JP7600993B2 - ペプチド内包フェリチン - Google Patents

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Description

本発明は、ペプチド内包フェリチンなどに関する。
細胞内の蛋白質や核酸を標的とし、生理活性を有するペプチドは医薬品としての応用が期待されている（非特許文献１）。しかし、それらのペプチドの多くは細胞膜透過性に課題を抱えており、様々な細胞内への送達技術が検討されている。
リポソームに代表されるナノ粒子・マイクロ粒子に、目的ペプチドを内包させ、リポソームと細胞膜を融合させることで、目的ペプチドを細胞内に送達するアプローチが報告されている（特許文献１）。また、細胞膜透過性を持つ分子やペプチドと融合させ、細胞膜を透過あるいはエンドソームにより細胞に取り込みませ、目的ペプチドを細胞内に送達するアプローチも報告されている（非特許文献２）。
ところで、フェリチンは、動植物から微生物まで普遍的に存在する、複数の単量体から構成される内腔を有する球状タンパク質である。ヒト等の動物では、フェリチンを構成する単量体としてＨ鎖およびＬ鎖の２種の単量体が存在すること、ならびにフェリチンは２４個の単量体から構成される多量体（多くの場合、Ｈ鎖およびＬ鎖の混合物）であって、外径１２ｎｍのカゴ状の形態および内径７ｎｍの内腔を有することが知られている。フェリチンは、生体あるいは細胞中の鉄元素のホメオスタシスに深く関わっており、その内腔中に鉄を保持できるため、鉄の輸送・貯蔵等の生理学的機能の役割を担うことが知られている。また、フェリチンは、トランスフェリン受容体提示細胞に取り込まれることが知られている（非特許文献３）。
フェリチンはまた、その内腔中に低分子有機化合物を封入するＤＤＳ担体（特許文献２）としての応用が検討されており、また、電子デバイスの作製にも利用されている。
米国特許第４，５１５，７３６号 中国特許出願公開第１０６１１０３３３号公報
Ｙ． Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２０１２；７（３）：６０７－６１３ Ｚ． Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｐ． ２０１６； ４（５）： ５２８－５３４ Ｌ． Ｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１０；１０７（８）：３５０５－１０
上述のように、目的ペプチドを細胞内に送達するアプローチとしては、リポソームまたは細胞透過性ペプチドの使用が報告されている。しかしながら、リポソームおよび細胞透過性ペプチドは通常、中性のｐＨ領域では、正に荷電しているため、細胞膜との相互作用により細胞膜を破壊するという課題がある。また、リポソームについては、リポソームが免疫原性を示し得ること、およびリポソームの代謝物が毒性を示し得るという課題もある。
したがって、本発明の目的は、上記のような細胞膜の破壊、免疫原性および毒性を回避できる、ペプチドの送達手段を提供することである。
本発明者らは、鋭意検討した結果、所定のペプチドをフェリチンに内包できること、このような所定のペプチドの使用によりペプチド内包フェリチンを作製できること、およびこのようなペプチド内包フェリチンの使用により所定のペプチドを特定の細胞の細胞内に送達できることを見出した。
フェリチンは、中性のｐＨ領域では負に帯電しており、また、トランスフェリン受容体を介して特定の細胞に取り込まれる。したがって、所定のペプチドを内包しているフェリチンの使用により、細胞膜を破壊せずに、所定のペプチドを細胞内に送達させることで、上記課題を解決できる。また、フェリチンは、ヒト等の哺乳動物に天然に存在する天然タンパク質であるため、フェリチンの種類（フェリチンが由来する哺乳動物種）と、ペプチド内包フェリチンが投与される哺乳動物種とを一致させることで、免疫原性の課題を解決できる。さらに、フェリチンは、天然アミノ酸で構成されており、天然アミノ酸の代謝物も生体中に存在する天然物質であることに照らすと、天然アミノ酸の代謝物には細胞毒性も懸念されないため、代謝物による細胞毒性の課題も解決することができる。
以上のように、本発明者らは、上記課題を解決することに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ペプチドが、３～１９個のアミノ酸残基から構成され、かつ
下記条件：
ａ）－１０．２≦Ｘ≦５．９、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４；
（ここで、ＸはｐＨ９でのペプチドの電荷を示し、Ｙはペプチドの化学式量を示す）
を満たす、ペプチド内包フェリチン。
〔２〕ペプチドが４～１６個のアミノ酸残基から構成される、〔１〕のペプチド内包フェリチン。
〔３〕ペプチドが下記条件：
ｂ）－１０．２≦Ｘ≦０．０、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４；あるいは
ｃ）３．７≦Ｘ≦５．９、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４
（ここで、ＸおよびＹは〔１〕と同じである）
を満たす、〔１〕または〔２〕のペプチド内包フェリチン。
〔４〕ペプチドの細胞内送達剤であって、
ペプチド内包フェリチンを含み、
ペプチドが、３～１９個のアミノ酸残基から構成され、かつ
下記条件：
ａ）－１０．２≦Ｘ≦５．９、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４；
（ここで、ＸはｐＨ９でのペプチドの電荷を示し、Ｙはペプチドの化学式量を示す）
を満たす、ペプチドの細胞内送達剤。
〔５〕ペプチドがヒト細胞の細胞内に送達される、〔４〕の剤。
〔６〕ペプチドが癌細胞の細胞内に送達される、〔４〕または〔５〕の剤。
〔７〕ペプチド内包フェリチンの製造方法であって、
１）ペプチドの存在下または不在下において、フェリチンをｐＨ３．０以下の緩衝液中で放置して、フェリチンを解離させること；および
２）解離したフェリチンおよびペプチドをｐＨ５．０以上１０．０以下の緩衝液中に共存させて、ペプチド内包フェリチンを生成すること；
を含み、
ペプチドが、３～１９個のアミノ酸残基から構成され、かつ
下記条件：
ａ）－１０．２≦Ｘ≦５．９、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４；
（ここで、ＸはｐＨ９でのペプチドの電荷を示し、Ｙはペプチドの化学式量を示す）
を満たす、製造方法。
本発明のペプチド内包フェリチンは、細胞膜を破壊せずに、所定のペプチドを細胞内に送達できる。本発明のペプチド内包フェリチンはまた、免疫原性、および代謝物による細胞毒性の双方を回避できる。本発明のペプチド内包フェリチンはさらに、所定のペプチドをトランスフェリン受容体提示細胞（特に、トランスフェリン受容体の発現量が高い細胞）の細胞内に特異的かつ再現良く送達できる。
図１は、カラムクロマトグラフィーによる、フェリチン（ＦＴＨ）およびペプチド（ＰＫＣ－Ｆ）の複合体の形成の確認を示す図である。 図２は、フェリチン（ＦＴＨ）に内包されたペプチド（ＰＫＣ－Ｆ）に対する、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す図である。 図３は、ペプチド（ＰＫＣ－Ｆ）に対する、ＬＣ－ＭＳ分析の結果を示す図である。 図４は、ペプチド（ＰＫＣ－Ｆ）内包フェリチン（ＦＴＨ）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示す図である。 図５は、ペプチド（ＰＫＣ－Ｆ）非内包フェリチン（ＦＴＨ）、およびペプチド（ＰＫＣ－Ｆ）内包フェリチン（ＦＴＨ）の表面電荷の比較を示す図である。 図６は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）提示細胞（ＳＫＢＲ－３細胞）内へのペプチド（ＰＫＣ－Ｆ）の取込みの測定結果を示す図である。ペプチド（ＰＫＣ－Ｆ）は、フェリチン（ＦＴＨ）に内包されている状態（試験対象）、およびペプチド（ＰＫＣ－Ｆ）のみの状態（陰対象）で用いられた。 図７は、二光子励起蛍光顕微鏡による、トランスフェリン受容体ＴｆＲ提示細胞（ＳＫＢＲ－３細胞）内へのペプチド（ＰＫＣ－Ｆ）の取込みの測定結果を示す図である。ペプチド（ＰＫＣ－Ｆ）は、フェリチン（ＦＴＨ）に内包されている状態（試験対象）、およびペプチド（ＰＫＣ－Ｆ）のみの状態（陰対象）で用いられた。 図８は、カラムクロマトグラフィーによる、フェリチン（ＦＴＨ）およびペプチド（ＦＡＭ－ＳＶ４０）の複合体の形成の確認を示す図である。 図９は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による、トランスフェリン受容体ＴｆＲ提示細胞（ＳＫＢＲ－３細胞）内へのペプチド（ＦＡＭ－ＳＶ４０）の取込みの測定結果を示す図である。ペプチド（ＦＡＭ－ＳＶ４０）は、フェリチン（ＦＴＨ）に内包されている状態（試験対象）、およびペプチド（ＦＡＭ－ＳＶ４０）のみの状態（陰対象）で用いられた。 図１０は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による、トランスフェリン受容体ＴｆＲ提示細胞（ＴｆＲ発現量の多いＳＫＢＲ－３細胞、およびＴｆＲ発現量の低いＨＥＫ２９３Ｅ細胞）間でのペプチド（ＦＡＭ－ＳＶ４０）の取込みの比較を示す図である。 図１１は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による、トランスフェリン受容体ＴｆＲ提示細胞（ＴｆＲ発現量の多いＳＫＢＲ－３細胞、およびＴｆＲ発現量の低いＨＥＫ２９３Ｅ細胞）間でのペプチド（ＦＡＭ－ＳＶ４０）の取込みの比較を示す図である。図１０の結果が図１１にプロットされている。 図１２は、脱会合・再会合プロセスを行った場合におけるペプチド（ＣｌＡｃ－ＦＨＣ）内包フェリチン（ＦＴＨ）由来のペプチド（ＣｌＡｃ－ＦＨＣ）のＭＳピークの存在（Ａ）、および脱会合・再会合プロセスを行わなかった場合における同ＭＳピークの不存在（Ｂ）を示す図である。 図１３は、脱会合・再会合プロセスを行った場合におけるペプチド（ＥＧＦＲ、ｃｙｌｏＲＧＤｆＶ、またはＦＧＦ３－ＦＰ１６）内包フェリチン（ＦＴＨ）由来のペプチド（ＥＧＦＲ、ｃｙｌｏＲＧＤｆＶ、またはＦＧＦ３－ＦＰ１６）のＭＳピークの存在を示す図である。 図１４は、脱会合・再会合プロセスを行った場合におけるペプチド（Ｈｙｍｅｎｉｓｔａｔｉｎ Ｉ、Ｅｘ１０、またはανβ６）内包フェリチン（ＦＴＨ）由来のペプチド（Ｈｙｍｅｎｉｓｔａｔｉｎ Ｉ、Ｅｘ１０、またはανβ６）のＭＳピークの存在を示す図である。 図１５は、脱会合・再会合プロセスを行った場合におけるペプチド（ＮＲＰ－１－２、Ｍｕｒｅｐａｖａｄｉｎ、またはＰａｋｔｉ－Ｌ１）内包フェリチン（ＦＴＨ）由来のペプチド（ＮＲＰ－１－２、Ｍｕｒｅｐａｖａｄｉｎ、またはＰａｋｔｉ－Ｌ１）のＭＳピークの存在を示す図である。 図１６は、脱会合・再会合プロセスを行った場合におけるペプチド（ＮＳ、ＧＲＰ７８－３、またはＦＢＰ００３２）内包フェリチン（ＦＴＨ）由来のペプチド（ＮＳ、ＧＲＰ７８－３、またはＦＢＰ００３２）のＭＳピークの存在を示す図である。 図１７は、脱会合・再会合プロセスを行った場合におけるペプチド（ＦＢＰ００３３）内包フェリチン（ＦＴＨ）由来のペプチド（ＦＢＰ００３３）のＭＳピークの存在を示す図である。 図１８は、フェリチン（ＦＴＨ）での各種ペプチドの内包の可否について、ペプチドのｐＨ９でのペプチドの電荷とペプチドの化学式量の間の相関性を示す図である（試行数３回）。●：３回とも再現性良く内包が確認されたペプチド；△：内包が確認できた場合が２回以下であったペプチド；×：１回も内包が確認できなかったペプチド。すなわち、ａ）－１０．２≦ｐＨ９でのペプチドの電荷（Ｘ）≦５．９、かつ４４５≦ペプチドの化学式量（Ｙ）≦２５２４の条件を満たすペプチドをフェリチンに内包することができた。また、上記条件を満たすペプチドの内、ｂ）－１０．２≦Ｘ≦０．０、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４、あるいはｃ）３．７≦Ｘ≦５．９、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４の条件を満たすペプチドはフェリチンに再現性良く内包できていた。 図１９は、カラムクロマトグラフィーによる、フェリチン（ＦＴＬ）およびペプチド（ＰＫＣ－Ｆ）の複合体の形成の確認を示す図である。
本発明は、ペプチドが、３～１９個のアミノ酸残基から構成され、かつ
下記条件：
ａ）－１０．２≦Ｘ≦５．９、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４；
（ここで、ＸはｐＨ９でのペプチドの電荷を示し、Ｙはペプチドの化学式量を示す）
を満たす、ペプチド内包フェリチンを提供する。
ペプチドを構成するアミノ酸は、アミノ基およびカルボキシ基の双方を有する化合物である限り特に限定されない。例えば、ペプチドを構成するアミノ酸は、タンパク質を構成する天然アミノ酸（２０種のＬ－α－アミノ酸）であっても、タンパク質を構成しない非天然アミノ酸であってもよい。天然アミノ酸としては、例えば、Ｌ－アラニン（Ａ）、Ｌ－アスパラギン（Ｎ）、Ｌ－システイン（Ｃ）、Ｌ－グルタミン（Ｑ）、Ｌ－イソロイシン（Ｉ）、Ｌ－ロイシン（Ｌ）、Ｌ－メチオニン（Ｍ）、Ｌ－フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ－プロリン（Ｐ）、Ｌ－セリン（Ｓ）、Ｌ－スレオニン（Ｔ）、Ｌ－トリプトファン（Ｗ）、Ｌ－チロシン（Ｙ）、Ｌ－バリン（Ｖ）、Ｌ－アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ－グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ－アルギニン（Ｒ）、Ｌ－ヒスチジン（Ｈ）、Ｌ－リジン（Ｋ）、およびグリシン（Ｇ）が挙げられる。非天然アミノ酸としては、例えば、Ｌ体またはＤ体の任意の非天然アミノ酸（例、α－アミノ酸、β－アミノ酸、およびγ－アミノ酸）を使用することができる。より具体的には、非天然アミノ酸としては、例えば、２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、オルニチン、ホモヒスチジン、ホモフェニルアラニン、シクロロイシン、１－アミノシクロヘキサンカルボン酸、カルボキシシクロプロピルアミン、２－アミノシクロヘキサンカルボン酸、１－アミノシクロブタンカルボン酸、ｔｅｒｔ－ロイシン、ノルバリン、ノルロイシン、ピログルタミン、ペニシラミン、ホモアミノ酸、４－アミノブチル酸、６－アミノヘキサン酸、７－アミノヘプタン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ酪酸、５－アミノレブリン酸、Ｄ－２－アミノアジピン酸、ならびに上記天然アミノ酸および非天然アミノ酸の修飾化合物（例えば、Ｎ－メチル化等のＮ－アルキル化化合物、カルボベンゾキシアミノ化化合物、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル化化合物、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル化化合物やアジド化化合物）が挙げられる。
ペプチドは、天然アミノ酸のみから構成されていてもよく、非天然アミノ酸のみから構成されていてもよく、天然アミノ酸および非天然アミノ酸の混合物から構成されていてもよい。ペプチドはまた、Ｎ末端アミノ基、およびＣ末端カルボキシ基が保護されたものであっても、保護されていないものであってもよい。Ｎ－末端アミノ基の保護基としては、例えば、アルキルカルボニル基（アシル基）（例、アセチル基、プロポキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基等のブトキシカルボニル基）、アルキルオキシカルボニル基（例、フルオレニルメトキシカルボニル基）、アリールオキシカルボニル基、アリールアルキル（アラルキル）オキシカルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル基）が挙げられる。Ｃ－末端カルボキシ基の保護基としては、例えば、エステルまたはアミドを形成可能な基が挙げられる。エステルまたはアミドを形成可能な基としては、例えば、アルキルオキシ基（例、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ）、アリールオキシ基（例、フェニルオキシ、ナフチルオキシ）、アラルキルオキシ基（例、ベンジルオキシ）、アミノ基が挙げられる。
ペプチドは、主鎖がアミド結合及び炭素鎖から構成されていてもよい。炭素鎖としては、例えば、アルキレン（例、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等のＣ１～Ｃ６アルキレン）、シクロアルキレン（例、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、シクロへプチレン、シクロオクチレン等のＣ３～Ｃ８シクロアルキレン）、アリーレン（例、フェニレン、ナフチレン等のＣ６～Ｃ１２アリーレン）が挙げられる。あるいは、ペプチドは、主鎖がアミド結合以外の結合構造、および／または炭素鎖以外の鎖構造を含むように構成されていてもよい。アミド結合以外の結合構造としては、例えば、Ｎ－アルキルアミド結合（例、Ｎ－メチルアミド結合、Ｎ－エチルアミド結合等の、窒素原子上にＣ１～Ｃ６アルキルを有するアミド結合）、エステル結合、エーテル結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、およびチオエステル結合が挙げられる。炭素鎖以外の鎖構造としては、例えば、ヘテロ環（例、オキサゾール、メチルオキサゾール、チアゾール、トリアゾール）を含む構造が挙げられる。
ペプチドはまた、直鎖状もしくは分岐状、または環状の構造を有することができる。例えば、環状の構造を有するペプチドは、Ｎ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基がアミド結合を介して環化したものであってもよい。また、複数（例、２個）のシステイン残基を含むペプチドは、システイン残基の側鎖にあるチオール基を介してジスルフィド結合を形成することにより、環状の構造を形成することができる。さらに、１個のシステイン残基を含むペプチドであっても、Ｎ末端アミノ酸残基またはＣ末端アミノ酸残基のいずれかと結合することにより、環状の構造を形成することもできる。
ペプチドを構成するアミノ酸残基数は、３～１９個である。ペプチドを構成するアミノ酸残基数は、好ましくは４個以上であってもよい。ペプチドを構成するアミノ酸残基数はまた、１８個以下、好ましくは１７個以下、より好ましくは１６個以下であってもよい。より具体的には、ペプチドを構成するアミノ酸残基数は、３～１８個、３～１７個、３～１６個、４～１８個、４～１７個、または４～１６個であってもよい。
本発明において、フェリチンに内包されるペプチドは、図１８に示されるように、下記条件を満たす。
ａ）－１０．２≦Ｘ≦５．９、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４；
（ここで、ＸはｐＨ９でのペプチドの電荷を示し、Ｙはペプチドの化学式量を示す）
ペプチドの化学式量の値は、ペプチドの組成式に基づいて原子量と原子数の積の総和として求めることができる。
ｐＨ９でのペプチドの電荷は、ＣｈｅｍＡｘｏｎ（Ｏ．Ｔｏｕｒｅ ｅｔ． ａｌ．， Ｏｉｌ Ｇａｓ Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１３， ６８， ２８１－２９７．）を利用して評価することができるが（実施例を参照）、ＣｈｅｍＡｘｏｎでの評価が所望されない場合（例えば、ＣｈｅｍＡｘｏｎでの評価が困難である又は正確性に欠ける極めて特殊なペプチドが用いられる場合）、Ｌ．Ｓｅｔｔｉｍｏ ｅｔ． ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ２０１４， ３１， １０８２－１０９５．に記載される実験的手法により評価してもよい。
理論によって本発明が拘束されることを望まないが、上記条件を満たすペプチドがフェリチンに内包される理由としては、以下が考えられる。
（１）－１０．２≦Ｘの条件が望ましい理由
ｐＨ５より高いｐＨの水溶液中でフェリチンは強く負に帯電する。そのため、フェリチンの内包に用いられる溶液のｐＨ（例、ｐＨ９）では、中性から正に帯電した分子はフェリチンに内包され易く、強い負に帯電した分子はフェリチンに内包され難いと考えられる。そのため、－１０．２＞Ｘの強く負に帯電したペプチドはフェリチンとの電気的反撥により、フェリチンに内包され難いと考えられる。一方、－１０．２≦Ｘのペプチドでは、ペプチド－フェリチン間の負電荷の反撥よりもフェリチンがかご状の超分子構造を形成する力の方が強いため、フェリチンに内包された可能性がある。
（２）Ｘ≦５．９の条件が望ましい理由
あまりにも強く正に帯電したペプチドは、電気的相互作用によりフェリチンの内外にペプチドが吸着し、フェリチンのカゴ状構造の形成を妨げ、内包されない可能性がある。また、強く正に帯電したペプチドは凝集しやすく、フェリチンに内包できないサイズの粒子を形成し、内包されない可能性もある。
（３）４４５≦Ｙの条件が望ましい理由
化学式量があまりにも小さいペプチドは、フェリチンがかご状構造を形成している途中で、フェリチン内部から拡散により流出してしまい、内包されにくい可能性がある。
（４）Ｙ≦２５２４の条件が望ましい理由
フェリチン内腔の直径は７ｎｍであり、化学式量が大きいため、かさ高い分子はフェリチンに内包され難いと考えられる。
好ましくは、フェリチンによるペプチドの内包に関する再現性の向上等の観点より、ペプチドは、下記条件を満たす：
ｂ）－１０．２≦Ｘ≦０．０、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４、あるいはｃ）３．７≦Ｘ≦５．９、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４
（５）０．０＜Ｘ＜３．７を除外した理由
化学式量がある程度大きく、あまり帯電していないペプチドは、ペプチド分子自体が凝集し、フェリチンに内包できないサイズの粒子を形成するため、フェリチンに内包され難いと考えられる。
本発明では、フェリチンとして、種々の動物に由来するフェリチンを使用することができる。フェリチンが由来する動物としては、例えば、哺乳動物または鳥類（例、ニワトリ）が挙げられるが、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、家畜および使役用の哺乳動物（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）が挙げられる。
ヒト等の動物では、フェリチンを構成するフェリチン単量体としてフェリチンＨ鎖およびＬ鎖の２種の単量体が存在すること、ならびにフェリチンは２４個の単量体から構成される多量体（多くの場合、Ｈ鎖およびＬ鎖の混合物）であることが知られている。したがって、本発明では、フェリチンＨ鎖のみから構成されるフェリチン、フェリチンＬ鎖のみから構成されるフェリチン、並びにフェリチンＨ鎖およびＬ鎖の混合物から構成されるフェリチンを用いることができる。
フェリチン単量体としては、天然フェチリン単量体、または２４量体の形成能を有するその遺伝子組換えフェリチン単量体のいずれも使用することができる。例えば、遺伝子組換えフェチリン単量体は、フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックス間のフレキシブルリンカー領域において改変されていてもよい。このような遺伝子組換えフェチリン単量体としては、例えば、フェリチン単量体を構成する６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて１番目と２番目の間、２番目と３番目の間、３番目と４番目の間、４番目と５番目の間、または５番目と６番目の間のフレキシブルリンカー領域に機能性ペプチドが挿入されたフェリチン単量体が挙げられる（例、米国特許出願公開第２０１６／００６０３０７号；Ｊａｅ Ｏｇ Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ（２０１３），７（９），７４６２－７４７１；Ｓｏｏｊｉ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１６），１７（３），１１５０－１１５９；Ｙｏｕｎｇ Ｊｉ Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１２），１３（１２），４０５７－４０６４を参照）。例えば、ヒトフェリチンＨ鎖（配列番号１）、およびヒトフェリチンＬ鎖（配列番号２）では、６つのα－ヘリックスのうちのＮ末端から数えて１～６番目のα－ヘリックスは、表１に示されるとおりである。したがって、ヒトフェリチンＨ鎖（配列番号１）のフレキシブルリンカー領域は、１番目と２番目の間のフレキシブルリンカー領域（４３～４９位のアミノ酸残基からなる領域）、２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域（７８～９６位のアミノ酸残基からなる領域）、３番目と４番目の間のフレキシブルリンカー領域（１２５～１２７位のアミノ酸残基からなる領域）、４番目と５番目の間のフレキシブルリンカー領域（１３８位のアミノ酸残基の位置）、または５番目と６番目の間のフレキシブルリンカー領域（１６０～１６４位のアミノ酸残基の領域）である。また、ヒトフェリチンＬ鎖（配列番号２）のフレキシブルリンカー領域は、１番目と２番目の間のフレキシブルリンカー領域（３８～４５位のアミノ酸残基からなる領域）、２番目と３番目の間のフレキシブルリンカー領域（７４～９２位のアミノ酸残基からなる領域）、３番目と４番目の間のフレキシブルリンカー領域（１２１～１２３位のアミノ酸残基からなる領域）、４番目と５番目の間のフレキシブルリンカー領域（１３４位のアミノ酸残基の位置）、または５番目と６番目の間のフレキシブルリンカー領域（１５５～１５９位のアミノ酸残基の領域）である。
Figure 0007600993000001
遺伝子組換えフェチリン単量体はまた、そのＮ末端領域および／またはＣ末端領域において改変されていてもよい。フェリチン単量体のＮ末端は多量体の表面上に露出され、そのＣ末端は表面上に露出し得ない。したがって、フェリチン単量体のＮ末端に付加されるペプチド部分は多量体の表面に露出して、多量体の外部に存在する標的材料と相互作用することができる（例、国際公開第２００６／１２６５９５号）。一方、フェリチン単量体のＣ末端は、そのアミノ酸残基を改変することで、フェリチン内腔中に内包される有機化合物と相互作用することができる（例、Ｙ．Ｊ．Ｋａｎｇ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１２，ｖｏｌ．１３（１２），４０５７）。このような遺伝子組換えフェチリン単量体としては、例えば、Ｎ末端またはＣ末端に機能性ペプチドが付加されたフェリチン単量体が挙げられる。
好ましくは、フェリチンは、臨床応用の観点より、ヒトフェリチンである。ヒトフェリチンとして、ヒトフェリチンＨ鎖のみから構成されるヒトフェリチン、ヒトフェリチンＬ鎖のみから構成されるヒトフェリチン、並びにヒトフェリチンＨ鎖およびＬ鎖の混合物から構成されるヒトフェリチンを用いることができる。
好ましくは、ヒトフェリチンＨ鎖は、以下であってもよい：
（Ａ１）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる、１もしくは数個のアミノ酸残基の修飾を含むアミノ酸配列を含み、かつ、２４量体形成能を有するタンパク質；または
（Ｃ１）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、２４量体形成能を有するタンパク質。
好ましくは、ヒトフェリチンＬ鎖は、以下であってもよい：
（Ａ２）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ２）配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる、１もしくは数個のアミノ酸残基の修飾を含むアミノ酸配列を含み、かつ、２４量体形成能を有するタンパク質；または
（Ｃ２）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、２４量体形成能を有するタンパク質。
上記（Ｂ１）および（Ｂ２）では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の修飾により、１個または数個のアミノ酸残基を改変することができる。アミノ酸残基の修飾は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。用語「１または数個」が示す数は、例えば１～５０個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～３０個、さらにより好ましくは１～２０個、特に好ましくは１～１０個または１～５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
上記（Ｃ１）および（Ｃ２）では、タンパク質の同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐにより行うことができる。より具体的には、ポリペプチドの同一性の算定％は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｐにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を用いて行うことができる。
アミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであるが、配列アライメントをさらに参考にして特定されてもよい。具体的には、当業者は、１）複数のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、配列アライメントを利用することによりアミノ酸配列において変異を導入すべき位置を特定でき、また、既知の二次および三次構造情報を併用して、アミノ酸配列において変異を導入すべきアミノ酸残基の位置を特定することもできる。好ましくは、変異の導入部位として、上記フレキシブルリンカー領域、並びにＮ末端およびＣ末端領域を利用することができる。
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
遺伝子組換えフェチリン単量体はまた、機能性ペプチドを含む遺伝子組換えフェチリン単量体であってもよい。機能性ペプチドとしては、目的タンパク質と融合された場合に任意の機能を目的タンパク質に付加することができるペプチドを用いることができる。このような機能性ペプチドとしては、生体有機分子に対する結合能を有するペプチド、プロテアーゼ分解性ペプチド、安定化ペプチド、細胞透過性ペプチドが挙げられる。
生体有機分子としては、例えば、タンパク質（例、オリゴペプチドまたはポリペプチド）、核酸（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）、糖質（例、モノサッカリド、オリゴサッカリドまたはポリサッカリド）、脂質が挙げられる。生体有機分子はまた、細胞表面抗原（例、癌抗原、心疾患マーカー、糖尿病マーカー、神経疾患マーカー、免疫疾患マーカー、炎症マーカー、ホルモン、感染症マーカー）であってもよい。生体有機分子はまた、疾患抗原（例、癌抗原、心疾患マーカー、糖尿病マーカー、神経疾患マーカー、免疫疾患マーカー、炎症マーカー、ホルモン、感染症マーカー）であってもよい。このような生体有機分子に対する結合能を有するペプチドとしては、タンパク質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｆ．Ｄａｎｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１２，ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１１，ｐ．２９６１；Ｃ－Ｈ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０１５，ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２９０，２９０－９１；Ｌ．Ｖａｎｎｕｃｃｉ ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２，ｖｏｌ．７，ｐ．１４８９；Ｊ．Ｃｕｔｒｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１，ｖｏｌ．１９（８），ｐ．１４６８；Ｒ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１７，ｖｏｌ．１１０－１１１，ｐ．１３を参照）、核酸に対する結合能を有するペプチド（例、Ｒ．Ｔａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５、ｖｏｌ．９２，ｐ．５２８２；Ｒ．Ｔａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｃｅｌｌ、１９９３、ｖｏｌ．７３， ｐ．１０３１；Ｒ．Ｔａｌａｎｉａｎ ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２，ｖｏｌ．３１，ｐ．６８７１を参照）、糖質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｋ．Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，ｖｏｌ．８９，Ｎｏ．１２，ｐ．５３９３－５３９７；Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．１１１，ｐ．４３６；Ａ．Ｂａｉｍｉｅｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｃｏｗ），２００５，ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１，ｐ．９０．を参照）、脂質に対する結合能を有するペプチド（例、Ｏ．Ｋｒｕｓｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｂ Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，１９９５，ｖｏｌ．５０ｃ，ｐ．３８０；Ｏ．Ｓｉｌｖａ ｅｔ．ａｌ．， Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．６，２７１２８；Ａ．Ｆｉｌｏｔｅｏ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．１７，ｐ．１１８００を参照）等の種々のペプチドが報告されている。
機能性ペプチドとしてプロテアーゼ分解性ペプチドが用いられる場合、プロテアーゼとしては、例えば、カスパーゼやカテプシンなどのシステインプロテアーゼ（Ｄ． ＭｃＩｌｗａｉｎ１ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．，２０１３，ｖｏｌ．５，ａ００８６５６；Ｖ．Ｓｔｏｋａ ｅｔ ａｌ．，ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ．２００５，ｖｏｌ．５７，Ｎｏ．４－５ｐ．３４７）、コラゲナーゼ（Ｇ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，２００７，ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．３，ｐ．６４６）、トロンビンやＸａ因子（Ｒ．Ｊｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００３，ｖｏｌ．３１，ｐ．１；Ｈ．Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．， ２０１０，ｖｏｌ．８４，Ｎｏ．２，ｐ．１０７６）、ウイルス由来プロテアーゼ（Ｃ．Ｂｙｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｒｅｓ．，２００６，ｖｏｌ．６７，ｐ．５０１）が挙げられる。
プロテアーゼ分解性ペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている（例、Ｅ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２０１５，ｖｏｌ．２５，ｐ．１２７９；Ｇ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．，２００７，ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．３，ｐ．６４６；Ｙ．Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１２，ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１２，ｐ．４０５７；Ｒ．Ｔａｌａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，ｖｏｌ．２７２，ｐ．９６７７；Ｊｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００３，ｖｏｌ．３１，ｐ．１；Ｈ．Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１０，ｖｏｌ．８４，Ｎｏ．２，ｐ．１０７６を参照）。したがって、本発明では、このようなペプチド、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなペプチド、またはそれらの変異ペプチドのアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドをプロテアーゼ分解性ペプチドとして用いることができる。
安定化ペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている（例、Ｘ．Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１１，ｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，ｐ．９７７；Ｅ．Ｆａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１６，ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．２，ｐ．５１４を参照）。したがって、本発明では、このようなペプチド、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなペプチド、またはそれらの変異ペプチドのアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドを安定化ペプチドとして用いることができる。
細胞透過性ペプチドとしては、種々のペプチドが報告されている（例、Ｚ．Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．４，Ｎｏ．５，ｐ．５２８を参照）。したがって、本発明では、このようなペプチド、またはそれらの変異ペプチド（例、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基の保存的置換等の変異）、あるいはこのようなペプチド、またはそれらの変異ペプチドのアミノ酸配列を１個または複数有するペプチドを細胞透過性ペプチドとして用いることができる。
機能性ペプチドとしては、生体有機分子に対する結合能を有するペプチドが好ましい。生体有機分子に対する結合能を有するペプチドとしては、タンパク質に対する結合能を有するペプチドがより好ましい。
本発明はまた、上述のペプチド内包フェリチンを含むペプチド送達剤を提供する。
本発明のペプチド送達剤は、フェリチンとトランスフェリン受容体提示細胞との間の相互作用を介して、ペプチド内包フェリチン中のペプチドをトランスフェリン受容体提示細胞の内部に送達することができる。トランスフェリン受容体提示細胞としては、例えば、表皮基底層、膵内分泌組織、脳下垂体、胎盤、脳内皮質、線条体、腎臓近位尿細管、食道、子宮頚管、胃粘膜上皮、胸部上皮等の組織および部位に存在する細胞、ならびに赤血球、血芽細胞、脳毛細血管内皮細胞、肝細胞、クッパー細胞、海馬ニューロン等の細胞が挙げられる。トランスフェリン受容体提示細胞としては、任意の哺乳動物に由来する細胞を利用することができる。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、家畜および使役用の哺乳動物（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）が挙げられる。臨床応用という観点から、哺乳動物は、好ましくはヒトである。
本発明のペプチド送達剤はまた、トランスフェリン受容体提示細胞全般の内部にペプチドを送達することができるが、トランスフェリン受容体の発現量が高い細胞の内部にペプチドをより特異的かつ再現良く送達することができる。したがって、トランスフェリン受容体提示細胞としては、トランスフェリン受容体の発現量が高い細胞が好ましい。トランスフェリン受容体の発現量が高い細胞としては、例えば、上述のトランスフェリン受容体提示細胞のうち、表皮基底層、膵内分泌組織、脳下垂体、胎盤等の組織および部位に存在する細胞、ならびに赤血球、血芽細胞、脳毛細血管内皮細胞、肝細胞、クッパー細胞等の細胞が挙げられる。
特定の実施形態では、トランスフェリン受容体提示細胞は、特定の疾患の原因となり得る細胞であってもよい。このような特定の疾患としては、例えば、癌、白血病、悪性リンパ腫が挙げられるが、癌が好ましい。癌としては、例えば、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、肺癌（例、扁平上皮がん、腺がんおよび大細胞がん等の非小細胞癌、ならびに小細胞癌）、消化器系癌（例、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌）、膵臓癌、腎臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、黒色腫が挙げられるが、乳癌が好ましい。したがって、本発明のペプチド送達剤は、このような特定の疾患の予防または治療に有用である。
本発明はまた、下記１）および２）を含む、上述のペプチド内包フェリチンの製造方法を提供する：
１）ｐＨ３．０以下の緩衝液中にフェリチンを放置して、フェリチンを解離させること（脱会合プロセス）；および
２）解離したフェリチンおよびペプチドをｐＨ５．０以上１０．０以下の緩衝液中に共存させて、ペプチド内包フェリチンを生成すること（再会合プロセス）。
上記１）では、ｐＨ３．０以下の緩衝液中にフェリチンを放置することで、フェリチン（２４量体）をフェリチン単量体に脱会合させることができる。緩衝液中でのフェリチンの放置は、ペプチドの存在下または不在下で行うことができる。緩衝液中でのフェリチンの放置がペプチドの不在下で行われる場合、上記２）の前にペプチドが緩衝液中に添加される。
緩衝液としては、ｐＨ３．０以下の酸性条件に対応できる任意の緩衝液を用いることができる。このような緩衝液としては、例えば、グリシン緩衝液；クエン酸緩衝液；酢酸緩衝液；リン酸緩衝液；炭酸緩衝液；ホウ酸緩衝液；酒石酸緩衝液；ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液が挙げられる。
１）で用いられる緩衝液のｐＨは、好ましくは２．８以下、より好ましくは２．６以下、さらにより好ましくは２．５以下である。ｐＨの測定は、ｐＨ分析計（ＬＡＱＵＡ、Ｆ－７２、Ｈｏｒｉｂａ）とｐＨ電極（９６８０Ｓ－１０Ｄ）を用いた２５℃での計測により行うことができる。
ｐＨ３．０以下の緩衝液中でのフェリチンの放置時間は、フェリチンの脱会合に要する時間である限り特に限定されない。より具体的には、このような時間は、ｐＨ等の条件によっても異なるが、ペプチド内包フェリチンの作製効率、およびペプチド内包フェリチンの作製時間の短縮等の観点から、例えば１分～１０時間であり、好ましくは２分～５時間、より好ましくは３分～２時間、さらにより好ましくは４分～１時間、特に好ましくは５～３０分間である。
１）の終了後、緩衝液の交換、または緩衝液もしくは塩基の追加により、２）の操作を行うことができる。例えば、緩衝液の交換は、１）の操作後の緩衝液を中和および放置し、次いで、解離したフェリチンおよびペプチドを含む上清を回収した後、ｐＨ５．０以上１０．０以下の緩衝液と混合することにより行うことができる。ｐＨ５．０以上１０．０以下の緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液が挙げられる。
２）で用いられる緩衝液のｐＨは、好ましくはｐＨ５．０以上９．５以下、より好ましくはｐＨ５．０以上９．２以下、さらにより好ましくはｐＨ５．０以上９．０以下である。
解離したフェリチンおよびペプチドの緩衝液中での放置時間は、フェリチンの再会合に要する時間である限り特に限定されない。より具体的には、このような時間は、ｐＨ等の条件によっても異なるが、ペプチド内包フェリチンの作製効率、およびペプチド内包フェリチンの作製時間の短縮等の観点から、例えば１０分～７２時間であり、好ましくは２０分～４８時間、より好ましくは３０分～２４時間である。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１：フェリチンの調製＞
ヒト由来フェリチンＨ鎖（ＦＴＨ（配列番号１））をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型として、５’－ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＧ－３’（配列番号３）および５’－ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧＴＣ－３’（配列番号４）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ－３’（配列番号５）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、ＦＴＨをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＨ）を構築した。
続いて、構築したｐＥＴ２０－ＦＴＨを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ－ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、目的タンパク質を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによってＦＴＨを分離精製した。そのＦＴＨを含む溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。結果、培養液１００ｍｌあたり、５ｍｇ／ｍｌのＦＴＨを含む溶液１ｍｌを得ることができた。
なお、ｐＨの測定は、ｐＨ分析計（ＬＡＱＵＡ、Ｆ－７２、Ｈｏｒｉｂａ）とｐＨ電極（９６８０Ｓ－１０Ｄ）を用いて、２５℃で行った。
＜実施例２：蛍光修飾されたペプチドの内包検討（１）＞
フェリチンを用いたペプチド送達に向けて、蛍光色素フルオロセイン（ＦＡＭ）で修飾されたペプチド（５（６）－ＦＡＭ－ＲＦＡＲＫＧＡＬＲＱＫＮＶＨＥＶＫＮ（配列番号９）、ＰＫＣ－Ｆ、化学式量２５２４、表３）が内包されたＦＴＨの構築を試みた。
終濃度５ｍｇ／ｍｌのＦＴＨ（化学式量５０９４２１）と終濃度０．５ｍＭのペプチドを含む５０ｍＭ グリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）０．５ｍｌを、室温で１５分間放置した。その後、１Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）５０μｌを加え中和し、３時間室温で放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を回収し、１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で３ｍｌまで容量を増やした。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、流速１．３ｍｌ／分で、サイズによって２４量体のＦＴＨを分離精製した。精製されたフェリチンを１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて流速０．５ｍｌ／分で分析したところ、ＦＴＨのみでは確認されない４８０ｎｍの吸光がＦＴＨのピークと同じ位置に確認され、ＦＴＨとペプチドが複合体を形成していることが分かった（図１）。
そのＦＴＨを含む溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．２５ｍｌまで濃縮した。溶液中にペプチドが含有されることはＬＣ－ＭＳ分析で確認した。ＬＣ－ＭＳ分析のために、サンプル溶液５０μｌに１Ｍグリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）５０μｌを加え室温で１５分間放置した。その溶液に９００μｌのエタノールを加え、激しく攪拌した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）により上清を回収した。その上清を分析した。今回、ＬＣ－ＭＳとして、ＬＣＭＳ－２０２０（島津製作所）、カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ－３、粒子径２μｍ、２．１ｍｍｘ５０ｍｍ（ＧＬ ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。そして、カラムに供されたサンプル１０μｌを、溶液Ａ（０．１％ぎ酸／９９．９％アセトニトリル）と溶液Ｂ（５０％水／５０％アセトニトリル）の混合比が９５対５から９５対５となるように流速０．２ｍｌ／分、１０分間かけて溶出させた。また、含有タンパク質濃度はプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。また、内包するペプチドの濃度はＰＫＣ－Ｆに修飾された蛍光色素ＦＡＭの４８０ｎｍの吸光から決定した。
その結果、ＬＣ－ＭＳの分析より、フェリチン内包されたペプチド（図２）と標品ペプチド（図３）の保持時間は共に３．９分間で同じで、ＭＳスペクトルも同等であり、フェリチン内包操作によってＰＫＣ－Ｆは分解されずに、内包されていることが確認された。そして、４．３ｍｇ／ｍｌ（８．５μＭ）のＦＴＨと０．１８ｍｇ／ｍｌ（７２μＭ）のペプチドを含む溶液０．２５ｍｌを得ることができた。この時のモル比からフェリチン１個あたり、平均８．５個のＰＫＣ－Ｆが内包されていた。
＜実施例３：蛍光修飾されたペプチドを内包したフェリチンの形状＞
精製されたＰＫＣ－Ｆ内包ＦＴＨがカゴ状形状を示すことは、図４に示すように、３％りんタングステン酸染色による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像によって確認した。この時のペプチド内包ＦＴＨの直径は１２ｎｍであり、天然型ヒトフェリチンと同じサイズであり、ペプチド内包により、フェリチンの高次構造が大きく損なわれないこと分かった。
続いて、そのＰＫＣ－Ｆ内包ＦＴＨ複合体を終濃度５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６あるいは７）、酢酸緩衝液（（ｐＨ４あるいは５）、あるいはトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）に各々ＦＴＨ量として終濃度０．１ｇ／ｌとなるように懸濁し、その緩衝液中、２５℃での表面電荷をゼータサイザーナノＺＳ（マルバーン社）にて測定した。測定は、サンプル７５０μｌをＤＴＳ１０７０セルに入れ、Ｍａｔｅｒｉａｌ設定（ＲＩ：１．４５０、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：０．００１）、Ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ設定（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２５℃、Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ：０．８８７２ｃＰ、ＲＩ：１．３３０、Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｏｎｓｔａｎｔ：７８．５）、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ ｍｏｄｅｌ（Ｆκａ ｖａｌｕｅ：１．５０）にて行われた。その結果、ペプチド内包処理されていないＦＴＨとＰＫＣ－Ｆ内包ＦＴＨ複合体の表面電荷は同等であり、ＦＴＨ表面にペプチドが吸着することで複合化しているわけではないことが分かった（図５）。
＜実施例４：蛍光修飾されたペプチド内包フェリチンを用いた細胞取り込み試験（１）＞
得られたＰＫＣ－Ｆ内包ＦＴＨを用いて、フェリチンによるＰＫＣ－Ｆの細胞内への輸送性を評価した。
評価用培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）＋１％非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ナカライテスク社））にＰＫＣ－Ｆ内包ＦＴＨの終濃度が１００ｎＭ（ＰＫＣ－Ｆ濃度０．８６μＭ）、２００ｎＭ（ＰＫＣ－Ｆ濃度１．７２μＭ）あるいは４００ｎＭ（ＰＫＣ－Ｆ濃度３．４４μＭ）となるように各々添加された培地１００μｌ中で、ヒト乳癌由来であるＳＫＢＲ－３細胞（２０，０００ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に添加し、３７℃で培養した。このＳＫＢＲ－３細胞はトランスフェリン受容体ＴｆＲが発現している。また、陰対照として、ＦＴＨ内包されていないペプチドが終濃度０．８６μＭ、１．７２μＭあるいは３．４４μＭで添加された培地でＳＫＢＲ－３細胞を同様に培養した。各々２４時間培養後、リン酸緩衝生理食塩水１００μｌにて２回洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）５０μｌ中で３７℃、１０分間放置した。その後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ培地１００μｌを加え、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）用プレートに細胞を移し、４００ｘｇ、５分間遠心分離した。各細胞をＦＡＣＳ用緩衝液（ＡｔｔｕｎｅＴＭ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｆｌｕｉｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に懸濁し、ＦＡＣＳ（Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で分析した。
その結果、ＰＫＣ－Ｆ内包ＦＴＨでは濃度依存的な蛍光強度の変化が確認（図６）され、濃度依存的に細胞への取り込み量が増加していることが示唆された。
同じ条件で調整された細胞を二光子励起蛍光顕微鏡（ＣＱ－１、横川電機株式会社）で観察したところ、ＰＫＣ－Ｆ内包ＦＴＨでのみ細胞内の蛍光を観察することができ、濃度依存的なＰＫＣ－Ｆ内包ＦＴＨの細胞への取り込みを確認することができた（図７）。一方、フェリチンに内包されていないＰＫＣ－Ｆでは、細胞内へ輸送は確認されなかった。
以上のことから、ＦＴＨで内包する事で、ＴｆＲ提示細胞内にペプチドを送達できることが分かった。
＜実施例５：蛍光修飾されたペプチドの内包検討（２）＞
フェリチンを用いたペプチド送達の汎用性を調べるために、ＰＫＣ－Ｆ以外のペプチドをフェリチンに内包させ細胞内への輸送を試みた。
先ず、蛍光修飾された２種類のペプチド〔（５（６）－ＦＡＭ－ＣＧＧＰＫＫＫＲＫＶＧ（配列番号１０）、ＦＡＭ－ＳＶ４０、化学式量１５１６、および５（６）－ＦＡＭ－ＣＧＧＫＲＰＡＡＩＫ ＫＡＧＱＡＫＫＫＫＧ（配列番号１１）、ＦＡＭ－Ｎｐ、化学式量３８４）〕が内包されたＦＴＨの構築を試みた。終濃度５ｍｇ／ｍｌのＦＴＨ（化学式量５０９４２１）と終濃度０．５ｍＭのペプチドを含む５０ｍＭ グリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）０．５ｍｌを、室温で１５分間放置した。その後、１Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）５０μｌを加え中和し、３時間室温で放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を回収し、１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で３ｍｌまで容量を増やした。その溶液を、Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬（株））で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて流速０．５ｍｌ／分でサイズによって２４量体のＦＴＨを分離精製した。このとき、ＦＡＭ－ＳＶ４０の内包操作を行ったフェリチンでは４３０ｎｍの吸光がフェリチン２４量体と同じ溶出位置に確認され、フェリチン内にＦＡＭ－ＳＶ４０が内包されていることが示唆された（図８）。しかし、ＦＡＭ－Ｎｐの内包操作を行ったフェリチンでは４８０ｎｍの吸光は確認されず、ＦＡＭ－Ｎｐが内包されていないことが分かった。このことは物性等の違いによりフェリチンに内包が難しいペプチドが存在することを示唆する。
次に、精製されたフェリチンに内包されたＦＡＭ－ＳＶ４０ペプチド量の定量を４８０ ｎｍの吸光、フェリチン量アルブミンを標準としたＣＢＢ染色による定量を行った。
その結果、６．３ｍｇ／ｍｌ（１２μＭ）のＦＴＨと０．０９ｍｇ／ｍｌ（３０μＭ）のＦＡＭ－ＳＶ４０ペプチドを含む溶液０．３ｍｌを得ることができた。この時のモル比からフェリチン１個あたり、平均２．５個のＦＡＭ－ＳＶ４０が内包されていた。
＜実施例６：蛍光修飾されたペプチド内包フェリチンを用いた細胞取り込み試験（２）＞
得られたＦＡＭ－ＳＶ４０内包ＦＴＨの細胞への取り込みを評価した。評価用培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）＋１％非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ナカライテスク社））にＦＡＭ－ＳＶ４０内包ＦＴＨの終濃度が１００ｎＭ（ＦＡＭ－ＳＶ４０濃度２５０ｎＭ）、２００ｎＭ（ＦＡＭ－ＳＶ４０濃度５００ｎＭ）あるいは４００ｎＭ（ＦＡＭ－ＳＶ４０濃度１０００ｎＭ）となるように各々添加された培地１００μｌ中で、ＳＫＢＲ－３細胞（２０，０００ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に添加し、３７℃で培養した。また、陰対照として、ＦＴＨ内包されていないペプチドが終濃度２５０ｎＭ、５００ｎＭあるいは１０００ｎＭで添加された培地でＳＫＢＲ－３細胞を同様に培養した。各々２４時間培養後、リン酸緩衝生理食塩水１００μｌにて２回洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）５０μｌ中で３７℃、１０分間放置した。
その後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ培地１００μｌを加え、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）用プレートに細胞を移し、４００ｘｇ、５分間遠心分離した。各細胞をＦＡＣＳ用緩衝液（ＡｔｔｕｎｅＴＭ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｆｌｕｉｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に懸濁し、ＦＡＣＳ（Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で分析した。結果として、ＦＡＭ－ＳＶ４０内包ＦＴＨでのみ濃度依存的な蛍光強度の上昇を観察することができた一方、ＦＡＭ－ＳＶ４０のみでは、蛍光は確認されなかった（図９）。
以上のことから、ＦＴＨに内包されることで、従来膜透過できないペプチドも細胞内に送達できることが分かった。
＜実施例７：ＴｆＲ発現量によるペプチド送達量の依存性の確認＞
フェリチンに内包することで、目的のペプチドを、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）提示細胞に特異的に送達できることを確認するために、ＴｆＲの発現量の異なる細胞株を用いて、ＦＴＨの取り込み効率のＴｆＲ依存性を評価した。
今回の評価では、ＴｆＲ発現量の多い細胞ＳＫＢＲ３（発現強度４４９．７ ＴＰＭ、データベース「Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）」を参照。）とＴｆＲ発現量の少ない細胞ＨＥＫ２９３細胞（発現強度７４．５ ＴＰＭ、データベース「Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ」を参照。）の亜株であるＨＥＫ２９３Ｅ細胞を用いた。
はじめにＳＫＢＲ３細胞とＨＥＫ２９３Ｅ細胞からＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標） ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて全ＲＮＡを回収した。５０ｎｇの各細胞由来の全ＲＮＡと２μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＶＩＬＯＴＭ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を混合し、全量１０μＬとなるよう水を添加した。２５℃で１０分、４２℃で６０分、８５℃で５分インキュベートした後、１１５μＬの水を添加して希釈することで０．４ｎｇ/μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。各ｃＤＮＡ溶液５μＬにＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、水４．８μＬ、２５μＭのプライマーミックスを加え、定量ＰＣＲ溶液を調製した。ＴｆＲ遺伝子用プライマーミックスは（Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＧＧＣＡＧＴＴＣＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＡ（配列番号２６）、Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＧＧＴＡＴＡＴＧＡ（配列番号２７））を混合して用いた。内標としては１８Ｓ ｒＲＮＡを定量した。１８Ｓ ｒＲＮＡ用遺伝子用プライマーミックスは（Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣ（配列番号２８）、Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＴＡＣＡＧＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡＧＡＧＴ（配列番号２９））を混合して用いた。定量ＰＣＲ（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＴＭシステム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、ＴｆＲのｍＲＮＡの発現量を確認したところ、ＳＫＢＲ３細胞のＴｆＲ発現量はＨＥＫ２９３Ｅ細胞の３．２倍高かった。
評価用培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）＋１％非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ナカライテスク社））にＦＡＭ－ＳＶ４０内包ＦＴＨの終濃度が０から８００ｎＭ（ＦＡＭ－ＳＶ４０濃度２μＭ）となるように各々添加された培地１００μｌ中で、各細胞（２０，０００ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に添加し、３７℃で培養した。各々２４時間培養後、リン酸緩衝生理食塩水１００μｌにて２回洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）５０μｌ中で３７℃、１０分間放置した。
その後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭＴＭ培地１００μｌを加え、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）用プレートに細胞を移し、４００ｘｇ、５分間遠心分離した。各細胞をＦＡＣＳ用緩衝液（ＡｔｔｕｎｅＴＭ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｆｌｕｉｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に懸濁し、ＦＡＣＳ（Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で分析した。
その結果、ＦＡＭ－ＳＶ４０内包ＦＴＨを１００ｎＭで含む培地で培養されたＳＫＢＲ３細胞の９０％以上が蛍光を発しており、ほとんどの細胞がＦＡＭ－ＳＶ４０内包ＦＴＨを取り込んでいることが示唆された。そして、その割合は同じ条件で得られたＨＥＫ２９３Ｅ細胞の６０倍であった（図１０）。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞の場合、９０％以上の細胞が蛍光を発するようになるには、ＦＡＭ－ＳＶ４０内包ＦＴＨを８００ｎＭ以上の高濃度で含む培地で培養する必要があった（図１１）。これらの結果は、ＴｆＲ発現量の多い細胞ＳＫＢＲ３は、より効率的にフェリチンを細胞内に取り込んだことを示唆する。
すなわち、フェリチンに内包することで、目的のペプチドを、対象細胞のＴｆＲ発現量に応じて細胞内に送達量を制御可能であることが分かった。
＜実施例８：フェリチンに内包可能なペプチドの探索（１）＞
脱会合・再会合プロセスによってフェリチンに内包可能なペプチドの探索を行った。脱会合・再会合プロセスでは、終濃度５ｍｇ／ｍｌのＦＴＨと終濃度０．５ｍＭのペプチドを含む５０ｍＭ グリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）１ｍｌを、室温で１５分間放置した。その後、１Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）３１０μｌを加え中和し、３時間室温で放置した。放置後、５０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）１．２ｍｌを加え、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清２．５ｍｌを５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で平衡化された脱塩カラムＰＤ－１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５充填品、ＧＥヘルスケア社）に供し、３．０ｍｌの５０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出し、封入されなかったペプチドとフェリチンとを分離した。その溶液全量（３．０ｍｌ）をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて０．１ｍｌに濃縮した。その濃縮液に１０ｍｌの５０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液を加え濃縮する操作を２回繰り返すことで、ＰＤ－１０で除去しきれなかったペプチドを除去し、サンプル溶液０．１ｍｌを得た。ＬＣ－ＭＳ分析のために、サンプル溶液５０μｌに１Ｍグリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）５０μｌを加え室温で１５分間放置した。その溶液に９００μｌのエタノールを加え、激しく攪拌した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）により上清を回収した。その上清を分析した。今回、ＬＣ－ＭＳとして、ＬＣＭＳ－２０２０（島津製作所）、カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ－３、粒子径２μｍ、２．１ｍｍｘ５０ｍｍ（ＧＬ ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。そして、カラムに供されたサンプル１０μｌを、溶液Ａ（０．１％ぎ酸／９９．９％アセトニトリル）と溶液Ｂ（５０％水／５０％アセトニトリル）の混合比が９５対５から９５対５となるように流速０．２ｍｌ／分、１０分間かけて溶出させた。
今回内包検討に用いたペプチドの一覧を表１に示す。ペプチドのフェリチンへの内包は、脱会合・再会合プロセスによるフェリチン内へのペプチド内包操作を行ったサンプルと、単純にフェリチンとペプチドを混合したサンプルを各々調製し、ＬＣ－ＭＳにより検出されたペプチドの量を比較した。例えば、ＣｌＡｃ－ＦＨＣは保持時間０．８分間で溶出し、脱会合・再会合プロセスではｍ／ｚ＝４４５にＣｌＡｃ－ＦＨＣ（化学式量４４５）由来のピークを確認できた（図１２Ａ）。しかし、脱会合・再会合プロセスを行わない単純なペプチドとフェリチンの混合のみではそのピークを観察できなかった（図１２Ｂ）。今回、脱会合・再会合プロセスでペプチドが内包されたＦＴＨのＬＣ－ＭＳの結果を図１３から図１７に示す。
Figure 0007600993000002
今回評価されたペプチドのフェリチンへの内包可否は次表５に示す。
＜実施例９：フェリチンに内包可能な物性の検討＞
今回、フェリチンに内包されたペプチドおよび内包できなかったペプチドについて、下記の各物性値とフェリチンへのペプチドの内包可否との相関関係を調べた。
（１）ペプチドの長さ（鎖長）
（２）ペプチドの化学式量
（３）疎水性度（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）
（４）ＧＲＡＶＹ
（５）平均親水性度（Ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）
（６）ペプチドに占める親水性アミノ酸の割合（Ｒａｔｉｏ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ／ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）
（７）ｐＨ９におけるペプチドの電荷
上記（１）～（７）の物性値は、以下の方法に基づき決定した。
（１）ペプチドの長さ（鎖長）
ペプチドの長さは、ペプチドを構成するアミノ酸残基の総数に基づき決定した。
（２）ペプチドの化学式量
ペプチドの組成式に基づいて原子量と原子数の積の総和として決定した。
（３）疎水性度
ペプチドの疎水性度（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）は、ＳＳＲＣａｌｃ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙに基づき算出した（Ｏ． Ｖ． Ｋｒｏｋｈｉｎ Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．（２００６），７８（２２）７７８５－７７９５）。今回、Ｐｒｏｔ ｐｉ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｐｉ．ｃｈ／Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ／ＰｅｐｔｉｄｅＴｏｏｌ）を用いて、３００オングストロームＣ１８カラム、０．１％ＴＦＡ溶出条件のデータベースを使用し、算出した。
（４）ＧＲＡＶＹ
ＧＲＡＶＹ（ｇｒａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）は、各アミノ酸残基のハイドロパシー値（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｓｃｏｒｅ）を加算し、そして配列の長さで割ることによって計算した（Ｊ， Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｒ． Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９８２ １５７（１） １０５－３２．）。
Figure 0007600993000003
（５）平均親水性度
平均親水性度（Ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）は、各アミノ酸残基の親水度値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）を加算し、そして配列の長さで割ることによって計算した（Ｈｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９８１ ７８（６） ３８２４－８．）。
Figure 0007600993000004
（６）ペプチドに占める親水性アミノ酸の割合
ペプチドに占める親水性アミノ酸の割合（Ｒａｔｉｏ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ／ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）は、ペプチドを構成する全アミノ酸の内、親水性アミノ酸（Ｈ、Ｃ、Ｔ、Ｓ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、ＮおよびＲ）の占める割合を評価することにより決定した。
（７）ｐＨ９におけるペプチドの電荷
ｐＨ９におけるペプチドの電荷は、ペプチドを構成する各アミノ酸残基の側鎖、修飾基、Ｎ末端のアミノ基又はその保護基、Ｃ末端のカルボキシ基又はその保護基を含む全ての官能基の電荷について、各官能基の解離定数（ｐＫａ）と電荷の正負を各々用いてｐＨ９として、以下の式を用いて算出した。
Figure 0007600993000005
各アミノ酸のｐＫａの評価は、ＣｈｅｍＡｘｏｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｅｍａｘｏｎ．ｃｏｍ／）を利用した（Ｏ．Ｔｏｕｒｅ ｅｔ． ａｌ．， Ｏｉｌ Ｇａｓ Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１３， ６８， ２８１－２９７．）。
Figure 0007600993000006
フェリチンへの内包の検討で使用されたペプチドの上記各物性値と、フェリチンへのペプチドの内包可否との関係は、以下のとおりである。
Figure 0007600993000007
その結果、ｐＨ９．０での電荷と化学式量の関係式と、ペプチドの内包のされ易さとの間に相関性が見出された（図１８）。
すなわち、ａ）－１０．２≦ｐＨ９でのペプチドの電荷（Ｘ）≦５．９、かつ４４５≦ペプチドの化学式量（Ｙ）≦２５２４の条件を満たすペプチドをフェリチンに内包することができた（図１８）。
また、上記条件を満たすペプチドの内、ｂ）－１０．２≦Ｘ≦０．０、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４、あるいはｃ）３．７≦Ｘ≦５．９、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４の条件を満たすペプチドはフェリチンに再現性良く内包できていた（図１８）。
＜実施例１０：フェリチンの調製（２）＞
ヒト由来フェリチンＬ鎖（ＦＴＬ（配列番号２））をコードするＤＮＡを全合成した。全合成されたＤＮＡを鋳型として、５’－ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＴＣＧＴＣＡＧ－３’（配列番号７）および５’－ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧ－３’（配列番号８）をプライマーとしてＰＣＲを行った。また、ｐＥＴ２０（メルク社）を鋳型として、５’－ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ－３’（配列番号５）および５’－ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号６）をプライマーとしてＰＣＲを行った。各々得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）で精製した後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）で、５０℃、１５分間のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素処理することで、ＦＴＬをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０－ＦＴＬ）を構築した。
続いて、構築したｐＥＴ２０－ＦＴＬを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地（１０ｇ／ｌのＢａｃｔｏ－ｔｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む）１００ｍｌ、３７℃で２４時間フラスコ培養した。得られた菌体を超音波破砕した後、上清を６０℃で２０分間加熱した。加熱後得られた上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｅｒｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、０ｍＭから５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、目的タンパク質を分離精製した。そのタンパク質を含む溶液の溶媒をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。その溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、サイズによってＦＴＬを分離精製した。そのＦＴＨを含む溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ ２０－１００Ｋ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた遠心限外濾過にて濃縮し、含有タンパク質濃度をプロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライテスク社）にて、ウシアルブミンを標準として決定した。結果、培養液１００ｍｌあたり、３ｍｇ／ｍｌのＦＴＬを含む溶液１ｍｌを得ることができた。
＜実施例１１：蛍光修飾されたペプチドの内包検討＞
蛍光色素フルオロセイン（ＦＡＭ）で修飾されたペプチド（５（６）－ＦＡＭ－ＲＦＡＲＫＧＡＬＲＱＫＮＶＨＥＶＫＮ（配列番号９）、ＰＫＣ－Ｆ、化学式量２５２４）が内包されたＦＴＬを構築した。
終濃度５ｍｇ／ｍｌのＦＴＬ（化学式量４８０４６６）と終濃度０．５ｍＭのペプチドを含む５０ｍＭ グリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ２．３）０．５ｍｌを、室温で１５分間放置した。その後、１Ｍのトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）５０μｌを加え中和し、３時間室温で放置した。放置後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）した後、上清を回収し、１０ｍＭ トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８）で３ｍｌまで容量を増やした。その溶液を、Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬（株））で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に注入し、流速１．３ｍｌ／分で、サイズによって２４量体のＦＴＬを分離精製した。精製されたフェリチンを、ＰＢＳで平衡化されたＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて流速０．５ｍｌ／分で分析したところ、ＦＴＬのみでは確認されない４８０ｎｍの吸光がＦＴＬのピークと同じ位置に確認され、ペプチドがＦＴＬに内包されていた（図１９）。以上のことからＦＴＬでもペプチドが内包可能であることが分かった。

Claims (6)

  1. ペプチドが、３～１９個のアミノ酸残基から構成され、かつ
    下記条件：
    ３．７≦Ｘ≦５．９、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４；
    （ここで、ＸはｐＨ９でのペプチドの電荷を示し、Ｙはペプチドの化学式量を示す）
    を満たし、
    ペプチドは、フェリチンを構成するフェリチン単量体のＣ末端に融合されていないペプチドである、
    ペプチド内包フェリチン。
  2. ペプチドが４～１６個のアミノ酸残基から構成される、請求項１記載のペプチド内包フェリチン。
  3. ペプチドの細胞内送達剤であって、
    ペプチド内包フェリチンを含み、
    ペプチドが、３～１９個のアミノ酸残基から構成され、かつ
    下記条件：
    ３．７≦Ｘ≦５．９、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４；
    （ここで、ＸはｐＨ９でのペプチドの電荷を示し、Ｙはペプチドの化学式量を示す）
    を満たし、
    ペプチドは、フェリチンを構成するフェリチン単量体のＣ末端に融合されていないペプチドである、
    ペプチドの細胞内送達剤。
  4. ペプチドがヒト細胞の細胞内に送達される、請求項３記載の剤。
  5. ペプチドが癌細胞の細胞内に送達される、請求項３または４記載の剤。
  6. ペプチド内包フェリチンの製造方法であって、
    １）ペプチドの存在下または不在下において、フェリチンをｐＨ３．０以下の緩衝液中で放置して、フェリチンを解離させること；および
    ２）解離したフェリチンおよびペプチドをｐＨ５．０以上１０．０以下の緩衝液中に共存させて、ペプチド内包フェリチンを生成すること；
    を含み、
    ペプチドが、３～１９個のアミノ酸残基から構成され、かつ
    下記条件：
    ３．７≦Ｘ≦５．９、かつ４４５≦Ｙ≦２５２４；
    （ここで、ＸはｐＨ９でのペプチドの電荷を示し、Ｙはペプチドの化学式量を示す）
    を満たし、
    ペプチドは、フェリチンを構成するフェリチン単量体のＣ末端に融合されていないペプチドである、
    製造方法。
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