JP7544761B2 - 増加した二本鎖rna産生のための方法及び組成物 - Google Patents
増加した二本鎖rna産生のための方法及び組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7544761B2 JP7544761B2 JP2022067530A JP2022067530A JP7544761B2 JP 7544761 B2 JP7544761 B2 JP 7544761B2 JP 2022067530 A JP2022067530 A JP 2022067530A JP 2022067530 A JP2022067530 A JP 2022067530A JP 7544761 B2 JP7544761 B2 JP 7544761B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dsrna
- microbial cell
- capsid protein
- gene
- gene encoding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 title claims description 338
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 title claims description 278
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 50
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title description 7
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 157
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 151
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 125
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 110
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 66
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 64
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims description 64
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 64
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 64
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims description 64
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 46
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 30
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 22
- 241000709744 Enterobacterio phage MS2 Species 0.000 claims description 16
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 15
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 15
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 14
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 11
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 9
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 5
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 claims description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 50
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 27
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 27
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 26
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 16
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 12
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 101150079036 rnc gene Proteins 0.000 description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 9
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 9
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 9
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000983708 Corynebacterium glutamicum MB001 Species 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 5
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 101150020798 rnt-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 4
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 4
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241001534160 Escherichia virus Qbeta Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000714216 Levivirus Species 0.000 description 3
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108091026838 U1 spliceosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 108700031758 U1A Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 2
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 2
- 101710186199 Coatomer subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 101100011900 Drosophila melanogaster rl gene Proteins 0.000 description 2
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 2
- 241001131798 Escherichia coli HT115 Species 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N 2-{[3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy}-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound OCC1OC(CO)(OC2OC(CO)C(O)C(O)C2O)C(O)C1O CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000755953 Bacillus subtilis (strain 168) Ribosome maturation factor RimP Proteins 0.000 description 1
- 108700027842 Bacteriophage lambda DNA replication complex Proteins 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 description 1
- 101710104359 F protein Proteins 0.000 description 1
- 238000012366 Fed-batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000617779 Homo sapiens U1 small nuclear ribonucleoprotein A Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- -1 LEU2 Proteins 0.000 description 1
- 241000714210 Leviviridae Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 238000012193 PureLink RNA Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 238000012233 TRIzol extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101710106597 U1 small nuclear ribonucleoprotein A Proteins 0.000 description 1
- 101150014333 U1A gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007438 host cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOBAEOGBNPPUQV-UHFFFAOYSA-N iron;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Fe].[Fe] YOBAEOGBNPPUQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 101150023497 mcrA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150079876 mcrB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 102220311690 rs771555522 Human genes 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021654 trace metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2330/00—Production
- C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
- C12N2795/18111—Leviviridae
- C12N2795/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
本出願は、2016年3月15日に出願された米国仮特許出願第62/308,381号の利益を主張する。
配列表の組み込み
同族pac部位を有するキャプシド二量体の相互作用は、直接共有結合によるか、または様々な親和性法によるかのいずれかで、所望のカーゴ分子をpac部位配列と関連付けることによって、様々な種類の異種RNAのキャプシド化を可能にするように設計された多くの異なる公開されたインビトロ及びインビボ法の対象である。本発明は、キャプシド化されたRNAよりむしろ非キャプシド化dsRNAを産生するキャプシドタンパク質の共発現を含む点で、このようなアプローチとは著しく異なる。さらに、本発明は、pacを完全に欠くdsRNA、または同族タンパク質親和性を有する認識された分散及び縮退RNA部位のインビボ産生を可能にする。そのようなdsRNA分子のインビボ産生は、外来配列を減少させることにより、オフターゲットRNAi相互作用の機会が減少するために、非常に望ましい。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
微生物細胞中で非キャプシド化dsRNAを産生するための方法であって、前記dsRNAが、キャプシドタンパク質をコードするコートタンパク質遺伝子と共発現される、方法。
(項目2)
前記キャプシドタンパク質が、レビウイルスコートタンパク質遺伝子によってコードされる、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージMS2のコートタンパク質遺伝子によってコードされる、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージQβのコートタンパク質遺伝子によってコードされる、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記dsRNAをコードする遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、誘導性プロモーターから発現される、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、構成的プロモーターから発現され、前記dsRNAをコードする前記遺伝子が、誘導性プロモーターから発現される、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記dsRNAをコードする前記遺伝子の前に、またはこれと同時に発現される、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記dsRNAをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞内の1つのプラスミドまたは染色体外要素上に存在する、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記dsRNAをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞内の別々のプラスミドまたは染色体外要素上に存在する、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記dsRNAをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記遺伝子のうちの一方が、プラスミドまたは染色体外要素上に存在し、前記dsRNAをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記遺伝子のうちの他方が、前記微生物細胞の染色体上に存在する、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記dsRNAをコードする前記遺伝子及び前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞の前記染色体上に存在する、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記dsRNAが、RNAi前駆体である、項目1に記載の方法。
(項目13)
前記dsRNAの産生後に、前記微生物細胞が続いて溶解され、前記dsRNAが、適用のための処理に先立って、前記溶解物から精製される、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記dsRNAの産生後に、前記微生物細胞が溶解され、前記dsRNAをさらに精製することなく、適用のために処理される、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記dsRNAの産生後に、前記微生物細胞が、前記dsRNAを溶解またはさらに精製することなく、適用のために処理される、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記キャプシドタンパク質が、短縮型キャプシドタンパク質を含む、項目1に記載の方法。
(項目17)
前記キャプシドタンパク質のN末端から本質的になる、項目16に記載の短縮型MS2キャプシドタンパク質。
(項目18)
前記キャプシドタンパク質の最初の41個のアミノ酸を含む、項目16に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
(項目19)
前記キャプシドタンパク質の最初の35個のアミノ酸を含む、項目16に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
(項目20)
前記キャプシドタンパク質の最初の25個のアミノ酸を含む、項目16に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
(項目21)
前記キャプシドタンパク質の最初の21個のアミノ酸を含む、項目16に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
(項目22)
前記キャプシドタンパク質の最初の11個のアミノ酸を含む、項目16に記載の短縮型キャプシドタンパク質。
(項目23)
前記微生物細胞が、細菌である、項目1に記載の方法。
(項目24)
前記微生物細胞が、グラム陰性細菌である、項目1に記載の方法。
(項目25)
前記微生物細胞が、Escherichia coliの株である、項目1に記載の方法。
(項目26)
前記微生物細胞が、グラム陽性細菌である、項目1に記載の方法。
(項目27)
前記微生物細胞が、Corynebacterium glutamicumの株である、項目1に記載の方法。
(項目28)
前記微生物細胞が、酵母である、項目1に記載の方法。
(項目29)
前記微生物細胞が、Saccharomyces cerevisiaeの株である、項目1に記載の方法。
B.一般的な材料、及び方法
C.好ましい実施形態
非キャプシド化dsRNAは、キャプシドタンパク質の非存在下よりも高いレベルでキャプシドタンパク質の存在下で産生される。
pAPSE10180及びpAPSE10181を含む発現株を構築し、上記の標準的な発現手順によってdsRNA産生を誘導した。記載されているように、産生されたそれぞれの菌株のキャプシド化及び非キャプシド化dsRNAの量を測定した。この実験の初期の推進力は、180個の塩基対の二本鎖ステム構造を有するRNA分子がVLP内に充填され得るか否かを決定することであった。180bpのdsRNAステムは、長さがおよそ60nmであるのに対し、MS2キャプシドの内径はおよそ20nmである。この幾何学的限界に基づいて、ほとんどまたはまったくキャプシド化が予想されず、宿主ヌクレアーゼ活性のために、ほとんどまたは全く取り込まれていないdsRNAが細胞溶解物から回収可能であると予想された。予想されるように、pAPSE10180発現細胞から少量のキャプシド化dsRNA(enキャプシド)が回収された(<2mg/L)。対照的に、驚くべきことに、pAPSE10180発現細胞からは、大量の非キャプシド化dsRNA(exキャプシド)が回収された(75~90mg/L)。さらに驚くべきことに、pAPSE10181発現細胞からは、実質上、非キャプシド化dsRNAは回収されなかった。
実施例2
特定のpac部位キャプシドタンパク質相互作用は、dsRNAの高レベル産生に必要とされない。
実施例3
ループのサイズ及び構造は、dsRNAの高レベル産生とは無関係である。
実施例4
ステムサイズは、dsRNAの高レベル産生とは無関係である。
実施例5
キャプシドタンパク質は、dsRNAの高レベル産生に必要である。
実施例6
他のキャプシドタンパク質は、dsRNAの高レベル産生を誘導することができる。
実施例7
キャプシドタンパク質以外のRNA結合タンパク質は、dsRNAの高レベル産生には不十分である。
実施例8
キャプシドタンパク質のN末端は、dsRNAの高レベル産生に十分である。
実施例9
フェドバッチ発酵はdsRNAの非常に高レベルの産生をもたらす。
通気させ、溶存酸素を攪拌のカスケード制御により30%に維持した。pAPSE10379を含有するHT115(DE3)の一晩培養物を37°Cで100ug/ulのアンピシリン及び12.5ug/ulテトラサイクリンを含有するLB中で増殖させて、種培地に接種した。種培地は、7.0のPHで維持された、5.68g/LのNa2HPO4、1.34g/LのKH2PO4、6.6g/Lの(NH4)2SO4、10g/Lのグルコース、1倍の微量金属及び1倍のビタミン溶液からなる限定倍地である。プラスミドの安定性を確実にするために、100ug/ulのアンピシリン及び12.5ug/ulのテトラサイクリンで抗生物質を添加する。飽和(OD600 3~5)時に、種培養物を使用して、発酵槽のための10%の接種材料を提供する。
実施例10
グラム陽性細菌におけるdsRNA産生のための組成物及び方法。
酵母におけるdsRNA産生のための組成物及び方法。
Claims (28)
- 微生物細胞であって、
(1)キャプシドタンパク質をコードするコートタンパク質遺伝子であって、前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージMS2の全長キャプシドタンパク質であるか、またはバクテリオファージMS2の前記キャプシドタンパク質の最初の41個のアミノ酸、最初の35個のアミノ酸、最初の25個のアミノ酸、最初の21個のアミノ酸、もしくは最初の12個のアミノ酸である、コートタンパク質遺伝子、および
(2)相補的配列のハイブリダイゼーションの際にステムループ構造が形成されるように非相補的配列によって分離された自己相補的な一続きの配列を含むdsRNA遺伝子であって、前記ステムループ構造が、MS2キャプシドの内径を超える長さを有する、dsRNA遺伝子
を含む、微生物細胞。 - 前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージMS2のコートタンパク質遺伝子によってコードされる、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記dsRNAをコードする前記遺伝子および前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、誘導性プロモーターから発現される、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、構成的プロモーターから発現され、前記dsRNAをコードする前記遺伝子が、誘導性プロモーターから発現される、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記dsRNAをコードする前記遺伝子の前に、またはこれと同時に発現される、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記dsRNAをコードする前記遺伝子および前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞内の1つのプラスミドもしくは染色体外要素上に、または前記微生物細胞内の別々のプラスミドもしくは染色体外要素上に存在する、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記ステムループ構造が116塩基またはそれ以上の長さである、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記dsRNAをコードする前記遺伝子および前記キャプシドタンパク質をコードする前記遺伝子のうちの一方が、プラスミドまたは染色体外要素上に存在し、前記dsRNAをコードする前記遺伝子および前記キャプシドタンパク質をコードする前記遺伝子のうちの他方が、前記微生物細胞の染色体上に存在する、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記dsRNAをコードする前記遺伝子および前記キャプシドタンパク質をコードする前記コートタンパク質遺伝子が、前記微生物細胞の染色体上に存在する、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記dsRNAが、RNAi前駆体である、請求項1に記載の微生物細胞。
- 微生物細胞であって、
(1)キャプシドタンパク質をコードするコートタンパク質遺伝子であって、前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージMS2のキャプシドタンパク質であり、前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージMS2の全長キャプシドタンパク質を含むか、またはバクテリオファージMS2の前記キャプシドタンパク質の41個、35個、25個、21個、または12個のアミノ酸のアミノ末端を含む、コートタンパク質遺伝子、および
(2)相補的配列のハイブリダイゼーションの際にステムループ構造が形成されるように非相補的配列によって分離された自己相補的な一続きの配列を含むdsRNA遺伝子であって、前記ステムループ構造が、MS2キャプシドの内径を超える長さを有する、dsRNA遺伝子
を含む、微生物細胞。 - 前記アミノ末端断片が前記キャプシドタンパク質の最初の41個のアミノ酸を含む、請求項11に記載の微生物細胞。
- 前記アミノ末端断片が前記キャプシドタンパク質の最初の35個のアミノ酸を含む、請求項11に記載の微生物細胞。
- 前記アミノ末端断片が前記キャプシドタンパク質の最初の25個のアミノ酸を含む、請求項11に記載の微生物細胞。
- 前記微生物細胞が細菌である、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記微生物細胞がグラム陰性細菌である、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記微生物細胞がグラム陽性細菌である、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記微生物細胞が、Escherichia coliの株であるか、またはCorynebacterium glutamicumの株である、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記微生物細胞が酵母である、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記微生物細胞が、Saccharomyces cerevisiaeの株である、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記微生物細胞が、フェドバッチ発酵条件下で培養され、それにより、前記微生物細胞において3g/Lの回収可能な非キャプシド化dsRNAの蓄積を達成することができる、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記dsRNAの前記ステムループ構造が、少なくとも75塩基対の長さである、請求項1に記載の微生物細胞。
- 前記dsRNAの前記ステムループ構造が、20nm以上の長さである、請求項1に記載の微生物細胞。
- その中で非キャプシド化dsRNAを産生するのに使用するための、微生物細胞を含む組成物であって、前記微生物細胞が、
(1)キャプシドタンパク質をコードするコートタンパク質遺伝子であって、前記キャプシドタンパク質が、バクテリオファージMS2の全長キャプシドタンパク質であるか、またはバクテリオファージMS2の前記キャプシドタンパク質の最初の41個のアミノ酸である、コートタンパク質遺伝子、および
(2)相補的配列のハイブリダイゼーションの際にステムループ構造が形成されるように非相補的配列によって分離された自己相補的な一続きの配列を含むdsRNA遺伝子であって、前記ステムループ構造が、MS2キャプシドの内径を超える長さを有する、dsRNA遺伝子
を含み、前記微生物細胞が前記コートタンパク質遺伝子とともに前記dsRNA遺伝子を共発現し、
産生される非キャプシド化dsRNAの量は、前記コートタンパク質遺伝子が共発現されない場合に産生される非キャプシド化dsRNAの量よりも多い、組成物。 - 前記使用が、前記コートタンパク質遺伝子とともに前記dsRNA遺伝子を共発現させることを含み、産生される非キャプシド化dsRNAの量は、前記コートタンパク質遺伝子が共発現されない場合に産生される非キャプシド化dsRNAの量よりも多い、請求項24に記載の組成物。
- 前記使用が、前記微生物細胞の溶解物から前記非キャプシド化dsRNAを回収するステップを含む、請求項24に記載の組成物。
- 前記非キャプシド化dsRNAを含む前記微生物細胞の前記溶解物が、前記dsRNAをさらに精製することなく、適用のために処理される、請求項26に記載の組成物。
- 前記非キャプシド化dsRNAの産生後に、前記微生物細胞が、前記非キャプシド化dsRNAを溶解することもまたはさらに精製することもなく、適用のために処理される、請求項24に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662308381P | 2016-03-15 | 2016-03-15 | |
US62/308,381 | 2016-03-15 | ||
JP2018548933A JP7140386B2 (ja) | 2016-03-15 | 2017-03-09 | 増加した二本鎖rna産生のための方法及び組成物 |
PCT/US2017/021661 WO2017160600A1 (en) | 2016-03-15 | 2017-03-09 | Methods and compositions for increased double stranded rna production |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018548933A Division JP7140386B2 (ja) | 2016-03-15 | 2017-03-09 | 増加した二本鎖rna産生のための方法及び組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022087312A JP2022087312A (ja) | 2022-06-09 |
JP7544761B2 true JP7544761B2 (ja) | 2024-09-03 |
Family
ID=59851196
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018548933A Active JP7140386B2 (ja) | 2016-03-15 | 2017-03-09 | 増加した二本鎖rna産生のための方法及び組成物 |
JP2022067530A Active JP7544761B2 (ja) | 2016-03-15 | 2022-04-15 | 増加した二本鎖rna産生のための方法及び組成物 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018548933A Active JP7140386B2 (ja) | 2016-03-15 | 2017-03-09 | 増加した二本鎖rna産生のための方法及び組成物 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10704045B2 (ja) |
EP (1) | EP3429336A4 (ja) |
JP (2) | JP7140386B2 (ja) |
CN (2) | CN109196102B (ja) |
AU (1) | AU2017233862B2 (ja) |
BR (1) | BR112018068144A2 (ja) |
CA (1) | CA3016899C (ja) |
IL (1) | IL261516A (ja) |
MX (2) | MX2018011170A (ja) |
SG (1) | SG11201807478QA (ja) |
WO (1) | WO2017160600A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016183022A1 (en) * | 2015-05-12 | 2016-11-17 | Apse, Llc | In vivo production of long double stranded rna utilizing vlps |
SG11201807478QA (en) | 2016-03-15 | 2018-09-27 | Apse Inc | Methods and compositions for increased double stranded rna production |
CN110494567B (zh) * | 2017-03-28 | 2024-07-12 | 味之素株式会社 | 生产rna的方法 |
EP3976787A4 (en) * | 2019-05-30 | 2023-10-25 | Rnaissance AG L.L.C | METHODS AND COMPOSITIONS FOR MICROBIAL ADMINISTRATION OF DOUBLE STRANDED RNA |
WO2020243593A1 (en) | 2019-05-30 | 2020-12-03 | Apse, Inc. | Improved methods and compositions for increased double stranded rna production |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20140271559A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for the production and delivery of double stranded rna |
JP2015500662A (ja) | 2011-12-21 | 2015-01-08 | アプス, エルエルシー | 加水分解酵素に対して耐性があるカプシドを有するvlpを用いるプロセス |
WO2015042556A1 (en) | 2013-09-23 | 2015-03-26 | Georgia Tech Research Corporation | Targeting non-coding rna for rna interference |
JP2018515079A (ja) | 2015-05-12 | 2018-06-14 | アプス, エルエルシー | VLPを利用した長い二本鎖RNAのin vivo生成 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020164585A1 (en) | 1998-01-16 | 2002-11-07 | Sean Chapman | Method for enhancing RNA or protein production using non-native 5' untranslated sequences in recombinant viral nucleic acids |
US8772254B2 (en) | 2004-10-25 | 2014-07-08 | Devgen N.V. | Method and constructs for delivering double stranded RNA to pest organisms |
CA2608579C (en) * | 2005-05-26 | 2019-09-10 | Cytos Biotechnology Ag | Scalable fermentation process |
US8324149B2 (en) * | 2008-11-18 | 2012-12-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Encapsidation of heterologous entities into virus-like particles |
GB201202119D0 (en) | 2012-02-08 | 2012-03-21 | Univ Swansea | Pest and pathogen control |
KR102271292B1 (ko) * | 2013-03-15 | 2021-07-02 | 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 | Rna-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키기 위한 rna-안내 foki 뉴클레아제(rfn)의 용도 |
MX364809B (es) | 2013-06-19 | 2019-05-07 | Apse Llc | Composiciones y metodos que se usan capsides resistentes a hidrolasas. |
WO2015038746A1 (en) * | 2013-09-11 | 2015-03-19 | Georgia Tech Research Corporation | Compositions and methods for inhibiting gene expression |
WO2015073720A1 (en) | 2013-11-14 | 2015-05-21 | Scarab Genomics, Llc | Bacteria with improved metabolic capacity |
SG11201807478QA (en) | 2016-03-15 | 2018-09-27 | Apse Inc | Methods and compositions for increased double stranded rna production |
-
2017
- 2017-03-09 SG SG11201807478QA patent/SG11201807478QA/en unknown
- 2017-03-09 BR BR112018068144A patent/BR112018068144A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2017-03-09 CN CN201780018422.3A patent/CN109196102B/zh active Active
- 2017-03-09 US US16/084,545 patent/US10704045B2/en active Active
- 2017-03-09 JP JP2018548933A patent/JP7140386B2/ja active Active
- 2017-03-09 CA CA3016899A patent/CA3016899C/en active Active
- 2017-03-09 WO PCT/US2017/021661 patent/WO2017160600A1/en active Application Filing
- 2017-03-09 MX MX2018011170A patent/MX2018011170A/es unknown
- 2017-03-09 CN CN202210337486.2A patent/CN115927299A/zh active Pending
- 2017-03-09 AU AU2017233862A patent/AU2017233862B2/en active Active
- 2017-03-09 EP EP17767194.8A patent/EP3429336A4/en active Pending
-
2018
- 2018-09-02 IL IL261516A patent/IL261516A/en unknown
- 2018-09-14 MX MX2020013746A patent/MX2020013746A/es unknown
-
2020
- 2020-07-07 US US16/922,948 patent/US11718851B2/en active Active
-
2022
- 2022-04-15 JP JP2022067530A patent/JP7544761B2/ja active Active
-
2023
- 2023-06-27 US US18/342,407 patent/US20230416744A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015500662A (ja) | 2011-12-21 | 2015-01-08 | アプス, エルエルシー | 加水分解酵素に対して耐性があるカプシドを有するvlpを用いるプロセス |
US20140271559A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for the production and delivery of double stranded rna |
WO2015042556A1 (en) | 2013-09-23 | 2015-03-26 | Georgia Tech Research Corporation | Targeting non-coding rna for rna interference |
JP2018515079A (ja) | 2015-05-12 | 2018-06-14 | アプス, エルエルシー | VLPを利用した長い二本鎖RNAのin vivo生成 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Molecular and Biochemical Parasitology,2012年04月20日,vol. 184, no. 1,pp. 55-58 |
Nature Biotechnology,2013年03月,vol. 31, no. 4,pp. 350-356,online methods pp. 1-2, suppl. pp. 1-25 |
RNA,2015年06月19日,vol. 21,pp. 1393-1395 |
RNA,2016年03月11日,vol. 22, no. 5,pp. 660-666 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2017233862B2 (en) | 2023-04-13 |
WO2017160600A1 (en) | 2017-09-21 |
SG11201807478QA (en) | 2018-09-27 |
CN109196102A (zh) | 2019-01-11 |
AU2017233862A1 (en) | 2018-10-04 |
CA3016899C (en) | 2023-09-19 |
MX2018011170A (es) | 2019-05-16 |
CA3016899A1 (en) | 2017-09-21 |
US20190093108A1 (en) | 2019-03-28 |
IL261516A (en) | 2018-10-31 |
JP2019508060A (ja) | 2019-03-28 |
US20230416744A1 (en) | 2023-12-28 |
CN109196102B (zh) | 2022-04-26 |
EP3429336A1 (en) | 2019-01-23 |
US11718851B2 (en) | 2023-08-08 |
US20220145294A1 (en) | 2022-05-12 |
US10704045B2 (en) | 2020-07-07 |
BR112018068144A2 (pt) | 2019-02-12 |
CN115927299A (zh) | 2023-04-07 |
JP2022087312A (ja) | 2022-06-09 |
JP7140386B2 (ja) | 2022-09-21 |
MX2020013746A (es) | 2021-03-02 |
EP3429336A4 (en) | 2019-10-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7544761B2 (ja) | 増加した二本鎖rna産生のための方法及び組成物 | |
JP7184648B2 (ja) | 標的核酸の改変のための改善された方法 | |
EP3461894B1 (en) | Engineered crispr-cas9 compositions and methods of use | |
US11439712B2 (en) | Methods and compositions for RNA-directed repression of transcription using CRISPR-associated genes | |
CA2912131C (en) | Oligonucleotides comprising capsid specific packaging sequences and methods of manufacture thereof | |
Hashiro et al. | Overexpression system for recombinant RNA in Corynebacterium glutamicum using a strong promoter derived from corynephage BFK20 | |
US7863222B2 (en) | shRNA library | |
JP2006526985A (ja) | dsRNAを大量産生するための方法およびキット | |
US20180291066A1 (en) | In vivo production of long double stranded rna utilizing vlps | |
US20220307038A1 (en) | Improved methods and compositions for increased double stranded rna production | |
JP2008048681A (ja) | RNAi法を用いた紅麹菌におけるカビ毒シトリニン生産抑制方法 | |
Beinhoff et al. | Gene silencing in Verticillium longisporum: evaluation and establishment of a method for post-transcriptional downregulation of genes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220415 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230307 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20230309 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230606 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230804 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230907 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231201 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20240229 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240430 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240730 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240822 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7544761 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |