JP2019526227A - 卵巣がんおよび膵臓がんのためのバイオマーカーとしてムチン様タンパク質(mlp)を検出するためのモノクローナル抗体、組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、卵巣がんおよび膵臓がんを検出する際に使用するためのモノクローナル抗体およびそのような抗体を含む組成物に関する。
本出願に添付された配列表は、複写用紙の代わりにテキストフォーマットで提供され、本明細書によってこの配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名前は、AB.1.0208.PCT.Sequence Listing.20170525_ST25である。テキストファイルは、25KBであり、2017年5月25日に作成され、EFS−Webを介して本明細書の提出と共に提出されたものである。
女性がん患者の間では、卵巣がんの発生率が高く、これには、高い死亡率が伴う(Modugnoら、Am J of Obstetrics and Gynecology、191巻:733〜740頁、2004年)。卵巣がんは、乳房、腸、肺および子宮のがんに続く、女性における5番目に最も一般的ながんである。卵巣がんは、後期に達するまで無症状であることからサイレントキラーと呼ばれている(Chauhanら、J of Ovarian Research、2巻:2215頁、2009年)。最初の症状は非局所性の軽度の疼痛であることから、卵巣がんの早期診断は困難であるが、卵巣の悪性腫瘍の症状が、後期にはより明らかになり、そうした症状には、食欲喪失および体重減少、閉経後の膣出血を伴う背部および骨盤における強度の疼痛、頻尿、便秘または下痢および腹部膨満が含まれる(American Cancer Society、2013年)。
これまでのところ、卵巣の悪性腫瘍の早期検出は、これまでまだ解決されていない要求である。現在使用されている腫瘍関連のバイオマーカーには、例えば、比較的非特異的な腫瘍マーカーであるCA−125があるが、これらはいずれも、卵巣の悪性腫瘍を早期に検出することができない。
したがって、卵巣の悪性腫瘍を早期に発見するためには、早期診断のための非侵襲性の臨床検査を開発する差し迫った必要性があり、早期には、治療が有効であり、治療すれば、予後は、より後期の卵巣がんよりもさらに良好である。
この要旨は、下記の詳細な説明でさらに記載する概念選択を簡潔な形で提供する。この要旨は、特許請求される主題の主要な特色を特定する意図もないし、また特許請求される主題の範囲の決定の支援として使用する意図もない。
(i)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体MLPクローン11、(ii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体MLPクローンB、および(iii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体MLPクローンCからなる群から選択される1つまたは複数の参照抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部を認識する。
抗原
配列番号1:全長ヒトムチン様タンパク質(MLP)、431アミノ酸長のアミノ酸配列
配列番号2:N末端ヒスチジンタグおよびヒトMLPのC末端領域の残基279〜431に対応するポリペプチド領域を含む融合タンパク質をコードするDNA
配列番号3:ヒトMLPのC末端領域の残基279〜431に融合されたN末端ヒスチジン検出タグを含む融合タンパク質(配列番号2によってコードされる)のアミノ酸配列
配列番号4:ヒトMLPのC末端領域(アミノ酸279〜431)のアミノ酸配列
配列番号5:SSGHRTEKRKRQQPQRRPAAGTGQRRGSEEMEEEG(ヒトMLPのアミノ酸残基397〜431)
配列番号6:EKRKRQQPQRRPAAGTGQRRGSEEMEEEG(ヒトMLPのアミノ酸残基403〜431)
配列番号7:mAbクローン11:VHアミノ酸配列
配列番号8:mAbクローンB:VHアミノ酸配列
配列番号9:mAbクローンC:VHアミノ酸配列
配列番号10:mAbクローン11:VLアミノ酸配列
配列番号11:mAbクローンB:VLアミノ酸配列
配列番号12:mAbクローンC:VLアミノ酸配列
配列番号13:クローン11およびクローンBに由来するCDR−H1
配列番号14:クローン11に由来するCDR−H2
配列番号15:クローン11に由来するCDR−H3
配列番号35:クローンBに由来するCDR−H3
配列番号16:クローンBに由来するCDR−H2
配列番号17:クローンCに由来するCDR−H1
配列番号18:クローンCに由来するCDR−H2
配列番号19:クローンCに由来するCDR−H3
配列番号20:クローン11およびクローンBに由来するCDR−H2コンセンサス
配列番号36:クローン11およびクローンBに由来するCDR−H3コンセンサス
配列番号21:クローン11に由来するCDR−L1
配列番号22:クローン11およびクローンBに由来するCDR−L2
配列番号23:クローン11およびクローンBに由来するCDR−L3
配列番号24:クローンBに由来するCDR−L1
配列番号25:クローンCに由来するCDR−L1
配列番号26:クローンCに由来するCDR−L2
配列番号27:クローンCに由来するCDR−L3
配列番号28:クローン11およびクローンBに由来するCDR−L1コンセンサス
配列番号29:クローン11に由来するVHをコードするDNA
配列番号30:クローンBに由来するVHをコードするDNA
配列番号31:クローンCに由来するVHをコードするDNA
配列番号32:クローン11に由来するVLをコードするDNA
配列番号33:クローンBに由来するVLをコードするDNA
配列番号34:クローンCに由来するVLをコードするDNA
本明細書においては、特段に定義しない限り、本明細書で使用するすべての用語は、本発明の当業者が理解すると予想される意味と同じ意味を有する。本発明を記載するために本明細書および特許請求の範囲で使用する用語を明確にするために、以下の定義を提供する。
本明細書の実施例1〜3に記載するように、本発明は、モノクローナル抗MLP抗体を提供し、これらの抗体は、(配列番号1に記載する)ヒト完全長ムチン様タンパク質「MLP」に高い親和性で結合し、ヒト対象に由来する血清試料中の卵巣がん、膵臓がん、結腸直腸がん、乳がん、虫垂がん、肺がん、腎臓がん、子宮頚がん、胆道がん、食道がん、上皮性皮膚がんおよび/またはその他のムチン分泌型のがんの存在を検出するためのバイオマーカーとして使用することが可能である。特定の実施形態では、本発明は、ヒトMLPの(配列番号4に記載する)C末端領域中のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。一部の実施形態では、本発明は、MLPのC末端領域であって、配列番号1のアミノ酸残基397〜431を含むかまたはアミノ酸残基397〜431からなる(配列番号5に記載する)C末端領域中のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。一部の実施形態では、本発明は、MLPのC末端領域であって、配列番号1のアミノ酸残基403〜431を含むかまたはアミノ酸残基403〜431からなる(配列番号6に記載する)C末端領域中のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。
III.MLP抗原
一実施形態では、本発明は、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6のうちの少なくとも1つをコードする核酸を含む細胞を提供する。
IV.抗MLPモノクローナル抗体
(i)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699を有するATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体MLPクローン11、(ii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700を有するATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体MLPクローンB、および(iii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701を有するATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体MLPクローンCからなる群から選択される1つまたは複数の参照抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部を認識する。
抗MLP抗体の結合親和性
バリアントの抗MLP抗体
抗MLPモノクローナル抗体(クローン11、BおよびC)を産生するハイブリドーマ
単鎖抗MLP抗体
ヒト化抗MLP抗体
抗MLP抗体を産生するための方法
別の態様では、本発明は、検出可能な部分(すなわち、検出および/または定量化を可能にする部分)で標識された抗MLP抗体を提供し、これらの抗体を使用して、診断に適用することができる。本明細書で使用する場合、「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的および/またはその他の物理的手段により検出可能な部分である。検出可能な部分は、当技術分野で周知の方法を使用して、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片に、直接的に、かつ/または(例えば、化学的なまたは組換えの手段による共有結合性の連結を介して)間接的にカップリングさせることができる。これらの標識された抗MLP抗体は、例えば、in−vitroでのアッセイにおいて、生物学的試料中のMLPの存在を検出するため、またはin vivoでのアッセイ(例えば、画像診断)において、生存体内のMLPを発現している細胞の存在を検出するために使用することができる。
(a)放射性同位体、例として、35S、14C、125I、3Hおよび131I。抗MLP抗体は、例えば、Current Protocols in Immunology、1巻および2巻、Gutigenら編、Wiley−Interscience、New York、N.Y.、Pubs.(1991年)に記載されている技法を使用して、放射性同位体で標識することができ、放射活性は、シンチレーションを計数することを使用して測定することができる。放射性同位体は、抗体に、直接的に、または中間の官能基を使用することによって間接的に結合させることができる。有用な中間の官能基には、キレート化剤、例として、エチレンジアミン四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸が含まれる。例えば、Shihら、Int J Cancer、46巻:1101頁(1990年)、および米国特許第5,057,313号を参照されたい。主題の抗MLP抗体および抗体断片はまた、in vivoでの診断の目的で、常磁性イオンおよび多様な放射線学的造影剤で標識することもできる。磁気共鳴画像法に特に有用である造影剤は、ガドリニウム、マンガン、ジスプロシウム、ランタンまたは鉄イオンを含む。追加の薬剤は、クロム、銅、コバルト、ニッケル、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウムまたはネオジムを含む。主題の抗MLP抗体およびそれらの断片はまた、超音波造影剤/増強剤にもコンジュゲートさせることができる。例えば、1つの超音波造影剤は、リポソームである。
(i)西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)と、基質としての過酸化水素(この場合、過酸化水素は、色素前駆体(例えば、オルトフェニレンジアミン(OPD)または3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン塩酸塩(TMB))を酸化する)、
(ii)アルカリホスファターゼ(AP)と、発色基質としてのpara−ニトロフェニルリン酸、および
(iii)β−D−ガラクトシダーゼ(β−D−Gal)と、発色基質(例えば、p−ニトロフェニル−β−D−ガラクトシダーゼ)または蛍光発光基質の4−メチルウンベリフェリル−β−D−ガラクトシダーゼ
が挙げられる。
治療剤にカップリングされている抗MLP抗体
本明細書に記載のとおり本発明者らは、初期上皮がん(例えば、卵巣がんおよび/または膵臓がん)を検出するための診断アッセイにおける使用のために好適である抗MLP抗体を生成した。卵巣がん腫瘍型、リスク因子、診断および分類の簡潔な概要を下に示す。
卵巣腫瘍型
卵巣腫瘍は、良性腫瘍と悪性腫瘍とに分けられる。良性腫瘍は、異常な細胞増殖であり、局所に留まり、身体の他の器官に伝播しない。通常症状は無い。しかし第2の種類の腫瘍はがん性(悪性)であり、身体の他の部分に転移できる。卵巣腫瘍は、それらの細胞の由来によって、下の表6に示すとおり上皮腫瘍、間質腫瘍および生殖細胞腫瘍に組織病理学的に分類される。
卵巣がんについてのリスク因子
卵巣がんの診断および分類
卵巣がんの早期検出のために研究されたMLP以外のバイオマーカー
治療
一態様では本発明の抗MLP抗体は、MLP抗原の存在について被検対象から得られた生物学的試料をスクリーニングするためのin vitroイムノアッセイにおいて使用され、MLPの存在または健常対象由来の対照または参照標準と比較したMLPの量の増加は、対象が上皮がん(例えば、卵巣がんまたは膵臓がん)を有するまたは上皮がん(例えば、卵巣がんまたは膵臓がん)を発症するリスクが増加していることを示す。被検対象は、明らかに健常な対象、または上皮がんを発症するリスクがある対象または、早期の上皮がんを有すると疑われる対象、または卵巣がん、膵臓がん、結腸直腸がん、乳がん、虫垂がん、肺がん、腎臓がん、子宮頸がん、胆管がん、食道がん、上皮皮膚がん等の上皮がんおよび/または他のムチン分泌型のがんを罹患している対象であってよい。そのようなin vitroイムノアッセイでは、抗MLP抗体またはその抗原結合性断片は、ネイキッドであってよく、または本明細書に記載される検出可能な部分で標識されていてよく、液相中でまたは下に記載される基材に結合されて利用されてよい。宿主免疫応答を考慮しないことから、in vitroアッセイの目的のためにマウス、キメラ、ヒト化またはヒト等の任意の種類の抗体は利用されてよい。
一実施形態では、前記抗体またはその抗原結合性断片は、(i)CDR−H1(配列番号17)、CDR−H2(配列番号18)およびCDR−H3(配列番号19)を含む重鎖可変領域、ならびに(ii)CDR−L1(配列番号25)、CDR−L2(配列番号26)およびCDR−L3(配列番号27)を含む軽鎖可変領域、ならびにそれらの保存的改変を含む。
別の態様では本発明の抗MLP抗体は、明らかに健常な対象、または上皮がんを発症するリスクがある対象、または早期上皮がんを有することが疑われる対象、または卵巣がん、膵臓がん、結腸直腸がん、乳がん、虫垂がん、肺がん、腎臓がん、子宮頸がん、胆管がん、食道がん、上皮皮膚がん等の上皮がんおよび/または他のムチン分泌型のがんを罹患している対象等の生存対象におけるMLP発現細胞の存在を検出するために使用される。放射標識されたモノクローナル抗体を用いるin vivo診断用画像化の種々の方法は、当技術分野において周知である。診断用画像化のために、主題の抗MLP抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書に記載されるin vivoでの使用のために好適な検出可能な部分で標識され(例えば、ガンマ発光放射性同位元素)患者に導入される。例えば免疫シンチグラフィーの技術では、抗MLP抗体はガンマ発光放射性同位元素で標識され、患者に導入され、ガンマカメラがガンマ発光放射性同位元素の位置および分布を検出するために使用される。例えば、Srivastava (編)、Radiolabeled Monoclonal Antibodies for Imaging and Therapy (Plenum Press 1988年);Chase、「Medical Applications of Radioisotopes」 Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版、Gennaroら (編)、624〜652頁(Mack Publishing Co.、1990年);およびBrown、「Clinical Use of Monoclonal Antibodies」 Biotechnology and Pharmacy、Pezzutoら (編) (Chapman & Hall 1993年)を参照されたい。患者に送達される放射線用量は、最短半減期、身体での最少貯留ならびに検出および正確な測定を可能にする同位体の最少量の最良の組合せのための同位体の選択を通じて可能な限り低いレベルに維持される。
別の態様では治療方法は、本明細書に開示される主題の抗MLP抗体等の抗MLP抗体またはその抗原結合性断片を卵巣がんもしくは膵臓がん等の上皮がんまたは他のムチン分泌悪性新生物を罹患している対象に投与することを含んで、悪性腫瘍を治療するために提供される。
追加的な薬学的方法は、治療適用における抗MLP抗体の作用の持続期間を調節するために使用されてよい。放出制御(Control release)調製物は、抗体、抗体断片または融合タンパク質と複合体化するまたはそれらを吸着するポリマーの使用を通じて調製することができる。例えば生体適合性ポリマーは、ポリ(エチレン−co−ビニルアセテート)のマトリクスおよびステアリン酸二量体およびセバシン酸のポリ酸無水物共重合体のマトリクスを含む。Sherwoodら、Bio/Technology 10巻:1446頁(1992年)。そのようなマトリクスからの抗体、抗体断片または融合タンパク質の放出速度は、抗体、抗体断片または融合タンパク質の分子量、マトリクス内の抗体の量および分散した粒子のサイズに依存する。Saltzmanら、Biophys. J. 55巻:163頁(1989年);Sherwoodら、上記。他の固体投与形態はAnselら、PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS、第5版(Lea & Febiger 1990年)およびGennaro (編)、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES、第18版(Mack Publishing Company 1990年)ならびにこれらの改訂版に記載されている。
組成物
別の態様では本発明は、治療剤および薬学的に許容される担体にカップリングされたMLP特異的モノクローナル抗体またはその断片の治療有効量を含む、卵巣がんまたは膵臓がんを治療するための組成物を提供する。一般に、任意の他の選択された治療剤にカップリングされたおよび/またはそれと組み合わされた本発明のMLP特異的抗体組成物は、薬学的に許容される担体に好適に含有される。担体は、無毒性、生体適合性であり、MLP特異的抗体(およびそれと組み合わされる任意の他の治療剤)の生物学的活性に有害に影響しないように選択される。ポリペプチドに関する例示的な薬学的に許容される担体は、Yamadaへの米国特許第5,211,657号に記載されている。MLP特異的抗体は、経口、非経口または外科的投与を可能にする、錠剤、カプセル、粉剤、顆粒剤、軟膏、溶液、デポジトリー(depositories)、吸入剤および注射剤等の固体、半固体、ゲル、液体またはガス状形態中の調製物に製剤化されてよい。本発明は、医用デバイス等をコーティングすることによる組成物の局所投与も検討する。
キット
本実施例は、グリコシル化ムチン様タンパク質(gMLP)が卵巣がんのバイオマーカーであることを実証し、ヒトMLPタンパク質の新規C末端領域を含む組換え融合タンパク質の組換え発現およびタンパク質産生ならびにヒトMLPのC末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の生成を記載している。
背景/原理:
1.rMLP C末端ポリペプチド抗原の発現
図2に示す、HISタグに融合されたC末端領域(ヒトMLPのアミノ酸279〜431、配列番号1として記載)を含む融合タンパク質をコードする核酸配列(配列番号2)をE.coliでの組換え(rMLP)C末端融合タンパク質の発現のためにpRSETB発現ベクター(Invitrogen)にクローニングした。
マウスを精製rMLP C末端タンパク質を用いて免疫化し、次に同じタンパク質を用いて追加免疫した。高力価の抗体を有するマウスを屠殺し、各マウスからの脾臓細胞を標準的手順に従って骨髄腫細胞に融合し、ハイブリドーマ細胞のクローン由来の上清を酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用してスクリーニングした。8個の候補マウスハイブリドーマを分析のために選択した(クローン1、4、5、6、7、11、クローンBおよびクローンCと名付けた)。
マイクロタイターELISAプレート(Maxisorb、Nunc)を、コーティング緩衝液(15mM炭酸ナトリウム無水Na2CO3および炭酸水素ナトリウムNaHCO3、pH9.6)を使用して10.0μg/mlの組換えMLP C末端タンパク質を用いてコーティングした。プレートを一晩、4℃でインキュベートした。翌日、残存タンパク質結合部位をTBS緩衝液(10mM Tris−HCL、140mM NaClおよび10mM CaCl2、pH7.4)中の1%ウシ血清アルブミン(albumen)(BSA)250μLをプレートの各ウェルに加えることによってブロックし、室温で、2時間インキュベートした。次にプレートを0.05%Tween20を含むTBS緩衝液を用いて3回洗浄した。TBS緩衝液中のモノクローナル抗体の系列希釈物(クローン1、4、5、6、7、C、11およびB)を1:100希釈から開始する2連でプレートに加え、2時間、室温でインキュベートした。次にウェルを3回洗浄した。アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体(1:5000希釈)100μLを次に各ウェルに加え、2時間、室温でインキュベートした。プレートを3回洗浄し;次に基質溶液(fast p−Nitrophenyl phosphate tablet sets、Sigma)を加え、20から30分間、室温でインキュベートした。吸光度をBiorad ELISAマイクロタイタープレートリーダーモデル608を使用して405nmで測定した。
検査したmAbクローン8個の内3個(クローン11、BおよびC)は、組換えMLP−C末端タンパク質に対するELISAアッセイにおいて陽性であり、クローンCを用いたシグナルは、クローン11およびBを用いて見られたシグナルより非常に弱かったが、5個のmAbクローンはELISAアッセイにおいて陰性であった(データは示されていない)。mAbクローンBおよび11は、およそ1μg/mlの力価でMLPに対して良好な結合を示した。
マイクロタイターELISAプレート(Maxisorb、Nunc)を、抗MLPモノクローナル抗体クローン11およびクローンBを用いて、コーティング緩衝液(15mM炭酸ナトリウム無水Na2CO3および炭酸水素ナトリウムNaHCO3、pH9.6)を使用する、1μg/mLから開始した0.05μg/mLまでの濃度の系列希釈でコーティングした。プレートを一晩、4℃でインキュベートした。翌日、残存タンパク質結合部位をTBS緩衝液(10mM Tris−HCL、140mM NaClおよび10mM CaCl2、pH7.4)中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)250μLをプレートの各ウェルに加ることによってブロックし、室温で、2時間インキュベートした。次にプレートを0.05%Tween20を含むTBS緩衝液を用いて3回洗浄した。濃度範囲0.01μg/mLから5μg/mLの組換えMLP C末端タンパク質の系列希釈物を2連でプレートに加え、2時間、室温でインキュベートした。次にウェルを3回洗浄した。アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたポリクローナルヤギ抗MLP抗体(1:5000希釈)100μLを次に各ウェルに加え、2時間、室温でインキュベートした。プレートを3回洗浄し;次に基質溶液(fast p−Nitrophenyl phosphate tablet sets、Sigma)を加え、20から30分間、室温でインキュベートした。吸光度をBiorad ELISAマイクロタイタープレートリーダーモデル608を使用して405nmで測定した。陰性対照としてプレートを、抗MLPモノクローナル抗体クローンBまたはクローン11を用いてコーティングし、MLP抗原の代わりにTBS緩衝液だけをmAbコートプレートに加えてポリクローナルヤギ抗MLP抗体を用いて発色させた。
図3Aは、ELISAアッセイによる抗MLP mAbクローンBによるrMLPの検出をグラフで例示する。図3Aに示すとおり、このアッセイの感度は非常に高く、0.01μg/mLの濃度に至るrMLP抗原の検出を示している。図3Aにさらに示すとおり、一次抗体mAbクローンBの0.01625μg/mLに至る希釈は、最大に近いシグナルを生じるように見える。
マイクロタイターELISAプレート(Maxisorb、Nunc)を、抗MLPモノクローナル抗体クローン11を1ウェルあたり0.1μgで用いてコーティング緩衝液(15mM炭酸ナトリウム無水Na2CO3および炭酸水素ナトリウムNaHCO3、pH9.6)を使用してコーティングした。プレートを一晩、4℃でインキュベートした。翌日、残存タンパク質結合部位をTBS緩衝液(10mM Tris−HCL、140mM NaClおよび10mM CaCl2、pH7.4)中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)250μLをプレートの各ウェルに加えることによってブロックし、室温で、2時間インキュベートした。次にプレートを0.05%Tween20を含むTBS緩衝液を用いて3回洗浄した。濃度範囲0.0001μg/mLから1μg/mLの組換えMLP C末端タンパク質の系列希釈物を2連でプレートに加え、2時間、室温でインキュベートした。次にウェルを3回洗浄した。アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたポリクローナルヤギ抗MLP抗体(0.5μg/mL)を次に各ウェルに加え、2時間、室温でインキュベートした。プレートを3回洗浄し;次に基質溶液(fast p−Nitrophenyl phosphate tablet sets、Sigma)を加え、20から30分間、室温でインキュベートした。吸光度をBiorad ELISAマイクロタイタープレートリーダーモデル608を使用して405nmで測定した。陰性対照として、コーティング抗体mAbクローン11を省き、ウェルをrMLPおよびポリクローナルMLP検出抗体の添加に先行してコーティング緩衝液を用いてインキュベートした。
図4は、ELISAアッセイによる抗MLP mAbクローン11を用いたrMLPの検出をグラフで例示する。図4に示すとおり、このサンドイッチELISAアッセイの感度は非常に高く、10ng/mL rMLP未満の濃度に至る直線性を示している。
本実施例は、上皮がん細胞バイオマーカーとしての使用のための抗MLPモノクローナル抗体クローンC、11およびBの分析を記載する。
Panc−1は、ヒト膵臓癌、上皮様細胞系であり、腫瘍原性研究のための非内分泌性膵臓がんのin vitroモデルとして使用される(ATCC CRL−1469)。細胞系A2780は、ヒト卵巣癌がん細胞系である(Louie K.G.ら、Cancer Res 45巻(5号):2110〜5頁、1985年;Hamilton T.C.ら、Seminars in Oncology 11巻(3号):285〜298頁、1984年)。
1.Panc−1(ヒト膵臓がん細胞系)から分泌されるgMLPへの結合に関する抗MLP mAbクローンC、11およびBの分析:
3種の抗MLP mAb(クローンC、11およびB)を、ATCCから得たヒト膵臓細胞系(Panc1)から得られた上清中に存在するgMLPへの結合について次のとおりドットブロットおよびELISAアッセイフォーマットにおいて検査した。
実施例1に記載のとおり生成した3種の抗MLP mAb(クローンC、11およびB)を、ATCCから得たヒト膵臓がん細胞系(Panc−1)に対して検査した。精製抗MLP特異的mAb(クローンC、11およびB)のドットブロット分析を、rMLP C末端タンパク質および、膵臓がん細胞系Panc−1の上清中に存在するグリコシル化全長MLP(gMLP)を用いて実行した。
図5は、Panc1細胞系上清(列A)、rMASP−3ポリペプチド(列B)およびmMLP C末端タンパク質(列C)に対して抗MLPモノクローナル抗体クローンC、クローンBおよびクローン11を用いて実行したドットブロットアッセイの結果を示している。図5に示すとおり、3種すべてのmAb(クローンC、クローンBおよびクローン11)は、Panc−1細胞系の上清に存在するMLP(gMLP)の天然産生グリコシル化形態(列A)、およびrMLP C末端タンパク質対照(列C)に結合することが見出されたが、陰性対照rMASP−3ポリペプチド(列B)には結合しなかった。
3種の抗MLP mAb(クローン11、BおよびC)を卵巣がん細胞系A2789から得られた濃縮上清由来の1.0μg/mlのグリコシル化MLPを用いてコーティングしたELISAプレートを用いて次のとおり検査した。
卵巣がん細胞系A2789由来のgMLPを用いてコーティングしたプレートを用いたELISAアッセイの結果
ドットブロットアッセイを卵巣がん細胞系A2780の上清を使用して上に記載のとおり実行した。4μlのタンパク質(rMLP、A2780上清由来のgMLPまたはrMASP−3)をニトロセルロース膜に滴下し、室温で乾燥させた。次にニトロセルロース膜をPBS中の5%スキムミルクを用いて45から60分間、室温で穏やかに振とうしながらブロックした。次に抗MLP mAbクローンC、11およびB(PBS中5%スキムミルク、容積10mLの1mg/mlプロテインGセファロース濃縮抗体保存液の最終濃度mAb 1:1000希釈)をニトロセルロース膜に加え、室温で、1時間、穏やかに振とうしながらインキュベートした。次に膜をPBSおよび0.05%Tween20を用いて3回洗浄した。1:6000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートした抗マウス抗体を加え、室温で、1時間、穏やかに振とうしながらインキュベートした。次に膜を3回洗浄し、抗体結合をECLキットによって検出した。
図7は、卵巣がん細胞系A2780上清(列A)、rMASP−3タンパク質(列B)およびrMLP C末端タンパク質(列C)に対して抗MLP抗体クローンC、クローンBおよびクローン11を用いて実行したドットブロットアッセイの結果を示している。
図8に示されるとおり、ドットブロット結果をA2780細胞系に由来する濃縮上清を使用するウエスタンブロットによって確認し、特徴的な180kDa gMLPバンド(列1)および28kDa rMLP C末端タンパク質(列3)がクローンC(上パネル)、クローンB(中パネル)およびクローン11(下パネル)を用いて検出され、陰性対照タンパク質rMASP−3(列2)は3種のMLP特異的mAbによって検出されなかった。
3種の抗MLP mAb(クローンC、5、11およびB)を、上に記載される方法を使用して、痕跡量のグリコシル化天然MLPを含有するA2780細胞から得た1μg/mlの濃縮上清を用いてコーティングしたELISAプレートを用いて検査した。
A2780細胞由来のgMLPを用いてコーティングしたプレートを用いたELISAアッセイの結果
これらの結果は、ウエスタンブロットおよびドットブロットによって決定されるとおり、MLP特異的モノクローナル抗体クローン11、BおよびCが、rMLP C末端タンパク質に特異的に結合し、膵臓がん細胞系および卵巣がん細胞系から分泌されるgMLPを検出することができることを実証している。さらに本実施例は、MLP特異的モノクローナル抗体クローン11およびBが、rMLP C末端タンパク質および卵巣がん細胞系から分泌されるgMLPの両方をELISAアッセイフォーマットにおいて検出できることを実証している。
本実施例は、ハイブリドーマクローン11、BおよびCによって産生される抗MLPモノクローナル抗体のVHおよびVL領域をコードするDNAのクローニングおよび配列決定を記載する。
重鎖可変領域(VH)配列
ATCC指定番号PTA−121699として2014年10月30日にATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系によって産生される抗MLPモノクローナル抗体αMLPクローン11のVH領域のアミノ酸配列を、配列番号7として記載する。
ATCC指定番号PTA−121699として2014年10月30日にATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系によって産生される抗MLPモノクローナル抗体αMLPクローン11のVL領域のアミノ酸配列を、配列番号10として記載する。
1.ヒトムチン様タンパク質の配列番号4に記載するC末端領域中のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片。
(i)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(ii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(iii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される1つまたは複数の参照抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部を認識する、第1項に記載の抗体。
(i)CDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3配列を含む重鎖可変領域、ならびに
(ii)CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3を含む軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域CDR−H3配列が、配列番号15、配列番号35、配列番号36または配列番号19に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含み、軽鎖可変領域CDR−L3配列が、配列番号23または配列番号27に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含み、単離抗体が、ヒトムチン様タンパク質(MLP)に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
(i)ATCC指定番号PTA−121699を有する、抗MLPモノクローナル抗体クローン11を分泌するハイブリドーマ細胞系、
(ii)ATCC指定番号PTA−121700を有する、抗MLPモノクローナル抗体クローンBを分泌するハイブリドーマ細胞系、および
(iii)ATCC指定番号PTA−121701を有する、抗MLPモノクローナル抗体クローンCを分泌するハイブリドーマ細胞系
からなる群から選択される細胞系。
(a)in vitroでのイムノアッセイにおいて、被検対象に由来する生物学的試料を抗MLP抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップと、
(b)前記抗体の結合の存在または非存在を検出するステップであって、前記結合の存在が、前記試料中のMLPの前記存在または量を示す、ステップと
を含み、
前記抗体またはその断片が、MLPの配列番号4に記載するC末端領域中のエピトープに結合する、方法。
(i)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(ii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(iii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される参照抗体と同じエピトープに結合するかまたは前記参照抗体とMLPへの結合について競合するモノクローナル抗体である、第56項に記載の方法。
(i)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(ii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(iii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される参照抗体と同じエピトープに結合するかまたは前記参照抗体とMLPへの結合について競合するモノクローナル抗体である、第68項に記載の方法。
(i)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(ii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(iii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される参照抗体と同じエピトープに結合するかまたは前記参照抗体とMLPへの結合について競合するモノクローナル抗体である、第74項に記載の方法。
(a)in vitroでのイムノアッセイにおいて、被検対象に由来する生物学的試料を抗MLP抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップと、
(b)前記抗体の結合の存在または非存在を検出するステップであって、前記結合の存在が、試料中のMLPの存在または量を示す、ステップと
を含み、
抗体またはその断片が、MLPの配列番号4に記載するC末端領域中のエピトープに結合する、方法。
(i)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(ii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(iii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される参照抗体と同じエピトープに結合するかまたは前記参照抗体とMLPへの結合について競合するモノクローナル抗体である、第78項に記載の方法。
(i)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(ii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(iii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される参照抗体と同じエピトープに結合するかまたは前記参照抗体とMLPへの結合について競合するモノクローナル抗体である、第92項に記載の方法。
を提供する。
(i)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(ii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(iii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される参照抗体と同じエピトープに結合するかまたは前記参照抗体とMLPへの結合について競合するモノクローナル抗体である、第98項に記載の方法。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
ヒトムチン様タンパク質の配列番号4に記載するC末端領域中のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片。
(項目2)
以下:
(i)前記抗体が、モノクローナル抗体であること、
(ii)前記抗体が、組換え、ヒト化またはキメラ抗体であること、
(iii)前記抗体が、完全ヒト抗体であること、
(iv)前記抗体またはその抗原結合性断片が、ELISAアッセイフォーマットにおけるように、上皮性がん細胞系から分泌されるグリコシル化ヒトMLPに結合することが可能であること、または
(v)前記抗体またはその抗原結合性断片が、10nM未満のKDでヒトMLPに結合すること
のうち、少なくとも1つが適用される、項目1に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
(項目3)
前記抗体またはその抗原結合性断片が、
(i)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(ii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(iii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される1つまたは複数の参照抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部を認識する、項目1または2に記載の抗体。
(項目4)
以下:
(i)配列番号7、配列番号8および配列番号9からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一である配列を含むかまたはそうした配列からなる、重鎖の可変領域を含むこと、および/または
(ii)配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一である配列を含むかまたはそうした配列からなる、軽鎖の可変領域を含むこと
のうち、少なくとも1つが適用される、項目1から3のいずれかに記載の抗体。
(項目5)
検出可能な部分で標識されており、かつ/または治療剤にカップリングされている、項目1から4のいずれかに記載の抗体。
(項目6)
基材上に固定化されている、項目1から5のいずれかに記載の抗体。
(項目7)
前記抗体またはその抗原結合性断片が、
(i)CDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3配列を含む重鎖可変領域、ならびに
(ii)CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3を含む軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域CDR−H3配列が、配列番号15、配列番号35、配列番号36または配列番号19に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含み、前記軽鎖可変領域CDR−L3配列が、配列番号23または配列番号27に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含み、前記単離抗体が、ヒトムチン様タンパク質(MLP)に結合する、項目1に記載のヒトムチン様タンパク質(MLP)に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
(項目8)
以下:
(i)重鎖可変領域CDR−H2配列が、配列番号20、14、16または18に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含むこと、
(ii)重鎖可変領域CDR−H1配列が、配列番号13または配列番号17に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変を含むこと、
(iii)軽鎖可変領域CDR−L2配列が、配列番号22または配列番号26に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変を含むこと、
(iv)軽鎖可変領域CDR−L1配列が、配列番号28、配列番号21、配列番号24または配列番号25に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変を含むこと、
(v)重鎖可変領域のCDR−H1が、配列番号13を含むこと、
(vi)重鎖可変領域のCDR−H2が、配列番号20を含み、任意選択で、配列番号20に記載する前記アミノ酸配列が、9位においてTを含有すること、
(vii)重鎖可変領域のCDR−H3が、配列番号15を含むこと、
(viii)軽鎖可変領域のCDR−L1が、配列番号28を含み、任意選択で、配列番号28に記載する前記アミノ酸配列が、9位においてTを含有し、任意選択で、配列番号28に記載する前記アミノ酸配列が、9位においてSを含有すること、
(vix)軽鎖可変領域のCDR−L2が、配列番号22を含むこと、
(x)軽鎖可変領域のCDR−L2が、配列番号26を含むこと、
(xi)軽鎖可変領域のCDR−L3が、配列番号23を含むこと、
(xii)前記抗体が、(i)CDR−H1(配列番号13)、CDR−H2(配列番号14)およびCDR−H3(配列番号15、配列番号35または配列番号36)を含む重鎖可変領域、ならびに(ii)CDR−L1(配列番号21)、CDR−L2(配列番号22)およびCDR−L3(配列番号23)を含む軽鎖可変領域、ならびにそれらの保存的改変を含むこと、
(xiii)前記抗体が、CDR−H1(配列番号13)、CDR−H2(配列番号16)およびCDR−H3(配列番号15)を含む重鎖可変領域、ならびに(ii)CDR−L1(配列番号24)、CDR−L2(配列番号22)およびCDR−L3(配列番号23)を含む軽鎖可変領域、ならびにそれらの保存的改変を含むこと、
(xiv)前記抗体が、(i)CDR−H1(配列番号17)、CDR−H2(配列番号18)およびCDR−H3(配列番号19)を含む重鎖可変領域、ならびに(ii)CDR−L1(配列番号25)、CDR−L2(配列番号26)およびCDR−L3(配列番号27)を含む軽鎖可変領域、ならびにそれらの保存的改変を含むこと、
(xv)前記抗体が、配列番号7を含む重鎖可変ドメインまたは配列番号7と少なくとも90%同一の配列を有するそのバリアントを含むこと、
(xvi)前記抗体が、配列番号8を含む重鎖可変ドメインまたは配列番号8と少なくとも90%同一である配列を有するそのバリアントを含むこと、または
(xvii)前記抗体が、配列番号9を含む重鎖可変ドメインまたは配列番号9と少なくとも90%同一である配列を有するそのバリアントを含むこと
のうち、少なくとも1つが適用される、項目1に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
(項目9)
前記抗体またはその抗原結合性断片が、Fab、Fab’断片、F(ab’)2断片、全抗体、単鎖抗体、ScFv、およびヒンジ領域を欠く一価の抗体からなる群から選択される、項目1から8のいずれかに記載の単離抗体。
(項目10)
項目7から9のいずれかに記載の抗MLP抗体またはその断片のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
(項目11)
項目10に記載の本発明の抗MLP抗体をコードする核酸分子を含む発現カセット。
(項目12)
項目10または項目11に記載の本発明の抗MLP抗体をコードする核酸分子のうちの少なくとも1つを含む細胞。
(項目13)
(i)2014年10月30日にATCCに寄託された、ATCC指定番号PTA−121699を有するハイブリドーマ細胞系により産生される、クローン11として指定される抗MLPモノクローナル抗体、
(ii)2014年10月30日にATCCに寄託された、ATCC指定番号PTA−121700を有するハイブリドーマ細胞系により産生される、クローンBとして指定される抗MLPモノクローナル抗体、および
(iii)2014年10月30日にATCCに寄託された、ATCC指定番号PTA−121701を有するハイブリドーマ細胞系により産生される、クローンCとして指定される抗MLPモノクローナル抗体
からなる群から選択される抗MLPモノクローナル抗体。
(項目14)
抗MLP抗体を産生するハイブリドーマ細胞系であって、
(i)ATCC指定番号PTA−121699を有する、抗MLPモノクローナル抗体クローン11を分泌するハイブリドーマ細胞系、
(ii)ATCC指定番号PTA−121700を有する、抗MLPモノクローナル抗体クローンBを分泌するハイブリドーマ細胞系、および
(iii)ATCC指定番号PTA−121701を有する、抗MLPモノクローナル抗体クローンCを分泌するハイブリドーマ細胞系
からなる群から選択される細胞系。
(項目15)
(i)配列番号1または配列番号1に対して少なくとも95%の同一性を有するそのバリアントを含むポリペプチド、
(ii)配列番号4のアミノ酸配列または配列番号4に対して少なくとも95%の同一性を有するそのバリアントを含むポリペプチド、
(iii)配列番号5のアミノ酸配列または配列番号5に対して少なくとも95%の同一性を有するそのバリアントを含むポリペプチド、および
(iv)配列番号6のアミノ酸配列または配列番号6に対して少なくとも95%の同一性を有するそのバリアントを含むポリペプチド
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離MLPポリペプチド。
(項目16)
単離抗MLP抗体を生成する方法であって、項目12または14に記載の細胞を、前記抗MLP抗体をコードする核酸分子の発現を可能にする条件下で培養するステップと、前記抗MLP抗体を単離するステップとを含む方法。
(項目17)
被検対象に由来する生物学的試料中のMLPの存在または量を決定することによって、上皮性がんを検出または診断する方法であって、
(a)in vitroでのイムノアッセイにおいて、被検対象に由来する生物学的試料を抗MLP抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップと、
(b)前記抗体の結合の存在または非存在を検出するステップであって、前記結合の存在が、前記試料中のMLPの前記存在または量を示す、ステップと
を含み、
前記抗体またはその断片が、MLPの配列番号4に記載するC末端領域中のエピトープに結合する、方法。
(項目18)
前記抗MLP抗体が、検出可能な部分で標識されており、ステップ(b)が、前記検出可能な部分の前記存在または量を検出することを含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
ステップ(b)に従って検出したMLPの前記量を、参照標準または健常対象に由来する対照試料と比較するステップをさらに含み、前記対照試料(または参照標準)と比較する場合の、被検試料中のMLPのレベルの少なくとも2倍またはそれより大きな(例えば、少なくとも5倍または少なくとも10倍の)増加が、前記被検対象における、卵巣がんまたは膵臓がん等の上皮性がんの存在またはそれらを発症するリスクの増加を示す、項目17または18に記載の方法。
(項目20)
前記生物学的試料が、血液、血清、血漿および組織からなる群から選択される、項目17に記載の方法。
(項目21)
前記抗MLP抗体またはその断片が、
(i)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(ii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(iii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される参照抗体と同じエピトープに結合するかまたは前記参照抗体とMLPへの結合について競合するモノクローナル抗体である、項目17に記載の方法。
(項目22)
前記抗MLP抗体またはその断片が、配列番号15、配列番号35、配列番号36または配列番号19に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含む重鎖可変領域CDR−H3配列を有し、配列番号23または配列番号27に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含む軽鎖可変領域CDR−L3配列を有するモノクローナル抗体である、項目17に記載の方法。
(項目23)
前記抗MLP抗体またはその断片が、表1に記載する重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域ならびにそれらの保存的改変配列を含むモノクローナル抗体である、項目17に記載の方法。
(項目24)
卵巣がんおよび/または膵臓がんのバイオマーカーに結合する1つまたは複数の追加の抗体を用いるイムノアッセイを実施するステップをさらに含む、項目17に記載の方法。
(項目25)
前記被検対象が、(i)明らかに健常である、(ii)卵巣がんまたは膵臓がんの家族歴を有する、(iii)卵巣がんと関連がある1つまたは複数の症状を経験している、または(iv)卵巣がんまたは膵臓がんに罹患していることが分かっており、卵巣がんまたは膵臓がんのための治療を受けたことがあるかまたは現時点で受けている、項目17に記載の方法。
(項目26)
前記被検対象から得られた生物学的試料からの前記アッセイの結果を、1つまたは複数の時点で比較して、治療レジメンの効能を評価するステップをさらに含む、項目17に記載の方法。
(項目27)
前記抗MLP抗体が、基材上に固定化されている、項目17に記載の方法。
(項目28)
前記イムノアッセイが、ELISAアッセイである、項目17に記載の方法。
(項目29)
被検対象中のムチンを分泌するがんの存在を検出または診断する方法であって、(a)MLPの配列番号4に記載するC末端領域中のエピトープに結合するヒト化もしくは完全ヒト抗MLP抗体またはその抗原結合性断片を生存被検対象に投与するステップと、(b)MLPに結合している前記抗体またはその断片の存在もしくは非存在または量を検出するステップとを含み、前記対象中のMLPの前記存在または量の検出が、ムチンを分泌するがんの存在を示す、方法。
(項目30)
前記ムチンを分泌するがんが、卵巣がん、膵臓がん、結腸直腸がん、乳がん、虫垂がん、肺がん、腎臓がん、子宮頚がん、胆道がん、食道がん、および上皮性皮膚がんからなる群から選択される、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記抗MLP抗体が、in vivoでの使用に適切な、検出可能な部分で標識されており、ステップ(b)が、前記検出可能な部分の存在または量を検出することを含む、項目29または30に記載の方法。
(項目32)
画像化手順、手術中の手順、内視鏡的手順または血管内の手順において使用される、項目29から31のいずれかに記載の方法。
(項目33)
前記抗MLP抗体またはその断片が、
(i)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(ii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(iii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される参照抗体と同じエピトープに結合するかまたは前記参照抗体とMLPへの結合について競合するモノクローナル抗体である、項目29に記載の方法。
(項目34)
前記抗MLP抗体またはその断片が、配列番号15、配列番号35、配列番号36または配列番号19に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含む重鎖可変領域CDR−H3配列を有し、配列番号23または配列番号27に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含む軽鎖可変領域CDR−L3配列を有するモノクローナル抗体である、項目29に記載の方法。
(項目35)
前記被検対象が、(i)明らかに健常である、(ii)卵巣がんまたは膵臓がんの家族歴を有する、(iii)卵巣がんと関連がある1つまたは複数の症状を経験している、または(iv)卵巣がんまたは膵臓がんに罹患していることが分かっており、卵巣がんまたは膵臓がんのための治療を受けたことがあるかまたは現時点で受けている、項目30に記載の方法。
(項目36)
卵巣がんまたは膵臓がんに罹患している対象を治療する方法であって、MLPの配列番号4に記載するC末端領域中のエピトープに結合するヒト化もしくは完全ヒト抗MLP抗体またはその抗原結合性断片を卵巣がんまたは膵臓がんに罹患している個体に投与するステップを含み、前記抗体またはその断片が、治療剤にカップリングされている、方法。
(項目37)
前記治療剤が、化学療法剤である、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記抗MLP抗体またはその断片が、
(i)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(ii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(iii)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される参照抗体と同じエピトープに結合するかまたは前記参照抗体とMLPへの結合について競合するモノクローナル抗体である、項目36に記載の方法。
(項目39)
前記抗MLP抗体またはその断片が、配列番号15、配列番号35、配列番号36または配列番号19に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含む重鎖可変領域CDR−H3配列を有し、配列番号23または配列番号27に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含む軽鎖可変領域CDR−L3配列を有するモノクローナル抗体である、項目36に記載の方法。
(項目40)
項目1から13のいずれかに記載の抗MLP抗体を含む組成物。
(項目41)
項目1から13のいずれかに記載の抗MLP抗体を少なくとも1つ含む、イムノアッセイにおける使用のための基材。
(項目42)
(a)少なくとも1つの容器、および(b)項目1から13のいずれかに記載の抗MLP抗体を少なくとも1つ含む、生物学的試料中のMLPの存在を検出するためのキット。
Claims (42)
- ヒトムチン様タンパク質の配列番号4に記載するC末端領域中のエピトープに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片。
- 以下:
(i)前記抗体が、モノクローナル抗体であること、
(ii)前記抗体が、組換え、ヒト化またはキメラ抗体であること、
(iii)前記抗体が、完全ヒト抗体であること、
(iv)前記抗体またはその抗原結合性断片が、ELISAアッセイフォーマットにおけるように、上皮性がん細胞系から分泌されるグリコシル化ヒトMLPに結合することが可能であること、または
(v)前記抗体またはその抗原結合性断片が、10nM未満のKDでヒトMLPに結合すること
のうち、少なくとも1つが適用される、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性断片。 - 前記抗体またはその抗原結合性断片が、
(iv)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(v)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(vi)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される1つまたは複数の参照抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部を認識する、請求項1または2に記載の抗体。 - 以下:
(i)配列番号7、配列番号8および配列番号9からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一である配列を含むかまたはそうした配列からなる、重鎖の可変領域を含むこと、および/または
(ii)配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一である配列を含むかまたはそうした配列からなる、軽鎖の可変領域を含むこと
のうち、少なくとも1つが適用される、請求項1から3のいずれかに記載の抗体。 - 検出可能な部分で標識されており、かつ/または治療剤にカップリングされている、請求項1から4のいずれかに記載の抗体。
- 基材上に固定化されている、請求項1から5のいずれかに記載の抗体。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、
(i)CDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3配列を含む重鎖可変領域、ならびに
(ii)CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3を含む軽鎖可変領域
を含み、
前記重鎖可変領域CDR−H3配列が、配列番号15、配列番号35、配列番号36または配列番号19に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含み、前記軽鎖可変領域CDR−L3配列が、配列番号23または配列番号27に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含み、前記単離抗体が、ヒトムチン様タンパク質(MLP)に結合する、請求項1に記載のヒトムチン様タンパク質(MLP)に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。 - 以下:
(i)重鎖可変領域CDR−H2配列が、配列番号20、14、16または18に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含むこと、
(ii)重鎖可変領域CDR−H1配列が、配列番号13または配列番号17に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変を含むこと、
(iii)軽鎖可変領域CDR−L2配列が、配列番号22または配列番号26に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変を含むこと、
(iv)軽鎖可変領域CDR−L1配列が、配列番号28、配列番号21、配列番号24または配列番号25に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変を含むこと、
(v)重鎖可変領域のCDR−H1が、配列番号13を含むこと、
(vi)重鎖可変領域のCDR−H2が、配列番号20を含み、任意選択で、配列番号20に記載する前記アミノ酸配列が、9位においてTを含有すること、
(vii)重鎖可変領域のCDR−H3が、配列番号15を含むこと、
(viii)軽鎖可変領域のCDR−L1が、配列番号28を含み、任意選択で、配列番号28に記載する前記アミノ酸配列が、9位においてTを含有し、任意選択で、配列番号28に記載する前記アミノ酸配列が、9位においてSを含有すること、
(vix)軽鎖可変領域のCDR−L2が、配列番号22を含むこと、
(x)軽鎖可変領域のCDR−L2が、配列番号26を含むこと、
(xi)軽鎖可変領域のCDR−L3が、配列番号23を含むこと、
(xii)前記抗体が、(i)CDR−H1(配列番号13)、CDR−H2(配列番号14)およびCDR−H3(配列番号15、配列番号35または配列番号36)を含む重鎖可変領域、ならびに(ii)CDR−L1(配列番号21)、CDR−L2(配列番号22)およびCDR−L3(配列番号23)を含む軽鎖可変領域、ならびにそれらの保存的改変を含むこと、
(xiii)前記抗体が、CDR−H1(配列番号13)、CDR−H2(配列番号16)およびCDR−H3(配列番号15)を含む重鎖可変領域、ならびに(ii)CDR−L1(配列番号24)、CDR−L2(配列番号22)およびCDR−L3(配列番号23)を含む軽鎖可変領域、ならびにそれらの保存的改変を含むこと、
(xiv)前記抗体が、(i)CDR−H1(配列番号17)、CDR−H2(配列番号18)およびCDR−H3(配列番号19)を含む重鎖可変領域、ならびに(ii)CDR−L1(配列番号25)、CDR−L2(配列番号26)およびCDR−L3(配列番号27)を含む軽鎖可変領域、ならびにそれらの保存的改変を含むこと、
(xv)前記抗体が、配列番号7を含む重鎖可変ドメインまたは配列番号7と少なくとも90%同一の配列を有するそのバリアントを含むこと、
(xvi)前記抗体が、配列番号8を含む重鎖可変ドメインまたは配列番号8と少なくとも90%同一である配列を有するそのバリアントを含むこと、または
(xvii)前記抗体が、配列番号9を含む重鎖可変ドメインまたは配列番号9と少なくとも90%同一である配列を有するそのバリアントを含むこと
のうち、少なくとも1つが適用される、請求項1に記載の単離抗体または抗原結合性断片。 - 前記抗体またはその抗原結合性断片が、Fab、Fab’断片、F(ab’)2断片、全抗体、単鎖抗体、ScFv、およびヒンジ領域を欠く一価の抗体からなる群から選択される、請求項1から8のいずれかに記載の単離抗体。
- 請求項7から9のいずれかに記載の抗MLP抗体またはその断片のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
- 請求項10に記載の本発明の抗MLP抗体をコードする核酸分子を含む発現カセット。
- 請求項10または請求項11に記載の本発明の抗MLP抗体をコードする核酸分子のうちの少なくとも1つを含む細胞。
- (i)2014年10月30日にATCCに寄託された、ATCC指定番号PTA−121699を有するハイブリドーマ細胞系により産生される、クローン11として指定される抗MLPモノクローナル抗体、
(ii)2014年10月30日にATCCに寄託された、ATCC指定番号PTA−121700を有するハイブリドーマ細胞系により産生される、クローンBとして指定される抗MLPモノクローナル抗体、および
(iii)2014年10月30日にATCCに寄託された、ATCC指定番号PTA−121701を有するハイブリドーマ細胞系により産生される、クローンCとして指定される抗MLPモノクローナル抗体
からなる群から選択される抗MLPモノクローナル抗体。 - 抗MLP抗体を産生するハイブリドーマ細胞系であって、
(i)ATCC指定番号PTA−121699を有する、抗MLPモノクローナル抗体クローン11を分泌するハイブリドーマ細胞系、
(ii)ATCC指定番号PTA−121700を有する、抗MLPモノクローナル抗体クローンBを分泌するハイブリドーマ細胞系、および
(iii)ATCC指定番号PTA−121701を有する、抗MLPモノクローナル抗体クローンCを分泌するハイブリドーマ細胞系
からなる群から選択される細胞系。 - (i)配列番号1または配列番号1に対して少なくとも95%の同一性を有するそのバリアントを含むポリペプチド、
(ii)配列番号4のアミノ酸配列または配列番号4に対して少なくとも95%の同一性を有するそのバリアントを含むポリペプチド、
(iii)配列番号5のアミノ酸配列または配列番号5に対して少なくとも95%の同一性を有するそのバリアントを含むポリペプチド、および
(iv)配列番号6のアミノ酸配列または配列番号6に対して少なくとも95%の同一性を有するそのバリアントを含むポリペプチド
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離MLPポリペプチド。 - 単離抗MLP抗体を生成する方法であって、請求項12または14に記載の細胞を、前記抗MLP抗体をコードする核酸分子の発現を可能にする条件下で培養するステップと、前記抗MLP抗体を単離するステップとを含む方法。
- 被検対象に由来する生物学的試料中のMLPの存在または量を決定することによって、上皮性がんを検出または診断する方法であって、
(a)in vitroでのイムノアッセイにおいて、被検対象に由来する生物学的試料を抗MLP抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップと、
(b)前記抗体の結合の存在または非存在を検出するステップであって、前記結合の存在が、前記試料中のMLPの前記存在または量を示す、ステップと
を含み、
前記抗体またはその断片が、MLPの配列番号4に記載するC末端領域中のエピトープに結合する、方法。 - 前記抗MLP抗体が、検出可能な部分で標識されており、ステップ(b)が、前記検出可能な部分の前記存在または量を検出することを含む、請求項17に記載の方法。
- ステップ(b)に従って検出したMLPの前記量を、参照標準または健常対象に由来する対照試料と比較するステップをさらに含み、前記対照試料(または参照標準)と比較する場合の、被検試料中のMLPのレベルの少なくとも2倍またはそれより大きな(例えば、少なくとも5倍または少なくとも10倍の)増加が、前記被検対象における、卵巣がんまたは膵臓がん等の上皮性がんの存在またはそれらを発症するリスクの増加を示す、請求項17または18に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、血液、血清、血漿および組織からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記抗MLP抗体またはその断片が、
(iv)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(v)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(vi)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される参照抗体と同じエピトープに結合するかまたは前記参照抗体とMLPへの結合について競合するモノクローナル抗体である、請求項17に記載の方法。 - 前記抗MLP抗体またはその断片が、配列番号15、配列番号35、配列番号36または配列番号19に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含む重鎖可変領域CDR−H3配列を有し、配列番号23または配列番号27に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含む軽鎖可変領域CDR−L3配列を有するモノクローナル抗体である、請求項17に記載の方法。
- 前記抗MLP抗体またはその断片が、表1に記載する重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域ならびにそれらの保存的改変配列を含むモノクローナル抗体である、請求項17に記載の方法。
- 卵巣がんおよび/または膵臓がんのバイオマーカーに結合する1つまたは複数の追加の抗体を用いるイムノアッセイを実施するステップをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記被検対象が、(i)明らかに健常である、(ii)卵巣がんまたは膵臓がんの家族歴を有する、(iii)卵巣がんと関連がある1つまたは複数の症状を経験している、または(iv)卵巣がんまたは膵臓がんに罹患していることが分かっており、卵巣がんまたは膵臓がんのための治療を受けたことがあるかまたは現時点で受けている、請求項17に記載の方法。
- 前記被検対象から得られた生物学的試料からの前記アッセイの結果を、1つまたは複数の時点で比較して、治療レジメンの効能を評価するステップをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記抗MLP抗体が、基材上に固定化されている、請求項17に記載の方法。
- 前記イムノアッセイが、ELISAアッセイである、請求項17に記載の方法。
- 被検対象中のムチンを分泌するがんの存在を検出または診断する方法であって、(a)MLPの配列番号4に記載するC末端領域中のエピトープに結合するヒト化もしくは完全ヒト抗MLP抗体またはその抗原結合性断片を生存被検対象に投与するステップと、(b)MLPに結合している前記抗体またはその断片の存在もしくは非存在または量を検出するステップとを含み、前記対象中のMLPの前記存在または量の検出が、ムチンを分泌するがんの存在を示す、方法。
- 前記ムチンを分泌するがんが、卵巣がん、膵臓がん、結腸直腸がん、乳がん、虫垂がん、肺がん、腎臓がん、子宮頚がん、胆道がん、食道がん、および上皮性皮膚がんからなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記抗MLP抗体が、in vivoでの使用に適切な、検出可能な部分で標識されており、ステップ(b)が、前記検出可能な部分の存在または量を検出することを含む、請求項29または30に記載の方法。
- 画像化手順、手術中の手順、内視鏡的手順または血管内の手順において使用される、請求項29から31のいずれかに記載の方法。
- 前記抗MLP抗体またはその断片が、
(iv)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(v)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(vi)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される参照抗体と同じエピトープに結合するかまたは前記参照抗体とMLPへの結合について競合するモノクローナル抗体である、請求項29に記載の方法。 - 前記抗MLP抗体またはその断片が、配列番号15、配列番号35、配列番号36または配列番号19に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含む重鎖可変領域CDR−H3配列を有し、配列番号23または配列番号27に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含む軽鎖可変領域CDR−L3配列を有するモノクローナル抗体である、請求項29に記載の方法。
- 前記被検対象が、(i)明らかに健常である、(ii)卵巣がんまたは膵臓がんの家族歴を有する、(iii)卵巣がんと関連がある1つまたは複数の症状を経験している、または(iv)卵巣がんまたは膵臓がんに罹患していることが分かっており、卵巣がんまたは膵臓がんのための治療を受けたことがあるかまたは現時点で受けている、請求項30に記載の方法。
- 卵巣がんまたは膵臓がんに罹患している対象を治療する方法であって、MLPの配列番号4に記載するC末端領域中のエピトープに結合するヒト化もしくは完全ヒト抗MLP抗体またはその抗原結合性断片を卵巣がんまたは膵臓がんに罹患している個体に投与するステップを含み、前記抗体またはその断片が、治療剤にカップリングされている、方法。
- 前記治療剤が、化学療法剤である、請求項36に記載の方法。
- 前記抗MLP抗体またはその断片が、
(iv)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121699でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローン11、
(v)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121700でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンB、および
(vi)2014年10月30日にATCC指定番号PTA−121701でATCCに寄託したハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗MLP抗体クローンC
からなる群から選択される参照抗体と同じエピトープに結合するかまたは前記参照抗体とMLPへの結合について競合するモノクローナル抗体である、請求項36に記載の方法。 - 前記抗MLP抗体またはその断片が、配列番号15、配列番号35、配列番号36または配列番号19に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含む重鎖可変領域CDR−H3配列を有し、配列番号23または配列番号27に記載するアミノ酸配列およびそれらの保存的改変配列を含む軽鎖可変領域CDR−L3配列を有するモノクローナル抗体である、請求項36に記載の方法。
- 請求項1から13のいずれかに記載の抗MLP抗体を含む組成物。
- 請求項1から13のいずれかに記載の抗MLP抗体を少なくとも1つ含む、イムノアッセイにおける使用のための基材。
- (a)少なくとも1つの容器、および(b)請求項1から13のいずれかに記載の抗MLP抗体を少なくとも1つ含む、生物学的試料中のMLPの存在を検出するためのキット。
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