JP7571012B2 - 配列決定用ライブラリーを調製するための方法および手段 - Google Patents

配列決定用ライブラリーを調製するための方法および手段 Download PDF

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Description

本明細書に提供されるシステム、方法、及び組成物は、酵素反応を選択的に制御するためのアッセイに関する。具体的には、本明細書に開示される態様は、オープンクロマチン配列決定、全ゲノム配列決定、又は標的化配列決定からの二次ＤＮＡ配列決定リードを阻害、低減、又は排除する方法に関する。
酵素は、ゲノム編集、ゲノミクスアッセイ、配列決定、医薬用途、及び診断にわたる広範な用途空間において多様な数の工程を実施し得るため、分子生物学及びゲノミクスにおいて有用なツールである。天然及び遺伝子操作酵素は、過去１０年間を通して、用途及び開発の急増を経験してきた。特異性及び効率性に強い焦点が置かれ、主焦点は酵素システムの改善であった。しかしながら、酵素システムは、オフターゲット効果を示し、結果の分析を困難にする。
本開示は、酵素が基質と相互作用する能力を妨害し、これにより酵素反応中に典型的に存在するノイズ又はエラーを低減又は排除する、交絡基質をタグ付けすることによって、酵素反応を選択的に制御するためのシステム、方法、及び組成物に関する。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、核ＤＮＡのためのトランスポザーゼアクセス可能なクロマチン配列決定（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）のためのアッセイから得られる配列決定リードなどの、配列決定から得られる一次配列決定リードを含む核酸ライブラリーに関する。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、全ゲノム配列決定又は染色体ＤＮＡのためのアッセイからの配列決定リードを含む。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）などの二次配列決定リードを含まないか、又はその低減された表現を有する。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、細菌ＤＮＡ、プラスミド、又は染色体外ＤＮＡに関する。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、二次核酸を配列決定することなく、又は二次核酸の配列決定を低減した、核酸を配列決定する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、核酸を含む試料を用意することと、試料をＤＮＡ結合分子と接触させることと、試料を挿入酵素複合体と接触させて、タグ付き核酸断片を生成することと、タグ付き核酸断片を配列決定して、配列リードを生成することと、を含む。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）配列決定リードなどの二次ＤＮＡ配列決定リードを阻害、排除、又は低減する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、二次核酸及び一次核酸を含む試料を用意することと、試料をｍｔＤＮＡなどの二次核酸に優先的に結合するＤＮＡ結合分子と接触させることと、ＤＮＡ転位をオープンクロマチン上で実施することと、を含み、二次核酸は、転位されないか、又は低い効率で転位される。
酵素の特異性を制御するための標的の修飾を示す概略図である。基質（１、２、又は３）は、全て酵素（５）の基質である。４によって修飾された基質３は、修飾（４）に起因して酵素（５）の基質ではない。修飾（４）は、ＤＮＡ染色剤、アフィニティータグ、分子、リガンド、酵素、ペプチド、又は他の修飾であり得る。
Ｈｏｅｃｈｓｔ色素の量を増加させることによって、転位実験におけるｍｔＤＮＡリードが低減され、それによって、望ましくないｍｔＤＮＡリードを排除又は低減することを示す棒グラフを示す。左から右へ、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素の濃度は、８μＭ（図２Ａ）、８０μＭ（図２Ｂ）、及び８００μＭ（図２Ｃ）である。 Ｈｏｅｃｈｓｔ色素の量を増加させることによって、転位実験におけるｍｔＤＮＡリードが低減され、それによって、望ましくないｍｔＤＮＡリードを排除又は低減することを示す棒グラフを示す。左から右へ、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素の濃度は、８μＭ（図２Ａ）、８０μＭ（図２Ｂ）、及び８００μＭ（図２Ｃ）である。 Ｈｏｅｃｈｓｔ色素の量を増加させることによって、転位実験におけるｍｔＤＮＡリードが低減され、それによって、望ましくないｍｔＤＮＡリードを排除又は低減することを示す棒グラフを示す。左から右へ、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素の濃度は、８μＭ（図２Ａ）、８０μＭ（図２Ｂ）、及び８００μＭ（図２Ｃ）である。
様々なＤＮＡ染色色素の転位効率を示すＤＮＡゲルを示す。図３Ａは、Ｈｏｅｃｈｓｔ及びＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色を示し、図３Ｂは、Ｓｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ及びＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ染色を示し、図３Ｃは、Ｑｕｂｉｔ染色又は染色なしを示す。高分子量ＤＮＡ生成物は、非効率的な転位を示す。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ及びＳｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅの両方において、１００μＭを超える濃度で阻害が観察される。 様々なＤＮＡ染色色素の転位効率を示すＤＮＡゲルを示す。図３Ａは、Ｈｏｅｃｈｓｔ及びＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色を示し、図３Ｂは、Ｓｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ及びＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ染色を示し、図３Ｃは、Ｑｕｂｉｔ染色又は染色なしを示す。高分子量ＤＮＡ生成物は、非効率的な転位を示す。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ及びＳｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅの両方において、１００μＭを超える濃度で阻害が観察される。 様々なＤＮＡ染色色素の転位効率を示すＤＮＡゲルを示す。図３Ａは、Ｈｏｅｃｈｓｔ及びＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色を示し、図３Ｂは、Ｓｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ及びＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ染色を示し、図３Ｃは、Ｑｕｂｉｔ染色又は染色なしを示す。高分子量ＤＮＡ生成物は、非効率的な転位を示す。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ及びＳｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅの両方において、１００μＭを超える濃度で阻害が観察される。
Ｈｏｅｃｈｓｔ（１００μＭ）、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（１００μＭ及び１０μＭ）、Ｓｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ（１００μＭ）、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ（１００μＭ）、Ｑｕｂｉｔ（１００μＭ又は１０μＭ）、及び色素なしを含む、様々な試験色素の結果を示す。結果は、二次ＤＮＡ配列決定リードを低減又は排除するために、選択された色素のみが好適であることを示す。
８μＭ、８０μＭ、及び８００μＭでの、様々な時間（２分又は２０分）にわたる、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色の結果を示す。
以下の「発明を実施するための形態」では、本明細書の一部を形成する、添付図面を参照する。図面では、同様の記号は、文脈がそうでない旨を指示しない限り、典型的には同様の構成要素を識別する。「発明を実施するための形態」、「図面」、及び「特許請求の範囲」に記載される例示的な実施形態は、限定することを意図するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態が利用され得、他の変更が行われ得る。本開示の態様は、本明細書に一般的に記載されるように、かつ図に示されるように、幅広い種類の異なる構成で配置、置換、組み合わせ、分離、及び設計され得、それらの全ては、本明細書に明示的に企図されることが容易に理解される。
本明細書で提供されるシステム、方法、及び組成物の実施形態は、酵素が交絡基質、例えば、酵素が通常結合するが、対象の基質の適切な分析を妨害する基質などに結合するのを妨害することによって、酵素反応を制御することに関する。
従来の酵素反応は、密接に関連する基質間の差異を分析するために必要な特異性を欠く。例えば、核酸に対する酵素は、核ＤＮＡと比較して、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）などの、様々な種類の核酸間の区別が不十分である。その結果、従来の酵素反応によって、標的分析物並びにオフターゲット分析物の両方に結果が提供され、それによって、結果を混乱させ、分析における時間、コスト、及び複雑性をもたらす。しかしながら、多くの用途では、酵素反応の選択性を制御することが望ましい。
一実施形態は、望ましくない標的を低減、阻害、又は排除することによって、対象の分析物のみを特異的に標的とするシステム及び方法である。図１は、基質結合に対する酵素の概念を概略的に示す。図１では、酵素５は、異なる基質１、２、及び３を認識し、結合することができ、次いで、酵素によって酵素的に触媒作用が及ぼされる。しかしながら、基質３は、酵素５が基質３を認識し、結合しないように、修飾４によって修飾されている。図１は、一般的な概略における方法及びシステムを示す。本明細書で提供される実施形態では、この概念は、トランスポザーゼ及び核酸の観点から、具体的には、一次ＤＮＡ配列決定リード（これは、例えば、核ＤＮＡを含む、対象のＤＮＡの配列決定リードである）、及び二次ＤＮＡ配列決定リード（これは、例えば、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、又は染色体外ＤＮＡを含む、望ましくないＤＮＡの配列決定リードである）の観点から記載される。しかしながら、一般的な方法及びシステムは、他の酵素／基質システムに適用可能であることを理解されたい。システム、方法、及び組成物の実施形態は、酵素反応の特異性を改善し、それによって、オフターゲット効果を低減することにより酵素分析が改善される。
例えば、特定の染色剤、又は一般的にはＤＮＡ結合分子が、周知のアフィニティータグを使用して、特定の標的にもたらされ得るように、この手法が適用され得る。これらのアフィニティータグは、望ましくない酵素活性を遮断するために、抗体複合体及びＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを含み得る。特定の種類のＤＮＡを特異的に遮断するが、他のものを遮断しないことによって、特定の酵素で見出される望ましくないオフターゲット効果を減少させ得る。代替的に、特定のアフィニティータグ（「ブロッカー」）を使用して、酵素を特定の標的にもたらし得る。そのような用途は、ＣＲＩＳＰＲ酵素などの広く使用されているタンパク質のオフターゲット活性を遮断することを含み得る。
本明細書で使用される場合、ＤＮＡ結合分子は、全てのＤＮＡに結合し得るが、例えば、ＤＮＡ結合分子のサイズ、電荷、又は疎水性を含む様々な因子によって決定されるアクセス可能性に起因して、特定のＤＮＡへの優先的なアクセスを有する分子を指す。その結果、特定のＤＮＡ種類が優先的に遮断される一方で、他のものは、配列決定ライブラリーを生成し得る酵素システムにアクセス可能である。したがって、いくつかの実施形態では、ＤＮＡへのディファレンシャルアクセスは、ＤＮＡが、酵素反応に向かう活性を低下させるように、ＤＮＡ結合分子との結合によって、特定の種類のＤＮＡにおいて可能である。例えば、ＤＮＡ染色剤は、核に入らないが、ｍｔＤＮＡに入り得、それによって、ｍｔＤＮＡを優先的に遮断する。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、核酸ライブラリーに関する。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、一次ＤＮＡ（核ＤＮＡなど）のためのトランスポザーゼアクセス可能なクロマチン配列決定（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）のためのアッセイから得られる配列決定リードを含むが、ｍｔＤＮＡなどのオフターゲット核酸（二次ＤＮＡ）からの配列決定リードを含まないか、又はその低減された量を含む。いくつかの実施形態では、二次ＤＮＡからの配列決定リードは、二次ＤＮＡに優先的に結合するＤＮＡ結合分子に起因して、排除、低減、又は阻害される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ＤＮＡ色素、アフィニティータグ、リガンド、酵素、ペプチド、又は生体分子を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ色素は、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、Ｓｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ、又はＱｕｂｉｔを含む。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、細胞の集団、単一細胞、細胞核の集団、又は単一細胞核から生成される。
本明細書で使用される場合、「核酸ライブラリー」は、様々な異なる形式において、合成的又は生合成的のいずれかで調製され得る核酸の意図的に作成された集合（例えば、可溶性分子のライブラリー、及び樹脂ビーズ、シリカチップ、又は他の固体支持体につながれたオリゴヌクレオチドのライブラリー）である。追加的に、用語「アレイ」は、本質的に任意の長さの核酸（例えば、長さ１～約１０００のヌクレオチドモノマー）を基質上にスポットすることによって調製され得る核酸のライブラリーを含むことを意味する。
アレイは、異なるマイクロフィーチャが、相対的な位置に従って互いから区別され得るように、表面と会合するか又は取り付けられるポリヌクレオチドを含むマイクロフィーチャなどの、異なるマイクロフィーチャの集団を指し得る。アレイの個々のフィーチャは、マイクロフィーチャの単一のコピー、又はアレイの個々のフィーチャにおけるマイクロフィーチャの集団として存在し得るマイクロフィーチャの複数のコピーを含み得る。各フィーチャにおけるマイクロフィーチャの集団は、典型的には均質であり、単一の種のマイクロフィーチャを有する。したがって、単一の核酸配列の複数のコピーは、例えば、同じ配列を有する複数の核酸分子上のフィーチャにおいて存在し得る。
いくつかの実施形態では、マイクロフィーチャの不均質集団は、フィーチャにおいて存在し得る。いくつかの実施形態では、フィーチャは、単一のマイクロフィーチャ種のみを含み得る。いくつかの実施形態では、フィーチャは、異なる配列を有する核酸の混合物などの、複数の異なるマイクロフィーチャ種を含み得る。アレイの隣接するフィーチャは、互いに不連続であり得る。フィーチャは、互いに隣接してもよいか、又は間隙によって分離されてもよい。フィーチャが、離間している実施形態では、隣接する部位は、例えば、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、１ｎｍ、０．５ｎｍ未満の距離、又は上記の距離のうちのいずれか２つの範囲内の任意の距離だけ分離され得る。アレイ上のフィーチャのレイアウトはまた、隣接するフィーチャ間の中心間距離の観点から理解され得る。本発明において有用なアレイは、約１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、１ｎｍ、０．５ｎｍ未満の中心間間隔、又は上記の距離のうちのいずれか２つの範囲内の任意の距離を有する隣接するフィーチャを有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される距離値は、アレイの隣接するフィーチャ間の平均距離を表し得る。したがって、例えば、距離が、アレイの全ての隣接するフィーチャ間の閾値距離を構成するという特定の記述によって、特に反対の指示がない限り、全ての隣接するフィーチャは、指定された範囲に収まる必要はない。実施形態は、様々な密度でフィーチャを有するアレイを含み得る。特定の実施形態の密度の例示的な範囲としては、約１０，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２～約２，０００，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２、約１００，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２～約１，０００，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２、約１００，０００フィーチャ／ｃｍ２～約１０，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２、約１，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２～約５，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２、約１０，０００フィーチャ／ｃｍ２～約１００，０００フィーチャ／ｃｍ２、約２０，０００フィーチャ／ｃｍ２～約５０，０００フィーチャ／ｃｍ２、約１，０００フィーチャ／ｃｍ２～約５，０００フィーチャ／ｃｍ２、又は上記の密度のうちのいずれか２つの範囲内の任意の密度が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「表面」は、試薬、ビーズ、又は分析物と接触するためにアクセス可能である基質又は支持構造体の一部を指し得る。表面は、実質的に平坦又は平面であり得る。代替的に、表面は丸みを帯びていてもよいか、又は輪郭付けされてもよい。表面に含まれ得る例示的な輪郭は、ウェル、くぼみ、柱、隆起部、チャネルなどである。基質又は支持構造体として使用され得る例示的な材料としては、変性又は機能化ガラスなどのガラス；アクリル、ポリスチレン若しくはスチレンと別の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、又はテフロン（登録商標）などのプラスチック；アガロース又はセファロースなどの多糖類又は架橋多糖類；ナイロン；ニトロセルロース；樹脂；シリカ又はケイ素及び変性ケイ素を含むシリカ系材料；炭素繊維；金属；無機ガラス；光ファイバ束、又は様々な他のポリマーが挙げられる。いくつかの異なる材料の単一材料又は混合物は、本発明において有用な表面を形成し得る。いくつかの実施形態では、表面はウェルを含む。
本明細書で使用される場合、「ビーズ」は、剛性又は半剛性材料から作製される小さな本体を指し得る。本体は、規則的又は不規則な寸法を有するかどうかにかかわらず、例えば、球、楕円、微小球、又は他の認識された粒子形状を特徴とする形状を有し得る。ビーズとして有用である例示的な材料としては、変性又は機能化ガラスなどのガラス；アクリル、ポリスチレン若しくはスチレンと別の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、又はテフロン（登録商標）などのプラスチック；アガロース又はセファロースなどの多糖類又は架橋多糖類；ナイロン；ニトロセルロース；樹脂；シリカ又はケイ素及び変性ケイ素を含むシリカ系材料；炭素繊維；金属；無機ガラス；光ファイバ束、又は様々な他のポリマーが挙げられる。例示的なビーズとしては、制御された細孔のガラスビーズ、常磁性ビーズ、トリアゾル、セファロースビーズ、ナノ結晶、及び当該技術分野において既知の他のビーズが挙げられる。ビーズは、生物学的又は非生物学的材料から作製され得る。磁気ビーズは、磁石を使用した磁気ビーズの操作の容易さに起因して特に有用である。特定の実施形態で使用されるビーズは、０．１μｍ～１００μｍの直径、幅、又は長さを有し得る。ビーズサイズは、フィーチャを分析するのに十分な信号を維持しながら、低減されたサイズを有する、したがって、増加した密度を有するように選択され得る。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、又はそれらの文法的等価物は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して少なくとも部分的に形成される複合体を形成する反応を指し得る。水素結合は、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基ペアリング、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、又は任意の他の配列特異的様式で発生し得る。複合体は、二重構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、又はこれらの任意の組み合わせを有し得る。鎖はまた、水素結合に加えて、架橋されるか、又はさもなければ力によって結合され得る。
本明細書で使用される場合、「伸長する」、「伸長」、又はそれらの任意の文法的等価物は、ポリメラーゼなどの伸長酵素によるプライマー、ポリヌクレオチド、又は他の核酸分子へのｄＮＴＰの付加を指し得る。例えば、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、得られる伸長プライマーは、核酸の配列情報を含む。いくつかの実施形態はＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ、又は逆転写酵素を使用して伸長を実施するものとして論じられているが、伸長は、当該技術分野において周知の任意の他の様式で実施され得る。例えば、伸長は、対象の鎖にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドなどの、オリゴヌクレオチドを一緒にライゲートすることによって実施され得る。
本明細書で使用される場合、「ライゲーション」又は「ライゲートする」、又はそれらの他の文法的等価物は、ホスホジエステル結合による２本のヌクレオチド鎖の結合を指し得る。ライゲーションは、化学的ライゲーションを含み得る。そのような反応は、リガーゼによって触媒作用が及ぼされ得る。リガーゼは、ＡＴＰ又は同様のトリホスフェートの加水分解によって、この反応に触媒作用を及ぼす酵素のクラスを指す。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、互換的に使用され得、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し得る。したがって、これらの用語は、一本鎖、二本鎖、又は多重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。ポリヌクレオチドの例としては、遺伝子又は遺伝子断片、全ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、エピゲノム、ゲノムＤＮＡ断片、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、核ＤＮＡ、リボソームＤＮＡ、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、レギュラトリーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＰＩＷＩインタラクティングＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及び長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）などのノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、短鎖ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）、短鎖核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、及びウイルスＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、プライマー、又は上記のうちのいずれかの増幅されたコピーが挙げられる。ポリヌクレオチドとしては、非天然塩基を有するヌクレオチドを含むメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチド、アザ又はデアザ－プリンなどの修飾天然塩基を有するヌクレオチドを挙げることができる。ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及びチミン（Ｔ）の特定の配列から構成され得る。ウラシル（Ｕ）もまた、例えば、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミンの天然置換として存在し得る。ウラシルは、ＤＮＡにも使用され得る。用語「核酸配列」は、天然及び非天然塩基を含む、ポリヌクレオチド又は任意の核酸分子のアルファベット表現を指し得る。追加的に、ＤＮＡは、非天然塩基対（複数可）（ＵＢＰ）を含有し得る。ＵＢＰは、実験室で作成され、自然界では発生しないＤＮＡの設計されたサブユニット（又は核酸塩基）である。
本明細書で使用される場合、一次核酸は、対象の核酸である。いくつかの実施形態では、一次核酸は核ＤＮＡである。一次核酸は、試料中で分析されることが望ましい任意の核酸であり得る。本明細書で使用される場合、二次核酸は、試料中に見られるが、対象の核酸ではない核酸であり、したがって、対象の核酸の分析関連において干渉である。いくつかの実施形態では、二次核酸は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）又は染色体外ＤＮＡである。二次核酸は、試料中に見られるが分析対象ではなく、対象の核酸をより効率的かつ正確に分析するために、分析から阻害、低減、又は排除することが望ましい任意の核酸であり得る。染色体外ＤＮＡは、細胞の核の外側に見られる任意のＤＮＡである。また、核外ＤＮＡ又は細胞質ＤＮＡとも称される。
核酸は、ホスホジエステル結合を含有し得、例えば、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ－メチルホスホロアミダイト、並びにペプチド核酸の骨格及び連結を含む他の種類の骨格を含み得る。核酸は、デオキシリボ及びリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンタニン、ヒポキサンタニン、イソシトシン、イソグアニン、及びニトロピロール（３－ニトロピロールを含む）並びにニトロインドール（５－ニトロインドールを含む）などの塩基類似体を含む塩基の任意の組み合わせを含有し得る。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも１つの無差別塩基を含み得る。無差別塩基は、２つ以上の異なる種類の塩基を有する塩基対であり得、例えば、ゲノムＤＮＡ試料などの複雑な核酸試料中のランダムハイブリダイゼーションのために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー又はインサートに含まれる場合、有用であり得る。無差別塩基の例としては、アデニン、チミン、又はシトシンと対になり得るイノシンが挙げられる。他の例としては、ヒポキサンチン、５－ニトロインドール、非環式５－ニトロインドール、４－ニトロピラゾール、４－ニトロイミダゾール、及び３－ニトロピロールが挙げられる。少なくとも２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の種類の塩基と、塩基対を形成し得る無差別塩基が使用され得る。
トランスポザーゼアクセス可能なクロマチンを使用する配列決定（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）のためのアッセイは、統合的エピゲノム分析の迅速かつ敏感な方法を指す。ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、オープンクロマチン部位を捕捉し、オープンクロマチン、ＤＮＡ結合タンパク質、個々のヌクレオソームのゲノム位置間の相互作用、及びヌクレオチド分解能を有するレギュラトリー領域におけるより高次のコンパクションを明らかにする。ヌクレオソームを厳密に回避する、許容し得る、又はそれと重複する傾向があるＤＮＡ結合因子のクラスが見出されている。ＡＴＡＣ－ｓｅｑを使用して、安静時のヒトＴ細胞の連続的な毎日のエピゲノムが測定され、標準的な採血を介してプロバンドから評価され、健康及び疾患を監視するための臨床的時間スケールにおける個人的エピゲノムの読み取りの実現可能性を実証した。より具体的には、ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、単一細胞からのクロマチンを挿入酵素複合体で処理して、ゲノムＤＮＡのタグ付き断片を生成することによって実施され得る。この工程では、クロマチンは、クロマチン内のオープン領域内のゲノムＤＮＡを切断し、断片の両端にアダプターを付加するＴｎ５又はＭｕＡなどの挿入酵素を使用して、タグメンテーションされる（例えば、同じ反応で断片化及びタグ付けされる）。いくつかの実施形態では、この適用は、全ゲノム配列決定又はエピゲノムプロファイリングである。
全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）は、次世代配列決定による全ゲノム配列決定のための、１０×、２０×、及び４０×フォーマットなどの多くの倍数によってゲノムを読み取る方法を指す。標的化配列決定は、試料中の選択されたＤＮＡ遺伝子座又は遺伝子のＤＮＡ配列を決定する、例えば、選択された群の癌関連遺伝子を配列決定する方法又はアッセイを指す。
場合によっては、条件は、クロマチン内の望ましい挿入レベル（例えば、オープン領域内で、平均して５０～２００塩基対毎に発生する挿入）を得るように調整され得る。本方法で使用されるクロマチンは、任意の好適な方法によって作製され得る。いくつかの実施形態では、核は単離、溶解され得、クロマチンは、例えば、核エンベロープから更に精製され得る。他の実施形態では、クロマチンは、単離された核を反応緩衝剤と接触させることによって単離され得る。これらの実施形態では、単離された核は、反応緩衝剤（挿入酵素複合体及び他の必要な試薬を含む）と接触すると溶解し得、これにより挿入酵素複合体がクロマチンにアクセスすることが可能になる。これらの実施形態では、本方法は、細胞の集団から核を単離することと、単離された核をトランスポザーゼ及びアダプターと組み合わせることと、を含み得、組み合わせることによって、核を溶解して当該クロマチンを放出すること、及びゲノムＤＮＡのアダプタータグ付き断片を生成することの両方がもたらされる。クロマチンは、他の方法（例えば、ＣｈＩＰ－ＳＥＱ法）にあるような架橋を必要としない。いくつかの実施形態では、酵素反応は、細胞から直接発生する。
クロマチンが断片化され、タグ付けされて、ゲノムＤＮＡのタグ付き断片を生成した後、アダプタータグ付き断片の少なくとも一部が配列決定されて、複数の配列リードを生成する。断片は、任意の好適な方法を使用して配列決定され得る。例えば、断片は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの可逆的ターミネーター法、Ｒｏｃｈｅのピロ配列決定法（４５４）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのライゲーションによる配列決定（ＳＯＬｉＤプラットフォーム）、又はＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォームを使用して配列決定され得る。そのような方法の例は、以下の参考文献：Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ２００５ ４３７：）３７６－８０）；Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６ ２４２：８４－９）；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００５ ３０９：１７２８－３２）；Ｉｍｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００９ １０：６０９－１８）；Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５５３：７９－１０８）；Ａｐｐｌｅｂｙ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５１３：１９－３９）、及びＭｏｒｏｚｏｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８ ９２：２５５－６４）に記載されており、これらは、全ての出発生成物、ライブラリー調製のための方法、試薬、及び工程の各々での最終生成物を含む、方法及び方法の特定の工程の一般的な説明について、参照により本明細書に組み込まれる。明らかなように、選択された次世代配列決定プラットフォームと互換性のある順方向及び逆方向配列決定プライマー部位が、増幅工程中に断片の末端に付加され得る。特定の実施形態では、断片は、断片に付加されたタグにハイブリダイズするＰＣＲプライマーを使用して増幅され得、ＰＣＲに使用されるプライマーは、特定の配列決定プラットフォームと互換性のある５’尾部を有する。ＡＴＡＣ－ｓｅｑを実施する方法は、国際出願第ＵＳ２０１４／０３８８２５号に記載されており、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、用語「クロマチン」は、真核細胞の核中に見られるような、タンパク質及びポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む分子の複合体を指す。クロマチンは、ヌクレオソーム、ゲノムＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡに一般に結合される他のＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）を形成するヒストンタンパク質の一部で構成される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、対象の標的核酸を更に分析することを更に含む。分析としては、例えば、ＤＮＡ分析、ＲＮＡ分析、タンパク質分析、タグメンテーション、核酸増幅、核酸配列決定、核酸ライブラリー調製、連続維持転位（ＣＰＴ－ｓｅｑ）、単一細胞コンビナトリアルインデックス配列決定（ＳＣＩ－ｓｅｑ）、又は単一細胞ゲノム増幅、単一細胞からの又は細胞の集団からの全ゲノム配列決定、エピゲノミクス、又はこれらの任意の組み合わせを挙げることができる。
ＤＮＡ分析は、ＤＮＡを増幅、配列決定、又はさもなければ分析するために使用される任意の技術を指す。ＤＮＡ増幅は、ＰＣＲ技術を使用して達成され得る。ＤＮＡ分析はまた、非標的化、非ＰＣＲベースのＤＮＡ配列決定（例えば、メタゲノミクス）技術も含み得る。非限定的な例として、ＤＮＡ分析としては、１６Ｓ ｒＤＮＡ（リボソームＤＮＡ）のハイパー可変領域を配列決定すること、及びＤＮＡを介した種識別のための配列決定を使用することを挙げることができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、精製されたＤＮＡを含み得る。
ＲＮＡ分析は、ＲＮＡを増幅、配列決定、又はさもなければ分析するために使用される任意の技術を指す。ＤＮＡを分析するために使用される同じ技術を使用して、ＲＮＡを増幅及び配列決定し得る。ＤＮＡよりも安定でないＲＮＡは、刺激に応じたＤＮＡの翻訳である。したがって、ＲＮＡ分析は、コミュニティの代謝的に活性なメンバーのより正確な写真を提供し得、試料中の生物のコミュニティ機能に関する情報を提供するために使用され得る。核酸配列決定は、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸分子の配列中のヌクレオチドの順序を決定するための配列決定の使用を指す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分析はまた、増幅を必要としないか、又は使用しない方法も含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「配列決定」は、ポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの同一性（例えば、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、又は少なくとも２００個以上の連続ヌクレオチドの同一性）が得られる方法を指す。
用語「次世代配列決定」又は「ハイスループット配列決定」又は「ＮＧＳ」は、一般に、ハイスループット配列決定技術を指し、超並列シグネチャ配列決定、ハイスループット配列決定、ライゲーションによる配列決定（例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定）、プロトンイオン半導体配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、単一分子配列決定、及びナノ細孔配列決定が挙げられるが、これらに限定されず、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、又はＲｏｃｈｅなどによって現在用いられている、合成による並列化された配列決定プラットフォーム又はライゲーションによる配列決定プラットフォームを指し得る。次世代配列決定方法はまた、ナノ細孔配列決定法、又はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商業化されたＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術、若しくはＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ及び／若しくはＢＧＩ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓによって商業化された単一分子蛍光ベース法などの電子検出ベース法を挙げることができる。
例示的な配列決定技術としては、標的化配列決定、単分子リアルタイム配列決定、電子顕微鏡ベースの配列決定、トランジスタ媒介配列決定、直接配列決定、ランダムショットガン配列決定、サンガージデオキシターミネーション配列決定、標的化配列決定、エクソン配列決定、全ゲノム配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定（例えば、マイクロアレイなどのアレイ）、パイロ配列決定、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動、デュプレックス配列決定、サイクル配列決定、単一塩基伸長配列決定、固相配列決定、ハイスループット配列決定、超並列ショットガン配列決定、エマルジョンＰＣＲ、低修飾温度での共増幅ＰＣＲ（ＣＯＬＤ－ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲ、可逆的色素ターミネーターによる配列決定、ペアエンド配列決定、短期配列決定、エキソヌクレアーゼ配列決定、ライゲーションによる配列決定、短リード配列決定、単一分子配列決定、合成による配列決定、リアルタイム配列決定、可逆的ターミネーター配列決定、イオン半導体配列決定、ナノボール配列決定、ナノ細孔配列決定、４５４配列決定、Ｓｏｌｅｘａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ配列決定、ｍｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＭｉｎＩＯＮ（商標）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、リアルタイムＳＭＲＴ（商標）技術（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐｒｏｂｅ－Ａｎｃｈｏｒ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ｃＰＡＬ（商標））（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ／ＢＧＩ）、ＳＯＬｉＤ（登録商標）配列決定、ＭＳ－ＰＥＴ配列決定、質量分析、及びこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、配列決定は、測定器を使用して、配列決定生成物を検出することを含み、測定器としては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０、３１００、３１００－Ａｖａｎｔ、３７３０、又は３７３ＯｘＩ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ、又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＯＬｉＤ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（全て、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ２０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、又は質量分析計が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、配列決定は、エマルジョンＰＣＲを含む。特定の実施形態では、配列決定は、ハイスループット配列決定技術を含む。特定の実施形態では、配列決定は、全ゲノム配列決定を含む。特定の実施形態では、配列決定は、超並列配列決定（例えば、超並列ショットガン配列決定）を含む。代替の実施形態では、配列決定は、標的化配列決定を含む。
タンパク質分析は、タンパク質の研究を指し、プロテオミクス分析、対象のタンパク質の翻訳後修飾の決定、タンパク質発現レベルの決定、又は他のタンパク質を有する若しくは核酸を有することを含む他の分子とのタンパク質相互作用の決定を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「タグメンテーション」は、トランスポゾン末端配列を含むアダプターと複合体化されたトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体によるＤＮＡの修飾を指す。タグメンテーションは、ＤＮＡの同時断片化及び二重断片の両方の鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションをもたらす。トランスポザーゼ酵素を除去する精製工程に続いて、追加の配列が、例えば、ＰＣＲ、ライゲーション、又は当業者に既知の任意の他の好適な手順によって、適合された断片の末端に付加され得る。
連続維持転位配列決定（ＣＰＴ－ｓｅｑ）は、標的核酸に隣接するテンプレート核酸断片の会合を維持するために、トランスポザーゼの使用による連続情報を維持しながらの配列決定の方法を指す。例えば、ＣＰＴは、ＤＮＡ上などの核酸上で実施され得る。ＣＰＴ核酸は、独自のインデックス又はバーコードを有する相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって捕捉され、固体支持体上に固定化され得る。いくつかの実施形態では、固体支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドは、バーコードに加えて、プライマーバインダー部位、独自の分子インデックスを更に含み得る。有利なことには、断片化された核酸の物理的近接性を維持するためのトランスポソームのそのような使用は、同じ元の分子、例えば、染色体からの断片化された核酸が、固体支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドから同じ独自のバーコード及びインデックス情報を受け取る可能性を高める。これは、独自のバーコードを有する連続して連結された配列決定ライブラリーをもたらす。連続して連結された配列決定ライブラリーを配列決定して、連続配列情報を導き出すことができる。
本明細書で使用される場合、用語「連続情報」は、共有情報に基づく２つ以上のＤＮＡ断片間の空間的関係を指す。情報の共有された態様は、隣接する、区画的、距離空間関係に関し得る。ｔｕｍにおけるこれらの関係に関する情報は、ＤＮＡ断片に由来する配列リードの階層的アセンブリ又はマッピングを容易にする。この連続情報は、そのようなアセンブリ又はマッピングの効率及び精度を改善させる。なぜなら、従来のショットガンの配列決定に関連付けられて使用される従来のアセンブリ又はマッピング方法は、個々の配列リードが由来する２つ以上のＤＮＡ断片間の空間的関係に関連するので、個々の配列リードの相対的なゲノム起源又は座標を考慮しないためである。
したがって、本明細書に記載される実施形態によれば、連続情報を捕捉する方法は、隣接する空間的関係を決定するための短距離連続法、区画的空間関係を決定するための中間範囲連続法、又は距離空間関係を決定するための長距離連続法によって達成され得る。これらの方法は、ＤＮＡ配列アセンブリ又はマッピングの精度及び品質を促進し、本明細書に記載されるものなどの任意の配列決定法とともに使用され得る。
連続情報は、個々の配列リードが由来する２つ以上のＤＮＡ断片間の空間的関係に関連するので、個々の配列リードの相対的なゲノム起源又は座標を含む。いくつかの実施形態では、連続情報は、非重複配列リードからの配列情報を含む。
いくつかの実施形態では、標的核酸配列の連続情報は、ハプロタイプ情報を示す。いくつかの実施形態では、標的核酸配列の連続情報は、ゲノム変異体を示す。
単一細胞コンビナトリアルインデックス配列決定（ＳＣＩ－ｓｅｑ）は、例えば、全ゲノム、メチル化、ＲＮＡ、同時ＤＮＡ及びＲＮＡ、若しくはＨｉ－Ｃ、若しくはライブラリーの他の分析、又はこれらの任意の組み合わせを含む、様々な分析のために数千の単一細胞ライブラリーを同時に生成するための配列決定技術である。
転位反応は、１つ以上のトランスポゾンが、ランダムな部位又はほぼランダムな部位で標的核酸に挿入される反応である。転位反応の構成要素としては、トランスポザーゼ（又はインテグラーゼなどの、本明細書に記載される核酸を断片化及びタグ付けすることができる他の酵素）、及びトランスポザーゼ（又は本明細書に記載されるような他の酵素）に結合する二本鎖トランスポゾン末端配列を含むトランスポゾン要素、及び２つのトランスポゾン末端配列のうちの１つに取り付けられたアダプター配列が挙げられる。二本鎖トランスポゾン末端配列の１つの鎖は、標的核酸の１つの鎖に転写され、相補的なトランスポゾン末端配列鎖は（非転写トランスポゾン配列）ではない。アダプター配列は、必要に応じて又は所望に応じて、１つ以上の機能的配列又は構成要素（例えば、プライマー配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサー領域、又はインデックスタグ配列）を含み得る。
トランスポゾンベース技術は、例えば、ＮＥＸＴＥＲＡ（商標）ＸＴ及びＦＬＥＸ ＤＮＡ試料調整キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）のワークフローに例示されているように、ＤＮＡを断片化するために利用され得、ゲノムＤＮＡなどの標的核酸は、標的の断片化及びタグ付け（タグメンテーション）を同時に行うトランスポソーム複合体で処理され、それによって、断片の末端に独自のアダプター配列でタグ付けされた断片化された核酸分子の集団を作成する。
本明細書で使用される場合、挿入酵素複合体は、ポリヌクレオチドと組み合わされて、断片化し、ポリヌクレオチドにアダプターを付加する挿入酵素及び２つのアダプター分子（「トランスポゾンタグ」）を含む複合体を指す。したがって、挿入酵素複合体は、「トランスポソーム複合体」であり得、少なくとも１つのトランスポザーゼ（又は本明細書に記載されるような他の酵素）及びトランスポゾン認識配列から構成される。いくつかのそのようなシステムでは、トランスポザーゼは、トランスポゾン認識配列に結合して、転位反応に触媒作用を及ぼすことができる機能的複合体を形成する。いくつかの態様では、トランスポゾン認識配列は、二本鎖トランスポゾン末端配列である。トランスポザーゼは、標的核酸内のトランスポザーゼ認識部位に結合し、トランスポザーゼ認識配列を標的核酸内に挿入する。いくつかのそのような挿入事象では、トランスポゾン認識配列（又は末端配列）の１本の鎖が標的核酸に転写され、切断事象がもたらされる。本開示のトランスポザーゼとともに使用するために容易に適合され得る例示的な転位手順及びシステムは、例えば、国際公開第１０／０４８６０５号、米国特許公開第２０１２／０３０１９２５号、米国特許公開第２０１２／１３４７００８７号、又は米国特許公開第２０１３／０１４３７７４号に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供される特定の実施形態とともに使用され得る例示的なトランスポザーゼとしては、以下のものが挙げられる（又は以下のものによってコード化される）：Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９，２６６，７２９－７３４を参照）、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼ、Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ（Ａｇｉｌｅｎｔにより特徴付けられ、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＱＸＴ生成物で使用されるトランスポザーゼ）、ＭｕＡトランスポザーゼ、並びにＲ１及びＲ２末端配列を含むＭｕトランスポザーゼ認識部位（Ｍｉｚｕｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｃｅｌｌ，３５：７８５，１９８３；Ｓａｖｉｌａｈｔｉ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４８９３，１９９５）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｔｎ５５２（Ｃｏｌｅｏｏ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：２３８４－８，２００１；Ｋｉｒｂｙ，Ｃ．ｅｔ Ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１７３－８６，２００２）、Ｔｙ１（Ｄｅｖｉｎｅ ＆ Ｂｏｅｋｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：３７６５－７２，１９９４、及び国際公開第９５／２３８７５号）、Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｔｎ７（Ｃｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：１５１２，１９９６；Ｃｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：２７－４８，１９９６）、Ｔｎ／Ｏ、及びＩＳ１０（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：４９－８２，１９９６）、Ｍａｒｉｎｅｒトランスポザーゼ（Ｌａｍｐｅ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５：５４７０－９，１９９６）、Ｔｃ１（Ｐｌａｓｔｅｒｋ，Ｒ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：１２５－４３，１９９６）、Ｐ Ｅｌｅｍｅｎｔ（Ｇｌｏｏｒ，Ｇ．Ｂ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６０：９７－１１４，２００４）、Ｔｎ３（Ｉｃｈｉｋａｗａ ＆ Ｏｈｔｓｕｂｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１８８２９－３２，１９９０）、細菌挿入配列（Ｏｈｔｓｕｂｏ ＆ Ｓｅｋｉｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：１－２６，１９９６）、レトロウイルス（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：２５２５－９，１９８９）、並びに酵母のレトロトランスポゾン（Ｂｏｅｋｅ ＆ Ｃｏｒｃｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：４０３－３４，１９８９）。更なる例としては、ＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１、及びトランスポザーゼファミリー酵素の遺伝子操作型（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００９）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．５：ｅ１０００６８９．Ｅｐｕｂ Ｏｃｔ．１６；Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７１：３３２－５）が挙げられ、トランスポザーゼに関して本明細書に引用される参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される方法はまた、トランスポザーゼの組み合わせも含み得、単一のトランスポザーゼのみではない。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５、ＭｕＡ、又はＶｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉトランスポザーゼ、又はこれらの活性変異体である。他の実施形態では、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼ又はその活性変異体である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、過活性Ｔｎ５トランスポザーゼ（例えば、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆら、国際公開第２００１／００９３６３号、米国特許第５，９２５，５４５号、同第５，９６５，４４３号、同第７，０８３，９８０号、及び同第７，６０８，４３４号、並びにＧｏｒｙｓｈｉｎ ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７３６７，１９９８）、又はその活性変異体である。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、国際公開第２０１５／１６０８９５号に記載されているようなＴｎ５トランスポザーゼであり、それは、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼ融合タンパク質は、融合伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）タグを含む。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型配列に対するアミノ酸５４、５６、及び３７２における変異を含む、過活性Ｔｎ５トランスポザーゼである。いくつかの実施形態では、過活性Ｔｎ５トランスポザーゼは、融合タンパク質であり、任意選択的に、融合タンパク質は、伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）である。いくつかの実施形態では、認識部位は、Ｔｎ５型のトランスポザーゼ認識部位である（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ ａｎｄ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：７３６７，１９９８）。一実施形態では、過活性Ｔｎ５トランスポザーゼ（例えば、ＥＺ－Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）と複合体を形成するトランスポザーゼ認識部位が使用される。いくつかの実施形態では、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼである。
本明細書に記載される方法、組成物、又はシステムの実施形態のうちのいずれかでは、トランスポゾンは、トランスポゾン末端配列を含む。いくつかの実施形態では、トランスポゾン末端配列は、モザイク末端（ＭＥ）配列である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡはタグメンテーションを使用してタグ付けされ、ＤＮＡはタグでタグ付けされ、タグに含まれるものは、ＭＥ配列などのトランスポゾン特異的配列である。したがって、ＤＮＡは、トランスポゾン特異的配列に基づいて、試料中のＲＮＡから区別される。
本明細書に記載される方法、組成物、又はシステムの実施形態のうちのいずれかでは、トランスポゾンは、アダプター配列を含む。アダプター配列は、プライマー配列、アンカー配列、ユニバーサル配列、スペーサー領域、インデックス配列、キャプチャ配列、バーコード配列、切断配列、配列決定関連配列、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の機能的配列又は構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、アダプター配列は、プライマー配列を含む。他の実施形態では、アダプター配列は、プライマー配列及びインデックス又はバーコード配列を含む。プライマー配列はまた、ユニバーサル配列であり得る。本開示は、使用され得るアダプター配列の種類に限定されず、当業者であれば、ライブラリー調製及び次世代配列決定に使用し得る追加の配列を認識する。ユニバーサル配列は、２つ以上の核酸断片に共通であるヌクレオチド配列の領域である。任意選択的に、２つ以上の核酸断片はまた、配列の違いの領域も有する。複数の核酸断片の異なるメンバーに存在し得るユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的である単一のユニバーサルプライマーを使用して、複数の異なる配列の複製又は増幅を可能にし得る。
アダプターとしては、一本鎖核酸などの核酸が挙げられる。アダプターとしては、約５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド未満、それらを超える、若しくはそれらに等しい、又は上記のサイズのうちのいずれか２つの間の範囲の長さを有する短い核酸を挙げることができる。
実施形態のうちのいずれかでは、Ａ１４－ＭＥ、ＭＥ、Ｂ１５－ＭＥ、ＭＥ’、Ａ１４、Ｂ１５、及びＭＥを含むアダプター配列又はトランスポゾン末端配列が、以下に提供される。
Ａ１４－ＭＥ：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号１）
Ｂ１５－ＭＥ：５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号２）
ＭＥ’：５’－ｐｈｏｓ－ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ－３’（配列番号３）
Ａ１４：５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ－３’（配列番号４）
Ｂ１５：５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ－３’（配列番号５）
ＭＥ：ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号６）
いくつかの実施形態では、プライマー配列は、配列決定用ライブラリーを調製するために含まれる。いくつかの実施形態では、プライマー配列は、Ｐ５プライマー配列又はＰ７プライマー配列である。Ｐ５及びＰ７プライマーは、様々なＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上で配列決定するために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．によって販売されている市販のフローセルの表面上で使用される。プライマー配列は、米国特許公開第２０１１／００５９８６５（Ａ１）号に記載されており、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。５’末端でアルキン末端であり得るＰ５及びＰ７プライマーの例としては、以下のものが挙げられる：
Ｐ５：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡＣ（配列番号７）
Ｐ７：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧ＊ＡＴ（配列番号８）
及びこれらの誘導体又は類似体。いくつかの例では、Ｐ７配列は、Ｇ＊位における修飾グアニン、例えば、８－オキソ－グアニンを含む。他の例では、＊は、Ｇ＊と隣接する３’Ａとの間の結合が、ホスホロチオエート結合であることを示す。いくつかの例では、Ｐ５及び／又はＰ７プライマーは、非天然リンカーを含む。任意選択的に、Ｐ５及びＰ７プライマーの一方又は両方は、ポリＴ尾部を含み得る。ポリＴ尾部は、一般に、上記の配列の５’末端、例えば、５’塩基と末端アルキン単位との間に位置するが、場合によっては、３’末端に位置し得る。ポリＴ配列は、任意の数のＴヌクレオチド、例えば２～２０個を含み得る。Ｐ５及びＰ７プライマーは、例として与えられるが、本明細書に提示される例では、任意の好適なプライマーが使用され得ることを理解されたい。Ｐ５及びＰ７プライマー配列を含むプライマー配列を有するインデックス配列は、配列決定用ライブラリーを活性化するために、Ｐ５及びＰ７を付加するのに役立つ。
核酸結合分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸に優先的に結合する分子である。ＤＮＡ結合分子などの核酸結合分子は、他の種類の核酸に結合することなく、特定の種類の核酸に特異的であり得る。例えば、ＤＮＡ結合分子は、ｍｔＤＮＡに優先的に結合し得るが、核ＤＮＡなどの他の核酸に結合しないか、又はより少ない程度で結合する。核酸結合分子の例としては、色素若しくは染色剤、タンパク質、酵素、生体分子、アフィニティータグ、粒子、蛍光ラベル、ペプチド、リガンド、又は核酸に特異的に結合することができる他の分子が挙げられる。したがって、いくつかの例では、核酸結合分子は、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、シアニン色素（例えば、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲゴールドなどのＳＹＢＲ色素、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、Ｓａｆｅグリーンを含む）、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、又はＳｙｔｏｘ色素（例えば、Ｓｙｔｏｘグリーン又はＳｙｔｏｘオレンジを含む）である。他の核酸結合分子としては、例えば、７－ＡＡＤ（７－アミノ－アクチノマイシンＤ）、アクリジンオレンジ、アクリジンレッド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６１０ Ｒ－フィコエリスリンストレプトアビジンｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７ Ｒ－フィコエリスリンストレプトアビジンｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＢＯＢＯ－３－ＤＮＡ、ＢＯＢＯ－３、Ｂｏｄｉｐｙ６５０／６６５－Ｘ、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５、ＤＤＡＯ、Ｄｒａｑ５、臭化エチジウム、エチジウムモノアジド、エチジウムホモダイマー、エチジウムホモダイマー－１（ＥｔｈＤ－１）、エチジウムホモダイマー－１－ＤＮＡ、エチジウムホモダイマー－２、ＬＤＳ７５１、ＬＤＳ７５１（ＤＮＡ）、ＬＯＬＯ－１、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒレッド、Ｎｉｌｅブルー－ＥｔＯＨ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ｄｓＤＮＡ、定量試薬、ＰＯＰＯ－１－ＤＮＡ、ＰＯ－ＰＲＯ－１－ＤＮＡ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ヨウ化プロピジウム－ＤＮＡ、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ、ＳＹＴＯ６０、ＳＹＴＯ６１、ＳＹＴＯ６２、ＳＹＴＯ６３、ＳＹＴＯ６４、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＴＯ－ＰＲＯ－１－ＤＮＡ、ＴＯ－ＰＲＯ－３、ＴＯ－ＰＲＯ－５、ＴＯＴＯ－１－ＤＮＡ、ＴＯＴＯ－３、ＹＯ－ＰＲＯ－１－ＤＮＡ、ＹＯ－ＰＲＯ－３、ＹＯＹＯ－１、ＹＯＹＯ－１－ＤＮＡ、及びＹＯＹＯ－３を挙げることができる。これらの核酸結合分子は、使用され得る例示的な分子であり、当業者は、対象の標的核酸とオフターゲット核酸とを区別する任意の核酸結合分子が使用され得ることを認識する。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、核酸を配列決定する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、核酸を含む試料を用意することと、試料をＤＮＡ結合分子と接触させることと、試料を挿入酵素複合体と接触させて、タグ付き核酸断片を生成することと、タグ付き核酸断片を配列決定して、配列リードを生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、試料は、細胞の集団、単一細胞、細胞核の集団、又は単一細胞核である。いくつかの実施形態では、試料は、ｍｔＤＮＡ及び核ＤＮＡを含み、ＤＮＡ結合分子は、ｍｔＤＮＡに結合するが核ＤＮＡには結合しない。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ＤＮＡ色素、アフィニティータグ、リガンド、酵素、ペプチド、又は生体分子を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ色素は、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、Ｓｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ、又はＱｕｂｉｔを含む。いくつかの実施形態では、挿入酵素複合体は、トランスポザーゼを含むトランスポソームである。いくつかの実施形態では、配列決定は、ＡＴＡＣ－ｓｅｑにより実施される。いくつかの実施形態では、ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、バルクＡＴＡＣ－ｓｅｑ又は単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ｍｔＤＮＡ配列決定リードを阻害、低減、又は排除する。いくつかの実施形態では、核酸結合分子は、特定のＤＮＡ配列（複数可）に優先的に結合する。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、ｍｔＤＮＡ配列決定リードを阻害、低減、又は排除する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、ｍｔＤＮＡ及び対象の核酸を含む試料を用意することと、試料を、ｍｔＤＮＡなどの二次ＤＮＡに優先的に結合するＤＮＡ結合分子と接触させることと、ＤＮＡ転位をオープンクロマチン上で実施することと、を含み、ｍｔＤＮＡなどの二次ＤＮＡは、転位されない。いくつかの実施形態では、試料は、細胞の集団、単一細胞、細胞核の集団、又は単一細胞核である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ＤＮＡ色素、アフィニティータグ、リガンド、酵素、ペプチド、又は生体分子を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ色素は、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、Ｓｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ、又はＱｕｂｉｔを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ転位は、ＡＴＡＣ－ｓｅｑを使用して実施される。いくつかの実施形態では、ＡＴＡＣ－ｓｅｑは、バルクＡＴＡＣ－ｓｅｑ又は単一の細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑを含む。いくつかの実施形態では、試料をＤＮＡ結合分子と接触させることによって、ｍｔＤＮＡへの転位が遮断される。いくつかの実施形態では、対象の核酸は、核ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、核ＤＮＡを配列決定することを更に含む。
本明細書で使用される場合、試料は、対象の分析物を有する任意の試料を含む。試料は、例えば、全血、血清、間質液、リンパ液、脳脊髄液、痰、尿、便、乳、汗、涙、臍帯、末梢血、骨髄、細胞、又は固体組織を含む、対象の分析物を有する生体試料などの、生体試料であり得る。いくつかの実施形態では、試料は、細胞の集団、細胞、細胞核の集団、又は細胞核である。試料は、被験物から得られてもよく、被験物からの１つ以上の対象の分析物を分析することが望ましい。本明細書で使用される場合、「被験物」とは、処理、観察、又は実験の対象である動物を指す。「動物」としては、魚、甲殻類、爬虫類、及び特に哺乳動物などの冷血並びに温血脊椎動物及び無脊椎動物が挙げられる。「哺乳動物」としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、サル、チンパンジー、及び類人猿、並びに特にヒトなどの霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。
試料は、環境源から得られた流体又は検体であり得る。例えば、環境源から得られる流体又は検体は、食品（food products）、食品（food produce）、家禽、肉、魚、飲料、乳製品、水（排水を含む）、池、川、貯水池、スイミングプール、土壌、食品加工及び／又は包装工場、農場、ハイドロカルチャー（水耕栽培の食品ファームを含む）、医薬製造工場、動物コロニー施設、又はこれらの任意の組み合わせから得られ得るか、又はこれらに由来し得る。いくつかの実施形態では、試料は、細胞培養物又は微生物コロニーから収集されるか、又はそれに由来する流体又は検体である。
本明細書で使用される場合、「分析物」、「標的分析物」、「対象の分析物」は、互換的に使用され、本明細書に開示される方法及びシステムにおいて測定される分析物を指す。いくつかの実施形態では、分析物は、生体分子であり得る。生体分子の非限定的な例としては、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、タンパク質、脂質、及び炭水化物などの巨大分子が挙げられる。特定の事例では、分析物は、ホルモン、抗体、増殖因子、サイトカイン、酵素、受容体（例えば、神経、ホルモン、栄養素、及び細胞表面受容体）、又はそれらのリガンド、癌マーカー（例えば、ＰＳＡ、ＴＮＦ－アルファ）、心筋梗塞のマーカー（例えば、トロポニン、クレアチンキナーゼなど）、毒素、薬物（例えば、常用薬物）、代謝剤（例えば、ビタミンを含む）などであり得る。タンパク質分析物の非限定的な実施形態としては、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質断片、タンパク質複合体、融合タンパク質、組み換えタンパク質、リンタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、オリゴヌクレオチドでタグ付けされたタンパク質などが挙げられる。標的分析物は、核ＤＮＡなどの核酸であり得る。
逆に、オフターゲット分析物は、通常は酵素反応を使用して分析されるが、対象の分析物及びオフターゲット分析物の両方が分析され、よれによって、結果の精度及び信頼性が低下するような、対象の標的分析物ではない分析物である。オフターゲット分析物は、分析しないことが好ましい分析物である。したがって、本明細書で提供される実施形態は、オフターゲット分析物分析を排除、低減、又は阻害する方法及び組成物に関する。
標的核酸は、試料中の核酸の平均サイズが、約２ｋｂ、１ｋｂ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ未満、それらを超える、若しくはそれらに等しい、又は上記のサイズのうちのいずれか２つの間の範囲である試料を含み得る。いくつかの実施形態では、試料中の核酸の平均サイズは、約２０００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、５０ヌクレオチド未満、それらを超える、若しくはそれらに等しい、又は上記のサイズのうちのいずれか２つの間の範囲である。
本明細書で使用される場合、用語「試薬」は、試料と反応する、試料と相互作用する、試料を希釈する、又は試料に添加するのに有用な薬剤又は２種以上の薬剤の混合物を記載し、溶解、核酸分析、核酸増幅反応、タンパク質分析、タグメンテーション反応、ＡＴＡＣ－ｓｅｑ、ＣＰＴ－ｓｅｑ、若しくはＳＣＩ－ｓｅｑ反応、又は他のアッセイ用の薬剤を含む、本明細書に記載されるアッセイで使用される薬剤を含み得る。したがって、試薬としては、例えば、緩衝剤、化学物質、酵素、ポリメラーゼ、５０塩基対未満のサイズを有するプライマー、テンプレート核酸、ヌクレオチド、ラベル、色素、又はヌクレアーゼを挙げることができる。いくつかの実施形態では、試薬としては、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５及びＰ７アダプター配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチドトリホスフェート、緩衝剤、又は二価カチオンが挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「単離される」、「単離する」、「単離」、「精製される」、「精製する」、「精製」、及びこれらの文法的等価物は、本明細書で使用される場合、特に指定しない限り、試料から、又は材料が単離される源（例えば、細胞）からの少なくとも１つの汚染物質（例えば、タンパク質及び／又は核酸配列など）の量の低減を指す。したがって、精製は、「濃縮」、例えば、試料中の所望のタンパク質及び／又は核酸配列の量の増加をもたらす。
本明細書に記載される方法及び組成物の利点としては、例えば、オープンクロマチン配列決定（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）によって対象のＤＮＡを特異的に標的とすること、分析からの望ましくないミトコンドリア配列決定リードを低減、阻害、又は排除すること、望ましくない標的を分離する必要性を低減又は排除して、分離方法への負担を少なくすること、及び望ましくない情報が収集及び分析されないためのコストの低減を挙げることができる。
この方法はまた、酵素の反応性及び選択性を制御することによって組み合わされ得る。本明細書に記載される組成物及び方法は、特定の標的を遮断することによって、酵素の活性及び特異性を制御する。当業者には理解されるように、同様の原理は、ＤＮＡ、タンパク質、ＲＮＡ、若しくは対象の任意の分析物、又は分析物の組み合わせに関するアッセイにも適用され得る。
本明細書で提供されるシステム及び方法の実施形態は、液滴内の試料を単離する際に使用するための液滴パーティショニングシステムとともに使用され得る。本明細書で使用される場合、用語「パーティショニング」又は「パーティションされる」は、試料を複数の部分又は「パーティション」に分離することを指す。パーティションは、固体又は流体であり得る。いくつかの実施形態では、パーティションは、固体パーティション、例えば、マイクロチャネルである。いくつかの実施形態では、パーティションは、流体パーティション、例えば、液滴である。いくつかの実施形態では、流体パーティション（例えば、液滴）は、不混和性流体（例えば、水及び油）、又はエマルジョンの混合物である。いくつかの実施形態では、流体パーティション（例えば、液滴）は、不混和性キャリア流体（例えば、油）によって囲まれた水滴である。他の実施形態では、流体パーティションは、１つの液滴の内容物が、隣接する液滴に拡散しないように、隣接する水滴から物理的又は化学的に分離される水滴である。例えば、パーティショニングは、対象の核酸を別個にパーティション、単離、及び／又は分析するために、液滴発生器（例えば、ＢｉｏＲａｄシステム、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓシステム、Ｍｉｃｒｏｎｉｔ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓシステム、油中水型マイクロ流体デバイス、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓシステム、又は任意の他の好適な液滴パーティショニングシステム）を使用して実施され得る。
本明細書で提供されるシステム及び方法の実施形態は、転位試薬、第１のタグに相補的な第１のプローブ、及び第２のタグに相補的な第２プローブを含有するキットを含み、第１及び第２プローブは、固体支持体上に固定化される。いくつかの実施形態では、第１プローブ及び第２プローブは、バーコードを含む。いくつかの実施形態では、第１プローブ及び第２プローブは、ポリＴプローブである。いくつかの実施形態では、固体支持体は、エッチングされた表面、ウェル、アレイ、フローセルデバイス、マイクロ流体チャネル、ビーズ、磁性ビーズ、カラム、液滴、又は微小粒子である。
実施例１－ミトコンドリアＤＮＡリードの低減
以下の実施例は、ＡＴＡＣ－ｓｅｑを使用してｍｔＤＮＡリードを低減する実施形態を実証する。
核ＤＮＡ及びｍｔＤＮＡの両方を有する試料を得た。試料を、様々なアリコートに分離し、各アリコートを、８μＭ、８０μＭ、及び８００μＭを含む様々な濃度で、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８色素と接触させた。次いで、各アリコートを、転位及びＡＴＡＣ－ｓｅｑに供し、ＤＮＡリードを分析した。
図２Ａ～図２Ｃに示されるように、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素は、選択的に染色されたｍｔＤＮＡであり、ｍｔＤＮＡへの転位を妨害するが、核ＤＮＡの転位を可能にする。表１は、図２Ａ～図２Ｃに示される結果として得られたリードを要約する。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素の濃度を増加させると、ＡＴＡＣ－ｓｅｑを使用してｍｔＤＮＡリードを減少させた。本方法及び組成物は、バルクＡＴＡＣ－ｓｅｑ又は単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑに使用されて、望ましくないｍｔＤＮＡ配列決定リードを阻害、低減、又は排除し得る。
転位及びＡＴＡＣ－ｓｅｑを実施することに加えて、試料の染色も行った。試料をＤＡＰＩで染色し、ｍｔＤＮＡの染色が発生したが、核ＤＮＡの活発に転写された（ＡＴＡＣ）領域では行われなかった。ＤＡＰＩはＤＮＡを染色したが、特定の位置では染色しなかった。ＲＮＡは、ＤＡＰＩが染色しない位置で転写される。ｍｔＤＮＡの特異な染色及び核ＤＮＡの活発に転写されていない領域は、ｍｔＤＮＡへの転位を効果的に阻害し、それによって、望ましくないオフターゲット転位を伴わずに、核ＤＮＡのＡＴＡＣ－ｓｅｑの効率が改善された。
実施例２－様々なＤＮＡ結合分子の効率
以下の実施例は、様々なＤＮＡ結合分子を使用することにより、ＡＴＡＣ－ｓｅｑを使用してｍｔＤＮＡリードを低減する実施形態を実証する。
核ＤＮＡ及びｍｔＤＮＡの両方を有する試料を得た。試料を、様々なアリコートに分離し、各アリコートを、様々な濃度で、異なる色素と接触させた。Ｈｏｅｃｈｓｔ（５０μＭ、２５μＭ、１２μＭ、６μＭ、３μＭ、及び０．６μＭの濃度）、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（５００μＭ、５０μＭ、５μＭ、０．５μＭ、及び０．１μＭの濃度）、Ｓｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ（５００μＭ、５０μＭ、５μＭ、０．５μＭ、及び０．１μＭの濃度）、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、０．１μＭ、及び０．０２μＭの濃度）、及びＱｕｂｉｔ（１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、０．１μＭ、及び０．０２μＭの濃度）を含む、５つの異なる色素を、図３Ａ～図３Ｃに示されるように使用した。任意の色素に曝されなかった別のアリコートを調製した。次いで、各アリコートを、Ｎｅｘｔｅｒａ転位に供し、生成物をゲル上で可視化した。図３Ａは、Ｈｏｅｃｈｓｔ及びＳＹＢＲ Ｇｏｌｄのゲルを示す。図３Ｂは、Ｓｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ及びＰｉｃｏＧｒｅｅｎのゲルを示し、図３Ｃは、Ｑｕｂｉｔのゲルを示し、色素を示さない。高分子量ＤＮＡ生成物は、非効率的な転位を示す。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ及びＳｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅについて、１００μＭを超える濃度で阻害が観察される。
各アリコートを転位に供し、図４及び図５に示されるように、ＤＮＡリードを分析した。図４に示されるように、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８は、ＡＴＡＣ－ｓｅｑプロファイル（ヌクレオソーム配置）を変更せず、ミトコンドリアＤＮＡリードを低減する（図２Ａ～図２Ｃにも示されるように）。Ｈｏｅｃｈｓｔは、比較的不偏性のＡＴＡＣ－ｓｅｑプロファイリングを可能にする一方で、ヌクレオソーム配置を変化させない。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄなど、いくつかの色素は、ＤＮＡに結合するが、非色素対照と比較して、ヌクレオソーム配置（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）に影響を及ぼした。
図５に示されるように、ｍｔＤＮＡの特異的な遮断は、核ＤＮＡ配列決定の特異性を増加させた。これらの結果は、ＤＮＡ結合分子のインターカレーションが、ＤＮＡの酵素的な転位活性を制御するために使用され得ることを実証する。
この手法は、より一般的に適用され得、望ましくない酵素活性を遮断するために、抗体複合体及びＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを含む周知のアフィニティータグを使用して、特定の染色剤、又は結合分子を、一般的に特定の標的にもたらすことができる。代替的に、特定のアフィニティータグ（「ブロッカー」）を使用して、酵素を特定の標的にもたらし得る。そのような用途は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のオフターゲット活性を遮断することを含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「含む（comprising）」は、「含む（including）」、「含有する（containing）」、又は「特徴付けられる（characterized by）」と同義であり、包括的又は非限定的であり、追加の列挙されていない要素又は方法の工程を排除するものではない。
上記の記載は、本発明のいくつかの方法及び材料を開示する。本発明は、方法及び材料の修正、並びに製造方法及び装置の変更を受けやすい。そのような修正は、本明細書に開示される本開示の考察又は本発明の実施から当業者には明らかとなる。したがって、本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態に限定されることを意図するものではなく、本発明の真の範囲及び趣旨内に入る全ての修正及び代替を包含する。
公開及び公開されていない出願、特許、及び参照文献を含むがこれらに限定されない本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、これによって、本明細書の一部をなすものである。参照により組み込まれる出版物及び特許又は特許出願が、本明細書に含有される開示と矛盾する範囲で、本明細書は、任意のそのような矛盾した材料に取って代わる、かつ／又はそれに対して優先することを意図している。
本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
核酸を配列決定する方法であって、
核酸を含む試料を用意することと、
前記試料をＤＮＡ結合分子と接触させることと、
前記試料を挿入酵素複合体と接触させて、タグ付き核酸断片を生成することであって、前記挿入酵素複合体が、前記ＤＮＡ結合分子によって阻害される、生成することと、
前記タグ付き核酸断片を配列決定して、配列リードを生成することと、を含む、方法。
（項目２）
前記試料が、細胞の集団、単一細胞、細胞核の集団、又は単一細胞核である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記試料が、一次核酸及び二次核酸を含み、前記ＤＮＡ結合分子が、一次核酸に対して二次核酸に優先的に結合する、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
前記一次核酸が、核ＤＮＡを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記二次核酸が、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）又は染色体外ＤＮＡを含む、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記ＤＮＡ結合分子が、ＤＮＡ色素、アフィニティータグ、リガンド、酵素、ペプチド、又は生体分子を含む、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記ＤＮＡ色素が、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、Ｓｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ、又はＱｕｂｉｔを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記挿入酵素複合体が、トランスポザーゼを含むトランスポソームである、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
配列決定が、トランスポザーゼアクセス可能なクロマチン配列決定（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）のためのアッセイによって、又は全ゲノム配列決定によって実施される、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
ＡＴＡＣ－ｓｅｑが、バルクＡＴＡＣ－ｓｅｑ又は単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記方法が、二次配列決定リードを阻害、低減、又は排除する、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
二次配列決定リードを阻害、低減、又は排除する方法であって、
一次核酸及び二次核酸を含む試料を用意することと、
前記試料を、二次核酸に優先的に結合するＤＮＡ結合分子と接触させることと、
ＤＮＡ転位をオープンクロマチン上で実施することと、を含み、前記二次核酸が、転位されないか、又は前記一次核酸よりも低い効率で転位される、方法。
（項目１３）
前記試料が、細胞の集団、単一細胞、細胞核の集団、又は単一細胞核である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ＤＮＡ結合分子が、ＤＮＡ色素、アフィニティータグ、リガンド、酵素、ペプチド、又は生体分子を含む、項目１２又は１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ＤＮＡ色素が、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、Ｓｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ、又はＱｕｂｉｔを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＤＮＡ転位が、トランスポザーゼアクセス可能なクロマチン配列決定（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、又はｇＤＮＡからの若しくは単一細胞からの全ゲノム配列決定のためのアッセイを使用して実施される、項目１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
ＡＴＡＣ－ｓｅｑが、バルクＡＴＡＣ－ｓｅｑ又は単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記試料を前記ＤＮＡ結合分子と接触させることが、前記二次核酸への転位を遮断又は低減する、項目１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記一次核酸が、核ＤＮＡを含む、項目１２～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記核ＤＮＡを配列決定することを更に含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記二次核酸が、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）又は染色体外ＤＮＡを含む、項目１２～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
ＤＮＡ配列決定から得られる一次配列決定リードを含む核酸ライブラリーであって、二次配列決定リードを含まないか、又はその低減された表現を有する、核酸ライブラリー。
（項目２３）
前記ＤＮＡ配列決定が、トランスポザーゼアクセス可能なクロマチン配列決定（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）のためのアッセイ、又はｇＤＮＡのための全ゲノム配列決定のためのアッセイである、項目２２に記載の核酸ライブラリー。
（項目２４）
前記一次配列決定リードが、核ＤＮＡ配列決定リードである、項目２２又は２３に記載の核酸ライブラリー。
（項目２５）
前記二次配列決定リードが、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）配列決定リード又は染色体外ＤＮＡ配列決定リードである、項目２２～２５のいずれか一項に記載の核酸ライブラリー。
（項目２６）
前記二次配列決定リードが、二次ＤＮＡに優先的に結合するＤＮＡ結合分子に起因して、低減、阻害、又は排除される、項目２２～２６のいずれか一項に記載の核酸ライブラリー。
（項目２７）
前記ＤＮＡ結合分子が、標的とする核酸領域に関する配列決定リード又はライブラリーを排除、低減、又は阻害するために特定の核酸配列に結合することができる、項目２６に記載の核酸ライブラリー。
（項目２８）
前記ＤＮＡ結合分子が、ＤＮＡ色素、アフィニティータグ、リガンド、酵素、ペプチド、又は生体分子を含む、項目２６に記載の核酸ライブラリー。
（項目２９）
前記ＤＮＡ色素が、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、Ｓｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ、又はＱｕｂｉｔを含む、項目２８に記載の核酸ライブラリー。
（項目３０）
前記核酸ライブラリーが、細胞の集団、単一細胞、細胞核の集団、又は単一細胞核から生成される、項目２２～２９のいずれか一項に記載の核酸ライブラリー。

Claims (14)

  1. 核酸を配列決定する方法であって、前記方法が、
    核酸を含む試料を用意することと、
    前記試料を、ＤＮＡ色素を含むＤＮＡ結合分子と接触させることと、
    前記試料を挿入酵素複合体と接触させて、タグ付き核酸断片を生成することであって、前記挿入酵素複合体が、前記ＤＮＡ結合分子によって阻害される、生成することと、
    前記タグ付き核酸断片を配列決定して、配列リードを生成することと、を含み、
    前記試料が、一次核酸及び二次核酸を含み、前記一次核酸が、核ＤＮＡを含み、前記二次核酸が、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）又は染色体外ＤＮＡを含み、前記ＤＮＡ結合分子が、一次核酸に対して二次核酸に優先的に結合する、方法。
  2. 前記試料が、細胞の集団、単一細胞、細胞核の集団、又は単一細胞核である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＤＮＡ色素が、ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ色素、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｏｌｄ、ＳｙｔｏｘＴＭ Ｏｒａｎｇｅ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＴＭ、又はＱｕｂｉｔＴＭを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記挿入酵素複合体が、トランスポザーゼを含むトランスポソームである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 配列決定が、トランスポザーゼアクセス可能なクロマチン配列決定（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）のためのアッセイによって、又は全ゲノム配列決定によって実施される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ＡＴＡＣ－ｓｅｑが、バルクＡＴＡＣ－ｓｅｑ又は単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記方法が、二次核酸の配列決定リードを阻害、低減、又は排除する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 二次核酸の配列決定リードを阻害、低減、又は排除する方法であって、
    一次核酸及び二次核酸を含む試料を用意することであって、前記一次核酸が、核ＤＮＡを含み、前記二次核酸が、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）又は染色体外ＤＮＡを含む、ことと、
    前記試料を、二次核酸に優先的に結合するＤＮＡ色素を含むＤＮＡ結合分子と接触させることと、
    ＤＮＡ転位をオープンクロマチン上で実施することと、を含み、前記二次核酸が、転位されないか、又は前記一次核酸よりも低い効率で転位される、方法。
  9. 前記試料が、細胞の集団、単一細胞、細胞核の集団、又は単一細胞核である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ＤＮＡ色素が、ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ色素、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｏｌｄ、ＳｙｔｏｘＴＭ Ｏｒａｎｇｅ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＴＭ、又はＱｕｂｉｔＴＭを含む、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 前記ＤＮＡ転位が、トランスポザーゼアクセス可能なクロマチン配列決定（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）、又はｇＤＮＡからの若しくは単一細胞からの全ゲノム配列決定のためのアッセイを使用して実施される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. ＡＴＡＣ－ｓｅｑが、バルクＡＴＡＣ－ｓｅｑ又は単一細胞ＡＴＡＣ－ｓｅｑを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記試料を前記ＤＮＡ結合分子と接触させることが、前記二次核酸への転位を遮断又は低減する、請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記核ＤＮＡを配列決定することを更に含む、請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法。
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