JP7639136B2

JP7639136B2 - 呼吸器ウイルス感染症の処置又は予防のためのスーパーオキシドジスムターゼ活性を有するポリペプチド及び細胞外小胞の使用

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Publication number: JP7639136B2
Application number: JP2023529033A
Authority: JP
Inventors: ジェグパン，; ユイジュンキム，; ジョンヒョンキム，
Original assignee: GENOFOCUS CO Ltd
Current assignee: GENOFOCUS CO Ltd
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2021-11-23
Publication date: 2025-03-04
Anticipated expiration: 2041-11-23
Also published as: EP4248986A4; WO2022108424A1; KR20220071139A; CN117098546A; US20240000901A1; EP4248986A1; KR102750010B1; JP2023550362A

Description

本発明は、対象における呼吸器ウイルス感染症の予防及び／又は処置のための、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）株から得られるスーパーオキシドジスムターゼ（以後、単に「ＳＯＤ」と称する）活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）株から得られるＳＯＤを含有する細胞外小胞（以後、単に「ＳＯＤ－ＥＶ」と称する）の使用に関する。

呼吸器感染症の原因の一つである呼吸器ウイルスは、活性酸素を生成する酵素（例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ）、キサンチンオキシダーゼなど）を誘導することが知られている。

さらに、代表的な呼吸器ウイルスであるコロナウイルスは主に、哺乳類や鳥類の気道や消化管に感染する。これらのコロナウイルスは、ライノウイルス、インフルエンザ、及び呼吸器多核体ウイルスと共に、風邪の原因となる病原体の１つであることが知られている。

一方、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、２０１９年に初めて知られた重症急性呼吸器疾患コロナウイルス２であり、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスとして分類されている。このウイルスに感染した疾患はコロナウイルス病２０１９と呼ばれ、ＣＯＶＩＤ－１９と略されている。世界保健機関（ＷＨＯ）はコロナウイルスのパンデミックを正式に宣言し、２０２０年１１月時点で韓国における感染者数は３万人に迫り、世界中では約５５６０万人が感染していることが判明しており、ＣＯＶＩＤ－１９は、広がり続けている。ＣＯＶＩＤ－１９に感染すると、約２～１４日の潜伏期間の後、発熱、咳、呼吸困難、及び肺炎などの症状が現れる。

ＣＯＶＩＤ－１９は、気道感染症を引き起こすウイルスの一種で、２０１９年に中国湖北省武漢市で初めて発見されたウイルスで、コロナウイルス科に属し、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）及び中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と類似したウイルスとして知られている。

ＣＯＶＩＤ－１９の臨床試験は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）処置薬のカレトラ（主成分：ロピナビル）又はエボラウイルス処置薬のレムデシビルなどの薬物について実施され、２０２０年１０月に米食品医薬品局（ＦＤＡ）がレムデシビルはＣＯＶＩＤ－１９の処置に適応があることを承認したが、ＣＯＶＩＤ－１９の予防及び処置の両方の効果を有する治療効果を備えた薬ではない。したがって、ＣＯＶＩＤ－１９を含むコロナウイルスなどの呼吸器ウイルス感染症を予防及び処置することができる新しい治療法を見つけることが重要である。

本発明の目的は、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は処置のための方法を提供することであり、この方法は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を有するポリペプチド及び／又はＳＯＤを含有する細胞外小胞の治療有効量を投与することを含む。

本発明の別の目的は、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は処置のための方法を提供することであり、この方法は、バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞の治療有効量を投与することを含む。

本発明のさらに別の目的は、コロナウイルス感染症又はコロナウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は処置のための方法を提供することであり、この方法は、バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞の治療有効量を投与することを含む。

本発明のさらに別の目的は、呼吸器ウイルス感染症の予防及び／又は処置のための医薬組成物を提供することであり、この組成物は、ＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はＳＯＤを含有する細胞外小胞を含む。

本発明のさらに別の目的は、呼吸器ウイルス感染症の予防及び／又は処置のための医薬組成物を提供することであり、この組成物は、バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞を含む。

本発明のさらに別の目的は、コロナウイルス感染症の予防及び／又は処置のための医薬組成物を提供することであり、この組成物は、バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞を含む。

本発明のさらに別の目的は、呼吸器ウイルス感染症の予防及び／又は改善のための食品組成物を提供することであり、この組成物は、ＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はＳＯＤを含有する細胞外小胞を含む。

本発明のさらに別の目的は、呼吸器ウイルス感染症の予防及び／又は改善のための食品組成物を提供することであり、この組成物は、バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞を含む。

本発明のさらに別の目的は、コロナウイルス感染症の予防及び／又は改善のための食品組成物を提供することであり、この組成物は、バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞を含む。

本発明のさらに別の目的は、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は処置のための医薬組成物の使用を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は処置のための薬物を調製するための医薬組成物の使用を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は改善のための食品組成物の使用を提供することである。

本発明の発明者等は、バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチドを単独で、又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞と一緒に哺乳動物に使用した場合、コロナウイルス感染を予防、処置、又は改善する効果を発揮することを確認し、本発明を完成させた。

本発明によるバチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞は、単独で、又は一緒に使用した場合、呼吸器ウイルス感染症又はそれによって引き起こされる疾患の予防、処置、又は改善に優れた効果を発揮する。

バチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞の粒径分析結果を示した図である。バチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞の粒径分析結果を示した図である。バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞のコロナウイルス感染症に対する予防及び治療効果を同定するための動物実験計画を示した図である。バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞の、コロナウイルス感染症によって引き起こされる肺損傷に対する治療効果を示した図である。バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞の、コロナウイルス感染症によって引き起こされる肺損傷に対する予防効果を示した図である。バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞を投与されたシリアンハムスターで観察された肺損傷が、ポリペプチド及び／又はＳＯＤを含有する細胞外小胞を投与されていないシリアンハムスターのものとは大きく異なることを示した図である。バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞を投与した後の肺を観察した病理組織学的結果を示した図である。バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞の治療的投与による肺の病理組織学的スコアを示した図である。バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞の予防的投与による肺の病理組織学的スコアを示した図である。

本発明の一態様では、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は処置のための方法であって、（ｉ）スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を有するポリペプチド、（ｉｉ）ＳＯＤを含有する細胞外小胞、又は（ｉｉｉ）ＳＯＤ活性を有するポリペプチド及びＳＯＤを含有する細胞外小胞の治療有効量を投与することを含む、方法が提供される。

この場合、呼吸器ウイルス感染症はコロナウイルス感染症であってもよい。コロナウイルス感染症は、風邪、肺炎、間質性肺炎、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、副鼻腔炎、ＣＯＶＩＤ－１９感染症、耳炎、又は咽頭炎から選択される。さらに、呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患は、ウイルス性肺損傷又は肺疾患であってもよい。

さらに、コロナウイルスは、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、又はデルタコロナウイルスであってもよい。特に、コロナウイルスはヒトコロナウイルスであってもよい。

本発明のＳＯＤ活性を有するポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。本発明のＳＯＤ活性を有するポリペプチドはまた、このアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含んでいると解釈される。実質的に同一とは、本発明のアミノ酸配列をその他の配列とできる限り一致するように整列させて、整列した配列を当技術分野で一般的に使用されるアルゴリズムを使用して分析した場合、少なくとも８０％の相同性、より好ましくは９６％の相同性、最も好ましくは９８％の相同性を有するアミノ酸配列を意味する。

ポリペプチドは、バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３株から単離することができる。バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３株は、２０１７年３月６日に受託番号ＫＣＴＣ１３２２２ＢＰとして韓国生命工学研究院に国際寄託されており、その株の特徴及び培養方法は、韓国特許第１７６２１９９号に記載されている。

本発明によるバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞とは、ＳＯＤ活性を有する細胞外小胞を意味する。細胞外小胞とは、タンパク質、脂質、及び核酸を含む複合水和物を含む、膜で囲まれたナノサイズの小胞の不均一な集合体を意味する。

ＳＯＤを含有する細胞外小胞は、バチルスズブチリスＳＯＤ株から単離することができる。

本発明では、バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞は、呼吸器ウイルスに既に感染した個体におけるウイルスの増殖を抑制するために利用することができる。好ましくは、バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞は、コロナウイルスに既に感染した個体におけるウイルスの増殖を抑制することができる。さらに好ましくは、バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞は、ＳＡＲＳ又はＣＯＶＩＤ－１９に感染した個体におけるウイルスの増殖を抑制することができる。

さらに、ＳＯＤ活性を有するポリペプチド及びＳＯＤを含有する細胞外小胞は、同時に、又は順次投与され得る。

本発明の別の態様では、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は処置のための方法を提供しており、この方法は、ＳＯＤ活性を有するポリペプチド並びに／或いはＳＯＤ及び／又はその薬学的に許容できる塩を含有する細胞外小胞の治療有効量を投与するステップを含む。呼吸器ウイルス感染症はコロナウイルス感染症であってもよい。さらに、コロナウイルス感染症は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症であってもよい。

本発明のさらに別の態様では、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は処置のための医薬組成物を提供することであり、この医薬組成物は、ＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はＳＯＤを含有する細胞外小胞を含む。この場合、呼吸器ウイルス感染症はコロナウイルス感染症であってもよい。

本発明のさらに別の態様では、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は処置のための医薬組成物を提供することであり、この医薬組成物は、バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞を含む。この場合、呼吸器ウイルス感染症はコロナウイルス感染症であってもよい。

本発明のさらに別の態様では、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は処置のための組成物の使用を提供する。この場合、組成物は前述のものと同じである。

本発明のさらに別の態様では、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は処置のための薬物の調製のための組成物の使用を提供する。この場合、組成物は前述のものと同じである。

本発明のＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はＳＯＤを含有する細胞外小胞は、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患に対する予防又は治療効果を有することが知られている化合物、ポリペプチドなどと一緒に使用することができる。さらに、本発明のバチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞は、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患に対する予防又は治療効果を有することが知られている化合物、ポリペプチドなどと一緒に使用することができる。

本発明のさらに別の態様では、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は改善のための方法を提供しており、この方法は、ＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はＳＯＤを含有する細胞外小胞を含む食品組成物の生物学的有効量を投与するステップを含む。

本発明のさらに別の態様では、呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防又は改善のための食品組成物を提供しており、この組成物は、ＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はＳＯＤを含有する細胞外小胞を含む。さらに詳細には、呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防又は改善のための食品組成物を提供しており、この組成物は、バチルスアミロリケファシエンス株に由来するＳＯＤ活性を有するポリペプチド及び／又はバチルスズブチリス株に由来するＳＯＤを含有する細胞外小胞を含む。この場合、呼吸器ウイルス感染症はコロナウイルス感染症であってもよい。

本発明の態様では、呼吸器ウイルス感染症又は呼吸器ウイルス感染症によって引き起こされる疾患の予防及び／又は改善のための食品組成物の使用を提供している。

本発明の医薬組成物は、従来の方法に従って、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤、エアゾール剤、注射液剤などの形態に製剤化して使用することができる。例えば、本発明の医薬組成物に含まれていてもよい担体、賦形剤、又は希釈剤には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油が含まれる。医薬組成物は、製剤化する場合、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、及び界面活性剤などの一般的に使用される希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。

本発明の医薬組成物は、所望の方法によって経口投与又は非経口投与することができ、非経口投与する場合、点鼻薬、皮膚外用適用、又は腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、又は胸腔内注射を選択することが好ましい。

この場合、経口投与用の固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形調製物は、複合組成を少なくとも１つの賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどと混合することによって調製することができる。単純な賦形剤に加えて、ステアリン酸マグネシウム及びタルクなどの潤滑剤も使用することができる。経口投与用の液体製剤には、懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤などが含まれ、一般的に単純な希釈剤として使用される水及び流動パラフィンに加えて、湿潤剤、甘味剤、香料、及び保存剤などの様々な賦形剤を使用することができる。

非経口投与用の製剤は、滅菌水性液剤、非水性液剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥調製物、坐剤などを含むことができる。非水性液剤又は懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用エステルなどを使用することができる。

さらに、本発明による医薬組成物は、吸入によって投与することができる。この薬物は肺に直接送達されるが、毒性はなく、少用量であっても長期間作用を発揮することができる。吸入のための投与は、薬物を含有する吸入可能な粒子又は液滴を含む、気道、鼻腔などを通して吸入できる医薬製剤を使用する投与であってもよい。例えば、吸入投与には、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）又は加圧定量噴霧式吸入器（ｐＭＤＩ）を使用することができるが、これらに限定はされない。例えば、薬物粒子は、送達装置（乾燥粉末吸入器）内に含まれる砕けやすいマトリックスに軽く圧縮されている。操作すると、送達装置はマトリックスから薬物粒子の一部を削り取り、それらを吸気中に分散させて気道に薬物粒子を送達する。或いは、薬物粒子は、送達装置（乾燥粉末吸入器）内のリザーバ内に含まれる自由流動粉末であってもよい。リザーバは、装置内の一体型区画であってもよいし、又は操作前に装置内に挿入されるカプセル、ブリスタ、若しくは類似の機能を備えたリザーバであってもよい。操作すると、装置はレザーバから薬物粒子の一部を分散させ、それらを吸気中に分散させて気道に薬物粒子を送達する。

さらに、本発明の医薬組成物は、担体、賦形剤、又は希釈剤をさらに含むことができる。ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、でん粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、又は二酸化ケイ素などの鉱物などを担体、賦形剤、又は希釈剤として使用することができる。

本発明の医薬組成物は、治療有効量で投与するべきである。本明細書で使用したように、「治療有効量」という用語は、あらゆる医学的処置に適用可能な合理的な利益／リスク比で疾患を処置するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の体重、性別、年齢、状態、疾患の重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時期、投与経路及び排泄速度、処置期間、組成物と組み合わせて使用される薬物、並びに医療分野ではよく知られているその他の要素を含む要素に従って決定することができる。本発明の医薬組成物は、個々の治療薬として、その他の治療薬と組み合わせて投与してもよく、従来の治療薬と順次又は同時に投与してもよい。このような投与は単回投与であっても複数回投与であってもよい。副作用を伴わず、最小限の量で最大限の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、そのような量は当業者であれば容易に決定することができる。

以後、本発明をより理解するために、実施例に従って本発明を詳細に説明する。しかし、以下の実施例は本発明を例示しているだけであり、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

実施例１．バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３からのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）ポリペプチドの単離／精製
１．１バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３の培養
バチルスアミロリケファシエンスＧＦ４２３株を培養するために、ＬＢ寒天培地（Ｌｕｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天；トリプトファン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ）で形成したシングルコロニーを、ＬＢ培地３０ｍＬに接種し、３７℃で１２時間培養した。この種培養物を、１ｍＭ硫酸マンガン（ＭｎＳＯ_４）を含有するＬＢ培地３Ｌに再接種し、３７℃で２０時間培養した。

１．２スーパーオキシドジスムターゼの単離及び精製
細胞培養液を４℃で３，５７８×ｇで２０分間遠心分離して上清を得た後、限外濾過（以後、ＵＦ（ＭＷＣＯ１０，０００））を使用して上清を１０倍に濃縮した。濃縮した上清３００ｍＬを４℃で撹拌しながら、硫酸アンモニウムを最大６０％飽和になるまで添加し、得られた混合物を３０分間撹拌した。その後、混合物を３，５７８×ｇで３０分間遠心分離して上清を得て、２Ｍ硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＰｒｅｐＴＭＰｈｅｎｙｌＨＰ１６／１０カラムに上清を添加した。次に、２Ｍ～０．１Ｍ硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）を使用して溶出を実施した。

ＳＯＤ含有画分（＃３５～＃４０）を収集し、ＵＦ（ＭＷＣＯ１０，０００）を使用して濃縮し、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）で透析して塩を除去した。タンパク質の濃度はブラッドフォードアッセイによって測定した（ＢｒａｄｆｏｒｄＭ、ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ、７２、２４８～２５４、１９７６）。

スーパーオキシドジスムターゼの活性は、スーパーオキシドジスムターゼアッセイキット（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）を使用して確認した。スーパーオキシドジスムターゼ活性の１単位は、スーパーオキシドラジカルを５０％阻害する酵素の量として定義される。精製したＳＯＤの活性は２２３１．１２±２６９Ｕ／ｍｇであり、ＳＤＳ上の分子量は約２２，０００ダルトンであった。

実施例２．バチルスズブチリス株からのＳＯＤを含有する細胞外小胞の単離／精製
２．１．バチルスズブチリスＳＯＤ株の培養
本発明者等が凍結保存したバチルスズブチリスＳＯＤ株を、スーパーオキシドジスムターゼの単離精製用の株として使用した。１ｍＭＤＳＭ（栄養培地８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．１２ｇ／Ｌ、Ｃａ（ＮＯ_３）_２、０．０１ｍＭＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、及び０．００１ｍＭＦｅＳＯ_４）を基礎培地として使用した。丸底チューブ及びフラスコ培養は、振盪インキュベーターを使用して実施し、撹拌速度は２００ｒｐｍ、温度は３７℃に設定した。発酵槽として５Ｌジャーファーメンター（ＦｅｒｍｅｎｔｅｃＣｏ．，Ｌｔｄ．、ＦＭＴ－ＳＴ－Ｍ０５）を使用し、撹拌速度２００ｒｐｍ、温度３７℃、通気量１．０ｖｖｍ、ｐＨ６．８に設定した。

バチルスズブチリス株の前培養は、ＳＯＤプレート上のシングルコロニーを採取し、そのコロニーを基礎培地３ｍＬを含む丸底チューブに接種し、９時間培養することによって実施した。さらに、丸底チューブで培養した培地３ｍＬを、基礎培地３０ｍＬを含む５００ｍＬフラスコに接種し、１６時間培養した後、本培養接種に使用した。発酵槽では、培養は３．０Ｌで実施し、接種量は１％で、培養は２４時間実施した。

２．２．ＳＯＤ－ＥＶ単離
上述のように、バチルスズブチリスＳＯＤ株をジャーファーメンターで２４時間培養した後、培地を４℃、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して培養上清を得た。培養上清では、ＴＦＦシステムの０．２２μｍカセットを使用して培地中に残存する細菌を除去し、純粋な培養上清のみを分離した。純粋な培養上清をＴＦＦシステムの１００ｋＤａカットオフ膜を使用して２００倍濃縮し、ＳＯＤを含む細胞外小胞（ＳＯＤ－ＥＶ）を得た。

２．３．ＳＯＤ－ＥＶの定量及び同定
上述の方法で得られたＳＯＤ－ＥＶについてタンパク質電気泳動を実施し、ブラッドフォード分析及びＢＣＡ分析を使用してＳＯＤ－ＥＶのタンパク質量を測定した。

［タンパク質電気泳動］
ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）４～２０％勾配ゲル（Ｂｉｏｒａｄ、Ｍｉｎｉ－ｐｒｏｔｅａｎＴＧＸプレキャストゲル）を使用した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ緩衝液として、２５ｍＭトリスベース、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ＳＤＳ（ｐＨ８．３）を使用し、ＳＯＤ－ＥＶを５×試料緩衝液と混合し、１００℃で１０分間加熱処置してから使用した。タンパク質電気泳動後、クマシー染色及びウェスタンブロットによってタンパク質を同定した。クマシーブリリアントブルーで３０分間タンパク質を染色した後、脱色緩衝液で３時間反応を行った。

［ウェスタンブロット］
ＳＯＤ－ＥＶのＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、タンパク質を０．２２μｍＰＶＤＦ膜に転写し、その後膜を５％スキムミルク中で１時間ブロックした。その後、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、抗ＳＯＤ抗体（１：１０，０００スキムミルク）を室温で３時間結合させた。その後、洗浄緩衝液を使用して３回洗浄し、２次抗体（１：１００，０００スキムミルク）をそれに結合させ、室温で１時間反応を実施した。その後、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄し、ＥＣＬ反応によって確認した。

Ｍｉｎｉ－ＰｒｏｔｅａｎＩＩ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｉｎｃ．）をタンパク質電気泳動装置として使用し、Ｃｈｅｍｉ－ｄｏｃＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｉｎｃ．）を確認装置として使用した。

［ＳＯＤを含有する細胞外小胞（ＳＯＤ－ＥＶ）のサイズの決定］
動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用して、精製したＳＯＤ－ＥＶのサイズを測定した。ＳＯＤ－ＥＶ試料を８μＬずつウェルに入れて、ＤＬＳ装置のチャンバー内に置き、レーザー光を使用して粒径を測定した。図１及び図２は、粒径分析結果を示す。ＳＯＤ－ＥＶのタンパク質濃度は、ブラッドフォード分析では０．５ｍｇ／ｍＬであり、ＢＣＡ分析では０．１２４ｍｇ／ｍＬであった（以下の表１を参照のこと）。

実施例３．コロナウイルス感染症に対するＳＯＤ及びＳＯＤ－ＥＶの予防及び治療効果
実施例３－１．ＳＯＤ及びＳＯＤ－ＥＶの予防的及び治療的投与後の肺の視覚的評価
コロナウイルス感染症に対するＳＯＤ及びＳＯＤ－ＥＶの予防及び治療効果を確認するために、動物実験用に６週齢のシリアンハムスター（雄）４０匹をＣｅｎｔｒａｌＬａｂ．ＡｎｉｍａｌＩｎｃ．から購入した。購入したシリアンハムスターを以下の表２に示したような８つの群に分け、それぞれＳＯＤ、ＳＯＤ－ＥＶ、並びにＳＯＤ及びＳＯＤ－ＥＶをそれぞれハムスターに投与し、呼吸器ウイルスであるＳａｒｓ－Ｃｏｖ２を負荷ウイルスとして使用した。

コロナウイルス感染症の処置効果を試験するための群として、処置モードとしてＧ１～Ｇ３に分類した。Ｇ１にはＳＯＤ－ＥＶ、Ｇ２にはＳＯＤ、並びにＧ３にはＳＯＤ及びＳＯＤ－ＥＶを、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ２負荷の当日から負荷の４日後まで毎日投与した。

コロナウイルス感染症の予防効果を試験するための群として、予防モードとしてＧ４～Ｇ６に分類した。Ｇ４にはＳＯＤ－ＥＶ、Ｇ５にはＳＯＤ、並びにＧ６にはＳＯＤ及びＳＯＤ－ＥＶを、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ２の負荷２日前から負荷の４日後まで１日１回投与した。

Ｇ７には試験物質を使用せずにウイルスを負荷し、Ｇ８にはウイルス負荷を含まないＳＯＤ－ＥＶ及びＳＯＤのみを投与した。治療モード及び予防モードそれぞれの実験計画は図３に示した通りである。

Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ２を負荷しなかったＧ８を除き、Ｇ１～Ｇ７全てにおいてＳａｒｓ－Ｃｏｖ２負荷後に肺損傷が観察された。

しかし、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ２負荷後にＳＯＤ及び／又はＳＯＤ－ＥＶを投与したＧ１～Ｇ３の肺損傷スコアは、Ｇ７のスコアよりも低かった（図４を参照のこと）。特に、ＳＯＤのみを投与したＧ２及びＳＯＤ－ＥＶをＳＯＤと一緒に投与したＧ３で示された肺損傷は、Ｇ７で観察された肺損傷と比較して統計的に有意な差を示しており（ｐ＜０．０５）、ＳＯＤを単独で、又はＳＯＤ及びＥＶを一緒に使用した場合、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ２などの呼吸器系ウイルスによって引き起こされる感染症の治療効果が優れていたことを示している。

さらに、負荷の２日前にＳＯＤ及び／又はＳＯＤ－ＥＶを投与したＧ４、Ｇ５、及びＧ６は、ＳＯＤ及び／又はＳＯＤ－ＥＶを投与しなかったＧ７よりも少ない肺損傷を示した（図５及び図６を参照のこと）。特に、ＳＯＤ－ＥＶとＳＯＤを一緒に投与したＧ６は、Ｇ７と比較して肺損傷において統計的に有意な差を示した（ｐ＜０．０５）。これらの実験結果は、ＳＯＤ及びＥＶを一緒に使用した場合、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ２などの呼吸器系ウイルスによって引き起こされる感染症の処置効果が優れていることを示している。

さらに、ＳＯＤ－ＥＶ及び／又はＳＯＤを投与したＧ１～Ｇ３における肺水腫及び炎症は、Ｇ７で確認されたものよりも少なかった（図７の治療モードを参照のこと）。

一方、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ２負荷の前にＳＯＤ－ＥＶ及び／又はＳＯＤを投与したＧ４～Ｇ６における肺水腫及び炎症は、Ｇ７よりも少なかった（図７の予防モードを参照のこと）。

実施例３－２．ＳＯＤ及びＳＯＤ－ＥＶの予防的及び治療的投与後の肺の病理組織学的評価
コロナウイルス感染症に対するＳＯＤ及びＳＯＤ－ＥＶの予防及び治療効果を確認するために、実施例３－１で肉眼で評価した８つの群の肺の病理組織学的検査を実施した。

詳細には、８つの群の肺から組織切片を採取し、各組織切片を１０％中性緩衝ホルマリン溶液中で２４時間固定した。固定した組織切片を自動組織処理装置に入れて組織内の水分を除去し、パラフィンを組織に浸透させた。浸潤処理完了後、組織切片を枠に入れ、枠内にパラフィンを流し込んで所定の形状のブロックを形成し、形成したブロックを冷却した後、ミクロトームを使用して厚さ４μｍに切断した。

上記の方法で作製したスライドに対して、以下のようにＨ＆Ｅ染色を実施した。

まず、パラフィン組織切片を含むスライドをそれぞれ別のキシレンに５分間入れて脱パラフィンし、その後１００％エタノールで３分間２回、８０％エタノールで２分間、及び７０％エタノールで２分間処理して再水和した。

切片を水道水で５分間洗浄した後、組織スライドをハリスヘマトキシリン中に１０分間入れ、水道水で３分間洗浄した。切片を０．５％酸性アルコールに素早く２回浸して残留物を除去し、水道水で１分間洗浄し、洗浄した切片を１％アンモニア溶液に２分間入れて青色を呈させた。その後、切片を９５％エタノールに１０秒間軽く浸し、次いでエオシンで１分３０秒染色した。染色した切片を１００％エタノール中で５０秒間３回脱水して、透明にするためにキシレンに５分間２回入れた。

Ｈ＆Ｅ染色を行ったスライドのカバースリップ上に水性固定溶液を１滴滴下した後、スライドを乾燥させ、結果を光学顕微鏡で観察した。

表３を病理組織学的スコアの基準として使用して病理組織学的検査を実施し、その結果を以下の表４、並びに図８及び９に示す。

病理組織学的検査によって、ＳＯＤ及び／又はＳＯＤ－ＥＶを投与したＧ１～Ｇ６で観察されたコンソリデーション及び気管支上皮萎縮は、ＳＯＤ及び／又はＳＯＤ－ＥＶを投与しなかったＧ７で観察されたものよりも有意に少ないことが示された（表４を参照のこと）。

さらに、負荷後にＳＯＤ及び／又はＳＯＤ－ＥＶを投与したＧ１、Ｇ２、及びＧ３は、ＳＯＤ及び／又はＳＯＤ－ＥＶを投与しなかったＧ７よりも病理組織学的スコアが低かった（図８を参照のこと）。特に、ＳＯＤのみを投与したＧ２及びＳＯＤと一緒にＳＯＤ－ＥＶを投与したＧ３で示された病理組織学的スコアは、Ｇ７で示されたものと比較して有意な差を示した（ｐ＜０．０１）。

さらに、ウイルスのみを負荷したＧ７は重度の気管支上皮萎縮を有し、したがって気管支上皮はほとんど観察されず、負荷の２日前にＳＯＤ及び／又はＳＯＤ－ＥＶを投与したＧ４、Ｇ５、及びＧ６は、Ｇ７よりも病理組織学的スコアが低かった（図９を参照のこと）。特に、ＳＯＤと一緒にＳＯＤ－ＥＶを投与したＧ６で示された病理組織学的スコアは、Ｇ７で示されたものと比較して有意な差を示した（ｐ＜０．０５）。

すなわち、病理組織学的スコアは肉眼で観察される肺障害スコアに対して一貫したパターンを示し、特に、コンソリデーション及び気管支上皮萎縮の予防及び処置効果が優れていることがわかった。

Claims

コロナウイルス感染症の予防及び／又は処置のための医薬組成物であって、
（ｉ）スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を有するポリペプチド、
（ｉｉ）ＳＯＤを含有する細胞外小胞（ＳＯＤ－ＥＶ）、又は
（ｉｉｉ）ＳＯＤ活性を有するポリペプチド及びＳＯＤを含有する細胞外小胞（ＳＯＤ－ＥＶ）
を活性成分として含み、前記ポリペプチドが、バチルスアミロリケファシエンス株に由来し、前記ＳＯＤ－ＥＶが、バチルスズブチリス株に由来する、医薬組成物。
コロナウイルス感染症の予防及び／又は改善のための食品組成物であって、
（ｉ）スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を有するポリペプチド、
（ｉｉ）ＳＯＤを含有する細胞外小胞（ＳＯＤ－ＥＶ）、又は
（ｉｉｉ）ＳＯＤ活性を有するポリペプチド及びＳＯＤを含有する細胞外小胞（ＳＯＤ－ＥＶ）
を活性成分として含み、前記ポリペプチドが、バチルスアミロリケファシエンス株に由来し、前記ＳＯＤ－ＥＶが、バチルスズブチリス株に由来する、食品組成物。
前記コロナウイルス感染症が、風邪、肺炎、間質性肺炎、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、副鼻腔炎、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ２感染症、耳炎、及び咽頭炎からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物又は請求項２に記載の食品組成物。
ＳＯＤ活性を有する前記ポリペプチド及び／又はＳＯＤを含有する前記細胞外小胞が、点鼻薬によって投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
ＳＯＤ活性を有する前記ポリペプチド及びＳＯＤを含有する前記細胞外小胞が、同時に、又は順次投与される、請求項１に記載の医薬組成物又は請求項２に記載の食品組成物。
コロナウイルス感染症の予防及び／又は処置のための薬物を調製するための、請求項１に記載の医薬組成物の使用。
コロナウイルス感染症の予防及び／又は改善のための食品を製造するための、請求項２に記載の食品組成物の使用。