JP7581355B2 - Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ、その変異体及びそれらの使用 - Google Patents

Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ、その変異体及びそれらの使用 Download PDF

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Description

技術分野
本開示は、生物触媒および合成生物学の分野に関する。本開示は、Ｄ－キシルロースとＬ－リブロースとの間の相互変換を可逆的に触媒することができる、Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ（Ｘｕ４Ｅ）と名付けられた新規ポリペプチド（酵素）及びそれらの変異体に関する。さらに、複数の人工酵素経路を構築することにより、自然界で最も豊富なペントースであるＤ－キシロースからＬ－ペントース（即ち、Ｌ－アラビノース、Ｌ－リボース、Ｌ－リブロース、Ｌ－キシルロース、Ｌ－キシロース及びＬ－リキソース）を生成するための新規な方法に関する。
背景技術
ペントース（又は五炭単糖）は、化学式がＣ5Ｈ10Ｏ5で、５個の炭素原子を持つ単糖である。それらは、アルドペントースとケトペントースの２種類に分けられる。８種類のアルドペントースと４種類のケトペントースがあり、それぞれのケトペントースは２種類のアルドペントースに対応している。１２種類のペントースもＬ型糖とＤ型糖に分けられ、それぞれでは４種類のアルドペントースと２種類のケトペントースがある。Ｄ－キシロース、Ｄ－リボース、Ｌ－アラビノースは天然糖であるが、他のペントースは、自然界にごく少量しか存在しない希少糖である。Ｄ－キシロースは、自然界で最も豊富なペントースである。Ｌ－ペントースは、特に多くの重要な医薬品前駆体として、医療及び健康用途に大きな可能性があるため、多くの注目を集めている。
自然界で最も豊富なペントースであるＤ－キシロースは、リグノセルロースから分離することができ、キシロース（ｗｏｏｄ ｓｕｇａｒ）と呼ばれている。Ｄ－キシロースはヘミセルロースキシランの主成分です。現在、Ｄ－キシロースは主にトウモロコシ穂軸とビートパルプの酸性又はアルカリ性加水分解物から分離されており、ほとんどのキシロースはゼロカロリーの甘味料であるキシリトールの変換に使用されている。
Ｌ－アラビノースは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認した、ショ糖の５０％の甘味を持つゼロカロリーの天然甘味料である（Ａｎｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．１９９７、Ｂｏｋｕ ｅｔ ａｌ．２００１）。さらに重要なのは、スクロースに３～４％のＬ－アラビノースを加えると、スクラーゼの活性を阻害し、スクロースの加水分解を防ぎ、スクロースの吸収を防ぐことができるため、カロリー摂取量によると、Ｌ－アラビノースはスクロース中和剤と見なされる（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００１ ）。同時に、腸内の未利用の糖は、有益なバクテリアの成長を促進し、それによって大腸での有害な微生物の成長を阻害するプレバイオティクスである。Ｌ－アラビノースは、出発物質として合成薬の製造に使用され、また分子生物学実験や工業発酵で広く使用されている生化学製品でもある。
Ｌ－アラビノースは、高等植物のヘミセルロースにアラビナン、アラビノキシラン、アラビノガラクタンの形で存在している。日本では、Ｌ－アラビノースは、トウモロコシ繊維（Ｂｏｋｕ ｅｔ ａｌ．２００１）、アラビアガム、サトウダイコンパルプ（Ａｎｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．１９９７）などのヘミセルロースをアルカリ抽出した後、酸加水分解することによって得られた。中国では、Ｌ－アラビノースはトウモロコシの穂軸の酸加水分解によるＤ－キシロースの生成の副産物である。Ｌ－アラビノースの高価格と限られた供給は、その幅広い用途を大きく制限する。
Ｌ－リボースは自然界では広く見られていない。これは、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、及びサイトメガロウイルスに対する抗ウイルス薬などの製造に使用される多くの新規ヌクレオチド類似体の前駆体です（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２０１４）。Ｌ－リボースは、グルコースデヒドロゲナーゼの競合的阻害剤としても機能する（Ｂｅｅｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１２）。以前は、Ｌ－リボースは、中間体としてリビトールを使用した２段階の微生物変換によって生成されていた。現在では、Ｌ－リボースの生合成は、Ｌ－アラビノースイソメラーゼ（Ｌ－ＡＩ）、及びＬ－リボースイソメラーゼ（Ｌ－ＲＩ、ＥＣ５．３．１．Ｂ３）又はマンノース６－ホスホイソメラーゼ（ＭＰＩ、ＥＣ５．３．１．８）によって、Ｌ－リブロースをＬ－リボースに変換するという２段階の酵素触媒反応ことで実施している（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２０１４）。
Ｌ－リブロースは、Ｌ－リボースとＬ－アラビノースを合成するための出発物質である。その５’－リン酸生成物であるＬ－リブロース５－リン酸は、ペントースリン酸経路の重要な代謝物である。
Ｌ－キシルロースはα－グルコシダーゼの阻害剤として作用し、血糖値を下げるために使用できる。Ｌ－キシロースは、抗ウイルス薬の製造用のＬ－リボース、及び肝炎又は肝硬変の指標としてのＬ－キシロースなど、他の重要な希少糖の製造にも使用できる。
動物用抗生物質アビラマイシンＡの成分であるＬ－リキトースは、潜在的なＬ－フコシダーゼ阻害剤である。
Ｌ－キシロースは、抗Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）用ヌクレオシドの合成、及びＬ－リボフラノースとその誘導体の合成の出発物質である。
エピメラーゼは、複数の不斉中心を含む基質の不斉炭素原子のコンフォメーション変化を触媒するイソメラーゼの一種である。五炭単糖４－エピメラーゼは長い間検索されていたが、報告されたことはなかった（Ｂｅｅｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１７）。Ｌ－リブロース５－リン酸４－エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．４）やＵＤＰ－Ｄ－キシロース４－エピメラーゼ（ＥＣ５．１ ．３．５）などの自然界の４－エピメラーゼは、そのペントース基質がリン酸又はウリジン二リン酸（ＵＤＰ）基を持っていることを必要とする。
Ｋｅｎ Ｉｚｕｍｏｒｉ教授は、希少糖生合成の完全な戦略を提案した（本開示の図１で示される）。Ｄ－キシロースから出発し、Ｌ－リブロース３－エピメラーゼ（又はペントース３－エピメラーゼ）、アルドースイソメラーゼ、アルドースレダクターゼ及びポリオールデヒドロゲナーゼを使用することにより、他の１１種類のペントースを生成することができる。従来の技術では、Ｄ－キシロースを原料とし、６種類のＬ－ペントースを製造する場合、キシリトール又はリビトールの製造工程を経る必要があるため、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）の必要な２種類のオキシドレダクターゼ、即ちアルドースレダクターゼ及びポリオールデヒドロゲナーゼを使用しなければならない。高価で不安定な補酵素（ＮＡＤ（Ｐ））の使用や、可逆平衡反応及び関連中間体の生成物の複雑な分離が必要があるため、Ｌ－ペントースの高い製造コストをもたらす。
発明の概要
発明が解決しようとする課題
既存のＬ－ペントース製造技術には高コストで複雑な製造工程の欠陥があるため、Ｌ－ペントースの新しい製造方法を提供する必要がある。
一実施形態において、本開示は、Ｄ－キシルロース及びＬ－リブロースの相互変換を触媒する化学反応能力を有する野生型ポリペプチド（酵素）及びその変異体を提供する（図２）。本公開における野生型Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ（Ｄ－ｘｙｌｕｌｏｓｅ4－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、Ｘｕ４Ｅ）及びその変異体は、天然で最も豊富なペントース、即ちＤ－キシロースを原料として利用してＬ－ペントースを製造することができる。一実施形態において、例示的なＬ－ペントースは、６種類のＬ体五炭単糖、即ち、Ｌ－アラビノース、Ｌ－リボース、Ｌ－リブロース、Ｌ－キシルロース、Ｌ－キシロース及びＬ－リキソースから選択される。
別の実施形態において、本開示は、前述のＸｕ４Ｅ変異体を調製するための方法を提供し、これは、分子生物学及び遺伝子工学的方法を介してＸｕ４Ｅ変異体を調製する。
別の実施形態において、本開示は、前述の野生型Ｘｕ４Ｅ及びその変異体の使用を提供し、それがＬ－ペントースを生成するために使用することができる。
別の実施形態において、本開示は、Ｌ－ペントースを製造するための新しい方法を提供し、この方法は、原料としてＤ－キシロース又はＤ－キシルロースを使用してＬ－ペントースを製造する方法を含む。
別の実施形態において、本開示は、Ｌ－ペントースを生成するための新規な方法を提供し、この方法は、Ｘｕ４Ｅ又はその変異体を使用してＤ－キシルロースをＬ－リブロースに変換するステップを含む。
特定の実施形態において、本開示は、Ｌ－ペントースを製造するための前述の方法をさらに最適化するための方法を提供する。
課題を解決するための手段
前述の課題を解決するための本開示の技術的な構成は以下の通りである。
（１）Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ活性を有し、（ａ）～（ｄ）からなる群のいずれか１つから選択されるポリペプチドであって：
（ａ）配列番号２－３２のいずれか１つで示される配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の配列同一性を有する配列によってコードされるポリペプチド；
（ｂ）非常に高いストリンジェンシー条件下で（ｉ）又は（ｉｉ）で示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド：
（ｉ）配列番号２－３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）（ｉ）の相補的ポリヌクレオチド全体；
（ｃ）配列番号２－３２のいずれか一つで示されるポリペプチドの変異体であって、前記変異体は、１つ又は複数の位置での１つ又は複数のアミノ酸の置換、複製、欠失、又は付加を含み、前記ポリペプチドは依然としてＤ－キシルロース４－エピメラーゼ活性を有する、ポリペプチド；及び
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）で示されるポリペプチドのフラグメントであり、そのフラグメントはＤ－キシルロース４－エピメラーゼ活性を持っている、前記ポリペプチド。
（２）ポリペプチドは、変異体であり、前記ポリペプチドと配列番号２－３２のいずれか１つで示されるポリペプチドと比較して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、（１）に記載のポリペプチド。
（３）ポリペプチドは、配列番号２－３２のいずれか１つで示されるポリペプチドの変異体であり、前記変異体は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個の部位にアミノ酸の変異を含み、前記ポリペプチドは依然としてＤ－キシルロース４－エピメラーゼ活性を持っている、（１）～（２）のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（４）前記ポリペプチドは、以下で示されるポリペプチドである、（１）～（３）のいずれか一項に記載のポリペプチドであって：
（ａ）配列番号２で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１０２、１２５、１３１、１６１、１６３、２６６、２６７、２９７、３０６、３１８、３３７、３９４、４０２及び４０３からなる群より選択される１つ以上である；
（ｂ）配列番号３で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１０２、１２５、１３１、１６１、１６３、２６６、２６７、２９７、３０６、３１８、３３７、３９４、４０２及び４０３からなる群より選択される１つ以上である；
（ｃ）配列番号４で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１０２、１２５、１３１、１６１、１６３、２６６、２６７、２９７、３０６、３１８、３３７、３９４、４０２及び４０３からなる群より選択される１つ以上である；
（ｄ）配列番号５で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１０５、１２８、１３４、１６４、１６６、２７０、２７１、３０１、３１０、３２２、３４１、３９８、４０６、４０７からなる群より選択される１つ以上である；
（ｅ）配列番号６で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１０５、１２８、１３４、１６４、１６６、２６９、２７０、３００、３０９、３２１、３４０、３９７、４０５、４０６からなる群より選択される１つ以上である；
（ｆ）配列番号７で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１１７、１４０、１４６、１７６、１７８、２８５、２８６、３１６、３２５、３３７、３５５、４１２、４２０、４２１からなる群より選択される１つ以上である；
（ｇ）配列番号８で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１２５、１４８、１５４、１８４、１８６、２９３、２９４、３２４、３３３、３４５、３６３、４２０、４２８、４２９からなる群より選択される１つ以上である；
（ｈ）配列番号９で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１２４、１４７、１５３、１８３、１８５、２９７、２９８、３２８、３３７、３４９、３６８、４２５、４３３、４３４からなる群より選択される１つ以上である；
（ｉ）配列番号１０で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１０８、１３１、１３７、１６７、１６９、２７６、２７７、３０７、３１６、３２８、３４６、４０３、４１１、４１２からなる群より選択される１つ以上である；
（ｊ）配列番号１１で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１１５、１３８、１４４、１７４、１７６、２８０、２８１、３１１、３２０、３３２、３５１、４０８、４１６、４１７からなる群より選択される１つ以上である；
（ｋ）配列番号１２で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１０７、１３０、１３６、１６６、１６８、２７２、２７３、３０３、３１２、３２４、３４３、４００、４０８、４０９からなる群より選択される１つ以上である；
（ｌ）配列番号１３で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１０９、１３２、１３８、１６８、１７０、２７５、２７６、３０６、３１５、３２７、３４６、４０３、４１１、４１２からなる群より選択される１つ以上である；
（ｍ）配列番号１４で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１０３、１２６、１３２、１６２、１６４、２６７、２６８、２９８、３０７、３１９、３３８、３９５、４０３、４０４からなる群より選択される１つ以上である；
（ｎ）配列番号１５で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１０５、１２８、１３４、１６４、１６６、２７１、２７２、３０２、３１１、３２３、３４２、３９９、４０７、４０８からなる群より選択される１つ以上である；
（ｏ）配列番号１６で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、６４、８８、９４、１２３、１２５、２３６、２３７、２６７、２７４、２８６、３７３、３８１、３８２からなる群より選択される１つ以上である；
（ｐ）配列番号１７で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１１０、１３３、１３９、１６９、１７１、２７１、２７２、３０２、３１１、３２３、３４２、３９９、４０７、４０８からなる群より選択される１つ以上である；
（ｑ）配列番号１８で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１０２、１２５、１３１、１６１、１６３、２６６、２６７、２９７、３０６、３１８、３３７、３９４、４０２、４０３からなる群より選択される１つ以上である；
（ｒ）配列番号１９で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１２１、１４４、１５０、１８０、１８２、２８９、２９０、３２０、３２９、３４１、３５９、４１６、４２４、４２５からなる群より選択される１つ以上である；
（ｓ）配列番号２０で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、１０７、１３０、１３６、１６６、１６８、２７３、２７４、３０４、３１３、３２５、３４４、４０１、４０９、４１０からなる群より選択される１つ以上である；
（ｔ）配列番号２１で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、２１、４８、５４、８４、８６、１８２、１８３、２１３、２２２、２３４、２６０、３２４、３３２、３３３からなる群より選択される１つ以上である；
（ｕ）配列番号２２で示される配列と比較して、前記ポリペプチドのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸は、以下の部位に対応する位置に変異を含み、ここで、前記部位は、３０、５５、６１、９１、９３、２０２、２０３、２３３、２４２、２５４、２７３、３３０、３３８、３３９からなる群より選択される１つ以上である、前記ポリペプチド。
（５）前記ポリペプチドは、配列番号２に対応して以下の変異を有するポリペプチドである、（１）～（４）のいずれか一項に記載のポリペプチドであって：
（ａ）１０２番目での変異、
（ｂ）１２５番目での変異、
（ｃ）１３１番目での変異、
（ｄ）１６１番目での変異、
（ｅ）１６３番目での変異、
（ｆ）２６６番目での変異、
（ｇ）２６７番目での変異、
（ｈ）２９７番目での変異、
（ｉ）３０６番目での変異、
（ｊ）３１８番目での変異、
（ｋ）３３７番目での変異、
（ｌ）３９４番目での変異、
（ｍ）４０２番目での変異、
（ｎ）４０３番目での変異
（ｏ）２６７及び２９７番目での組み合わせ変異、
（ｐ）３０６及び４０３番目での組み合わせ変異、
（ｑ）１２５及び２９７番目での組み合わせ変異、
（ｒ）１６３、２６７、４０３番目での組み合わせ変異、
（ｓ）１２５、２６７及び２９７番目での組み合わせ変異、
（ｔ）１６３、２６７、２９７及び４０３番目での組み合わせ変異、
（ｕ）１２５、１６３、２６７及び２９７番目での組み合わせ変異、
（ｖ）１２５、１６３、２６７、２９７及び４０３番目での組み合わせ変異、
（ｗ）１２５、１６３、２６７、２９７、４０２及び４０３番目での組み合わせ変異、
（ｘ）１６３、２６７、２９７、３０６、４０２及び４０３番目での組み合わせ変異、
（ｙ）１２５、１６３、２６７、２９７、３０６、４０２及び４０３番目での組み合わせ変異、
（ｚ）１２５、１３１、１６３、２６７、２９７、３０６、４０２及び４０３番目での組み合わせ変異、
（ａａ）
（ｂｂ）１２５、１６３、２６７、２９７、３０６、３１８、４０２及び４０３番目での組み合わせ変異、
（ｃｃ）１２５、１３１、１６３、２６７、２９７、３０６、３１８、４０２及び４０３番目での組み合わせ変異、前記ポリペプチド。
（６）前記ポリペプチドは、配列番号２に対応して以下の部位のいずれか１つで変異したポリペプチドである、（５）に記載のポリペプチドであって：
（ａ）配列番号２の１０２番目に対応するアミノ酸がグリシン（Ｇ）からロイシン（Ｌ）に変異する、
（ｂ）配列番号２の１２５番目に対応するアミノ酸がセリン（Ｓ）からアスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、スレオニン（Ｔ）又はアスパラギン（Ｎ）に変異する、
（ｃ）配列番号２の１３１番目に対応するアミノ酸がアルギニン（Ｒ）からアスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）又はセリン（Ｓ）に変異する、
（ｄ）配列番号２の１６１番目に対応するアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）からアラニン（Ａ）に変異する、
（ｅ）配列番号２の１６３番目に対応するアミノ酸がバリン（Ｖ）からリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）又はメチオニン（Ｍ）に変異する、
（ｆ）配列番号２の２６６番目に対応するアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）からアラニン（Ａ）に変異する、
（ｇ）配列番号２の２６７番目に対応するアミノ酸がバリン（Ｖ）からロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）又はイソロイシン（Ｉ）に変異する、
（ｈ）配列番号２の２９７番目に対応するアミノ酸がアスパラギン（Ｎ）からフェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）又はリジン（Ｋ）に変異する、
（ｉ）配列番号２の３０６番目に対応するアミノ酸がトリプトファン（Ｗ）からメチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）又はスレオニン（Ｔ）に変異する、
（ｊ）配列番号２の３１８番目に対応するアミノ酸がグルタミン（Ｑ）からリジン（Ｋ）に変異する、
（ｋ）配列番号２の３３７番目に対応するアミノ酸がリジン（Ｋ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変異する、
（ｌ）配列番号２の３９４番目に対応するアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）からメチオニン（Ｍ）に変異する、
（ｍ）配列番号２の４０２番目に対応するアミノ酸がセリン（Ｓ）からバリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）又はチロシン（Ｙ）に変異する、
（ｎ）配列番号２の４０３番目に対応するアミノ酸がチロシン（Ｙ）からトリプトファン（Ｗ）、スレオニン（Ｔ）、イソロイシン（Ｉ）又はフェニルアラニン（Ｆ）に変異する。
（７）前記ポリペプチドは、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ、サーモトガカルディフォンティス（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｃａｌｄｉｆｏｎｔｉｓ）、シュードサーモトガ・レティンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）、ハラナエロビウムコンゴレンス（Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ）、サーモセディミバクターリトリペルエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｌｉｔｏｒｉｐｅｒｕｅｎｓｉｓ）、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ、Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｃｅｔｏｔｈｅｒｍｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｔｈｅｒｍａｒｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ ａｄｏｒｎａｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎａｐｈｔｈｏｐｈｉｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｉｎｇｕｌｉｓｐｈａｅｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｃａｌｄｉｆｏｎｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚａｌｉｈａｅ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ,Ｐａｒａｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏ－ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来する、（１）～（６）のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（８）前記ポリペプチドは、配列番号２－３２で示されるポリペプチドのＮ末端又は中部又はＣ末端に１個又は１個以上のアミノ酸残基が欠失したものを含む、（１）に記載のポリペプチド。
（９）前記ポリペプチドは、以下からなる群から選択される：
（ｉ）配列番号２で示されるポリペプチドのＮ末端に対応する位置から、１～１００個のアミノ酸、好ましくは１～９０個のアミノ酸、より好ましくは１～８６個、より好ましくは１～５０個、より好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～１０個のアミノ酸の欠失によって形成され、且つＤ－キシルロースのＬ－リブロースへの変換を触媒する活性を有する、又は
（ｉｉ）配列番号２で示されるポリペプチドの１９６－２３６番目に対応するアミノ酸において、１～４１個のアミノ酸、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個のアミノ酸の欠失によって形成され、且つＤ－キシルロースのＬ－リブロースへの変換を触媒する活性を有する、（８）に記載のポリペプチド。
（１０）前記ポリペプチドは、以下からなる群から選択される：
（ｉ）配列番号２で示されるポリペプチドの１～８６番目に対応するアミノ酸が欠失しており、且つＤ－キシルロースのＬ－リブロースへの変換を触媒する活性を有する、
（ｉｉ）配列番号２で示されるポリペプチドの１９６－２３６番目に対応するアミノ酸が欠失しており、且つＤ－キシルロースのＬ－リブロースへの変換を触媒する活性を有する、又は
（ｉｉｉ）配列番号２で示されるポリペプチドの１～８６番目のアミノ酸及び１９６－２３６番目に対応するアミノ酸が欠失しており、且つＤ－キシルロースのＬ－リブロースへの変換を触媒する活性を有する、（８）～（９）のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（１１）前記ポリペプチドは、配列番号３３～１２２で示される配列に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる；任意に、前記ポリペプチドは、配列番号３３－１２２によってコードされるポリペプチドのいずれかに対して少なくとも９８．３％、少なくとも９８．５％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、（１）～（１０）のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（１２）前記ポリペプチドと配列番号２で示されるポリペプチドと比較して、Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ活性が向上している、（１）～（１１）のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（１３）前記ポリペプチドは、配列番号３３－１２２で示される配列を含む配列によってコードされる、或いは、前記ポリペプチドは、配列番号３３－１２２で示される配列によってコードされるポリペプチドである、（１）～（１２）のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（１４）ポリヌクレオチドは、（１）～（１３）のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（１５）配列番号２－３２のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列には、少なくとも1個の変異を含む；好ましく、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号３３－１２２のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードする、（１４）に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（１６）発現宿主におけるポリペプチドの産生を制御する制御配列の１個又は複数個に作動可能に連結される、（１４）又は（１５）に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクト。
（１７）（１６）に記載の核酸コンストラクトを含む組み換え発現ベクター。
（１８）（１６）に記載の核酸コンストラクト又は（１７）に記載の組み換え発現ベクターを含む組み換え宿主細胞。
（１９）（１）～（１３）のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生する方法であって、
前記方法は以下の工程（ａ）を含む：
（ａ）ポリペプチドの産生に資する条件下で細胞又は菌株を培養する工程；
そのうち、前記細胞又は菌株は、前記ポリペプチドを産生し、前記細胞又は菌株は、（１６）に記載の核酸コンストラクト又は（１７）に記載の組み換え発現ベクターを含み、前記核酸コンストラクト又は前記組み換え発現ベクターは前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む；
任意に、さらに以下の工程（ｂ）を含む：
（ｂ）前記ポリペプチドを精製又は回収する、
前記方法。
（２０）（１）～（１３）のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いて触媒反応を行うことを含む、Ｄ－キシルロースをＬ－リブロースに変換する方法。
（２１）前記ポリペプチドは配列番号２－１２２のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む配列によってコードされる、或いは、前記ポリペプチドは配列番号２－１２２のいずれか１つで示される配列によってコードされるポリペプチドである、（２０）に記載の方法。
（２２）以下の工程を含む、Ｌ－ペントースを調製する方法であって、
（ａ）Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼを用いて、Ｄ－キシルロースをＬ－リブロースに変換する、
任意に、さらに以下の工程を含む：
（ｂ）Ｄ－キシロースイソメラーゼを用いて、Ｄ－キシロースをＤ－キシルロースに変換する、前記方法。
（２３）前記方法は、さらにＬ－アラビノースイソメラーゼを用いて、Ｌ－リブロースをＬ－アラビノースに変換することを含み、前記Ｌ－ペントースはＬ－アラビノースである、（２２）に記載の方法。
（２４）前記方法は、さらにＬ－リボースイソメラーゼ又はマンノース６－ホスホイソメラーゼ又はそれらの組み合わせを用いて、Ｌ－リブロースをＬ－リボースに変換することを含み、前記Ｌ－ペントースはＬ－リボースである、（２２）に記載の方法。
（２５）前記方法は、さらにＬ－リブロース３－エピメラーゼを用いて、Ｌ－リブロースをＬ－キシルロースに変換することを含み、前記Ｌ－ペントースはＬ－キシルロースである、（２２）に記載の方法。
（２６）前記方法は、さらにＬ－リブロース３－エピメラーゼを用いて、Ｌ－リブロースをＬ－キシルロースに変換し、Ｌ－フコースイソメラーゼ又はＤ－アラビノースイソメラーゼ又はＬ－ラムノースイソメラーゼを用いて、Ｌ－キシルロース又はＬ－キシルロースとＬ－リブロースとの組合せをＬ－キシロースに変換することを含み、前記Ｌ－ペントースはＬ－キシロースである、（２２）に記載の方法。
（２７）前記方法は、さらにＬ－リブロース３－エピメラーゼを用いて、Ｌ－リブロースをＬ－キシルロースに変換し、Ｌ－ラムノースイソメラーゼを用いてＬ－キシルロースをＬ－キシロースに変換することを含み、前記Ｌ－ペントースはＬ－リキソースである、（２２）に記載の方法。
（２８）前記Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼは（１）～（１３）のいずれか一項に記載のポリペプチドから選択される；好ましくは、前記Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼは配列番号２－１２２のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む配列によってコードされる、或いは、前記酵素は、配列番号２－１２２のいずれか１つで示される配列によってコードされる酵素である、（２２）～（２７）のいずれか一項に記載の方法。
（２９）前記方法は、さらに前記Ｌ－ペントースを精製及び／又は分離する工程を含む、（２２）～（２８）のいずれか一項に記載の方法。
（３０）前記分離工程は、擬似移動床（ＳＭＢ）を使用して単離する工程を含む、（２９）に記載の方法。
（３１）前記方法の反応系には、さらに酵素反応液を含み、好ましくは、前記酵素反応液に金属イオンを含み、より好ましくは、前記金属イオンは、Ｃｏ2+、Ｚｎ2+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｃａ2+、Ｎｉ2+、Ｃｕ2+、Ｆｅ2+、Ｓｒ2+、Ｂａ2+、Ｃｄ2+、Ｐｂ2+、Ｆｅ3+、Ａｌ3+、Ｂｉ3+、Ａｇ +、Ｌｉ +から選択される１つ以上であってもよい、（２２）～（３０）のいずれか一項に記載の方法。
（３２）前記反応は、好気性、微好気性又は嫌気性条件下で行う、（２２）～（３１）のいずれか一項に記載の方法。
（３３）前記反応は、３０℃～９０℃温度下で行い、好ましくは、前記反応は、４０℃～８０℃温度下で行う、（２２）～（３２）のいずれか一項に記載の方法。
（３４）前記反応は、ｐＨが３．０から１１．０の範囲内で行い、好ましくは、前記反応は、ｐＨが４．０から１０．０の範囲内で行う、（２２）～（３３）のいずれか一項に記載の方法。
（３５）前記反応は、嫌気性、温度が４５～５５℃、ｐＨが８．０、金属イオンがＣｏ2+又はＭｇ2+又はＭｎ2+又はそれらの組み合わせの条件下で行う、（２２）～（３４）のいずれか一項に記載の方法。
（３６）前記反応は、インビトロ触媒反応又は全細胞生体触媒反応を含む、（２２）～（３５）のいずれか一項に記載の方法。
（３７）前記反応は、インビトロ触媒反応であり、前記インビトロ触媒反応は、段階的又は同時に行うことができる、（３６）に記載の方法。
（３８）前記インビトロ触媒反応は、段階的に行う場合、１つの反応容器又は直列の複数の反応容器において実施される、（３７）に記載の方法。
（３９）前記反応容器は、バッチ供給バイオリアクター、固定化酵素を含む充填床バイオリアクター、酵素又は細胞リサイクルバイオリアクター、膜分離を含むバイオリアクター、及び連続供給バイオリアクターのうちの１つ又は複数から選択されるものである、（３８）に記載の方法。
（４０）前記インビトロ触媒反応における酵素は、遊離酵素、前記酵素を含む細胞溶解物、前記酵素を含む全細胞、固定化酵素の１つ又は複数の形態で存在する、（２２）～（３９）のいずれか一項に記載の方法。
（４１）前記全細胞生体触媒反応の反応様式は、細胞工場を使用して反応を行うことであり、前記細胞は（１６）記載の核酸コンストラクト又は（１７）に記載の組み換え発現ベクターを含む、（３６）に記載の方法。
（４２）Ｌ－ペントースの調製におけるポリペプチドの使用において、前記ポリペプチドは、（１）～（１３）のいずれか一項に記載のポリペプチドから選択される、前記使用。
（４３）前記Ｌ－ペントースはＬ－アラビノース、Ｌ－リボース、Ｌ－リブロース、Ｌ－キシルロース、Ｌ－キシロース及びＬ－リキソースのうちの１つ又は複数から選択される、（４２）に記載の使用。
（４４）Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ活性を有する酵素としてのポリペプチドの使用において、前記ポリペプチドは、（１）～（１３）のいずれか一項に記載のポリペプチドから選択される、前記使用。
発明の効果
一実施形態において、本公開は、Ｄ－キシルロースとＬ－リブロースとの相互変換の化学反応を触媒する能力を有する野生型Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ（Ｘｕ４Ｅ）及びその変異体を発見した。
特定の実施形態において、本公開によって提供されるＸｕ４Ｅ変異体は、野生型Ｘｕ４Ｅと比較して、改善された特性、例えば、改善された物理的及び／又は化学的特性を有する。例示的に、特定の実施形態において、Ｘｕ４Ｅ変異体は、野生型Ｘｕ４Ｅと比較して、酵素活性が増加した。別の特定の実施形態において、Ｘｕ４Ｅ変異体は、野生型Ｘｕ４Ｅと比較して、反応速率が増加した。別の特定の実施形態において、Ｘｕ４Ｅ変異体は、野生型Ｘｕ４Ｅと比較して、Ｋmが減少した。
別の実施形態において、本公開は、従来技術の従来の製造方法と比較して、より単純な製造プロセスを有し、Ｌ－ペントースの製造コストを低減する、Ｌ－ペントースを調製するための新しい方法を発見した。
図１は、従来技術であるすべてのペントース同士の相互変換に関するＩｚｕｍｏｒｉｎｇ図を示している。 図２は、Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ（Ｘｕ４Ｅ）によって触媒されるＤ－キシルロース及びＬ－リブロースの相互変換に関する図を示している。 図３は、Ｘｕ４ＥによるＤ－キシロースを６種類のＬ－ペントースに変換するための人工多酵素経路を示している。ここで、Ｄ－ＸＩ：Ｄ－キシロースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．５）、Ｌ－ＡＩ：Ｌ－アラビノースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．４）、Ｌ－ＲＩ：Ｌ－リボースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．Ｂ３）、ＭＰＩ：ホスホマンノースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．８）、Ｄ－ＬＩ：Ｄ－リボースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．１５）、Ｒｕ３Ｅ：Ｌ－リブロース３－エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．３１）、Ｌ－Ｆｕｌ：Ｌ－フコースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．２５）、Ｄ－ＡＩ：Ｄ－アラビノースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．３）、及びＬ－ＲａＩ：Ｌ－ラムノースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．１４）。 図４は、４種類の希少糖のＨＰＬＣクロマトグラフィーによる単離結果を示している。ここで、（ａ）は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈ水素イオン交換カラムが使用された場合を示す。その分離条件は：カラム温度６０℃、流動相が５ｍＭ 硫酸、流量が０．６ｍＬ／ｍｉｎである。（ｂ）は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｐ鉛イオン交換カラムが使用された場合を示す。その分離条件は：カラム温度６０℃、流動相が脱イオン水、流量が０．６ｍＬ／ｍｉｎである。（ｃ）は、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｕｇａｒ Ｐａｋ Ｉカルシウムイオン交換カラムが使用された場合を示す。その分離条件は：カラム温度８０℃、流動相が脱イオン水、流量が０．５ｍＬ／ｍｉｎである。（ｄ）は、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＫＳ－８０１ナトリウムイオン交換カラムが使用された場合を示す。その分離条件は：カラム温度７０℃、流動相が脱イオン水、流量が０．５ｍＬ／ｍｉｎである。 図５は、野生型Ｘｕ４Ｅと、様々な反応条件下での指向性進化によって得られた８つの代表的なＸｕ４Ｅ変異体の比活性の比較を示している。 図６は、野生型ＴｍＸｕ４Ｅに基づく単一アミノ酸残基の変化がその比活性に及ぼす影響を示している。 図７は、熱処理によって精製されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現した３種類の耐熱性酵素（即ち、Ｄ－ＸＩ、Ｘｕ４Ｅ、及びＬ－ＡＩ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示している。Ｔ：全細胞溶解物、Ｓ：上清、Ｈ：熱処理された細胞溶解物。 図８は、５０ｍＭ Ｄ－キシロースからＬ－アラビノースへのワンポットプロセスを示している。Ｌ－アラビノースは、１Ｕ／ｍＬ ＸＩ及び１Ｕ／ｍＬ ＡＩ、０．２ｍＭ Ｃｏ2+、１ｍＭ Ｍｎ2+、１ｍｇ／ｍＬ Ｘｕ４Ｅ（野生型又は変異体）を含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）で生成された。反応は、５０℃、嫌気性条件下で行う。 図９は、５００ｍＭ Ｄ－キシロースからＬ－アラビノースへのワンポットプロセスを示している。反応は、１０Ｕ／ｍＬ ＸＩ及び１０Ｕ／ｍＬ ＡＩ、０．２ｍＭ Ｃｏ2+、１ｍＭ Ｍｎ2+、１０ｍｇ／ｍＬ Ｘｕ４Ｅ Ｍ８７を含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）で行った。反応は、５０℃、嫌気性条件下で行う。 図１０は、Ｌ－アラビノースに関する、生物変換及び擬似移動床（ＳＭＢ）による製造・分離（ａ）と、高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）による工業化製造・分離（ｂ）と、の比較を示している。 図１１は、Ｘｕ４Ｅ触媒による基質（Ｄ－キシルロース）からの生成物（Ｌ－リブロース）のＨＰＬＣ分離図を示している。ここで、ＨＰＬＣ単離されたピークは、一次質量分析（図１２）、及び二次質量分析（図１３）で確認された。 図１２は、ＨＰＬＣ単離された基質（Ｄ－キシルロース）、及び生成物（Ｌ－リブロース）ピークの一次質量分析図を示している。 図１３は、ＨＰＬＣ単離された基質（Ｄ－キシルロース）、及び生成物（Ｌ－リブロース）ピークの二次質量分析図を示している。 図１４Ａ及び図１４Ｂは、異なる物種からのＸｕ４Ｅ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列分析比較の結果を示している。 図１４Ａ及び図１４Ｂは、異なる物種からのＸｕ４Ｅ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列分析比較の結果を示している。
発明を実施するための形態
定義
本開示の特許請求の範囲及び／又は明細書において、特に断りがない限り、例えば、「１個の／１種類（ａ,ａｎ）」、「前記（ｓａｉｄ）」又は「前記（ｔｈｅ）」などは、対象が単数形及び／又は複数形の両方を含むことが意図される。
特許請求の範囲及び明細書で使用される場合、「含む」、「有する」、「包括する」、「所有する」、又は「含有する」という用語は、包括的又は自由形式を意味し、追加の引用されていない参照要素又は方法工程は除外されないことである。
本開示で使用される場合、「約」という用語は、数値が、数値を決定するために使用されるデバイス又は方法の誤差の標準偏差を含むことを意味する。実例として、前述の標準偏差は、通常、元の値の２０－３０％の範囲内にある。
本開示は、「又は」という用語の定義を代替物及び「及び／又は」としてのみ支持するが、特許請求の範囲における「又は」という用語は、明示的に代替物としてのみ又は代替物間で相互に排他的であると述べられていない限り、「及び／又は」を意味する。
本開示で使用される場合、「変換（ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ）」という用語は、他の有機又は無機触媒を使用することができるが、主に１つ又は複数のポリペプチド（酵素）によって触媒される１つの分子から別の分子への化学的変換を指す。その収率は、生成物のモル量と基質のモル量との間の比率（単位は％で）を指す。
本開示で使用される場合、「単糖」は、加水分解されてより単純な糖を与えることができず、リン酸基又はＵＤＰ基などの化学基によって修飾されない任意の糖（例えば、Ｄ－グルコース、五炭単糖、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノース）を指す。
本開示で使用される場合、「ペントース」又は「五炭単糖」という用語は、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースなど、分子に５つの炭素原子を含む任意の単糖を指す。
本開示で使用される場合、「単糖」は、「Ｄ－」又は「Ｌ－」として標識され得る。前述の２つのシリーズの分割は、比較標準としてのグリセルアルデヒドの構造に基づいており、フィッシャー投影式の最も低い不斉炭素原子の構成に従って決定される。右旋性のグリセルアルデヒドは、フィッシャー投影式の右側にヒドロキシル基を持つ異性体として定義され、Ｄ－異性体と呼ばれる。左旋性のグリセルアルデヒドは、左側にヒドロキシル基を持つグリセルアルデヒドとして定義され、Ｌ－異性体と呼ばれる。つまり、単糖のキラル炭素原子がＤ－グリセルアルデヒドと同じであり、ヒドロキシル基が右端にあり、Ｄ－単糖としてラベル付けされている。単糖のキラル炭素原子がＬ－グリセルアルデヒドと同じである場合、ヒドロキシル基は左端にあり、Ｌ－単糖としてラベル付けされている。
本開示で使用される場合、「４－エピメラーゼ」という用語は、糖の４番目の炭素でのヒドロキシル基を交換することができる酵素を指す。例示的に、「４－エピメラーゼ」は、Ｄ－タガトース及びＤ－フルクトースの４番目の炭素でのヒドロキシル基を交換できる酵素、Ｄ－キシルロース及びＬ－リブロースの４番目の炭素でのヒドロキシル基を交換できる酵素、Ｄ－グルコース及びＤ－ガラクトースの４番目の炭素でのヒドロキシル基を交換できる酵素、Ｄ－キシロース及びＬ－アラビノースの４番目の炭素のヒドロキシル基を交換できる酵素である。
本開示で使用される場合、「ポリペプチド」、「酵素」、「ポリペプチド又は酵素」、「ポリペプチド／酵素」という用語は同じ意味を有し、本開示を通して交換可能である。前記用語は、ペプチド結合を介して多くのアミノ酸で構成されるポリマーを指し、リン酸基やホルミル基などの修飾を含む場合と含まない場合がある。
本開示で使用される場合、「Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ」（Ｄ－ｘｙｌｕｌｏｓｅ４－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）及びその略称「Ｘｕ４Ｅ」という用語は、Ｄ－キシルロースとＬ－リブロースの相互変換を触媒できるポリペプチド（酵素）をを指す。
本開示で使用される場合の、１つの「酵素活性の単位（Ｕ）」は、１分間あたり、酵素反応によって基質から１μｍｏｌの生成物を生成するのに必要な酵素の量として定義される。
本開示で使用される場合、「比活性」という用語は、「相対活量」又は「Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ」としても表現され、これらは、本開示において同じ意味を有し、交換可能に使用することができる。これは、ポリペプチド（酵素）のミリグラムあたりの酵素活性（Ｕ／ｍｇ）を指す。
本開示で使用される場合、２つの核酸又はポリペプチドの比較における「配列同一性」又は「同一性パーセント」という用語は、ヌクレオチド又はアミノ酸残基配列アライメントアルゴリズムを使用して測定される場合、又は目視検査によって測定される場合、最大の対応、それらは同一であるか、同一の配列の特定のパーセンテージを持っている。つまり、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の同一性は、以下の比率を使用して定義することができる。この比率は、同一のヌクレオチド又はアミノ酸の数に応じて２つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸配列を最大に比較し、必要に応じてギャップを追加して、整列時に同じ数のヌクレオチド又はアミノ酸を達成する方法であり、整列部分のヌクレオチド又はアミノ酸の総数の比率である。
本開示で使用されるように、２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列同一性は、以下の方法によって測定され得る：ポリヌクレオチド又はポリペプチドのヌクレオチド又はアミノ酸配列を整列させ、同じヌクレオチド又はアミノ酸残基を含む整列したポリヌクレオチド又はポリペプチドの位置の数をスコアリングし、整列したポリヌクレオチド又はポリペプチドの位置の数と比較する異なるヌクレオチド又はアミノ酸残基が比較される。ポリヌクレオチドは、例えば、異なるヌクレオチドを含むか、又は欠落したヌクレオチドによって、ある位置で異なる可能性がある。ポリペプチドは、例えば、異なるアミノ酸を含むか、又は欠落しているアミノ酸によって、１つの位置で異なる可能性がある。配列同一性は、同じヌクレオチド又はアミノ酸残基を含む位置の数を、ポリヌクレオチド又はポリペプチド中のアミノ酸残基の総数で割ることによって計算することができる。例えば、同一性パーセントは、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基を含む位置の数を、ポリヌクレオチド又はポリペプチド中のヌクレオチド又はアミノ酸残基の総数で割って、１００を掛けることによって計算することができる。
例示的に、本開示において、２つ以上の配列又は部分配列は、配列アライメントアルゴリズムを使用して最大の対応のために比較及び整列された場合、又は目視検査「配列同一性」又は「同一性パーセント」によって測定された場合、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオシド又はアミノ酸残基が「配列同一性」又は「同一性パーセント」を有する。「配列同一性」又は「同一性パーセント」の決定／計算は、配列の任意の適切な領域に基づくことができる。例えば、長さに関して、少なくとも約５０残基の長さの領域、少なくとも約１００残基の領域、少なくとも約２００残基の領域、少なくとも約４００残基の領域、又は少なくとも約５００残基の領域である。ある特定の実施形態において、配列は、比較される生体高分子（即ち、核酸又はポリペプチド）のいずれか又は両方の全長にわたって実質的に同一である。
本開示で使用されるように、異なる配列のヌクレオチド又はアミノ酸の番号付けは、ヌクレオチド又はアミノ酸残基配列比較アルゴリズムを使用して、又は目視検査によって測定されたときの最大の対応に基づいて比較される。それは、「配列同一性」又は「パーセント同一性」をさらに判断する場合、基準ヌクレオチド又は基準アミノ酸と比較した標的ヌクレオチド又は標的アミノ酸の番号付けである。例示的に、本開示において、「配列番号５で示される配列は、配列番号２で示される配列に従って番号が付けられる」とは、配列番号５（標的アミノ酸に相当）で示される配列及び配列番号２（参照アミノ酸に相当）で示される配列が「配列同一性」又は「パーセント同一性」について判断される場合や、配列番号５で示される配列が、最大の対応を有する配列番号２で示される配列と比較又は整列される場合、配列番号２で示される配列に対応する番号、即ち、配列番号５に示されている配列の番号を意味する。
本開示で使用される場合、「アミノ酸変異」又は「ヌクレオチド変異」という用語は、「１つ又は複数のアミノ酸又はヌクレオチドの置換、複製、欠失又は付加」を含む。本開示において、「変異」という用語は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の変化を指す。特定の実施形態において、「変異」という用語は「置換」を指す。
一実施形態において、本開示の「変異」は、「保存的変異」から選択され得る。本開示において、「保存的変異」という用語は、通常、タンパク質の機能を維持する変異を指す。保存的変異の代表的な例は、保存的置換である。
本開示で使用される場合、「保存的置換」という用語は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換に関する。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されており、且つアルカリ性側鎖（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、及びシステイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファン）、β－分岐鎖（例えば、スレオニン、バリン及びイソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びヒスチジン）が含まれる。
本開示で使用される場合、「保存的置換」は、通常、タンパク質の１つ又は複数の部位で１つのアミノ酸を交換している。そのような置換は保守的である可能性がある。具体的には、保存的置換と見なされる置換には、ＡｌａからＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及ＶａｌからＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。また、保存的変異には、遺伝子が由来する個体差、株、及び種の違いに起因する自然発生の変異も含まれる。
本開示で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドから構成されるポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、個々のフラグメントの形態であり得るか、又は数又は濃度において少なくとも１回単離されたヌクレオチド配列に由来するより大きなヌクレオチド配列構造の一部であり得る。配列及びそれらの構成要素であるヌクレオチド配列は、標準的な分子生物学的方法（例えば、クローニングベクターを使用する）によって同定、操作、及び回収することができる。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（即ち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表される場合、これには、「Ｕ」が「Ｔ」に置き換わるＲＮＡ配列（即ち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含まれる。言い換えれば、「ポリヌクレオチド」は、他のヌクレオチド（個々のフラグメント又はフラグメント全体）から除去されたヌクレオチドのポリマーを指し、又は発現ベクター又はポリシストロン配列などのより大きなヌクレオチド構造の構成成分又は成分であり得る。ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ配列が含まれる。「組換えポリヌクレオチド」は「ポリヌクレオチド」の一種である。
本開示で使用される場合、「組換えポリヌクレオチド」という用語は、自然界で一緒に連結されていない配列を持つポリヌクレオチドを指す。組換えポリヌクレオチドは適切なベクターに含まれ得、そしてベクターは適切な宿主細胞への形質転換に使用され得る。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。次に、ポリヌクレオチドは、組換え宿主細胞で発現されて、例えば、「組換えポリペプチド」を産生する。
本開示で使用される場合、「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むが、これらに限定されない；ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。
本開示で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードし、その発現のために制御配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む線状又は環状ＤＮＡ分子を指す。
本開示で使用される場合、「組み換え発現ベクター」という用語は、例えば、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するために使用されるＤＮＡコンストラクトを指す。組換え発現ベクターは、例えば、ｉ）プロモーター及びエンハンサーなどの、遺伝子発現に対して調節効果を有する遺伝子要素のコレクション；ｉｉ）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造又はコード配列；及びｉｉｉ）適切な転写及び翻訳の開始及び終結配列を有する転写サブユニット；を含むことができる。組換え発現ベクターは、任意の適切な方法で構築される。ベクターの性質は重要ではなく、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾンなど、あらゆるベクターを使用できる。本開示で使用することができるベクターには、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミドなどの染色体、非染色体、及び合成ＤＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されない。例としては、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミド、及びプラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ワクチン、アデノウイルス、鶏痘、バキュロウイルス、ＳＶ４０、及び偽狂犬病などのウイルスに由来するＤＮＡがある。
本開示で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、コード配列の発現を指示するように、調節配列がポリヌクレオチドのコード配列に対して所定の位置に配置される構成を指す。例示的に、調節配列は、プロモーター及び／又はエンハンサーによってコードされる配列から選択され得る。
本開示で使用される場合、「核酸コンストラクト」という用語は、適切な調節配列に作動可能に連結されたポリペプチド又はドメイン又はモジュールをコードするポリヌクレオチドを含む。調節配列は、選択した細胞又は株でのポリヌクレオチドの発現に必要である。
本開示で使用される場合、「内因性」という用語は、生物又は細胞内で自然に発現又は産生されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は他の化合物を指す。つまり、内因性ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は他の化合物は外因性ではない。例えば、「内因性」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、それが最初に自然から単離されたときに細胞内に存在する。
本開示で使用される場合、「外因性」という用語は、発現が望まれる特定の細胞又は生物において自然に見出されるか又は発現される任意のポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。外因性ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は他の化合物は内因性ではない。
本開示で使用される場合、「野生型」という用語は、自然界に見出される可能性のある物体を指す。例えば、生物に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人間によって意図的に改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、自然に発生している。本開示で使用されるように、「天然に存在する」及び「野生型」は同義語である。
本開示で使用される場合、「変異体」という用語は、「野生型」又は「比較基準」ポリヌクレオチド又はポリペプチドヌクレオチド又はポリペプチドに対して１つ又は複数（例えば、いくつか）の位置に変化（即ち、置換、挿入及び／又は欠失）を含むポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。ここで、置換とは、ある位置を占めるヌクレオチド又はアミノ酸を別のヌクレオチド又はアミノ酸で置き換えることを指す。欠失とは、位置を占めるヌクレオチド又はアミノ酸の除去を指す。挿入とは、その位置を占めるヌクレオチド又はアミノ酸に隣接し、その直後にヌクレオチド又はアミノ酸を付加することを指す。例示的に、本開示における「変異体」は、Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ（Ｘｕ４Ｅ）活性を依然として有するポリペプチドである。
本開示で使用されるように、「過剰発現された」組換え遺伝子は、微生物において対応する天然に存在する遺伝子よりも多くのＲＮＡ及び／又はタンパク質を産生する。ＲＮＡ及びタンパク質の量を測定するための方法は、当技術分野で知られている。過剰発現は、酵素活性などのタンパク質活性を測定することによっても決定できる。本開示の実施形態によれば、「過剰発現」は、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、又は少なくとも５０％以上の量である。過剰発現されたポリヌクレオチドは通常、宿主細胞に固有のポリヌクレオチドであり、その生成物は、宿主細胞で通常生成される量よりも多い量で生成される。例えば、限定されないが、過剰発現は、ポリヌクレオチドをポリヌクレオチドの天然プロモーター以外のプロモーターに作動可能に連結することによって、又はポリヌクレオチドの追加のコピーを宿主細胞に導入することによって達成される。
本開示で使用される場合、「フラグメント」という用語は、成熟ポリペプチド又はドメインのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端から１つ又は複数（例えば、いくつか）のアミノ酸が欠失しているポリペプチド又は触媒又は炭水化物結合部分を意味する。本開示の技術的な構成において、前記フラグメントは、Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ（Ｘｕ４Ｅ）活性を有する。
本開示で使用される場合、「単離された」という用語は、自然界には見られない形態又は環境の物質を意味する。単離された物質の非限定的な例には、（１）天然に存在しないあらゆる物質；（２）酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド、又は補因子を含むがこれらに限定されない物質、この物質は、本質的に関連している１つ又は複数又はすべての天然成分から少なくとも部分的に除去される；（３）自然界に存在する物質と比較して人工的に改変された物質；或いは、（４）自然に関連する他の成分と比較して物質の量を増やすことによって変更された物質（例えば、宿主細胞での組換えプロセス、物質をコードする遺伝子の複数のコピー、及び物質をコードする遺伝子に自然に関連するプロモーターよりも強力なプロモーターの使用）が含まれる。分離された物質は、発酵ブロスサンプルに存在する可能性がある。例えば、宿主細胞は、本開示のポリペプチドを発現するように遺伝子改変することができる。宿主細胞からの発酵ブロスは、単離されたポリペプチドを含む。分離された物質は、生体内変化液のサンプルに存在する可能性がある。例えば、標的生成物であるＬ－アラビノースは、酵素的に触媒された多糖類混合液体から分離することができる。
本開示で使用される場合、「高ストリンジェンシー条件」という用語は、少なくとも１００ヌクレオチドの長さのプローブについては、標準的なサザンブロッティング手順に従い、４２℃で５Ｘ ＳＳＰＥ（生理食塩水リン酸ナトリウムＥＤＴＡ）、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの剪断及び変性サーモン精子ＤＮＡ及び５０％ホルムアミド中で１２～２４時間プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを行ったということを指す。最後に、担体材料を、２Ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを使用して６５℃で１５分間３回洗浄した。
本開示で使用される場合、「非常に高ストリンジェンシー条件」という用語は、少なくとも１００ヌクレオチドの長さのプローブについては、標準的なサザンブロッティング手順に従い、４２℃で５Ｘ ＳＳＰＥ（生理食塩水リン酸ナトリウムＥＤＴＡ）、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの剪断及び変性サーモン精子ＤＮＡ及び５０％ホルムアミド中で１２～２４時間プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを行ったということを指す。最後に、担体材料を、２Ｘ ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを使用して７０℃で１５分間３回洗浄した。
本開示で使用される場合、「遊離酵素」という用語は、生物を含まない酵素を指す。本開示の遊離酵素は、それらが発現される細胞の溶解後、部分的又は高度に精製された後、溶液中に懸濁され得る。それは、可溶性であるか、又は不溶性マトリックスに結合され得る。
本開示で使用される場合、「固定化酵素」という用語は、特定の空間範囲内で触媒的に作用し、繰り返しかつ連続的に使用することができる酵素を指す。酵素触媒反応は通常水溶液中で行われ、固定化酵素は水溶性酵素を物理的又は化学的方法で処理して水に不溶性になるが、それでも酵素活性を有するものである。
本開示で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などに適した任意の細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製中に起こる変異のために親細胞とは異なる親細胞の任意の子孫を包含する。
本開示で使用される場合、「全細胞微生物」という用語は、それらの細胞膜を完全に溶解していない全細胞を指す。前記酵素を含む全細胞微生物を直接使用するか、安定性とリサイクル性のために固定化するか、又は全細胞を透過処理して反応速度を速くすることができる。
本開示で使用される場合、「触媒反応」という用語は、触媒の作用下で起こる化学反応を指す。触媒は特定の反応を選択的に加速することしかできず、化学反応を熱力学的に可能ないくつかの方向の１つに進行させる可能性がある。触媒と反応物が同じ相にある場合、均一系触媒反応 （Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）と呼ばれ、異なる相にある場合、不均一系触媒反応（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）と呼ばれる。生物学的触媒－酵素が関与する反応は、酵素触媒反応（Ｅｎｚｙｍｉｃ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）と呼ばれる。
特定の実施形態において、前記触媒反応は、インビトロで酵素又は複数の酵素によって触媒され得、前述の触媒反応は、「酵素触媒反応」とも呼ばれ得、これは、酵素を使用する化学変換のプロセスを指す。触媒として、この反応プロセスは生物変換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）又は生物触媒（ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ）とも呼ばれる。
別の特定の実施形態において、前記触媒反応は、インビボ／細胞内で実施することができ、前述の触媒反応は、「細胞内触媒反応」と呼ばれることもある。
本開示で使用される場合、「細胞内触媒反応」という用語は、「全細胞生体触媒反応」と呼ばれることもあり、無傷の生物（即ち、細胞全体、組織、さらには個体）を触媒として利用する化学変換のプロセスを指す。全細胞生体触媒反応で一般的に使用される有機触媒は主に微生物であり、これは本質的に、１つ又は複数の微生物細胞内の１つ又は複数の酵素によって触媒される。動物細胞、植物細胞、さらには生物学的個体を使用する生体内変化法も開発されている。全細胞生体内変化の一般的に使用される方法には、反応面への細胞の固定化、ミクロスフェアの懸濁、及び多孔性固相担体が含まれる。
本開示で使用される場合、「発酵生成物」という用語は、細胞発酵によって生成され、回収及び／又は精製が全く又は最小限に抑えられる調製物を指す。発酵生成物は、発酵の終わりに得られる発酵材料の未分画又は分画された内容物を含み得る。典型的には、発酵生成物は分画されておらず、例えば、遠心分離による微生物細胞（例えば、糸状菌細胞）の除去後に存在する使用済み培地及び細胞破片を含む。いくつかの実施形態において、発酵生成物は、使用済み細胞培養培地、細胞外酵素、及び生存可能及び／又は生存不能な微生物細胞を含む。
本開示で使用される場合、「生体触媒生成物」という用語は、回収及び／又は精製が全く又は最小限に抑えられる生体触媒（ポリペプチド又は酵素又は全細胞）によって生体触媒される調製物を指す。生体触媒作用は、金属イオンを含む生体触媒による水性緩衝液中で実施される。いくつかの実施形態において、生体触媒には、反応のための遊離酵素、前記酵素を含む細胞溶解物、前記酵素を含む全細胞生物、前記酵素を固定化及び架橋する凝集体を含む。
本開示で使用される場合、「バイオリアクター」という用語は、生物（例えば、微生物）が保有する酵素又は生物学的機能を利用して生体内変化反応を実行する装置システムである。それは、発酵槽、固定化酵素、固定化細胞リアクターなどの生体機能シミュレーターである。
特に定義されていない限り、又は文脈によって明確に示されていない限り、本開示で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ及び変異体
一実施形態において、Ｄ－キシルロースとＬ－リブロースの相互変換を可能にする、これまでに報告されたことのないペントース４－エピメラーゼを発見した。Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ（Ｘｕ４Ｅ）と名付けた（図２）。
特定の実施形態において、本発明者らは、２つの酵素ファミリーからのいくつかの酵素においてＸｕ４Ｅ様酵素活性：タガチュロネート（ｔａｇａｔｕｒｏｎａｔｅ）３－エピメラーゼ（ＥＣ５．１．２．７）及びＬ－リブロース５－リン酸４－エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．４）を初めて発見した。
別の実施形態において、野生型Ｘｕ４Ｅを使用してｘｕ４ｅのＤＮＡ変異体のライブラリーを作成し、それから物理化学的特性が変化したＸｕ４Ｅ変異体を同定した。
例示的に、特定の実施形態において、Ｘｕ４Ｅ変異体は、野生型Ｘｕ４Ｅと比較して、比活性が増加した。別の特定の実施形態において、Ｘｕ４Ｅ変異体は、野生型Ｘｕ４Ｅと比較して、反応速率が増加した。別の特定の実施形態において、Ｘｕ４Ｅ変異体は、野生型Ｘｕ４Ｅと比較して、Ｋmが減少した。
Ｌ－ペントース生産のための人工酵素経路
補酵素ＮＡＤ（Ｐ）が必要ではない、Ｘｕ４ＥによりＤ－キシロースを６つのＬ－ペントースに変換するための人工多酵素触媒経路を設計した（表２）。Ｘｕ４Ｅとその変異体に用いて、人工的な多酵素触媒経路を設計し、４－エピメラーゼ、３－エピメラーゼ及びアルドースイソメラーゼによって（図３及び表２）、Ｄ－キシロースから６つのＬ－ペントース（即ち、Ｌ－アラビノース、Ｌ－リボース、Ｌ－リブロース、Ｌ－キシロース、Ｌ－リキソース及びＬ－キシルロース）が調製された。これらの人工多酵素経路は、高価な２つのＮＡＤ（Ｐ）依存性オキシドレダクターゼ（即ち、アルドースレダクターゼとポリオールデヒドロゲナーゼ）を必要としない。
例示的に、本開示で示されるＬ－ペントースの製造において、図１で示されるキシリトール又はリビトールを通る経路は必要とされない。
酵素及び／又はそれらの変異体
本開示で開示される新規酵素は、様々な生物において自然に存在する。所望の活性を有する特定の酵素が実施例で使用されているが、他の酵素が同様の活性を有し、使用することができるので、本開示はこれらの酵素に限定されない。例えば、Ｄ－キシルロースとＬ－リブロースの相互変換を触媒することもできるいくつかの新しいペプチドが発見される可能性がある。本開示に記載されている他の反応は、この実施形態に記載されていない酵素によって触媒することができ、この実施形態にも含まれる。
いくつかの特定の実施形態において、例えば、酸性又は塩基性条件下でより活性で安定であるこれらの酵素の変異体を、本開示で使用することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体には、置換、挿入、又は欠失変異体が含まれ、変異体は、未修飾酵素と実質的に相同又は実質的に同一であり得る。いくつかの特定の実施形態において、変異体は、酵素の少なくともいくらかの生物学的活性、例えば、触媒活性を保持する。他の変異体には、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の生物学的活性を保持する酵素変異体が含まれる。
生物に由来するポリペプチド又はポリヌクレオチドは、天然のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に対する１つ又は複数の修飾を含み、天然酵素よりも優れていないとしても同様の活性（例えば、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又は少なくとも１１０％、又はさらに高い酵素活性）を示している。例えば、場合によっては、酵素活性は、親／天然に存在する配列の指向性進化によって改善される。あるいは、任意に、コード配列を変異させて、所望の特性を得る。例示的に、「所望の特性」は、より良い熱安定性、増加した反応速度、最適なｐＨ、又は金属補因子の好みなどから選択される。
酵素の形
本開示で使用される遊離酵素又は酵素を含む細胞溶解物は水溶性である。通常、固定化酵素を使用するのが最適である。固定化酵素は一般的に、より安定していて耐久性がある。固定化酵素はまた、回収及び複数の触媒サイクルでの使用が容易であり、製造プロセスのコストを削減する。酵素固定化の多くの方法が当技術分野で知られている。酵素はまた、架橋されて架橋酵素凝集体（Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅ,ＣＬＥＡ）を形成することができ、これは一般により安定であり、回収及び再利用がより容易である。多くの酵素が生物に存在し、希少糖を製造するための生体触媒として機能することができるが、人工微生物で異種発現することもでき、生体触媒として使用することができる。
本開示で使用されるリコンビナーゼは、完全な細胞溶解なしに細胞全体に留まることができる。細胞全体には１つ又は複数の酵素が含まれている。通常、固定化された全細胞を使用するのが最適です。細胞全体は、有機溶媒処理、化学試薬処理、又は熱処理などの多くの技術によって透過処理することができる。固定化された細胞はまた、複数の触媒サイクルにわたってリサイクル及び再利用が容易であり、これにより製造プロセスのコストを削減する。全細胞透過性及び全細胞固定化の多くの方法が当技術分野で知られている。本開示は、本開示に記載される反応を触媒する全細胞の固定化及び架橋の方法に関する。
エラープローンＰＣＲ
エラープローンＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼを使用してプロモーター配列を増幅する場合、マグネシウムイオンの濃度向上、マンガンイオンの追加、体系内の４つのｄＮＴＰの濃度の変更、忠実度の低いＤＮＡポリメラーゼの使用等反応条件を調整することによって、ターゲットＤＮＡ配列にランダムに変異を導入して、ターゲット配列に対してランダムな変異体を取得する方法である。
Ｌ－ペントースの製造方法
（１）製造・分離・精製過程
本開示の方法及び組成物は、様々な従来の発酵又は酵素バイオリアクター（例えば、バッチ、流加、細胞又は酵素のリサイクル及び連続発酵又は連続酵素触媒作用）に適合させることができる。
本開示の実施例において、単位時間あたりに形成される生体触媒生成物の量は、一般に、酵素の触媒活性条件（例えば、ｐＨ、温度、金属イオン）及び触媒プロセスに存在する酵素の量の関数である。
本開示の実施形態において、金属イオンを含む溶液は、１つ又は複数の金属イオンを含み得る。例示的に、前記金属イオンを含む溶液は、ＣｕＣｌ2、ＦｅＣｌ3、ＺｎＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＣｏＣｌ2、ＮｉＣｌ2又はＭｎＣｌ2を含む溶液から選択され得る。
効率的な微生物触媒発酵プロセスの重要なパラメーターのいくつかには、微生物をより大きな細胞密度への成長、所望の生成物の収量の増加、体積生産性の量の増加、望ましくない共代謝物の除去、安価な炭素及び窒素源の利用の改善、発酵槽条件の変化への適応、細菌増殖産生の増加、組換え酵素の合成の増加、酸性条件に対する耐性の増加、アルカリ性条件に対する耐性の増加、有機溶媒に対する耐性の増加、高塩分条件に対する耐性の増加、及び高温又は低温耐性に対する耐性の増加などが含まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される複数の酵素は、１つ以上の遊離酵素、酵素を含む細胞溶解物、酵素を含む全細胞、固定化酵素として存在し得、生体触媒作用は、ペントース基質を含む反応溶液中で行われ、変換された生成物が反応溶液に形成される。一実施形態において、酵素的に触媒された最終生成物は、当技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して、反応溶液から単離することができる。
Ｌ－ペントースは、多酵素、反応物、反応中間体、及び生体触媒生成物から単離することができ、生体触媒生成物は、当技術分野で知られている様々な方法を使用して、反応物及び反応中間体から回収及び／又は精製することができる。いくつかの実施形態において、生体触媒生成物は、バイオリアクターから回収される。一実施形態では、微生物を破壊し、培養培地又は溶解物を遠心分離して、粒子状の細胞破片を除去し、細胞膜を分離して、Ｌ－ペントースの生成を触媒することができる酵素を含む可溶性タンパク質画分をもたらす。Ｌ－ペントースの分離及び精製方法には、クロマトグラフィー、擬似移動床クロマトグラフィー、結晶化、イオン性、疎水性及びサイズ排除樹脂に基づく吸着及び放出、濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、遠心分離、抽出、塩又は溶媒による沈殿、乾燥、又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。所望の分離は、酵素の除去／回収に限定されず、残りの生成物及び反応物（Ｄ－キシロース、Ｄ－キシルロース、Ｌ－ペントース及び金属イオンを含む）の混合物の一部又はすべての回収も含み、所望の分離は、さらなる精製を必要としない場合がある。Ｄ－キシロース、Ｄ－キシルロース及びＬ－リブロースの回収の有無、ならびに酵素の精製、固定化及び回収は、本開示に含まれるさらなる実施形態である。
（２）改変微生物細胞におけるポリペプチド（酵素）の産生
反応の一部又はすべてを触媒する本開示に記載の酵素は、非天然の、操作された異種生物で発現させることができる。具体的には、経路の酵素をコードする遺伝子を単離し、生産生物を形質転換するために使用される発現ベクターに挿入し、ゲノムに組み込み、酵素を直接発現させることができる。微生物を操作するための方法は、「分子生物学における現代の方法」（Ｏｎｌｉｎｅ ＩＳＢＮ：９７８０４７１１４２７２０,Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ．）、「微生物代謝工学：方法及びプロトコル」（Ｑｉｏｎｇ Ｃｈｅｎｇ Ｅｄ．,Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、及び「システム代謝工学：方法及びプロトコル」（Ｈａｌ Ｓ．Ａｌｐｅｒ Ｅｄ．,Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）などの出版物で説明されているように、当技術分野で知られている。
変異体は、挿入、破壊、置換、又は欠失などの当技術分野で周知の方法を使用して、ポリヌクレオチドの発現をアップレギュレート又はダウンレギュレートすることによって構築することができる。例えば、修飾又は不活化されるポリヌクレオチドは、活性に必要なコード領域又はその一部、あるいはコード領域の発現に必要な調節エレメントであり得る。そのような調節又は制御配列の例は、プロモーター配列又はその機能的部分、即ち、ポリヌクレオチドの発現に影響を与えるのに十分な部分であり得る。改変することができる他の制御配列には、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、転写ターミネーター、及び転写活性化因子が含まれるが、これらに限定されない。
当業者は、操作された微生物細胞を増殖させて酵素を産生することができる。微生物細胞による組換え酵素の生産に関するガイドラインとプロトコルは、「発酵及び生物化学工学ハンドブック：原理、プロセス設計、及び機器」（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｈｅｎｒｙ Ｃ．Ｖｏｇｅｌ ａｎｄ Ｃｅｌｅｓｔｅ Ｌ．Ｔｏｄａｒｏ,Ｎｏｙｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ19９７）、「発酵技術の原則」（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ ｅｔ．ａｌ．,Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｈｅｉｎｅｍａｎ,２００３）などの出版物に記載されている。
（３）生物学的反応条件
本開示のいくつかの実施形態において、複数の酵素を混合して、Ｄ－キシロースなどの原材料又は他の中間体（Ｄ－キシルロース）をＬ－ペントースに変換し、Ｌ－ペントースを回収することができる人工多酵素経路を形成する。生物学的反応プロセスは、好気性、微小好気性又は嫌気性条件下で実施することができる。本開示の別のいくつかの実施形態において、生体触媒反応は、嫌気性条件下（即ち、検出可能な酸素なしで）で実行される。
本開示のいくつかの実施形態において、生物学的反応プロセスは、３０℃～９０℃の条件下で実施される。本開示のいくつかの実施形態において、生物学的反応プロセスは、４０℃～８０℃の条件下で実施される。本開示いくつかの実施形態において、生物学的反応プロセスは、５０℃～７０℃の条件下で実施される。本開示いくつかの実施形態において、生物学的反応プロセスは、６０℃～７０℃の条件下で実施される。
プラスミド及び組み換えタンパク質調製
すべての組換えタンパク質の過剰発現は、Ｅ。ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用して実行された。本開示に含まれるすべての組換えタンパク質発現／過剰発現方法は、「分子生物学実験ガイド」に記載されている技術的な構成に従って実施することができる。
例示的に、対応するタンパク質のコード遺伝子を保有するｐＥＴプラスミドは、以下のように調製される。
Ｘｕ４Ｅ酵素活性を有する可能性のあるＬ－リブロース５－リン酸－４－エピメラーゼ（ＲＰ４Ｅ）を調製するために、サーマスマリヌス（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８）及びゲオバチルス ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のｒｐ４ｅ遺伝子は、対応するゲノムから増幅された。拡張オーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＰＯＥ－ＰＣＲ）に基づく単純なクローニング技術（Ｙｏｕ,Ｃ．,Ｘ．－Ｚ．Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｙ．－Ｈ．Ｐ．Ｚｈａｎｇ（２０１２）．"Ｓｉｍｐｌｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ:ｄｉｒｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ（ＤＮＡ ｍｕｌｔｉｍｅｒ）ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ．"Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８:１５９３－１５９５．）により、それらをｐＥＴ２０ｂプラスミドに挿入し、対応するプラスミドｐＥＴ２０ｂ－ＴｍＲＰ４Ｅ、ｐＥＴ２０ｂ－ＥｃＲＰ４Ｅ、ｐＥＴ２０ｂ－ＢｓＲＰ４Ｅ、及びｐＥＴ２０ｂ－ＧｓＲＰ４Ｅを構築した。ＰＯＥ－ＰＣＲの反応条件は次の通りである。２５０ｎｇのｐＥＴ２０ｂプラスミドバックボーンと等モルの標的遺伝子フラグメント、０．２ｍＭ の様々なｄＮＴＰ、及び０．０２Ｕ／μｌのＱ５ＤＮＡポリメラーゼ； ＰＣＲ増幅条件：９８℃で１分間、９８℃で２０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で７２秒間、３０サイクル、７２℃で５分間。
Ｘｕ４Ｅ酵素活性を有する可能性のある野生型Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ（Ｘｕ４Ｅ）を調製するために、一対のプライマーＦ_ＵｘａＥ（Ｆ）とＲ_ＵｘａＥ（Ｒ）を使用した:
Ｆ（配列番号１２３）：５’－ＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＴＣＡＡＡＧＡＣＣ－３’、
Ｒ（配列番号１２４）：ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＡＣＧＴＧＣＣ－３’。
ＰＣＲ法により、サーモスポラマリーナ（Ｔｈｅｒｍｕｓｍａｒｉｎｕｓ）のゲノムからｕｘａＥ遺伝子を増幅した。
ｐＥＴ２８ａに基づいて、１対のプライマーＦ_ｐＥＴ２８ａ（Ｆ）とＲ_ｐＥＴ２８ａ（Ｒ）を使用して増幅した：
Ｆ（配列番号１２５）：５’－ＧＣＴＧＧＡＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧ－３’、
Ｒ（配列番号１２６）：５’－ＣＴＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧ－３’。
ＰＯＥ－ＰＣＲ法により、マルチマープラスミドを増幅して大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換し、プラスミドｐＥＴ２８ａ－ｔｍ_ＵｘａＥを得た。
Ｌ－アラビノースイソメラーゼ（Ｌ－ＡＩ）を調製するために、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＡＩのＤＮＡ配列をコドン最適化し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｉｏ（Ａｎｈｕｉ、Ｃｈｉｎａ）によって合成して、プラスミドｐＥＴ２０ｂ－ＢｓＡＩを得た。
Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ由来の耐熱性キシロースイソメラーゼ（Ｄ－ＸＩ）をコードするプラスミドｐＥＴ２０ｂ－ＴｔｃＸＩは、参考文献（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２０１８）から入手した。
特に断りのない限り、すべての組換え酵素にはヒスチジン融合タグがあり、ニッケルイオン樹脂を使用したアフィニティー吸着によって精製される。標的タンパク質をコードする遺伝子を保有するｐＥＴプラスミドを、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞を使用して２５０ｍｌのＬＢ培地で３７℃の温度で培養した。細胞の吸光度Ａ600が約０．６－０．８に達した時、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加してタンパク質の発現を誘導した。タンパク質の発現は、３７℃で６時間、又は１８℃で１６時間行った。遠心分離により細胞を回収した後、ペレットを０．１Ｍ 塩化ナトリウムと１０ｍＭ イミダゾールを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）に再懸濁した。超音波処理により細胞膜を破壊し、遠心分離後、酵素を含む上清のサンプルをニッケルイオン樹脂精製カラムにロードした。目的の酵素は、０．１Ｍ 塩化ナトリウムと１５０－５００ｍＭ イミダゾールを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）を使用して溶出することにより精製した。酵素濃度は、標準品としてウシ血清アルブミンを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ測定法によって決定することができる。組換えタンパク質の発現レベルとタンパク質の純度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を使用して検出され、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェア（Ｂｏｌｅ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）のアバンダンス分析機能を使用して定量化した。
Ｌ－アラビノース合成に使用される熱安定性酵素は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ由来のＤ－キシロースイソメラーゼ、Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａに由来する野生型Ｘｕ４Ｅ及びＸｕ４Ｅ変異体Ｍ８、及び（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＬ－アラビノースイソメラーゼであり、それらは熱処理（５０～８０℃、１０～６０分）によって精製することができる。細胞溶解物を熱処理して遠心分離し、上記の３つの酵素を含む上清を混合する。これはＤ－キシロースからＬ－アラビノースへの変換に使用できる。
スクリーニン用グプラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅ及びスクリーニン用宿主大腸菌ＪＺ９１９の構築
スクリーニン用グプラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅには、ＰBADプロモータープロモーターの制御下にあるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子、在ＰAraＣプロモーターの制御下にある野生型ａｒａＣ遺伝子、及びＰtacプロモーターの制御下にあるｘｕ４ｅ遺伝子が含まれる。大腸菌細胞では、Ｘｕ４Ｅ陽性変異体がより多くのＬ－アラビノースを産生し、これにより大腸菌細胞がより高レベルのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質を発現し、より強い蛍光シグナルが得られた。スクリーニングプラスミドは、標準的なＤＮＡアセンブリ技術を使用して構築された。
大腸菌ＪＺ９１９（ＴＯＰ１０ΔｘｙｌＢ:: ａｒａＡ）をスクリーニン用宿主として構築し、スクリーニン用グプラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅとともに使用した。スクリーニン用グプラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅは、細胞内Ｌ－アラビノース濃度を検出し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナルを表示できる遺伝子センサーを搭載している。Ｌ－アラビノースを蓄積するために、Ｄ－キシルロースとＬ－リブロースの利用に関連する２つの遺伝子を大腸菌宿主細胞でノックアウトし、ａｒａＡ遺伝子を大腸菌ゲノムに挿入した。大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０（ΔａｒａＡＢＣＤ）から、ゲノム内のｘｙｌＢ遺伝子をａｒａＡ遺伝子に置き換え、ノックアウトと挿入を同時に行った。
Ｘｕ４Ｅ変異体ライブラリーの構築
ｘｕ４ｅ遺伝子の変異ライブラリーは、変異率の低いエラープローンＰＣＲ（ｅｐ－ＰＣＲ）を使用して確立された。
プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＵｘａＥをＤＮＡテンプレートとして使用し、プライマーは：ＭＵｘａＥ－ＩＦ（配列番号１２７）：５’－ＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡ－３’、ＭＵｘａＥ－ＩＲ（配列番号１２８）：５’－ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＡＣＧ ＴＧＣＣ－３’であった。
変異体ライブラリーは、ＰＣＲ増幅によって得られた。ＭＵｘａＥ－ＩＦは５’末端リン酸化プライマーである。ＭＵｘａＥ－ＩＲの５’末端の最後の２８ｂｐ配列は、プラスミドバックボーンの配列と相同な相補配列である。５０μｌのｅｐ－ＰＣＲ反応系には、１ｎｇ／μｌプラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０５ｍＭ ＭｎＣｌ2、０．４μＭプライマー（ＭＵｘａＥ－ＩＦ及びＭＵｘａＥ－ＩＲ）、及び０．０５Ｕ／μｌ ＮＥＢ Ｔａｑポリメラーゼが含まれる。
Ｘｕ４Ｅ変異体ライブラリーのハイスループットスクリーニング
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＺ９１９の化学的コンピテントセルは、従来技術に従って、例えば、「分子生物学実験ガイド」に記載されている方法によって調製することができる。さらに、ｕｘａＥ変異体ライブラリーを保有する大腸菌ＪＺ９１９細胞を、Ｄ－キシロースを含むＬＢ固形培地で培養した。３７℃で１２時間培養した後、４時間ごとにコロニーの色が観察された。コロニーの蛍光強度を検出するために、目視観察又は紫外線照射によって陽性クローンを選んだ。より強い蛍光強度を示すクローンを選び、Ｄ－キシロースを添加した０．５ｍｌのＬＢ培地を含む９６ディープウェルプレートで培養し、３７℃で１２時間培養した。ＳｙｎｅｒｇｙＭｘ多機能マイクロプレートリーダー（Ｂｅｒｔｏｎ、Ｖｅｒｍｏｎｔ、ＵＳＡ）を使用して、９６ウェルプレートの細胞培養培地からの蛍光シグナルを測定した。蛍光励起スキャンは５８９ｎｍで実行され、発光スキャンは６１０ｎｍで実行された。
ポリペプチド／酵素がＸｕ４Ｅ酵素活性を有するかどうかを判断するための測定方法
Ｄ－キシロース／Ｄ－キシルロース混合液を用意した。Ｄ－キシロース／Ｄ－キシルロース混合物は、１Ｍキシロース、５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び５０ｍｇの固定化Ｄ－ＸＩを含む１ｍｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）で調製し、ＸＩはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｇ４１６６）から購入した。７０℃で一晩反応させた後、固定化されたＸＩを遠心分離により除去した。Ｄ－キシロース／Ｄ－キシルロース混合物は、約７００ｍＭ のキシロース及び３００ｍＭ のキシルロースを含んでいた。
Ｘｕ４Ｅの酵素活性アッセイは、段階的な酵素活性測定方法を使用して実施された。反応溶液は、７０ｍＭ キシロース、３０ｍＭ キシルロース、及び０．２ｍＭ Ｃｏ2+又は２ｍＭ Ｚｎ2+を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファーでした。特に指定のない限り、Ｘｕ４Ｅ酵素活性アッセイは３０～８０℃で１５分～２４時間実施し、酵素タンパク質の溶解度は０．００１～１０ｇ／Ｌであった。Ｘｕ４Ｅが反応を触媒した後、６５μＬの反応溶液をピペットで取り、３５μＬの１．８８Ｍ ＨＣｌＯ4と混合し、１３．５μＬの５ＭＫＯＨを混合物に加えて中和した。遠心分離して沈殿物を除去した後、１０Ｕ／ｍＬ（過剰）Ｌ－ＡＩと１ｍＭ Ｍｎ2+を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）でＬ－リブロースを含む上清をＬ－アラビノースへの２回目の変換反応を行い、酵素反応は５０℃で１５分間行った。Ｌ－アラビノース濃度は、メガザイムＬ－アラビノース／Ｄ－ガラクトースアッセイキット（Ｋ－ＡＲＧＡ、ブレイ、アイルランド）を使用して決定した。
速度論的パラメーターを決定するために、Ｘｕ４Ｅの酵素活性アッセイを、５０℃で０．２ｍＭ Ｃｏ2+を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．５）で実施した。Ｄ－キシロースとＤ－キシルロースの合計濃度は１．５～１０００ｍＭ であり、Ｄ－キシルロースの濃度は０．５～３００ｍＭ であった。酵素活測定在５０℃行う１５ｍｉｎ。酵素活性アッセイは５０℃で１５分間行った。Ｄ－キシルロースに対するＸｕ４Ｅの見かけＫm及びｋcat定数は、ミカエリス式の非線形フィッティングに基づいてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．,Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して計算した。
Ｄ－キシロースからのＬ－アラビノースの生産
５０ｍＭ Ｄ－キシロースからのＬ－アラビノースの生成は、１ｍｌの反応系で実施され、反応系は、０．２ｍＭ Ｃｏ2+、１ｍＭ Ｍｎ2+、１ｇ／Ｌ Ｘｕ４Ｅ（ＤＮＡ配列が配列番号１で示される野生型、及びアミノ酸配列が配列番号４０で示される代表的な変異体Ｍ８）、１Ｕ／ｍＬ Ｄ－ＸＩ及び１Ｕ／ｍＬ Ｌ－ＡＩを含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）であった。Ｌ－アラビノースが５００ｍＭ Ｄ－キシロースから生成された場合、Ｘｕ４Ｅの濃度は１０ｇ／Ｌに増加し、Ｄ－ＸＩ及びＬ－ＡＩの濃度も１０Ｕ／ｍＬに増加した。３つの酵素を混合した後、反応溶液を５０℃で反応させた。Ｌ－アラビノースの濃度は、メガザイムＬ－アラビノース／Ｄ－ガラクトースアッセイキット（Ｋ－ＡＲＧＡ、ブレイ、アイルランド）を使用して測定し、Ｄ－キシロース、Ｄ－キシルロース及びＬ－リブロースの濃度は、示差屈折率検出器を備えた島津高速液体クロマトグラフィーを使用して検出され、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＡｍｉｎｅｘＨＰＬＣＨＰＸ－８７Ｈ液体カラムを使用して分離された。
Ｘｕ４ＥがＤ－キシルロースを使用して製造した産物がＬ－リブロースであることの確認
野生型又は変異型Ｘｕ４Ｅにより、得られた生成物について、ＬＣ－ＥＳＩ－ＱＴＯＦ－ＭＳにてＬ－リブロースに確認された。１ ｍＬの反応系には、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ Ｄ－キシルロース、０．２ｍＭ Ｃｏ2+及び１ｇ／Ｌ Ｘｕ４Ｅが含まれる。反応を５０℃で１時間実施し、次に５３８μＬのＨＣｌＯ4を添加することにより反応を停止させた。２０７μＬの５ＭＫＯＨを加えることにより混合物を中和した。不活性化されたタンパク質と沈殿物を遠心分離で除去し、サンプルを島津高速液体クロマトグラフィーで分離し、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を備えた四重極飛行時間型タンデム質量分析ＱＴＯＦ（ｃｏｍｐａｃｔ ＱＴＯＦ、Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ）で生成物を検出した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｕｇａｒ Ｐａｋ Ｉカルシウムイオン交換カラム（３００ ｘ６．５ ｍｍ、１０μｍ粒子サイズ）をサンプル分離の固定相として使用しました（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏ、米国マサチューセッツ州ミルフォード）。移動相は脱イオン水、流量は０．５ｍＬ／ｍｉｎであった。カラム温度は８０℃、サンプルローディングは２０μｌであった。ＥＳＩは負イオンモードを使用した。キャピラリー電圧は４５００Ｖ、噴霧器圧力は２ｂａｒ、乾燥ヒーターは２００℃、乾燥気流は８Ｌ／ｍｉｎであった。
発酵生成物又は細胞溶解物
本開示はまた、本開示のポリペプチドを含む発酵生成物又は細胞溶解物に関する。発酵生成物には、全細胞（目的のポリペプチドを産生するために使用される本開示のポリペプチドをコードする遺伝子を含む宿主細胞を含む）、又は細胞溶解物などの発酵プロセスで使用される他の成分がさらに含まれる。いくつかの実施形態において、該組成物は、前記酵素を含む死滅した全細胞、前記酵素を含む細胞溶解物、及び培地を含む前記酵素を含む細胞死滅した全培養液である。
擬似移動床による分離
擬似移動床（ＳＭＢ）は、液体分離操作に吸着の原理を利用する物質移動装置であり、逆流連続操作モードで実行されている。工業用ＳＭＢは、有機酸、アミノ酸、希少糖などの低付加価値の生物学的製品を分離するためにますます使用されている。酵素固定化とＳＭＢ分離を組み合わせることで、必要なＬ－ペントースの製造コストを効果的に削減し、基質の利用効率を向上させることができる。例示的に、ＳＭＢ樹脂には、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＫＳ－８０１ナトリウムイオン交換カラム、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｕｇａｒ Ｐａｋ Ｉカルシウムイオン交換カラム、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｐ鉛イオン交換カラム又はＢｉｏ－Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈ水素イオン交換カラムのいずれかが含まれる。或いは、類似の樹脂、又はそれらのシリーズの組み合わせである。
実施例
本開示の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の特定の実施形態を示す一方で、この詳細な説明を読んだ後、様々な変形例及び修正が当業者に明らかになるので、詳細な説明及び特定の例は例示の目的でのみ与えられることを理解されたい。
実施例で使用されるすべての試薬は、特に断りのない限り、市販されているものである。
材料及び方法
試薬及び材料
特に明記されていない限り、すべての薬剤は分析グレード以上であり、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州、米国）又はＣｈｉｎａ Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｇｒｏｕｐ（上海、中国）から購入した。サーモスポラマリーナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８及びＡｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓのゲノムＤＮＡは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ）から購入した。大腸菌ＴＯＰ１０及びＤＨ５α（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）をＤＮＡ操作及びプラスミド増幅に使用した。組換えタンパク質の発現には、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．,Ｌｔｄ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。
本開示の技術的な構成において、記載のヌクレオチド及びアミノ酸配列リストの番号によって表される意味は以下の通りである：
配列番号１に示されているのは、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８の野生型タガチュロネート（tagaturonate）３－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ_００４０８１５２６．１、ＫＥＧＧ ＩＤ ＴＭ０４４０）のヌクレオチド配列である。
配列番号２に示されているのは、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８の野生型タガチュロネート３－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ_００４０８１５２６．１、ＫＥＧＧ ＩＤ ＴＭ０４４０）のアミノ酸配列である。
配列番号３に示されているのは、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）のタガチュロネート３－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ_０１５９１８７４４．１）のアミノ酸配列である。
配列番号４に示されているのは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ ＳＧ１のタガチュロネート３－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ_１０１５１２８８８．１）のアミノ酸配列である。
配列番号５に示されているのは、サーモトガカルディフォンティス（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｃａｌｄｉｆｏｎｔｉｓ）的タガチュロネート３－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ_０４１０７７３７５．１）のアミノ酸配列である。
配列番号６に示されているのは、シュードサーモトガ・レティンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）のタガチュロネート３－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ_０１２００２８７２．１）のアミノ酸配列である。
配列番号７に示されているのは、ハラナエロビウムコンゴレンス（Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ）のタガチュロネート３－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ_０８１３７４５４３．１）のアミノ酸配列である。
配列番号８に示されているのは、サーモセディミバクターリトリペルエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｌｉｔｏｒｉｐｅｒｕｅｎｓｉｓ）の４－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＴＹＰ５３２４８．１）のアミノ酸配列である。
配列番号９に示されているのは、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓの４－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ_０１２８４４０２６．１）のアミノ酸配列である。
配列番号１０に示されているのは、Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓの４－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ_０６６１８８４７４．１）のアミノ酸配列である。
配列番号１１に示されているのは、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の４－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＨＣＺ０６１４６．１）のアミノ酸配列である。
配列番号１２に示されているのは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍの４－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＲＫＸ４５４５４．１）のアミノ酸配列である。
配列番号１３に示されているのは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ａｃｅｔｏｔｈｅｒｍｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍの４－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＨＡＦ７１３９４．１）のアミノ酸配列である。
配列番号１４に示されているのは、Ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｔｈｅｒｍａｒｕｍの４－エピメラーゼ遺伝子（Ｋｅｇｇ ＩＤ：Ｔｈｅｔｈ_１０８３）のアミノ酸配列である。
配列番号１５に示されているのは、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＤＳＭ５７１の４－エピメラーゼ遺伝子（Ｋｅｇｇ ＩＤ：Ｔｔｈｅ_２３９１）のアミノ酸配列である。
配列番号１６に示されているのは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ ａｄｏｒｎａｔｕｓ１５０５の４－エピメラーゼ遺伝子（Ｋｅｇｇ ＩＤ：ＴＣＡＲＢ_０８２８）のアミノ酸配列である。
配列番号１７に示されているのは、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｔａｌｉｃｕｓの４－エピメラーゼ遺伝子（Ｋｅｇｇ ＩＤ：Ｔｈｉｔ_１７４６）のアミノ酸配列である。
配列番号１８に示されているのは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎａｐｈｔｈｏｐｈｉｌａの４－エピメラーゼ遺伝子（Ｋｅｇｇ ＩＤ：Ｔｎａｐ_０２２２）のアミノ酸配列である。
配列番号１９に示されているのは、Ｔｈｅｒｍｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ ＤＳＭ８５３２の４－エピメラーゼ遺伝子（Ｋｅｇｇ ＩＤ：Ｃｓｔ_ｃ０８５１０）のアミノ酸配列である。
配列番号２０に示されているのは、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍの４－エピメラーゼ遺伝子（Ｋｅｇｇ ＩＤ：ＤＩＣＴＨ_１９２３）のアミノ酸配列である。
配列番号２１に示されているのは、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＤＳＭ６１９２の４－エピメラーゼ遺伝子（Ｋｅｇｇ ＩＤ：ＳＴＨＥＲＭ_ｃ０４３５０）のアミノ酸配列である。
配列番号２２に示されているのは、Ｓｉｎｇｕｌｉｓｐｈａｅｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａの４－エピメラーゼ遺伝子（Ｋｅｇｇ ＩＤ：Ｓｉｎａｃ_２８０６）のアミノ酸配列である。
配列番号２３に示されているのは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＭＳＢ８的Ｄ－キシルロース５－リン酸４－エピメラーゼ遺伝子（Ｋｅｇｇ ＩＤ：ＴＭ０２８３）のアミノ酸配列である。
配列番号２４に示されているのは、サーモトガカルディフォンティス（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｃａｌｄｉｆｏｎｔｉｓ）的Ｄ－キシルロース５－リン酸４－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ_０４１０７７２９１．１）のアミノ酸配列である。
配列番号２５に示されているのは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＳＭ４３５９的Ｄ－キシルロース５－リン酸４－エピメラーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＭ２２５７７．１）のアミノ酸配列である。
配列番号２６に示されているのは、Ｐｓｅｕｄｏｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅのＩＩアルドラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＵＫ２１０９４．１）のアミノ酸配列である。
配列番号２７に示されているのは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＤ－キシルロース５－リン酸４－エピメラーゼ遺伝子（Ｋｅｇｇ ＩＤ：ＢＳＵ２８７８０）のアミノ酸配列である。
配列番号２８に示されているのは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚａｌｉｈａｅ的Ｄ－キシルロース５－リン酸４－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ_０６０７８８４８８．１）のアミノ酸配列である。
配列番号２９に示されているのは、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ的Ｄ－キシルロース５－リン酸４－エピメラーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦＬ１５０５２．１）のアミノ酸配列である。
配列番号３０に示されているのは、Ｐａｒａｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ的Ｄ－キシルロース５－リン酸４－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ_０４２３８５６３３．１）のアミノ酸配列である。
配列番号３１に示されているのは、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍのＤ－キシルロース５－リン酸４－エピメラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ_０９４０４３８７８．１）のアミノ酸配列である。
配列番号３２に示されているのは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ＭＧ１６５５のＤ－キシルロース５－リン酸４－エピメラーゼ遺伝子（Ｋｅｇｇ ＩＤ：ｂ００６１）のアミノ酸配列。
配列番号３３～１２２に示されているのは、本発明者らによって構築された変異体である。変異体の特定の変異部位については、本開示の表３の説明を参照されたい。
なお、先行技術（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）のデータベースに開示された内容によれば、配列番号３～３２で示されるアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列もまた、当技術分野の当業者に知られている。
実施例１．ペントースの分離と検出
Ｄ－キシロース、Ｄ－キシルロース、Ｄ－リブロース及びＬ－アラビノースは、以下の（１）～（４）に記載されている方法のいずれかを使用して分離された：
（１）Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＬＣ ＨＰＸ－８７Ｈ液相イオン交換カラムを使用して分離した。その分離条件は：カラム温度が６０℃、流動相が５ｍＭ 硫酸、流量が０．６ｍＬ／ｍｉｎであった。
（２）Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｐ鉛イオン交換カラム、カラム温度が８０℃、流動相が脱イオン水、流量が０．６ｍＬ／ｍｉｎであった。
（３）Ｗａｔｅｒｓ Ｓｕｇａｒ Ｐａｋ Ｉカルシウムイオン交換カラム、カラム温度が８０℃、流動相が脱イオン水、流量が０．５ｍＬ／ｍｉｎであった。
（４）Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＫＳ－８０１ナトリウムイオン交換カラム、カラム温度が７０℃、流動相が脱イオン水、流量が０．５ｍＬ／ｍｉｎであった。
上記（１）～（４）の方法で分離したＤ－キシルロース、Ｄ－キシロース、Ｄ－リブロース、Ｌ－アラビノースの場合、その濃度は、示差屈折率検出器を備えた島津高速液体クロマトグラフィーで検出できる。
実験結果：Ｄ－キシロース、Ｄ－キシルロース、Ｄ－リブロース及びＬ－アラビノースについて、上記（１）～（４）に示したＨＰＬＣによるクロマトグラフィー分離の効果を図４に示した。その中で、（１）に示すＨＰＬＣ分離条件が最も優れた分離効果を示している。
実施例２．Ｌ－リブロース－５－リン酸４－エピメラーゼからのＸｕ４Ｅ機能を持つ酵素のマイニング
基質構造の類似性と類似な酵素触媒メカニズムを考慮して、Ｌ－リブロース－５－リン酸４－エピメラーゼファミリー（ＲＰ４Ｅ、ＥＣ５．１．３．４）からＤ－キシルロースをＬ－リブロースに変換する可能性のあるＸｕ４Ｅ酵素を選択した。我々が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サーモスポラマリーナ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）のそれぞれから４つのＲＰ４Ｅをクローニングし、ｐＥＴプラスミドにクローニングした。発現プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を増殖させ、組換えタンパク質を発現させた。
Ｈｉｓ－ｔａｇ付きタンパク質をアフィニティー吸着により精製した後、本開示に記載の「ポリペプチド／酵素がＸｕ４Ｅ酵素活性を有するかどうかを判断するための測定方法」により、得られた組換えタンパク質を検出した。試験結果から、サーモスポラマリーナ（Ｔｈｅｒｍｕｓｍａｒｉｎｕｓ）、枯草菌及びバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する３つのＲＰ４Ｅは、ある程度のＸｕ４Ｅ活性を示し、比活性は約０．０００２～０．０００３Ｕ ／ｍｇであったが、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＲＰ４Ｅの比活性は０．０００１Ｕ／ｍｇ未満であった。
上記の実験結果に基づいて、Ｌ－リブロース－５－リン酸４－エピメラーゼファミリー（ＲＰ４Ｅ、ＥＣ５．１．３．４）を保有する多くの微生物から対応するｒｐ４ｅ遺伝子をクローニングし、それらをｐＥＴプラスミドにクローニングした。前述の発現プラスミドを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を培養し、組換えタンパク質を発現させた。さらに、得られた組換えタンパク質は、本開示に記載の「ポリペプチド／酵素がＸｕ４Ｅ酵素活性を有するかどうかを判断するための測定方法」によって検出された。
前述の実験方法により、Ｘｕ４Ｅ酵素活性を有する天然酵素は、配列番号２３～３２で示される配列によってコードされる酵素であることが見出された。
実施例３．タガチュロネート３－エピメラーゼからのＸｕ４Ｅ機能を有する新しい酵素のマイニング
基質構造の類似性と類似な酵素触媒作用メカニズムを考慮して、例２と同様の方法を使用して、タガチュロネート３－エピメラーゼ（ＵｘａＥ、ＥＣ５．１．２．７）からＤ－キシルロースをＬ－リブロースに変換する機能を持つ可能な新しい酵素を選択した。様々な微生物から複数のｕｘａｅ遺伝子をクローニングし、それらをｐＥＴプラスミドにクローニングした。発現プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を増殖させ、組換えタンパク質を発現させた。
Ｈｉｓ－ｔａｇ付きタンパク質をアフィニティー吸着により精製した後、本開示に記載の「ポリペプチド／酵素がＸｕ４Ｅ酵素活性を有するかどうかを判断するための測定方法」により、得られた組換えタンパク質を検出した。試験結果から、サーモスポラマリーナ（Ｔｈｅｒｍｕｓｍａｒｉｎｕｓ）由来のタガチュロネート３－エピメラーゼ（Ｔｍ０４４０）は、最適化された反応条件なしで、約０．０１２ Ｕ/ｍｇの比活性を示した。
前述の実験方法により、Ｘｕ４Ｅ酵素活性を有する天然酵素は、配列番号２～２２で示される配列によってコードされる酵素であることが見出された。
実施例４．活性の増強されたＸｕ４Ｅ変異体Ｍ４
指向性進化のための天然酵素として、熱安定性が高く、触媒作用のある無差別活性が高いサーモスポラマリーナ（Ｔｈｅｒｍｕｓｍａｒｉｎｕｓ）由来のタガチュロネート３－エピメラーゼ（ＴｍＸｕ４Ｅ）を使用した。ここで、前述のＴｍＸｕ４Ｅのアミノ酸配列は、配列番号２で示される配列であり、前述のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１で示される配列である。
ｘｕ４ｅ変異体のライブラリーを構築するために、変異率が低い（即ち、遺伝子ごとに約１つの変異部位を生成する）Ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを使用した。プラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅに挿入された変異体のライブラリーを宿主大腸菌ＪＺ９１９に形質転換し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地の固体プレートにプレーティングした。プレート上で約１０,０００クローンをスクリーニングし、陽性変異体を選択して９６ウェルプレートに播種し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地で培養した。本開示に記載の「Ｘｕ４Ｅ変異体ライブラリーのハイスループットスクリーニング」法を使用して、マイクロプレートリーダーを使用して、マイクロプレート内の細胞培養液の蛍光シグナルを検出し、陽性変異体を確認した。１回ごとにいくつかの陽性変異体を選んだ。
スクリーニングされた変異体から、Ｓ１２５Ｄを含む変異体Ｍ４を選択した。変異体Ｍ４の比活性の検出を行った。Ｍ４は、天然酵素と比較して比活性が２５％増加したことが分かった（図５）。
実施例５．活性を高め続けるＸｕ４Ｅ変異体Ｍ４７
実施例４より選択した変異体Ｍ２から、変異率が低い（つまり、遺伝子ごとに約１つの変異部位を生成する）Ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを使用して、ｘｕ４ｅ変異体のライブラリーを構築した。プラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅに挿入された変異体のライブラリーを宿主大腸菌ＪＺ９１９に形質転換し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地の固体プレートに塗布した。プレート上で約１０,０００クローンをスクリーニングし、陽性変異体を選択して９６ウェルプレートに播種し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地で培養した。マイクロプレートリーダーを使用してマイクロプレート内の細胞培養液の蛍光シグナルを検出することにより、陽性変異体を確認した。
スクリーニングで得られた変異体から、２つのアミノ酸変異Ｓ１２５Ｄ/Ｎ２９７Ｆを含む変異体Ｍ４７を選択した。前述の変異体Ｍ４７の比活性の検出を行った。Ｍ４７はより高い比活性を示すことが分かった（図５）。
実施例６．活性を高め続けるＸｕ４Ｅ変異体Ｍ５７
実施例５で選択された変異体Ｍ４７から出発して、低い変異率（即ち、遺伝子あたり約１つの変異部位を生成する）でＥｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを使用して、ｘｕ４ｅ変異体のライブラリーを構築した。プラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅに挿入された変異体のライブラリーを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＺ９１９に形質転換し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地の固体プレートに塗布した。プレート上で約１０,０００クローンをスクリーニングし、陽性変異体を選択して９６ウェルプレートに播種し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地で培養した。マイクロプレートリーダーを使用してマイクロプレート内の細胞培養液の蛍光シグナルを検出することにより、陽性変異体を確認した。
スクリーニングで得られた変異体から、３つのアミノ酸変異Ｓ１２５Ｄ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ２９７Ｆを含む変異体Ｍ５７を選択した。前述の変異体Ｍ５７の比活性の検出を行った。結果として、Ｍ５７はより高い比活性を示すことが分かった（図５）。
実施例７．活性を高め続けるＸｕ４Ｅ変異体Ｍ６１
実施例６で選択された変異体Ｍ５７から出発して、低い変異率（即ち、遺伝子あたり約１つの変異部位を生成する）でＥｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを使用して、ｘｕ４ｅ変異体のライブラリーを構築した。プラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅに挿入された変異体のライブラリーを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＺ９１９に形質転換し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地の固体プレートに塗布した。プレート上で約２０,０００クローンをスクリーニングし、陽性変異体を選択して９６ウェルプレートに播種し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地で培養した。マイクロプレートリーダーを使用してマイクロプレート内の細胞培養液の蛍光シグナルを検出することにより、陽性変異体を確認した。
スクリーニングで得られた変異体から、４つのアミノ酸変異Ｓ１２５Ｄ／Ｖ１６３Ｋ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ２９７Ｆを含む変異体Ｍ６１を選択した。前述の変異体Ｍ６１の比活性の検出を行った。結果として、Ｍ６１はより高い比活性を示すことが分かった（図５）。
実施例８．活性を高め続けるＸｕ４Ｅ変異体Ｍ６４
実施例７で選択された変異体Ｍ６１から出発して、低い変異率（即ち、遺伝子あたり約１つの変異部位を生成する）でＥｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを使用して、ｘｕ４ｅ変異体のライブラリーを構築した。プラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅに挿入された変異体のライブラリーを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＺ９１９に形質転換し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地の固体プレートに塗布した。プレート上で約１５,０００クローンをスクリーニングし、陽性変異体を選択して９６ディープウェルプレートに播種し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地で培養した。マイクロプレートリーダーを使用してマイクロプレート内の細胞培養液の蛍光シグナルを検出することにより、陽性変異体を確認した。
スクリーニングで得られた変異体から、５つのアミノ酸変異Ｓ１２５Ｄ／Ｖ１６３Ｋ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ２９７Ｆ／Ｙ４０３Ｗを含む変異体Ｍ６４を選択した。前述の変異体Ｍ６４の比活性の検出を行った。結果として、Ｍ６４はより高い比活性を示すことが分かった（図５）。
実施例９．活性を高め続けるＸｕ４Ｅ変異体Ｍ７２
実施例８で選択された変異体Ｍ６４から出発して、低い変異率（即ち、遺伝子あたり約１つの変異部位を生成する）でＥｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを使用して、ｘｕ４ｅ変異体のライブラリーを構築した。プラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅに挿入された変異体のライブラリーを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＺ９１９に形質転換し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地の固体プレートに塗布した。プレート上で約１２,０００クローンをスクリーニングし、陽性変異体を選択して９６ウェルプレートに播種し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地で培養した。マイクロプレートリーダーを使用してマイクロプレート内の細胞培養液の蛍光シグナルを検出することにより、陽性変異体を確認した。
スクリーニングで得られた変異体から、６つのアミノ酸変異Ｓ１２５Ｄ／Ｖ１６３Ｋ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ２９７Ｆ／Ｓ４０２Ｖ／Ｙ４０３Ｗを含む変異体Ｍ７２を選択した。前述の変異体Ｍ７２の比活性の検出を行った。結果として、Ｍ７２はより高い比活性を示すことが分かった（図５）。
実施例１０．活性を高め続けるＸｕ４Ｅ変異体Ｍ７５
実施例９で選択された変異体Ｍ７２から出発して、低い変異率（即ち、遺伝子あたり約１つの変異部位を生成する）でＥｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを使用して、ｘｕ４ｅ変異体のライブラリーを構築した。プラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅに挿入された変異体のライブラリーを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＺ９１９に形質転換し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地の固体プレートに塗布した。プレート上で約１８,０００クローンをスクリーニングし、陽性変異体を選択して９６ウェルプレートに播種し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地で培養した。マイクロプレートリーダーを使用してマイクロプレート内の細胞培養液の蛍光シグナルを検出することにより、陽性変異体を確認した。
スクリーニングで得られた変異体から、７つのアミノ酸変異Ｓ１２５Ｄ／Ｖ１６３Ｋ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ２９７Ｆ／Ｗ３０６Ｍ／Ｓ４０２Ｖ／Ｙ４０３Ｗを含む変異体Ｍ７５を選択した。前述の変異体Ｍ７５の比活性の検出を行った。結果として、Ｍ７５はより高い比活性を示すことが分かった（図５）。
実施例１１．活性を高め続けるＸｕ４Ｅ変異体Ｍ８７
実施例９で選択された変異体Ｍ７２から出発して、低い変異率（即ち、遺伝子あたり約１～２つの変異部位を生成する）でＥｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを使用して、ｘｕ４ｅ変異体のライブラリーを構築した。プラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅに挿入された変異体のライブラリーを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＺ９１９に形質転換し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地の固体プレートに塗布した。プレート上で約２５,０００クローンをスクリーニングし、陽性変異体を選択して９６ディープウェルプレートに播種し、Ｄ－キシロースを含むＬＢ培地で培養した。マイクロプレートリーダーを使用してマイクロプレート内の細胞培養液の蛍光シグナルを検出することにより、陽性変異体を確認した。
スクリーニングで得られた変異体から、９つのアミノ酸変異Ｓ１２５Ｄ／Ｒ１３１Ｓ／Ｖ１６３Ｋ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ２９７Ｆ／Ｗ３０６Ｍ／Ｑ３１８Ｋ／Ｓ４０２Ｖ／Ｙ４０３Ｗを含む変異体Ｍ８７を選択した。前記変異体Ｍ８７的アミノ酸配列は、配列番号１１９で示される配列である。
実施例１２．Ｍ８７変異体の比活性の測定
実施例１１で得られた変異体Ｍ８７の比活性を野生型Ｘｕ４Ｅと比較した（図５）。
比較結果から、変異体Ｍ８７の比活性は約２Ｕ/ｍｇであった。つまり、野生型Ｘｕ４Ｅと比較して、変異体の比活性が大幅に改善されている。
実施例１３．単一変異の変異体の調製
野生型ＴｍＸｕ４Ｅから出発して、本開示に記載の「Ｘｕ４Ｅ変異体ライブラリーの構築」の方法により、部位飽和変異誘発により野生型ＴｍＸｕ４Ｅ上の１つのアミノ酸を変更することにより、９つの単一アミノ酸部位の変異体ライブラリーを調製した。ここで、前述の野生型ＴｍＸｕ４Ｅのアミノ酸配列は、配列番号２で示される配列であり、前述のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１で示される配列である。
９つのアミノ酸変異部位が変異体Ｍ８７から選択され、これらは、それぞれ１２５位のセリンで、１３１位のアルギニン、１６１位のバリン、２６７位のバリン、２９７位のアスパラギン、３０６位のトリプトファン、３１８位のグルタミン、４０２位のセリン、又は４０３位のチロシンである。９つの変異体ライブラリーを宿主大腸菌ＪＺ９１９のプラスミドｐＧＳ－Ｘｕ４Ｅに挿入し、Ｄ－キシロースを含む各ＬＢ培地にプレーティングした。陽性変異体は、本開示に記載されている「Ｘｕ４Ｅ変異体ライブラリーのハイスループットスクリーニング」法によってスクリーニングされた。陽性変異体は野生型酵素と比較して９６ウェルマイクロプレートで検証され、ＤＮＡシーケンシングによってシーケンシングされた。
スクリーニングにより得られた変異体から、以下の９つの変異体：Ｓ１２５Ｄ、Ｒ１３１Ｓ、Ｖ１６３Ｋ、Ｖ２６７Ｉ、Ｎ２９７Ｆ、Ｗ３０６Ｍ、Ｑ３１８Ｋ、Ｓ４０２Ｖ及びＹ４０３Ｗが選択された。ここで、前述の変異体におけるアミノ酸の番号付けは、配列番号２に従って番号が付けられている。
上記の９つの変異体は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で過剰発現し、ニッケル含有イオン樹脂へのアフィニティー吸着によって精製された。変異体Ｓ１２５Ｄ、Ｖ１６３Ｋ、Ｖ２６７Ｉ、Ｎ２９７Ｆ、Ｗ３０６Ｍ、Ｑ３１８Ｋ、Ｓ４０２Ｖ及びＹ４０３ＷのＸｕ４Ｅ酵素の比活性を図６に示す。これらのうち、８つの変異体は野生型ＴｍＸｕ４Ｅよりも高い比活性を示し、Ｒ１３１Ｓ変異体は野生型ＴｍＸｕ４Ｅよりもわずかに低い比活性を示した。
実施例１４．Ｘｕ４Ｅ多重変異体の調製及び比活性の測定
実施例４－実施例１１と同じ方法で、Ｘｕ４Ｅ変異体をさらにスクリーニングした。
スクリーニング後、Ｘｕ４Ｅに基づいて以下のアミノ酸多重変異体を得た（ここで、前述のＸｕ４Ｅ変異体はすべて配列番号２に従って番号が付けられている）：
Ｍ４１（二重変異）：Ｖ２６７Ｉ／Ｎ２９７Ｆ、
Ｍ４６（二重変異）：Ｗ３０６Ｍ／Ｙ４０３Ｗ、
Ｍ５０（３つの変異）：Ｖ１６３Ｋ／Ｖ２６７Ｉ／Ｙ４０３Ｗ、
Ｍ５８（４つの変異）：Ｖ１６３Ｋ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ２９７Ｆ／Ｙ４０３Ｗ、
Ｍ６８（６つの変異）：Ｖ１６３Ｋ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ２９７Ｆ／Ｗ３０６Ｍ／Ｓ４０２Ｖ／Ｙ４０３Ｗ、
Ｍ７８（７つの変異）：Ｒ１３１Ｓ／Ｖ１６３Ｋ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ２９７Ｆ／Ｗ３０６Ｍ／Ｓ４０２Ｖ／Ｙ４０３Ｗ。
上記の変異体の比活性は、本開示に記載されている「Ｘｕ４Ｅ酵素活性測定」の方法によって検出された。
実験結果から、Ｍ４１、Ｍ４６、Ｍ５０、Ｍ５８、Ｍ６８、Ｍ７８の酵素活性は、それぞれ約０．３０Ｕ／ｍｇ、０．２１Ｕ／ｍｇ、０．１８Ｕ／ｍｇ、０．３３Ｕ／ｍｇ、０．４１Ｕ／ｍｇ、０．５７Ｕ／ｍｇであった。
実施例１５．単一変異のＸｕ４Ｅ変異体の調製及び比活性の測定
実施例４と同じ方法で、Ｘｕ４Ｅ変異体ライブラリーを取得した。
得られたＸｕ４Ｅ変異体は以下の通りである（ここで、前述のＸｕ４Ｅ変異体はすべて配列番号２に従って番号が付けられている）：
Ｍ１３（単一変異）：Ｄ１６１Ａ、
Ｍ１９（単一変異）：Ｅ２６６Ａ、
Ｍ１（単一変異）：Ｇ１０２Ｌ、
Ｍ３０（単一変異）：Ｋ３３７Ｄ、
Ｍ３１（単一変異）：Ｄ３９４Ｍ。
実験結果から、Ｍ１３、Ｍ１９、Ｍ１、Ｍ３０、Ｍ３１の比活性は、それぞれ約０．００８Ｕ／ｍｇ、０．０１３Ｕ／ｍｇ、０．０３Ｕ／ｍｇ、０．０６Ｕ／ｍｇ、０．０４Ｕ／ｍｇであった。
上記の実験結果から、上記のＸｕ４Ｅ変異体の比活性は野生型ＴｍＸｕ４Ｅ（０．０９ Ｕ / ｍｇ）よりも低いが、それでもＸｕ４Ｅ酵素活性を有している。
実施例１６．組換え熱安定性酵素の単純な精製
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ由来のＤ－キシロースイソメラーゼ、サーモスポラマリーナ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＸｕ４Ｅ、及びバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＬ－アラビノースイソメラーゼは、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で異種発現した。細胞を回収して破砕した後、細胞溶解物の上清を熱処理（７０℃、２０ ｍｉｎ）した。遠心分離後、３つの熱安定性酵素を含む上清を混合して、それによりＤ－キシロースからＬ－アラビノースへの生物変換を行った。ＳＤＳ－ＰＧＡＥにより、標的タンパク質の発現量と精製タンパク質の純度を検出した（図７）。
実施例１７．Ｄ－キシロースからのＬ－リブロースの合成
Ｄ－キシロースイソメラーゼ（Ｄ－ＸＩ）、及びＸｕ４Ｅ変異体Ｍ８７を含む２酵素システムを構築した。基質は５０ｍＭ Ｄ－キシロースであった。反応混合物には、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ Ｃｏ2+、１ｍＭ Ｍｎ2+、１ｇ／Ｌ Ｘｕ４Ｅ Ｍ８及び１Ｕ／ｍＬ ＸＩが含まれる。反応溶液を穏やかに混合し、次に嫌気性条件下で５０℃で反応させた。
１２時間の反応後、Ｌ－リブロースがＨＰＬＣにより検出され、Ｌ－リブロースの取得に成功した。人工ルートの結果は設計と一致していることが証明されている。
実施例１８．５０ｍＭ Ｄ－キシロースを使用したＬ－アラビノースの合成
Ｄ－キシロースイソメラーゼ（Ｄ－ＸＩ）、Ｘｕ４Ｅ変異体Ｍ８７及びＬ－アラビノース合成酵素（Ｌ－ＡＩ）を含む３酵素システムを構築した。基質は５０ｍＭ Ｄ－キシロースであった。反応混合物は、０．２ｍＭ Ｃｏ2+、１ｍＭ Ｍｎ2+、１ｇ／Ｌ Ｘｕ４Ｅ（ここで、Ｘｕ４Ｅは野生型又はＭ８７変異体から選択される）、１Ｕ／ｍＬ Ｄ－ＸＩ及び１Ｕ／ｍＬ Ｌ－ＡＩを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）である。３つの酵素と基質を含む反応液を混合した後、５０℃で反応を行った。
Ｘｕ４Ｅ変異体Ｍ８７を含む３酵素システムは８時間の反応後に２１ｍＭ のＬ－アラビノースを生成したが、野生型を含む３酵素システムは２４時間の反応でわずか１．２５ｍＭ のＬ－アラビノースを生成した（図８）。
実施例１９．５００ｍＭ Ｄ－キシロースを使用したＬ－アラビノースの合成
Ｄ－キシロースイソメラーゼ（Ｄ－ＸＩ）、Ｘｕ４Ｅ変異体Ｍ８７及びＬ－アラビノース合成酵素（Ｌ－ＡＩ）を含む３酵素システムを構築した。基質は５００ｍＭ Ｄ－キシロースであった。反応混合物には、１００ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ Ｃｏ2+及び１ｍＭ Ｍｎ2+を含む。Ｘｕ４Ｅの濃度が１５ｇ／Ｌで、ＸＩ及びＡＩの濃度が２０Ｕ／ｍＬに増加した。
Ｍ８７を含む３酵素系は、４時間の反応後に１７５ｍＭ Ｌ－アラビノースを生成した。そのＬ－アラビノースの比容積生産率は６．５６ｇ/リットル/時間に達した。８時間の反応後、反応が平衡に達したとき、基質のＤ－キシロースは２０７ｍＭ 、中間生成物のＤ－キシルロースとＬ－リブロースは、それぞれ５５ｍＭと４２ｍＭ 、生成物のＬ－アラビノースは１９６ｍＭであった（図９）。
実施例２０．Ｄ－キシロースからのＬ－リボースの生産
Ｄ－キシロースイソメラーゼ（Ｄ－ＸＩ）、Ｘｕ４Ｅ変異体Ｍ８７及びリン酸マンノースイソメラーゼ（ＭＰＩ）を含む３酵素システムを構築した。基質は５０ｍＭ Ｄ－キシロースであった。Ｇ．ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来のｍｐｉ遺伝子をクローン化し、ｐＥＴプラスミドに挿入した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２０１４）。反応混合物は、０．２ｍＭ Ｃｏ2+、１ｍＭ Ｍｎ2+、１ｇ／Ｌ Ｘｕ４Ｅ（Ｍ８７変異体）、１Ｕ／ｍＬ ＸＩ及び１Ｕ／ｍＬ ＭＰＩを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）である。３つの酵素と基質を含む反応溶液とを混合した後、触媒反応を４０℃で実施した。
２４時間の反応後、Ｌ－リボースがＨＰＬＣで検出され、この人工経路の結果が設計と一致していることが証明された。
実施例２１．Ｌ－ペントースの製造と分離
エピメラーゼとイソメラーゼによって触媒される反応は反応平衡状態で存在するため、標的基質を酵素及び基質/中間体から効果的に分離することが非常に重要である。例えば、Ｄ－グルコースを使用して高フルクトースシロップを製造するには、擬似移動床（ＳＭＢ）を使用してＤ－グルコースとフルクトースシロップを分離し、未利用のＤ－グルコースをさらにリサイクルし、高フルクトース含有シロップを取得する（図１０）。固定化キシロースイソメラーゼ及びキシロースイソメラーゼを含む固定化微生物全細胞は、高フルクトースシロップの工業生産に広く使用されている（図１０）。精製リコンビナーゼ又は過剰発現リコンビナーゼを含む粗細胞溶解物に限定されないが、複数の酵素の共固定化は、酵素の耐用年数を延長し、酵素及び生成物/中間体の分離を容易にし、酵素コストの使用を削減する。さらに、酵素を含む微生物の全細胞を固定化して、生体触媒の安定性及び生体触媒の再利用性を改善することは、オプションのソリューションである。さらに、反応速度を上げるために、微生物の全細胞の透過処理もオプションのソリューションでもある。
本実施例では、擬似移動床（ＳＭＢ）を使用しているが、充填樹脂はＳｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＫＳ－８０１ナトリウムイオン交換カラム、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｕｇａｒ Ｐａｋ Ｉカルシウムイオン交換カラム、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｐ鉛イオン交換カラム、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈ水素イオン交換カラム、又は同様の機能を備えたクロマトグラフィー分離カラムがあるが、これらに限定されない。
Ｌ－アラビノースの製造を例にとると、擬似移動床（ＳＭＢ）を使用して、未使用のＤ－キシロース及び中間生成物であるＬ－リブロースとＤ－キシルロースからＬ－アラビノースを分離できる（図１０）。
実施例２２．Ｘｕ４Ｅ触媒による生成物Ｌ－リブロースの特徴付け
基質Ｄ－キシルロースの反応は、野生型Ｘｕ４Ｅ及びＸｕ４Ｅ変異体Ｍ８７で触媒された。野生型Ｘｕ４Ｅは５０℃で２４時間行い、Ｘｕ４Ｅ変異体Ｍ８７は５０℃で１０分間行った。基質のＤ－キシルロースと生成物のＬ－リブロースを、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｕｇａｒ Ｐａｋカラムを備えたＨＰＬＣで分離した。
ＨＰＬＣクロマトグラムを図１１に示す。生成物（Ｌ－リブロース）の保持時間は１５．４９分で新しいピーク（黒い実線）であり、Ｌ－リブロース標準の保持時間と同じである。ＨＰＬＣで分離された生成物のピークは、Ｄ－キシルロース及びＬ－リブロース標準品と比較して、一次質量分析（図１２）及び二次質量分析（図１３）によって特徴づけられた。
実験結果は、野生型Ｘｕ４Ｅ及びＸｕ４Ｅ変異体Ｍ８７がＤ－キシルロースからＬ－リブロースへの酵素反応を触媒できることを明確に示している。
実施例２３． 異なる由来の野生型Ｘｕ４Ｅの変異体の機能の検出
バイオインフォマティクスの方法に基づいて、実施例３、実施例１４及び実施例１５で得られた異なる野生型Ｘｕ４Ｅの配列を分析及び比較した。その中で、*は異なる由来の野生型Ｘｕ４Ｅの保存されたアミノ酸部位を示す。
同時に、本出願の実施例に記載の試験方法により配列番号２に示す配列と比較して配列同一性を算出する際に、前述の異なる野生型Ｘｕ４Ｅのアミノ酸に番号を付けた。
図１４Ａ及び図１４Ｂで示されるように、前述の異なる野生型Ｘｕ４Ｅについて、配列番号２で示される前述の番号付けに対応して番号付けされる場合、配列番号２で示される番号付けの以下の部位に対応するアミノ酸は、変異後も依然としてＸｕ４Ｅ活性を有する：Ｇ１０２、Ｓ１２５、Ｒ１３１、Ｄ１６１、Ｖ１６３、Ｅ２６６、Ｖ２６７、Ｎ２９７、Ｗ３０６、Ｑ３１８、Ｋ３３７、Ｄ３９４、Ｓ４０２、Ｙ４０３。
実施例２４． 短縮された配列を有するＸｕ４Ｅ変異体の構築
本発明者らは、野生型Ｘｕ４Ｅをコードする配列を切断して、１～８６位及び１９６－２３６位をコードするアミノ酸配列を別々に又は一緒に除去し、本開示に記載の方法によって、切断したＸｕ４Ｅ変異体の生物活性を測定した。
実験結果は、配列切断後のタンパク質の活性が、９０％（１～８６番目のアミノ酸除去）、８７％（１９６～２３６番目のアミノ酸除去）、又は８５％（１９６～２３６番目のアミノ酸除去）、８５％（１９６－２３６番目アミノ酸を同時に除去）であるＸｕ４Ｅの活性を依然として維持していることを示している。
実施例２５．本開示におけるＸｕ４Ｅ活性を有する酵素の統計
本開示の実施例４～１６に記載の方法により、Ｘｕ４Ｅ活性を有する酵素の配列及びその酵素活性の実験結果を得た。
実験結果を表３に示す。
この仕様で開示されているすべての技術的特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。 この仕様で開示されている各特徴は、同じ、同等、又は類似の目的を果たす他の特徴に置き換えることもできる。 したがって、特に明記しない限り、開示される各特徴は、一連の同等又は類似の特徴の例にすぎない。
さらに、前述の説明から、当業者は、本開示からその主要な特徴を容易に理解することができ、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な異なる目的に適応するために本発明に多くの修正を加えることができる。使用条件、したがってそのような変更も、添付の特許請求の範囲に含まれることを意図している。
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Claims (15)

  1. Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ活性を有するポリペプチドであって、
    前記ポリペプチドは、配列番号３３～１２２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、
    ポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチドは、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）に由来する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 単離されたポリヌクレオチド、核酸コンストラクト、組み換え発現ベクター、又は組み換え宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチド又は前記核酸コンストラクトは、請求項１～２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
    前記組み換え発現ベクター又は組み換え宿主細胞は、請求項１～２のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する、単離されたポリヌクレオチド、核酸コンストラクト、組み換え発現ベクター、又は組み換え宿主細胞。
  4. 請求項１～２のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生する方法であって、
    前記方法は以下の工程（ａ）を含む：
    （ａ）ポリペプチドの産生に資する条件下で細胞又は菌株を培養する工程；
    そのうち、前記細胞又は菌株は、前記ポリペプチドを産生し、前記細胞又は菌株は、請求項３に記載の核酸コンストラクト又は組み換え発現ベクターを含み、前記核酸コンストラクト又は前記組み換え発現ベクターは、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む；
    方法。
  5. 請求項１～２のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いて触媒反応を行うことを含む、Ｄ－キシルロースをＬ－リブロースに変換する方法。
  6. Ｌ－ペントースを調製する方法であって、前記方法は、以下の工程：
    （ａ）Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼを用いて、Ｄ－キシルロースをＬ－リブロースに変換すること、
    を含み；
    ここで、前記Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼは、請求項１～２のいずれか一項に記載のＤ－キシルロース４－エピメラーゼ活性を有するポリペプチドである、方法。
  7. 前記方法は、さらに以下の工程：
    （ｂ）Ｄ－キシロースイソメラーゼを用いて、Ｄ－キシロースをＤ－キシルロースに変換すること、
    を含む；
    請求項６に記載の方法。
  8. 前記方法は、さらに、
    （ｉ）Ｌ－アラビノースイソメラーゼを用いて、Ｌ－リブロースをＬ－アラビノースに変換することを含み、前記Ｌ－ペントースはＬ－アラビノースである；
    （ｉｉ）Ｌ－リボースイソメラーゼ又はホスホマンノースイソメラーゼ又はそれらの組み合わせを用いて、Ｌ－リブロースをＬ－リボースに変換することを含み、前記Ｌ－ペントースはＬ－リボースである；
    （ｉｉｉ）Ｌ－リブロース３－エピメラーゼを用いて、Ｌ－リブロースをＬ－キシルロースに変換することを含み、前記Ｌ－ペントースはＬ－キシルロースである；
    （ｉｖ）Ｌ－リブロース３－エピメラーゼを用いて、Ｌ－リブロースをＬ－キシルロースに変換し、Ｌ－フコースイソメラーゼ又はＤ－アラビノースイソメラーゼ又はＬ－ラムノースイソメラーゼを用いて、Ｌ－キシルロースをＬ－キシロースに変換することを含み、前記Ｌ－ペントースはＬ－キシロースである；及び／又は
    （ｖ）Ｌ－リブロース３－エピメラーゼを用いて、Ｌ－リブロースをＬ－キシルロースに変換し、Ｌ－ラムノースイソメラーゼを用いてＬ－キシルロースをＬ－リキソースに変換することを含み、前記Ｌ－ペントースはＬ－リキソースである、
    請求項６～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記方法の反応系には、さらに酵素反応液を含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記酵素反応液が金属イオンを含み、前記金属イオンは、Ｃｏ2+、Ｚｎ2+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｃａ2+、Ｎｉ2+、Ｃｕ2+、Ｆｅ2+、Ｓｒ2+、Ｂａ2+、Ｃｄ2+、Ｐｂ2+、Ｆｅ3+、Ａｌ3+、Ｂｉ3+、Ａｇ +、Ｌｉ +から選択される１つ以上であってもよい、
    請求項９に記載の方法。
  11. 前記反応は、好気性、微好気性又は嫌気性条件下で行われる、請求項９に記載の方法。
  12. 前記反応は、嫌気性、温度が４５～５５℃、ｐＨが８．０、金属イオンがＣｏ2+又はＭｇ2+又はＭｎ2+又はそれらの組み合わせの条件下で行う、請求項１０～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記反応は、インビトロ触媒反応又は全細胞生体触媒反応を含み；
    前記反応は、インビトロ触媒反応であり、前記インビトロ触媒反応は、段階的又は同時に行うことができ；
    前記インビトロ触媒反応は、段階的に行う場合、１つの反応容器又は直列の複数の反応容器において実施され；
    前記反応容器は、バッチ供給バイオリアクター、固定化酵素を含む充填床バイオリアクター、酵素又は細胞リサイクルバイオリアクター、膜分離を含むバイオリアクター、及び連続供給バイオリアクターのうちの１つ又は複数から選択されるものであり；
    前記インビトロ触媒反応における酵素は、遊離酵素、前記酵素を含む細胞溶解物、前記酵素を含む全細胞、固定化酵素の１つ又は複数の形態で存在する、
    請求項６～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. Ｌ－ペントースの調製におけるポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドは、請求項１～２のいずれか一項に記載のポリペプチドから選択され；
    前記Ｌ－ペントースは、Ｌ－アラビノース、Ｌ－リボース、Ｌ－リブロース、Ｌ－キシルロース、Ｌ－キシロース及びＬ－リキソースのうちの１つ又は複数から選択される、使用。
  15. Ｄ－キシルロース４－エピメラーゼ活性を有する酵素としてのポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドは、請求項１～２のいずれか一項に記載のポリペプチドから選択される、前記使用。
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