JP7650467B2 - 自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の判定方法、並びに炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤 - Google Patents

自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の判定方法、並びに炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤 Download PDF

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Description

本発明は、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の判定方法、並びに炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤に関する。
ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ；マイクロＲＮＡ）とは、タンパク質に翻訳されない約１７～２４ヌクレオチドからなる非コードＲＮＡである。ヒトのｍｉＲＮＡは、現在２５００種類以上が発見されている。このｍｉＲＮＡは、自分自身と相補的な標的部位をもつ様々な遺伝子の翻訳を抑制する働きがあり、細胞の発生、分化、増殖、細胞死等の基本的な生物学的機能を制御している。このようにマイクロＲＮＡは細胞内の多くの遺伝子の発現制御を行っているため、その発現の変化は疾患の発生や進行等に関連すると考えられており、マイクロＲＮＡを疾患の診断、早期発見に利用しようという研究が行われている。
例えば、癌とｍｉＲＮＡとの関連について、Ｃａｌｉｎらは、リンパ性白血病において、ｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６が頻繁にダウンレギュレーションしていることを報告している（非特許文献１参照；Ｃａｌｉｎ ＧＡ，Ｄｕｍｉｔｒｕ ＣＤ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｍら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２，ｖｏｌ．９９，ｐ．１５５２４－９）。また、Ｍｉｃｈａｅｌらは、ヒト大腸癌においてｍｉＲ－１４３及びｍｉＲ－１４５の発現が低下していることを報告している（非特許文献２参照；Ｍｉｃｈａｅｌ ＭＺ， ＳＭ ＯＣ， ｖａｎ Ｈｏｌｓｔ Ｐｅｌｌｅｋａａｎ ＮＧ，Ｙｏｕｎｇ ＧＰ，Ｊａｍｅｓ ＲＪ，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００３，ｖｏｌ．１，ｐ．８８２－９１）。組織がん細胞中に特定のｍｉＲＮＡが存在しているという報告（特許文献１参照；特開２００９－１００６８７号公報）等もある。このように、ｍｉＲＮＡは、がん等の疾病と深い関わりがあり、それらの診断、予後予測等に利用できる可能性があると考えられている。
一方、難治性眼表面疾患であるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）の診断や予後予測等にｍｉＲＮＡを用いることができるという報告はない。ＳＪＳを始めとする炎症性疾患や、その他自己免疫疾患の診断や予後予測等を高い確度で簡便に行う方法が強く求められている。
特開２００９－１００６８７号公報
Ｃａｌｉｎ ＧＡ，Ｄｕｍｉｔｒｕ ＣＤ，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｍら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２，ｖｏｌ．９９，ｐ．１５５２４－９ Ｍｉｃｈａｅｌ ＭＺ， ＳＭ ＯＣ， ｖａｎ Ｈｏｌｓｔ Ｐｅｌｌｅｋａａｎ ＮＧ，Ｙｏｕｎｇ ＧＰ，Ｊａｍｅｓ ＲＪ，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００３，ｖｏｌ．１，ｐ．８８２－９１
本発明は、上述のような状況の中、難治性眼表面疾患であるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）を始めとする炎症性疾患や、その他自己免疫疾患の罹患可能性、発症及び／又は重症化リスク、治療効果等の判定が可能な新規方法を提供することを目的とする。
本発明は、難治性眼表面疾患であるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）を始めとする炎症性疾患や、その他自己免疫疾患の新規治療剤を提供することも目的とする。
前記課題を解決するために、本発明者が種々検討した結果、難治性眼表面疾患であるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）患者の手術時に摘出される結膜組織の結膜上皮組織等において、特定のマイクロＲＮＡの発現パターンが、健常人と大きく異なっていることを見出し、これらのマイクロＲＮＡを指標として、疾患の罹患可能性、重症度、発症及び／又は重症化リスク、治療効果等の判定を行う新規の判定方法を完成させた。また、これらのうちの特定のマイクロＲＮＡの阻害剤が、疾患治療に有効であることを示す結果が得られ、新規治療剤としての可能性が強く示唆された。すなわち本発明の要旨は、以下の通りである。
［１］生体試料中のｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｃ、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５から成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを指標とする、被験者における自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の判定方法。
［２］被験者における自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の罹患可能性を判定する、［１］に記載の判定方法。
［３］被験者における自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の重症度を判定する、［１］に記載の判定方法。
［４］被験者における自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の発症及び／又は重症化リスクを判定する、［１］に記載の判定方法。
［５］被験者における自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の治療効果を判定する、［１］に記載の判定方法。
［６］上記生体試料が、被験者の上皮細胞、血液（血清、血漿、全血等）、涙液から成る群より選択される少なくとも１種である、［１］から［５］のいずれかに記載の判定方法。
［７］ｍｉＲ－４５５－３ｐ阻害剤を有効成分とする、炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤。
［８］上記ｍｉＲ－４５５－３ｐ阻害剤が、生体におけるｍｉＲ－４５５－３ｐの発現及び／又は機能を阻害する、［７］に記載の予防及び／又は治療剤。
［９］上記ｍｉＲ－４５５－３ｐ阻害剤が、核酸オリゴ、低分子化合物、及びＨｓａ－ｍｉＲ－４５５－３ｐ抗体から成る群より選択される少なくとも１種である、［７］又は［８］に記載の予防及び／又は治療剤。
［１０］上記ｍｉＲ－４５５－３ｐ阻害剤が、核酸オリゴである、［９］に記載の予防及び／又は治療剤。
［１１］上記核酸オリゴが、天然及び非天然のＲＮＡ又はＤＮＡからなるオリゴである、［１０］に記載の予防及び／又は治療剤。
［１２］上記核酸オリゴが、ｍｉＲ－４５５－３ｐのアンチセンスオリゴである、［１１］に記載の予防及び／又は治療剤。
［１３］上記核酸オリゴが、修飾されている、［１０］から［１２］のいずれかに記載の予防及び／又は治療剤。
本発明によると、難治性眼表面疾患であるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）を始めとする炎症性疾患や、その他自己免疫疾患の罹患可能性、重症度、発症及び／又は重症化リスク、治療効果等の判定が可能となる。具体的には、ＳＪＳ疾患特異的に発現が変動するマイクロＲＮＡは、医学的に有用な生物学的指標となり、また、疾患重症度と相関するマイクロＲＮＡは、治療効果の評価を可能とする。本発明は、難治性眼表面疾患の結膜上皮組織を標的とする疾患特異的マイクロＲＮＡ発現プロファイリンクによる非侵襲的な診断技術の確立と治療法選択への活用という新しい医療技術の提供につながる。さらに本発明によると、難治性眼表面疾患であるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）を始めとする炎症性疾患や、その他自己免疫疾患の新規治療剤を提供することもできる。
ＳＪＳ患者と健常対照の結膜上皮細胞のｍｉＲＮＡ発現の比較結果（定量ＰＣＲ）を示す。 ＳＪＳ患者と健常対照の結膜上皮細胞のｍｉＲＮＡ発現の比較結果（定量ＰＣＲ）を示す。 ＳＪＳ患者と健常対照の結膜上皮細胞のｍｉＲＮＡ発現の比較結果（定量ＰＣＲ）を示す。 ヒトｍｉＲＮＡの測定系によるＳＪＳ患者と健常対照の結膜上皮細胞のｍｉＲＮＡ発現の比較結果（定量ＰＣＲ）を示す。 ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞におけるＡＮＫＲＤ１、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ２、ＧＥＭ、ＰＴＧＳ２、ＲＮＡＳＥ８の定量ＰＣＲの結果を示す。 ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞におけるＩＬ６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２０、ＫＰＲＰの定量ＰＣＲの結果を示す。 ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞におけるＳＬＩＴＲＫ６の定量ＰＣＲの結果を示す。 ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が増強されたヒト培養結膜上皮細胞におけるＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＣＴＧＦ、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ２、ＰＴＧＳ２、ＣＸＣＬ８の定量ＰＣＲの結果を示す。 ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞におけるＩＬ１ＲＬ１、ＣＴＧＦ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＡＤＭ、ＳＥＲＰＩＮＢ２の定量ＰＣＲの結果を示す。 マウス接触性皮膚炎モデルにおけるＡＮＫＲＤ１、ＣＸＣＬ２、ＰＴＧＳ２、ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２０の定量ＰＣＲの結果を示す。 マウス接触性皮膚炎モデルにおけるＩＬ１ＲＬ１、ＳＥＲＰＩＮＢ２の定量ＰＣＲの結果を示す。
以下、本発明について詳細に説明する。なお、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。
［自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の判定方法］
本発明の自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の判定方法は、生体試料中のｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｃ、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５から成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」と表記することもある）を指標とすることを特徴とする。本発明の判定方法は、被験者における、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の罹患可能性、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の重症度、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の発症及び／又は重症化リスク、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の治療効果を判定する方法である。
本発明におけるマイクロＲＮＡの由来となる生物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を好適に例示することができ、中でもヒト、マウスをより好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。本発明のマイクロＲＮＡであるｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｃ、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５－５ｐの各ヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号６６～７４に示される。マイクロＲＮＡの配列は特に哺乳動物間では保存性が高く、ヒト以外の哺乳動物においてもヒトと同様の発現プロファイルを示す可能性が高い。
また、本発明におけるマイクロＲＮＡには、配列番号６６～７４に示されるヌクレオチド配列において１若しくは２個以上のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたＲＮＡからなるマイクロＲＮＡが含まれる。上記の「１若しくは２個以上」としては、１～５個が好ましく、１～３個がより好ましく、１～２個がさらに好ましく、１個が特に好ましい。なお、上記のヌクレオチド配列からなるＲＮＡが、患者の試料においてコントロールと比較して発現が増加又は低下するかどうかは、例えば後述のマイクロアレイ法や定量ＰＣＲ法により容易に確認することができる。なお、ヒト以外の上記の各生物からの本件マイクロＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されている情報に基づいて確認又は特定することができる。
本発明の判定方法が適用される自己免疫疾患としては、例えば、自己免疫性肝炎、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、内耳自己免疫疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、心筋症、セリアックスプルー－ヘルペス状皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＰＤ）、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、デゴス病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、実験的自己免疫型脳脊髄炎（ＥＡＥ）、線維筋痛－線維筋炎、グレーヴス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン－依存型糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変症、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症（全身性進行性硬化症（ＰＳＳ）、全身性硬化症（ＳＳ）としても公知）、シェーグレン症候群、スティッフパーソン症候群、全身性紅斑性狼瘡、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑及びヴェーゲナー肉芽腫症等が挙げられる。
本発明の判定方法が適用される炎症性疾患としては、例えば、スティーブンス・ジョンソン症候群、皮膚炎疾患（すなわち、乾癬、湿疹、火傷、皮膚炎）、関節炎（関節リウマチ、脊椎関節症、痛風関節炎、変性関節疾患（すなわち、変形性関節症）、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、未分化脊椎炎、ベーチェット病、溶血性自己免疫性貧血、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、穀粉症、急性肩痛、乾癬性関節炎、若年性関節炎を含む）、喘息、アテローム性動脈硬化、骨粗鬆症、気管支炎、腱炎、滑液包炎、遺尿症、好酸球性疾患、消化管疾患（炎症性腸疾患、消化性潰瘍、限局性腸炎、憩室炎、消化管出血、クローン病、胃炎、下痢症、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎を含む）、胃食道逆流症、好酸球性食道炎、胃不全麻痺（例えば、糖尿病性胃不全麻痺等）、食物不耐性、食物アレルギー、その他の機能性腸疾患（例えば、非潰瘍性消化不良、非心臓性胸痛等）等が挙げられる。これらのうち、本発明の判定方法が好適に適用される炎症性疾患としては、スティーブンス・ジョンソン症候群、皮膚炎疾患が好ましく、スティーブンス・ジョンソン症候群がより好ましい。
本発明の判定方法としては、
（Ａ）被験者の生体試料中（上皮細胞、血液（血清、血漿、全血等）、涙液）及びコントロールとしての正常被検者の生体試料中のＲＮＡを抽出する工程、
（Ｂ）抽出したＲＮＡ中の、特定のマイクロＲＮＡの発現量を測定する工程、
（Ｃ）コントロールと被験者の生体試料におけるマイクロＲＮＡの発現量を比較し、判定する工程
を備えている限り特に制限されない。なお、上記特定のマイクロＲＮＡとは、ｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｃ、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５から成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡである。
被験者の生体試料におけるｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に、及び／又はｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５から成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患である、つまり自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患に罹患している可能性（罹患可能性）があると評価する。また、上記発現量の増加及び／又は低下の程度によって、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の重症度、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の発症及び／又は重症化リスクを判定することもできる。さらに、治療後のｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が、治療前よりも低下した場合、及び／又はｍｉＲ－１２５、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５から成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が、治療前よりも増加した場合に、治療効果があったと判定し、変化なし、或いは上記と逆の変化を示した場合には、治療効果がなかった、或いは悪化したと判定する。なお、本発明の判定方法において、コントロールとしては、正常被検者、又は自己免疫疾患及び／若しくは炎症性疾患に罹患していない被験者の生体試料を用いる。本発明におけるマイクロＲＮＡの発現量としては、サンプル間のばらつきを補正するために適切な内部標準遺伝子（ＲＮＵ４４、ｍｉＲ－１４９＊等）又は外部標準遺伝子（ｍｉＲ－３９等）で補正した相対発現量を用いることがより正確な判定を行なう観点から好ましい。
本発明において生体試料としては、特に限定されないが、例えば被験者の組織の細胞、血液等が挙げられ、具体的には、結膜上皮、皮膚等の表皮細胞、血清、血漿、全血、涙液等が好ましい生体試料として挙げられる。
上記（Ａ）工程におけるＲＮＡを抽出する方法としては、生体試料から、マイクロＲＮＡを含むＲＮＡを抽出できる方法である限り特に制限されないが、例えば、細胞・組織は、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、血漿・血清は、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を添付のプロトコールにしたがって用いることによって、マイクロＲＮＡを含むトータルＲＮＡを抽出することができる。
上記（Ｂ）工程における特定のマイクロＲＮＡの発現量を測定する方法としては、マイクロＲＮＡを含むＲＮＡ中の上記特定のマイクロＲＮＡ量を同定し得る方法である限り特に制限されないが、例えば、上記特定のマイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、上記特定のマイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイを判定に使用するマイクロアレイ法；上記特定のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットを判定に使用する定量ＰＣＲ法；上記特定のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットと、本件マイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含む蛍光プローブとを判定に使用する定量ＰＣＲ法（蛍光プローブ法）等を例示することができる。
上記のマイクロアレイ法としては、上記特定のマイクロＲＮＡの発現量を測定することが可能である限り特に制限されないが、組織から抽出したＲＮＡをラベル（好ましくは蛍光ラベル）で標識し、そのＲＮＡを、同定対象とするマイクロＲＮＡに相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）又はその一部からなるプローブが固定されたマイクロアレイに接触させてハイブリダイゼーションを行った後、マイクロアレイを洗浄して、マイクロアレイ上に残ったマイクロＲＮＡの発現量を測定する方法を例示することができる。
上記の核酸配列のヌクレオチドの種類としては、本発明における特定のマイクロＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限されないが、安定性が高いことからＤＮＡであることが好ましい。また、上記のポリヌクレオチドの一部の長さとしては、本発明における特定のマイクロＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限されないが、ハイブリダイゼーションの安定性を確保する観点から、１０～１００ｍｅｒであることが好ましく、１０～４０ｍｅｒであることがより好ましい。なお、上記のポリヌクレオチド又はその一部は、当該技術分野において周知の方法を用いて化学合成等することにより取得することができる。
上記のポリヌクレオチド又はその一部を固定するアレイとしては、特に制限されないが、ガラス基板やシリコン基板等を好適に例示することができ、ガラス基板をより好適に例示することができる。上記のポリヌクレオチド又はその一部をアレイに固定する方法としては特に制限されず、公知の方法を用いることができる。また、上記アレイの他に、例えばＲＮＡのラベル化反応に用いる試薬、ハイブリダイゼーション反応に用いる試薬、洗浄に用いる試薬、組織からのＲＮＡ抽出に用いる試薬等の、マイクロアレイ法に用いる試薬等の任意の要素をさらに用いてもよい。
上記の定量ＰＣＲ法としては、上記特定のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセットを用いる方法であり、かつ、上記特定のマイクロＲＮＡの発現量を測定することが可能である限り特に制限されず、アガロース電気泳動法、ＳＹＢＲグリーン法、蛍光プローブ法等の通常の定量ＰＣＲ法を用いることができる。
定量ＰＣＲ法におけるプライマーセットとは、上記特定のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマー（ポリヌクレオチド）の組合せを意味する。上記プライマーとしては、上記特定のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得る限り特に制限されないが、本発明における特定のマイクロＲＮＡの配列の５’側の一部の配列からなるプライマー（フォワードプライマー）と、そのマイクロＲＮＡの配列の３’側の一部の配列に相補的な配列からなるプライマー（リバースプライマー）とからなるプライマーセットを例示することができる。ここで、５’側とは、成熟型マイクロＲＮＡの配列において比較した場合に、リバースプライマーに対応する配列よりも、５’側であることを意味し、３’側とは、成熟型マイクロＲＮＡの配列において比較した場合に、フォワードプライマーに対応する配列よりも、３’側であることを意味する。
上記の蛍光プローブとしては、上記特定のマイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を含んでいる限り特に制限されず、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法（ＦＲＥＴ原理を利用したものも含む）や、サイクリングプローブ法に用いうる蛍光プローブを好適に例示することができる。
上記プライマーセットや、上記の蛍光プローブは、その配列情報に基づき当該技術分野において周知の方法を用いて化学合成等することにより得ることができる。
上記（Ｃ）工程で、コントロールと被験者の生体試料におけるマイクロＲＮＡの発現量を比較し、判定する場合、上記生体試料中、上記特定のマイクロＲＮＡの発現量の増加や低下の程度としては、例えば、コントロールに対する割合として好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは１００％以上の増加、又は５０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは９０％以上の低下であることを挙げることができる。
［判定用キット］
本発明は、上述の本発明の判定方法において必要な試薬等を含む、自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の判定キットも含まれる。本発明の判定用キットは、測定対象又は測定原理等に応じた種々の構成をとることができる。本発明の判定用キットの構成要素として、例えば、上記特定のマイクロＲＮＡの発現量を測定することができる、上記特定のマイクロＲＮＡの配列に相補的な核酸配列からなるポリヌクレオチド又はその一部を備えたマイクロアレイ、上記特定のマイクロＲＮＡの配列を増幅し得るプライマーセット、及びハイブリダイゼーション用のプローブを含むことができる。このようなｍｉＲＮＡとしては、上述の本発明の判定方法において指標として採用するｍｉＲＮＡが好ましい。具体的には、配列番号１～８の塩基配列からなるｍｉＲＮＡである。
さらに、本発明の判定用キットには、その構成・使用目的等に応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等が含まれる。なお、ＰＣＲ反応後の検出を容易にするために、これらプライマーの少なくともいずれかの末端に、当業者に公知の任意の蛍光物質等の標識物質が結合させてもよい。
［炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤］
本発明は、ｍｉＲ－４５５－３ｐ阻害剤を有効成分とする、炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤も含む。上記ｍｉＲ－４５５－３ｐ阻害剤は、生体におけるｍｉＲ－４５５－３ｐの発現及び／又は機能を阻害するものであれば特に限定されないが、上記ｍｉＲ－４５５－３ｐ阻害剤は、核酸オリゴ、低分子化合物、及びＨｓａ－ｍｉＲ－４５５－３ｐ抗体から成る群より選択される少なくとも１種であることが好ましいく、なかでも核酸オリゴであることがより好ましく、天然及び非天然のＲＮＡ又はＤＮＡからなるオリゴであることがさらに好ましく、ｍｉＲ－４５５－３ｐのアンチセンスオリゴであることが特に好ましい。なお、上記核酸オリゴは、生体に投与された際の分解を抑制する目的、及び／又は疾患部位に特異的に結合させる目的等により、修飾されていることが好ましい。
本発明における「核酸オリゴ」は、天然及び非天然のＲＮＡまたはＤＮＡからなるオリゴであり、ｍｉＲ－４５５－３ｐの機能を制御する核酸のオリゴマーを意味する。本発明における核酸オリゴとしては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、核酸アプタマーが含まれる。
本発明における核酸オリゴとして好ましくは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを挙げることができ、より好ましくは、ｓｉＲＮＡを挙げることができる。ｓｉＲＮＡは、細胞で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味し、例えば１５～４９塩基対と、好適には１５～３５塩基対と、さらに好適には２１～３０塩基対とすることが出来る。また、ｓｈＲＮＡは、一本鎖のＲＮＡがヘアピン構造を介して二重鎖を構成しているＲＮＡである。
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の相同性を有する。
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）等により不対合部分が含まれていてもよい。本発明においてはｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。
本発明における炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤（薬剤）には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる材料が添加されていてもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療効果を有する材料であってもよいし、当該治療効果を有さない材料であってもよく、上記治療剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。また、治療効果を有さない材料であって、炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤と併用することによって相乗的効果もしくは相加的な安定化効果を有する材料であってもよい。
製剤上許容される材料としては、例えば滅菌水や生理食塩水、保存剤、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、結合剤等を挙げることができる。
本発明における薬剤を注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられる）、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０）等と併用してもよい。所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
また、必要に応じ、本発明における薬剤をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）としたりすることもできる。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る。使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
本発明の炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤をヒトの医薬として使用する場合には、これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。製剤化する場合には、上記に記載の製剤上許容される材料を添加しても良い。
本発明におけるすべての薬剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤等を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００００１ｍｇから１ｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．００００１～１００ｍｇ、好ましくは０．０００１～５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。
本発明は、ｍｉＲ－４５５－３ｐ阻害剤を用いた、炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療方法も含む。ｍｉＲ－４５５－３ｐ阻害剤、炎症性疾患、自己免疫疾患についての具体的な説明としては、上述の本発明の炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の項の説明を適用できる。
以下に本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［Ｓｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）の病態に関わる結膜上皮のｍｉＲＮＡについての解析］
１．マイクロアレイを用いた網羅的ｍｉＲＮＡ解析
ＳＪＳ患者の眼表面再建術時に切除摘出された結膜組織から、ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）を用いて結膜上皮を分離後、市販の試薬（ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコールに従いｍｉＲＮＡを抽出した。その後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ ｍｉＲＮＡ ４．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社）を用い、網羅的ｍｉＲＮＡ解析を行った。コントロールとしては、結膜弛緩症患者の眼表面再建術時に切除摘出された結膜組織から分離した結膜上皮を用いた。それぞれ、ＳＪＳ患者と対照コンロトールの数は、ｎ＝３で解析した。
網羅的ｍｉＲＮＡ解析の結果、約３万種類のｍｉＲＮＡのうち表１に示す１３種類のｍｉＲＮＡの発現が、ＳＪＳ患者においてコントロールの１／５以下に低下していた（ＡＮＯＶＡ ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０５）。また、表２に示す５２種類のｍｉＲＮＡの発現が、ＳＪＳ患者においてコントロールの５倍以上に増加していた（ＡＮＯＶＡ ｐ－ｖａｌｕｅ＜０．０５）。表中のＦｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅの値は、ＳＪＳサンプル３つの各発現シグナルの平均を、コントロールサンプル３つの各発現シグナルの平均で割った値である。
Figure 0007650467000001
Figure 0007650467000002
Figure 0007650467000003
２．定量ＰＣＲ
上記網羅的ｍｉＲＮＡ解析でＳＪＳ患者とコントロールとの間に有意な発現量の差が見られた複数のｍｉＲＮＡについて、常法に従って定量ＰＣＲを行った。解析対象のｍｉＲＮＡは、ｍｍｕ－ｍｉＲ－３１、ｏｄｉ－ｍｉＲ－３１、ｏｌａ－ｍｉＲ－３１、ｃｒｍ－ｍｉＲ－７２、ｂｍａ－ｍｉＲ－７２、ｂｆｌ－ｍｉＲ－３１、ｏａｎ－ｍｉＲ－３１、ｘｔｒ－ｍｉＲ－３１ｂ、ｇｇｏ－ｍｉＲ－１２５ａ、ｍｍｌ－ｍｉＲ－７１９３－５ｐ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８５、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４８４、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４５５、ｍｍｕ－ｍｉＲ－２０４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ、ｇｇａ－ｍｉＲ－３５３５とした。ＳＪＳ患者の結膜上皮サンプルはｎ＝６、コントロールとしての結膜患者弛緩症の結膜上皮サンプはｎ＝７とした。結果を図１に示す。
図１に示すとおり、ＳＪＳ患者では、ｍｉＲ－３１、ｍｉＲ－７２、ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が顕著に増強していた。一方、ｍｉＲ－１２５ａの発現は、ＳＪＳ患者では有意に低下していた。これらのｍｉＲＮＡは、ＳＪＳの罹患可能性、重症度、発症及び／又は重症化リスク、治療効果等の判定等の指標として用いることができると考えられた。以下で、これらについてｈｕｍａｎのｍｉＲＮＡの測定系を使用した定量ＰＣＲ試験を行った。
３．定量ＰＣＲ（ｈｕｍａｎ）
上記の試験で、ＳＪＳ患者とコントロールとで、発現量の有意な差が見出されたｍｉＲＮＡについて、ヒトの定量ＰＣＲ系を用いて、発現の確認を行った。ｍｉＲ－７２については、定量ＰＣＲ解析用のｈｕｍａｎのｐｒｏｂｅが存在しないため、ここではｈｓａ－ｍｉＲ－３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａについて定量ＰＣＲを行った。結果を図２に示す。
図２に示すとおり、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５５－３ｐは、ＳＪＳ患者の結膜上皮において、コントロールと比較して有意に強発現していることが確認できた。ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａは、ＳＪＳ患者の結膜上皮において、コントロールと比較して有意に発現が低下していた。これらのｍｉＲＮＡは、ＳＪＳの罹患可能性、重症度、治療効果等の判定等の指標として有用であると考えられた。
［ｍｉＲ－４５５－３ｐの解析］
１．阻害試験
ｍｉＲ－４５５－３ｐが疾患治療のターゲットになり得るか否かを確認するために、プライマリー正常ヒト培養結膜上皮細胞（ＰＨＣｊＥ）に対して、ｍｉＲ－４５５－３ｐのｉｎｈｉｂｉｔｏｒの遺伝子導入による抑制試験を行った。
プライマリー正常ヒト培養結膜上皮細胞を、Ｃｎｔ－ＰＲ培地中、５ Ｘ １０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで１２ ｗｅｌｌ プレートに播種した。
１ｗｅｌｌにＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）５０μＬ及びリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）２μＬを添加し、別のｗｅｌｌにＯｐｔｉ－ＭＥＭ５０μＬ、ｍｉＲ－４５５－３ｐのｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ｍｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） ７２ｐｍｏｌを添加し、その後、両方のｗｅｌｌの液を混合して室温で１５分静置してｉｎｈｉｂｉｔｏｒとリポフェクタミン複合体を形成させた。上記プライマリー正常ヒト培養結膜上皮細胞の各ｗｅｌｌ（Ｃｎｔ－ＰＲ ０．５ｍＬ／ｗｅｌｌ）に１００μＬの複合体を添加して混合した。３７℃、５％ＣＯ２条件下、２４時間培養後、培地交換を行い、さらに６時間培養してサンプルを回収した。ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されていることをＰＣＲにより確認した。
次に、このｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞細胞を用いて、網羅的遺伝子発現解析を行った。具体的には、高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）、ＨｕｍａｎＧｅｎｅ１．０ ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））を用いて遺伝子発現プロファイルを調べた。全ＲＮＡはＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて抽出した。２８，８６９個以上の遺伝子をカバーする約７６４，８８５個のプローブセットを使用した。プロセス全体を通して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのプロトコールに従った。スキャンしたマイクロアレイ画像は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）のフォルト設定で取得した。ハイブリダイゼーションのアーチファクトを検出するために画像を目視で検査した。
結果を表３、表４に示した。表３には、ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞細胞において、コントロールの１／３以下に発現が低下した遺伝子を、表４には、コントロールの３倍以上に発現が増加した遺伝子を示す。
Figure 0007650467000004
Figure 0007650467000005
Figure 0007650467000006
Figure 0007650467000007
Figure 0007650467000008
Figure 0007650467000009
Figure 0007650467000010
上記の網羅的遺伝子発現解析により、ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞において発現が顕著に低下したことが示された遺伝子（表３）の内、炎症に関与することが知られている、ＡＮＫＲＤ１、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ２、ＧＥＭ、ＰＴＧＳ２、ＲＮＡＳＥ８、ＩＬ６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２０、ＫＰＲＰについて、定量ＰＣＲを行った。その結果を図３に示す。
図３に示すとおり、ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞細胞では、コントロールの細胞と比較して、確かに、ＡＮＫＲＤ１、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ２、ＧＥＭ、ＰＴＧＳ２、ＲＮＡＳＥ８、ＩＬ６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２０、ＫＰＲＰの遺伝子発現が低下していることが、定量ＰＣＲにおいても確認された。この結果から、ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現を抑制することが、炎症の予防や治療に有効である可能性が示唆された。
上記の網羅的遺伝子発現解析により、ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞において発現が顕著に増加したことが示された遺伝子（表４）の内、炎症に関与することが知られている、ＩＦＩ４４Ｌ、ＳＬＩＴＲＫ６、ＴＮＦＳＦ１０、ＯＡＳ２、ＭＸ１、ＯＡＳ１について、定量ＰＣＲを行った。ＳＬＩＴＲＫ６の定量ＰＣＲの結果を図４に示す。
図４に示すとおり、ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞細胞では、コントロールの細胞と比較して、ＳＬＩＴＲＫ６の遺伝子発現が顕著に増加していることが、定量ＰＣＲにおいても確認された。しかし、これ以外のＩＦＩ４４Ｌ、ＴＮＦＳＦ１０、ＯＡＳ２、ＭＸ１、ＯＡＳ１については、有意な発現の増加が認められなかった。
２．発現増強試験（Ｍｉｍｉｃ試験）
ｍｉＲ－４５５－３ｐの機能を確認するために、プライマリー正常ヒト培養結膜上皮細胞（ＰＨＣｊＥ）に対して、ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現を増強する試験を行った。
プライマリー正常ヒト培養結膜上皮細胞（ＰＨＣｊＥ）に対して、ｍｉＲ－４５５－３ｐのｍｉｍｉｃ（ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃ）の遺伝子導入による発現増強試験を行った。プライマリー正常ヒト培養結膜上皮細胞を、Ｃｎｔ－ＰＲ培地中、５ Ｘ １０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで１２ｗｅｌｌプレートに播種した。１ｗｅｌｌにＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）５０μＬ及びリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）２μＬを添加し、別のｗｅｌｌにＯｐｔｉ－ＭＥＭ５０μＬ、ｍｉＲ－４５５－３ｐのｍｉｍｉｃ（ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ｍｉＲＮＡ ｍｉｍｉｃ）１８ｐｍｏｌを添加し、その後、両方のｗｅｌｌの液を混合して室温で１５分静置してｓｉＲＮＡとリポフェクタミン複合体を形成させた。ｍｉＲ－４５５－３ｐのｍｉｍｉｃを正常ヒト培養結膜上皮細胞の各ｗｅｌｌ（Ｃｎｔ－ＰＲ ０．５ｍＬ／ｗｅｌｌ）に１００μＬの複合体を添加して混合した。３７℃、５％ＣＯ２条件下、２４時間培養後、培地交換を行い、さらに６時間培養してサンプルを回収した。ｍｉＲ－４５５－３ｐ現が増強されていることをＰＣＲにより確認した。
次に、このｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が増強されたヒト培養結膜上皮細胞細胞を用いて、網羅的遺伝子発現解析を行った。網羅的遺伝子発現解析の具体的な方法は、上記阻害試験の際の方法と同様である。その結果、炎症に関与することが知られているＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＣＴＧＦ、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ２、ＰＴＧＳ２、ＣＸＣＬ８の発現が、コントロールに比べて増強していることがわかった。これらの結果は定量ＰＣＲでも確認できた（図５）。
３．ＳＪＳ患者の結膜上皮細胞における遺伝子発現の網羅解析
ＳＪＳ患者の眼表面再建術時に切除摘出された結膜組織から分離した結膜上皮細胞について、網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果を、上記表３に示した阻害試験の結果、ｍｉＲ－４５５－３ｐのｉｎｈｉｂｉｔｏｒ処理によりｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞細胞の網羅的遺伝子発現解析の結果と比較した。ＳＪＳ患者の結膜上皮細胞において、コントロールと比較して発現が上昇していた遺伝子のうち、ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞細胞において、発現が顕著に低下した遺伝子を表５にリストアップした。
Figure 0007650467000011
上記表５に示した遺伝子のうち、ＩＬ１ＲＬ１、ＣＴＧＦ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＡＤＭ、ＳＥＲＰＩＮＢ２について、ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞細胞を用いた定量ＰＣＲを行った。その結果を図６に示す。
図６に示すとおり、ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現が抑制されたヒト培養結膜上皮細胞細胞では、コントロールの細胞と比較して、確かに、ＩＬ１ＲＬ１、ＣＴＧＦ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＡＤＭ、ＳＥＲＰＩＮＢ２Ｐの遺伝子発現が低下していることが、定量ＰＣＲにおいても確認された。ｍｉＲ－４５５－３ｐの発現を抑制することで、ＳＪＳ患者の結膜上皮細胞において発現が増強しており、かつ炎症に関与する遺伝子の発現を低下させることができた。このことから、ｍｉＲ－４５５－３ｐを阻害することがＳＪＳの治療に効果を奏する可能性が示唆された。
４．マウス接触性皮膚炎モデル
ｍｉＲ－４５５－３ｐ阻害で発現が抑制される遺伝子の、マウス接触性皮膚炎モデルの組織での動態についての解析を行った。
Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹部及び胸部に１％トリニトロクロロベソゼン（ＴＮＣＢ）を塗布した。７日目に、マウスの耳に１％ＴＮＣＢ又は溶媒のみ（アセトン：オリーブオイル＝４：１）を塗布した。翌日（８日目）、耳介を採取しＲＮＬａｔｅｒに浸漬させ、６時間後に取り出し、－８０℃に保存した。その後、ドライアイスで耳介を粉砕後、トリゾールで溶解し、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡを抽出した。ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓを用いたＳｙｂｒＧｒｅｅｎ法によりＱ－ＰＣＲを行った。
ＡＮＫＲＤ１、ＣＸＣＬ２、ＰＴＧＳ２、ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２０、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＥＲＰＩＮＢ２は、マウス接触性皮膚炎モデルの組織において発現が増加していることがわかった。結果を図７に示す。これらの遺伝子は、ヒト培養結膜上皮細胞細胞を用いた上述の試験によりｍｉＲ－４５５－３ｐ阻害で発現が抑制されることが判明しているものである。したがって、皮膚炎等の炎症、さらには、自己免疫疾患等に対しても、ｍｉＲ－４５５－３ｐを阻害する物質が、予防又は治療効果を奏する可能性が示唆された。
［Ｓｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）の病態に関わる血液（血漿）のｍｉＲＮＡについての解析］
１．マイクロアレイを用いた網羅的ｍｉＲＮＡ解析
ＳＪＳ患者の血液から血漿を分離し、市販の試薬（ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製））のプロトコールに従いｍｉＲＮＡを抽出した。その後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ ｍｉＲＮＡ ４．０ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社）を用い、網羅的ｍｉＲＮＡ解析を行った。コントロールとしては、健常ボランティアの血液を用いた。
網羅的ｍｉＲＮＡ解析の結果、ＳＪＳ患者の血液中で、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、ｍｉＲ－５４８ａｃがコントロールと比較して顕著に変化していることがわかった。これらについては、定量ＰＣＲによっても、ＳＪＳ患者での発現増強が確認できた（データは省略）。
２．ＳＪＳの重症度と、患者血液中のｍｉＲ－６２８－３ｐ及びｍｉＲ－５４８ａｃの発現量との相関の解析
健常人、ＳＪＳ軽症患者、ＳＪＳ重症患者の血液中のｍｉＲ－６２８－３ｐ及びｍｉＲ－５４８ａｃの量を比較した。その結果を表６及び表７に示す。
Figure 0007650467000012
Figure 0007650467000013
表６及び７に示したとおり、ＳＪＳの重症度と、患者血液中のｍｉＲ－６２８－３ｐ及びｍｉＲ－５４８ａｃの発現量とは相関しており、血中のｍｉＲ－６２８－３ｐ及びｍｉＲ－５４８ａｃは、ＳＪＳの重症度の判定の指標として用いることが可能である。したがって、ＳＪＳの罹患可能性、重症度、治療効果等の判定等の指標として有用であると考えられた。
本発明によると、難治性眼表面疾患であるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）を始めとする炎症性疾患や、その他自己免疫疾患の罹患可能性、発症及び／又は重症化リスク、治療効果等の判定が可能となる。具体的には、ＳＪＳ疾患特異的に発現が変動するマイクロＲＮＡは、医学的に有用な生物学的指標となり、また、疾患重症度と相関するマイクロＲＮＡは、治療効果の評価を可能とする。本発明は、難治性眼表面疾患の結膜上皮組織を標的とする疾患特異的マイクロＲＮＡ発現プロファイリンクによる非侵襲的な診断技術の確立と治療法選択への活用という新しい医療技術の提供につながる。さらに本発明は、難治性眼表面疾患であるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）を始めとする炎症性疾患や、その他自己免疫疾患の新規治療方法を提供することもできる。

Claims (6)

  1. 被験者由来の結膜上皮組織中のｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５、並びに被験者由来の血漿中のｍｉＲ－６２８－３ｐ及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを指標とし、
    ｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に、及び／又はｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５から成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に、Ｓｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）に罹患している可能性があると評価する、ここで、上記コントロールとしては、ｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡについては正常被検者由来の結膜上皮組織を用い、ｍｉＲ－６２８－３ｐ及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡについては正常被験者由来の血漿を用いる、被験者におけるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）の罹患可能性の判定を補助する方法。
  2. 被験者由来の結膜上皮組織中のｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５、並びに被験者由来の血漿中のｍｉＲ－６２８－３ｐ及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを指標とし、
    ｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に、及び／又はｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５から成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に、その増加及び／又は低下の程度によって、被験者におけるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）の重症度を判定する、ここで、上記コントロールとしては、ｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡについては正常被検者由来の結膜上皮組織を用い、ｍｉＲ－６２８－３ｐ及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡについては正常被験者由来の血漿を用いる、被験者におけるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）の重症度の判定を補助する方法。
  3. 被験者由来の結膜上皮組織中のｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５、並びに被験者由来の血漿中のｍｉＲ－６２８－３ｐ及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを指標とし、
    ｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して増加している場合に、及び／又はｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５から成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が、コントロールと比較して低下している場合に、その増加及び／又は低下の程度によって、被験者におけるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）の発症及び／又は重症化リスクを判定する、ここで、上記コントロールとしては、ｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡについては正常被検者由来の結膜上皮組織を用い、ｍｉＲ－６２８－３ｐ及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡについては正常被験者由来の血漿を用いる、被験者におけるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）の発症及び／又は重症化リスクの判定を補助する方法。
  4. Ｓｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）患者の被験者由来の結膜上皮組織中のｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５、並びにＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）患者の被験者由来の血漿中のｍｉＲ－６２８－３ｐ及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを指標とし、
    治療後のｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｍｉＲ－３１－５ｐ、ｍｉＲ－７２－５ｐ、ｍｉＲ－６２８－３ｐ、及びｍｉＲ－５４８ａｃから成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が、治療前と比較して低下している場合に、及び／又は治療後のｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２０４－３ｐ及びｍｉＲ－３５３５から成る群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡの発現量が、治療前と比較して増加している場合に、治療効果があったと判定し、変化なしの場合には治療効果がなかったと判定し、上記と逆の変化を示した場合には、悪化したと判定する、被験者におけるＳｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）の治療効果の判定を補助する方法。
  5. ｍｉＲ－４５５－３ｐのアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする、Ｓｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群（ＳＪＳ）の予防及び／又は治療剤。
  6. 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、修飾されている、請求項６に記載の予防及び／又は治療剤。
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