一性は８５～９５％である。
実施例５：ＣＤＲ配列のコンセンサス
可変重鎖のＣＤＲの配列のコンセンサスを、上記のソフトウェアを使用して決定した。図５は、１０種の抗体すべてがＶＨ ＣＤＲ１の高い類似性を有することを示しており、それらの同一性は６６～１００％である。１０種の抗体のＶＨＣＲＤ２には６６％の類似性があり、同一性は５０～６６％である。対照的に、これらの１０種の抗体のＶＨ ＣＤＲ３の類似性は非常に小さい。ＶＨ ＣＤＲ３中のアミノ酸のみが、１０種の抗体すべてにおいて同一である。コンセンサス配列は、これらの１０種の抗体において、ＶＨよりもＶＬのＣＤＲの類似性がより高いことを示している。１０種の抗体のＶＬ ＣＤＲ１には８２％の類似性があり、それらの同一性は７３～８２％である（図６）。１０種の抗体のＶＬ ＣＤＲ２には８６％の類似性があり、それらの同一性は７２～８６％である。ＶＬ ＣＤＲ３に関しては、７５％の１０種の抗体の類似性があるが、同一性は４５～７５％である（図６）。

Claims (14)

  1. ＡＳ－ＳＰＩＫ（配列番号８２）上のエピトープに特異的に結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫ（配列番号８３）に結合しない、単離された抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該単離された抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＡＳ－ＳＰＩＫ上のエピトープに特異的に結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない他のクラスの抗体の結合を排除しないものであり、
    （ａ）配列番号２１のＣＤＲＨ１配列、配列番号３１のＣＤＲＨ２配列、配列番号４１のＣＤＲＨ３配列、配列番号５１のＣＤＲＬ１配列、配列番号６１のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７１のＣＤＲＬ３配列、または
    （ｂ）配列番号２３のＣＤＲＨ１配列、配列番号３３のＣＤＲＨ２配列、配列番号４３のＣＤＲＨ３配列、配列番号５３のＣＤＲＬ１配列、配列番号６３のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７３のＣＤＲＬ３配列、または
    （ｃ）配列番号２４のＣＤＲＨ１配列、配列番号３４のＣＤＲＨ２配列、配列番号４４のＣＤＲＨ３配列、配列番号５４のＣＤＲＬ１配列、配列番号６４のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７４のＣＤＲＬ３配列、または
    （ｄ）配列番号２７のＣＤＲＨ１配列、配列番号３７のＣＤＲＨ２配列、配列番号４７のＣＤＲＨ３配列、配列番号５７のＣＤＲＬ１配列、配列番号６７のＣＤＲＬ２配列、及び配列番号７７のＣＤＲＬ３配列、
    を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 前記ＣＤＲＨ１配列、ＣＤＲＨ２配列、及びＣＤＲＨ３配列がフレームワーク配列内に存在し、且つ前記ＣＤＲＬ１配列、ＣＤＲＬ２配列、及びＣＤＲＬ３配列がフレームワーク配列内に存在する、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  3. 前記フレームワーク配列の少なくとも一部がヒトコンセンサスフレームワーク配列を含む、請求項２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  4. （ａ）配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列及び配列番号１１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列、または
    （ｂ）配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列及び配列番号１３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列、または
    （ｃ）配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列及び配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列、または
    （ｄ）配列番号７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列及び配列番号１７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列、
    を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  5. （ａ）配列番号１の重鎖可変領域配列及び配列番号１１の軽鎖可変領域配列、または
    （ｂ）配列番号３の重鎖可変領域配列及び配列番号１３の軽鎖可変領域配列、または
    （ｃ）配列番号４の重鎖可変領域配列及び配列番号１４の軽鎖可変領域配列、または
    （ｄ）配列番号７の重鎖可変領域配列及び配列番号１７の軽鎖可変領域配列、
    を含む、請求項４に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  6. ＡＳ－ＳＰＩＫ上のエピトープが、配座エピトープである、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  7. 多重特異性であり、任意で二重特異性である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  8. モノクローナルである、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  9. 対象が肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝内胆管癌（ＩＣＣ）、または肝硬変を有するかどうかを判定するためのインビトロ方法であって、
    （ａ）前記対象由来の生物学的検査試料を請求項１～８のいずれか１項に記載の抗ＡＳ－ＳＰＩＫ抗体または抗原結合フラグメントと接触させて、ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体を生成させることと、
    （ｂ）前記生物学的検査試料中のＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を検出することと、
    （ｃ）前記ＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の濃度を、対照試料中に検出されるかまたは障害を有さない正常で健康な個体の集団由来の試料中に検出される基準値と比較することと、を含み、前記生物学的検査試料中の前記基準値より大きいＡＳ－ＳＰＩＫ－抗体複合体の上昇した濃度レベルが、前記対象が肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝内胆管癌（ＩＣＣ）、または肝硬変を有していることを示す、インビトロ方法。
  10. 前記抗体または抗原結合フラグメントが検出可能な標識を含む、請求項９に記載のインビトロ方法。
  11. 対象由来の生物学的検査試料中のＡＳ－ＳＰＩＫ濃度を検査するためのキットであって、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体、または抗原結合フラグメントを備えるキット。
  12. ＳＰＩＫに特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントをさらに備える、請求項１１に記載のキット。
  13. ＡＳ－ＳＰＩＫおよびＮＳ－ＳＰＩＫの両方に特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントをさらに備える、請求項１１に記載のキット。
  14. ＡＳ－ＳＰＩＫに特異的に結合し、且つＮＳ－ＳＰＩＫに結合しない、前記抗体または抗原結合フラグメントが、アッセイ機器に事前に結合される、請求項１１に記載のキット。
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