JP7511742B2 - ２，３，５－置換されたチオフェン化合物の肥満細胞症の予防、改善または治療用途 - Google Patents

２，３，５－置換されたチオフェン化合物の肥満細胞症の予防、改善または治療用途 Download PDF

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Description

本発明は、２，３，５－置換されたチオフェン化合物の肥満細胞症の予防、改善または治療用途に関する。
肥満細胞症（Ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）は、肥満細胞が異常に皮膚、骨髄、肝、脾臓およびリンパ節のような内部臓器に蓄積される希少疾患である。英国のある研究において、全身性肥満細胞症の発生率は年間３０万人に２人の頻度を示すことが報告された。
肥満細胞は、アレルギーの主因になる免疫細胞である。肥満細胞の表面にはＩｇＥ形態の抗体が付くことのできる表面因子がある。基質に結合した後、比較的すぐに落ちる他の抗体とは異なり、ＩｇＥは肥満細胞に結合すればほとんど落ちない。この時、ＩｇＥに結合する物質（すなわち、アレルゲン）が人体内に入ってＩｇＥと結合をすれば、そのＩｇＥと結合している肥満細胞が活性化される。このように活性化された肥満細胞は、神経伝達物質であるヒスタミン（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）を外部に分泌してアレルギー反応を誘発させる。肥満細胞症が成人期に始まる患者の場合、皮膚だけでなく、身体の内部臓器に影響を与えるのに対し、子供の頃に疾患が始まる場合、皮膚に目立った症状が現れるが、身体の臓器には極めて軽微な症状が現れたり、臓器に影響を与えないこともある。もし、この疾患の症状が骨髄または身体の内部臓器に現れると、この疾患を「全身性肥満細胞症（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）」と呼ぶ。大部分の患者の場合、ゆっくり進行する傾向を示すが、ある患者は、肥満細胞症診断の際、骨髄異形成疾患（Ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）または骨髄増殖疾患（Ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）のような血液疾患が発見されたりもする。肥満細胞症の進行と予後は、このような血液系疾患に関連して決定される。より深刻な肥満細胞症と肥満細胞性白血病が極少数の患者から現れる。肥満細胞症は男性と女性において同じ比率で現れ、小児期－発病形態の肥満細胞症は、主に２歳の頃に始まる。
成人期－発現の肥満細胞症の場合、遺伝的突然変異によって肥満細胞成長因子（ｃ－ｋｉｔ）受容体の過度の活動で異常な肥満細胞が現れる。そして、このような突然変異は、特定の組織内で肥満細胞が蓄積されるようにする原因とされる。肥満細胞から出る媒介体であるヒスタミン、ヘパリン、プロスタグランジンＤ２のような物質によって症状が現れる。ヒスタミンは自然的な化学物質であり、正常なアレルギー反応時に放出される。これによって、かゆみ（ｉｔｃｈｉｎｇ）、ウィージング（ｗｈｅｅｚｉｎｇ）、血管拡張、そして胃酸が過度に分泌する。ＫＩＴ遺伝子の突然変異が機能を得た時、全身性肥満細胞症が現れるという報告がある。ＫＩＴは、造血、肥満細胞の発達と機能、配偶子形成（ｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）およびメラニン形成（ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）の機能と関連性があるチロシンキナーゼ受容体である。ＫＩＴ遺伝子は、４番染色体の長腕に位置（４ｑ１２）し、等級ＩＩＩ受容体チロシンキナーゼ（ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、ＫＩＴを暗号化する。ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖは、肥満細胞症において最も優勢なＫＩＴ突然変異であり、全身性肥満細胞症のための世界保健機関の診断基準に準ずるケースの９０％以上で起こる。しかし、その正確な発病機序はまだ知られていない状況である。
臨床血液内科で広く使用されるＴＫ抑制剤であるイマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）（ＳＴＩ５７１）が野生型（ｗｔ）ＫＩＴまたは稀に発生するＦ５２２Ｃ－突然変異されたＫＩＴの変異体を示す新生物性肥満細胞の増殖を妨げることが、最近明らかになった（Ａｋｉｎ Ｃ，Ｂｒｏｃｋｏｗ Ｋ，Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＳＴＩ５７１ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｂｅａｒｉｎｇ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｏｒ ｍｕｔａｔｅｄ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｃ－ｋｉｔ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ２００３；３１：６８６－６９２．；Ｍａ Ｙ，Ｚｅｎｇ Ｓ，Ｍｅｔｃａｌｆｅ ＤＤ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃ－ＫＩＴ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃａｕｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＳＴＩ５７１ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＫＩＴ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ；ｋｉｎａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｉｔｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｓｈｏｗ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｔｈａｎ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｏｓｅ ｗｉｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｔｙｐｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｂｌｏｏｄ２００２；９９：１７４１－１７４４．；Ｆｒｏｓｔ ＭＪ，Ｆｅｒｒａｏ ＰＴ，Ｈｕｇｈｅｓ ＴＰ，Ａｓｈｍａｎ ＬＫ．Ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｕｔａｎｔ Ｖ５６０ＧＫｉｔ ｉｓ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ Ｉｍａｔｉｎｉｂ（ＳＴＩ５７１）ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｃ－ｋｉｔ ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｍｕｔａｎｔ Ｄ８１６ＶＫｉｔ ｉｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ．ＭｏＩ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００２；１：１１１５－１１２４．；Ａｋｉｎ Ｃ，Ｆｕｍｏ Ｇ，Ｙａｖｕｚ ＡＳ，Ｌｉｐｓｋｙ ＰＥ，Ｎｅｃｋｅｒｓ Ｌ，Ｍｅｔｃａｌｆｅ ＤＤ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｆｏｒｍ ｏｆ ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃ－ｋｉｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｍａｔｉｎｉｂ．Ｂｌｏｏｄ．２００４；１０３：３２２２－３２２５．）。しかし、イマチニブは、ｃ－ＫＩＴ突然変異Ｄ８１６Ｖを有する新生物性肥満細胞の増殖を抑制するのに失敗し、このため、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖを遮断して全身肥満細胞症における新生物性肥満細胞の増殖を遮断する新規ＴＫ抑制剤の開発が必要である。
そこで、本発明者らは、肥満細胞症の治療に使用できる新規物質を開発するための研究を行って、本発明を完成した。
本発明の一つの目的は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む肥満細胞症の予防または治療用薬学的組成物を提供することである：
。
本発明の他の目的は、下記化学式１で表される化合物またはその許容可能な塩を含む肥満細胞症の予防または改善用食品組成物を提供することである：
。
本発明の他の目的は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む組成物を肥満細胞症患者に投与するステップを含む肥満細胞症の治療方法を提供することである：
。
本発明の他の目的は、肥満細胞症を予防または治療するための、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供することである：
。
本発明の他の目的は、肥満細胞症を予防または治療するための薬学的組成物製造のための、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供することである：
。
本発明の一態様は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む肥満細胞症の予防または治療用薬学的組成物を提供することである：
。
本発明の他の態様は、下記化学式１で表される化合物またはその許容可能な塩を含む肥満細胞症の予防または改善用食品組成物を提供することである：
。
本発明の他の態様は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む組成物を肥満細胞症患者に投与するステップを含む肥満細胞症の治療方法を提供することである：
。
本発明の他の態様は、肥満細胞症を予防または治療するための、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供することである：
。
本発明の他の態様は、肥満細胞症を予防または治療するための薬学的組成物製造のための、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供することである：
。
本発明の一具体例による２，３，５－置換されたチオフェン化合物を含む組成物は、肥満細胞症の増殖抑制率および肥満細胞症によって発生する炎症反応の抑制活性に優れているので、肥満細胞症の予防、改善または治療に有用に活用できる。
ｃ－ｋｉｔタンパク質のアミノ酸配列のうち８１６番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）からバリン（Ｖ）に置換された突然変異を示す図である。 （Ａ）本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１、（Ｂ）スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、および（Ｃ）ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）の処理濃度によるｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ Ｂａ／Ｆ３細胞株内のシグナル伝達阻害能を示す写真である。 （Ａ）陰性対照群であるＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄ）、（Ｂ）、（Ｃ）スニチニブ、および（Ｄ）（Ｅ）（Ｆ）本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１の処理濃度によるｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ Ｂａ／Ｆ３細胞株のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＰＩ ＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。 （Ａ）陰性対照群であるＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄ）、（Ｂ）スニチニブ、および（Ｃ）本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１の処理によるｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ Ｂａ／Ｆ３細胞株のｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。 （Ａ）陰性対照群であるＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄ）、（Ｂ）スニチニブ、および（Ｃ）本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１の処理によるｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ Ｂａ／Ｆ３細胞株の各細胞周期別ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを示すグラフである。 本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１、イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）およびスニチニブの処理濃度によるＨＭＣ－１．２細胞株内のシグナル伝達阻害能を示す写真である。 本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１およびイマチニブの処理濃度によるＨＭＣ－１．２細胞株の細胞死滅効果をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＰＩ ＦＡＣＳ分析方法で確認した結果を示すグラフである。 本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１、イマチニブおよびスニチニブの処理濃度によるＨＭＣ－１．２細胞株の細胞死滅効果をウェスタンブロット分析方法で確認した結果を示す写真である。 本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１、イマチニブおよびスニチニブの経口投与２１日目に肥満細胞症マウスモデルの状態を比較した写真である。 本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１、イマチニブおよびスニチニブの経口投与による肥満細胞症マウスモデルにおける腫瘍増殖抑制活性を比較したグラフである。 本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１、イマチニブおよびスニチニブの経口投与（Ａ）０日目および（Ｂ）２１日目に肥満細胞症マウスモデルにおける腫瘍の体積を示すグラフである。 本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１、イマチニブおよびスニチニブの経口投与２１日目に肥満細胞症マウスモデルにおける（Ａ）腫瘍の体積および（Ｂ）腫瘍の重量を対照群に対する比率で示すグラフである。 本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１、イマチニブおよびスニチニブの経口投与２１日目に肥満細胞症マウスモデルの脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）を示す写真である。 本発明の一具体例によるＰＨＩ－１０１、イマチニブおよびスニチニブの経口投与２１日目に肥満細胞症マウスモデルの（Ａ）脾臓／体重の比率および（Ｂ）脾臓／体重の比率を対照群と比較して示す写真である。
本発明の一態様は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む肥満細胞症の予防または治療用薬学的組成物を提供することである：
。
本発明の一具体例において、前記肥満細胞症は、肥満細胞性白血病、全身性肥満細胞症、および侵襲性全身性肥満細胞症からなる群より選択されるいずれか１つの疾病であってもよい。
本発明の一具体例において、前記肥満細胞症は、ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する８１６番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）がバリン（Ｖａｌｉｎｅ）またはヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）に置換されて発生するものであってもよい。
本発明の一具体例において、前記肥満細胞症は、ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する５６０番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）がバリンに置換；ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する８２９番目のアミノ酸であるアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）がプロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）に置換；ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する５７６番目のアミノ酸であるロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）がプロリンに置換；ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する５５９番目のアミノ酸であるバリンがアスパラギン酸に置換；ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する６７０番目のアミノ酸であるスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）がイソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）に置換；およびｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する６５４番目のアミノ酸であるバリンがアラニンに置換；からなる群より選択される１つ以上の置換によって発生するものであってもよい。
本発明の他の態様は、下記化学式１で表される化合物またはその許容可能な塩を含む肥満細胞症の予防または改善用食品組成物を提供することである：
。
本発明の他の態様は、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む組成物を肥満細胞症患者に投与するステップを含む肥満細胞症の治療方法を提供することである：
。
本発明の他の態様は、肥満細胞症を予防または治療するための、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供することである：
。
本発明の他の態様は、肥満細胞症を予防または治療するための薬学的組成物製造のための、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供することである：
。
以下、本発明を一つ以上の実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１．ｃ－ｋｉｔ突然変異細胞株に対するＰＨＩ－１０１の抑制活性の確認
１－１．ｃ－ｋｉｔ突然変異細胞株の成長阻害能の確認
化学式１で表される化合物（以下、「ＰＨＩ－１０１」という）のｃ－ｋｉｔ突然変異細胞株に対する抑制活性を測定した。
。
具体的には、ｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ突然変異（図１）Ｂａ／Ｆ３細胞株を１０，０００ｃｅｌｌｓ／１００μｌに合わせて、９６ウェルプレートに１００μｌずつ入れた。４時間後、Ｂａ／Ｆ３細胞株１００μｌに、１０ｐｏｉｎｔ、１／３ずつ連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）した対照化合物およびＰＨＩ－１０１をそれぞれ０．５μｌずつ処理して、最終濃度が最高５０μＭとなるように処理し、５％ＣＯ２の３７℃条件で７２時間培養した。対照化合物としては、ｃ－ｋｉｔ抑制剤であるイマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）およびスニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）を使用した。培養後、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ ｇｌｏ ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞数を測定して、対照化合物およびＰＨＩ－１０１の５０％成長抑制値（ＧＩ５０、μＭ）を測定した。
その結果、ＰＨＩ－１０１は、対照化合物に比べてｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ Ｂａ／Ｆ３突然変異細胞株に対する高い阻害能を示すことが確認され、ｐａｒｅｎｔａｌ Ｂａ／Ｆ３細胞株に比べてより高い選択性を示すことが確認された（表１）。
１－２．ｃ－ｋｉｔリン酸化および下位シグナル伝達阻害能の確認
ｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株において、対照化合物およびＰＨＩ－１０１のｃ－ｋｉｔリン酸化および下位シグナル伝達阻害能（ｐ－ＳＴＡＴ３、ｐ－ＥＲＫ１／２）を測定し、対照化合物としてはスニチニブおよびダサチニブを使用した。
具体的には、ｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で分注し、対照化合物およびＰＨＩ－１０１をそれぞれ０．１、１および１０μＭの濃度で処理し、２時間培養した。その後、溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１％ＮＰ４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ、Ｎａ３ＶＯ４および２．５ｍＭ ＮａＦ、およびプロテアーゼ阻害剤混合物（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ））を用いて細胞溶解物を得た。同量の細胞溶解物を８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｇｅｌを用いて１００Ｖで１時間３０分間電気泳動し、分離されたタンパク質をニトロセルロースメンブレンに電気的に移動させた。メンブレンを５％脱脂乳で室温で３０分間ブロッキングした後、一次抗体ｐ－ｃ－ｋｉｔ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ７１９（Ｙ７１９）、ｐ－ＳＴＡＴ３ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ７０５（Ｙ７０５）およびｐ－ＥＲＫ１／２ Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ２０２／Ｔｙｒｏｓｉｎｅ２０４（Ｔ２０２／Ｙ２０４）を１：５０００で希釈して、メンブレンと４℃で１６～２０時間反応させた。発現の程度を比較するための対照群として、抗－βアクチン（ａｃｔｉｎ）を１：１００００の比率で希釈して一次抗体として使用した。以後、メンブレンをＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間３回ずつ洗浄した後、ＨＲＰ－結合抗－ｒａｂｂｉｔを二次抗体として１：１００００の比率で希釈して室温で１時間培養した後、ＴＢＳＴで５分間３回ずつ洗浄し、化学発光基質試薬を処理し、暗室でフィルムで発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を検出してタンパク質の発現程度を確認した。
その結果、ＰＨＩ－１０１は、対照化合物に比べてｐ－ｃ－ｋｉｔ（Ｙ７１９）リン酸化に対する高い阻害能を示し、対照化合物と類似の下位シグナル伝達（ｐ－ＳＴＡＴ３、ｐ－ＥＲＫ１／２）阻害能を示すことが確認された（図２）。
１－３．細胞死滅効果の確認
ｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株にＰＨＩ－１０１を処理した後、細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）効果を分析した。
具体的には、ｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株を１×１０６／ｍｌの濃度で分け、ＰＨＩ－１０１を０．１、１、１０μＭの濃度で、対照化合物としてはスニチニブを１、１０μＭの濃度で２４時間処理した。その後、培地を除去し、１ｍｌ ＰＢＳで１回洗浄した。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳを除去した。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含んでいるＰＢＳ１００μｌで細胞を溶かし、５μｌ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖを入れて２０分間反応させた。反応が終わると、４００μｌのＣａ２＋、Ｍｇ２＋を含んでいるＰＢＳを追加し、５μｌ ＰＩ（Ｐｒｏｐｏｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）を入れた後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ－Ｃ６、ＢＤ）を用いてＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）分析法で細胞死（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）の程度を調べた。
その結果、ＰＨＩ－１０１は、０．１μＭの濃度でも細胞死滅を強く誘導し、濃度依存的に細胞死が増加することが確認された（図３）。
１－４．細胞周期進行抑制効果の確認
ｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株にＰＨＩ－１０１ １μＭを処理した後、ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ＦＡＣＳ分析によりＳｕｂＧ１／ＧＯ－１ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを分析した。
具体的には、ｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株を１×１０６／ｍｌの濃度で分け、ＰＨＩ－１０１および対照化合物であるスニチニブを１μＭの濃度で２４時間処理した。その後、培地を除去し、ｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株を７０％エタノールに入れて、４℃で２４時間固定した後、４０μｇ／ｍｌ ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）および１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅが混合されたＰＢＳ緩衝溶液で３０分間反応させて、ｔｏｔａｌ ＤＮＡをすべて染色した。染色された細胞の細胞周期の分析はフローサイトメーター（ＦＡＣＳ－Ｃ６、ＢＤ）を用いて行われた。Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期にある細胞の比率（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）を測定し、これに基づいて、ＳｕｂＧ１／ＧＯ－１ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを確認した。
その結果、ＰＨＩ－１０１の処理によってＳｕｂＧ１／ＧＯ－１ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎが増加して、ｃ－ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ突然変異Ｂａ／Ｆ３細胞株の細胞周期の進行がスニチニブに比べて抑制されることが確認された（図４および図５）。
実施例２．肥満細胞症細胞株に対するＰＨＩ－１０１の抑制活性の確認
２－１．肥満細胞症細胞株の成長阻害能の測定
肥満細胞症（Ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）細胞株に対するＰＨＩ－１０１の抑制活性を測定した。
具体的には、ＨＭＣ－１．２細胞株（イマチニブ耐性細胞株、ｃ－ｋｉｔ Ｇ５６０Ｖ／Ｄ８１６Ｖ突然変異保有）に対して、対照化合物およびＰＨＩ－１０１のＧＩ５０（μＭ）を実施例１－１の方法と同様の方法で測定し、対照化合物としては、イマチニブ、ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、スニチニブおよびポナチニブ（Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ）を使用した。
その結果、ＰＨＩ－１０１は、対照化合物に比べて著しいＨＭＣ－１．２細胞株阻害能を示すことで確認された（表２）。
２－２．ｃ－ｋｉｔリン酸化および下位シグナル伝達阻害能の確認
肥満細胞症細胞株において、対照化合物およびＰＨＩ－１０１のｃ－ｋｉｔリン酸化および下位シグナル伝達阻害能（ｐ－ＳＴＡＴ５、ｐ－ＡＫＴ、ｐ－ＥＲＫ）を測定し、対照化合物としてはイマチニブおよびスニチニブを使用した。
具体的には、ＨＭＣ－１．２細胞株に０．１、１μＭの濃度の対照化合物および０．０１、０．１、１μＭの濃度のＰＨＩ－１０１を処理し、一次抗体としてｐ－ｃ－ｋｉｔ、ｐ－ＳＴＡＴ５、ｐ－ＡＫＴおよびｐ－ＥＲＫを１：３０００で希釈して使用したことを除けば、実施例１－２と同様の方法でｃ－ｋｉｔリン酸化と下位シグナル伝達阻害能を確認した。
その結果、ＰＨＩ－１０１は、濃度依存的にｃ－ｋｉｔおよび下位シグナルのリン酸化を減少させ、対照化合物に比べてはるかに高い下位シグナル阻害能を示し、０．１μＭでも下位シグナルを強く阻害することが確認された（図６）。
２－３．Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＰＩ ＦＡＣＳ分析による細胞死滅効果の確認
肥満細胞株にＰＨＩ－１０１を処理して、細胞死滅マーカーであるｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰおよびｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３の水準を分析し、対照化合物としてはイマチニブを使用した。
具体的には、ＨＭＣ－１．２細胞株に１μＭの濃度の対照化合物および０．１、１μＭの濃度のＰＨＩ－１０１を処理したことを除けば、実施例１－３と同様の方法で分析して、ＨＭＣ－１．２細胞株に対するＰＨＩ－１０１の細胞死滅効果を分析した。
その結果、ＰＨＩ－１０１は、１μＭでも細胞死滅を強く誘導したことが確認されて、肥満細胞株に対するＰＨＩ－１０１の細胞死滅効果を確認した（図７）。
２－４．ウェスタンブロット分析による細胞死滅効果の確認
肥満細胞株にＰＨＩ－１０１を処理して、細胞死滅マーカーであるｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰおよびｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３の水準を分析し、対照化合物としてはイマチニブおよびスニチニブを使用した。
具体的には、ＨＭＣ－１．２細胞株に１μＭの濃度の対照化合物および０．１、１μＭの濃度のＰＨＩ－１０１を処理し、一次抗体としてｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰおよびｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３を１：５０００で希釈して使用したことを除けば、実施例１－２と同様の方法で分析して、ＨＭＣ－１．２細胞株に対するＰＨＩ－１０１の細胞死滅効果を分析した。
その結果、ＨＭＣ－１．２細胞株において対照化合物に比べて高いｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰおよびｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３の水準が確認されて、肥満細胞株に対するＰＨＩ－１０１の細胞死滅効果を確認した（図８）。
実施例３．マウスモデルにおけるＰＨＩ－１０１の肥満細胞症に対する抑制活性の確認
３－１．ＨＭＣ－１．２細胞株を用いた肥満細胞症マウスモデルの確立
マウスは６～８週齢のＮＯＤ ＳＣＩＤ雌マウス（１８～２２ｇ）（ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）で用意した。マウスを実験に用いる前の７日間順化させており、健康に異常のあるマウスは実験から除いた。４０％～７０％の相対湿度に維持される２２±３℃の飼育場（３００×１８０×１５０ｍｍ）で１２時間の明暗周期でマウスを飼育した。プロトコルで明示された期間を除いた全体実験期間の間、滅菌された乾燥顆粒食品（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｋｅａｏｘｉｅｌｉ Ｆｅｅｄ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）および水をマウスが自由に摂取できるようにした。
７５Ｔフラスコで浮遊形態で培養されたＨＭＣ－１．２細胞５０ｍｌを円錐管（ｃｏｒｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に入れて１２００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、ｗｅｌｇｅｎｅ）で１２００ｒｐｍで２分間遠心分離して洗浄した後、抗生剤およびＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）のないＲＰＭＩ１６４０（ｗｅｌｇｅｎｅ）に懸濁させた。細胞をトリパンブルー（Ｔｒｙｐｈａｎ ｂｌｕｅ）で染色し、血球計算板（ｈｅｍａｔｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で細胞数を計測した後、０．１ｍｌ Ｌ－１５およびＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ、ｃａｔ．Ｎｏ．３５６２３４）の混合物（１：１）中のＨＭＣ－１．２細胞（１×１０６）を、Ａｖｅｒｔｉｎ（２５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔投与して痲酔されたマウスの右脇腹に皮下注射して腫瘍を誘導した。
その後、平均腫瘍サイズが１５０～２００ｍｍ３に到達した時、各グループおよび処理時点で平均腫瘍の体積が同一となるように、マウスを各グループごとに４匹ずつ割り当て、３週間毎日イマチニブ９０ｍｇ／ｋｇ、スニチニブ２０、４０ｍｇ／ｋｇ、ＰＨＩ－１０１ ７、２０、４０、８０ｍｇ／ｋｇの用量をそれぞれマウスに毎日１回経口投与した。経口投与時、各化合物は５％１－メチル－２－ピロリドンに溶かした後、１５％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ、３０％ＰＥＧ Ｅ４００ ＨＳ１５および５０％０．０５Ｍクエン酸に完全に混合して使用した。
３－２．肥満細胞症抑制活性の確認
ＨＭＣ－１．２細胞株を用いた肥満細胞症マウスモデルにおいて、ＰＨＩ－１０１の投与によって肥満細胞症が抑制されるかを確認した。
具体的には、毎日、実施例３－１の肥満細胞症マウスモデルの皮膚状態、出血および便の状態などを確認して異常の有無をモニタリングしながら、薬物の経口投与開始後３日間隔でマウスの体重を測定して体重の変化の有無を確認した。また、キャリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて３日間隔で幅および長さを測定し、腫瘍の体積を次の式を用いて計算した。
Ｖ＝（Ｗ（２）×Ｌ）／２
（Ｖ：腫瘍の体積、Ｗ：腫瘍の幅、Ｌ：腫瘍の長さ）
また、薬物の経口投与開始後３週間目にマウスを犠牲にし、腫瘍の重量（ｔｕｍｏｒ ｗｅｉｇｈｔ）をデジタル秤を用いて測定し、各データについてはＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いて各群の有意性テストを進行させた。
その結果、ＰＨＩ－１０１の投与によって濃度依存的に肥満細胞症細胞の増殖が抑制されることが確認され、対照化合物処理群に比べて４０ｍｇ／ｋｇ以上の濃度でＰＨＩ－１０１を処理した群で肥満細胞症の増殖が著しく抑制されたことが確認された（図９～図１２）。
一方、実験の間、肥満細胞症マウスモデルにおいて異常症状は発見されておらず、非特異的な体重減少（＜１０％）が現れる投与群はなく、ＰＨＩ－１０１は、８０ｍｇ／ｋｇの高用量でも体重の減少がないことが確認された。
３－３．肥満細胞症による炎症反応抑制活性の確認
ＨＭＣ－１．２細胞株を用いた肥満細胞症マウスモデルにおいて、ＰＨＩ－１０１の投与によって肥満細胞症による炎症反応が抑制されるかを確認した。
具体的には、実施例３－１の肥満細胞症マウスモデルに薬物投与３週後、マウスを犠牲にし、体重（ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）および脾臓の重量（ｓｐｌｅｅｎ ｗｅｉｇｈｔ）をデジタル秤を用いて測定した後、脾臓／体重の比率を求めた。
その結果、ＰＨＩ－１０１の投与によって対照群に比べて濃度依存的に脾臓／体重の比率が減少したことが確認されて（図１３および図１４、表４）、ＰＨＩ－１０１の投与によって肥満細胞症による炎症反応も効果的に抑制されたことが確認された。
実施例４．多様なｃ－ｋｉｔタンパク質の突然変異におけるＰＨＩ－１０１のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合活性の確認
４－１．キナーゼ分析
キナーゼ－標識された（ｋｉｎａｓｅ－ｔａｇｇｅｄ）Ｔ７ファージ（ｐｈａｇｅ）菌株は、ＢＬ２１菌株に由来する大膓菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主として用意された。大膓菌を対数期（ｌｏｇ－ｐｈａｓｅ）に成長させ、Ｔ７ファージに感染させた後、溶解するまで３２℃で振盪させながら培養した。溶解物を遠心分離および濾過して細胞残骸を除去した。その後、ｑＰＣＲ検出のためにＨＥＫ－２９３細胞で生成されたキナーゼをＤＮＡで標識した。ストレプトアビジン－コーティングされた（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｃｏａｔｅｄ）磁性ビーズをビオチニル化された（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）小分子リガンドで室温で３０分間処理して、キナーゼ分析のための親和性樹脂を生成した。リガンドビーズを過剰のビオチンでブロッキングし、非結合リガンドの除去および非特異的結合を減少させるためにブロッキングバッファー（ＳｅａＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄した。キナーゼ、リガンド親和性ビーズおよびＰＨＩ－１０１を１ｘ結合バッファー（２０％ＳｅａＢｌｏｃｋ、０．１７ｘ ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、６ｍＭ ＤＴＴ）と混合して結合反応を誘導した。ＰＨＩ－１０１を１００％ＤＭＳＯ中の１１１Ｘストックとして用意した。結合定数（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｋｄ）は、３個のＤＭＳＯ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｏｉｎｔを有する１１－ｐｏｉｎｔ ３－ｆｏｌｄ化合物連続希釈法（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｓｅｒｉｅｓ）を用いて決定された。Ｋｄ測定のためのすべての化合物は１００％ＤＭＳＯでａｃｏｕｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ（ｎｏｎ－ｃｏｎｔａｃｔ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）によって分配された。その後、化合物をＤＭＳＯの最終濃度が０．９％となるように分析に直接希釈させた。すべての反応はそれぞれ０．０２ｍｌの最終体積でポリプロピレン３８４－ウェルプレートで行われた。分析プレートを１時間振盪させながら室温でインキュベーションし、親和性ビーズを洗浄バッファー（１ｘ ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。次に、ビーズを溶離バッファー（１ｘ ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５μＭ非－ビオチニル化親和性リガンド）に再懸濁させ、３０分間振盪させながら室温でインキュベーションした。溶離液中のキナーゼの濃度はｑＰＣＲによって測定された。
４－２．化合物処理
それぞれの試験化合物の１１－ｐｏｉｎｔ ３－ｆｏｌｄ連続希釈液を１００ｘ最終試験濃度で１００％ＤＭＳＯとして用意した後、分析において１ｘで希釈した（最終ＤＭＳＯ濃度＝１％）。大部分のＫｄは化合物の最高濃度＝３０，０００ｎＭを用いて測定された。決定された初期Ｋｄが＜０．５ｎＭ（試験された最低濃度）の場合、より低い最高濃度から始めて連続希釈で測定を繰り返した。４０，０００ｎＭで測定されたＫｄ値はＫｄが＞３０，０００ｎＭであると表示した。
４－３．結合定数の分析
ｃ－ｋｉｔタンパク質のＫｄはＨｉｌｌ ｅｑｕａｔｉｏｎを用いて標準用量－反応曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃｕｒｖｅ、数式１）で計算した。
Ｈｉｌｌ Ｓｌｏｐｅは－１に設定された。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムおよび非線形最小二乗法（ｎｏｎ－ｌｉｎｅａｒ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅ ｆｉｔ）を用いて曲線をフィッティングした。
４－４．多様なｃ－ｋｉｔタンパク質の突然変異に対するＰＨＩ－１０１の結合活性抑制効果の確認
実施例４－１～４－３の方法で多様なｃ－ｋｉｔタンパク質の突然変異に対するＰＨＩ－１０１の結合活性抑制効果を分析した。
その結果、ＰＨＩ－１０１は、７個の突然変異ｃ－ｋｉｔタンパク質の結合活性を抑制することが確認された（表５）。
このような結果を通して、ＰＨＩ－１０１は、ｃ－ｋｉｔタンパク質のうちＡ８２９Ｐ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８１６Ｖ、Ｌ５７６ＰまたはＶ５５９Ｄ突然変異を有する肥満細胞症、ｃ－ｋｉｔタンパク質のうちＶ５５９ＤとＴ６７０Ｉ突然変異を同時に有する肥満細胞症、およびｃ－ｋｉｔタンパク質のうちＶ５５９ＤとＶ６５４Ａ突然変異を同時に有する肥満細胞症の治療に特に効果的に使用できることを確認した。
これまで本発明についてその実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は、上述した説明ではなく、特許請求の範囲に示されており、それと同等の範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれていると解釈されなければならない。

Claims (6)

  1. 下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む肥満細胞症の予防または治療用薬学的組成物：
    。
  2. 前記肥満細胞症は、肥満細胞性白血病、全身性肥満細胞症、および侵襲性全身性肥満細胞症からなる群より選択されるいずれか１つの疾病である、請求項１に記載の肥満細胞症の予防または治療用薬学的組成物。
  3. 前記肥満細胞症は、
    ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する８１６番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）がバリン（Ｖａｌｉｎｅ）またはヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）に置換されて発生するものである、請求項１に記載の肥満細胞症の予防または治療用薬学的組成物。
  4. 前記肥満細胞症は、
    ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する５６０番目のアミノ酸であるグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）がバリンに置換；
    ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する８２９番目のアミノ酸であるアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）がプロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）に置換；
    ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する５７６番目のアミノ酸であるロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）がプロリンに置換；
    ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する５５９番目のアミノ酸であるバリンがアスパラギン酸に置換；
    ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する６７０番目のアミノ酸であるスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）がイソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）に置換；および
    ｃ－ｋｉｔタンパク質を構成する６５４番目のアミノ酸であるバリンがアラニンに置換；
    からなる群より選択される１つ以上の置換によって発生するものである、請求項１に記載の肥満細胞症の予防または治療用薬学的組成物。
  5. 下記化学式１で表される化合物またはその許容可能な塩を含む肥満細胞症の予防または改善用食品組成物：
    。
  6. 肥満細胞症を予防または治療するための薬学的組成物製造のための、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩の使用：
    。
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