JP7530675B2 - 羊水細胞由来のｅｃｍ上での心筋細胞の成熟化のための方法、細胞構築物、ならびに薬物化合物の心毒性および催不整脈スクリーニングのための使用 - Google Patents

羊水細胞由来のｅｃｍ上での心筋細胞の成熟化のための方法、細胞構築物、ならびに薬物化合物の心毒性および催不整脈スクリーニングのための使用 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年２月２１日出願の米国仮特許出願第６２／８０８，６９０号の利益を主張し、該出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は一般に、細胞由来の細胞外マトリックス上のヒト幹細胞に由来する心筋細胞の細胞構築物の使用、構築物を作成する方法、ならびに構築物を使用した薬物化合物の心毒性および催不整脈スクリーニングアッセイのための方法に関する。
心毒性、または心毒性の感知された可能性は、新たな薬物の調査および選択の間の毒性関連薬物損耗（ａｔｔｒｉｔｉｏｎ）の主要な原因である。リード薬物候補となる新たな化学的実体の心安全性試験は、薬物発見および開発パイプラインの重要な局面である。心および非心薬物の多数の心副作用は、１つまたは複数の心イオンチャネルとの薬物相互作用によって引き起こされる。心イオンチャネルは、細胞興奮性、収縮性および全体的心性能を調節し、心イオンチャネル機能の変更は、心突然死に繋がり得る。これは、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＩＣＨ）からの薬物候補試験ガイドラインの公表に寄与した。
ＩＨＣからの現行の前臨床薬物候補試験ガイドライン（ＩＣＨ Ｓ７ＡおよびＳ７Ｂ－Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ）は、遺伝子改変された異種細胞およびｉｎ
ｖｉｖｏ動物モデルに依存する。これらの研究、たとえば、ｈＥＲＧアッセイおよびＱＴ延長研究は、ヒトに対する心毒性および催不整脈リスクを正確に予測しないことが、ますます認識されてきている。２００５年以降、薬物化合物の心安全性は、心電図（ＥＣＧ）のＱＴ間隔または活動電位持続時間（ＡＰＤ）に対するその影響または潜在的影響、ならびにトルサードドポアント（ＴｄＰ）と呼ばれる生命を脅かす不整脈に繋がる可能性によって、ほとんど排他的に決定されてきた。しかし、ＱＴ間隔を延長させる薬物が必ずしもＴｄＰを引き起こすとは限らないので、ＱＴ延長は、ＴｄＰの理想的な指標ではない。ＱＴ延長パラメーターは、催不整脈の代理マーカーに過ぎないことが現在認識されている。前臨床試験および臨床試験からのデータは、ＱＴ延長の大きさとＴｄＰなどの致死的不整脈の発症のリスクとの間に一定の関係性が存在しないことを示している。
したがって、ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）および薬物発見における他の利害関係者は、前臨床心毒性試験における進化を求めてきた。提案された新たなパラダイムは、包括的ｉｎ－ｖｉｔｒｏ催不整脈アッセイ（ＣｉＰＡ）と呼ばれる。ＣｉＰＡ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ｈｔｔｐ：／／ｃｉｐａｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）の不可欠の部分は、心毒性および催不整脈アッセイについてヒト幹細胞由来心筋細胞から収集されたデータの組込みを含む。これらの新たな提案されたガイドラインの全体的な目的は、新たな薬物のリスクをより正確に評価する、催不整脈の可能性の、より正確かつ包括的な機構ベースの評価を提供することである。提案されたＣｉＰＡ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅのガイドラインを検討すると、ＦＤＡは、ヒト心筋細胞が新たなイニシアチブに取り込まれることができる前になされるべき２つの前進を規定している。第１に、ヒト幹細胞由来心筋細胞の成長および成熟化状態は、成人ヒト心筋細胞の構造および機能により密接に似るように進化させる必要がある。第２に、これらの細胞を使用する信頼性のあるハイスループットスクリーニングプラットフォームが開発される必要がある。
心筋細胞の電気生理学をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価するために現在利用されるシステムには、一般に３つの型が存在する：１）パッチクランプシステム；２）微小電極アレイ（ＭＥＡ）システム；および３）電位感受性色素（ＶＳＤ）可視化法。手動パッチクランプシステムは、個別の細胞の電気生理学を評価するために、非常に初期の調査研究において最も一般的に使用されている。これらのデバイスは、正確かつ高感度なイオン電流測定を提供するが、心組織における細胞－細胞相互作用をより密接に模倣するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞システムには使用できない。ＭＥＡシステムは、細胞培養ウェル中に取り込まれて、ウェルにわたる電流の測定を可能にする電極を含む。ハイスループット解析、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞システムにおいてインピーダンスを測定する能力を可能にしながら、これらのシステムは、低い空間的解像度を有し、活動電位形状についてのデータを提供せず、細胞の直接的可視化、および心組織アーキテクチャーをより密接に模倣する３－Ｄ培養システムを評価する能力を妨害する。ＶＳＤシステムは、以下を含む特色を有して、上記した現在の技術の欠点の多くに対処するので、ますます関心を抱かれている：１）ハイスループット解析を可能にする；２）高い空間的解像度を提供する；３）培養ディッシュにわたるインパルス伝播の可視化を可能にする；および４）より自然な試験環境に繋がる、細胞外マトリックスの添加を含む培養条件の改変を可能にする。
ヒト幹細胞に由来する心筋細胞、たとえば、誘導多能性幹細胞の使用は、心毒性および催不整脈アッセイスクリーニングにおいて、今日まで成功が限定的であった。誘導ヒト多能性幹細胞に由来する心筋細胞（ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）は、市販されており、解凍され得、単層としてプレーティングされ得る凍結保存されたバイアル中で、いくつかの企業から購入することができる。これらのｈｉＰＳＣ－ＣＭは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで大規模で作成することができる。また、ｈｉＰＳＣ－ＣＭは、特定の個体のために患者特異的ｈｉＰＳＣから得ることができる。しかし、ｈｉＰＳＣ－ＣＭを新たなＣｉＰＡ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅパラダイムの有意義な部分にするためになおも克服すべきハードルが存在する。１）ｈｉＰＳＣ－ＣＭの構造および機能の成熟化を前進させる必要がある。特に、Ｋｉｒ２．１カリウムチャネルは、現在入手可能なｈｉＰＳＣ－ＣＭ中には存在せず、ナトリウムチャネル発現は低い。現在入手可能なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、機能的かつ構造的に非常に未熟である。現在使用されるｈｉＰＳＣ－ＣＭベースの催不整脈スクリーニングアッセイの大多数は、成人心筋細胞の構造にも機能にも似ていない未熟な胎児様細胞に依存する。２）ハイスループット電気生理学的スクリーニングプラットフォームにおけるｈｉＰＳＣ－ＣＭ単層の電気的ペーシングが必要とされる。現在のｈｉＰＳＣ－ＣＭベースの催不整脈スクリーニングの大多数は、ＴｄＰ誘導の代理マーカーとして、電場電位持続時間（ＭＥＡ技術）または活動電位持続時間延長（ＶＳＤ技術）にもっぱら依存する。活動電位（ＱＴ間隔）を延長させる全ての薬物が致死的ＴｄＰ不整脈を引き起こすわけではないので、これは制約である。未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭのある特定の成熟化状態は、培養においてＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭおよび骨髄細胞由来のＥＣＭを使用することによって達成されているが、催不整脈スクリーニングアッセイにおけるこれらのｈｉＰＳＣ－ＣＭの使用は、特に、低リスク薬物と高リスク薬物との間で、ヒトにおけるＴｄＰの場合に生じることが公知のものと一致する不整脈活性化パターンの観察において、一貫した結果を生じなかった。
したがって、進歩した材料および新たな方法が、新たな薬物候補の正確で信頼性のある効率的な開発のための薬物化合物の心安全性責任の正確な評価およびスクリーニングのために必要とされる。
本開示は、薬物候補の心安全性責任の評価およびスクリーニングに関連する当技術における上述の限界および欠陥の少なくともいくつかに対する解決策を提供する。解決策は、ヒト幹細胞由来心筋細胞の成熟化のために使用することができる、羊水から単離された細胞から誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）の発見を前提としている。次いで、これらの成熟心筋細胞は、薬物の心毒性および催不整脈試験のために、ＡＦＣ－ＥＣＭとの細胞構築物において使用され得る。
一態様では、ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞の成熟化のための方法であって、（ａ）ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を提供するステップ；（ｂ）羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）を提供するステップ；（ｃ）未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭをＡＦＣ－ＥＣＭと接触させるステップ；および（ｄ）培養培地中で未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭをＡＦＣ－ＥＣＭと共に培養して、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟化を誘導し、それにより成熟心筋細胞を形成するステップ、を含み、成熟心筋細胞が、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる、方法が開示される。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、図６～１４のうちいずれか１つに示される形態学と同様のまたは同じ形態学を有する。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、ＡＦＣ－ＥＣＭ上にプレーティングされる。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に単層を形成し、それにより、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に成熟心筋細胞の単層を含む細胞構築物を形成し、成熟心筋細胞は、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１を発現しない。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞を含まない。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、成熟心筋細胞よりも少ないミトコンドリアを有すること、無秩序化した筋フィラメントを有すること、円形形状を有すること、および／または単一の核を有することによって特徴付けることができる。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも多い量のミトコンドリアを有すること、構造化された緻密な筋フィラメントを有すること、および／または２つの核を有すること（二核性）によってさらに特徴付けることができる。
別の態様では、羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）上に成熟心筋細胞の単層を含む細胞構築物であって、成熟心筋細胞が、ＡＦＣ－ＥＣＭ培養した、ヒト誘導多能性幹細胞に由来する心筋細胞（ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）であり、成熟心筋細胞が、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる、細胞構築物が開示される。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、図６～１４のうちいずれか１つに示される形態学と同様のまたは同じ形態学を有する。一部の態様では、成熟心筋細胞は、内向き整流Ｋｉｒ２．１カリウムチャネルを含む、および／または内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１を発現する。ある特定の態様では、成熟心筋細胞は、ＡＦＣ－ＥＣＭ上での培養において、ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）から成熟化され得、成熟心筋細胞は、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造（縞模様の外観）を有するロッド状細胞によって特徴付けられる。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の単層は、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される。一部の実施形態では、線維トラック（ｆｉｂｅｒ ｔｒａｃｋ）が、構築物上に存在する。一部の実施形態では、ＡＦＣ－ＥＣＭは、ラミニン、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ－２（ＩＶ）、ならびに／またはそれらのアイソフォームを含む。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）のアイソフォームは、アイソフォーム２である。一部の実施形態では、アグリンのアイソフォームは、アイソフォーム６である。一部の実施形態では、ＡＦＣ－ＥＣＭは、フィブロネクチンおよび／またはそのアイソフォームをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＦＣ－ＥＣＭは、デコリン、ペルレカン、および／またはコラーゲン（ＩＩＩ）を含まない。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞を含まない。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、成熟心筋細胞よりも少ないミトコンドリアを有すること、無秩序化した筋フィラメントを有すること、円形形状を有すること、および／または単一の核を有することによって特徴付けることができる。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも多い量のミトコンドリアを有すること、構造化された緻密な筋フィラメントを有すること、および／または２つの核を有すること（二核性）によってさらに特徴付けることができる。
別の態様では、羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）上に成熟心筋細胞の細胞構築物を作成するための方法であって、（ａ）ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を提供するステップ；（ｂ）羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）を提供するステップ；（ｃ）ＡＦＣ－ＥＣＭ上に未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭをプレーティングするステップ；および（ｄ）培養培地中でＡＦＣ－ＥＣＭ上のプレーティングされた未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭを培養して、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟心筋細胞への成熟化を誘導し、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に成熟心筋細胞の単層を形成し、それにより細胞構築物を形成するステップ、を含み、成熟心筋細胞が、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる、方法が開示される。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、図６～１４のうちいずれか１つに示される形態学と同様のまたは同じ形態学を有する。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の単層は、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される。一部の実施形態では、線維トラックが、細胞構築物上に存在する。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞を含まない。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、成熟心筋細胞よりも少ないミトコンドリアを有すること、無秩序化した筋フィラメントを有すること、円形形状を有すること、および／または単一の核を有することによって特徴付けることができる。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも多い量のミトコンドリアを有すること、構造化された緻密な筋フィラメントを有すること、および／または２つの核を有すること（二核性）によってさらに特徴付けることができる。
別の態様では、薬物化合物の心毒性および／または催不整脈効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するための方法であって、薬物化合物を、本明細書全体で開示する細胞構築物のいずれか１つの成熟心筋細胞と接触させるステップ、ならびに成熟心筋細胞の電気生理学における変化を観察して、薬物化合物が成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有するかどうかを確認するステップ、を含む方法が、開示される。成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、薬物化合物が成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有することを裏付ける。成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、ＡＰＤ延長、ＡＰＤ延長プラスローター、ならびに／または種々の型の不整脈、たとえば、頻脈性不整脈（ＴＡ）、静止状態（ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ）（Ｑ）、遅延後脱分極（ＤＡＤ）、および／もしくは早期後脱分極（ＥＡＤ）を含み得るが、これらに限定されない。観察は、細胞生存度、細胞密度、および／または細胞の形態学もまた含み得る。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、活動電位持続時間（ＡＰＤ）の延長である。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、早期後脱分極（ＥＡＤ）である。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、遅延後脱分極（ＤＡＤ）である。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、活動電位持続時間延長（ＡＰＤ延長）プラスローターである。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、不整脈である。一部の態様では、細胞構築物は、（ａ）ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を提供するステップ；（ｂ）羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）を提供するステップ；（ｃ）ＡＦＣ－ＥＣＭ上に未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭをプレーティングするステップ；および（ｄ）培養培地中でＡＦＣ－ＥＣＭ上のプレーティングされた未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭを培養して、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟心筋細胞への成熟化を誘導し、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に成熟心筋細胞の単層を形成し、それにより細胞構築物を形成するステップ、を含むプロセスによって調製することができ、成熟心筋細胞は、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、図６～１４のうちいずれか１つに示される形態学と同様のまたは同じ形態学を有する。一実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１を発現しない。別の実施形態では、成熟心筋細胞の単層は、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される。別の実施形態では、線維トラックが、細胞構築物上に存在する。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞を含まない。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、成熟心筋細胞よりも少ないミトコンドリアを有すること、無秩序化した筋フィラメントを有すること、円形形状を有すること、および／または単一の核を有することによって特徴付けることができる。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも多い量のミトコンドリアを有すること、構造化された緻密な筋フィラメントを有すること、および／または２つの核を有すること（二核性）によってさらに特徴付けることができる。
また、以下の実施形態１～２０が、本発明に関連して開示される：
実施形態１は、ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞の成熟化のための方法であって、
（ａ）ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を提供するステップ；
（ｂ）羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）を提供するステップ；
（ｃ）未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭをＡＦＣ－ＥＣＭと接触させるステップ；および
（ｄ）培養培地中で未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭをＡＦＣ－ＥＣＭと共に培養して、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟化を誘導し、それにより成熟心筋細胞を形成するステップ
を含み、成熟心筋細胞が、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる、方法である。
実施形態２は、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭが、ＡＦＣ－ＥＣＭ上にプレーティングされる、実施形態１に記載の方法である。
実施形態３は、成熟心筋細胞が、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に単層を形成し、それにより、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に成熟心筋細胞の単層を含む細胞構築物を形成し、成熟心筋細胞が、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される、実施形態１または２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４は、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭが、内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１を発現しない、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５は、羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）上に成熟心筋細胞の単層を含む細胞構築物であって、成熟心筋細胞が、ＡＦＣ－ＥＣＭ培養した、ヒト誘導多能性幹細胞に由来する心筋細胞（ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）であり、成熟心筋細胞が、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる、細胞構築物である。
実施形態６は、成熟心筋細胞の単層が、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される、実施形態５に記載の細胞構築物である。
実施形態７は、線維トラックが構築物上に存在する、実施形態５または６のいずれか１つに記載の細胞構築物である。
実施形態８は、ＡＦＣ－ＥＣＭが、ラミニン、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ－２（ＩＶ）、ならびに／またはそれらのアイソフォームを含む、実施形態５～７のいずれか１つに記載の細胞構築物である。
実施形態９は、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）のアイソフォームが、アイソフォーム２であり、および／またはアグリンのアイソフォームが、アイソフォーム６である、実施形態８に記載の細胞構築物である。
実施形態１０は、ＡＦＣ－ＥＣＭが、フィブロネクチンおよび／またはそのアイソフォームをさらに含む、実施形態８または９のいずれか１つに記載の細胞構築物である。
実施形態１１は、ＡＦＣ－ＥＣＭが、デコリン、ペルレカン、および／またはコラーゲン（ＩＩＩ）を含まない、実施形態５～１０のいずれか１つに記載の細胞構築物である。
実施形態１２は、羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）上に成熟心筋細胞の細胞構築物を作成するための方法であって、
（ａ）ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を提供するステップ、
（ｂ）羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）を提供するステップ；
（ｃ）ＡＦＣ－ＥＣＭ上に未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭをプレーティングするステップ；
（ｄ）培養培地中でＡＦＣ－ＥＣＭ上のプレーティングされた未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭを培養して、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟心筋細胞への成熟化を誘導し、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に成熟心筋細胞の単層を形成し、それにより細胞構築物を形成するステップ
を含み、成熟心筋細胞が、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる、方法である。
実施形態１３は、成熟心筋細胞の単層が、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される、実施形態１２に記載の方法である。
実施形態１４は、線維トラックが細胞構築物上に存在する、実施形態１２または１３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５は、薬物化合物の心毒性および／または催不整脈効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するための方法であって、薬物化合物を、実施形態５～１１に記載の細胞構築物のいずれか１つの成熟心筋細胞と接触させるステップ、ならびに成熟心筋細胞の電気生理学における変化を観察して、薬物化合物が成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有するかどうかを確認するステップ、を含む方法である。
実施形態１６は、成熟心筋細胞の電気生理学における変化が、活動電位持続時間（ＡＰＤ）の延長であり、ＡＰＤの延長が、薬物化合物が成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有することを裏付ける、実施形態１５に記載の方法である。
実施形態１７は、成熟心筋細胞の電気生理学における変化が、早期後脱分極であり、早期後脱分極（ＥＡＤ）が、薬物化合物が成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有することを裏付ける、実施形態１５に記載の方法である。
実施形態１８は、成熟心筋細胞の電気生理学における変化が、遅延後脱分極であり、遅延後脱分極（ＤＡＤ）が、薬物化合物が成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有することを裏付ける、実施形態１５に記載の方法である。
実施形態１９は、成熟心筋細胞の電気生理学における変化が、活動電位持続時間（ＡＰＤ）プラスローターであり、ＡＰＤの延長プラスローターが、薬物化合物が成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有することを裏付ける、実施形態１５に記載の方法である。
実施形態２０は、成熟心筋細胞の電気生理学における変化が、不整脈であり、不整脈が、薬物化合物が成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有することを裏付ける、実施形態１５に記載の方法である。
用語「約」または「ほぼ」は、当業者に理解されるものと近いものとして定義され、１つの非限定的な実施形態では、この用語は１０％以内、好ましくは５％以内、より好ましくは１％以内、最も好ましくは０．５％以内であると定義される。
用語「実質的に」およびその変形形態は、１０％以内、５％以内、１％以内、または０．５％以内の範囲を含むと定義される。
本明細書で使用される場合、用語「％ｗ／ｗ」または「ｗｔ．％」は、成分を含む材料（たとえば、組成物）の総重量に基づく成分の重量パーセントを意味する。非限定的な例では、組成物１００グラム中の成分１０グラムは、組成物の総重量中１０％ｗ／ｗの成分である。本明細書で使用される場合、用語「％ｖ／ｖ」または「ｖｏｌ．％」は、成分を含む材料（たとえば、組成物）の総体積に基づく成分の体積パーセントを意味する。非限定的な例では、組成物１００ｍＬ中の成分１０ｍＬは、組成物の総体積中１０％ｖ／ｖの成分である。本明細書で使用される場合、用語「％ｗ／ｖ」は、成分を含む材料（たとえば、組成物）の総体積に基づく成分の重量パーセントを意味する。非限定的な例では、組成物１００ｍＬ中の成分１０グラムは、組成物の総体積中１０％ｗ／ｖの成分である。本明細書で使用される場合、用語「％ｖ／ｗ」は、成分を含む材料（たとえば、組成物）の総重量に基づく成分の体積パーセントを意味する。非限定的な例では、組成物１００グラム中の成分１０ｍＬは、組成物の総重量中１０％ｖ／ｗの成分である。
用語「阻害する」もしくは「低減する」もしくは「防止する」もしくは「回避する」、またはこれらの用語の任意の変形形態は、特許請求の範囲および／または明細書中で使用される場合には、所望の結果を達成するための任意の測定可能な低減または完全な阻害を含む。
用語「有効な」は、その用語が明細書および／または特許請求の範囲で使用される場合には、所望の、期待した、または意図した結果を達成するために適切であることを意味する。
単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」等の任意の形のｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」等の任意の形のｈａｖｉｎｇ）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」等の任意の形のｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」等の任意の形のｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）は包括的またはオープンエンドであり、言及していないさらなる要素または方法ステップを排除しない。
単語「１つの（「ａ」または「ａｎ」）」の使用は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（またはこれらの単語の任意の変形形態）と併せて使用される場合、「１つの（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」、および「１つまたは２つ以上の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ）」の意味とも一致する。
組成物およびその使用のための方法は、本明細書全体で開示する成分またはステップのいずれか「を含み」、「本質的にそれらからなり」、または「それらからなる」ことができる。遷移的な語句「本質的に～からなる」に関して、非限定的な一態様では、本明細書で開示される細胞構築物の基礎的で新規な特徴は、幹細胞に由来する心筋細胞を、成熟天然成人心筋細胞および天然の心臓組織のものと似た成熟化状態へと成熟化させるそれらの能力に起因した、薬物化合物の心毒性および／または催不整脈スクリーニング試験におけるそれらの使用である。
本明細書で論じるいずれの実施形態も、本発明のいずれの方法または組成物に関しても実施可能であり、逆もそうであることが意図されている。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために用いることができる。
本発明のその他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示しているが、説明のためのみに提供していることを理解されたい。それは、本発明の精神および範囲内で種々の変形および改変がこの詳細な説明から当業者には明らかになるからである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞の成熟化のための方法であって、
（ａ）ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を提供するステップ；
（ｂ）羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）を提供するステップ；
（ｃ）前記未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭを前記ＡＦＣ－ＥＣＭと接触させるステップ；および
（ｄ）培養培地中で前記未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭを前記ＡＦＣ－ＥＣＭと共に培養して、前記未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟化を誘導し、それにより成熟心筋細胞を形成するステップ；
を含み、前記成熟心筋細胞が、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる、方法。
(項目２)
前記未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭが、前記ＡＦＣ－ＥＣＭ上にプレーティングされる、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記成熟心筋細胞が、前記ＡＦＣ－ＥＣＭ上に単層を形成し、それにより、前記ＡＦＣ－ＥＣＭ上に成熟心筋細胞の単層を含む細胞構築物を形成し、前記成熟心筋細胞が、前記ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される、項目１または２のいずれか一項に記載の方法。
(項目４)
前記未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭが、内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１を発現しない、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
(項目５)
羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）上に成熟心筋細胞の単層を含む細胞構築物であって、前記成熟心筋細胞が、ＡＦＣ－ＥＣＭ培養した、ヒト誘導多能性幹細胞に由来する心筋細胞（ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）であり、前記成熟心筋細胞が、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる、細胞構築物。
(項目６)
成熟心筋細胞の前記単層が、前記ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される、項目５に記載の細胞構築物。
(項目７)
線維トラックが前記構築物上に存在する、項目５または６のいずれか一項に記載の細胞構築物。
(項目８)
前記ＡＦＣ－ＥＣＭが、ラミニン、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ－２（ＩＶ）、ならびに／またはそれらのアイソフォームを含む、項目５から７のいずれか一項に記載の細胞構築物。
(項目９)
前記コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）のアイソフォームが、アイソフォーム２であり、および／または前記アグリンのアイソフォームが、アイソフォーム６である、項目８に記載の細胞構築物。
(項目１０)
前記ＡＦＣ－ＥＣＭが、フィブロネクチンおよび／またはそのアイソフォームをさらに含む、項目８または９のいずれか一項に記載の細胞構築物。
(項目１１)
前記ＡＦＣ－ＥＣＭが、デコリン、ペルレカン、および／またはコラーゲン（ＩＩＩ）を含まない、項目５から１０のいずれか一項に記載の細胞構築物。
(項目１２)
羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）上に成熟心筋細胞の細胞構築物を作成するための方法であって、
（ａ）ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を提供するステップ、
（ｂ）羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）を提供するステップ；
（ｃ）前記ＡＦＣ－ＥＣＭ上に前記未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭをプレーティングするステップ；
（ｄ）培養培地中で前記ＡＦＣ－ＥＣＭ上にプレーティングされた前記未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭを培養して、前記未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟心筋細胞への成熟化を誘導し、前記ＡＦＣ－ＥＣＭ上に前記成熟心筋細胞の単層を形成し、それにより前記細胞構築物を形成するステップ；
を含み、前記成熟心筋細胞が、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる、方法。
(項目１３)
成熟心筋細胞の前記単層が、前記ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される、項目１２に記載の方法。
(項目１４)
線維トラックが前記細胞構築物上に存在する、項目１２または１３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５)
薬物化合物の心毒性および／または催不整脈効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するための方法であって、前記薬物化合物を、項目５から１１のいずれか１つに記載の細胞構築物の前記成熟心筋細胞と接触させるステップ、ならびに前記成熟心筋細胞の電気生理学における変化を観察して、前記薬物化合物が前記成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有するかどうかを確認するステップ、を含む方法。
(項目１６)
前記成熟心筋細胞の電気生理学における前記変化が、活動電位持続時間（ＡＰＤ）の延長であり、ＡＰＤの延長が、前記薬物化合物が前記成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有することを裏付ける、項目１５に記載の方法。
(項目１７)
前記成熟心筋細胞の電気生理学における前記変化が、早期後脱分極（ＥＡＤ）であり、早期後脱分極（ＥＡＤ）が、前記薬物化合物が前記成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有することを裏付ける、項目１５に記載の方法。
(項目１８)
前記成熟心筋細胞の電気生理学における前記変化が、遅延後脱分極（ＤＡＤ）であり、遅延後脱分極（ＤＡＤ）が、前記薬物化合物が前記成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有することを裏付ける、項目１５に記載の方法。
(項目１９)
前記成熟心筋細胞の電気生理学における前記変化が、活動電位持続時間（ＡＰＤ）プラスローターであり、ＡＰＤの延長プラスローターが、前記薬物化合物が前記成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有することを裏付ける、項目１５に記載の方法。
(項目２０)
前記成熟心筋細胞の電気生理学における前記変化が、不整脈であり、前記不整脈が、前記薬物化合物が前記成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有することを裏付ける、項目１５に記載の方法。
図１は、１０倍の対物レンズを用いる倍率１００倍における羊水細胞由来ＥＣＭの明視野画像の顕微鏡写真である。
図２は、トポグラフィー、接着、および剛性を示す、羊水細胞由来ＥＣＭおよび骨髄細胞由来ＥＣＭの３つの代表的な４０×４０μｍの切片の原子間力顕微鏡写真である。
図３は、骨髄細胞由来および羊水細胞由来のＥＣＭの接着および剛性（弾性モジュラス）の定量を示す散布図である。それぞれの点は独立の測定点を表す。
図４は、羊水細胞由来ＥＣＭおよび骨髄細胞由来ＥＣＭの上におけるｉＰＳＣの０日目および２日目の培養を示す顕微鏡写真である。
図５は、羊水細胞由来ＥＣＭおよび骨髄細胞由来ＥＣＭの存在下で培養したｉＰＳＣの成長曲線のプロットである。
図６は、単一のウェル中のＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の顕微鏡写真 － ３．１３ｍｍ２である。
図７は、単一のウェル中のＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の顕微鏡写真 － ２．１５ｍｍ２である。
図８は、単一のウェル中のＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の顕微鏡写真 － １．４６ｍｍ２である。
図９は、単一のウェル中のＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の顕微鏡写真 － ０．５４ｍｍ２である。
図１０は、単一のウェル中のＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の顕微鏡写真 － ０．５４ｍｍ２である。
図１１は、単一のウェル中のＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の顕微鏡写真 － ０．５４ｍｍ２である。
図１２は、単一のウェル中のＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の顕微鏡写真 － ０．５４ｍｍ２である。
図１３は、単一のウェル中のＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の顕微鏡写真 － ０．１３ｍｍ２である。
図１４は、単一のウェル中のＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の顕微鏡写真 － ０．０４ｍｍ２である。
図１５は、単一のウェル中の標準的なＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上の心筋細胞の顕微鏡写真 － ３．１３ｍｍ２である。
図１６は、単一のウェル中の標準的なＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上の心筋細胞の顕微鏡写真 － ２．１５ｍｍ２である。
図１７は、単一のウェル中の標準的なＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上の心筋細胞の顕微鏡写真 － １．４６ｍｍ２である。
図１８は、単一のウェル中の標準的なＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上の心筋細胞の顕微鏡写真 － ０．５４ｍｍ２である。
図１９は、単一のウェル中の標準的なＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上の心筋細胞の顕微鏡写真 － ０．１３ｍｍ２である。
図２０は、単一のウェル中のＢＭ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の顕微鏡写真 － ２．１５ｍｍ２である。
図２１は、単一のウェル中のＢＭ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の顕微鏡写真 － １．４６ｍｍ２である。
図２２は、マルチウェルプレート中のＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞を使用して活動電位またはカルシウムの一過的測定を記録するための機器の構成の概略図である。
図２３は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ、ＢＭ－ＥＣＭ、およびＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養した心筋細胞から記録された、ベースラインのおよび薬物Ｅ４０３１後の自発的活動電位の記録である。 同上。
図２４は、薬物Ｅ４０３１との接触後の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ、ＢＭ－ＥＣＭ、およびＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養した心筋細胞からの安定なローター（ＴｄＰ様不整脈）の数の棒グラフである。
図２５は、種々の薬物についての、ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養した成熟心筋細胞から記録された自発的活動電位の記録である。
図２６は、列挙した薬物の各々の全ての用量について記録された全ての不整脈の棒グラフである。
図２７は、列挙した薬物の各々の１０×有効治療血漿濃度（ＥＴＰＣ）における不整脈を有するウェルの％の棒グラフである。
図２８は、列挙した薬物の各々の、時間（ミリ秒）での活動電位トライアンギュレーション（ＡＰＤ９０－ＡＰＤ３０）の棒グラフである。
図２９は、ＡＦＣ－ＥＣＭ（ＳＢＳ－ＡＦマトリックス） 対 Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上の心筋細胞の心筋細胞性能を比較する、列挙した薬物の一部の各々の、時間（ミリ秒）での活動電位トライアンギュレーション（ＡＰＤ９０－ＡＰＤ３０）の棒グラフである。
図３０は、列挙した薬物の任意の濃度での、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤｙｎａｍｉｃｓからのｉＣｅｌｌ（登録商標）ｈｉＰＳＣ－ＣＭ（白丸） 対 ＮｃａｒｄｉａからのＣｏｒ．４Ｕ（登録商標）ｈｉＰＳＣ－ＣＭ（黒丸）の心筋細胞性能を比較する、列挙した薬物の薬物誘導活動電位最大トライアンギュレーションの棒グラフである。Ｂｌｉｎｏｖａ ｅｔ ａｌ， ２０１８， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓからの図。
図３１は、トロポニンＩについての免疫蛍光染色を用い、核をマークするためにＤＡＰＩを使用した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭの顕微鏡写真である。
図３２は、α－アクチニンについての免疫蛍光染色を用い、核をマークするためにＤＡＰＩを使用した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭの顕微鏡写真である。
図３３は、ｃＴｎＴおよびＮカドヘリンについての免疫蛍光染色を用い、核をマークするためにＤＡＰＩを使用した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭの顕微鏡写真である。
図３４は、ｃＴｎＴについての免疫蛍光染色を用い、核をマークするためにＤＡＰＩを使用した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養した単一のｈｉＰＳＣ－ＣＭ細胞の顕微鏡写真である。
図３５は、α－アクチニンについての免疫蛍光染色を用い、核をマークするためにＤＡＰＩを使用した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養した単一のｈｉＰＳＣ－ＣＭ細胞の顕微鏡写真である。
図３６は、図３５に示される単一の細胞の細胞円形度の比較のグラフである。
図３７は、ｃＴｎＩ発現についての免疫蛍光染色を用い、核をマークするためにＤＡＰＩを使用した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭの顕微鏡写真である。
図３８は、ｃＴｎＩ発現およびＧＡＰＤＨについてのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭおよびＡＦＣ－ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭのウエスタンブロッティングである。
図３９は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭの、ＧＡＰＤＨと比較したｃＴｎＩ発現のグラフである。
図４０は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄでミトコンドリアについて染色した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭの顕微鏡写真である。
図４１は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭについてのＭｉｔｏＴｒａｋｅｒ（商標）Ｒｅｄ蛍光強度／心筋細胞を示すグラフである。
図４２は、微小電極アレイ（ＭＥＡ）プレート上にコーティングしたＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭおよびＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭの顕微鏡写真（透過光）である。
羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）上での培養において成熟化されたヒト幹細胞由来心筋細胞、たとえば、ヒト誘導多能性幹細胞に由来するもの（ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）は、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ、または他のＥＣＭ、たとえば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭおよび骨髄細胞由来のＥＣＭ上で成熟化させたｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも、より良い、より一貫した心毒性および催不整脈アッセイ結果を実証している。ＡＦＣ－ＥＣＭ上で成熟化させたｈｉＰＳＣ－ＣＭは、正常成人ヒト心組織の心筋細胞において見出されるそれらの細胞形態学およびサルコメア構造によって示されるように、他のＥＣＭ、たとえばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上で、およびさらには他の天然の細胞由来のＥＣＭ、たとえば骨髄細胞由来のＥＣＭ上で成熟化させたｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも、成熟化のより高い状態を驚くべきことに実証している。さらに、ウエスタンブロッティング手法によって実証されるような、ｃＴｎＩ（心筋トロポニンＩ）タンパク質のよりロバストな発現は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも、ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭについて見られた。また、ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも、より多くのミトコンドリア、およびより分極した内膜電位を有するミトコンドリアを有する。したがって、ＡＦＣ－ＥＭＣは、ｈｉＰＳＣ－ＣＭにおけるミトコンドリア生合成、成熟化、および機能を刺激することができる。正常成人または成熟ヒト心ヒト組織は、サルコメア構造（縞模様の外観）を有するロッド状細胞によって特徴付けられる。心筋細胞の形態学およびサルコメア構造は、顕微鏡（透過光、または免疫蛍光染色による）によって視覚的に同定することができる。非限定的な例として、ＡＦＣ－ＥＣＭ上で成熟化した心筋細胞の形態学およびサルコメア構造は、図１４の顕微鏡写真中の矢印によって同定される縞模様の外観を有するロッド状細胞の存在によって、はっきりと見ることができる。さらに、ＰＤＭＳなどのシリコーン基材の使用は、これらの結果を達成するために必要とされなかった。驚くべきことに、ＡＦＣ－ＥＣＭおよびＡＦＣ－ＥＣＭ上での培養において未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭから成熟化された成熟心筋細胞の単層を含む細胞構築物は、たとえば、ハイスループットｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイにおいて、トルサードドポアント（ＴｄＰ）などの薬物誘導不整脈の一貫した可視化を可能にすることによって、有用であることが示されている。この「ディッシュにおけるＴｄＰ」技術は、薬物誘導ＴｄＰの代理マーカーとして、電場電位持続時間（ＭＥＡ技術）または活動電位持続時間延長に依存することを越えた大きな進歩である。したがって、本明細書で開示される細胞構築物および方法は、催不整脈の間接的な指標である単純な分極および脱分極事象ではなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおける不整脈事象の可視化を可能にするより包括的かつ予測的なｉｎ ｖｉｔｒｏ不整脈アッセイを開発することによって、現行のＣｉＰＡ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅのガイドラインに勝っている。本開示において概説される細胞システムおよび方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト心単層モデルシステムにおいて、不整脈事象が伝播および可視化されるのを可能にする。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞を含まない。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、成熟心筋細胞よりも少ないミトコンドリアを有すること、無秩序化した筋フィラメントを有すること、円形形状を有すること、および／または単一の核を有することによって特徴付けることができる。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、区別できるサルコメア構造（縞模様の外観）を有するロッド状細胞を有することによって特徴付けることができる。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも多い量のミトコンドリアを有すること、構造化された緻密な筋フィラメントを有すること、および／または２つの核を有すること（二核性）によってさらに特徴付けることができる。
培養中でのヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）の成熟化のために、細胞由来の、羊水から単離された細胞からｉｎ－ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）を使用して、成熟心筋細胞（成熟ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を形成する方法が、本明細書で開示される。薬物化合物の心毒性および／または催不整脈スクリーニングアッセイのために有用なＡＦＣ－ＥＣＭ上のこれらの成熟心筋細胞の単層を含む細胞構築物もまた、本明細書で開示される。かかる細胞構築物を使用して薬物化合物の心毒性および／または催不整脈効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するための方法もまた、本明細書で開示される。
Ａ．羊水細胞由来細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）
周産期の細胞は３つの群、即ち羊水からの細胞、胎盤からの細胞、および臍帯からの細胞に分けることができる。羊水は、胎児の羊膜、皮膚、ならびに消化管、呼吸器官、および尿生殖器官から剥れた発育中の胎児由来の細胞を含むいくつかの細胞源を有している。胎盤も、膜シート（羊膜および絨毛膜）、絨毛、および血液を含むいくつかの細胞源を有している。臍帯細胞は一般に２つの細胞源、即ち臍帯血およびＷｈａｒｔｏｎのジェリーから来る。これら３つの周産期細胞源からの細胞は、幹細胞を含み得る。本発明の羊水細胞由来ＥＣＭを産生するために用いられる細胞は、ヒト（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、マウス、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、または霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳動物の羊水から得られる。好ましい実施形態では、細胞はヒトの羊水からのものである。羊水は満期産（妊娠期間約３７週超）、または早期産（妊娠期間約３７週未満）のヒトから供給を受けることができる。早期産は、後期早期産（妊娠期間約３３週～約３７週）、中期早期産（妊娠期間約２９週～約３３週）、および極早期産（妊娠期間約２３週～約２９週）を含む。羊水は羊水が存在する任意の妊娠期間で出生の前にヒトから供給を受けることができ、出生の際の羊水の供給源と合わせることができる。一般には、出生に先立って羊水穿刺の術式によって羊水を収集する。一部の実施形態では、羊水は満期産、早期産、後期早期産、中期早期産、極早期産において、もしくは出生前に、またはそれらの組合せで、ヒトから供給を受ける。一部の実施形態では、羊水は出生前に供給を受け、妊娠期間約１０週から出生まで、または妊娠期間約１０週から約２３週まで、または妊娠期間約１０週から約１６週まで、または妊娠期間約１２週から出生まで、または妊娠期間約１２週から約２３週まで、または妊娠期間約１２週から約１６週まで、収集する。一部の実施形態では、出生前に供給を受ける羊水は、羊水穿刺の手順によって収集する。細胞は当技術で公知の手法、たとえばＭｕｒｐｈｙ ｅｔ． ａｌ．， Ａｍｎｉｏｔｉｃ Ｆｌｕｉｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｐｅｒｉｎａｔａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ． ２０１３に開示された手法によって羊水から得られ、単離され得る。
羊水は、自発的に、または当業者には公知の特定の成長因子もしくは成長因子の組合せによる処置の結果として、３つの胚葉（外胚葉、内胚葉、中胚葉）の全てから誘導される細胞型に分化する能力を有する細胞を含む。即ち、単一の細胞が、３つの胚葉のいずれかに特異的な遺伝子を発現するように誘導される能力を有している。羊水はまた、胎児の羊膜、皮膚、ならびに消化管、呼吸器官、および尿生殖器官から剥れた発育中の胎児由来の細胞を含む異なる細胞型の混合物を含む。羊水および胎盤膜の起源により、これらの細胞は高度に多能性の分化の可能性を維持し、３つの胚葉全ての細胞を含む細胞集団を含むことができる。羊水細胞は幹細胞を含み得る。一部の実施形態では、羊水細胞は単離された幹細胞である。一部の実施形態では、羊水細胞は３つの胚葉（外胚葉、内胚葉、中胚葉）の全てから誘導される細胞型および／または多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）および／または多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）に分化する能力を有する幹細胞を含む。
本明細書で開示される羊水細胞由来のＥＣＭは、種々のタンパク質を含み得る。ＥＣＭのタンパク質は質量分析および免疫組織化学染色を含む当技術で公知の手法によって同定することができる。ＥＣＭは、表２（以下の実施例１を参照）に列挙した成分およびそれらの任意のバリアント、誘導体、またはアイソフォームを含み得るが、これらに限定されない。羊水細胞由来ＥＣＭは、表２の成分のいずれかおよびそれらの任意のバリアント、誘導体、またはアイソフォームの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、組合せは、ラミニン、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ－２（ＩＶ）、ならびに／またはそれらのアイソフォームを含み、それらから本質的になり、またはそれらからなり得る。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）のアイソフォームはアイソフォーム２である。一部の実施形態では、アグリンのアイソフォームはアイソフォーム６である。一部の実施形態では、細胞由来ＥＣＭは、フィブロネクチンおよび／またはそのアイソフォームをさらに含み、それらから本質的になり、またはそれらからなる。一部の実施形態では、羊水細胞由来ＥＣＭは、デコリン、ペルレカン、およびコラーゲン（ＩＩＩ）のうちいずれか１つまたはその全てを含まない。本発明の羊水細胞由来ＥＣＭと骨髄細胞由来マトリックスのタンパク質の間のいくつかの注目すべき相違を、表１に記載している。
表１
羊水細胞由来のＥＣＭ（ＡＦＣマトリックス）と骨髄細胞由来のマトリックス（ＢＭマトリックス）との相違
羊水細胞由来のＥＣＭは、以下のプロセスによって産生され得る：
（ａ）羊水から細胞を単離する、
（ｂ）単離した細胞を、細胞培養容器または基質でコーティングした細胞培養容器に播種する、
（ｃ）培養培地を細胞培養容器に添加する、および
（ｄ）細胞を培養し、それにより細胞由来ＥＣＭを産生する、および
（ｅ）必要に応じて細胞由来ＥＣＭを脱細胞する。
細胞が直ちにまたは培養のある期間の後にコンフルエントな単層を形成することを可能にする任意の細胞播種密度を用いてよい。一部の実施形態では、播種密度は約１０細胞／ｃｍ２～約１００，０００細胞／ｃｍ２、または約１００細胞／ｃｍ２～約７５，０００細胞／ｃｍ２、または約５００細胞／ｃｍ２～約５０，０００細胞／ｃｍ２、または約５００細胞／ｃｍ２～約１０，０００細胞／ｃｍ２、または約５００細胞／ｃｍ２～約５，０００細胞／ｃｍ２、または約５００細胞／ｃｍ２～約２，５００細胞／ｃｍ２、または約１，０００細胞／ｃｍ２～約２５，０００細胞／ｃｍ２、または約２，０００細胞／ｃｍ２～約１０，０００細胞／ｃｍ２、または約３，０００細胞／ｃｍ２～約５，０００細胞／ｃｍ２である。
本発明のため、細胞の培養に適した任意の型の容器を用いることができる。その例は細胞培養フラスコ、Ｔフラスコ、撹拌フラスコ、回転フラスコ、発酵器、およびバイオリアクターを含むが、これらに限定されない。揺動ボトル、振盪フラスコ、チューブ、およびその他の容器も、揺動プラットフォームまたは振盪器の上に設置する場合には好適な容器である。細胞培養容器は、細胞の接着を改良するために基質でコーティングすることができる。細胞容器をコーティングするための好適な基質の非限定的な例は、フィブロネクチンである。
種々の市販の細胞培養用培地、たとえばアルファ最小基本培地（α－ＭＥＭ）培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が羊水細胞の培養のために好適である。種々の補助的な物質、たとえば重炭酸ナトリウム、Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、および／または血清を培地に添加することによって、市販の培養培地を改質することができる。血清はウシ胎児血清であってよい。培地は無血清であってもよい。さらに、ＥＣＭにおける細胞の産生を誘導するために、Ｌ－アスコルビン酸等の物質を培地または改質した培地に添加することができる。
当初の培養培地を培養プロセスの間の種々の時間で別の培地に交換および／または置き換えることができる。たとえば、当初の培地は「完全培地」であり、次いで培養プロセスの間に「誘導培地」に置き換えることができる。「完全培地」の非限定的な例は、（α－ＭＥＭ）プラス２ｍＭのＬ－グルタミンプラス抗生剤－抗真菌剤プラス１５％のウシ胎児血清を含む。「誘導培地」の非限定的な例は、「完全培地」プラス５０ｍＭのＬ－アスコルビン酸を含む。
羊水細胞の培養はインキュベーター中３７℃で、５％のＣＯ２および９０％の湿度で行なうことができる。培養は、正常酸素、即ち大気中２０～２１％の酸素中、または低酸素条件を含むが、これらに限定されない種々の環境条件下で行なうことができる。
羊水細胞の羊水細胞由来ＥＣＭの脱細胞は、生きている羊水細胞の除去または羊水細胞の非生存化を含み得る。羊水細胞は、羊水細胞を溶解し、次いで溶解した羊水細胞を洗浄によって除去することを含み得るが、これらに限定されない当技術で公知の方法を用いてＥＣＭから脱細胞することができる。ＥＣＭから羊水細胞を除去するために種々の物質を用いることができる。非限定的な例は、ＰＢＳ緩衝剤中にＴＲＩＴＯＮ（登録商標） Ｘ－１００および水酸化アンモニウムを含む「抽出緩衝剤」を含む。羊水細胞からＥＣＭが脱細胞された後、得られるＥＣＭは実質的に細胞を含まず、または生きている羊水細胞を含まない。フィーダー細胞を用いる場合には、脱細胞法はＥＣＭ上に存在するいずれの生きているフィーダー細胞にも適用され、したがってＥＣＭは生きているフィーダー細胞を実質的に含まないか、または含まない。脱細胞法はＥＣＭ上に存在するいずれの生きている細胞にも適用され、したがってＥＣＭはいずれの生きている細胞も実質的に含まないか、または含まない。したがって、脱細胞されたＥＣＭはＥＣＭが無細胞であることを意味し、ＥＣＭがいずれの生きている細胞をも含まないことを意味する。
一部の実施形態では、羊水細胞由来ＥＣＭ（ＡＦＣ－ＥＣＭ）は三次元（３Ｄ）ＥＣＭである。
上記の方法は、臍帯血およびＷｈａｒｔｏｎのジェリーを含む臍帯からの細胞、ならびに膜シート（羊膜および絨毛膜）、絨毛、および血液を含む胎盤組織からの細胞等の他の周産期細胞からの細胞由来ＥＣＭの産生にも適用される。
一実施形態では、周産期細胞由来ＥＣＭは以下のプロセスによって産生される。
（ａ）臍帯から細胞を単離する、
（ｂ）単離した細胞を、細胞培養容器または基質でコーティングした細胞培養容器に播種する、
（ｃ）培養培地を細胞培養容器に添加する、および
（ｄ）細胞を培養し、それにより細胞由来ＥＣＭを産生する、および
（ｅ）必要に応じて細胞由来ＥＣＭを脱細胞する。
一部の実施形態では、臍帯から単離された細胞は臍帯血および／またはＷｈａｒｔｏｎのジェリーからのものである。
別の実施形態では、周産期細胞由来のＥＣＭは、以下のプロセスによって産生される：
（ａ）胎盤組織から細胞を単離する、
（ｂ）単離した細胞を、細胞培養容器または基質でコーティングした細胞培養容器に播種する、
（ｃ）培養培地を細胞培養容器に添加する、および
（ｄ）細胞を培養し、それにより細胞由来ＥＣＭを産生する、および
（ｅ）必要に応じて細胞由来ＥＣＭを脱細胞する。
一部の実施形態では、胎盤組織から単離された細胞は、膜シート（羊膜および／または絨毛膜）、絨毛、および／または血液からのものである。
一態様では、臍帯から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞由来の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が開示される。一部の実施形態では、臍帯から単離された細胞は、臍帯血および／またはＷｈａｒｔｏｎのジェリーからのものである。
別の態様では、胎盤組織から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞由来の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が開示される。一部の実施形態では、胎盤組織から単離された細胞は、膜シート（羊膜および／または絨毛膜）、絨毛、および／または血液からのものである。
Ｂ．未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟化のための細胞構築物および方法
ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞の成熟化のための方法であって、（ａ）ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を提供するステップ；（ｂ）羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）を提供するステップ；（ｃ）未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭをＡＦＣ－ＥＣＭと接触させるステップ；および（ｄ）培養培地中で未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭをＡＦＣ－ＥＣＭと共に培養して、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟化を誘導し、それにより成熟心筋細胞（成熟ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を形成するステップ、を含み、成熟心筋細胞が、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる、方法が、本明細書で開示される。正常成人ヒト心ヒト組織は、サルコメア構造（縞模様の外観）を有するロッド状細胞によって特徴付けられる。心筋細胞の形態学およびサルコメア構造は、顕微鏡によって視覚的に同定することができる。非限定的な例として、ＡＦＣ－ＥＣＭ上で成熟化した心筋細胞の形態学およびサルコメア構造は、図１４の顕微鏡写真中の矢印によって同定される縞模様の外観を有するロッド状細胞の存在によって、はっきりと見ることができる。
羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）上の成熟心筋細胞の単層を含む細胞構築物であって、成熟心筋細胞が、ＡＦＣ－ＥＣＭ培養した、ヒト誘導多能性幹細胞に由来する心筋細胞（ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）であり、成熟心筋細胞が、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる、細胞構築物もまた、本明細書で開示される。ある特定の態様では、成熟心筋細胞は、ＡＦＣ－ＥＣＭ上での培養において、ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）から成熟化され得、成熟心筋細胞は、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる。一部の態様では、成熟心筋細胞は、内向き整流Ｋｉｒ２．１カリウムチャネルを含む、および／または内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１を発現する。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の単層は、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される。一部の実施形態では、線維トラックが、構築物上に存在する。一部の実施形態では、ＡＦＣ－ＥＣＭは、ラミニン、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ－２（ＩＶ）、ならびに／またはそれらのアイソフォームを含む。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）のアイソフォームは、アイソフォーム２であり、および／またはアグリンのアイソフォームは、アイソフォーム６である。一部の実施形態では、ＡＦＣ－ＥＣＭは、フィブロネクチンおよび／またはそのアイソフォームをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＦＣ－ＥＣＭは、デコリン、ペルレカン、および／またはコラーゲン（ＩＩＩ）を含まない。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞を含まない。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、成熟心筋細胞よりも少ないミトコンドリアを有すること、無秩序化した筋フィラメントを有すること、円形形状を有すること、および／または単一の核を有することによって特徴付けることができる。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも多い量のミトコンドリアを有すること、構造化された緻密な筋フィラメントを有すること、および／または２つの核を有すること（二核性）によってさらに特徴付けることができる。
羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）上の成熟心筋細胞を含む細胞構築物の調製のための方法であって、（ａ）ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を提供するステップ、（ｂ）羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）を提供するステップ；（ｃ）ＡＦＣ－ＥＣＭ上に未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭをプレーティングするステップ；および（ｄ）培養培地中でＡＦＣ－ＥＣＭ上のプレーティングされた未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭを培養して、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟心筋細胞への成熟化を誘導し、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に成熟心筋細胞の単層を形成し、それにより細胞構築物を形成するステップ、を含み、成熟心筋細胞が、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる、方法もまた、本明細書で開示される。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の単層は、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される。一部の実施形態では、線維トラックが、構築物上に存在する。
未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ－ＦＵＪＩなどの商業的供給源から、商品名ｉＣｅｌｌ（登録商標）の下で、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏなどの商業的供給源から、商品名Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）の下で得ることができる。ｉＣｅｌｌ（登録商標）Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ、ｉＣｅｌｌ（登録商標）Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ２、およびＣｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓは、バイアル中で入手可能なヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する凍結保存された生きている心筋細胞である。未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、特定の個体のために実験室設定において患者特異的ｈｉＰＳＣから生成することもできる。この場合、ｈｉＰＳＣの分化は、７日間の分化期間の間の種々の日におけるＧＳＫ３阻害剤、ＲＰＭＩ／Ｂ２７マイナスインスリン、Ｗｎｔ阻害剤およびＲＰＭＩ／Ｂ２７プラスインスリンを使用して、８～１０日目までに、拍動する心筋細胞を得るための小分子プロトコールを使用して達成され得る。未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭを生成するための方法の好適な非限定的な例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０３２９８２５号に開示されている。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１を発現しない。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞を含まない。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、成熟心筋細胞よりも少ないミトコンドリアを有すること、無秩序化した筋フィラメントを有すること、円形形状を有すること、および／または単一の核を有することによって特徴付けることができる。
ＡＦＣ－ＥＣＭは、本開示において本明細書で開示される産生方法を使用して得ることができ、本開示に記載される特徴を有し得る。一部の実施形態では、ＡＦＣ－ＥＣＭは、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭとの接触前に脱細胞される。
未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、ＡＦＣ－ＥＣＭと接触しているときには、懸濁液中にあり得、あるいは細胞は、好適な細胞培養容器中もしくはその上で、またはマルチウェルプレート中で、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に直接プレーティングされ得る。好適なマルチウェルプレートの非限定的な例は、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェルおよび３８４ウェルプレートを含む。一部の実施形態では、細胞培養容器またはマルチウェルプレートの接触表面は、ＡＦＣ－ＥＣＭの形成前にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）でコーティングされる。一部の実施形態では、細胞培養容器またはマルチウェルプレートの接触表面は、ＡＦＣ－ＥＣＭの形成前にＰＤＭＳでコーティングされない。任意の細胞播種密度の未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭを使用することができる。一部の実施形態では、細胞が直ちにまたは培養のある期間の後にコンフルエントな単層を形成することを可能にする未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの細胞播種密度を使用する。細胞密度は、単層形成を改善するために、所望により改変され得る。マルチウェルプレートでは、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ細胞は、各ウェルの中央に設置される。種々のマルチウェルプレートにおける未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの細胞播種密度の非限定的な例は、以下の通りである：６ウェルプレートでは、約２００，０００細胞が、１ウェル当たりプレーティングされ得る；１２ウェルプレートでは、約１５０，０００細胞が、１ウェル当たりプレーティングされ得る；２４ウェルプレートでは、約１７５，０００細胞が、１ウェル当たりプレーティングされ得る；４８ウェルプレートでは、約１００，０００細胞が、１ウェル当たりプレーティングされ得る；９６ウェルプレートでは、約５０，０００細胞が、１ウェル当たりプレーティングされ得る；３８４ウェルプレートでは、約１５，０００細胞が、１ウェル当たりプレーティングされ得る。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの細胞播種密度は、９６ウェルプレートでは、１ウェル当たり約５０，０００細胞である。一部の実施形態では、細胞播種密度は、６ウェルプレートでは、１ウェル当たり約２００，０００細胞である。未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟化を誘導するために、好適な培養培地、たとえば、ＲＰＭＩ培地またはＭｅｄｉａ １９９培地が、ＡＦＣ－ＥＣＭと接触した未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭに添加され、細胞は、細胞が天然の成人心筋細胞と同様の形態学を有する成熟心筋細胞へと成熟するまで、ある期間、一般には７日間にわたって、標準的な細胞培養手法を使用してＡＦＣ－ＥＣＭと共に培養される。最初の３～４日間の間、未熟なｈｉＰＣＳ－ＣＭは、接着性であり、連続した単層を形成し、成熟化プロセスを開始している。驚くべきことに、心筋細胞の成熟化のための期間は、７日間またはそれ未満かかり得るが、一般に、たとえば、１００日間までのずっと長い期間が、他の基材で典型的である。これらの成熟心筋細胞の形態学は、従来の光学顕微鏡手法を使用して可視化することができる、筋肉の基礎的収縮単位である区別できるサルコメア構造（縞模様の外観）を有するロッド状細胞によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも多い量のミトコンドリアを有すること、構造化された緻密な筋フィラメントを有すること、および／または２つの核を有すること（二核性）によってさらに特徴付けることができる。また、ＡＦＣ－ＥＣＭは、成熟心筋細胞が従う線維トラックを天然に産生できる。これは、天然の心臓をより密接に模倣する単層に、ある程度の異方性を生じる。したがって、心筋細胞は、ＡＦＣ－ＥＣＭの形成の間に羊水細胞によって天然の異方的構成で定められたＡＦＣ－ＥＣＭの整列後に、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に天然に整列され得る。種々の実施形態では、培養中で未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭが成熟するための期間は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０日間であり得る。好ましくは、心筋細胞の成熟化のための期間は、１４日間、またはより好ましくは、１０日間、またはさらにより好ましくは７日間である。一部の実施形態では、培養中で未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭが成熟するための期間は、７日間である。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、ＡＦＣ－ＥＣＭ上にプレーティングされる。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、培養の間に、ＡＦＣ－ＥＣＭ上にコンフルエントな単層を形成し、それにより、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に成熟心筋細胞の単層を含む細胞構築物を形成する。一部の実施形態では、成熟心筋細胞は、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、マルチウェルプレート中で、ＡＦＣ－ＥＣＭ上にプレーティングされる。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のインサートを有する。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、ＰＤＭＳのインサートを有さない。
Ｃ．薬物化合物の心毒性および／または催不整脈効果を決定するための方法
薬物化合物の心毒性および／または催不整脈効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するための方法であって、薬物化合物を、本明細書全体で開示する細胞構築物のいずれか１つの成熟心筋細胞と接触させるステップ、ならびに成熟心筋細胞の電気生理学における１つまたは複数の変化を観察して、薬物化合物が成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有するかどうかを確認するステップ、を含む方法が、本明細書で開示される。成熟心筋細胞の電気生理学における１つまたは複数の変化は、薬物化合物が成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有することを示し、それを裏付ける。成熟心筋細胞の電気生理学の１つまたは複数の変化は、ＡＰＤ延長、ＡＰＤ延長プラスローター、ならびに／または種々の型の不整脈、たとえば、頻脈性不整脈（ＴＡ）、静止状態（Ｑ）、遅延後脱分極（ＤＡＤ）、および／もしくは早期後脱分極（ＥＡＤ）を含み得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、活動電位持続時間（ＡＰＤ）の延長である。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、早期後脱分極（ＥＡＤ）である。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、遅延後脱分極（ＤＡＤ）である。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、活動電位持続時間（ＡＰＤ）プラスローターである。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、不整脈である。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、頻脈性不整脈（ＴＡ）である。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の電気生理学における変化は、静止状態（Ｑ）である。観察は、細胞生存度、細胞密度、および／または細胞の形態学もまた含み得る。一部の態様では、細胞構築物は、（ａ）ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を提供するステップ；（ｂ）羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）を提供するステップ；（ｃ）ＡＦＣ－ＥＣＭ上に未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭをプレーティングするステップ；および（ｄ）培養培地中でＡＦＣ－ＥＣＭ上のプレーティングされた未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭを培養して、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟心筋細胞への成熟化を誘導し、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に成熟心筋細胞の単層を形成し、それにより細胞構築物を形成するステップ、を含むプロセスによって調製することができ、成熟心筋細胞は、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる。他の態様では、この方法は、薬物化合物を、本明細書全体で開示する細胞構築物のいずれか１つと接触させるステップ、ならびに心毒性および／または催不整脈事象を観察するステップを含み得る。一つの特定の場合には、この方法は、（ａ）ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞（未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ）を提供するステップ；（ｂ）羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）を提供するステップ；（ｃ）ＡＦＣ－ＥＣＭ上に未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭをプレーティングするステップ；（ｄ）培養培地中でＡＦＣ－ＥＣＭ上のプレーティングされた未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭを培養して、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟心筋細胞への成熟化を誘導し、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に成熟心筋細胞の単層を形成し、それにより細胞構築物を形成するステップ；（ｅ）薬物化合物を、構築物の成熟心筋細胞の単層と接触させるステップ；ならびに（ｆ）成熟心筋細胞の電気生理学における変化を観察して、薬物化合物が成熟心筋細胞に対する心毒性および／または催不整脈効果を有するかどうかを確認するステップ、を含み、成熟心筋細胞は、成人ヒト心組織と似た区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、マルチウェルプレート中で、ＡＦＣ－ＥＣＭ上にプレーティングされる。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のインサートを有する。一部の実施形態では、マルチウェルプレートは、ＰＤＭＳのインサートを有さない。一部の実施形態では、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１を発現しない。一部の実施形態では、成熟心筋細胞の単層は、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に整列される。一部の実施形態では、線維トラックが、細胞構築物上に存在する。
心毒性および／または催不整脈試験は、かかる活性を測定するために好適な任意の型の装置を使用して実施され得る。一部の実施形態では、ＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の単層の細胞構築物は、上記のように調製される。成熟化プロセス（一般に、７日間またはそれ未満）の後、各ウェルの電気生理学は、プレートリーダーを使用して観察される。好適な電位感受性またはカルシウム感受性蛍光色素が、各ウェル中にロードされる。非限定的な電位感受性色素は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販されるＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）色素を含む。一部の実施形態では、プレートリーダーは、各色素を励起するために適切な波長の発光ダイオード（ＬＥＤ）などの好適な照明と組み合わせた好適な高時空ＣＣＤカメラに依存し得る。かかる高時空ＣＣＤカメラは、ＳｃｉＭｅａｓｕｒｅから市販される。一部の実施形態では、カメラ画像獲得速度は、１秒当たり１５０フレームよりも大きいまたはそれと等しい。一部の実施形態では、カメラおよびレンズの組合せは、活動電位およびカルシウム波伝播を観察するのに十分な解像度で、マルチウェルプレートの全てのウェルを同時に可視化することを可能にするように設計される。各プレートは、カメラシステムの下に中心合わせされ、照明はオンに切り替えられ、カメラ獲得が開始され、電気生理学的活性が記録される。実験は約３７℃で実施される。ベースライン読み取りを行った後に、試験される薬物がウェルに添加され、効果が記録される。自発的活性は、画像を得るために十分な期間、たとえば、少なくとも１０秒間にわたって記録される。画像は、コンピューター上に保存され得る。画像が解析され、活動電位持続時間、伝導速度、拍動数および活性化パターンが、画像解析ソフトウェアを使用して定量され得る。電気的波パターンの可視化は、薬物化合物が潜在的に致死的な不整脈、たとえば、トルサードドポアント（ＴｄＰ）を引き起こす効果を決定するために重要である。したがって、自発的活動電位持続時間に対する化合物の効果についての情報を提供することに加えて、本明細書で開示される方法は、使用される装置の型に依存して、インパルス伝導速度および活性化パターンについての情報もまた提供することができる。
Ｄ．哺乳動物幹細胞を拡大／増殖させる方法
哺乳動物細胞の単離、維持、および拡大／増殖のために、細胞由来の、羊水から単離された細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）を使用する方法もまた、本明細書で開示される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養はおそらく、全ての細胞生物学ならびに再生医療および組織工学の発展している分野において最も普遍的で重要、かつあまりよく理解されていない一面である。第１に、これによって細胞の挙動の観察が可能になり、それにより細胞機能の種々の態様を詳細に研究することができる。第２に、これによって特定の細胞群の数を増加させることができる。基礎研究ならびに多くの臨床応用のためには、少量の生体試料から大量の比較的まれな細胞を獲得することが必要である。ｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞培養によって、少数の細胞を体外で拡大してより適切な数の細胞を獲得することが可能になる。最後に、これにより細胞を後日の使用のために保存することが可能になる。ｉｎ－ｖｉｔｒｏで細胞数を拡大し、後の使用のために生存している細胞を凍結することによって、比較的少量の生体試料から数日、数か月、またはさらには数年もの期間にわたって複数の実験のための細胞を獲得することができる。
細胞培養が普遍的に存在しているにも関わらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養が細胞の天然の特徴に及ぼす効果は未だに比較的十分に理解されていない。現在の実施の多くは意図的な思想、計画、および実験からではなく、その代わりに偶然の観察から生じている。哺乳動物細胞の培養は１９００年代の初期に始まり、１９１１年にＡｌｅｘｉｓ ＣａｒｒｅｌおよびＭｏｎｔｒｏｓｅ Ｂｕｒｒｏｗｓが最初にｉｎ ｖｉｔｒｏにおける哺乳動物組織の培養について科学論文に発表した。彼らは、哺乳動物組織の切片を切り出してこれを顕微鏡のスライドの上に置くことによって組織の生理学および解剖学を研究していた。その際、彼らはいくつかの細胞が組織からスライド上に遊走することに気付いた。彼らは続いて細胞を永久的に培養するための手法を記述した。現在では彼らの観察のいくつかは妥当でないようであるが、彼らの研究は現代の細胞培養の道を開くものであった。
造血幹細胞（ＨＳＣ）の発見の後、世界中のグループが（ＨＳＣ）を研究していた。ＨＳＣの（懸濁液中での）培養の間、骨髄細胞の副集団がプラスチックフラスコの底に固着して増殖し始めることが観察された。これらの細胞は後にＨＳＣとは区別できることが認識され、最終的に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と名付けられた。ＭＳＣの発見に繋がるこの偶然の観察のために、ＭＳＣおよびその他の多くの哺乳動物の細胞型を定義する属性としてプラスチックへの接着性が今でも広く用いられている。
プラスチック基材の上で細胞を培養する慣行には問題があり得、これはなぜなら、細胞機能の調節における微小環境の重要な役割を実証する、現在では文献で広く受け入れられている実質的な証拠が存在するからである。微小環境は幹細胞および前駆細胞の分化の指令を補助し、成熟した細胞型の挙動を調節していることが示されてきた。
細胞を、ｉｎ－ｖｉｔｒｏで拡大するようにその天然の環境から取り出すと、細胞はその周囲の細胞外マトリックスまたは微小環境から細胞の周囲の組成および状態に関する重要な情報を細胞に中継する重要な手掛りを失い得る。細胞の微小環境の変化は、これらの細胞の挙動に重大な影響を有し得る。大部分の接着性細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで単離し拡大する現在の標準法は、ポリスチレン（プラスチック）からなる培養容器中に細胞を入れることである。ポリスチレンは細胞の付着および成長を促進するためのある様式で処理されていてもよいが、多くの場合、表面は細胞にとって完全に異物である。他の場合には、表面は個別のマトリックスタンパク質（たとえばフィブロネクチンまたはコラーゲン）またはタンパク質のある種の組合せでコーティングされていることもある。これらの単純な基材は、天然の微小環境の複雑さならびに正常な細胞機能における微小環境の重要な役割を無視している。細胞は直ちに、細胞がその天然の環境にある場合とは大きく異なる様式で、この異物環境に応答し始める。
プラスチック基材上で細胞を培養することにおけるこの問題に対処するために、５つの主なアプローチが現在採用されている：
１．問題を無視する。ｉｎ ｖｉｖｏで期待される機能と一致する所望の機能を達成する試みの代わりに、適切なマトリックス基材がなくても特定の所望の機能を示す細胞を発見するために、種々の培地の中で数多くの細胞型を試験することができる。このアプローチは洗練されておらず、変数の間の複雑な相互干渉および細胞と細胞外マトリックスとの間の相互作用の幅広さのために、所望の結果を得ることに失敗することが多い。
２．重要な成分を同定する。多くの学究的な研究室およびいくつかの企業は、細胞を単離した元の組織を考慮し、その組織の中で細胞機能に重要であり得る特有の要素を探すというアプローチをとってきた。次いで僅か１つのまたは数個のマトリックス成分からなる単純な基質の上で細胞を培養する。天然には、マトリックスはある場合には１００を超える異なるタンパク質を含む極めて複雑な環境であるため、このアプローチは失敗することが多い。細胞は、細胞が必要とせず受容するシグナルに対するのとちょうど同様に強く、細胞が必要とするが受容できないシグナルに応答する。
３．ショットガンアプローチ。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）等のタンパク質ゲルの使用は、一種のショットガンアプローチを採用している。ゲルが多くの異なる細胞型のための必要な結合モチーフを含むであろうという希望のもとに、多くの異なるマトリックスタンパク質を含むゲルが創成される。このアプローチは、細胞を特定の方向に押しやる手掛りを提供すること、または細胞が期待している全ての手掛りを提供できないことによって、失敗することがある。
４．組織由来のマトリックス。これは、典型的には遺伝的に同様の動物から目的の組織を単離し、組織を物理的に破壊しまたは化学的に消化して溶液または均一な懸濁液を得て、次いで分解した組織で培養容器をコーティングすることを含む、生物模倣アプローチである。たとえば、サテライト細胞を培養しようとすれば、筋肉を収集し、組織をホモジナイズし、次いでホモジナイズした筋肉で培養容器をコーティングして、細胞を播種してもよい。この方法はいくつかの理由で失敗することが多い。第１に、特定の組織型の中であっても、幹細胞／前駆細胞のニッチは組織のそれ以外とは異なっていることがある。筋肉を単純にホモジナイズしても、適切なニッチが創成されていることを保証するものではない。第２に、ニッチは生化学的な手掛りに加えて構造的および物理的な手掛りからなっている。生化学的手掛りの多く／大部分が組織ホモジネート中に存在しても、構造は破壊されており、細胞は極めて異なる機械的手掛りを感知し得る。最後に、組織由来マトリックスの製造可能性は組織の利用可能性による。これは可能な細胞培養の全量に影響し、ロット間の変動の原因となる。
５．細胞由来のマトリックス。培養中の細胞を誘導してその培養容器中にマトリックスを分泌させることができる。このマトリックスはｉｎ ｖｉｖｏのニッチについて利用可能な最良の近似であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで製造することができる。細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導してマトリックスを生産させることができ、続いて、たとえばマトリックスの構造および化学を保持する非イオン化界面活性剤を用いることによって、細胞をマトリックスから除去することができる。このアプローチは、いくつかの重要な利点を有している。（１）マトリックス構造を再創成して撹乱されないままにすることができる。（２）目的の組織／細胞型に基づいてマトリックスをカスタマイズできる。（３）マトリックスは幹細胞および前駆細胞のニッチに特異的であることができる。（４）マトリックスを大量に製造することができる。
細胞由来のマトリックスに関しては、全ての細胞型を効率よく単離して任意の所与の細胞由来マトリックスの上で拡大できるわけではない。実際上、多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、支持成長基材について他の細胞の型とは極めて異なる要求事項を有しているようである。マトリックスを産生するために用いられる特定の細胞型はマトリックスの組成に影響を及ぼし、したがってそのマトリックスに対する種々の細胞型の反応に影響を及ぼすことが公知である（Ｍａｒｉｎｋｏｖｉｃ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｅ ｓｉｚｅ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｆｉｔ ａｌｌ： ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｉｃｈｅ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ． Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ． ５４－５５， ４２６－４４１ （２０１６）を参照）。米国特許第８，０８４，０２３号で開示された以前の研究は、骨髄間質細胞または間葉系幹細胞によって産生された細胞外マトリックスの産生および組成を記載している（Ｃｈｅｎ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｍａｄｅ ｂｙ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｃｅｌｌｓ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｍａｒｒｏｗ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ｔｈｅｉｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２， １９４３－１９５６ （２００７）およびＬａｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｅｘ
ｖｉｖｏ： ａ ｒｏｂｕｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｈｉｇｈｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ
ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９， １０９５－１０７ （２０１０）も参照）。この骨髄細胞由来マトリックスは他のＭＳＣの拡大をサポートすることが示されたが、他の型の幹細胞、具体的には誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の付着および成長には効果的ではなかった。ｉＰＳＣは、ＭＳＣよりもずっと広いカテゴリーから細胞および組織を形成する拡張された可能性を示した。これは特に興味深い課題を表しており、これはなぜなら、標準的な培養条件下でｉＰＳＣのコンフルエントな単層を成長させることが困難なため、ｉＰＳＣから細胞由来マトリックスを産生させることが実用的でないためである。以前の細胞由来マトリックスの主な限界は、組織特異的マトリックス（たとえば骨髄ＭＳＣからの骨髄マトリックス、脂肪ＭＳＣからの脂肪マトリックス、またはｈＵＶＥＣからの内皮マトリックス）を作成するために、細胞の標的集団が既に出発基材に接着できることが必要であることである。ｉＰＳＣ、胚性幹細胞（ＥＳ）、および多くの他の細胞型における困難さは、これらが単純な基材には容易に接着しないことである。
本開示は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳ）を含むがこれらに限定されない多能性幹細胞（ＰＳＣ）の単離、拡大、および増殖をサポートする細胞由来細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に関連する当技術における上述の限界および欠陥の少なくともいくつかに対する解決策を提供する。解決策は羊水細胞由来の細胞外マトリックスの使用を前提としている。羊水中に見出される中立で容易に接着し、高度に増殖性の周産期の細胞の使用により、これらのＰＳＣの接着、単離、拡大、および増殖を驚くべきことにサポートする細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の創成が可能になる。この技術的達成は、従来技術の細胞由来ＥＣＭでは不可能であった。
哺乳動物細胞の機能は、主としてそれが存在する環境、たとえば細胞外マトリックスによって決定される。細胞はその環境に存在するシグナル（ポジティブシグナル）に、また必要ではあるが存在しないシグナル（ネガティブシグナル）に、反応する。中立の幹細胞は、幹細胞の生存度および幹細胞性を維持するために必要なニッチモチーフを含むマトリックスを産生することができるが、より成熟した細胞が分泌して幹細胞を特定の運命に進める可能性がある多くの細胞系列特異的シグナルを欠いている可能性がある。理論に縛られるわけではないが、未成熟の細胞、たとえば周産期の細胞または周産期の幹細胞は、骨髄間質細胞由来のＥＣＭ等の当技術で以前開示されたＥＣＭとは異なるＥＣＭを産生し得、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）よりも高い可能性を有する多能性幹細胞（ＰＳＣ）等の幹細胞のより良い単離および拡大／増殖を可能にし得ることが示唆される。質量分析によって、以前から公知であった細胞由来のＥＣＭと比較して、本発明の羊水細胞由来のＥＣＭは、３種の胚葉の全てに見出されるマトリックスタンパク質を含み、骨形成性細胞系列に強く関連する特定のタンパク質を欠いていることが示された。さらに、本開示のＥＣＭは多能性細胞の接着および拡大を促進することが公知であるラミニン等の特定のモチーフを含む。
多能性幹細胞（ＰＳＣ）は自己更新して３つの胚葉、即ち外胚葉、内胚葉、および中胚葉のいずれかに分化することができ、これらから全ての組織および臓器が発育する。胚性幹細胞（ＥＳ）は、現在のところ唯一の公知の天然の多能性幹細胞である。誘導された多能性幹（ｉＰＳＣ）細胞もＰＳＣである。ｉＰＳＣは一般に成人組織または成人細胞から採取された細胞から誘導され、胚性幹細胞のレベルにまで再プログラミングされる。ｉＰＳＣを産生する方法は当技術で公知である。
多能性幹細胞（ＰＳＣ）を拡大／増殖させる方法は、ＰＳＣを得るステップ、および本発明の羊水細胞由来のＥＣＭの存在下でそれらを培養するステップを含む。ＰＳＣは、ｉＰＳＣまたはＥＳであり得る。細胞が直ちにまたは培養のある期間の後にコンフルエントな単層を形成することを可能にする任意の播種密度を用いてよい。一部の実施形態では、播種密度は、約１０細胞／ｃｍ２～約１００，０００細胞／ｃｍ２、または約１００細胞／ｃｍ２～約７５，０００細胞／ｃｍ２、または約５００細胞／ｃｍ２～約５０，０００細胞／ｃｍ２、または約５００細胞／ｃｍ２～約１０，０００細胞／ｃｍ２、または約５００細胞／ｃｍ２～約５，０００細胞／ｃｍ２、または約５００細胞／ｃｍ２～約２，５００細胞／ｃｍ２、または約１，０００細胞／ｃｍ２～約２５，０００細胞／ｃｍ２、または約２，０００細胞／ｃｍ２～約１０，０００細胞／ｃｍ２、または約３，０００細胞／ｃｍ２～約５０００細胞／ｃｍ２である。
一部の実施形態では、ＰＳＣは未分化の状態で維持され、その幹細胞性を維持する。培養におけるＰＳＣの増殖に好適な細胞培養手法は当技術で公知である。幹細胞増殖のための好適な市販の培養培地は、Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃから入手可能なＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ｉＰＳ－Ｂｒｅｗ ＸＦを含むが、これに限定されない。一部の実施形態では、Ｒｏｃｋ阻害剤は使用しない。細胞が（たとえば、明視野顕微鏡によって判定して）コンフルエンスに近づき始めれば、大きなコロニーをより小さなコロニーに切断し、次いでこれらをディッシュから物理的に持ち上げて羊水細胞由来ＥＣＭの新たなプレートに配置して再播種することによって、細胞を手作業で継代することができる。この手順は無限に繰り返すことができる。一部の実施形態では、培養中の多能性幹細胞（ＰＳＣ）を増殖させる方法であって、ＰＳＣを培養培地中で細胞由来の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の存在下で培養し、それによりＰＳＣを増殖させるステップを含み、細胞由来のＥＣＭは羊水から単離された細胞からｉｎ－ｖｉｔｒｏで誘導される、方法が開示される。
上記のＰＳＣを拡大／増殖する方法は、他の周産期細胞由来のＥＣＭの存在下での培養においてＰＳＣを拡大／増殖する際の使用にも適用される。一部の実施形態では、培養中の多能性幹細胞（ＰＳＣ）を増殖させる方法であって、ＰＳＣを培養培地中で細胞由来の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の存在下で培養し、それによりＰＳＣを増殖させるステップを含み、細胞由来のＥＣＭは、臍帯または胎盤組織から単離された細胞からｉｎ－ｖｉｔｒｏで誘導される、方法が開示される。一部の実施形態では、臍帯から単離される細胞は臍帯血および／またはＷｈａｒｔｏｎのジェリーからのものである。他の実施形態では、胎盤組織から単離される細胞は膜シート（羊膜および／または絨毛膜）、絨毛、および／または血液からのものである。
以下の実施例は、本発明のある非限定的な態様を実証するために含まれている。当業者であれば、以下の実施例で開示される手法は本発明の実施において良好に機能するように本出願人によって発見された手法を表していることが認識できよう。しかし、当業者には、本開示に照らして本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示した特定の実施形態において多くの変更が可能であり、同様または類似の結果が得られることが認識されよう。
（実施例１）
羊水細胞由来ＥＣＭ（ＡＦＣ－ＥＣＭ）の産生
以下の手順を用いて、４種の羊水細胞由来ＥＣＭ（マトリックスＡ、マトリックスＢ、マトリックスＣ、およびマトリックスＤ）を作成した。４名のドナーの満期産（妊娠期間３７週超）から収集した羊水から無菌的に単離した細胞を、フィブロネクチンでコーティングした組織培養処理済みフラスコに播種し、完全培地中、３７℃、５％ＣＯ２および９０％のＲＨで、インキュベーター中で培養した。完全培地は、アルファ最小基本培地（ａＭＥＭ）プラス２ｍＭのＬ－グルタミンプラス抗生剤－抗真菌剤プラス１５％のウシ胎児血清であった。
３～４日目に、完全培地の半分をフラスコから吸引し、半分の新たな完全培地で置き換えた。フラスコを上記と同じ条件でインキュベーターに戻した。
７～８日目に、完全培地を培養フラスコから吸引し、誘導培地で補充した。フラスコを上記と同じ条件でインキュベーターに戻した。誘導培地は、完全培地プラス５０ｍＭのＬ－アスコルビン酸であった。
１０～１１日目に、誘導培地を培養フラスコから吸引し、フラスコ内で形成されたＥＣＭをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。次いでＰＢＳをフラスコから吸引した。抽出緩衝剤をフラスコに加え、室温で７～１０分インキュベートしてそれぞれのＥＣＭから細胞を除去し、次いで抽出緩衝剤をフラスコから吸引した。抽出緩衝剤は、０．５％（ｖ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）－Ｘ１００および２０ｍＭの水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）を含むＰＢＳであった。
細胞を除去したフラスコ中のＥＣＭのそれぞれをＰＢＳで３回、無菌水で１回洗浄し、次いで無菌水をフラスコから吸引した。細胞を除去したフラスコ中の４種のＥＣＭを室温で乾燥させ、次いで４℃で保存した。
１０倍の対物レンズを用いる倍率１００倍における羊水細胞由来ＥＣＭ（マトリックスＢ）の明視野画像の顕微鏡写真を図１に示す。トポグラフィー、接着、および剛性を示す羊水細胞由来ＥＣＭ（マトリックスＢ）および骨髄細胞由来ＥＣＭの３つの代表的な４０×４０ｕｍの切片の原子間力顕微鏡写真を図２に示す。骨髄細胞由来および羊水細胞由来のＥＣＭは構造的にも物理的にも区別できる。骨髄細胞由来および羊水細胞由来のＥＣＭの接着および剛性（弾性モジュラス）の定量により、図３ａ（接着）および図３ｂ（剛性）の散布図に示すように、骨髄ＥＣＭが羊水ＥＣＭより１０倍剛性で、３倍非接着性であることが示され、ここでＢＭは骨髄細胞由来のＥＣＭ、ＡＤは羊水細胞由来のＥＣＭ（マトリックスＢ）である。各点は独立した測定点を表す。
（実施例２）
羊水細胞由来ＥＣＭの組成
実施例１で産生された羊水細胞由来ＥＣＭのそれぞれの組成を、質量分析によって決定した。成分をそのスペクトルカウントおよび分子量とともに表２に列挙する。
表２
羊水細胞由来ＥＣＭ（ＡＦＣ－ＥＣＭ）成分






















































（実施例３）
羊水細胞由来ＥＣＭ上におけるｉＰＳＣの増殖
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、以下の手順を用いて実施例１の羊水細胞由来ＥＣＭ（マトリックスＢ）の上で培養して増殖させた。凍結保存された市販のｉＰＳＣを、３７℃の水浴を用いて解凍した。細胞懸濁液を幹細胞増殖用の市販の培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ、ＭＡＣＳ ｉＰＳ Ｂｒｅｗ）の中に希釈し、６ウェルプレートのＥＣＭ上にほぼ１，０００細胞／ｃｍ２、培地２ｍＬ／ウェルで播種した。Ｒｏｃｋ阻害剤は使用しなかった。１日目に、培地の全体積を培養中の細胞から穏やかに吸引し、新鮮な培地で置き換えた。２４時間ごとに全培地を新鮮な培地で置き換えた。細胞が（明視野顕微鏡によって判定して）コンフルエンスに近づき始めれば、無菌の針を用いて大きなコロニーをほぼ１００個のより小さなコロニーに切断し、次いでこれらを無菌の針でディッシュから物理的に持ち上げてＥＣＭの新たなプレートに配置して再播種することによって、細胞を手作業で継代した。この手順は無限に繰り返すことができる。
羊水細胞由来ＥＣＭおよび骨髄細胞由来ＥＣＭの上におけるｉＰＳＣの０日目および２日目の培養を示す顕微鏡写真を図４に示す。
羊水細胞由来ＥＣＭおよび骨髄細胞由来ＥＣＭの存在下で培養したｉＰＳＣのｉＰＳＣコロニー成長曲線のプロットを図５に示す。
図４および図５に見られ得るように、ｉＰＳＣは羊水細胞由来ＥＣＭの存在下における培養で増殖した一方、骨髄細胞由来ＥＣＭの存在下で培養したｉＰＳＣは成長しなかった。
（実施例４）
ＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の細胞構築物の調製、およびＡＦＣ－ＥＣＭ上での未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭの成熟化
羊水からｉｎ－ｖｉｔｒｏで誘導された細胞から誘導された細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）上に成熟心筋細胞の単層を含む細胞構築物を、以下の方法を使用して調製した。
実施例１に概説した方法論を使用して、ＡＦＣ－ＥＣＭを、９６ウェルプレート（シリコーンインサートは使用しなかった）中で調製した。標準的な細胞培養手法を使用して、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ－ＦＵＪＩから市販される未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭ（ｉＣｅｌｌ（登録商標）Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）を、ＡＦＣ－ＥＣＭ上にプレートした。未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭを、１ウェル当たり５０，０００細胞の密度（９６ウェルプレート）または１ウェル当たり２００，０００細胞の密度（６ウェルプレート）でプレートし、ＲＰＭＩ培地中で７日間培養して、ＡＦＣ－ＥＣＭ上に成熟心筋細胞のコンフルエントな単層を形成させ、それにより、ＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞単層の細胞構築物を形成した。
７日間の期間にわたり、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、区別できるサルコメア構造を有するロッド状細胞によって特徴付けられる成熟天然成人心筋細胞の形態学および整列へと成熟することが観察された。比較目的のために、ｉＣｅｌｌ（登録商標）の未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭもまた、９６ウェルプレート中にプレートし（シリコーンインサートは使用しなかった）、標準的なＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上、および参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０８４，０２３号に開示された方法によって調製した骨髄細胞由来のＥＣＭ（ＢＭ－ＥＣＭ）上で、同様の様式で培養した。この研究の結果は、図６～２１に、異なるＥＣＭ上の心筋細胞の顕微鏡写真で示される。
図６～１４で見ることができるように、ＡＦＣ－ＥＣＭ上の心筋細胞は、天然の成人心筋細胞と似た区別できるサルコメア構造を有する成熟ロッド状細胞である。ＡＦＣ－ＥＣＭ上で成熟化した心筋細胞の形態学およびサルコメア構造は、図１４の顕微鏡写真中の矢印によって同定される縞模様の外観を有するロッド状細胞の存在によって、はっきりと見ることができる。これらの図は、ＡＦＣ－ＥＣＭ上の線維トラックの存在を示し、成熟心筋細胞の単層が、ＡＦＣ－ＥＣＭと整列して、天然の成人心筋細胞および天然の心臓筋肉組織において見出される特徴と密接に似ていることもまた示している。対照的に、図１５～１９および図２０～２１で見ることができるように、標準的なＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭおよびＢＭ－ＥＣＭ上の心筋細胞はそれぞれ、胎児様心筋細胞と似ており、天然の成人心筋細胞の特徴も天然の心臓筋肉組織の特徴も有さない。
したがって、ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養した未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭは、標準的なＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭまたは骨髄細胞由来の天然の細胞由来のＥＣＭ上で培養した未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも、より高い成熟化の状態を達成した。ｈｉＰＳＣ－ＣＭ形態学は、異なるＥＣＭによって異なって影響されたことが明らかである。
（実施例５）
ＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の細胞構築物を使用した、薬物のハイスループット心毒性スクリーニング試験
ＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の単層の細胞構築物を、９６ウェルプレート（シリコーンインサートは使用しなかった）を使用して、実施例４に記載されるように調製した。７日間の成熟化プロセス後、各ウェルの電気生理学を、以下のハイスループットスクリーニング方法を使用して、プレートリーダーを使用して観察した。Ｈａｎｋｓ平衡塩溶液中のＦｌｕｏＶｏｌｔ（商標）色素を、各ウェル中にロードした。高時空ＣＣＤカメラ（ＳｃｉＭｅａｓｕｒｅ ＤａＶｉｎｃｉカメラ）を、図２２の概略図に示されるように、発光ダイオード（ＬＥＤ）と組み合わせた。カメラおよびレンズの組合せを、活動電位およびカルシウム波伝播を観察するのに十分な解像度で、９６ウェルプレートの全てのウェルを同時に可視化することを可能にするように設計した。各プレートを、カメラシステムの下に中心合わせし、照明をオンに切り替え、カメラ獲得を開始し、電気生理学的活性を記録した。実験は約３７℃で実施した。自発的活性を、少なくとも１０秒間にわたって記録し、画像をコンピューター上に保存した。ベースライン読み取りを取得した後に、５００ｎＭの薬物Ｅ４０３１（ｈＥＲＧチャネルブロッカー）を各ウェルに添加した。画像を解析し、活動電位持続時間、伝導速度、拍動数および活性化パターンを、画像解析ソフトウェアを使用して定量した。比較目的のために、未熟なｈｉＰＳＣ－ＣＭを、実施例４に記載されるように、９６ウェルプレート（シリコーンインサートは使用しなかった）中で、標準的なＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭおよび骨髄細胞由来のＥＣＭ（ＢＭ－ＥＣＭ）上で培養し、５００ｎＭの薬物Ｅ４０３１（ｈＥＲＧチャネルブロッカー）を、ＡＦＣ－ＥＣＭ研究と同様の様式で解析した。Ｅ４０３１試験の結果は、図２３および図２４に示される。図２３で見ることができるように、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭおよびＢＭ－ＥＣＭ上の心筋細胞から記録された自発的活動電位の記録は、薬物Ｅ－４０３１のみが活動電位持続時間（ＡＰＤ）延長を引き起こしたことを示した；しかし、ＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞に対しては、薬物Ｅ－４０３１は、ヒトにおけるＴｄＰの場合に生じることが公知のものと一致する不整脈活性化パターンである、ＡＰＤ延長プラスローター（ＴｄＰ様不整脈）を引き起こした。したがって、３つ全てのＥＣＭが、予測されたＡＰＤ延長に反応する心筋細胞の単層を産生したが、ＡＦＣ－ＥＣＭのみが、ＴｄＰに特徴的な、ＡＰＤ延長の頻脈性不整脈への遷移を明らかにする心筋細胞の単層を産生した。図２４で見ることができるように、ＡＦＣ－ＥＣＭ上の心筋細胞の１００％が、ローター（ＴｄＰ様不整脈）を伴って、薬物Ｅ４０３１に応答した。
さらなる研究において、薬物ドンペリドン（３μＭ）、ジソピラミド（１００μＭ）、アジミリド（１０μＭ）、ｄ，ｌソタロール（Ｄ，１ Ｓｏｔａｌｏｌ）（１００μＭ）、イブチリド（０．１０μＭ）、およびベプリジル（１０μＭ）を、上記プレートリーダー方法を使用して、９６ウェルプレート中で実施例４で調製した（シリコーンインサートなしの）ＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞を用いて試験した。試験の結果は図２５に示される。これらの結果において見ることができるように、種々の型の不整脈、即ち、頻脈性不整脈（ＴＡ）、静止状態（Ｑ）、早期後脱分極（ＥＡＤ）が、記録中に表記された種々の薬物によって引き起こされた。ＦＤＡによって患者においてＴｄＰ致死的不整脈を引き起こすことに関して高リスクと分類された薬物に応答して、これらは、観察された不整脈の範囲である。
以下の表３および４に示される種々の薬物もまた、上記プレートリーダー方法を使用して、９６ウェルプレート中で実施例４で調製した（シリコーンインサートなしの）ＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞を用いて試験し、検出された任意の不整脈および有効治療血漿濃度（ＥＴＰＣ）の１０倍におけるＡＰＤ９０延長についての観察を表記した。薬物を、ＣｉＰＡの検証および試験のための化合物のＣｉＰＡ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅリストから選択した。これらは、患者において致死的不整脈（ＴｄＰ）を引き起こすことについて、高リスク、中間リスクまたは低リスクと分類されている。ＣｉＰＡ化合物の完全なリストは、ｈｔｔｐ：／／ｃｉｐａｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／ｓｉｔｅｓ／２４／２０１６／０５／ＣｉＰＡ－Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ｐｄｆにおいて見出すことができる。
表３

表４
表３および４中の試験した薬物からのデータのさらなる解析は、図２６～２９に示される。図２６は、任意の用量の各薬物化合物について観察された不整脈の総数をグラフで示す。図２７は、１０×有効治療血漿濃度（ＥＴＰＣ）の具体的な臨床的に適切な用量での、各薬物についての不整脈の相対的発生率をグラフで示す。
図２８は、各薬物についての時間（ミリ秒）での活動電位トライアンギュレーション（ＡＰＤ９０－ＡＰＤ３０）をグラフで示す。トライアンギュレーションは、ＡＰＤ３０からＡＰＤ９０までの再分極時間として定義される。活動電位トライアンギュレーション（ＡＰＤ９０－ＡＰＤ３０）は、薬物の催不整脈作用についての予測因子として使用される。図２９は、ＡＦＣ－ＥＣＭ（ＳＢＳ－ＡＦ Ｍａｔｒｉｘ）上 対 Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上の心筋細胞の心筋細胞アッセイ性能を比較する、一部の薬物についての時間（ミリ秒）での活動電位トライアンギュレーションを示す。
図３０は、列挙した薬物の任意の濃度での、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤｙｎａｍｉｃｓからのｉＣｅｌｌ（登録商標）ｈｉＰＳＣ－ＣＭ（白丸） 対 ＮｃａｒｄｉａからのＣｏｒ．４Ｕ（登録商標）ｈｉＰＳＣ－ＣＭ（黒丸）の心筋細胞性能を比較する、列挙した薬物の最大薬物誘導活動電位トライアンギュレーションをグラフで示す。この図は、刊行物Ｂｌｉｎｏｖａ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏａｒｒｈｙｔｈｍｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ， ２０１８， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２４， ３５８２－３５９２からである。図２８とは対照的に、図３０に示されるデータセットには、高リスク化合物と中間リスク化合物との間に層別化はほとんど存在しない。したがって、本開示のＡＦＣ－ＥＣＭは、他の天然の細胞由来のＥＣＭまたはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭよりも、より現実的な機能および薬物応答性を有するより成熟した心筋細胞の産生を提供する。
（実施例６）
ＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の細胞構築物の観察
ＡＦＣ－ＥＣＭ上の成熟心筋細胞の細胞構築物を、以下に述べた以下の改変を伴って、上記実施例４に記載される手順に従って調製した：
ＡＦＣ－ＥＣＭを、Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバースリップ上に堆積させて、細胞の免疫染色、およびレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ）を使用するイメージングを可能にした。
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭを、比較のために、Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバースリップの別々のサブセットに適用した。
Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ－ＦＵＪＩからの細胞（ｉＣｅｌｌ（登録商標）Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）を、各ＥＣＭでコーティングしたこれらのＴｈｅｒｍａｎｏｘカバースリップ上に、６ウェルプレートでは、１ウェル当たり２００，０００細胞の密度で、単層としてプレートした。
細胞培養培地中での７日間のインキュベーション後、細胞を、３％パラホルムアルデヒド中で固定し、ｈｉＰＳＣ－ＣＭにおける細胞発現および局在化を決定するための市販の一次抗体の適用を用いた免疫細胞化学のために処理した。重要な心筋フィラメントタンパク質に対する以下の一次抗体を使用した：トロポニンＩ、α－アクチニン、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）およびＮ－カドヘリン。市販の蛍光標識された二次抗体を検出に使用した。ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）蛍光染色を使用して核をマークした。
細胞の標識化および可視化のための全ての手順は、参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献中に記載される通りである。Ｈｅｒｒｏｎ， Ｔ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃａｒｄｉａｃ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ： Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９ （２０１６）。ｄａ
Ｒｏｃｈａ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｃＭｙＢＰ－Ｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ ｈｕｍａｎ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ＥＳ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ
ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ． ９９， １９７－２０６ （２０１６）。ｄａ Ｒｏｃｈａ， Ａ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．
ｈｉＰＳＣ－ＣＭ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｐｒｏ－Ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ Ｓｃｒｅｅｎ． Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ７， １３８３４ （２０１７）。
細胞形状を、ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅにおいて解析した蛍光画像を使用して定量した。細胞の面積および周囲長を使用して、細胞円形度を、確立された数学的方程式を使用して定量した；円形度指数＝４π＊面積／周囲長２。
一部の場合には、ミトコンドリアを、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して染色した。
結果：上記実施例４で見られた結果と一致して、蛍光標識化およびイメージングを使用したデータは、ＡＦＣ－ＥＣＭが、ｈｉＰＳＣ－ＣＭの迅速な（７日間の）成熟化を促進することを実証し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭが、形状が円形であり、サルコメアの無秩序化を有するが、ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭの同じバッチ（同系比較対象）が、ロッド状であり、サルコメアおよび筋フィラメントの緊密な緻密化／構造化を有することを示している。
図３１の顕微鏡写真は、トロポニンＩについての免疫蛍光染色を用い、核をマークするためにＤＡＰＩを使用した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭを示す。図３２の顕微鏡写真は、α－アクチニンについての免疫蛍光染色を用い、核をマークするためにＤＡＰＩを使用した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭを示す。図３３の顕微鏡写真は、ｃＴｎＴおよびＮカドヘリンについての免疫蛍光染色を用い、核をマークするためにＤＡＰＩを使用した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭを示す。図３１～３３で見ることができるように、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭは、形状が円形であり、サルコメアの無秩序化を有するが、ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭの同じバッチ（同系比較対象）は、ロッド状であり、サルコメアおよび筋フィラメントの緊密な緻密化／構造化を有する。図３１～３３中、細胞の一部の例は、円形細胞またはロッド状細胞のいずれかとして矢印で同定され、サルコメアの一部の例は、矢印で同定される。図３４の顕微鏡写真は、ｃＴｎＴについての免疫蛍光染色を用い、核をマークするためにＤＡＰＩを使用した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養した単一のｈｉＰＳＣ－ＣＭ細胞を示し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上で培養した細胞が円形であるが、ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養した細胞がロッド状であることを示している。図３５の顕微鏡写真は、α－アクチニンについての免疫蛍光染色を用い、核をマークするためにＤＡＰＩを使用した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養した単一のｈｉＰＳＣ－ＣＭ細胞を示し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上で培養した細胞が円形であるが、ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養した細胞がロッド状であることを示している。図３６のグラフは、図３５に示される単一の細胞の細胞円形度の比較を示し、より大きい丸さを示す、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上で培養した細胞についてのより高い円形度指数を示している。
図３７の顕微鏡写真は、ｃＴｎＩ発現についての免疫蛍光染色を用い、核をマークするためにＤＡＰＩを使用した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭを示す。図３８は、ｃＴｎＩ発現およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）についてのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭおよびＡＦＣ－ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭのウエスタンブロッティングを示す。図３８のウエスタンブロッティングの解析は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭについて、ＧＡＰＤＨと比較したｃＴｎＩ発現を示す図３９のグラフに示される。この解析は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも、ＡＦＣ－ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭからのよりロバストなｃＴｎＩ発現を示す、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭよりもＡＦＣ－ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭについてより高いｃＴｎＩ発現／ＧＡＰＤＨ比を示している。
図４０の顕微鏡写真は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄでミトコンドリアについて染色した、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭを示し、ＡＦＣ－ＥＣＭ上の細胞が、より大きい赤のシグナルによって明らかな、より多くのミトコンドリア、およびより分極した内膜電位を有するミトコンドリアを有することを示している。図４１のグラフは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ 対 ＡＦＣ－ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭについてのＭｉｔｏＴｒａｋｅｒ（商標）Ｒｅｄ蛍光強度／心筋細胞を示し、ＡＦＣ－ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭが、より高いＭｉｔｏＴｒａｋｅｒ（商標）Ｒｅｄ蛍光強度を有することを示しており、これは、これらの細胞が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上のｈｉＰＳＣ－ＣＭよりも、より多くのミトコンドリア、およびより分極した内膜電位を有するミトコンドリアを有することを示している。
図４２の顕微鏡写真（透過光）は、微小電極アレイ（ＭＥＡ）プレート上にコーティングしたＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭおよびＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭを示す。図４２で見ることができるように、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭは、形状が円形であり、ＡＦＣ－ＥＣＭ上で培養したｈｉＰＳＣ－ＣＭは、ロッド状である。

Claims (19)

  1. 薬物化合物の心毒性または催不整脈効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定するための方法であって、前記方法が：
    （ｉ）ヒト誘導多能性幹細胞に由来する未熟な心筋細胞を得ることであって、前記未熟な心筋細胞が、単一の核を示す、得ること；
    （ｉｉ）前記未熟な心筋細胞を、妊娠期間３７週超のヒトから得られた羊水から単離された細胞を培養することから得られた細胞外マトリックス（ＡＦＣ－ＥＣＭ）と接触させることであって、前記ＡＦＣ－ＥＣＭが、ラミニン、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ－２（ＩＶ）、またはそれらのアイソフォームを含む、接触させること；
    （ｉｉｉ）前記ＡＦＣ－ＥＣＭ上に成熟心筋細胞の単層を形成するために、培養培地中で前記未熟な心筋細胞を前記ＡＦＣ－ＥＣＭと共に培養することであって、前記成熟心筋細胞が２つの核を示す、培養すること；ならびに
    （ｉｖ）前記薬物化合物を成熟心筋細胞と接触させること、および前記薬物化合物が前記成熟心筋細胞に対する心毒性または催不整脈効果を有するかどうかを確認するために、前記成熟心筋細胞の電気生理学における変化を観察すること、を含む、方法。
  2. 前記成熟心筋細胞の前記電気生理学における前記変化が、活動電位持続時間（ＡＰＤ）の延長であり、ＡＰＤの延長が、前記薬物化合物が前記成熟心筋細胞に対する心毒性または催不整脈効果を有することを裏付ける、請求項１に記載の方法。
  3. 前記成熟心筋細胞の前記電気生理学における前記変化が、早期後脱分極（ＥＡＤ）であり、早期後脱分極（ＥＡＤ）が、前記薬物化合物が前記成熟心筋細胞に対する心毒性または催不整脈効果を有することを裏付ける、請求項１に記載の方法。
  4. 前記成熟心筋細胞の前記電気生理学における前記変化が、遅延後脱分極（ＤＡＤ）であり、遅延後脱分極（ＤＡＤ）が、前記薬物化合物が前記成熟心筋細胞に対する心毒性または催不整脈効果を有することを裏付ける、請求項１に記載の方法。
  5. 前記成熟心筋細胞の前記電気生理学における前記変化が、活動電位持続時間（ＡＰＤ）プラスローターであり、ＡＰＤの延長プラスローターが、前記薬物化合物が前記成熟心筋細胞に対する心毒性または催不整脈効果を有することを裏付ける、請求項１に記載の方法。
  6. 前記成熟心筋細胞の前記電気生理学における前記変化が、不整脈であり、前記不整脈が、前記薬物化合物が前記成熟心筋細胞に対する心毒性または催不整脈効果を有することを裏付ける、請求項１に記載の方法。
  7. 前記コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）のアイソフォームが、アイソフォーム２であるか、または前記アグリンのアイソフォームが、アイソフォーム６である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記ＡＦＣ－ＥＣＭが、フィブロネクチンまたはそのアイソフォームをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  9. 羊水から単離された前記細胞が、羊膜、皮膚、ならびに消化管、呼吸器官、および尿生殖器官からの胎児の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 工程（ｉｉｉ）における前記ＡＦＣ－ＥＣＭ上の前記成熟心筋細胞の層が、前記成熟心筋細胞の単層である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記成熟心筋細胞の単層が、コンフルエントな単層である、請求項１０に記載の方法。
  12. 工程（ｉｉｉ）の間の前記未熟な心筋細胞の前記成熟心筋細胞への成熟化のための期間が、４日～１４日である、請求項１に記載の方法。
  13. 工程（ｉｉｉ）の間の前記未熟な心筋細胞の前記成熟心筋細胞への成熟化のための期間が、６日～１０日である、請求項１に記載の方法。
  14. 前記未熟な心筋細胞を前記ＡＦＣ－ＥＣＭと接触させることが、前記ＡＦＣ－ＥＣＭ上に前記未熟な心筋細胞をプレーティングすることを含む、請求項１に記載の方法。
  15. 前記ＡＦＣ－ＥＣＭが、プレーティングの間、細胞培養容器またはマルチウェルプレート中に含まれる、請求項１４に記載の方法。
  16. プレーティングの間、前記未熟な心筋細胞の１０細胞／ｃｍ２ ～１００，０００細胞／ｃｍ２の播種密度が使用される、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記ＡＦＣ－ＥＣＭが、異方的な線維トラックに構造化される、請求項１に記載の方法。
  18. 前記成熟心筋細胞が、前記ＡＦＣ－ＥＣＭの前記異方的な線維トラック上に異方的に整列される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＡＦＣ－ＥＣＭが、デコリン、ペルレカン、およびコラーゲン（ＩＩＩ）を含まない、請求項１に記載の方法。
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