JPH06500775A - 新規な５ＨＴ１ａ受容体を介する悪性細胞増殖の調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な５Ｈｂ 本出願は１９９０年９月４日出願の米国特許出願第０７１５７８７１０号の一部 継続出願である。明確化のために、５ＨＴ２類似受容体が５Ｈｂ 定されている。

新規５ＨＴ２類似受容体が形質転換ジュルカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞上に存在 すること、および、当該受容体がヒト科Ｔリンパ球（活性化Ｔ細胞）上に存在す ることが初期的な研究により明らかにされている。さらに、実験により、５ＨＴ 受容体が活性化されかつ休止していないＴ細胞上に存在すること、これらの５Ｈ Ｔ受容体とジェルカット細胞上の５ＨＴ受容体とが類似の薬理特性を有すること 、さらに、当該５ＨＴ受容体が、条件により、アデニル酸シクラーゼ活性を調節 し、ＣＤ４＋細胞の増殖を抑制し、また、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進すること ができることが確認されている。さらに、薬理的、生物化学的および分子構造分 析の組み合わせによる当該ジュルカット細胞および活性化Ｔ細胞上の５ＨＴ特定 受容体のキャラクタリゼーションにより、５ＨＴ受容体の存在が確認されており 、また、該ジュルカット細胞および活性化Ｔ細胞上の受容体が受容体の５ＨＴｌ ａ族に属していることが知られている。すなわち、当該ジュルヵット細胞および 活性化Ｔ細胞の場合、このことは、５ＨＴｂ ての検討、信号トランスダクションの検討、および、特定ヒト科５ＨＴ１ａオリ ゴヌクレオチドプローブを用いてのノーリン（ｎｏｒｔｈｅｒｎ）分析法等の判 定基準に基づいている。一方、休止Ｔｍ胞はこれらの判定基準によっては５ＨＴ ｂ らの知見は当該受容体や細胞増殖のメカニズムに相互作用する化合物を同定する ための種々の方策を開拓する基礎となってきた。

本発明は細胞表面分子として存する新規セロトニン受容体の認識に基づく細胞増 殖の調節に関する。当該新規受容体は５Ｉ（Ｔ２族に属するセロトニン受容体で ある。

なお、該５ＨＴ２類似受容体は、例えばＣＤ４＋やＣＤｓ十等の、悪性細胞若し くは腫瘍細胞、さらには、活性化Ｔ細胞上に存在する。

本発明はまた増殖している細胞がセロトニンを含有／表現することの認識に基づ く細胞増殖の調節に関する。

なお、該セロトニンを含有する悪性または腫瘍細胞および活性化Ｔ細胞の増殖は セロトニン合成の阻害によって低減することができる。

本発明はまた、細胞増殖を促進もしくは抑制するために、効果的な量のアゴニス ト若しくはアンタゴニストを導入することによって、当該新規５ＨＴ２受容体を 示す細胞増殖の調節に関する。

免疫システムの細胞に結合するか若しくはある作用を及ぼすための多くの神経伝 達物質が開示されている（文献１参照）。そのような神経伝達物質の−っである セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）はまた炎症部位において 放出される血小板の主生成物でもある（２−４）。また、セロトニンはＩＦＮ誘 導誘導ファイサイトシス大するためのもの（５）、マクロファージ上のＩＦＮ誘 導１ａ表現を抑制するためのもの（６）、ＮＫ細胞細胞毒性を増大するためのも の（７）、単離ブレーＢリンパ球におけるイオン浸透性に影響を及ぼすためのも の（８）、および、インビトロにおけるマイトゲン促進のＴ細胞増殖を抑制する ためのもの（９）が知られている。さらに、当該セロトニンおよびセロトニン受 容体はマウスモデルにおける遅延型過敏症の表現のために必要とされることが示 唆されている（１０−１１）。

また、当該セロトニン受容体の機能的、薬理的および分子構造的特性が末梢およ び中枢神経系において特徴付けられている（１２）。さらに、５ＨＴの異なる作 用を媒介する受容体の明確なカテゴリーが規定されている（１３）。また、５Ｈ Ｔアンタゴニストを使用する実験によって、遅延型過敏症応答を真正な受容体に 転移することのできるＴリンパ球が５ＨＴ受容体を表現できるということが示唆 されている（１１）。また、ケタンセリン（ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ）やリタンセ リン（ｒ　ｉ　ｔ　ａｎｓｅｒｉｎ）等の特定の５ＨＴ２アンタゴニストは当該 応答の転移を防止する。なお、ここに報告された実験の目的は５ＨＴ受容体の並 順型がヒト科Ｔリンパ球上に同定できるか、および、当該５ＨＴ受容体が神経系 における５ＨＴ受容体についてそれ以前に報告されたものと類似の信号トランス ダクションを媒介し得るかを決定することであった。その結果、ヒト科Ｔリンパ 系（ジュルカット）が、フォスファチジルイノシトール加水分解および細胞内Ｃ ａ＋十可動化を媒介し得る５ＨＴ２類似受容体亜類型を表現することがわかった 。

また、休止１９２８球の活性化は、当該活性化がこれらの細胞に調節やイフェク ターの活性を作用させるために、たいていの免疫応答に対して臨界関係にある。

また、当該活性化の間は、比較的無活動状態の細胞が細胞分化や増殖を含む複雑 な変化をする。さらに、当該Ｔリンパ球の活性化は該Ｔ細胞と抗原存在細胞との 界面において生じるリガンド−受容体間相互作用の結果である。なお、当該Ｔリ ンパ球および抗原存在細胞上の多数の異なる細胞表面分子は抗原のプレゼンテー ション時に生じる上記の複雑な細胞−細胞間相互作用に関与することが可能であ り、抗原−誘導Ｔリンパ球の活性は当該Ｔ細胞抗原受容体の刺激を含む必要があ る。ただし、当該Ｔ細胞抗原受容体の刺激だけでは増殖応答を誘導するには不十 分であり、該Ｔ細胞上に表現される他の細胞表面分子が補助分子として機能する 。該補助分子は接合分子として機能することができ、抗原受容体を介して開始し たトランスメンブランシグナルを修飾し、かつ／または、それら自体のトランス メンブランシグナル作用を開始する。

該細胞表面分子の多くは上記Ｔ細胞の活性化、分化、および増殖に伴う作用の間 に該Ｔ細胞の表面上に現出する。なお、該Ｔ細胞の増殖はＩ　Ｌ−２の作用を通 して、その特定の細胞表面受容体上で主に調節されると考えられている。なお、 該ＩＬ−２はまた他のＴ細胞の増殖において生じるいわゆるオートクリン（ａｕ ｔｏｃｒｉｎｅ）およびバラクリン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）作用を有する。

さらに、該ＩＬ−２作用下のＴ細胞増殖は当該Ｔ細胞成長のための主たるメカニ ズムとして考えられているが、特定の状況においては、当該Ｔ細胞の増殖がＩＬ −２と独立して生じる。

新規な５ＨＴ２類似受容体が活性化Ｔ細胞上に細胞表面として存在することが知 られているが、当該新規な５ＨＴ２類似受容体がセロトニン合成の阻害により調 節できることもすでに認識されている。

本発明はまた細胞増殖を促進または抑制するために新規な５ＨＴ２アンタゴニス トを呈示する細胞の増殖を調節することに関する。

さらに、本発明は新規な５ＨＴ２類似受容体を呈示する細胞増殖の調節に関する 。当該抗体は５ＨＴ２類似受容体に対して特定な単−若しくは複数のエピトープ を有する複数の「型」の抗体を含む。さらに、該抗体の「型」には、ポリクロー ナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ（ｃｈｔｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化若し くはヒト科抗体をも含む。

さらに、本発明は、５ＨＴ２類似受容体または該５ＨＴ２類似受容体に対する抗 体に結合するミモトーブ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）や小ペプチドリガンドを生じるこ とによって新規な５ＨＴ２類似受容体を呈示する細胞増殖の調節に関する。なお 、該小ペプチドリガンドはアゴニストおよび／またはアンタゴニストとして機能 する。

正常な二倍体細胞の増殖は一般に内因性若しくは外因性の成長因子の連続的供給 の存在を必要とする。また、腫瘍細胞の増殖は一般に外因性成長因子の付加を必 要としないと認識されている。これは、腫瘍細胞が該細胞自体の成長因子を生成 する能力を有すること、成長因子受容体が変化してそれらが連続的に活性化する こと、あるいは、シグナルトランスダクションの要素が変化して当該腫瘍細胞の 連続的な活性化が引き起こされること等に起因する。該腫瘍細胞はまた特異な受 容体を表現でき、また、通常親細胞組織に連係のない特異なホルモンや成長因子 を生成することもできる。さらに、最近では、正常な二倍体マウス繊維芽細胞に おける５ＨＴ１ｃまたは５ＨＴ２受容体の表現（遺伝子トランスフェクションに よる）によって、これらの細胞における形質転換の表現型が得られることが明ら かになっている。つまり、これらの受容体をエンコードするｃＤＮＡが導入され ると、形質転換された細胞が二次メツセンジャーシグナルを形質転換する５ＨＴ に対する高アフィニティ受容体を表現する。また、これらの繊維芽細胞により、 組織培養における集合点が形成され、ソフトアガーにおける成長が可能になり、 はだか鼠において腫瘍形成が生じる。このことは、セロトニンの合成および５Ｈ Ｔ受容体の変体の表現が腫瘍形成において重要な役割を果たす可能性を示すもの である。つまり、正常な細胞は、二次メツセンジャー経路を形質転換することの できるセロトニンおよび／またはセロトニン受容体を合成する能力を得ることに より、形質転換の表現型を得ることができる。したがって、ここで示す結論とし ては、（１）増殖細胞はセロトニンを含む、（２）セロトニン合成の阻害は、正 常な細胞によってではなく、腫瘍細胞により細胞増殖を阻害する、（３）正常細 胞ではなく、腫瘍細胞の増殖はある特定のセロトニン受容体アンタゴニストによ って阻害される。

免五見鷹ｌ ５ＨＴ２類似受容体に対する結合に有効なセロトニンの量を機能的に減少するこ と、または、当該５ＨＴ２類似受容体結合部位の有効性を機能的に低減すること から成る５ＨＴ２類似受容体を呈示する細胞の増殖を抑制的に調節する方法。当 該方法は悪性細胞または腫瘍細胞および活性化Ｔ細胞に適用される。該活性化Ｔ 細胞はＩＬ−２依存性でもよく、また、ＩＬ−２非依存性であってもよい。当該 細胞の増殖は、セロトニン合成を阻害する酵素トリプトファンヒドロキシラーゼ の活性を阻害する化合物を十分量投与することによって抑制される。当該化合物 の例としてはｐ−クロロフェニルアラニンが挙げられる。

５ＨＴ２類似受容体結合部位の有効性を機能的に低減することから成る５ＨＴ２ 類似受容体を呈示する細胞の増殖を抑制的に調節する方法において、当該増殖が 、該細胞増殖を阻止するために、当該５ＨＴ２類似受容体に結合するに足る量の 少なくとも一種のアンタゴニストを導入することよって、抑制されることを特徴 とする方法。

当該少なくとも一種のアンタゴニストは５ＨＴ受容体リガンドの群から選択され る。さらに、当該５ＨＴ受容体リガンドの群には、リタンセリン（ｒｉｔａｎｓ ｅｒｉｎ）、メスラジン（ｍｅｓｕｌｅｒｇｉｎｅ）　、ミアンセリン（ｍｉａ ｎｓｅｒｆｎ）、スビペロン（ｓｐｉｐｅｒｏｎｅ）、および、当該５ＨＴ２類 似受容体に対するミモトーブおよび抗体が含まれる。

５ＨＴ２類似受容体結合部位の有効性を機能的に高めることから成る５ＨＴ２類 似受容体を呈示する細胞を促進的に調節する方法。該細胞の増殖は、当該細胞増 殖を促進するに十分な量の少なくとも一種のアゴニストを導入することによって 高められる。該少な（とも一種のアゴニストは５ＨＴ受容体リガンドの群から選 択される。

さらに、該５ＨＴ受容体リガンドの群はペランセリン（ｐｅｌａｎｓｅｒｉｎ） 、ケタンセリン（ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ）、メチルセロトニン、８−　ＯＨ−Ｄ 　Ｐ　Ａ　Ｔ。

およびプロプラノロールを含む。

５ＨＴ２類似受容体に対する結合に有効なセロトニンの量を機能的に減少するこ と、または、当該５ＨＴ２類似受容体結合部位の有効性を機能的に低減すること による５ＨＴ２類似受容体を呈示する細胞の増殖を抑制的に調節することから成 る哺乳類のＴ細胞依存型病状の治療方法。当該細胞の増殖は、セロトニン合成を 阻害する酵素トリプトファンヒドロキシラーゼの活性を阻害する化合物の効果量 を投与することによって抑制される。当該化合物の例としてはｐ−クロロフェニ ルアラニンが挙げられる。

５ＨＴ２類似受容体結合部位の有効性を機能的に低減することによる５ＨＴ２類 似受容体を呈示する細胞の増殖を抑制的に調節することから成る哺乳類のＴ細胞 依存型病状の治療方法において、当該増殖が、該細胞増殖を阻止するために、当 該５ＨＴ２類似受容体に結合するに足る量の少なくとも一種のアンタゴニストを 導入することよって、抑制されることを特徴とする方法。当該少なくとも一種の アンタゴニストは５ＨＴ受容体リガンドの群から選択される。さらに、当該５Ｈ Ｔ受容体リガンドの群には、リタンセリン（ｒｉｔａｎｓｅｒｉｎ）、メスラジ ン（ｍｅｓｕｌｅｒｇｉｎ）、ピレンペロン（ｐｉ　ｒｅｎｐｅ　ｒｏｎｅ）　 、スビペロン（ｓｐｉｐｅｒ。

ｎｅ）、および、当該５ＨＴ２類似受容体に対するミモトーブおよび抗体が含ま れる。

５ＨＴ２類似受容体に対する結合に有効なセロトニンの量を機能的に減少するこ と、または、当該５ＨＴ２類似受容体結合部位の有効性を機能的に低減すること による５ＨＴ２類似受容体を呈示する細胞の増殖を抑制的に調節することから成 る哺乳類の腫瘍性病状の治療方法。

当該細胞の増殖は、セロトニン合成を阻害する酵素トリプトファンヒドロキシラ ーゼの活性を阻害する化合物の効果量を投与することによって抑制される。当該 化合物の例としてはｐ−クロロフェニルアラニンが挙げられる。

５ＨＴ２類似受容体結合部位の有効性を機能的に低減することによる５ＨＴ２類 似受容体を呈示する細胞の増殖を抑制的に調節することから成る哺乳類の腫瘍性 病状の治療方法において、当該増殖が、該細胞増殖を阻止するために、当該５Ｈ Ｔ２類似受容体に結合するに効果的な量の少なくとも一種のアンタゴニストを導 入することよって、抑制されることを特徴とする方法。当該少なくとも一種のア ンタゴニストは５ＨＴ受容体リガンドの群から選択される。さらに、当該５ＨＴ 受容体リガンドの群には、リタンセリン（ｒｉｔａｎｓｅｒｉｎ）、メスラジン （ｍｅｓｕｌｅｒｇｉｎ）、ビレンペロン（ｐｉｒｅｎｐｅｒｏｎｅ）、スビベ ロン（ｓｐｉｐｅｒｏｎｅ）、および、当該５ＨＴ２類似受容体に対するミモト ープおよび抗体が含まれる。

５ＨＴ２類似受容体結合部位の有効性を機能的に高めることから成る５ＨＴ２類 似受容体を呈示するＴ細胞の増殖を促進的に調節することによる哺乳類の免疫欠 損病状の治療方法。該細胞の増殖は、当該細胞増殖を促進するに十分な量の少な くとも一種のアゴニストを導入することによって高められる。該少なくとも一種 のアゴニストは５ＨＴ受容体リガンドの群から選択される。さらに、該５ＨＴ受 容体リガンドの群はペランセリン（ｐｅｌａｎｓｅｒｉｎ）、ケタンセリン（ｋ ｅｔａｎｓｅｒｉｎ）、メチルセロトニン、８−０Ｈ−ＤＰＡＴ、プロプラノロ ールおよびミアンセリンを含。

の　な　日 第１図はジュルカット細胞に結合している５ＨＴを示すためのグラフである。該 ジュルカット細胞（ＩＸ１０６）は、５０μＭの５　ＨＴ’　（非特定結合）の 非存在下（全結合）または存在下４℃で６分間（”Ｈ）５ＨＴの指定濃度で培養 した。特定結合（ロ）はこれら二つの値の差として表現されている。第１Ａ図は スキャッチャードプロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ　ｐｌｏｔ）上に示した結果を 示す。

第２図はジュルカット細胞に対する（”Ｈ）５ＨＴの会合および解離の速度を示 す図である。（Ａ）はジュルカット細胞に対する（”Ｈ）５ＨＴの会合の経時変 化を示す。条件は、培養時間が異なること（［］）以外は、「材料および方法」 の欄において記載したものである。

（Ｂ）はジュルカット細胞からの（ＩＨ）５ＨＴ結合（ロ）の解離の経時変化を 示す。

第３図はジュルカット細胞における細胞内Ｃａ２″″イオン濃度についての０Ｋ Ｔ３および５ＨＴの作用の比較を示す図である。データ収集を開始してから約５ 秒後に、０ＫＴ３　（１μｇ／ｍｌ）または５ＨＴ　（５μＭ）を直接細胞に添 加して、データを合計４分にわったて採集した。次いで、相対細胞内カルシウム 濃度を紫色蛍光（カルシウム結合インド−１（ｉｎｄｏ−１））と青色蛍光（カ ルシウム遊離インド−１）との対比から計算して、時間の関数としてプロットし た。

第４図は細胞内Ｃａ”における５ＨＴ媒介の増加の濃度依存性を示す図である。

インド−１を付与したジュルカット細胞を３７℃で２分間５ＨＴ存在下に培養し た。

増加した細胞内（ａ２＋（■）を有する細胞と全細胞内Ｃａ２＋濃度（ロ）との 比率を「材料および方法」に記載するような装置（ＦＡＣ８ＴＡＲＰ　１　ｕ　 ｓ）を用いて蛍光の増加を計測することによって決定した。この場合、陽性細胞 は３７５乃至４２５ｎＭのＣａ−を含み、陰性細胞は１５０乃至１７５ｎＭのＣ ａ’“を含むのもとした。

第５図はフォスファチジルイノシトールターンオーバーにおける５ＨＴ媒介増加 を示す図である。ジニルカット細胞を（”Ｈ）イノシトール存在下４８時間ラベ ル処理した。次いで、ラベル処理した細胞を３μＭの５ＨＴ（ロ）または１μｇ ／ｍｌの０ＫＴ３　（■）の存在下に所定時間培養し、その後、集菌してアニオ ン交換クロマトグラフィによりＩＰレベルの分析を行った。

第６Ａ図はＴ細胞の胚（ｂｌａｓｔｓ）への３Ｈ−５ＨＴの特定結合を示す図で ある。

第６Ｂ図はＴ細胞の胚へのケタンセリンの結合を示す図である。

第６Ａ−１図および第６Ｂ−１図は第６Ａ図および第６Ｂ図からそれぞれ得られ た結合データのスキャツチャード分析を示している。

第７図は種々の５ＨＴ受容体リガンドを用いた競争実験を示す図である。

第８図はＰＢＬにおける５ＨＴの同定を示す図である。

第９図はＰＢＬの増殖についての５ＨＴの作用を示す図である。

第１０図は５ＨＴ受容体に結合し、Ｔ細胞増殖を促進または抑制する類似体を示 す図である。

第１１図はＰＷＭによるＣＤＳ＋サプレッサＴ細胞の活性化が５ＨＴを必要とす ることを示す図である。

第１２図は５ＨＴに結合する類似体の存在下または非存在下に０ＫＴ３により刺 激されたＰＢＬの作用を示す図である。

第１３Ａ図および１３Ｂ図は腫瘍細胞上のセロトニン受容体の特性を示す図であ る。（Ａ）ジュルカット細胞を対数増殖期から採取し、３Ｈ−５ＨＴ　（◆）、 １２５１−ＬＳＤ　（◇）、３Ｈ−ケタンセリン（■）、３Ｈ−８０Ｈ−ＤＰＡ Ｔ　（Ｅｌ）または３Ｈ−ＤＯＢ　（［］）（ＮＥＮ）の存在下で５０ＨＭの５ ＨＴの存在下または非存在下に６分間、Ｏ乃至４℃で、ＲＰＭ１１６４０媒体の 全容積６００μｌ中において３Ｘ１０’／ｍｌに培養した。当該期間中（図示せ ず）に結合平衡に到達した。次いで、細胞をニトロセルロース膜（ミリボア（Ｍ ｉｌｌｉｐｏｒｅ））上に収集し、試験管およびフィルタを冷却したＰＢ８４ｍ ｌによりそれぞれ３回洗浄した。アスコルビン酸塩（１００μＭ）を当該洗浄液 に加え、フィルタへの非特定結合を減少した（１５）。この結果、特定結合が全 結合と５０ＨＭ５ＨＴの存在下に観察された結合との差として表現される。

第１３Ａ−１図は５ＨＴ　（ロ）とケタンセリン（◆）を用いた結合データのス キャッチャード分析を示す。Ｋｄは１３０ｎＭであった。

（Ｂ）細胞を１００μｎＭの３Ｈ−５ＨＴおよび所定濃度の５ＨＴ（［Ｅｌ）、 ケタンセリン（ｏ）、ａ〜メチルセロトニン（◆）、メスラジン（■）　、８０ Ｈ−ＤＰＡＴ（◇）およびリタンセリン（ロ）等の５ＨＴ受容体リガンドの存在 下Ｏ℃で６分間培養し、上記の如く結合３Ｈ−５ＨＴを決定した。その後、５０ ＨＭの５ＨＴ存在下で特定結合を決定した。

第１４図は５ＨＴ受容体リガンドによる腫瘍細胞増殖のリタンセリン媒介による 阻害の逆反応を示す図である。

ＭＥ１８０細胞をリタンセリン（２０ＨＭ）の存在下または非存在下で、所定濃 度の５ＨＴ　（［Ｅｌ）　、ペランセリン（◆）、ケタンセリン（ロ）、ミアン セリン（◇）、８０Ｈ−ＤＰＡＴ　（■）、プロプラノロール（ロ）等の５ＨＴ 受容体リガンドの存在下または非存在下に４８時間培養した。次いで、１μＣｉ の”Ｈ−ＴｄＲを用いて当該培養の最後の６時間でラベル処理を行い、その後、 収集してＤＮＡ内への取込みを測定した。結果をリタンセリンまたは他のリガン ドの非存在下におけるＭＥ１８０細胞培養への’Ｈ−ＴｄＲの取込み制御の割合 として表現した。ＭＥ１８０細胞による３Ｈ−ＴｄＲの取込みはりタンセリンの 非存在下では４０６７９＋／−２５４８であり、リタンセリンの存在下では２２ １５＋／−４３３であった。したがって、これらのリガンドはそれらの特定５Ｈ Ｔ受容体部位に１１−１Ｏｎの間で作用する。

第１５図はＴ細胞胚の細胞内ｃＡＭＰ含有量における５ＨＴ依存変化を示す図で ある。

第１６図は５ＨＴ添加後のＴ細胞培養におけるｃＡＭＰ含有量（０）および増殖 （・）の変化の割合を示す図である。

第１７図はガンマインターフェロン（ＩＦＮ）への抗増殖作用の阻害を示す図で ある。（Ａ）ＭＥ１８０細胞を３００μＭトリプトファン（閣）または５μＭ５ Ｈｔｐ（◆）の存在下または非存在下（ロ）でＩＦＮを用いて３日間培養した。

（Ｂ）ＭＥ１８０細胞を異なる濃度の５Ｈｔｐ（Ｅりまたはトリプトファン（◆ ）の存在下で１００ｕ／ｍｌのＩＦＮを用いて３日間培養した。その後、１μＣ ｉの’Ｈ−ＴｄＲにより４時間処理した後、対照の細胞増殖は’Ｈ−ＴｄＲの８ ８７６５±１２５６Ｃｐｍとなった。

第１８図は５Ｈｔｐの能力比較とガンマインターフェロンの抗増殖作用を逆転す るための５Ｈｔｐの代謝物質を示す図である。ＭＥ１８０細胞を所定濃度の５Ｈ ｔｐ（０）　、５ＨＴ　（・）、メラトニン（■）、Ｎ−メチルセロトニン（ロ ）または５−ヒドロキシインドール酢酸（×）の存在下または非存在下に１００ ｕ／ｍｌのＩＦＮを用いて３日間培養した。対照の増殖は７３４５６±２２８９ Ｃｐｍであり、ＩＦＮ存在下の増殖では１６８９４±１１４５であった。

第１９図はガンマＩＦＮを用いた培養後のトリプトファンおよび５ＨＴの細胞損 失を示す図である。ＭＥ１８０細胞を１００ｕ／ｍｌのＩＦＮ存在下（・）また は非存在下（０）に所定日数経過後した後、採取して、ＨＰＬＣにより５ＨＴ含 有量（上図）およびトリプトファン含有量（下図）をそれぞれ分析した。

第２０図は５ＨｔｐがガンマＩＦＮを用いる培養において細胞外トリプトファン の損失を阻害しないことを示す図である。ＭＥ１８０細胞を１００　ｕ　／　ｍ 　ＩのＩＦＮ存在下（・、口）または非存在下（０）で、１０ＨＭ５Ｈｔｐの存 在下（・）または非存在下（ロ）に培養した。

培養媒体を所定日数経過後に採取し、ＨＰＬＣによりトリプトファン含有量を分 析した。

第２１図は５Ｈｔｐが低トリプトファンによって細胞増殖の阻害を逆転すること を示す図である。ＭＥ１８０細胞をＲＰＭＩ−１６４０媒体中で、所定量のトリ プトファンを用いて、３μＭの５Ｈｔｐの存在下（・）または非存在下（０）に ４８時間培養した。結果を２日目の６時間の処理後の”Ｈ−ＴｄＲの取込みとし て示した。

■の−　な−Ｂ まず５ＨＴ受容体亜類型がヒト科Ｔリンパ球上に同定し得るか、また、５ＨＴ受 容体がシグナルトランスダクションに媒介し得るかを決定するための検討を行っ た。

ここで、５ＨＴはセロトニン若しくは５−ヒドロキシチブタミンを示し、ＤＯＢ は（Ｒ）−（−）−４−ブロモ−２，５−ジメト牛シーアンフェタミン、８０Ｈ −ＤＰＡＴは８−ヒドロキシ−２−（ジ−ｎ−プロピルアミン）テトラリン、Ｉ Ｐはリン酸イノシトール、ＩＣ５０は５０％にまで応答を阻害するに要する濃度 、さらに、ＥＣ５０は最大応答の半分を生じるに要する濃度をそれぞれ示す。

区１ ’Ｈ−５ｈ　ｔ　（２０Ｃｉ／ｍｍｏ　ｌ）　、”Ｈ−ケタンセリン（６５Ｃｉ ／ｍｍｏ　Ｉ）　、”’−Ｉリセルグ酸ジアミ　ド　（ＬＳＤ、２２００Ｃｉ／ ｍｍｏ　ｌ）　、　”Ｈ−８０Ｈ−ＤＰＡＴ　（１２８Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および ｓＨ−ミオ−イノシトール（４８Ｃｉ　／ｍｍｏ　ｌ）をニューイングランドニ ュークリア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）から入手した。ＦＣＳ 、ＲＰＭＩ　１６４０およびＬ−グルタミンをギブコ（ＧＩＢＣＯ）から入手し た。また、インド−１をシグマケミカル社（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｃｅｈｍｉｃａｌ 　Ｃｏ、）から入手した。

ジュルカット細胞をアメリカンタイプカルチャコレフシラン（Ａｍｅｒｉｃａｎ 　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手し、１０％ＦＣＳ 添加で抗体の非存在下かつ１ｍＭグルタミンの存在下にＲＰＭ１１６４０媒体中 において連続的な培養状態に維持した。

ジュルカット　か゛の　の ジュルカット細胞の１−２１培養体を遠心分離により採取し、ＥＤＴＡ１ｍＭ含 有、ｐＨ７，５のトリス塩酸１０ｍＭ液に懸濁して、氷上で１０分間培養し、そ の後、ホモゲナイザ（Ｄｏｕｎｃｅ　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で均一化して全 量で２０２０−４Ｏにした。その後、該ホモゲネートを１１００００ｘで１０分 間遠心分離して、核と細胞くずを除去した。この上澄み液をさらに１１００００ ０ｘで１時間遠心分離した。次いで、該ペレットをＥＤＴＡ含有のトリス塩酸バ ッファに懸濁して７．７ｍｇ／ｍ＋の蛋白濃度にした。この試料膜を結合アッセ イに使用するまで一７０℃で保存した。

Ｌ血ヱユ皇ｌ ジュルカット細胞を対数増殖期の培養体から採取し、全量６００μｌで３．０Ｘ ＩＯ＠／ｍ＋に、若しくは、ＲＰＭ１１６４０存在下０乃至４℃で、”Ｈ−５Ｈ Ｔ存在下に、５ＨＴアゴニストまたはアンタゴニスト（詳細はテキスト参照）存 在下または非存在下で６分間培養した。当該培養中に結合平衡に到達した。また 、細胞を３Ｈ−５ＨＴで培養することにより置換反応を行い、次いで、テキスト に記載のラベル化されていないアゴニストまたはアンタゴニストでの培養を行っ た。その後、細胞をグラスファイバフィルタ上に収集し、試験管およびフィルタ を冷却したＰＢ３４ｍｌで３回洗浄した。次いで、”’Ｉ−ＬＳＤ若Ｌ＜！ｔ” Ｈ−８０Ｈ−ＤＰＡＴＰｉ合が評価された時点でアスコルビン酸塩（１００μＭ ）を当該洗浄液に加えてフィルタに対する非特定結合を減少した（１４−１５） 。

各フィルタの洗浄時間は２０秒以下である。また、３Ｈ−５ＨＴのジュルカット 細胞に対する全結合の代表値は１０１００ｎ全添加ｃｐｍ数：１０＠）のＩＨ− ５ＨＴ存在下１１００００−１５０００ｃｐであった。なお、１００μＭ５ＨＴ （非特定結合）の存在下では約１５００−３０００ｃｐｍが結合したままであっ た。次に、会合速度についての検討をするため、細胞を１１００ｎの３Ｈ−５Ｈ Ｔ存在下で１００μＭの５ＨＴ存在下オヨヒ非存在下に種々の時間で培養した。

次いで、結合反応をＰＢＳの添加により停止して、濾過した。同様に、解離速度 について検討するため、細胞を１１００ｎの５Ｈ−５ＨＴ存在下でＯ乃至４℃で １０分間培養した。その後、５ＨＴを最終濃度が１００μＭとなるまで添加し、 反応を冷却したＰＢＳを加えて停止し、さらにサンプルを濾別した。このように して、結合アッセイを最小３回二重に行ない、該二重のサンプルは互いに５％以 内であった。

ジュルカット細胞の試料膜を用いての結合アッセイを、総蛋白量５００乃至７０ ０　μｇ　／　ｍ　１でｐＨ７，５のトリス塩酸バッファ中で行うことを除いて 、同様の手順で行った。

Ｃａ＋＋ 細胞内Ｃａ＋十の移動化を改良した装置（Ｂｅｃｔ。

ｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣ８ＴＡＲＰｌｕｓ）を用いたインド−１法によ って評価した（１６−１７）。

つまり、ジュルカット細胞を３７℃で４５分間ＨＥＰＥ８１０ｍＭ存在下ＤＭＥ Ｍ中で２μＭのインド−１により培養し、その後、３回洗浄して１０６個／ｍｌ でＰＢＳ中に懸濁した。その一部（１ｍｌ）を３７℃に保ち、修飾したサンプル 配置場所に保持して、データ収集を開始した。データ収集を始めてから約５秒後 に、５ＨＴまたは０ＫＴ３　（濃度についてはテキスト参照）を当該サンプルに 直接添加し、全体で４分間にわたりデータ測定をした。蛍光発光は集光レンズに 対して４５’に配置した長光路フィルタ（４５５ｎｍカットオフ）によって分割 され、２個の帯域光路フィルタＢ　Ｐ　４８５／２２およびＢＰ３９５／２０を 通して同時に測定される。次いで、収集した一連のデータを処理して紫色蛍光（ ３９５／２０ｎｍ）の青色蛍光（４８５／２２ｎｍ）に対する比率値を時間の関 数として得る。このようにすることにより、カルシウム濃度を以下の式により計 算する。

［（ａ　＋＋コ　＝Ｋｄ　−（Ｒ−Ｒｍ　ｉ　ｎ）　／　（Ｒｍａｘ−Ｒ）・Ｓ 　ｆ　２／Ｓ　ｂ　２ 上式において、Ｋｄは解離定数（２５０ｎｍ）であり、Ｒ，ＲｍｉｎおよびＲｍ ａｘは、休止状態、ゼロおよび飽和カルシウム濃度におけるそれぞれの蛍光強度 比率の値であり、Ｓｆ２／Ｓｂ２はカルシウム遊離およびカルシウム結合染料の 蛍光強度の比率値を示す（１８）。

また、全ポピユレーションに対する個々のジュルカット細胞の応答についての５ ＨＴの濃度の影響を評価した。

この場合、細胞を３７℃に保ち、５ＨＴを加えて２分間培養した。その後、１０ ０００個のデータリストを収集した。次いで、該データを紫色蛍光と青色蛍光の 比により分析し、標準偏差閾値の約２倍に相当する細胞数の割合をめた。これら の実験は最小３回行い同様の結果をジュルカット細胞（２ｘ１０”／ｍｌ）を１ ０μＣ１／ｍｌのｓＨ−ミオ−イノシトールを用いてＲＰＭＩＩ６４０媒体中で １％透析ＦＣ８存在下４８時間ラベル化した。その後、細胞を採集し、ＦＣＳ無 しのＲＰＭＩＩ６４０媒体中で２回洗浄した。次いで、該細胞をＦＣＳ無しの媒 体中に３７℃、ｌＸｌ０’／ｍ！で懸濁し、テキストに記載の如＜５ＨＴで処理 した後、遠心分離により数回収集した。その後、抽出物を７規定ＫＯＨで中和し 、上述のようにしてアニオン交換クロマトグラフィによりＩＰのレベル値を分析 した（１９）。二重に作成したサンプルは５％以内であり、当該リン酸イノシト ールのレベル値の測定は３回行い同様の結果を得た。

ＰＢＭ立二且ｌ ＰＢＭＣを正常な提供者から得た血液中のバッフィコートから得た。次いで、当 該ＰＢＭＣをリンパ単離勾配（ｉｓｏｌｙｍｐｈ　ｇｒａｄｔｅｎｔｓ　（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ、Ｐｆｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））上で単離して、ＰＢＳ中で２ 回洗浄した。その後、１０％ＤＭＳＯ−９０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯＳＧｒａｎｄ 　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）の溶液中に懸濁し、使用するまで液体窒素中に保存した 。当該液体窒素中での保存後のＰＢＭＣの細胞表面Ａｇおよび増殖応答は新鮮な リンパ球特性と同一であった。

ＰＷＭおよびＰＨＡをＧ　Ｉ　ＢＣＯ（ＯＫＴ３をマウス（ＢＡＬＢ／ｃ　ｍ１ ｃｅ）の腹水から得て、１：１０００の希釈で使用）から得て、ＰＢＳ中で１／ ８０に希釈し、培養に使用した。また、精製した組換または天然Ｉ　Ｌ−２をボ ーエリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ　ｒ　Ｍａｎｎｈｅ　ｉｍ　（Ｉ ｎｄ　ｉ　ａｎａｐｏ　ｌ　ｉ　ｓ。

ＩＮ））から購入した。Ｉ　Ｌ−２活性の１単位を２４時間アッセイにおけるＩ Ｌ−２依存型細胞系ＣＴＬＬの最大増殖を５０％生じさせるに要する量として定 義した。

なお、精製したｒＩＬ−１、ｒＩＬ−４およびｒｒＬ−６をゲンザイム（Ｇｅｎ ｚｙｍｅ　（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ））から入手した。

級ｎ旦Ｉ ＰＢＭＣ，ＣＤ４＋細胞ＭＣまたはＣＤ４＋細胞を１０％ＦＣＳ添加で抗体無添 加のＲＰＭＩ−１６４０媒体中、３乃至８日間、フラットボトム９６−ウェルミ クロカルチャープレート（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｆｎｓ。

ｎ）中で、５Ｘ１０’個細胞／ｍｌの濃度に、空気中５％ｃｏの加湿雰囲気中に おいて総容量１００乃至２００μｌで培養した。次いで、（”Ｈ）ＴｄＲの取込 みを測定するために、ＩＣｉの（３Ｈ）チミジン（２Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒ ｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を 、細胞がフィルタ紙（ＰＨＤ　ｃｅｌｌ　ｈａｒｖｅｓｔｅｒ、Ｃｈａｒａｂ　 ｒ　ｔ　ｄ　ｇ　ｅ、　ＭＡ）上に採取される１８時間乃至２０時間前に二重に 、培養体に添加した。データは当該二重に作成したサンプルの（”Ｈ）ＴｄＲの 取込みの平均値を示している。なお、当該二重に作成したサンプルは５％以内で あり、さらに、これらの実験を少なくとも３回行って同様の結果を得ており、次 の実験において陽性調節として再現した。

微生物アッセイへの適用：１６　：１７０６゜結合アッセイをジュルカット細胞 についてｐ１５−１６に記載したと同様に行った。

表１１ ５ＨＴ合成の阻害は腫瘍細胞°系による増殖の阻害をもたらす。ＭＥ１８０頸管 がん腫細胞をＡＴＣＣから入手し、（）に記載の如く保持した。次いで、該細胞 を４８時間培養し、５ＨＴ含有量か”Ｈ−ＴｄＲの添加による細胞増殖のいずれ かについて分析をおこなった。３Ｈ−ＴｄＲ：媒体と細胞を分離し、５ＨＴを抽 出して、蛋白質を７０％エタノールで沈殿させた。その後、サンプルを装置（Ｓ ｐｅｅｄ−ｖａｃ、）を用いて濃縮した。

次いで、サンプルの５ＨＴ含有量を、２８０ｎｍ励起フィルタと３６０ｎｍ発光 フィルタとを有する蛍光検出装置（Ｂｅｃｋｍａｎ）を備えたＨＰＬＣ（Ｈｅｗ ｌ　ｅ　ｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）によって分析した。Ａ（リン酸によりｐＨ３，０ に調節した５　０　ｍ　Ｍ　）リエチルアミン）とＢ（４０％メタノールでｐＨ ３，０の５０ｍＭ　トリエチルアミン）とから成る二つの移動相を用意した。勾 配はＡ１００％からＢ１００％まで２５分間で線形とした（５１）。標準的な保 持時間を次のようにした。５ＨＴ。

３．５０分、５０Ｈ−トリプトファン、４．７７分、トリプトファン、９．１１ 分、５０Ｈ−インドール酢酸、１２．５分、および、メラトニン、２１．６９分 。この場合も、細胞を培養の最後の４時間において１μＣｉの３Ｈ−ＴｄＲで処 理し、ＤＮＡへの取込みを測定するために採取した。次いで、培養を三重に行っ た。トリプトファンからの実際の５ＨＴ合成を３−Ｈトリプトファンで細胞を培 養することによって確認し、可溶性成分を抽出して、メチルプロパノ−ルー酢酸 エチル−水酸化アンモニウム−水（４５−３０−１７−８）の溶媒システムでの 薄層クロマトグラフィによって３Ｈ−５ＨＴを分析した（５２）。このような条 件下において、トリプトファンのＲｆ値は０．０３であり、５ＨＴのＲｆ値は０ ゜５０であった。

モデルシステムとして、形性転換したヒト科ジュルカットＴ細胞に対する”Ｈ− ５ＨＴの結合を調べ、Ｔ細胞が当該神経伝達物質のための特定結合部位を表現で きるかを決定した。これらの細胞は、抗原やマイトゲンの刺激によるシグナルト ランスダクシジンの機構を探求するために、これまで多くの研究者によって使用 されてきた（２０−２１）。第１図示の結果はジュルカット細胞に対する”Ｈ− ５ＨＴの結合が検出可能であり、当該結合が飽和し得ることを示している。また 、所定濃度（第１図）の５ＨＴの存在下における’Ｈ−５ＨＴ結合の量からラベ ル化されていない５ＨＴの１００μＭ存在下におけるｊＨ−５ＨＴ結合の量を差 し引くことによって、特定結合を決定した。なお、これらの５ＨＴの濃度におい ては、当該特定結合は全結合の約７０−８０％であり、”Ｈ−５ＨＴの最大結合 比率には培養して５分以内に到達する（第２図）。また、５ＨＴの結合は１乃至 ２μＭの５ＨＴにおいて最大となる。第１Ａ図は当該結合データのスキャッチャ ードブロフトを示している。また、３種の分離した実験からのデータにより、解 離定数（Ｋｄ）の平均値９０ｎＭを得た。さらに、”Ｈ−５ＨＴのジュルカット 細胞に対する結合部位密度は１０６個の細胞当たり１３０ｆｍｏｌすなわち１細 胞当たり８００００受容体であった。加えて、これらデータについてのヒルスロ ープ（Ｈｉ　ｌ　１　ｓ　１ｏｐｅ）値は０．８であった（図示せず）。さらに 、アフィニティ定数や受容体密度についての影響を調べるために種々の結合条件 を検討した。その結果、２ｍＭまでのＭ　ｇ　＋＋イオン、１０μＭまでのバル ジリン、３ｍＭまでのＥＤＴＡ若しくは１０μＭまでのイミブラミン（５ＨＴの 捕捉を阻止する）の添加は結合定数や受容体密度を変更しないことがわかった（ データ示さず）。なお、ここに示す全ての結果は対数増殖期から由来したもので ある。また、１０’個／ｍ１を超える培養体から得たジュルカット細胞は５ＨＴ 受容体が実質的に少ない。さらに、これらの培養体はまたＣａ＋＋イオンを移動 したりリン酸イノシトールの濃度を増加することによって５ＨＴに対して応答し ない。

単離した膜試料もまた同様の特性を５ＨＴに付与する。

さらに、５ＨＴの結合は１−２μＭの５ＨＴにおいて飽和状態に達し、スキャッ チャード分析により決定されたＫｄの平均値は１６０ｎＭであった。また、当該 ５ＨＴの結合および解離の速度（以下を参照）は完全な細胞や膜試料の場合と同 様であった。さらに、同様な５ＨＴの濃度若しくは５ＨＴアゴニストまたはアン タゴニストの濃度では、”Ｈ−５ＨＴの膜試料または完全な細胞への結合が防止 される。また、５ＨＴの試料膜への結合と完全な細胞への結合との主な差は受容 体／細胞の数の計算により明らかとなる。この結果、完全な細胞では当該細胞当 たりの受容体の数は５ｏｏｏｏであり、単離した膜試料における該数値は３００ ００であった。現時点では、何がこの差に起因しているのかは不明である。しか し、結合データが５ＨＴ濃度の関数として５ＨＴに対する完全な細胞の生物学的 応答に対比されているので、当該完全な細胞に対する５ＨＴの結合の結果のみを ここでは報告する。

次いで、結合の速度を調べた。第２ａ図における結果から、”Ｈ−５ＨＴの結合 は４分で完了し、最大結合の半分が３０秒で生じたことがわかる。結合は１０分 間維持された。これらのデータから、２．ｌＸｌ０’°／　ｍ　。

１−ｍ１ｎの会合速度定数（ｋｌ）が以下の式に基づいて計算できる。

ｋｌ＝　［１／ｌ　（ａ−ｂ）　Ｉｎ　［ｂ　（ａ−ｘ）　／ａ　（ｂ−Ｘ）］ 、 同式中、ａは”Ｈ−５ＨＴの初期濃度であり、ｂは受容体の濃度であり、Ｘは時 間ｔにおける受容体−リガント濃度の量である。さらに、該受容体−リガント複 合体は過剰のラベル化しない５ＨＴの存在下に速やかに解離した。これらの結果 を第２ｂ図に示す。擬−次解離速度定数は１．１／分であり以下の式により計算 できる。

ｋ　２＝　（１／ｌ）Ｉ　ｎ　（ａ／ｘ）　、同式中、ａは時間ｔにおいて結合 した”Ｈ−５ＨＴの量である（１５）。さらに、当該に１で割ったｋｓの比の値 がＫｄの計算値であり、１８０ｎＭとなる。この値は理論的にスキャッチャード 分析により計算したＫｄ値とよく合致する。

また、５ＨＴに対する細胞表面受容体は薬理学上並びに機能特性上においていく つかの並順型に分類されている（１２−１３）、５ＨＴの５ＨＴ１ａまたは５Ｈ Ｔ１ｂ部位への結合は刺激されたアデニル酸シクラーゼの活性を阻害し、５ＨＴ １ｃまたは５ＨＴ２部位への結合はリン酸イノシトールのレベル値および細胞内 Ｃａ＋十濃度を増加する。この際、ジュルカット細胞をインド−１すなわち細胞 内Ｃａ＋十の変化に感応する蛍光染料と共に培養し、５μＭの５ＨＴまたは１ａ ｇ／ｍｌの０ＫＴ３の存在下または非存在下の培養後に、「方法」において記載 するフローサイトメトリーによって分析した。これらの結果を第３図に示す。ま た、ＰＢＳ中で培養した細胞は１ｌ５０−１７５ｎのベースラインカルシウム濃 度を有しており、１０分の間、該細胞内Ｃａ＋十濃度が変化しなかった。また、 ０ＫＴ３存在下に培養したジュルカット細胞では、細胞内Ｃａ＋十濃度が２分以 内に最大２μＭにまで増加し、その後、７００ｎＭのレベルにまで減少した。さ らに、５μＭの５ＨＴ存在下に培養したジュルカット細胞では、該細胞内Ｃａ＋ 十濃度は２分以内に４００ｎＭにまで増加した。また、当該５ＨＴで処理したジ ュルカット細胞は、０ＫＴ３に対する該ジュルカット細胞の応答の特徴である、 ［Ｃａ＋＋］における大きな初期ピークを示さなかった（２０−２１）。第４図 は当該ジュルカット細胞培養における細胞内Ｃａ＋＋濃度の増加と５ＨＴ濃度の 関数としての個々のジュルカット細胞におけるＣａ＋十濃度との比較を示してい る。

この場合、所定の５ＨＴ濃度において、該細胞は低Ｃａ＋十濃度（１５０−１７ ５ｎＭ）を有するものと高Ｃａ＋十濃度（３７５−４２５ｎＭ）を有するものと に分割することができる。したがって、第３図示の培養全体の応答は該低細胞内 Ｃａ＋十濃度または高細胞内Ｃａ＋＋濃度のいずれかを有する個々の細胞の平均 として実際的に表現できる。なお、該細胞内Ｃａ＋十濃度の増加は、当該増加し た細胞内Ｃａ＋十濃度を有する細胞の増加を意味する。さらに、最大応答の半分 が１００乃至３００ｎＭの５ＨＴの間であり、この値は上記結合データから得た 解離定数にほぼ匹敵する。

増加した細胞内Ｃａ＋十濃度は、フォスファチジルイノシトールバイオフォスフ ェートの加水分解によって生成されるＩＰ３によって媒介可能である（２２）。

５ＨＴの５ＨＴ２受容体族に対する結合が神経組織におけるリン酸イノシトール のレベルを高めることがわかった。

この場合、ジュルカットＴ細胞を３Ｈ−イノシトールで４８時間ラベル化し、３ μＭの５ＨＴまたは１μｇ／ｍｌの０ＫＴ３により刺激した。次いで、細胞を５ ＨＴまたは０ＫＴ３の添加後に種々の時間において採取して、アニオン交換クロ マトグラフィによってＩＰのレベルを分析した。第５図に示す結果から、当該Ｉ Ｐレベルが５ＨＴまたは０ＫＴ３の添加後に増加しており、１分以内に最大値に 到達していることがわかる。その後、該ＩＰレベルは１０分間にわたり減少し、 ベースラインのレベルに近付いた。なお、これらの条件下では、５ＨＴおよび０ ＫＴ３の両方の場合で同様なＩＰレベルの増加が見られた。

さらに、異なる５ＨＴ受容体亜類型を区別するために多くの５ＨＴアゴニストま たはアンタゴニストを使用した。その結果、５ＨＴ２受容体アンタゴニストの一 種であるケタンセリン、５ＨＴ２受容体アゴニストの一種であるアルファーメチ ルセロトニン、および、５ＨＴがジュルカット細胞への”Ｈ−５ＨＴの結合を阻 害した。この場合、”Ｈ−５ＨＴの特定結合の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０ ）は、ケタンセリン、アルファーメチルセロトニンおよび５ＨＴのそれぞれにつ いて２０ＨＭ、　３μＭおよび０．８μＭであった。また、５ＨＴｂ体の特定ア ゴニストの一種である８０Ｈ−ＤＰＡＴおよび５ＨＴ３受容体の特定アンタゴニ ストの一種であるＩＣ３−２０５９３０は３Ｈ−５ＨＴのジュルカット細胞への 結合を阻止しなかった。さらに、他の二種の５ＨＴＩＣ／２受容体アンタゴニス トであるミアンセリンとメスラジンは５ＨＴのジニルカット細胞に対する結合を 阻害しなかった。これらの結果を表１に示す。また、リタンセリンおよびペラン セリン等の他の５ＨＴ２受容体アンタゴニストもまた５ＨＴの結合を阻害しなか った（表示せず）。さらに、”’Ｉ−ＬＳＤＳ”Ｈ−ケタンセリンおよび”Ｈ− ＤＯＢを中枢神経系における５ＨＴ１　ｃまたは５ＨＴ２の部位をラベル化する ために使用した。また、”Ｈ−８０ＨＤＦＡＴを中枢神経系における５ＨＴ１ａ 部位をラベル化するために使用した。表２にこれらのリガンドのジニルカット細 胞に対する結合の比較をスキャッチャード分析により決定したＫｄ値と共に示し た。

この場合、特定結合を１００μＭの５ＨＴ存在下に決定した。この結果、採用の 条件下において、３Ｈ−ケタンセリンと”Ｈ−５ＨＴとがジュルカット細胞をラ ベル化し、”’Ｉ−Ｌ　Ｓ　Ｄ、！：”Ｈ−Ｄｏ　Ｂとが該ジュルカット細胞を ラベル化しなかった。さらに、”Ｈ−８０ＨＤＰＡＴもまたジュルカット細胞を ラベル化しなかった。なお、ケタンセリンについての結合定数は１１００ｎであ った。

また、これらの５ＨＴ受容体アゴニストおよびアンタゴニストのそれぞれの特定 受容体群に対するアフィニティ定数は１乃至５ＨＭの範囲内であった。

次に、上記５ＨＴ２アゴニストであるアルファーメチルセロトニンのＣａ＋十移 動度を促進する作用について試験した（表３）。この結果、３μＭの５ＨＴに比 して、１０ＨＭのアルファーメチルセロトニンにより最大のＣａ＋十移動度が生 じ、最大刺激の半分をもたらすに要する濃度（Ｅ　Ｃ５０）は、２００ｎＭの５ ＨＴに比して、アルファーメチルセロトニンの場合は１μＭであった。

また、結合した５ＨＴの置換値は同じであり、さらに、該結合５ＨＴの置換につ いてのＩＣ５０は８００ｎＭの５ＨＴに比してアルファーメチルセロトニンの場 合は３μＭであった。また、表４はいくつかの５ＨＴ２アンタゴニストについて のジュルカット細胞における５ＨＴ媒介Ｃａ＋十移動の阻害作用の比較を示して いる。該試験されたアンタゴニストのうち、ケタンセリンのみが当該５ＨＴ媒介 Ｃａ＋十移動を阻害した。また、このＩＣ５０値は１０ＨＭであった〇 表１ ５ＨＴ受容体による５ＨＴの結合の阻害アゴニスト　アンタゴニスト アンタゴニスト　六　型　ＩＣ５０” ５ＨＴ　内因性　０．８μＭ ケタンセリン　５ＨＴ２　２０ＨＭ アルファーメチルセロトニン ５ＨＴ２　３μＭ ８−ＯＨ−ＤＰＡＴ　５ＨＴ１ａ　＞５０ＨＭＩＣＳ−２０５−９３０ ５ＨＴ３　＞２０ＨＭ メスラジン　５ＨＴ１ｃ／２　＞５０ＨＭミアンセリン　５ＨＴ１ｃ　２　＞５ ０　Ｍ（ａ）　当該結合処理は、２Ｘ１０”個のジュルカット細胞を用いて、１ １００ｎのＩＨ−５ＨＴと種々の濃度のアゴニストおよびアンタゴニストの存在 下に、「方法」の部分において記載の如く行った。

表２ ジュルカット　に・　る５ＨＴ　”　リガンドの　合５ＨＴ受容体リガンド　Ｋ ｄ”　Ｋｄ’　５ＨＴ部位ジュルカット ３Ｈ−ケタンセリン　１１００ｎ　１ＨＭ　５ＨＴ２”’Ｉ−ＬＳＤ　＞１Ｏｎ Ｍ　〜１ｎＭ　５ＨＴ１ｃ”Ｈ−ＤＯＢ　＞１１００ｎ　′ＬｎＭ　５ＨＴ２ａ （ａ）　ジュルカット細胞を、１Ｈ−ケタンセリン（１−５００ｎＭ）　、”’ Ｉ−ＬＳＤ　（０，３−３−１Ｏｎまたは”Ｈ−ＤＯＢ　（０，５−５−２００ ｎ存在下、１０分間、０−４℃で培養した。１００μＭ５ＨＴの存在下特定結合 を決定した。

（ｂ）記載値は文献１２および１３から得た。

表３ ５ＨＴ２アゴニストによるＣａ＋＋ アゴニスト　３Ｈ−５ＨＴ　Ｃａ＋十移動度の置換 ＩＣ５０”　ＥＣ５０ゝ ５　ＨＴ　８００　ｎ　Ｍ　２００　ｎ　Ｍアルファーメチルセロトニン　３Ｍ 　ＬＭ（ａ）　３Ｈ−５ＨＴの置換の決定のためのデータは第５図から得た。

（ｂ）　ＥＣ５０値は種々の濃度の５ＨＴ２アゴニストを用いてジュルカット細 胞を培養し、次いでＣａ＋十濃度の変化を時間関数として調べることによって決 定した。

なお、該Ｃａ＋十の変化速度は最初の６０秒間において線形であり、５ＨＴアゴ ニストの添加後２−３分で完了する。

表４ ５ＨＴ２アンタゴニストによるＣａ＋十移動の阻害Ｃａ＋十移動度 Ｃａ＋＋　ｎＭ”　ＩＣ５０’ ５ＨＴ　（１μＭ）　４２５　−− ＋ケタンセリン　２８５　１０ＨＭ ＋ペランセリン　４３５　＞１０ＨＭ ＋ミアンセリン　４４０　＞１０ＨＭ ＋メスラジン　４６０　＞１０　Ｍ （ａ）　５ＨＴを添加する前に、ジュルカット細胞（１ｘｌＯ’／ｍｌ）を、１ ０ＨＭの所定のアンタゴニストの存在下５分間培養した。次いで、当該ジュルカ ット細胞におけるＣａ＋十移動度を、５ＨＴ添加の２分後に、「方法」に記載の ようにフローサイトメトリーにより決定した。現時点では５ＨＴに対する当該応 答は時間についてまだ線形である（第４図）。

（ｂ）　ＩＣ５０値は１μＭ５ＨＴ存在下ジュルカット細胞によるＣａ＋十移動 の５０％を阻害するアゴニストの濃度である。

神経伝達物質５ＨＴは炎症時に放出されて、遅延型過敏症応答（３，４，１０） において重要な役割を果たすと考えられている。一方、ケタンセリンやリタンセ リン等の５ＨＴのアンタゴニストは動物体における当該ＤＴＨ応答を阻止するこ とが示されている（１０−１１）。

さらに、該５ＨＴアンタゴニストによるある種の抗原特定Ｔ細胞クローンの治療 は、ＤＴＨ応答を真正な受容体に転移するそれらの能力を阻害する。しかし、二 次メツセンジャーを介して細胞内シグナルを形質転換する機能的な５ＨＴ受容体 はまだ該Ｔ細胞上に同定されていない。

すなわち、ここに記載する実験の目的は、当該５ＨＴに対する機能的受容体がヒ ト科Ｔ細胞上に同定し得るか、また、それらは中枢若しくは末梢の神経系存在す る他の種類の細胞上にすでに同定されている亜類型に類似であるかについて、生 化学および薬理学の両面について分析することである。

そこで、次に、当該５ＨＴの受容体の亜類型について、機能的に、薬理学的に、 また、分子構造的に特徴付けをした（１２−１３）、この場合、５ＨＴ１ａ、５ ＨＴ１ｂおよび５ＨＴ１ｄから成る５ＨＴ１群、５ＨＴ１ｃ。

５ＨＴ２ａおよび５ＨＴ２ｂから成る５ＨＴ２群、および、現在唯一の因子によ り構成される５ＨＴ３群を使用した。また、５ＨＴ１ａ、５ＨＴ１ｃおよび５Ｈ Ｔ２受容体をエンコードするｃＤＮＡを同定し、当該ｃ　ＤＮＡがすべて７種の メンプランスパンニングユニットを有するＧプロティンリンク受容体である蛋白 質をエンコードすることがわかった（２３−２５）。機能的には、５ＨＴの５Ｈ Ｔ１ａ部位に対する結合はアデニル酸シクラーゼの活性を変化しく２６）、カリ ウムイオン経路を変更し、さらに、神経細胞伝達を阻害する（１２−１３）。

また、５ＨＴ１ａ部位にのみ専ら結合する特定アゴニストも同定した。これらの うちの二種は８０Ｈ−ＤＰＡＴとイブサビロン（ｉｐｓａｐｉｒｏｎｅ）である 。さらに、５ＨＴの５ＨＴ１ｃまたは５ＨＴ２部位への結合がフォスファチジル イノシトールのターンオーバーと細胞内Ｃａ＋十の移動を増加することがわかっ た。また、該５ＨＴ１ｃおよび５ＨＴ２と等価的アフィニティをもって相互作用 する多くの５ＨＴ２アンタゴニストを同定した。なお、当該アンタゴニストの例 としては、メスラジンやミアンセリンが挙げられる。また、他の５ＨＴ２アンタ ゴニストとしては、ケタンセリン、リタンセリンおよびペランセリン等がある。

これらのリガンドは５ＨＴ２部位のラベル化に使用され、該５ＨＴ２部位に対し てナノモルレベルのアフィニティを有しており、さらに、目的組織内における５ ＨＴ媒介のフォスファチジルイノシトールのターンオーバーを阻害する（１２− １３）。

なお、当該５ＨＴ２群には付加的に異種因子が含まれても良い。また、フォスフ ァチジルイノシトールのターンオーバーを媒介する５ＨＴ部位を脳の海鳥領域並 びに前脳において同定した。ただし、これらの組織においては、当該フォスファ チジルイノシトールターンオーバーは極めて高濃度（５ＨＴ２部位に対する正常 なアフィニティ１１−１Ｏｎに対して１−１０ＨＭ）のケタンセリンによっての み阻害される（２７−２８）。一方、５ＨＴ３受容体は主に末梢神経系に存在し ているように見える。

なお、これらの受容体は５ＨＴ１および／または５ＨＴ２選択リガンドの影響を 受けない。しかしながら、ＩＣ５２０５９０３等の特定リガンドは末梢神経系に おいて５ＨＴの影響を阻止できることを確認した（１２−１３）。

なお、ジュルカット細胞に対する５ＨＴ結合におけるＫｄ値はスキャッチャード 分析により決定した場合は９０ｎＭであり、反応速度分析により決定した場合は １８０ｎＭであった。さらに、５ＨＴ受容体の部位の密度はジュルカット細胞１ ０６個につき１３０ｆｍｏｌまたは１個の細胞につき５ｏｏｏｏ部位であった。

すなわち、５ＨＴはフォスファチジルイノシトールのターンオーバーを刺激し、 これら細胞における細胞内Ｃａ＋十を増加する。さらに、該５ＨＴ結合の飽和と 最大のＣａ＋十応答とが１−３μＭの５ＨＴにおいて観察できた。また、該最大 Ｃａ＋十応答の半分に相当する状態が２００ｎＭの５ＨＴにおいて見られ、この 値はジュルカット細胞への５ＨＴの結合についてのＫｄ値に近い。なお、３Ｈ− ５ＨＴの結合および５ＨＴ媒介のＣａ＋十移動は特定の５ＨＴ１ａアゴニスト８ ０Ｈ−ＤＰＡＴや特定の５ＨＴ３リガンドＩＣ８−２０５９３０によって影響さ れなかった。さらに、該５ＨＴや８０Ｈ−ＤＰＡＴはジュルカット細胞における ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの濃度を変化しなかった（データ示さず）。これらのデータは５ ＨＴの上記５ＨＴ２受容体群に対する結合に一貫している。加えて、５ＨＴ２ア ゴニストであるアルファメチルセロトニンマレエートは結合した５ＨＴを置換し 、ジニルカット細胞におけるＣａ＋十移動を刺激した。しかし、ケタンセリンは 弱いアフィニティ　（１００ｎＭのＫｄ）で当該ジュルカット細胞に結合し、ま た、”’Ｉ−ＬＳＤ　（５ＨＴにより置換される）のジュルカット細胞に対する 結合は検出されなかった。また、ミアンセリン、メスラジン、ペランセリンおよ びリタンセリン（すべて５ＨＴ２アンタゴニスト）は≦２０μＭの濃度では該ジ ュルカット細胞への５ＨＴの結合を阻害せず、また、５ＨＴ媒介のＣａ＋＋移動 も阻害しなかった。ただ、ケタンセリンのみが高濃度で５ＨＴを置換し、Ｃａ＋ 十移動を阻害した（１０ＨＭで５０％）。さらに、特定５ＨＴ２ａリガンドの１ Ｈなお、該５ＨＴ結合をＣａ＋十移動度と対比して考えると、当該５ＨＴアンタ ゴニストによる効果は等価であると見なせる。以上の結果から、当該ジェルカッ ト細胞上の５ＨＴ受容体は５ＨＴ１ｃ、５ＨＴ２若しくは５ＨＴ２ｂの受容体の いずれでもないといえる。さらに、それは、５ＨＴを結合しフォスファチジルー イノシトールのターンオーバーを媒介するが、ミクロモル程度の濃度でのキタン セリンによってのみ阻害される、上記海鳥領域上に見られるものにより近いよう に見える（２７−２８）。このことは、付加的な異種因子が該５ＨＴ２群に存在 することを示唆するものである。

ここに示すデータはヒト科ジュルカット細胞上の５ＨＴ受容体を説明し、また、 当該受容体がフォスファチジルーイノシトールターンオーバーを刺激し、かつ、 これらの細胞内における細胞内Ｃａ＋十濃度を増加することを示すものである。

当該５ＨＴにより引き起こされるリン酸イノシトールのレベル増加は０ＫＴ３に より引き起こされる増加に類似している。また、５ＨＴによるＣａ＋十濃度の増 加は２分以内で１７５ｎＭから４００ｎＭであった。一方、０ＫＴ３によるＣａ ＋十濃度の増加は２分以内で最大２μＭであった。さらに、この増加値はその後 の付加的な１分以内に７００ｎＭに急速に減少した。ただし、これらのデータは 、該ジェルカット細胞上の５ＨＴとその受容体との間の生物学的または免疫学的 相互作用の結果を示すものではない。しかし、上記フオスファチジルーイノシト ールのターンオーバーはＴ細胞活性（２９参照）におけるシグナル形質転換の重 要な要素の一つであり、５ＨＴによるこの経路の刺激は重要な免疫学上の結果を もたらす。さらに、５ＨＴはまた炎症の部位において充分に存在して該Ｔ細胞の 機能を変性することができる。。また、５ＨＴは血小板の主要な蓄積生成物であ り、該炎症部位における血小板の凝集時に放出される。注目すべきは、当該血小 板における５ＨＴのレベルがリューマチ様関節炎および全身性紅斑性狼癒等の自 己免疫症により低下することである（３０）。さらに、５ＨＴ２アンタゴニスト が通常の抵抗力を有するラットにおける連鎖球菌細胞壁抽出物に対する炎症や関 節炎の応答を悪化させることが示されている（３１）。しかし、現時点では、こ れらの作用がＴ細胞上の５ＨＴ受容体を介して発現することが明らかではない。

そこで、該５ＨＴの特定アンタゴニスト若しくはアゴニストの有効性により、活 性化Ｔ細胞上での５ＨＴと５ＨＴ受容体との免疫学的相互作用を把握することが 可能になり、さらに、当該Ｔ細胞上のインビボでの免疫および炎症の応答におけ る該５ＨＴ受容体の役割がより明確になると考えられる。最後に、（実験的にで はあるが）５ＨＴ受容体の類似体はヒト科末梢Ｔ細胞の胚上には存在するが、休 止しているヒト科末梢Ｔ細胞上には存在しない。

形性転換された細胞（ジュルカット細胞）上に新規な５ＨＴ２類似受容体が存在 するということの証明に続いて、当該受容体がヒト科Ｔリンパ球（活性化Ｔ細胞 ）上に存在することを証明するためにさらに実験を行った。

Ｔ　の５ＨＴ　” ジェルカット細胞上の５ＨＴ受容体は、従来の５ＨＴ２受容体に比して、”Ｈ− ５ＨＴ　（１００ｎＭ）やケタンセリン（１００ｎＭ）に対して弱いアフィニテ ィを持っている。３Ｈ−５ＨＴのＴ細胞の胚に対する特定結合は検出可能であり 、飽和可能である。すなわち、結合した３Ｈ−５ＨＴのうちの約８０％が１１０ ０ｔｔの５ＨＴにより置換され、該結合は１−３μＭの５ＨＴで飽和した。飽和 時には、１０個のＴ細胞当たり２００−２５０ｆｍｏｌの５ＨＴが結合した。ま た、５ＨＴの結合は１−３μＭの５）（Ｔで飽和した。この場合のＫｄ値はスキ ャッチャード分析により決定され、その値は１８０ｎＭ（３回の別々の実験値の 平均）であった。ここ結果、Ｔ細胞の胚は１０６個の細胞当たり２２４ｆｍｏｌ の５ＨＴと結合し、１個の細胞当たり１２００００個の受容体の部位密度である ことがわかる。この結果を第６Ａ図に示す。第６Ａ−１図は該結合データのスキ ャッチャード分析を示している。すなわち、該３回の別々の実験データにより、 解離定数の平均が２００ｎＭとなった。また、第６Ｂ図はＴ細胞の胚に対するケ タンセリンの結合を示している。該結合は飽和可能であり、Ｔ細胞の胚は同一数 のケタンセリンと５ＨＴ受容体とを表現した。また、該ケタンセリンの特定結合 が１００μＭの５ＨＴの存在下または非存在下において決定された。第６Ｂ−１ 図は当該ケタンセリンの結合データのスキャッチャード分析を示し、その平均解 離定数は４００ｎＭとなっている。

以上より、これらのデータはＴ細胞の坏土に単一の受容体が存在し、それが５Ｈ Ｔとケタンセリンとの両方にそれらの所定の濃度範囲においてそれぞれ結合する ことを概念的に示している。

種々の５ＨＴ受容体リガンドを使った競争実験を行った結果、５ＨＴ、アルファ メチルセロトニンおよびケタンセリンがＴ細胞に対する結合についてＨ−５ＨＴ に匹敵し得ることがわかった（第７図）。なおＩＣ５０の値はそれぞれ０．１μ Ｍ、０．０６μＭおよび２０ＨＭだった。さらに、８０Ｈ−ＤＰＡＴ　（５ＨＴ １　ａ受容体に対して特定）、ＩＣ３−２０５９３０（５ＨＴ３受容体に対して 特定）、ミアンセリン（５ＨＴ１ｃおよび５ＨＴ２の受容体に対して特定）およ びスビペロン（５ＨＴ２受容体に対して特定）等の５ＨＴ受容体リガンドは当該 Ｔ細胞の胚に対する結合について５ＨＴには匹敵しなかった。また、該５ＨＴ受 容体のＴ細胞の坏土での特性は当該５ＨＴ受容体のジェルカット細胞上での特性 に匹敵し、神経組織において見られる受容体の特性からは明確に区別できる。

次いで、該５ＨＴ受容体の存在について、多くの異なるＴ細胞ポピユレーション を評価した。この場合、休止しているリンパ球は、Ｔ細胞の胚（１５００００／ 細胞）に比して、受容体の低いレベル（２４０００／細胞）を示した。また、Ｃ Ｄ４＋とＣＤａ＋のＴ細胞系は共に５ＨＴ受容体の高いレベルを示しく１４３０ ００および１７１０００受容体／細胞）、また、ＣＤ３＋４−８−Ｔ細胞系は５ ３０００受容体／細胞のレベルを示し、この値は休止しているリンパ球上で観察 されたものよりも僅かに高いだけである。さらに、異なるＴ細胞マイトゲンを用 いた刺激を加えた後に、当該５ＨＴ受容体の表現を時間の関数として調べた。そ の結果、受容体の増加は刺激後７２時間は線形であった。また、３種のＴ細胞マ イトゲン、ＰＨＡ、ＰＷＭ、０ＫＴ３は該Ｔ細胞上での５ＨＴ受容体数の増加に おいて実質的差異を示さなかった（表８）。

表８ 細胞　ｉ几工昔澄 Ｆｍｏ　１／細胞１０’個　受容体／細胞ＰＢＬ　４０±　３　２４０００ Ｔ細胞の胚　２５０±１１　１５００００ＣＤ４＋Ｔ細胞系　２３８±　９　１ ４３０００ＣＤ８＋Ｔ細胞系　２８５±　５　１７１０００ＣＤ３＋４−８− Ｔ　、　８８±　６　５２８００ リンパ球においては、細胞内ｃＡＭＰの増加は、当該リンパ球の増殖およびイフ エクタ（ｅ　ｆ　ｆ　ｅ　ｃ　ｔ　ｏ　ｒ）機能の阻害に一般的に関係する（５ ７）。逆に、細胞内Ｃａ＋十の増加は、抗原若しくはマイトゲンのシグナルによ るリンパ球の活性化、これに続くリンパ球の増殖およびイフエクタ機能において 一般的に必要であると認識されている。なお、ここで示す結果としては、５ＨＴ ｂ増加に媒介し得るということである。したがって、これにより、リンパ球の増 殖およびそのイフエクタ機能が当然向上する。また、該５ＨＴｂ けるアデニル酸シクラーゼとｃ　Ａ　Ｍ　Ｐのレベル値を調節する。すなわち、 該アデニル酸シクラーゼの活性化の状態により、５ＨＴ１ａアゴニストがｃＡＭ Ｐのレベルを高めたり抑制したりすることができ、また、リンパ球の増殖や機能 を向上したり抑制したりすることができる。

５ＨＴ、特定５ＨＴ１ａアゴニストの８０ＨＤＰＡＴおよび５ＨＴ１ａアンタゴ ニストのスピベロンに対するジュルカット細胞およびＴ細胞の胚の生物学的応答 ジュルカット細胞　Ｔ細胞胚 条件　Ｃａ＋＋　ｃＡＭＰ　Ｃａ＋＋　ｃＡＭＰｎＭ　（ｍａｔ　ｎＭ　（ｍｏ ｌ −−２００４，７２６０１，８ ５ＨＴ＋　６１０　４．９　２６０　０．６５ＨＴ−１−スピヘｃｒ：ｚ　２２ ５　４，７　２５０　１．４８０ＨＤＰＡＴ　４７０　４，８　２５５　０，５ ８０ＨＤＰＡＴ＋ スビベロン　２８０　４．６　２６５　１．６なお、Ｃａ＋十測定については、 上記細胞をインド−１によりラベル化し、５ＨＴ３μＭおよび８ｏＨＤＰＡＴ１ ０ｎＭ存在下または非存在下で、１１００ｎのスビペロン存在下または非存在下 に、当該細胞内Ｃａ＋十濃度を５分間にわたりモニタした。結果を細胞内Ｃａ＋ ＋の濃度値として示した。一方、ｃＡＭＰは上記種々の処理後に細胞から抽出し 、かつ、その値は記載の如く定量的であった。この場合、アデニル酸シクラーゼ を活性化するために、すべての細胞を１０μＭのフォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏ ｌｉｎ）で前処理した。結果をｐｍｏ　１（ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ　／　１０６個の細 胞）として示した。

Ｔ細胞中における５ＨＴと５ＨＴ１ａ特定アゴニストの８０ＨＤＦＡＴとの生物 学的および薬理学的応答の比較生物学的応答　薬理学的応答 ＥＣ５０１Ｃ５０ＩＣ５０ リガンド　Ｃａ＋＋　ｃＡＭＰ　Ｃａ＋＋　ｃＡＭＰ　ムデータ８０　ＨＤ　Ｐ 　Ａ　Ｔ　５ｎＭ　３ｎＭ　１．５ｎＭ５　ＨＴ　２００ｎＭ　４００ｎＭ　３ ．ＯｎＭスピベロン６０ｎＭ　７０ｎＭ　５０．ＯｎＭ細胞細胞内Ｃａ＋側定を ジュルカット細胞を用いて行い、ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの測定を活性化Ｔ細胞を用いて 行った。さらに、ジュルカット膜を１ｎＭの８０ＨＤＦＡＴによりラベル化し、 置換処理を種々の濃度の所定リガンドの存在下に行った。

ＰＢＬにおける５ＨＴの５ 休止状態のＰＢＬをＰＨＡＳＰＷＭまたは０ＫＴ３の存在下または非存在下に、 種々の時間で培養し、採取し、５ＨＴ含有量を分析した。これらの結果を第８図 に示す。

ＰＢＬは培養初期において５ＨＴを４μｍｏｌ／１０細胞で含有していた。当該 レベルは４日間維持されたが７日までに消失した。一方、０ＫＴ３またはＰＨＡ のいずれかによるＰＢＬの刺激により５ＨＴの含有量は７２時間以内に７５％以 上消失し、概ねその時間に５ＨＴ受容体が最大レベルに到達していた。また、Ｐ ＷＭによるＰＢＬの刺激では、最初の４８時間は５ＨＴのレベルが５０％程度ま で増加し、その後、徐々に減少した。なお、これらの細胞は７日目の時点で約２ ｐｍｏ１５ＨＴ／１０細胞に維持されていた。

ＰＢＬの　における５ＨＴの ＰＨＡによって刺激されたＰＢＬの増殖は比較的高濃度の５ＨＴによって部分的 に阻害される。第９図はこの知見を示し、また、他のＴ細胞マイトゲン０ＫＴ３ およびＰＷＭに対する該ＰＢＬの増殖についての５ＨＴの作用を示している。す なわち、０ＫＴ３存在下の当該ＰＢＬの増殖は５ＨＴの添加に影響されない。こ れに反して、ＰＷＭで刺激された培養体への５ＨＴの添加は”Ｈ−ＴｄＲの取込 みを３倍増加させた。また、当該最大取込み増大の半分が５ＨＴ１５μＭに対応 していた。また、この現象は培養期間のうち３日から５日に５ＨＴが添加された 場合に観察でき、この時点で、５ＨＴ受容体が最大に表現される（表Ｖ参照）。

また、当該培養期間の初期に５ＨＴを添加すると、増殖が３倍に高められるが、 この作用を成すためにさらに多くの５ＨＴ（１００μＭ）が必要となる。この差 を説明するための可能性としては、当該５Ｉ（Ｔの活性が３日目まで出現しない ５ＨＴ受容体により媒介され、かつ、培養期間の初期における該５ＨＴの代謝ま たは酸化が３日目までに該培養媒体中において当該５ＨＴの効果的な濃度を減少 するということが考えられる。

さらに、５ＨＴ受容体に結合し、活性化Ｔ細胞上において該５ＨＴ受容体と相互 作用するいくつかの類似体について、上記ＰＷＭにより刺激したＰＢＬの増殖を 促進若しくは阻害する能力を試験した。これら試験したもののうち、５ＨＴ、ケ タンセリン（５ＨＴ２受容体アンタゴニスト）およびアルファメチルセロトニン （５ＨＴ２受容体アゴニスト）は該Ｔ細胞の増殖を１０乃至３０μＭの濃度範囲 において約３倍に促進した。しかし、他の２種の５ＨＴ２受容体アンタゴニスト 、すなわち、リタンセリン（５ＨＴ　２に対して選択的）およびミアンセリン（ ５ＨＴ２および５ＨＴ１ｃに対して選択的）は該Ｔ細胞増殖を刺激しなかった。

ただし、リタンセリンは高い濃度においていくらか阻害性を示したように思えた 。

これらの結果を第１０に示す。次に、ＰＢＬの培養におけるＣＤＡ＋およびＣＤ ８＋Ｔ細胞の増殖をＰＷＭで刺激した。この場合、ＣＤ４＋およびＣＤＳ＋９２ ８球の混合培養においては、ＣＤＳ＋９２６球の細胞の方が７日目において主に 増殖されていた。第５図示の結果はまた、もしもＣＤＳ＋９２８球が抗体および 補体処理により除去されると、５ＨＴまたは５ＨＴ受容体リガンドでのＰＢＬ培 養の増殖を刺激する能力が失われることを示している。

また、上述の結果はＴ細胞胚が５ＨＴ受容体を表現すること、５ＨＴがＰＷＭで 刺激されたＴ細胞増殖を高めること、および、該Ｔ細胞が５ＨＴを含むことを示 している。このことは当該５ＨＴがＰＷＭによって活性化されたＴ細胞の正常な 増殖に対して重要であることの可能性を示している。この場合、トリプトファン ヒドロキシラーゼのインヒビター、５ＨＴ合成における速度制限段階を細胞内の ５ＨＴの蓄積を枯渇するために使用した。

表９における結果はｐ−クロロフェニルアラニン（ｐＣＰＡ）による５ＨＴ合成 の阻害がＰＷＭにより刺激した細胞増殖をも部分的に阻害することを示している 。なお、５ＨＴやケタンセリンをこれらの培養体に添加すると、当該ｐＣＰＡの 阻害効果が逆転する。

表９ ５ＨＴ合成の阻害によるＴ細胞増殖の抑制ＰＢＬ　ＰＷＭ　ｐＣＰＡ　５ＨＴ　 ケタンセリン　３Ｈ−ＴｄＲ２ｍａ＋）　１０ａ＋ｍ　１０ｍｍ　ｃ　ｍ）＋　 −−−−１７２８±２１０ ＋　＋　−−−１１９５４±１０２２ ＋　＋　＋　−−４３０６±６８８ ＋　＋　＋　＋　−９７２６±１６１４＋　＋　＋　−＋　１００６８±４６９ ＰＷＭによるＣＤＢ＋サプレッサＴ　の　にお番る５ＨＴの ＣＤｇ＋サプレッサＴ細胞はＰＷＭで刺激したＰＢＬの培養における増殖細胞の 最も多くの割合を占める。ｐＣＰＡによる５ＨＴ合成の阻害がＰＷＭで刺激され た培養における増殖を阻害するため、該ｐＣＰＡがサプレッサ細胞機能の表現を も阻害すると考えられる。これらの結果を第１１図に示す。５ＨＴ含有量を減少 するために、ＰＢＬの培養体をｐＣＰＡの存在下または非存在下においてＰＷＭ により刺激した。また、５ＨＴ受容体に対するアゴニストを生成して該ｐＣＰＡ の作用を逆転するために、いくつかの培養体をケタンセリンで処理した。さらに 、７日後に培養体を洗浄し、ミドマイシンＣで処理し、ＰＷＭで刺激した新鮮な ＣＤ４＋Ｔ細胞に添加して、抑制細胞活性を試験した。その結果、ＰＷＭで刺激 した培養体に対応する細胞が該ＰＷＭの存在下にＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を該サプ レッサ細胞と該対応する細胞との比を１：２として最大７０％まで抑制した。ま た、５０％までの増殖の抑制が７×１０個の細胞若しくは１個のサプレッサ細胞 に対して７個の対応する細胞により達成された。さらに、当該サプレッサ細胞を 生成するために使用された主培養体におけるｐｃＰＡの存在は該サプレッサ細胞 の活性発生を完全に阻止した。一方、ケタンセリンをｐＣＰＡと共に該培養体に 加えた場合は、当該サプレッサ細胞の活性は調節の点で正常であった。

ＰＨＡあるいは０Ｋ７３等の他のＴ細胞マイトゲンはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ 細胞の両方の増殖を刺激するが、培養の最初の１週間以内にＣＤ８＋Ｔ細胞によ りサプレッサ細胞の活性を表現するには至らない。さらに、該０ＫＴ３またはＰ ＨＡのいずれかにより刺激されたＰＢＬは７２時間以内にその５ＨＴ含有量が低 下するが、ＰＷＭにより刺激された培養体は少なくとも７日間当該５ＨＴ含有量 を維持する。また、該ＰＨＡまたは０ＫＴ３のいずれかにより刺激された培養体 にｐＣＰＡを添加すると、増殖が阻害されない（図示せず）。なお、該５ＨＴ含 有量のサプレッサ細胞活性に対する関連性を調べるために、ＰＢＬをＴ細胞の５ ＨＴ受容体アゴニストであるケタンセリン（５ＨＴ受容体アンタゴニスト）存在 下または非存在下で０ＫＴ３により刺激し、培養の５日後にサプレッサ細胞の活 性を試験した。その結果、該０ＫＴ３で刺激した培養体から得たＴ細胞胚からは 検出可能な程度のサプレッサ細胞活性が存在しなかった。これに対して、０ＫＴ ３およびケタンセリンの両方により刺激した培養体から得たＴ細胞胚は、二次培 養において試験した際に、サプレッサ細胞活性を発現した。これらの結果を第１ ２図に示す。

ＣＤ８＋Ｔリンパ　に・　−る　マイトゲンとしての５ＨＴ ＰＷＭに応じたＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖はＣＤ４＋Ｔ細胞を必要とする。上記 ５ＨＴまたは５ＨＴ受容体リガンドによるＰＢＬ増殖培養の３倍増加は該ＣＤ８ ＋Ｔ細胞の除去後は消失する。それゆえ、５ＨＴが該ＣＤ８十Ｔ細胞に対する共 通マイトゲン（ｃｏ−ｍｉｔｏｇｅｎ）として作用し、ＰＷＭの存在下における 増殖を刺激する可能性があると考えられる。これらの結果を第９図に示す。なお 、ＣＤ８＋Ｔ細胞の培養体はＰＷＭの存在下またはＰＷＭおよびＩＬ２の存在下 では増殖しない。

これに対して、ＣＤ８＋Ｔ細胞含有の培養体およびＰＷＭは５ＨＴまたはケタン セリンの存在下に増殖する。さらに、該増殖の程度はＣＤ４＋Ｔ細胞が該ＣＤ８ ＋Ｔ細胞の培養体に添加された場合に匹敵する。また、５ＨＴまたはケタンセリ ンのみの添加は該ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激しない。以上のことから、これら のデータは５ＨＴがＣＤｇ＋サプレッサＴ細胞に対する共通マイトゲンであるこ とを示すと考えられる。

５ＨＴによる　Ｔ　におけるｃＡＭＰレベルの特定の５ＨＴ受容体亜類型に連結 する二つのシグナルトランスダクション経路はアデニル酸シクラーゼの変性およ びフォスフォリパーゼＣの活性化である。この場合、フォスフォリバーゼＣの活 性化はリン酸イノシトールを増加し、かつ、細胞内Ｃａ＋十濃度を高める。また 、ジュルカット細胞においては、５ＨＴが該リン酸イノシトールと細胞内Ｃａ＋ 十濃度の増加を促す。それゆえ、リン酸イノシトールのレベルおよび細胞内Ｃａ ＋十の変化を５ＨＴに呼応するＴ細胞胚（１’ＨＡ）内で測定し、さらに、当該 変化を０ＫＴ３に呼応する陽性調節として測定した。これらの結果を表７に示す 。ジュルカット細胞に比して、５ＨＴは上記リン酸イノシトール量の変化や細胞 内Ｃａ＋十濃度の変化を引き起こさない。また、陽性調節として、０ＫＴ３はＴ 細胞経内のリン酸イノシトールの濃度や細胞内Ｃａ＋十濃度の増加を促進する。

したがって、該Ｔ細胞胚は当該リン酸イノシトールのレベルや細胞内Ｃａ＋十濃 度の変化により５ＨＴに応答しないので、細胞内ｃＡＭＰの量を５ＨＴの存在下 および非存在下の場合において比較した。すなわち、休止Ｔ細胞、Ｔ細胞胚およ びジュルカット細胞の３種について比較を行い、ＣＡＭＰレベルをフォルスコリ ンの存在下および非存在下の場合で比較した。これらの結果を表８に示す。

この結果、休止Ｔ細胞は５ＨＴに呼応して細胞内ｃＡＭＰレベルを変化しないが 、活性化Ｔ細胞は５ＨＴ　（５μＭ）に呼応して２倍以上までｃＡＭＰを増加し た。また、ジュルカット細胞は５ＨＴに呼応してｃＡＭＰレベルを変化しなかっ た。つまり、フォルスコリンがアデニル酸シクラーゼを活性化し、細胞内ｃＡＭ Ｐを増加したと考えられる。それゆえ、フォルスコリンは体止Ｔ細胞、活性化Ｔ 細胞およびジュルカット細胞においてｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ濃度を増加した。なお、該 フォルスコリン依存のｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ量の増加は活性化Ｔ細胞への５ＨＴの添加 により阻害されたが、休止Ｔ細胞またはジュルカット細胞への添加では当該阻害 反応は生じなかった。第２図は活性化Ｔ細胞におけるｃＡＭＰレベルの増加を引 き起こすに要する５ＨＴの濃度を示しており、また、フォルスコリン存在下にお ける、当該活性化Ｔ細胞でのｃＡＭＰレベルの減少を示している。該ｃＡＭ）’ レベルの変化は３０ｎＭから３μＭの範囲での５ＨＴ濃度に比例している。また 、最大応答の半分の値が２００から８００ｎＭの間の５ＨＴ量に相当しており、 このことは、結合データから得られるＫｄ値の場合と同様である。また、ＰＭＡ の添加も該Ｔ細胞胚やジュルカット細胞におけるｃＡＭＰレベルの増加をもたら す。ただし、フォルスコリンの場合に比して、５ＨＴは、いずれの細胞種におい ても、当該ＰＭＡ依存のｃＡＭＰ増加を阻害しない。これらの結果も表９に示し ている。

５ＨＴによるＣＤ８＋Ｔ　の　１゛ 上記細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化は活性化Ｔ細胞の機能および増殖に影響すること が知られている（５３）。上述の結果に基づき、５ＨＴは、活性Ｔ細胞上の異な るサブポピユレーションまたは異なる刺激因子に作用された活性Ｔ細胞において 、異なる細胞内ｃＡＭＰ量の調節ができると考えられる。表ＶＩＩに示す結果は ＰＨＡ、０ＫＴ３またはＰＷＭで初期的に刺激したＴ細胞胚におけるｃ　Ａ　Ｍ 　Ｐ濃度の変化の比較を示す。該Ｔ細胞は増殖応答のピークにおいて採取され、 ５ＨＴの存在下または非存在下でのｃＡＭＰ含有量をアッセイした。また、該培 養体を最後の４８時間５ＨＴの存在下で培養して、増殖についての影響を調べた 。この結果、該５ＨＴはＰＨＡで刺激したＴ細胞ではｃ　Ａ　Ｍ　Ｐのレベルを ２倍に増加し、また、０ＫＴ３で刺激した細胞培養体では該ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐ量を 僅かに増やしたが、ＰＷＭで処理したＴ細胞においてはｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの量を６ ０％減少した。つまり、５ＨＴ存在下または非存在下での異なる刺激因子による Ｔ細胞培養における増殖応答は細胞内ｃＡＭＰのレベルに影響することがわかっ た。したがって、５ＨＴはＰＨＡに応答するＴ細胞の増殖を僅かに阻害するが、 ＰＷＭに応答するＴ細胞の増殖を３倍以上に促進する。加えて、該ＰＷＭによる 刺激に先立ってＣＤ８＋Ｔ細胞を除去すると、これらの培養体における５ＨＴの 上記共通マイトゲンとしての効果が消滅する。それゆえ、５ＨＴはｃＡＭＰレベ ルの調整により、明らかに該Ｔ細胞増殖の促進もしくは抑制のいずれも行うこと ができる。ただし、当該応答の方向はマイトゲンとしての作用と上記刺激因子に 応答するＴ細胞のサブポピユレーションとによって定まると考えられる。第３図 は５ＨＴに対するＰＷＭ活性Ｔ細胞の増殖応答が比較的速められた結果を示して いる。なお、該５ＨＴの存在下における増殖促進は数時間以内に検出でき、４０ 時間でその最大ピークに到達する。また、ＣＡ　Ｍ　Ｐのレベルは３０分で対照 量の６０％まで減少し、さらに後続の４０時間において、対照量の４０％が減少 する。第４図は該ＰＷＭ活性Ｔ細胞上の５ＨＴの共通マイトゲンとしての効果に おける濃度依存性を示している。

この場合、５ＨＴは増殖アッセイの４８時間前に培養体に添加した。なお、最大 の増殖促進は５ＨＴ３０μＭにおいて観られ、ＩＣ５０は１０μＭであった。

当該５ＨＴのＴ細胞への添加の結果は該応答細胞の表現型に依存する。すなわち 、０ＫＴ３またはＰＨＡによるＴ細胞増殖の促進によりＣＤ４およびＣＤ８表現 型のＴ細胞胚が生じ、Ｐ　Ｗ　ＭによるＴ細胞培養の促進によりＣＤ８表現型の Ｔ細胞胚が主に生じる。なお、５ＨＴに対するこれら２種の培養体の応答は異な る。また、当該ＰＨＡまたは０ＫＴ３により刺激された培養体への５ＨＴの添加 はｃＡＭＰの量を増加し、該Ｔ細胞増殖を僅かに阻害する。これに対して、ＰＷ Ｍで刺激した培養体への５ＨＴの添加はｃＡＭＰ量を６０％減少し、Ｔ細胞増殖 を３乃至４倍に高める。なお、これらの培養体における細胞増殖はＦＭＳ　（図 示せず）により計測した限りにおいてはＣＤ８＋Ｔ細胞が主体的であり、サプレ ッサ細胞を発現するが細胞障害作用は呈示しない。また、ＣＤ８＋Ｔ細胞を除く ことにより、これらの培養体における５ＨＴの共通マイトゲンとしての効果が消 失する。該５ＨＴはまた平滑筋細胞若しくは繊維芽細胞等の特定種細胞の成長因 子として作用する（４６．４７）。このことは、当該５ＨＴの成長因子としての 特性が免疫系細胞に限定されないことを示すと考えられる。

以上のことから、Ｔ細胞は活性時において５ＨＴに対応する受容体を表現し、該 ５ＨＴは活性Ｔ細胞の増殖および機能に影響することがわかる。さらに、５ＨＴ が血小板の分泌顆粒の主成分であり、それゆえ、炎症部位において放出されるこ とが明らかになっている（２−４）。

したがって、該５ＨＴは炎症部位において存在してＴ細胞の機能に影響を及ぼす と考えられる。さらに、最近では、精製した休止Ｔ細胞もまた５ＨＴを含むこと が明らかになっている（５０）。そして、該Ｔ細胞はガンマＩＦＮに呼応して媒 体中に５ＨＴを放出する。なお、このような条件下においては、該媒体中の濃度 は約３００ｎＭ　／　ｍ　１　／　Ｔ細胞１０個となる。このことはＴ細胞５Ｈ Ｔ受容体のＫｄの場合に極めて近似している。そして、５ＨＴがＴ細胞により放 出されると、該５ＨＴはＴ細胞により当該Ｔ細胞機能の調節において重要な役割 を果たすようになる。また、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細・胞の非存在下にお いてＦ’ＷＭに呼応して増殖しないことが明らかになっている（５４−５６）。

したがって、５ＨＴがガンマＩＦＮに呼応してＣＤ４＋Ｔ細胞により放出でき、 かつ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の成長因子として作用するという仮定が興味深くなる。リ ューマチ様関節炎はリューマチ症状において大きな群を成す主要病状である。自 己免疫成分を伴うリューマチ症状としては、リューマチ様関節炎、全身性紅斑性 狼癒、ショーグレン（Ｓｊｏｇｒｅｎ″　Ｓ）症候群、硬皮症、混合結合組織病 、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター（Ｒｅｉｔｅｒ’　ｓ）症候群およびベセッ ト（Ｂｅｈｃｅｔ’　ｓ）病が挙げられる。

該リューマチ様関節炎における関節炎は後因子的奇形を伴う関節部の破壊により 生じる。また、患部は関節部に限らず、免疫症候群により引き起こされる脈管炎 では皮膚、目および肺が含まれる。

該関節炎は滑液細胞と循環する体液中から関節の滑液層内に浸透する種々の細胞 要素（およびそれらの可溶生成物）との複雑な相互作用により引き起こされる。

このことは大量の細胞増殖を引き起こし、また、該滑液細胞の活性化をもたらす 。さらに、組織培養中における当該滑液細胞の特性は形質転換した細胞のそれら と同一視されてきた。なお、関節障害につながる一連の作用についての詳細な議 論は基礎免疫学（ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　２ｅｄ、、Ｐ ａｕｌ、（１９８９）ｐｐ８４６−８４９）を参照されたい。

実験的関節炎の発現対象には、純粋にＴ！胞媒介された自己免疫症であるアジュ バント関節炎を選択した。なお、該関節炎は、油液中のマイコバクテリウム結核 菌（完全なフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）のアジュバント）の注射によるラット（ 例ニルイスラット（Ｌｅｗｉｓｒａｔｓ））の筋肉緊張により誘発できる。なお 、関節部分におけるマイコバクテリウムのペプチドグリカンとプロテオグリカン との間には構造的類似点がある。すなわち、該マイコバクテリウム結核菌の非ペ プチドにはＴ細胞媒介のアジュバント関節炎により認識されるエピトープが含ま れる。加えて、リューマチ様関節炎を伴う親細胞からのＴ細胞は該共通のエピト ープに応答する。上記文献（Ｐａｕｌ）参照。

ニアシュバント　Ｓ 熱殺菌したマイコバクテリウムブチリラム（Ｍｙｃ。

ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｆｕｍ）若しくはマイコバクテリウム結核菌Ｈ ３７Ｒａ、１０ｍｇ／ｍｌと共に超重鉱物油を加えて完全フロインドアジュバン ト（ＣＦＡ）を作成した。０８目に、雌のルイスラット（２００−２２５ｇ）の 右の後ろ脚の足裏（投与部）に該アジュバントを０．１ｍｌ皮下注射投与した（ １００μｇ／動物個体）。まず、初期炎症反応が投与した足に生じた。

この症状は５日目までに治まり、９日目から１２日目まで二次的な継続炎症／関 節炎症状が投与した足と該足と対を成す非投与の左足の両方に生じた。該足の裏 および踵の直径の計測を２日目の初期症状および１２日目と１６日目の二次的症 状（両足）について、手持ち式の技術者用カリバスにより行った。測定結果を０ ８目の足の直径を基準とする腫れの変化＋または−８，Ｅ、の平均値として表現 した。

次いで、薬物を水、生理食塩水またはこれらのいずれかと２％ポリエチレングリ コール４００１０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０との混合液に溶解若しくは 懸濁し、症状の発現前または発現後に、正規の方法（経口、点滴、筋肉内）で投 与した。

この結果、当該アジュバント関節炎は明らかにＴ細胞によって媒介され、該病状 を健全な動物体に転移し得る活性化Ｔ細胞を単利することができた。さらに、リ タンセリンは１０または３０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇで当該病状の進展を阻害し、 ケタンセリンは該病状の進展を阻止しないことがわかった。

表１０ ７’）土１＜　＞上Ｍ亙丞に・　るリタン上１ンのデータ実験１　２　症状−１ ６日目 平均踵径　％　阻害状態 ±ｓ、Ｅ２ｍＩ１１ 対照　２．５５±、４４ 対照　極めて ＋リタンセリン　０．９３±、３１６３．５　活性３０ｍｇ／ｋｇ　ｉ、ｐ。

（日数−１，０，１，５，７，９，１２）十ケタンセリン　２．０９±、４６　 ２３　７　蔦・実験２ 対照　２．３５±、５６ 対照 ＋リタンセリン　１．３９±、３０４０，３＊　活性３０ｍｇ／ｋｇ　ｐ、ｏ。

（日数−１，０，３，６，８，１０，１３）＋ペランセリン　２４４±、３４　 ４．３　Ｘ実験３ 対照　３．２８±、４４ 対照 ＋リタンセリン　２．３３±、４３２９．０　不活性３、ｏｍｇ／ｋｇ　ｐ、ｏ − ＋リタンセリン　０．８９±、２１７２．９　極めて１０ｍ　ｋ　ｏ、　Ｈ 本当該活性の差はわずかに異なる投与スケジュールによると説明できる。

■ 精製した組み換えヒト科ＩＦＮをアムゲン（Ａｍｇｅｎ）（Ｔｈｏｕｓａｎｄ　 ０ａｋｓ、ＣＡ）から購入し、使用前に媒体により希釈した。５−０Ｈ−トリプ トファン、５ＨＴ、）リブトファン、５−０Ｈ−インドール酢酸およびメラトニ ンをシグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）から入手し、ｐ−クロロフェニルアラニン（ｐＣ ＰＡ）をリサーチバイオケミカル社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ 　ｌ　ｓ、Ｉ　ｎｃ、）（Ｎａ　ｔ　ｉ　ｃｋ、ＭＡ）から入手した。また、Ｒ ＰＭ１１６４０媒体、ウシ胎児結成（ＦＣ８）、ピルビン酸ナトリウムおよびグ ルタミン酸ナトリウムをギブコ（、ＧＩＢＣＯ）から入手した。平底マルチウェ ル組織培養皿をベクトンディッキンソン（Ｂｅｅｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ） またはコスタ−（Ｃｏｓｔ　ａ　ｒ）から入手した。さらに、ＨＰＬＣ用の溶媒 をアルドリッチ（Ａ　Ｉ　ｄ　ｒ　ｉ　ｃ　ｈ）から入手した。

紅ｎ亙１ ヒト科頸管癌腫細胞系ＭＥ１８０をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃ ｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手し、組織培養フラスコ内において、１０％ＦＳＣ 存在下、無抗体で、５％ＣＯ２含有空気中３７℃の人体条件下にＲＰＭ１１６４ ０媒体中で保持した。

アッセイ ＭＥ１８０細胞を完全な培地内に１Ｘ１０５細胞／ｍ１．１００μｌ／ウエル（ ９６ウエルプレート）で加え、異なる量のＩＦＮの存在下または非存在下に３日 間培養した。３日目に、該培養体を１μＣｉの！Ｈ−ＴｄＲで５時間処理し、フ ィルタ紙上に採取した。なお、該培養は二重に最低３回行い、同様の結果を得た 。また、大部分は次の実験に対する陽性調節として繰り返された。二重に作成し たものは互いに１０％以内で等しかった。また、”Ｈ−ＴｄＲの取り込みは液体 シンチレーションスペクトロメータにより検出した。

ト１　トファン　５−０Ｈ−トリ　トファンおよび５ＨＴの　およ テキストに記載のような種々の時間における種々の処理の後、細胞および培地を 分離し、エタノールと混ぜて最終の濃度を７０％にした。次いで、サンプルをＯ −４℃で一晩保存した後、沈殿物および細胞片を遠心分離により除去した。その 後、サンプルを濃縮してからスピードバック（Ｓ　ｐ　ｅ　ｅ　ｄ−ｖ　ａ　ｃ ）を用いて乾燥し、さらに、２０ｕｌのバッフｙＡに溶解してＨＰＬＣ（Ｈｅｗ ｌｅｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）による分析にかけた（１３）。

該ＨＰＬＣ装置は２８０ｎｍ励起フィルタと３６０ｎｍ発光フィルタとを備える 蛍光検出器（Ｇｉｌｓｏｎ）を備えている。なお、２種の移動相は、Ａニリン酸 でｐＨ３、Ｏに調節したトリエチルアミン５０ｎＭと、Ｂ：４０％メタノール含 有のバッファＡとから成る。さらに、溶出勾配はＡ１００％からＢ１００％まで ２５分間にわたり線形である。既知の標準保持時間は、５ＨＴで３゜５０分、５ −０Ｈ−トリプトファンで４．７７分、トリプトファンで９．１１分、５−０Ｈ −インドール酢酸で１２．５１分、さらに、メラトニンで２１．６９分であった 。また、既知標準での細胞抽出物におけるピークの同定は既知量の標準物質と該 細胞抽出物とを混合することとクロマトグラフ上のピークの同定を示すことによ って行った。該細胞抽出物からのトリプトファンと５ＨＴの回収率は当該抽出処 理を開始する前に該細胞と既知量の標準物質とを混合することにより決定した値 の９０％以上であった。該５ＨＴおよびトリプトファンの定量的処理は３回行わ れ同様な結果を得た。

トリプトファン　たは５Ｈ）ｌ　トファンによるＩＦＮ　の” ＩＦＮによる細胞増殖の阻害は特定種の腫瘍細胞系においてインドールアミン２ ．３−ジオキシゲナーゼにより促進されるトリプトファンの損失によるものであ る。

したがって、外因性トリプトファンの添加は該ＩＦＮによる細胞増殖の阻害を低 減する（参考６−９および第１図）。該トリプトファンは必須アミノ酸であり、 蛋白合成に必要とされ、また、神経伝達物質５ＨＴやメラトニンの合成にも必要 である。第１図示の結果は当該トリプトファン並びに５Ｈトリプトフアンが細胞 増殖のＩＦＮ媒介阻害を低減することを示している。分子構造学的には、当該５ Ｈ）リブトファンはトリプトファンよりも太きくＭＥ１８０に対するＩＦＮの活 性を阻害する点で該トリプトファンよりも５００倍の作用効果がある（１７Ｂ図 ）。また、該５Ｈ）リブトファンは５ＨＴ合成における前駆体であり、蛋白合成 には使用されない。このことは、５ＨＴ合成の阻害がＩＦＮで処理された細胞の 培養においてトリプトファンの枯渇の重要な結果であるという可能性を示してい る。第２図の結果は細胞増殖の■ＦＮ媒介阻害を比較するためのものである。最 適な結果は該化合物が当該３日間の培養における１日目および２日目に添加され た場合に得られる。なお、これらの条件下では、５ＨトリプトフアンのみがＩＦ Ｎの活性を阻害する。また、他の５Ｈトリプトフアン代謝物質、５ＨＴ。

メラトニン、Ｎ−Ａｃ−５ＨＴまたは５−０Ｈ−インドール酢酸は５Ｈ）リブト ファン代謝を生じるが、上記細胞増殖のＩＦＮ媒介阻害を阻止しない。

トリプトファンおよびｔＨＴの　レベル　のＩＦＮ」二＆擾」（下 上記の結果から、培養地におけるトリプトファンの損失は５Ｈ１−リブトファン またはその代謝物質である５ＨＴ等の損失につながり、細胞増殖の阻害をもたら す。第３図はＩＦＮ存在下の培養での種々の異なる時間における細胞内のトリプ トファンおよび５ＨＴのレベルを示している。すなわち、該トリプトファンおよ び５ＨＴの両方を含有する細胞の場合、これらの両方がＩＦＮ存在下の培養にお いて損失する。なお、５Ｈトリプトフアンは細胞抽出物内において検出できなか った。つまり、該５Ｈトリプトフアンの合成は５ＨＴ合成における速度制限段階 であるため、当該５Ｈトリプトフアンは一般に細胞内に蓄積されないのである。

５Ｈ）リ　トファンによるＩＦＮ　の５ＨＴと　の口′ ５Ｈ）リプトファンが５ＨＴレベルを回復するかを調べるために、腫瘍細胞を阻 害量のＩＦＮ存在下、５Ｈ）リプトファンの存在下または非存在下に培養した（ 表５）。ＩＦＮの処理により５ＨＴは検出不能のレベルまで減少するが、５Ｈト リプトフアンが存在している場合は、該５ＨＴのレベルは維持される。実際、該 ｒＦＮと５Ｈトリプトフアンとを含む培養体では、未処理の培養体に比して、５ ＨＴのレベルが４倍高かった。なお、５Ｈトリプトフアンを添加しても、これら の培養体における細胞増殖を回復することができた。

５Ｈトｌ　トファンはＩＦＮ　の立　からのトリ　トファン　せ ５ＨトリプトフアンのＩＦＮ媒介による細胞増殖の阻害の阻止能力については二 つの有力な説明が存在し、一つは、それが培養地からのトリプトファンの損失を 防止するためであるということ、また、他の一つは、それが細胞内５ＨＴのレベ ルを回復するためであるということである。第４図の結果は、ＩＦＮで処理した 細胞の培養において５Ｈ）−リブトファンは細胞外トリプトファンの損失を阻止 しないということを示している。ＭＥ１８０細胞の対照培養では、７２時間の培 養において、有意量のトリプトファンは消費されない。他方、ＩＦＮで処理した 細胞の培養では、５０％のトリプトファンが２４時間で消費され、さらに、４８ 時間以内に９５％が消費される。さらに、該ＩＦＮで処理された培養での培養地 におけるトリプトファンの損失速度を５Ｈ）リブトファンの添加によって低減す ることはできなかった。ただし、これらの条件下では、５ＨＴのレベルおよび細 胞増殖は対照値まで回復した。

゛　のトリ　トファンによる　の　は５Ｈトリプトフアンによ　される 種々の濃度のメチオニンまたはロイシンの存在下における腫瘍細胞の増殖が１０ −２０μＭのアミノ酸において最大速度に到達する。これに対して、種々の濃度 のトリプトファンの存在下における腫瘍細胞の増殖が５０−１００μＭのアミノ 酸において最大速度に到達する（６）。第５図は異なる濃度のトリプトファンの 存在下で、３μＭの５Ｈトリプトフアンの存在下または非存在下に行ったＭＥ　 １８０細胞の増殖の比較を示している。また、５Ｈ）−リブトファンの非存在下 では、最大増殖は５０μＭのトリプトファンにの存在下に生じた。また、５Ｈト リプトフアンの存在下では、最大増殖が１０μＭのトリプトファン存在下で生じ た。これらの条件から、５Ｈトリプトフアンの添加は細胞のｓＨ−トリプトファ ンの蛋白への取り込み能力に影響しないことがわかった。このことは、５Ｈトリ プトフアンがＭＥ１８０細胞によってトリプトファンに変換されず、また、蛋白 合成にも使用されないことを示している（図示せず）。

５ＨＴＡ　の　はＭＥ１８０　による 上記の結果は細胞内５ＨＴの減少がＭＥ１８０細胞の増殖を阻害するということ を示している。それゆえ、ＭＥ１８７０細胞をトリプトファンヒドロキシラーゼ の特定インヒビターであるｐＣＰＡ存在下に培養し、このことが細胞内５ＨＴの 損失および細胞増殖の阻害をもたらすかを調べた。結果を表６に示す。ｐＣＰＡ 存在下４８時間のＭＥ１８０細胞の培養はｔＨＴの損失と細胞増殖の阻害をもた らしたが、細胞外トリプトファンの損失は生じなかった。さらに、当該５ＨＴの 損失および細胞増殖の阻害は５Ｈトリプトフアンの添加により阻止された。

したがって、二種の独立したメカニズム、すなわち、インドールアミン−２，３ −ジオキシゲナーゼを触媒とするトリプトファンの酸化、あるいは、トリプトフ ァンヒドロキシラーゼの阻害、による５ＨＴの枯渇は腫瘍細胞の増殖の阻害をも たらした。また、両方の場合において、該腫瘍細胞の増殖は５Ｈ）リブトファン による５ＨＴレベルの回復により回復した。

他の付加的な腫瘍細胞系並びに正常な二倍体細胞についても、これらが５ＨＴを 含有するか、あるいは、ｐＣＰＡが細胞内５ＨＴ濃度を低下し、細胞増殖を阻害 するか、さらには、５Ｈトリプトフアンが５ＨＴレベルを回復し、当該細胞増殖 の阻害を逆転するかを調べるために試験した。これらの結果を表７に示す。この 結果、試験したすべての腫瘍細胞系は５ＨＴを含み、５種の細胞系のうちの４種 の増殖がｃｃＰＡによって阻害された。さらに、当該腫瘍細胞系の増殖阻害は５ Ｈ）リブトファンの添加により大きく逆転した。このことは、多くの腫瘍細胞系 において、その増殖に５ＨＴ若しくは当該５ＨＴの代謝物質が必要であることを 示している。これに対して、正常な二倍体のいくつかの異なる種類はｃｃＰＡに よって阻害されなかった。

表６ 表５ ５Ｈ）リプトファン（５Ｈｔｐ）はＩＦＮ処理したＭＥ１８０細胞における５Ｈ Ｔレベルとその増殖を回復する。

細胞内レベル＊ 培養条件　５ＨＴ　増殖 （ｎ＋ｏ１ｍ　”Ｈ−ＴｄＲ ＭＥ１８０細胞　１８　９８０６９±１０２５＋ＩＦＮ　１　１９７８９±　８ ７４ ＋ＩＦＮ＋５Ｈｔｐ　８０　９９６７２±１９８４３２　９６３３１±１５９３ ＋５Ｈｔ ＊ＭＥ１８０細胞培養を３日間行い、２Ｘ１０’個細胞／ｍｌに阻害した。ＩＦ Ｎ　（３００ｕ／ｍｌ）を初期に添加し、５Ｈｔｐ（最終濃度：３ＨＭ）を毎日 添加した。

その後、サンプルを採取し５ＨＴをＨＰＬＣにより分析表７ トリブトファンヒドロキシラーゼの阻害は５ＨＴレベルを低下し、細胞増殖を阻 害する。

培養条件　細胞内本　細胞外＊　増殖 ５ＨＴ　）リブドアｙン　（”Ｈ−ＴｄＲ）ｍｏｌ　ｍ　ｍ ＭＥ１８０細胞　１６．５　１２　４４４４３±２２４４＋　ｐ　ＣＰ　Ａ　３ ．１　２５　１６６４２±１７２３＋ｐＣＰＡ ＋５Ｈｔｐ　３７．１　検出不能　４２２２１±４１２８＋　５　Ｈｔ　４４． ６　４２９８２±２６２９＋ＭＥ　１８０細胞をｐＣＰＡ２ｍＭおよび／または ５Ｈトリプトファン１０μＭの存在下４８時間培養した。培養地または細胞を採 取し、ＨＰＬＣによりトリプトファンおよび５ＨＴを分析した。

５ＨＴ合成の阻害は腫瘍細胞による増殖を阻害する。

細胞　５ＨＴ含有量　増殖（ｃｐｍＸｌｏｏｏ）ポピユレーション （ｍｏｌ／ｍｇ蛋白）　対照　＋ｐＣＰＡ　＋ｐＣＰＡ＋５−０Ｈ−ｔｙｒｐ 形ｊ」え換ＪＪＬ系 Ｅ１８０ １３±２　４４．７　１２，６　４２，２Ｔ２９ ２４±３　５６．７　１４．１　４７．４ジユルカツト ３１±３　８５．６　２４．０　４０．２０ＬＴ−４ ２２±５　３４．３　３６゜５　３１．５３９±６　１９４．０　７１．８　１ ５５．６Ｔ２０ 検出不能　２９．０　６．５　２９．７ＬＵ級泊 Ｔ細胞胚 ２５±２　４５．９　３７．１　４１．４繊維芽細胞 ２９±４　１０．３　９．３　１０．２（肺） 繊維芽細胞 検出不能　４．８　３．９　４．５ （滑液） 内皮細胞 ７．５　７．９　７．５ ＊異なるヒト細胞系をＡＴＣＣから人手した。これらの培養条件は既に記述のも のである（６）。血清を５ＩＴを除くために使用する前に透析した。ＭＥ１８０ （頚管癌腫細胞）、ＢＴ２０（胸部癌種細胞）、ＨＴ２９（結腸腺癌細胞）、ｔ Ｊ９３７（組織法リンパ腫、単球種）、ジュルカット（Ｔ細胞リンパ腫細胞）　 、ＭＯＬＴ−４（急性リンパ芽球白血病）、内皮細胞（−次培養体）、滑液繊維 芽細胞（−次培養体）、肺繊維芽細胞（ＭＲＣ−５；長期系列）またＴ細胞肺の 一次培養体を４８時間培養した。

セロトニンは悪性細胞若しくは腫瘍細胞において存在することがわかり、５ＨＴ ２類似受容体は腫瘍細胞上に存在することがわかった。さらに、該腫瘍細胞の増 殖は、活性Ｔ細胞と同様に、セロトニン受容体アゴニストおよびアンタゴニスト により、あるいは、セロトニン合成の阻害により調節できることが示された。

神経組織においては、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５）（Ｔ）が トリプトファンのヒドロキシル化および脱炭酸化により合成され、顆粒組織に蓄 積される（３５−３６）。さらに、該５ＨＴは適当な刺激により放出され、近接 細胞上の特定受容体に結合して二次メツセンジャー経路を活性化する（３７−３ ９）。該セロトニン合成の速度制限段階はトリプトファンヒドロキシラーゼの活 性のレベルである。さらに、該トリプトファンヒドロキシラーゼの特定酵素イン ヒビターすなわちｐ−クロロフェニルアラニン（ｐＣＦ’Ａ）は細胞内における セロトニンのレベルを枯渇するために使用されてきた（４０−４１）。そこで、 ヒト頚管癌腫細胞（ＭＥ１８０）を５−０Ｈ−トリプトファンの存在下または非 存在下にｐＣＰＡで４８時間処理し、５ＨＴ含有量や細胞増殖の速度を調べた。

その結果、当該培養細胞中では、１３±２ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白の５ＨＴがｐＣＰ Ａの処理後に４±ｌｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白に減少した。同様に、該培養細胞の培地 において、４４ｎＭの５ＨＴがｐＣＰＡの作用により１０ｎＭに減少した。しか し、５−０Ｈ−トリプトファンの添加により、対照細胞の５ＨＴのレベルまで５ ＨＴを回復できた。また、該ＭＥ１８０細胞のｐＣＰＡによる処理では、Ｈ−Ｔ ｄＲの取り込み量が７０％減少した。さらに、当該５−０Ｈ−トリプトファンに よって増殖阻害も大幅に逆転した（表ＶＩ　Ｉ　Ｉ）。また、いくつかの他の腫 瘍細胞系および正常な二倍体細胞系の５ＨＴ含有量についても調べ、それらをｐ ＣＰＡ存在下に４８時間培養して５ＨＴレベルを減少しようとした（表ＩＸ）。

その結果、当該細胞の抽出物における５ＨＴの濃度は１０１０−４０ｐ　Ｉ／ｍ ｇ蛋白の範囲であった。また、５ＨＴの前駆体である５−０Ｈ−トリプトファン は当該細胞抽出物中に検出できなかった。さらに、ｐＣＰＡ存在下の培養細胞で は、試験した６種の腫瘍細胞系列のうち５種において細胞増殖が阻害されたが、 正常な二倍体細胞においては有意な作用効果が見られなかった。さらに、ｐＣＰ Ａで処理した細胞培養体に５−０Ｈ−トリプトファンを添加すると、腫瘍細胞の 培養体では増殖の阻害が大幅に逆転したが、正常な二倍体細胞の培養体では、細 胞増殖への影響が特に見られなかった。

したがって、５ＨＴの枯渇は腫瘍細胞の増殖阻害につながるが、正常な細胞増殖 ではそのような影響はなく、さらに、５−０Ｈ−トリプトファンの添加により５ ＨＴレベルを回復すれば、これらの細胞における増殖が回復する。

セロトニンは培地中で種々の濃度に蓄積され、５ＨＴ受容体を介して二次メツセ ンジャー経路を形質転換できる（３７−３８）。なお、該二次メツセンジャー経 路（リン酸イノシトールの放出および細胞内Ｃａ＋十の変化）を形質転換する５ ＨＴ受容体はジェルカット細胞上において同定されるがＭｏ１ｔ−４細胞上では されない（４２）。そこで、多くの５ＨＴ受容体アゴニストおよびアンタゴニス トを試験して、それらが５ＨＴとは逆に該腫瘍細胞の増殖を阻害するかを調べた 。試験したもののうち、５ＨＴ２受容体アンタゴニスト４０であるリタンセリン は１０−５０ＨＭの範囲において腫瘍細胞の増殖を（試験した６系列のうちの５ 種において）７０乃至９５％まで阻害したが、正常な二倍体細胞の増殖は阻害し なかった。ただし、低濃度（＜　１０　ｕＭ）のリタンセリンでは腫瘍細胞の増 殖は阻害されなかった。なお、５ＨＴを添加すると、該リタンセリンによる阻害 作用は部分的に逆転した（表Ｘ）。さらに、腫瘍細胞の１種であるＭｏ１ｔ−４ の増殖はｐＣＰＡによって阻害されず、また−、リタンセリンによっても阻害さ れなかった。加えて、ｐＣＰＡは細胞抽出物中の５ＨＴの濃度を低下するが、リ タンセリンは当該細胞抽出物中の５ＨＴ含有量を実質的に増加した。例えば、Ｍ Ｅ１８０細胞からの抽出物は１５．５　ｐｍｏ　１７ｍｇ蛋白の５ＨＴを含むが 、リタンセリンで処理した培養体からの抽出物は５８．８Ｈｍｏｌ／ｍｇ蛋白の ５ＨＴを含む。したがって、５ＨＴ合成のインヒビターと５ＨＴ受容体アンタゴ ニストは共に腫瘍細胞による増殖を阻害するが、正常な二倍体細胞による増殖は 阻害しない。さらに、当該５ＨＴ受容体を結合する多種類のリガンドを試験し、 それらのりタンセリン媒介による腫瘍細胞の増殖阻害の阻止能力を調べた。

これらの結果を第１４図に示す。これによれば、別の５ＨＴ２受容体アンタゴニ ストであるケタンセリンおよびペランセリン、５ＨＴ１ｃ受容体アンタゴニスト であるミアンセリン、および、５ＨＴ１受容体アゴニストおよびアンタゴニスト である８−０Ｈ−ＤＰＡＴおよびプロプラノロールはそれぞれリタンセリンによ る増殖阻害を濃度依存による態様において部分的に阻止した。これらのデータは 概ねジュルカット細胞についてのデータと等しいが、これらの５ＨＴ受容体を１ 種類に特徴付けられた５ＨＴ受容体亜類型に分類することはできなかった（４２ ）。なお、興味ある点は、リタンセリン、ケタンセリンおよびペランセリンがす べて類似の薬理学的および生物学的特性を有する５ＨＴ２受容体アンタゴニスト である反面、リタンセリンは腫瘍細胞の増殖を阻害し、ケタンセリンおよびペラ ンセリンは該リタンセリンによる阻害を阻止することである。このことはこれら のデータが新しい５ＨＴ受容体亜類型を規定するに充分であることを意味してい るのではない。なお、これらの５ＨＴ受容体の型を完全に規定するためには、さ らに詳細な分析がこれら受容体にとって必要とされる。また、これらのデータか ら、当該５ＨＴと５ＨＴ受容体とがある組織培養における特定種類の腫瘍細胞系 の増殖に必要となる可能性が現出したと考えられる。この種の増殖の特性には、 細胞が、該細胞表面受容体に結合し細胞機能を刺激する、当該細胞の成長因子を 放出するような成長因子作用のオートクリン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）経路におい て一貫しているものがある（４３−４４）。ここで示すデータでは、該５ＨＴが 腫瘍細胞により生成され、増殖に必要とされることが示されている。さらに、当 該５ＨＴ受容体に結合するために知られるリガンドの研究により、５ＨＴが細胞 表面受容体を介して増殖を刺激する作用を有すると考えられるようになった。こ の点から、該５ＨＴが非活動性の繊維芽細胞と平滑筋細胞の両方に対応する成長 因子であることが示されていることを知ることが重要となる（４５−４７）。こ れらの例においては、内因性５ＨＴに対する外因性５ＨＴがＤＮＡ合成を促進す るために使用される。さらに、これらの結果は、正常な二倍体細胞がそれらの成 長因子や成長因子受容体を生成する能力を得ることにより形質転換され得るとい う現在の多くの腫瘍形成についての概念上で一貫している（４８−４９）。すな わち、当該５ＨＴおよび５ＨＴ受容体の生成は正常な細胞が永久の形質転換表現 型を得るための一つの方法となり得る。そして、当該腫瘍細胞がセロ　□トニン を合成し、かつ、インビボにおける増殖のために該セロトニンを必要とするかは 未解決の重要な問題である。

培養体　５ＨＴ　増殖 細胞内　細胞外　（ｃｐｍ） ｍｏｌ　ｍ　ｎＭ ＭＥ１８０細胞 １３±２　４４±３　４４７００±５６２０＋ｐＣＰＡ ４±１　１０±２　１２６００＋１２２０＋ｐＣＰＡ＋５−０Ｈ−ｔ　ｒｙｐ １６±４５６±４　４２２００±４２２０表１２ ５ＨＴ合成の阻害は腫瘍細胞による増殖を阻害するが正常な二倍体細胞による増 殖を阻害しない。異なる種類のヒト細胞系をＡＴＣＣから入手した。これらの培 養条件は（５０）に示す通りである。まず、５ＨＴを除くために使用する前に血 清を透析した。ＭＥ１８０（頚管癌腫細胞）　、ＢＴ２０　（胸部癌種細胞）　 、ＨＴ２９　（結腸腺癌細胞）、Ｕ９３７（組織法リンパ腫、単球種）、ジニル カット（Ｔ細胞リンパ腫細胞）　、ＭＯＬＴ−４（急性リンパ芽球白血病）、内 皮細胞（−次培養体）、滑液繊維芽細胞（−次培養体）、肺繊維芽細胞（ＭＲＣ −５；長期系列）またＴ細胞肺の一次培養体を４８時間培養した。他の条件は表 １１に記載の通りである。

５ＨＴ含有量　増殖 細胞　（ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白）　（ｃｐｍ　Ｘ　１０００）ポピユレーシヨン 対照　＋ｐＣＰＡ　＋ｃＣＰＡ ＋ｐＣＰＡ　＋５−ＯＨ− ｒ 形ｊ］Ｌ換１を系 Ｅ１８０ １３±２　４４，７　１２．６　４２，２Ｔ２９ ２４±３　５６．７　１４．１　４７．４ジユルカツト ３１±３　８５．６　２４．０　４０，２０ＬＴ−４ ２２±５　３４，３　３６．５　３１．５３９±６　１９４．０　７１．８　１ ５５．６Ｔ２０ 検出不能　２９゜０　６．５　２９，７瓜１≦」し１級１ Ｔ細胞胚 ２５±２　４５．９　３７．１　４１．４繊維芽細胞（肺） ２９±４　１０．３　９．３　１０．２繊維芽細胞（滑液） 検出不能　４．８　３．９　４．５ 内皮細胞 Ｘ　７．５　７９　７．５ 表１３ ５ＨＴ受容体アンタゴニストによる腫瘍細胞の増殖の阻害と５ＨＴによるその逆 転作用 腫瘍細胞系列と正常二倍体細胞を３０μＭのリタンセリン（１−１０ｎＭの濃度 において５ＨＴ２部位に対して活性を有する５ＨＴ２受容体アンタゴニスト）の 存在下または非存在下で、１μＭの５ＨＴの存在下または非存在下に４８時間培 養した。この場合、５ＨＴの添加は対照の増殖処理には影響しなかった。また、 培養は三重に行い、標準誤差は１０％以下であった（データ示さな細胞　３Ｈ− ＴｄＲの取り込み ポピユレーション　（ｃｍｐｘｌｏｏｏ）対照　＋リタンセリン　＋リタンセリ ン＋５ＨＴ 形ｆｌ換ＪＪ順系 ＭＥ１８０　４０．７　２．２　２１．４ジユルカツト　７５．８　０．４　５ １．６ＨＴ２９　１５９．５　２５．３　５８．４Ｕ９３７　６８．９　１５． ２　４５．８Ｍ０ＬＴ−４３４，５３２，８５５，５ＢＴ２０　２７．３　３． １　１９．ＩＬ？Ｌ二量婆亙ｌ 繊維芽細胞　１０．３　８．７　８．ＯＴ細胞胚　４３．９　４０，５　４５． ５繊維芽細胞（滑液） １０．９　１４．４　１１．５ なお、科学的に合成できるアゴニストやアンタゴニストに加えて、上記５Ｈ７２ 類似受容体に対する多種類のミモトーブおよび／または抗体が本発明の範囲に及 ぶ。

該新規５Ｈ７２類似受容体の同定は当該受容体に対する抗体の発生を可能にする 。さらに、該抗体は研究用プローブとして、また、治療用に利用できる。なお、 該抗体の発生技術は当業界において周知の方法である。当該方法については、上 述の文献（Ｆｕｎｄａｍｅｎ　ｔ　ａ　ＩＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５ｅｃｏｎｄ 　Ｅｄｉｔｉ。

ｎ）の１２章を参照されたい。また、当該抗体には、ポリクローナル、モノクロ ーナル、キメラ、人体適用型およびヒト型を含む多くの「型」が発生可能である ことを認識した。さらに、これらの抗体の「型」は共通に当該新規５ＨＴ２類似 受容体に特定の１種以上のエピトープを認識する能力を備えている。

また、当該新規５ＨＴ２類似受容体の同定により、精製した受容体を、特定的に 蛋白に結合するペプチドを同定するために、ランダムなペプチドシーケンスのラ イブラリをスクリーニングするためのプローブとして使用することができる。さ らに、該精製した受容体に対して発生された抗体もプローブとして使用すること ができる。

この場合のペプチドのライブラリを構成するための技法については、クイラ（Ｃ ｗｉｒｌａ）他の文献「ペプチドＪ　（Ｐｅｐｔ　１ｄｅｓ　；Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ　Ｉ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、Ｖｏｌ、８７．６３７８−６３８２、Ａｕ ｇｕｓｔ　１９９０）のリガンドを同定するためのペプチドの広大なライブラリ を参照されたい。また、上記のスクリーニングの方法については、デブリン（Ｄ ６ｖｌｉｎ）他の「ランダムペプチドライブラリＪ　（Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｅｐｔ ｉｄｅ　Ｌｔｂｒａｒｉｅｓ；５ｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、２４９，４０４−４０６ ．２７Ｊｕｌｙ　１９９０）の特定蛋白結合分子の種、および、スコー７ト他（ Ｓｃｏｔｔ、、Ｓｍ１ｔｈ）の「エピトープライブラリによるペプチドリガンド の調査Ｊ　（Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｇａｎｄｓ； ５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、２４９，３８６−３９０゜２７　Ｊｕｌｙ　１９９０ ）を参照されたい。

参考文献 １．Ｐｌａｕｔ、Ｍ、１９８７．Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｎｏｌ、５二６２１ ２、Ｈｅｎ５ｏｎ、Ｐ、Ｍ、１９７０．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｆ、１０５：４７６ 抗原−抗体複合体および補体によるラビットの血小板から組成物を放出するメカ ニズム。

３、Ｅｓｓｍａｎ、Ｗ、Ｂ、１９７８．５ｐｅｃｔ　ｒｕｍ、（Ｗ、Ｂ、Ｅｓｓ ｍａｎ、ｅｄ、）Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐ、１５ 健康体および病体における組織中および体液中のセロトニン。

４．０１ｓｏｎ、Ｐ、Ｓ、、Ｕ、Ｌｊｕｎｇｖｉｓｔ。

ａｎｄ　Ｓ、−Ｅ、Ｂｅｒｇｅｎｔｚ、１９７４．Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、５： １ 実験的動脈および静脈トロンビン中における血小板、赤血球およびフィブリン含 有量の分析。

５．５ｔｅｒｎｂｅ　ｒｇ、Ｅ、Ｍ、、Ｈ，Ｊ、Ｗｅｎｄｅｒ、Ｍ、に、Ｌｅｕ ｎｇ、　ａｎｄ　Ｃ，Ｗ、Ｐａｒｋｅｒ、１９８７．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３ ８：４３マウスマクロファージ上のセロトニン（５−ＨＴ）および他のモノアミ ンの作用：インターフェロン−ガンマ誘導食菌作用のモジュレーション。

６、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、Ｅ、Ｍ、、Ｊ、Ｔｒｉａｌａｎｄ　Ｃ，Ｗ、Ｐａｒｋ ｅｒ、１９８６．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７：２７６ マウスマクロファージ上のセロトニンの作用：セロトニンによるＩａ表現の抑制 および５−ＨＴ２セロトニン性受客受容体アンタゴニストる該抑制作用の逆転。

７、Ｈｅ１ｌｓｔｒａｎｄ、に、、ａｎｄ　Ｓ、Ｈｅｒｍｏｄｓｓｏｎ、１９８ ７．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３９：８６９ ヒト科天然キラー細胞の細胞毒性の調節におけるセロトニンの役割。

８、Ｃｈｏｑｕｅｔ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｈ，Ｋｏｒｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５：４５５７ リンパ球における電圧−ゲートコンダクタンス上のセロトニンの二つの作用。

９、Ｂｏｎｎｅｔ、Ｍ、、Ｇ、Ｌｅｓｐｉｎａｔｓ、ａｎｄ　Ｃ，Ｂｕｒｔｉｎ 、１９８４．Ｃｅ１ｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、８３：２８０ フィトヘムアグルチニンおよび抗原に応答するリンパ球のヒスタミンおよびセロ トニン抑制。

１０、Ｇｅｒｓｈｏｒｎ、Ｒ，に、、Ｐ、Ｗ、Ａｓｋｅｎａｓｅ、ａｎｄ　Ｍ、 Ｄ、Ｇｅｒｓｈｏｎ、１９７５゜Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４２ニア３２ 遅延型過敏症皮膚反応の発生のための血管作用性アミンの要求。

１１、Ａｍｅｉｓｅｎ、Ｊ、−Ｃ，、Ｒ，Ｍｅａｄｅ。

ａｎｄ　Ｐ、Ｗ、Ａｓｋｅｎａｓｅ、１９８９．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８ ９：３１７１ 遅延型過敏症におけるセロトニン関与についての新しい解釈二Ｔ細胞の作用によ る接触感度のセロトニン−２受容体アンタゴニストの阻害。

１２、Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ａ、Ｗ、、ａｎｄ　Ｓ、Ｊ、Ｐｅｒｏｕｔｋａ、１９８ ９．Ｆａｓｅｂ　Ｊ、３：２２５−ヒドロキシトリプタミン受容体群。

１３、Ｐｅｒｏｕｔｋａ、Ｓ、Ｊ、１９８８．Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１１：４５５−ヒドロキシトリプタミン受容体並類 型。

１４、Ｋａｄａｎ、Ｍ、Ｊ、、Ａ、Ｍ、Ｋｒｏｈｎ、Ｍ。

Ｊ、Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｌ、Ｗａｌｔｚ、ａｎｄ　Ｐ、Ｒ。

Ｈａｒｔｉｇ、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、４３：６０１ラツト前脳皮質における セロトニン受容体への１２５１−リセルグ酸ジエチルアミンの結合特性。

１５、Ｍｏｒｅｔｔ　１−Ｒｏｊａｓ、Ｉ、、Ｅ、Ｇ、Ｅｚｒａｔ　ｌ５ｏｎ、 Ｌ、Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ、Ｍ、Ｌ。

Ｅｎｔｍａｎ、ａｎｄ　Ａ、Ｊ、Ｇａｒｂｅｒ、１９８３、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、２５８：１２４９９ラツトにおける骨格筋のセロトニン性およびアドレナ リン性調節：Ｉｌ、サルコレンマ受容体の機能および特異性のプローブとしての ［１２５Ｉ］インドリセルグ酸ジエチルアミンおよび［１２５Ｉ］イオドブイン ドロールの用途。

１６、Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ、Ｐ、Ｓ、、Ｃ，Ｈ，Ｊｕｎｅ、Ａ、Ｇｒｏｓｓ ｍａｎ、ａｎｄ　Ｊ、Ａ、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ、１９８６．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、１３７　：　９５２ ＰＨＡまたはアンチＣＤ３によるマイトゲン刺激後の細胞内遊離カルシウム応答 におけるＴ細胞の異種体。フローサイトメトリーによるインド−１と免疫蛍光法 の同時使用。

１７、Ｋｅｌ　ｌｅｙ、に、Ａ、１９８９．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１０（印刷中 ） オンライン試薬添加とフローサイトメーターのサンプル遷移時間の短縮を実現す るサンプルの状態調節。

１８、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ、Ｇ、、Ｍ、Ｐｏｅｎｉｅ　ａｎｄ　Ｒ，Ｙ、Ｔ ｓｉｅｎ、１９８５．Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０：３４４０ 大幅に改良した蛍光特性によるＣａ＋十指示体の新しい発生。

１９、Ｓｍ１ｔｈ、Ｃ，Ｄ、、ａｎｄ　Ｒ，Ｓｎｙｄｅｒｍａｎ、１９８７．Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１４１：２６１ ヒト白血球におけるポリフオスフオイノシチドの受容体媒介による加水分解にお けるグアニンヌクレオチド調節蛋白。

２０、Ｒｏｓｏｆ　ｆ、Ｐ、Ｍ、、Ｎ、Ｓａｖａｇｅ　ａｎｄ　Ｃ，Ａ、Ｄｉｎ ａｒｅｌｌｏ、１９８８．　Ｃｅ１１．５４ニア３ 新規メカニズムによるＴリンパ球におけるインターロイキン−１刺激のジアシル グリセロール生成。

２１　Ｗｅｉｓｓ、Ａ、、ＲｏＬ、Ｗｉｓｋｏｃｉ　１ａｎｄ　Ｊ、５ｔｏｂｏ 、１９８４．Ｊ、Ｉｍｍｕｎ。

１．１３３：１２３ ヒト科Ｔ細胞の活性における７３表面分子の役割二ＩＬ−２生成のための２種の 刺激要求が予備翻訳段階において発生する状態を反映する。

２２、Ｂｅｒ　ｒ　ｉｄｇｅ、Ｍ、Ｊ、１９８７．Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５６：１５９イノシトールトリフオスフエートおよび ジアシルグリセロール：二種の相互作用二次メツセンジャー。

２３、Ｆａｒｇｉｎ、Ａ、、Ｊ、Ｒ，Ｒａｙｍｏｎｄ。

Ｍ、Ｊ、Ｌｏｈｓｅ、Ｍ、に、Ｋｏｂ　ｉ　ｌｋａ、Ｍ、Ｇ。

Ｃａｒｏｎ、ａｎｄ　Ｒ，Ｊ、Ｌｅｆｔｋｏｗｉｔｚ。

１９８８、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）３３５：３５ベーターアドレナリン 受容体シーケンスに類似のゲノムクローンＧ−２１が５−ＨＴ１ａ受容体をエン コードする。

２４、Ｊｕｌｉｕｓ、Ｄ、、Ａ、Ｂ、ＭａｃＤｅｒｍ。

ｔｔ、ＲｏＡｘｅｌ　ａｎｄ　Ｔ、Ｊｅｓｓｅｌ、１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　 ２４１：５５８セロトニンＩＣ受容体をエンコードする機能ｃＤＮＡの分子特性 。

２５、Ｐｒ１ｔｃｈｅｔｔ、Ｄ、Ｂ、、Ａ、Ｗ、Ｂａａｈ、Ｍ、Ｗｏｚｎｙ、Ｏ ，Ｔａ　Ｉｅｂ、Ｒ９Ｄａ　ｌ　Ｔｏｓｏ、Ｊ、Ｃ，５ｈｉｎ　ａｎｄ　Ｐ、Ｈ ，Ｓｅｅｂｕｒｇ、１９８８．ＥＭＢＯ，Ｊ、７：４１３５クローン化したラッ トセロトニン５ＨＴ２受容体の構造および機能表現。

２６、ＤｅＶｉｖｏ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｓ、Ｍａａｙａｎｔ、１９８６．Ｊ、Ｐｈ ａｒｍａｃｏｉ　Ｅｘｐ、Ｔｈｅｒ、２３８：２４８ ギニア豚およびラットの大脳海鳥膜におけるフォルスコリン刺激アデニル酸シク ラーゼ活性の５Ｈｂ体媒介による阻害特性。

２７、Ｃｏｎｎ、Ｐ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｅ、５ａｎｄｅｒｓ−Ｂｕｓｈ、１９８５ ．Ｊ、Ｐｈａｒｍ、ａｎｄ　Ｅｘｐ、Ｔｈｅｒａｐ、２３４：１９５ セロトニン刺激フオスフオイノシチドターンオーバー：ラットの皮質下を含まな い大脳皮質内の８２結合部位による媒介。

２８、Ｃｏｎｎ、Ｐ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｅ、５ａｎｄｅｒｓ−Ｂｕｓｈ、１９８４ ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍ、２３：９９３ 大脳皮質におけるセロトニン刺激のフオスフオチジルイノシトール代謝を阻害す る選択的５−ＨＴ２アンタゴニスト。

２９、Ｂｅｒｒｉｄｇｅ、Ｍ、Ｊ、ａｎｄ　Ｒ，Ｆ、Ｉｒｖｉｎｅ、１９８９． Ｎａｔｕｒｅ、３４１：１９７リン酸イノシトールおよび細胞シグナル作用３０ 、Ｚｅｌｌｅｒ、Ｊ、、Ｅ、Ｗｅｉｓｓｂａｒｔｈ。

Ｂ、Ｂａｒｕｔｈ、Ｈ，Ｍｉｅ　ｌｋｅ　ａｎｄ　Ｈ，Ｄｅｉｃｈｅｒ、１９８ ３．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄＲｈｅｕｍａ　ｔ　ｉ　ｓｍ、２６　：　５３ ２リユーマチ症炎症における血小板のセロトニン含有量：臨床活性の補正。

３１、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、Ｅ、Ｍ、、Ｊ、Ｍ、、Ｈｉｌ　１、Ｇ、Ｐ、Ｃｈｒ ｏｕｓｏｓ、Ｔ、Ｋａｍｉ　Ｉａｒｉｓ、Ｓ、Ｊ、Ｌｉ　ｓｔｗａｋ、Ｐ、Ｗ、 Ｇｏｌｄ、ａｎｄ　Ｒ，Ｌ、Ｗｉ　Ｉｄｅｒ、１９８９．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１ ．Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ、８６：２３７４関節炎症のルイスラットの連鎖球 菌細胞壁における炎症性媒介誘導の視床下部−下垂体一副腎軸推活性の欠陥。

３２、Ｂａｙｌｉｎ、Ｓ、Ｂ、ａｎｄ　Ｍｅｎｄｅｓ。

ｈｎ、Ｇ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　１゜３３、Ｊｕｌｉｕｓ、Ｄ 、、Ｌｉｖｅｌｌｉ、Ｔ、Ｊ、。

Ｊｅｓｓｅｌ　ｌ、Ｔ、Ｍ、ａｎｄ　Ａｘｅｌ、Ｒ，５ｃｉｅｎｃｅ　２４４． １０５７−１０６２　（１９８９）３４、Ｊｕ　ｌ　ｉｕｓ、Ｄ、、Ｈｕａｎｇ 、に、Ｎ、、Ｌｉｖｅｌｌｉ、Ｔ、Ｊ、、Ａｘｅｌ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｊｅｓｓｅ 　Ｉ　Ｉ、ＴｏＭ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　ｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、８７．　９２８−９３２ ３５、Ｂｕｃ−Ｃａｒｏｎ、Ｍ、Ｈ，、Ｌａｕｒａｙ。

Ｊ、Ｍ、、Ｌａｍｂｌｉｎ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｋｅｌ　ｌｅｒｍａｎｎ、Ｏ，Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔ　１．、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、８７．　１９２２−１９２６　（１ ９９０）３６、Ｌａｕｂｓｈｅｒ、Ａ、ａｎｄ　Ｐｌｅｔｓｃｈｅｒ、Ａ、Ｊ、 Ｐａｒｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、３１゜３７、Ｐｅｒｏｕｔｋａ、Ｓ、Ｊ、　Ａ ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１１．　４５−６０　（１９８８）３８、Ｓ ｃｈｍｉｄｔ、Ａ、Ｗ、、ａｎｄ　Ｐｅｒｏｕｔｋａ、Ｓ、Ｊ、Ｆｅｄ、Ａｍ、 Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏ　１．　Ｊ、３．　２２４２−２２４９　（１９８９） ３９、Ｇｌｅｎｎｏｎ、Ｒ，Ａ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ。

３０、　１−１２　（１９８７） ４０、Ｈａｍｏｎ、Ｍ、、Ｂｏｕｒｇｏｉｎ、Ｓ、、Ｈｅｒｙ、Ｓ、、ａｎｄ　 Ｓｉｍｏｎｎｅｔ、Ｇ、Ｍｏｌ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１４．　９９−１１０　（１９７８）４１、Ｋｏｅ、Ｂ、 Ｋ、、ａｎｄ　Ｗｅｉｓｓｍａｎ。

Ａ、Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　、　Ｅｘｐ、Ｓｃｉ、１５４゜４２、Ａｕｎｅ 、Ｔ、Ｍ、、Ｋｅ　Ｉ　ｌｅｙ、Ｋ、Ａ、。

Ｒａｎｇｅｓ、Ｇ、Ｅ、、ａｎｄ　Ｂｏｍｂａｒａ、Ｍ。

Ｐ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９９０）（印刷中）４３゜　ＤｅＬａｒｃｏ、Ｊ 、Ｅ、、ａｎｄ　Ｔｏｄａｒｏ、Ｇ、Ｊ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、７６、　４００１−４００５　（１９７８）４４、Ｔｏｄａｒｏ、 Ｇ、Ｊ、、ＤｅＬａｒｃｏ、Ｊ。

Ｅ、、ａｎｄ　Ｆｒｙｌｉｎｇ、Ｃ，Ｍ、ＦＡＳＥＢＪ、４１．　２９９６−３ ００３　（１９８２）４５、Ｓｅｕｗｅｎ、に、、Ｍａｇｎａｌｄｏ、Ｉ、。

ａｎｄ　Ｐｏｕｙｓｓｅｇｕｒ、Ｊ、Ｎａｔｕｒｅ、３３５、　２５４−２５６ 　（１９８８）４６、Ｓｅｕｗｅｎ、に、、ａｎｄ　Ｐｏｕｙｓｓｅｇｕｒ、Ｊ 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、３９゜４７、Ｎｅｍｅｃｅｋ、Ｇ、 Ｍ、、Ｃｏｕｇｈｌｉｎ。

Ｓ、Ｒ，、Ｈａｎｄｌｅｙ、Ｄ、Ａ、、ａｎｄ　Ｍｏｓｋｏｗｉ　ｔｚ、Ｍ、Ａ 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ、ｓａ、６７４−６７８　（１９８６）４８、Ｂ１５ｈｏｐ、Ｊ、Ｍ、 Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５２．　３０１−３５４　（１９８３）４ ９、Ｖａｒｍｕｓ、Ｈ，Ｅ、Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、１８．　５５３− ５８７　（１９８４）５０、Ａｕｎｅ、Ｔ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｐｏｇｕｅ、Ｓ。

Ｌ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、８４．　８６３−８７５１、Ｆｉｎｏｃｃｈ ｉａｒｏ、Ｌ、Ｍ、Ｅ、、Ａｒｚｔ、Ｅ、Ｓ、、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃａｓｔ ｅｌｏ。

Ｓ、、Ｃｒ１ｓｃｕｏｌｏ、Ｍ、、Ｆｉｎｋｉｅｌｍａｎ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｎａ ｈｍｏｄ、Ｖ、Ｅ、Ｊ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅｓ、８．　７０５−７１６ ５２、Ｗａ　１ｋｅｒ、Ｒ，Ｆ、、Ｆｒ　ｉｅｄｍａｎ、Ｄ。

Ｗ、、ａｎｄ　Ｊｉｍｅｎｅｚ、Ａ、Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ。

３３、　１９１５−１９２４　（１９８３）５３、Ａｌｔｍａｎ、Ａ、、Ｔ、Ｍ ｕｓｔｅｌｉｎ　ａｎｄ　Ｋ、Ｍ、Ｃｏｇｇｅｓｈａｌ　ｌ、１９９０．　Ｃｒ １ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖ、ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０：Ｔリンパ球活性：シグナ ルトランスダクションの生物学的モデル。

５４、Ｐｕｃｋ、Ｊ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｒ，Ｒ，Ｒｉｃｈ。

１９８４、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３２：１１０６ボークウイードマイトゲンに より刺激されたＴ細胞サブセットの増殖を支配する調節的相互作用。

５５、Ａｕｎｅ、Ｔ、Ｍ、ａｎｄ　Ｓ、Ｌ、Ｐｏｇｕｅ。

１９８９、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４２：３７３１ＣＤ８＋サプレッサＴリンパ 球の連続系の発生および特性。

５６、Ｆｏｘ、Ｅ、Ｊ、、Ｒ，Ｇ、Ｃｏｏｋ、Ｄ、Ｅ。

Ｌｅｗｉｓ、ａｎｄ　Ｒ，Ｒ，Ｒｉｃｈ、１９８６．Ｊ。

Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７８：２１４サプレツサＴ細胞の増殖シグナル：イン ビトロでポークライードマイトゲンにより刺激されたヘルパー細胞はサプレッサ 細胞成長因子を生成する。

５７、Ｋａｍｍｅｒ、Ｇ、Ｍ、、１９８８．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ 、９，２２２−２２９アデニル酸シクラーゼ−ｃＡＭＰ−蛋白キナーゼ。免疫応 答の経路および調節。

詰ｍノス 時間（分） 、　〜　）−＆　〜 ｏ　（ＪＩ　堵　ｏ　。

ＦＩＧ、　ｆ３Ａ ＦＩＧ、　６Ｂ ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、　８ ０　！００００　２００００ 添加したサプレッサＴ細胞 ＦＩＧ、７７ ＦＩＧ、　１２ Ｆｍｏｌ　結合量／１０個絽胞 ＦＩＧ、　１３Ｂ ＦＩＧ、　１４ ＦＩＧ、　１５ ＦＩＧ、　１６ ＩＦＮ７ ＦＩＧ、　１７Ａ ５Ｈ）リプトファンまたはトリプトファン（μＭ）ＦＩＧ、７７Ｂ ＦＩＧ、　１Ｂ アッセイ日数　。

ＦＩＧ、　２０ ＥＧ、　２−１ 国際調査報告 Ｆｅｌ１１ｐｃＴＡシｎ＋ａ　１−−１−１−＋２トＰ糎＋２８６引国際調査報 告 ＬＩＳ　９１０６１７５ Ｓ＾　５０７６２

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．５ＨＴ１ａ受容体待合部位の有効性を低下することから成ることを特徴とす る５ＨＴ１ａ受容体を呈示する悪性細胞の増殖を抑制的に調節する方法。
2. ２．前記５ＨＴ１ａ受容体結合部位の有効性を、５ＨＴリガンドの群から選択し た少なくとも一種のアンタゴニストの効果量を投入することによって低下するこ とを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．前記５ＨＴ受容体リガンドの群がリタンセリン、ミアンセリン、スピペロン 、ミモトープおよび前記５ＨＴ１ａ受容体に対する抗体を含むことを特徴とする 請求項２に記載の方法。
4. ４．５ＨＴ１ａ受容体に対して結合可能なセロトニンの量を機能的に減少するこ とから成ることを特徴とする５ＨＴ１ａ受容体を呈示する悪性細胞の増殖を抑制 的に調節する方法。
5. ５．前記悪性細胞の増殖を、酵素トリプトファンヒドロキシラーゼの活性を阻害 する化合物の効果量を投与してセロトニン合成を阻害することにより抑制するこ とを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. ６．５ＨＴ１ａ受容体結合部位の有効性を機能的に増加することから成ることを 特徴とする５ＨＴ１ａ受容体を呈示する悪性細胞の増殖を増進的に調節する方法 。
7. ７．前記悪性細胞の増殖を、８−ヒドロキシジプロピルアミノテトラリンＨＢｒ を含む５ＨＴ１ａ受容体リガンドの群から選択した少なくとも一種のアゴニスト の量を投入することによって増進することを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. ８．５ＨＴ１ａ受容体結合部位の有効性を低下することによって５ＨＴ１ａ受容 体を呈示する細胞の増殖を抑制的に調節することから成ることを特徴とする哺乳 類における悪性細胞依存症を治療する方法。
9. ９．前記細胞の増殖を、当該細胞増殖を阻害するために前記５ＨＴ受容体に結合 するに足る、５ＨＴ受容体リガンドの群から選択した少なくとも一種のアンタゴ ニストの効果量を投入することによって抑制することを特徴とする請求項８に記 載の方法。
10. １０．前記５ＨＴ受容体リガンドの群がリタンセリン、ミアンセリン、スピペロ ン、ミモトープおよび当該５ＨＴ受容体の抗体を含むことを特徴とする請求項９ に記載の方法。
11. １１．５ＨＴ受容体に結合し得るセロトニンの量を機能的に減少することによっ て５ＨＴ１ａ受容体を呈示する細胞の増殖を抑制的に調節することから成る哺乳 類における悪性細胞依存症を治療する方法。
12. １２．前記悪性細胞の増殖を、酵素トリプトファンヒドロキシラーゼの活性を阻 害する化合物の効果量を投与してセロトニン合成を阻害することにより低下する ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記悪性細胞の増殖を、リタンセリン、ミアンセリン、スピペロン、ミモ トープおよび前記５ＨＴ１ａ受容体の抗体を含む５ＨＴ受容体リガンドの群から 選択した少なくとも一種のアンタゴニストの効果量を投入することによって低下 することを特徴とする請求項１２に記載の方法。