JP7495438B2

JP7495438B2 - 唾液腺炎の治療におけるボツリヌス神経毒素の改善された使用

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Application number: JP2022000897A
Authority: JP
Inventors: サイコス，ジャノス; プルテ，イレナ; アルトハウス，マイケル; クルーア，マルクス; ウエグナー，ニコ
Original assignee: メルツファルマゲーエムベーハーウントコンパニーカーゲーアーアー
Priority date: 2017-03-24
Filing date: 2022-01-06
Publication date: 2024-06-04
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Description

本発明は、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態の治療におけるボツリヌス神経毒素の改善された使用に関する。特に、耳下腺および顎下腺に１．４５対１～１．７対１の間の用量比で投与されるボツリヌス神経毒素が開示されている。

流涎は、一般に唾液が唇の縁を越えて溢れる（前部流涎として知られる）、または不注意で咽頭に溢れたり無意識に声門および気管に入る（後部流涎として知られる）症状をもたらす多種多様な臨床状態によって表される。前部流涎は、患者にとって社会的交流に関する障害が大部分であるが、後部流涎は健全な咳反射をする被験者あるいは無意識に静かに呼吸をしている被験者に咳や刺激を引き起こし得る。

流涎という用語は、しばしば臨床状態、使用国、医学の専門分野に応じて医学用語の唾液腺炎、過唾液分泌または流涎症の一般用語で使用される。定義によれば、唾液腺炎は「唇縁を超える唾液の過剰なこぼれ」であり、過唾液分泌は「唾液の過剰な産生」であり、流涎症は「妊婦における過唾液分泌」である。これらの用語および定義は、それらの不明な原因ならびに、基礎的疾患および障害の病理学的メカニズムに関しては一貫して使用されていない。

唾液腺炎の原因は様々であり得、一般に唾液の過剰産生または唾液管理の性能低下、あるいは解剖学的構造もしくは生理学的機能の排除と関連する。もちろん、これらの要因を組み合わせると明確に原因を区別できなくなり、したがって上記の症状の診断の記述子が矛盾して使用される。一部の例では、唾液腺および管、唇、口腔、ならびに歯（口唇閉鎖の欠陥、歯の不正咬合）の解剖学的奇形および変形だけで、口腔と外界との間の局所バイパスを誘導し、生成した唾液の制御不能な流出を可能にする。

奇形、狭窄、瘢痕、瘻孔および迂回は、口腔癌または頭頸部癌、けが、およびそれらの手術の合併症の恒久的な結果として起こり得る。知的障害を持つ患者は、口を永久的に開いている可能性があり、奇形の有無にかかわらず同じ効果を引き起こす。例えば、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳性麻痺、脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ），クロザピン誘発性過唾液分泌、レット症候群、アンジェルマン症候群、てんかん性脳症および脳腫瘍、咽頭喉頭全摘術、喉頭亜全摘出術および声門上喉頭切除術、認知症もしくは知的障害または唾液腺炎もしくは過唾液分泌の他のあらゆる原因から選択される神経学的疾患の患者においては、感覚運動能力の低下、口頭神経筋制御不良、防衛反射の減少、嚥下筋の運動低下、嚥下頻度の減少または嚥下不良もしくは嚥下障害が、生来の唾液腺炎の最も頻繁な原因であるように思われる。嚥下の運動制御の妨害により頻繁に飲みみ込まれない場合、生成された刺激されていないまたは刺激された唾液は口腔内にプールされる。制御されていない口の開きと前傾の頭部の姿勢は、プールされた唾液が患者の唇の縁を越えてあふれやすくなる。

唾液分泌はまた、例えば、唾液腺における唾液核または神経終末の持続的な活性化を引き起こす重い虫歯や歯石、唾液腺の肥大、胃食道逆流などの刺激因子、あるいは副作用として過唾液分泌を誘発する薬物または毒素（例、クロザピン、ベンゾジアゼピン、抗精神病薬）によっても恒久的に増加し得る。

その他の点では健康な個人において唾液の過剰産生だけはある程度まで抑制することができる。唾液管理に障害がある患者では、口の中のプールされた唾液を制御する能力または過剰に分泌された量の唾液を飲み込む能力の上限はより低く、したがってより困難である。

嚥下障害に対する治療法の選択肢は、リハビリ対策（嚥下訓練、口腔運動制御訓練）に焦点を当てているが、パーキンソン病やＡＬＳなどの進行性神経疾患患者では、意識のない頻繁な嚥下のメカニズムの訓練または開発はほとんどできない。それゆえ、唾液腺炎の治療は、しばしば唾液産生の減少に集中している。最も初期のアプローチは、口腔内およびその周囲の唾液腺によって産生される唾液の量を制御するムスカリン性コリン作用性神経に対して抑制作用する、周知の抗コリン薬（例えばアトロピン、臭化イプラトロピウム、スコポラミン、グリコピロレート、トロピカミド）を使用した。この症状には、他のいくつかの抗コリン作用薬誘導体も試験され、認可外で使用されている。最近では、グリコピロレートのみが、米国およびＥＵの小児の流涎の治療に承認されている。

別の治療選択肢はボツリヌス毒素であり、これは筋緊張および治療された筋肉の痙縮、または多汗症を減少させるために筋肉内注射によって患者に投与される。口腔乾燥症は、このような患者での薬の副作用として検出されており、このことが唾液腺のボツリヌス毒素ＡまたはＢを用いた直接的な治療、すなわち主唾液腺の耳下腺および顎下腺にボツリヌス毒素ＡまたはＢを腺内または実質内注入することによって唾液腺を治療することを医者に動機付けた。

クロストリジウムは、ファーミキューテス門に属する嫌気性菌グラム陽性細菌属である。クロストリジウムは約１００種からなり、ボツリヌス菌および破傷風菌などの一般的な自由生活細菌および重要な病原体を含む。両種はそれぞれ神経毒、ボツリヌス毒素および破傷風毒素を産生する。これらの神経毒は、神経細胞のカルシウム依存性神経伝達物質分泌の強力な阻害剤であり、人間に知られている最強の毒素の一つである。ヒトにおける致死量は体重１キログラムあたり０．１ｎｇ～１ｎｇの間にある。

汚染された食品を介したボツリヌス毒素の経口摂取または創傷におけるボツリヌス毒素の生成は、様々な筋肉の麻痺を特徴とするボツリヌス中毒症を引き起こす場合がある。呼吸筋の麻痺は罹患者に死をもたらす場合がある。

ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）および破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）は両方とも、冒されたニューロンの軸索からのシナプスへの神経伝達物質の放出が阻害される類似の初期生理学的作用機序を介して機能するが、それらは臨床応答において異なる。ボツリヌス神経毒素は末梢神経系の神経筋接合部および他のコリン作動性シナプスに作用して神経伝達物質アセチルコリンの放出を阻害し、それにより弛緩性麻痺を引き起こすが、中枢神経にトランスサイトーシスされる破傷風神経毒は主に中枢神経系で作用し、シナプトブレビンタンパク質を分解することにより、抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡ（γ－アミノ酪酸）およびグリシンの放出を防止する。結果として生じる脊髄運動ニューロンの過活動は、強縮性攣縮（硬直性麻痺）と呼ばれる、主動筋および拮抗筋組織の全身性収縮を引き起こす。

破傷風神経毒素は１つの免疫学的に異なる型で存在するが、ボツリヌス神経毒素は、ＢｏＮＴ／ＡからＢｏＮＴ／Ｈと命名された７つの異なる免疫原性血清型とさらに亜型を含めて発生することが知られている。ほとんどのボツリヌス菌株は１種類の神経毒を産生するが、複数の神経毒を産生する菌株も記載されている。

ボツリヌス神経毒素および破傷風神経毒素は、相同性の高いアミノ酸配列を有し、類似のドメイン構造を示す。それらの生物学的に活性な形態は、ジスルフィド結合によって連結された２本のペプチド鎖、約５０ｋＤａの軽鎖および約１００ｋＤａの重鎖を含む。異なるクロストリジウム神経毒素間で長さが変化するリンカーまたはループ領域は、ジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残基の間に位置する。このループ領域は、未知のクロストリジウムエンドプロテアーゼによってタンパク質分解的に開裂し生物学的に活性な神経毒が得られる。

ＴｅＮＴおよびＢｏＮＴによる中毒の分子機構はよく似ているように思われる。すなわち、標的神経への進入が重鎖Ｃ末端部分の特定の細胞表面受容体への結合によって媒介される。その後、神経毒が受容体媒介エンドサイトーシスによって取り込まれる。そのようにして形成されたエンドソーム内の低いｐＨが、その後にクロストリジウム神経毒の構造変化を誘導し、これが神経毒をエンドソーム膜中に包埋し、エンドソーム膜を通して細胞質中に移行することを可能にし、細胞質では重鎖と軽鎖を連結するジスルフィド結合が還元される。次いで、軽鎖は、シナプス間隙への神経伝達物質放出の異なる段階、例えば認識、ドッキングおよび神経伝達物質含有小胞と原形質膜との融合に不可欠である、いわゆるＳＮＡＲＥタンパク質を選択的に切断することができる。ＴｅＮＴ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ、およびＢｏＮＴ／ＧはシナプトブレビンまたはＶＡＭＰ（小胞関連膜タンパク質）のタンパク質分解的切断を誘導し、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅは原形質膜関連タンパク質ＳＮＡＰ－２５を切断し、ＢｏＮＴ／Ｃ１は、内在性原形質膜タンパク質シンタキシンおよびＳＮＡＰ－２５を切断する。

ボツリヌス菌では、ボツリヌス神経毒素は、神経毒成分と非毒性タンパク質とを含むタンパク質複合体として形成される。付属タンパク質は神経毒成分を包埋し、それによって毒性効果に何も加えずに消化管内の消化酵素による分解から神経毒成分が保護される。したがって、ほとんどの血清型のボツリヌス神経毒素は経口毒性である。例えば４５０ｋＤａまたは９００ｋＤａの複合体はボツリヌス菌の培養物から入手可能である。

近年、ボツリヌス神経毒素は、例えばジストニアおよび攣縮の治療における治療薬として使用されており、さらに化粧用途、例えば縮緬皺の処理などに使用されている。ボツリヌス神経毒素複合体を含む調製物は、例えば、ＩｐｓｅｎＬｔｄ（Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標））、ＳｏｌｓｔｉｃｅＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓＬＬＣ／ＵＳＷｏｒｌｄｍｅｄｓＬＬＣ（Ｍｙｏｂｌｏｃ（登録商標））またはＡｌｌｅｒｇａｎＩｎｃ．（Ｂｏｔｏｘ（登録商標））から市販されている。（いかなる複合タンパク質も含まないボツリヌス神経毒素の高純度の神経毒成分は、例えば、フランクフルトのＭｅｒｚＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＧｍｂＨ（Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）、Ｂｏｃｏｕｔｕｒｅ（登録商標））から入手可能である。

様々な基礎疾患に起因する唾液腺炎を有する患者におけるボツリヌス神経毒素ＡおよびＢの使用について、先行技術でいくつかの報告がある。例えば、Ｂｒｅｈｅｒｅｔ等。例えば、Ｂｒｅｈｅｒｅｔｅｔａｌ．（ＡｎｎａｌｅｓｆｒａｎｃａｉｓｅｓｄＯｔｏ－ｒｈｉｎｏ－ｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｉｅｅｔｄｅＰａｔｈｏｌｏｇｉｅＣｅｒｖｉｃｏ－ｆａｃｉａｌｅ，ｖｏｌｕｍｅ１２８，Ｉｓｓｕｅ５，２０１１，ｐａｇｅｓ２６６－２７１）、Ｂａｒｂｅｒｏｅｔａｌ．（ＪＮｅｕｒｏｌ．２０１５Ｄｅｃ；２６２（１２）：２６６２－７）、Ｓｕｓｋｉｎｄｅｔａｌ．（Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．２００２Ｊａｎ；１１２（１）：７３－８１）、Ｐｏｒｔａｅｔａｌ．（ＪＮｅｕｒｏｌＮｅｕｒｏｓｕｒｇＰｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００１Ａｐｒ；７０（４）：５３８－４０．）、Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｉｅｔａｌ．（ＰａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍＲｅｌａｔＤｉｓｏｒｄ．２０１６Ｓｅｐ；３０：７３－７）およびＣａｓｔｅｌｎｏｖｏｅｔａｌ．（ＭｏｖｅｍｅｎｔＤｉｓｏｒｄｅｒｓ２０１３，Ｖｏｌｕｍｅ２８，ＡｂｓｔｒａｃｔＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）は、さまざまな病状の唾液腺炎を治療するために、唾液腺に投与する毒素の量を変えたいくつかの異なるプロトコルによるさまざまな毒素の使用を報告する。唾液腺炎にボツリヌス神経毒素を使用する安全性と有効性に関するデータを提供する多くの研究があるにもかかわらず、使用される毒素の投与量、投与部位および種類が明確に推奨されていない。

発明の目的
本発明の目的の一つは、例えば抗菌作用、凝集、ペリクル形成、消化、味覚、排泄および／または水収支のための潤滑剤として、イオンリザーバとして、緩衝剤として、洗浄剤として被験者において通常に生理的機能を示すが流涎を示さない程度に唾液産生量を抑制し、唾液腺の活性を長期間制限する、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態の治療のためのボツリヌス神経毒素を提供することである。本発明の別の目的は、ボツリヌス神経毒素による治療に関連した副作用を回避すること、または治療中に頻度、重症度および／または持続期間を少なくとも減少させることである。本発明のさらなる目的として、ボツリヌス神経毒素は、基礎疾患が治療によって冒されないように長期間にわたる有利な治療結果を提供する必要があり、それ故に長期持続療法は、反復注射サイクルによって有効性の減少もしくは安全性を損なうことなく効果的かつ安全に適用される必要がある。

驚くべきことに、ボツリヌス神経毒素は、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態の治療に使用される場合、これらの１つ以上の目的に対処できることが確認されており、ここで、前記ボツリヌス神経毒素は、各耳下腺および各顎下腺に注射により投与され、そして各耳下腺と各顎下腺に投与されるボツリヌス神経毒素の用量の間の比が１．４５対１～１．７対１である。

下記実施例で測定された、ベースラインからの非刺激唾液流量の平均減少を、プラセボと比較して示す図である。下記実施例で測定された、変化スケールの平均の全体的印象を示す図である。下記実施例で測定された、経時での被験者の奏効率を示す図である。下記実施例で測定された、ベースラインからのドローリング重症度および頻度スケール合計スコアの平均減少を示す図である。下記実施例で測定された、ベースラインからのmROMPドローリングサブスコア減少を示す図である。

発明の詳細な説明
本発明は、本発明の以下の詳細な説明およびそれに含まれる実施例を参照することによってより容易に理解され得る。

第一の実施態様では、本発明は、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態の治療に使用するためのボツリヌス神経毒素に関し、ここで前記ボツリヌス神経毒素は、耳下腺および顎下腺に注射により投与され、各耳下腺と各顎下腺に投与されるボツリヌス神経毒素の用量の間の比が１．４５対１～１．７対１である。好ましい実施形態では、本発明のボツリヌス神経毒素は耳下腺および顎下腺に投与され、ここで各耳下腺と各顎下腺に投与されるボツリヌス神経毒素の用量の間の比が１．５０対１～１．６対１である。特に好ましい実施形態では、本発明のボツリヌス神経毒素は耳下腺および顎下腺に投与され、各耳下腺と各顎下腺に投与されるボツリヌス神経毒素の用量の間の比が１．５０対１である。

さらなる実施形態では、本発明は、患者における唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態の治療する方法に関し、方法は、治療有効量のボツリヌス神経毒素を耳下腺および顎下腺に注射により投与することを含み、ここで各耳下腺と各顎下腺に投与されるボツリヌス神経毒素の用量の間の比が１．４５対１～１．７対１である。好ましい実施形態では、本発明の方法は、耳下腺および顎下腺に注射により治療有効量のボツリヌス神経毒素を投与することを含み、ここで各耳下腺と各顎下腺に投与されるボツリヌス神経毒素の用量の間の比が１．５０対１～１．６対１である。特に好ましい実施形態では、本発明の方法は、耳下腺および顎下腺に注射により治療有効量のボツリヌス神経毒素を投与することを含み、ここで各耳下腺と各顎下腺に投与されるボツリヌス神経毒素の用量の間の比が１．５０対１である。

さらなる態様では、本発明は一般に、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態を治療するためのボツリヌス毒素に関する。本発明の特定の実施形態では、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態は、例えば、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳性麻痺、脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ），クロザピン誘発性過唾液分泌、レット症候群、アンジェルマン症候群、てんかん性脳症、脳腫瘍、咽頭喉頭全摘術、喉頭亜全摘出術および声門上喉頭切除術、認知症もしくは知的障害（例えば、全体的発達遅延、重度学習障害）、または唾液腺炎もしくは過唾液分泌の他のあらゆる原因と関連する。本発明による唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患又は状態はまた、ダウン症候群、スミス－レムリ－オピッツ症候群、メビウス症候群、ＭＥＧＤＥＬ症候群、ベックウィズ－ヴィーデマン症候群、舌のリンパ管奇形、フォックス・チャバニー・マリー症候群、染色体異常および１７ｑ２１欠失様遺伝性疾患、家族性自律神経失調症、２２番部分トリソミー、Ａｉｃａｒｄｉ症候群、ＳＭＡ１型、ＧＭ１－ガングリオシドーシスまたはアペール症候群、ウィルソン病、水頭症様先天性脳奇形、小頭症、橋小脳形成不全、後頭蓋窩腫瘍、神経セロイドリポフスチン症、バッテン病、異染性脳白質変性症、多発性関節拘縮、脳症、脳回欠損または脳回肥厚、脊髄損傷様脳損傷、低酸素性虚血性脳症、先天性トキソプラズマ症、先天性サイトメガロウイルス感染症、髄膜後脳瘤またはヘルペス後脳炎、口腔統合運動障害様神経運動障害、核上性麻痺、弁蓋部症候群、ミオパチー、乳児けいれん、筋強直性ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、神経線維腫症１型またはミトコンドリア病、胎児性アルコール症候群、自閉症または若年性ギランバレー症候群でもあり得る。

本発明の特定の実施形態では、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患又は状態は脳卒中に関連し、特に唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患又は状態は脳卒中後（ｐｏｓｔｓｔｒｏｋｅ）に発生する。

本発明の好ましい実施形態では、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患又は状態は、例えば外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中後、パーキンソン病または非定型パーキンソン症候群（進行性核上性麻痺［ＰＳＰ］、多系統萎縮症［ＭＳＡ］、大脳皮質基底核変性症［ＣＢＤ］）に関連する。本発明の別の好ましい実施形態では、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態は、持続期間が少なくとも３ヵ月、唾液腺炎重症度がドローリング重症度サブスケールで少なくとも２スコアポイント、ドローリング頻度がサブスケールで少なくとも２スコアポイント、ならびにドローリング重症度および頻度スケールが少なくとも６スコアポイントの慢性唾液腺炎を伴う外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中後、パーキンソン病または非定型パーキンソニズム（進行性核上性麻痺［ＰＳＰ］、多系統萎縮症［ＭＳＡ］、大脳皮質基底核変性症［ＣＢＤ］）である。本発明の別の好ましい実施形態では、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態は、少なくとも０．３ｇ／分の非刺激時の唾液流量を有する慢性唾液腺炎を伴う外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中後、パーキンソン病または非定型パーキンソニズム（進行性核上性麻痺ＰＳＰ、多系統萎縮症ＭＳＡ、大脳皮質基底核変性症ＣＢＤ）である。

本発明は、更なる実施形態において、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態の治療に使用するボツリヌス神経毒素および薬剤的に許容できる担体を含む医薬組成物に関し、ここで前記ボツリヌス神経毒素は各耳下腺および各顎下腺に注射により投与され、各耳下腺と各顎下腺に投与されるボツリヌス神経毒素の用量の間の比が１．４５対１～１．７対１である。

本発明の一実施形態によれば、ボツリヌス神経毒素は７０Ｕ～１１０Ｕの総用量で耳下腺および顎下腺に投与される。好ましい実施形態では、耳下腺および顎下腺に投与されるボツリヌス神経毒素の総用量は７５Ｕ～１００Ｕである。

本発明の一実施形態によれば、ボツリヌス神経毒素は７５Ｕの総用量で耳下腺および顎下腺に投与される。代替の実施形態では、耳下腺および顎下腺に投与されるボツリヌス神経毒素の総用量は１００Ｕである。

一般に、ボツリヌス神経毒素は、本発明に従って、０．５～２．３５Ｕ／Ｋｇ体重の総用量で耳下腺および顎下腺に投与することができる。特に好ましい実施形態では、ボツリヌス神経毒素は、１～１．２５Ｕ／Ｋｇ体重の総用量で耳下腺および顎下腺に投与される。低体重のためボツリヌス毒素は一般に投与表８に示したように小児に投与される。別の実施形態では、最大２．５Ｕ／ｋｇの総投与量が小児の耳下腺および顎下腺に投与される。

本発明のさらなる態様によれば、ボツリヌス神経毒素は、４５～５５Ｕ／ｍＬの範囲のボツリヌス神経毒素濃度を有する水性組成物で投与される。本発明の好ましい実施形態では、ボツリヌス神経毒素は５０Ｕ／ｍＬのボツリヌス神経毒素濃度を有する水性組成物として投与される。特定の好ましい実施形態では、１００Ｕバイアルの内容物が合計２．０ｍＬの生理食塩水で再構成され、耳下腺および顎下腺に投与される体積が、以下の通りである。
－耳下腺：各側に０．６ｍｌ、
－顎下腺：各側に０．４ｍｌ。
数回の連続治療サイクルが想定される場合、かりに以前の治療サイクルでは口腔乾燥症または嚥下障害が生じる場合は注入量を減らすことができる。このような副作用のさらなる発生を回避するために、注入者の裁量で減量することを勧める。減量したボツリヌス神経毒素の投与が想定される場合、耳下腺および顎下腺に投与される注入量は以下の通りである。
－耳下腺：各側に０．４５ｍｌ、
－顎下腺：各側に０．３ｍｌ。

生物学的活性は一般にマウス単位（Ｕ）で表される。本明細書中で使用される場合、１Ｕは腹腔内注射後に特定のマウス集団の５０％を致死させるボツリヌス神経毒素の神経毒成分の量（すなわちマウスｉ．ｐ．ＬＤ５０）である。ボツリヌス神経毒素の生物学的活性を測定するための別の特に有用な方法は、例えばＷＯ２００９／１１４７４８，ＷＯ２０１３／０４９５０８またはＷＯ２０１４／２０７１０９に開示されているような細胞ベースのアッセイである。そのような細胞ベースのアッセイで得られた活性結果は、マウスｉ．ｐ．ＬＤ５０アッセイで得られた活性値に対応する。市販のインコボツリヌス毒素Ａ（複合タンパク質を含まないボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）、ＭｅｒｚＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＧｍｂＨ）またはオナボツリヌス毒素Ａ（複合タンパク質を含むボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂｏｔｏｘ（登録商標）、ＡｌｌｅｒｇａｎＩｎｃ．）などのボツリヌス血清型Ａ製剤について得られた活性結果は当業者に公知の変換率を用いて他の毒素の値に変換することができる。例えば、アボボツリヌス毒素Ａ（複合タンパク質を含むボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）、ＩｐｓｅｎＢｉｏｐｈａｒｍＬｉｍｉｔｅｄ）の必要な用量は、インコボツリヌス毒素Ａまたはオナボツリヌス毒素Ａの投与量に２．５～５の係数を掛けることによって決定できる。リマボツリヌス毒素Ｂ（ボツリヌス毒素血清型Ｂ、Ｍｙｏｂｌｏｃ（登録商標）、ＳｏｌｓｔｉｃｅＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＵＳＷｏｒｌｄＭｅｄｓＬＬＣ）の投与量は、インコボツリヌス毒素Ａまたはオナボツリヌス毒素Ａの投与量に２０～４０の係数を掛けることによって計算できる。

本発明のさらなる実施形態において、ボツリヌス神経毒素は、注射部位あたり０．３～０．５ｍＬの容量で顎下腺に投与され、注射部位あたり０．５～０．７ｍＬの容量で耳下腺に投与される。本発明の特に好ましい実施形態において、ボツリヌス神経毒素は、注射部位あたり０．４ｍＬの容量で顎下腺に投与され、注射部位あたり０．６ｍＬの容量で耳下腺に投与される。

本発明のさらなる実施形態では、ボツリヌス神経毒素は患者の両側にある各顎下腺の一箇所に注入される。注射は、腺の解剖学的範囲に応じて腺の幾何学的中心に行う。

本発明のさらなる実施形態では、ボツリヌス神経毒素は患者の両側にある各耳下腺の一箇所に注入される。注射は、腺の解剖学的範囲に応じて腺の幾何学的中心に行う。

好ましい実施形態では、総用量のボツリヌス神経毒素が各顎下腺の１箇所および各耳下腺の１箇所に注入される。

本発明の一実施形態は、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態の治療に使用するためのボツリヌス神経毒素に関し、ここで前記ボツリヌス神経毒素は耳下腺および顎下腺に注射により投与され、各耳下腺と各顎下腺に投与される神経毒素の用量の間の比が１．４５対１～１．７対１であり、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態の治療は脳卒中に関連し、そしてボツリヌス神経毒素の総投与量１００Ｕが各顎下腺の１箇所および各耳下腺の１箇所に注入される。

本発明の一実施形態は、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態の治療に使用するためのボツリヌス神経毒素に関し、ここで前記ボツリヌス神経毒素は耳下腺および顎下腺に注射により投与され、各耳下腺と各顎下腺に投与される神経毒素の用量の間の比が１．５～１であり、唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患または状態は脳卒中に関連し、そしてボツリヌス神経毒素の総投与量１００Ｕが各顎下腺の１箇所および各耳下腺の１箇所に、特にそれぞれ腺の幾何学的中心に注入される。

本発明の特定の実施形態では、ボツリヌス神経毒素は超音波ガイドを使用しないで耳下腺および顎下腺に注入される。この場合、腺内の標的部位は、当業者には周知であるように解剖学的ランドマーク方位を用いて決定される。耳下腺は、外耳道の下方かつ前方に位置し、下顎枝の後方かつ側頭骨の乳様突起の前方に位置する。腺は表面的に見たときにおおよそ楔形であり、横断面で見たときにも楔形である。耳下腺は簡単に触診することができる。耳下腺の触知可能なランドマークを見つけるためには、人は下顎前枝と胸鎖乳突筋の間を触診する必要がある。各耳の前方に触診を開始し、頬領域、次に下顎骨角の下方に移動する。解剖学的ランドマークを用いて耳下腺の表面の境界が触診され、ボツリヌス神経毒素が耳下腺の中央に注入される。注射は、腺本体の上半分または下半分に行うことができる。単一の注入地点を選択する必要がある。同じ手順が被験者の反対側にも適用される。顎下腺は、以下の解剖学的構造の隣にある下顎弓の下の口の底の下にある。顎二腹筋の上位にあり、それぞれの顎下腺は顎舌骨筋によって分離された浅葉と深葉に分割されている。浅葉は腺の大部分を構成し、顎舌骨筋がその下を走る。深葉はより小さな部分である。顎下腺は必ずしも容易に触知できるわけではないが、その解剖学的位置は明確に定義されている。注射は、ごくまれにではあるが、排泄管に沿って行われる。顎下腺は、下顎の下の位置に２本の指で腺を固定して注入される。針は、下顎骨に対して７０～９０度の角度で上から前へ口床の方向に挿入されるであろう（Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ２００５，Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ２００５，Ａｎａｔｏｍｙ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＳａｌｉｖａｒｙＧｌａｎｄｓ（唾液腺の解剖学、機能、および評価））。

他の実施形態では、ボツリヌス神経毒素は、超音波ガイドを使用して耳下腺および顎下腺に注入される。当業者は、腺の体内の標的領域のサイズおよび位置を完全に決定するために超音波画像化技術を適用することをよく知っている。例えば、７．５ＭＨｚを超える高周波線形変換器を使用して、腺を識別して視覚化することができる［Ｈｏｗｌｅｔｔ，Ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｕｌｔｒａｓｏｕｎｄａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｈｅｐａｒｏｔｉｄｇｌａｎｄ（２００３）ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＲａｄｉｏｌｏｇｙ７６，２７１－２７７（耳下腺の高解像度超音波評価（２００３）、英国ジャーナル・オブ・ラジオロジー７６、２７１～２７７）］。

一般に、ボツリヌス神経毒素は耳下腺および顎下腺に複数回注入されることが想定されている。特定の実施形態では、本発明によるボツリヌス神経毒素は連続周期治療で投与される。本発明によれば、治療周期は２回のボツリヌス神経毒素投与間の時間間隔であり、すなわち治療周期は１回のボツリヌス神経毒素投与と次のボツリヌス神経毒素が注射によって投与されるまでの追跡期間からなる。ボツリヌス神経毒素は、好ましくは少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回または少なくとも８回の治療サイクルで投与される。一実施形態では、ボツリヌス神経毒素は２～６回の治療周期、特に４回の治療周期で投与される。

耳下腺および顎下腺へのボツリヌス神経毒素の２回連続投与の間の時間間隔は、１０～２０週または１２～２０週の間で変わり得る。別の実施形態では、耳下腺および顎下腺へのボツリヌス神経毒素の２回連続投与の間の時間間隔は、６～１０週間の間で変わり得る。好ましい実施形態では、耳下腺および顎下腺へのボツリヌス神経毒素の２回の連続投与の間の時間間隔は、１２～１８週間、または１４～１８週間で変わる。最も好ましい実施形態では、時間間隔は１５、１６または１７週、特に１６週である。

本発明の一実施形態では、耳下腺および顎下腺へのボツリヌス神経毒素のすべての連続投与の間の時間間隔は同じままである。

本発明の一実施形態において、ボツリヌス神経毒素は、少なくとも４回連続の治療周期で耳下腺および顎下腺に注入され、ボツリヌス神経毒素の連続投与間の時間間隔は１６週間である。

一般に、当業者に公知の唾液腺炎または唾液分泌亢進に関連する疾患又は状態の治療のためのボツリヌス毒素の有効性を決定するためのいくつかの方法がある。唾液腺炎の治療もしくは唾液分泌亢進と関連する疾患または状態の治療のためのボツリヌス毒素の有効性を決定するための測定値および尺度は、例えば、非刺激唾液流量（ｕＳＦＲ）、変化スケールの平均全体的印象（ＧＩＣＳ）、ドローリング重症度および頻度スケール（ＤＳＦＳ）、パーキンソン病の修正ＲａｄｂｏｕｄＯｒａｌＭｏｔｏｒＩｎｖｅｎｔｏｒｙ（ｍＲＯＭＰ）、修正教師のドローリングスケール（ｍＴＤＳ）、ドローリング衝撃スケール（ＤＩＳ）、ドローリング指数（ＤＱ）、ドローリング評価スケール（ＤＲＳ）および／またはＵＰＤＲＳドローリングスケールの決定から選択することができる。

特定の実施形態では、唾液腺炎の治療もしくは唾液分泌亢進と関連する疾患または状態の治療のためのボツリヌス毒素の有効性を決定するために、これらの測定値および尺度の少なくとも２つを組み合わせることができる。

本発明の一実施形態では、、唾液腺炎の治療もしくは唾液分泌亢進と関連する疾患または状態の治療のためのボツリヌス毒素は、ベースライン唾液産生、すなわち非刺激唾液流量（ｕＳＦＲ）が０．１～１．６ｇ／分の患者に使用される。好ましい実施形態では、唾液腺炎の治療もしくは唾液分泌亢進と関連する疾患または状態の治療のためのボツリヌス毒素は、ベースライン唾液産生、すなわち非刺激唾液流量（ｕＳＦＲ）が０．３ｇ／分を超える患者に使用される。別の実施形態では、唾液腺炎の治療もしくは唾液分泌亢進と関連する疾患または状態の治療のためのボツリヌス毒素は、ベースラインでドローリング重症度および頻度スケール（ＤＳＦＳ）合計スコア≧６、重症度サブスコア≧２および頻度サブスコア≧２をもつ患者に使用される。一般に、ｕＳＦＲおよびＤＳＦＳスコアの決定は当業者に周知である。本発明によれば、ｕＳＦＲは、４つの収集用の吸収性綿棒を用いて５分間収集した唾液の重量によって決定される。唾液の収集は、口腔に吸着材料（例えば、４本のデンタルロール、Ｓａｌｉｖｅｔｔｅ（登録商標）またはＳａｌｉｍｅｔｒｉｃｓＯｒａｌＳｗａｂｓ（登録商標））を５分間入れることによって行われる。吸着材料は閉じられた口腔から唾液を吸着し、収集した唾液量よる吸着材料の増加量は、口腔内に入れる前と後の吸着材料の重さを測定することにより決定される。３０分の休止後に５分間の唾液生成量の収集および測定を繰り返すことにより、第２の値が得られる。両方の平均値が測定結果の信頼性を保証する（測定値の個体内変動を減少による）（ＪｏｎｇｅｒｉｕｓＰＨ，ｖａｎＬｉｍｂｅｅｋＪ，ＲｏｔｔｅｖｅｅｌＪＪ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｓａｌｉｖａｒｙｆｌｏｗｒａｔｅ（唾液流量の評価）：ｂｉｏｌｏｇｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎａｎｄｍｅａｓｕｒｅｅｒｒｏｒ（生物学的変化と測定誤差）．Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．２００４；１１４（１０）：１８０１－４）。

本発明のさらなる実施形態では、１００Ｕのボツリヌス神経毒素の投与は、投与後４週間以内にベースラインと比較してｕＳＦＲを少なくとも２５％減少させる。好ましい実施形態では、１００Ｕボツリヌス神経毒素の投与は、注射後４週間以内にベースラインと比較してｕＳＦＲを少なくとも３０％（中央値）減少させる。本発明の別の実施形態では、１００Ｕのボツリヌス神経毒素の投与は、投与後８週間以内にベースラインと比較してｕＳＦＲを少なくとも２２％（中央値）減少させる。好ましい実施形態では、１００Ｕボツリヌス神経毒素の投与は、注射後８週間以内にベースラインと比較してｕＳＦＲを少なくとも２８％（中央値）減少させる。

本発明のさらなる実施形態において、１００Ｕのボツリヌス神経毒素の投与は、投与後４週間以内に患者によって評価された変化スケールの全体的印象（ＧＩＣＳ）スコアをベースラインのドローリングと比較して７ポイントのリッカート様尺度で少なくとも＋０．９０スコアポイント改善する。好ましい実施形態では、１００Ｕのボツリヌス神経毒素の投与は、注射後４週間以内にベースラインのドローリングと比較して少なくとも＋１．００スコアポイントの変化スケールの全体的印象（ＧＩＣＳ）の改善を示す。本発明の別の実施形態では、１００Ｕのボツリヌス神経毒素の投与は、投与後８週間以内にベースラインのドローリングと比較して、変化スケールの全体的印象（ＧＩＣＳ）によって測定されたドローリングを少なくとも＋１．００スコアポイント改善する。好ましい実施形態では、１００Ｕのボツリヌス神経毒素の投与は、注射後１２週間以内にベースラインと比較して、変化スケールの全体的印象（ＧＩＣＳ）によって測定されたドローリングを少なくとも＋０．９０のスコアポイントを改善する。変化スケールの全体的印象（ＧＩＣＳ）は、「唾液腺への最後の注射の直前と比較して、治療結果として現在どのように機能しているかの全体的印象はどうですか？」という質問に対して「－３の非常に悪い」から「＋３の非常に改善した」までの範囲の尺度で答えるリッカート様尺度を用いて決定される（Ｌｉｋｅｒｔ，Ｒｅｎｓｉｓ（１９３２）．”ＡＴｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｔｈｅＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＡｔｔｉｔｕｄｅｓ”．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＰｓｙｃｈｏｌｏｇｙ．１４０：１－５５））。

本発明のさらなる実施形態では、１００Ｕのボツリヌス神経毒素の投与は、投与後４週間以内にベースラインと比較して平均ドローリング重症度および頻度スケール（ＤＳＦＳ）合計スコアを少なくとも０．９０スコアポイント減少させる。好ましい実施形態では、１００Ｕのボツリヌス神経毒素を投与は、注射後４週間以内にベースラインと比較して平均ドローリング重症度および頻度スケール（ＤＳＦＳ）合計スコアが少なくとも１．２０スコアポイント減少させる。本発明の別の実施形態では、１００Ｕのボツリヌス神経毒素の投与は、投与後８週間以内にベースラインと比較して平均ドローリング重症度および頻度スケール（ＤＳＦＳ）合計スコアを少なくとも１．５０スコアポイント減少させる。ドローリング重症度および頻度スケール（ＤＳＦＳ）は２つのサブスケール、「ドローリング頻度」の４ポイントのリッカート尺度、および「ドローリング重症度」の５ポイントのリッカート尺度を用いて決定される。ＤＳＦＳは、２つのサブスケールの合計スコアである。評価は、「この１週間」の時間周期を指す。最高予想スコアは９である（Ｔｈｏｍａｓ－ＳｔｏｎｅｌｌＮ，ＧｒｅｅｎｂｅｒｇＪ．Ｔｈｒｅｅｔｒｅａｔｍｅｎｔａｐｐｒｏａｃｈｅｓａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｒｏｏｌｉｎｇ．３つの治療法および流涎の軽減での臨床的要因。Ｄｙｓｐｈａｇｉａ．１９８８；３（２）：７３－８．）。

流涎の重症度
１乾燥（流涎なし）
２軽度（唇がぬれる）
３中度（唇と下顎がぬれる）
４重度（流涎が衣類をぬらすまで拡大）
５重篤（手、受け皿および物体がぬれる）

流涎の頻度
１なし
２時折（毎日ではない）
３頻繁（日常の一部）
４常時

本発明のさらなる実施形態において、１００Ｕのボツリヌス神経毒素の投与は、投与後４週間以内にベースラインと比較してパーキンソン病の平均修正ＲａｄｂｏｕｄＯｒａｌＭｏｔｏｒＩｎｖｅｎｔｏｒｙ（ｍＲＯＭＰ）の唾液制御領域合計スコアを少なくとも３．５０スコアポイント減少させる。好ましい実施形態では、１００Ｕのボツリヌス神経毒素の投与は、注射後４週間以内に、ベースラインと比較してパーキンソン病の平均修正ＲａｄｂｏｕｄＯｒａｌＭｏｔｏｒＩｎｖｅｎｔｏｒｙ（ｍＲＯＭＰ）の唾液制御領域合計スコアを少なくとも４．６０スコアポイント減少させる。本発明の別の実施形態では、１００Ｕのボツリヌス神経毒素の投与は、投与後８週間以内にベースラインと比較してパーキンソン病の修正ＲａｄｂｏｕｄＯｒａｌＭｏｔｏｒＩｎｖｅｎｔｏｒｙ（ｍＲＯＭＰ）の唾液制御領域合計スコアを少なくとも５．５ポイント減少させる。好ましい実施形態では、１００Ｕのボツリヌス神経毒素の投与は、注射後８週間以内にベースラインと比較してパーキンソン病の修正ＲａｄｂｏｕｄＯｒａｌＭｏｔｏｒＩｎｖｅｎｔｏｒｙ（ｍＲＯＭＰ）の唾液制御領域合計スコアを少なくとも６．５０スコアポイント減少させる。パーキンソン病の修正ＲａｄｂｏｕｄＯｒａｌＭｏｔｏｒＩｎｖｅｎｔｏｒｙ（ｍＲＯＭＰ）は、スピーチ、嚥下および唾液制御領域における５ポイントのリッカート尺度のオランダ２３項目アンケートであるオリジナルＲＯＭＰインベントリ［Ｋａｌｆ２０１１，Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｈａｂｉｌ．］によって決定される。ＲＯＭＰは、米国英語への言語的適応期間で患者へのインタビューから生じる表現の小さな変更を実装するように修正（ｍＲＯＭＰ）された。ｍＲＯＭＰは現在、明確に区別できる応答選択と回収期間が最近７日間の２４項目を有する。

本発明の一態様では、ボツリヌス神経毒素はボツリヌス神経毒素複合体である。例えば４５０ｋＤａまたは９００ｋＤａとの複合体はボツリヌス菌の培養物から入手可能である。本発明によるボツリヌス菌神経毒複合体は、神経毒成分と非毒性タンパク質とを含む。付属タンパク質は神経毒成分を包埋し、それによって毒性効果に何も加えずに消化管内の消化酵素による分解から神経毒成分が保護される。

本発明の別の態様では、ボツリヌス神経毒素はボツリヌス神経毒素複合体の神経毒成分である。一般に神経毒成分は１５０ｋＤａの分子量を有する。神経毒成分は、ボツリヌス菌神経毒複合体の他のいかなるタンパク質成分も含まない。

本発明によるボツリヌス神経毒素は血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）、ボツリヌス神経毒素血清型Ｂ（ＢｏＮＴ／Ｂ）、ボツリヌス神経毒素血清型Ｃ１（ＢｏＮＴ／Ｃ１）、ボツリヌス神経毒素血清型Ｄ（ＢｏＮＴ／Ｄ）、ボツリヌス神経毒素血清型Ｅ（ＢｏＮＴ／Ｅ）、ボツリヌス神経毒素血清型Ｆ（ＢｏＮＴ／Ｆ）またはボツリヌス神経毒素血清型Ｇ（ＢｏＮＴ／Ｇ）を含む異なる血清型の群から選択される。ボツリヌス神経毒素、特にその軽鎖および重鎖は上記のボツリヌス神経毒素の抗原的に異なる血清型の１つから誘導することができる。一態様では、前記ボツリヌス神経毒素の軽鎖および重鎖は、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、またはＢｏＮＴ／Ｇからなる群から選択されるボツリヌス神経毒素の軽鎖および重鎖である。別の態様において、本発明の前記ボツリヌス神経毒素をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１（ＢｏＮＴ／Ａ）、配列番号３（ＢｏＮＴ／Ｂ）、配列番号５（ＢｏＮＴ／Ｃ１）、配列番号７（ＢｏＮＴ／Ｄ）、配列番号９（ＢｏＮＴ／Ｅ）、配列番号１１（ＢｏＮＴ／Ｆ）、または配列番号１３（ＢｏＮＴ／Ｇ）で示される核酸配列を含む。さらに、一態様では、配列番号２（ＢｏＮＴ／Ａ）、配列番号４（ＢｏＮＴ／Ｂ）、配列番号６（ＢｏＮＴ／Ｃ１）、配列番号８（ＢｏＮＴ／Ｄ）、配列番号１０（ＢｏＮＴ／Ｅ）、配列番号１２（ＢｏＮＴ／Ｆ）、または配列番号１４（ＢｏＮＴ／Ｇ）のいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが包含される。さらに、本発明の手段および方法の一態様において、配列番号２（ＢｏＮＴ／Ａ）、配列番号４（ＢｏＮＴ／Ｂ）、配列番号６（ＢｏＮＴ／Ｃ１）、配列番号８（ＢｏＮＴ／Ｄ）、配列番号１０（ＢｏＮＴ／Ｅ）、配列番号１２（ＢｏＮＴ／Ｆ）、および配列番号１４（ＢｏＮＴ／Ｇ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるボツリヌス神経毒素が包含される。

別の態様では、本発明のボツリヌス神経毒素をコードする前記ポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失、および／または付加を含む前述のポリヌクレオチドの変異体であり、これが、さらに別の態様では、１つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加をもつポリヌクレオチドをもたらし得る。さらに、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、別の態様において、配列番号１、３、５、７、９、１１または１３のいずれか１つに示される核酸配列と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列変異体、もしくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列変異体を含む。本明細書で使用される「同一の」という用語は、２つの核酸配列間または２つのアミノ酸配列間の同一アミノ酸の数を決定することによって特徴付けられる配列同一性を指し、ここで配列は最高次一致が得られるように整列される。同一性は、例えばＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムに体系化されている公開された技術または方法を使用して計算することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ１９９０，ＪＭｏｌＢｉｏｌ２１５，４０３）。同一性パーセント値は、一態様においては、アミノ酸配列全体にわたって計算される。種々のアルゴリズムに基づく一連のプログラムは、異なる配列を比較するために当業者に利用可能である。この文脈では、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈまたはＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムが特に信頼できる結果をもたらす。配列アラインメントを実施するために、ＧＣＧソフトウェアパケット（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ１９９１，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，米国ウィスコンシン州マディソン、米国５３７１１）の一部であるプログラムＰｉｌｅＵｐ（Ｈｉｇｇｉｎｓ１９８９、ＣＡＢＩＯＳ５、１５１）またはプログラムＧａｐａｎｄＢｅｓｔＦｉｔ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ１９７０、ＪＭｏｌＢｉｏｌ４８；４４３；Ｓｍｉｔｈ１９８１、ＡｄｖＡｐｐｌＭａｔｈ２、４８２）を使用し得る。本発明の別の態様において、パーセント（％）で上述した配列同一性値は、以下の設定で全配列領域にわたってプログラムＧＡＰを使用して決定される：ギャップ重み：５０、長さ重み：３、平均一致：１０．０００および平均不一致：０．０００、特に指定のない限り、これは常に配列アライメントの標準設定として使用される。一態様において、前述の各変異型ポリヌクレオチドは、それぞれのボツリヌス神経毒素、すなわちＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／ＦまたはＢｏＮＴ／Ｇの生物学的特性の１つ以上、および別の態様においてはすべてを保持するポリペプチドをコードする。未処理の前駆体がいくつかの生物学的機能を発揮するかまたは部分的に活性であり得ると考えられるとしても、完全な生物学的活性はタンパク質分解活性化後にのみ維持されることを当業者は理解するであろう。本明細書で使用される「生物学的特性」は、（ａ）受容体結合、（ｂ）内在化、（ｃ）エンドソーム膜横断移動、および／または（ｄ）シナプス小胞膜融合に関与するタンパク質の細胞内タンパク質分解切断を指す。生物学的活性を評価するためのインビボアッセイには、Ｐｅａｒｃｅｅｔａｌ．（Ｐｅａｒｃｅ１９９４，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２８：６９－７７）、Ｄｒｅｓｓｌｅｒｅｔａｌ．（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ２００５，Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．２０：１６１７－１６１９，Ｋｅｌｌｅｒ２００６，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１３９：６２９－６３７）に記載されているマウスＬＤ５０アッセイおよびエクスビボマウス片側横隔膜アッセイ、またはＷＯ２００９／１１４７４８，ＷＯ２０１４／２０７１０９もしくはＷＯ２０１３／０４９５０８に記載されている細胞ベースのアッセイが含まれる。生物学的活性は一般にマウス単位（Ｕ）で表される。本明細書で使用される場合、１Ｕは腹腔内注射後に特定のマウス集団の５０％を致死させるボツリヌス神経毒素の神経毒成分の量、すなわちマウスｉ．ｐ．ＬＤ５０である。さらなる態様では、変異体ポリヌクレオチドは、例えば、酵素認識が改善される切断部位を含んだり、あるいは受容体結合または上述で特定した他の任意の特性を改善し得るなどの生物学的特性が改善または変更されたボツリヌス神経毒素をコードすることができる。ボツリヌス神経毒素の生物学的活性を測定するための特に有用な方法は、例えばＷＯ２００９／１１４７４８、ＷＯ２０１３／０４９５０８またはＷＯ２０１４／２０７１０９に開示されているような細胞ベースのアッセイである。

理論に縛られることなく、特に、複合体形成タンパク質を含まないボツリヌス神経毒素、すなわちボツリヌス神経毒素の神経毒成分がボツリヌス菌神経毒複合体の他のいかなるタンパク質成分も含まない製剤（インコボツリヌス毒素ＡＸｅｏｍｉｎ（登録商標））は、複合体形成タンパク質を含有する他のボツリヌス神経毒素（オナボツリヌス毒素Ａ、ボトックス（登録商標）、アボボトリヌス毒素Ａ、，Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）、リマボツリヌス毒素Ｂ、Ｍｙｏｂｌｏｃ（登録商標）、もしくは他の複合体形成タンパク質含有物）と比較して、唾液腺と唾液管の細胞内構造を破壊することなく、コリン作動性神経伝達の臨床的に可逆的、機能的不活性化を可能にすることが想定されている。ボツリヌス菌神経毒素複合体のタンパク質成分を一切含まないボツリヌス神経毒素の神経毒成分の使用は、ボツリヌス毒素注入後に切除した子供の顎下唾液腺で記述されているように、腺房細胞に物理的損傷を誘発しない［Ｍｏｓｓｅｒｉ２０１６，Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ－ＨｅａｄａｎｄＮｅｃｋＳｕｒｇｅｒｙ耳鼻咽喉学－頭頸部手術］。

一般に、ボツリヌス神経毒素による神経終末の遮断は不可逆的であるが、新しい神経終末が芽生えて新しいつながりを生むため臨床効果は一時的である。複合タンパク質は、治療用の生物学的不活性化合物と見なされており、一般に痙縮、ジストニア、多汗症、頭痛、鬱病、排尿筋痙攣の治療用の筋肉内注射もしくは眉間のしわの線やしわ等の美容適応に使用されるボツリヌス神経毒素の有効性に影響を及ぼさないと考えられている。

複合タンパク質は、ボツリヌス菌に由来するクロストリジウムタンパク質の名残である。これらのタンパク質はボツリヌス神経毒素タンパク質複合体の神経毒成分と一緒に産生され、それらは攻撃的な環境（例えば胃の酸性条件）における毒素の保護において基本的な役割を果たし、そしてそれらは腸の上皮バリアを通して毒素の内部移行を助ける。複合体形成タンパク質は、血球凝集素および非血球凝集素からなり、ボツリヌス毒素タンパク質複合体の非毒性タンパク質と見なされる。血球凝集素（ＨＡ）は、Ｅ－カドヘリンを直接結合することによって腸の上皮細胞間バリアを破壊することが記載されている［Ｆｕｊｉｎａｇａ２００９，Ｔｏｘｉｃｏｎ［Ｓｕｇａｗａｒａｅｔａｌ２０１０Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，［Ｌｅｅ２０１４，Ｓｃｉｅｎｃｅ］。唾液腺分泌上皮において、挿入された管上皮および横紋管上皮は、腸上皮と同様の外胚葉生殖系列から発生する。唾液腺の密着結合に特に興味深いのは、唾液腺の発達、組織の組織化、および細胞の分化に役割を果たすカドヘリンファミリーのメンバーである。上皮（Ｅ）－カドヘリンは、上皮組織における主要な細胞間接着分子であり、上皮表現型の最上の形成体と見なされている［Ｄａｖｉｅｓ２００６，ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＣｅｌｌ］。初期の形態形成では、Ｅ－カドヘリンとβ－カテニンは唾液腺リモデリングに関与している可能性が高いが、細胞分化の間、それらは安定した細胞間接触を形成し、唾液細胞極性の確立と維持においてＲｈｏＧＴＰアーゼと協力し得る［Ｂａｋｅｒ２０１０，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］。Ｅ-カドヘリンのような独特の細胞間構造は、腸および唾液腺においても上皮細胞の分極で基本的な役割を果たす。したがって、Ｅ－カドヘリンとボツリヌス毒素の複合体形成タンパク質との干渉は、唾液腺の通常の生物学的活性を妨害する。例えば、ＸｕおよびＳｈａｎは、ＢｏＮＴ／ＡＰｒｏｓｉｇｎｅ（登録商標）Ｈｅｎｇｌｉ（登録商標）（中国、甘粛省、ＬａｎｚｈｏｕＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）のラット顎下腺への投与後（すなわち、複合体形成タンパク質をもつボツリヌス神経毒素）、腺細胞膜上のアクアポリン（ＡＱＰ５）がダウンレギュレートされるが、これは除神経の二次的影響とすることができることを示した（Ｘｕらの歯科研究の２０１５ジャーナル、シャンら２０１３口腔科学の国際ジャーナル）。

ボツリヌス神経毒素を含む医薬製剤を調製するために、神経毒は、当技術分野で公知の所望の用途目的に応じて種々の技術によって処方することができる。例えば、（生物学的に活性な）ボツリヌス神経毒素は、医薬組成物として１つ以上の薬剤的に許容できる担体と組み合わせて使用することができる。薬剤的に許容できる担体（複数）は、他の製剤成分と相溶性であり、そしてそのレシピエントに有害ではないという意味で許容されなければならない。使用される医薬担体は、固体、ゲル、または液体を含み得る。固体担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液体担体の例は、グリセロール、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン、様々な種類の湿潤剤などである。適切な担体は、上記のものおよび当技術分野で周知の他のものを含み、例えばペンシルベニア州イーストンのマックパブリッシングカンパニーのレミントンの薬学を参照されたい。一態様では、医薬組成物は、投与前に希釈剤に溶解することができる。希釈剤もボツリヌス神経毒生成物の生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は蒸留水または生理食塩水である。さらに、医薬組成物または製剤はまた、他の担体または非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤などを含み得る。したがって、製剤化ボツリヌス神経毒生成物は、一態様では液体または凍結乾燥形態で存在することができる。一態様では、それは、グリセロール、タンパク質安定剤（ＨＳＡ）、またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒアルロン酸または遊離アミノ酸などの非タンパク質安定剤と一緒に存在することができる。一態様では、適切な非タンパク質安定剤は、ＷＯ２００５／００７１８５またはＷＯ２００６／０２０２０８に開示されている。本発明によるボツリヌス神経毒素を含むＨＳＡ安定化製剤に適した製剤は、例えば、米国特許第８，３９８，９９８号明細書に開示されている。製剤化されたボツリヌス神経毒生成物は、治療上有効な用量で様々な疾患または障害のヒトまたは動物の治療に、あるいは美容目的に使用することができる。

一般手順：臨床試験は、４回の連続注射の後にそれぞれ１６週間の観察期間が続く、すなわち４回の連続治療サイクルで行った。各治療サイクルの終わりに、次サイクルに入るための適格性について被験者を調べた。最初の治療サイクル（主期間［ＭＰ］）は、プラセボと比較して、ＮＴ２０１（すなわち、複合体形成タンパク質を含まないボツリヌス毒素血清型Ａ、インコボツリヌス毒素Ａ）の２つの異なる用量レベル（７５Ｕおよび１００Ｕ）で行われた。被験者は、２：２：１（７５Ｕ：１００Ｕ：プラセボ）の比でそれぞれの治療にランダム化した。インコボツリヌス毒素Ａを５０Ｕ／ｍＬの濃度に生理食塩水中で再構成し、１００Ｕ用量群は患者に各耳下腺に３０Ｕの毒素を、そして各顎下腺に２０Ｕの毒素を投与し、７５Ｕ用量群は患者に各耳下腺に２２．５Ｕの毒素を、そして各顎下腺に１５Ｕの毒素をそれぞれ投与した。両方の用量群において、それぞれの耳下腺および顎下腺に割り当てられた総用量をそれぞれの腺の１つの部位に注入した。ＭＰの後に３回の連続治療サイクルの投与量盲検下の延長期間が続き、ここでは被験者がＭＰと同じ方法で７５Ｕまたは１００ＵＮＴ２０１のいずれかの投与を受けた。ＭＰ中にプラセボを受けた被験者は、１：１にランダム化して延長期間に７５Ｕまたは１００ＵＮＴ２０１の投与を受けたので、全体の投与量ランダム化比は１：１であった。試験のＭＰ結果は、７５Ｕおよび１００Ｕ投与量は共に臨床的関連性の治療効果に達することを示している。それらを以下に要約する。

実施例１：プラセボ対照主期間（ｕＳＦＲ）の結果
全体として、慢性の厄介な唾液腺炎を有する１８４人の被験者を試験のＭＰ中に治療した。この試験は、２つの共一次有効性評価項目を有した。共一次有効性評価項目の１つは４週目のベースラインからの非刺激唾液流量（ｕＳＦＲ）の変化であった（経時的平均変化は表１を参照）。すべての時点で、ｕＳＦＲは両方のＮＴ２０１処置群で有意に減少し、その効果は図１に示すようにＮＴ２０１１００Ｕ用量群でより顕著であった。４週目では、プラセボを上回る統計的に有意な優位性がＮＴ２０１１００Ｕ群で示された（ｐ＝０．００４）。ＮＴ２０１７５Ｕの平均ｕＳＦＲ値（表１）は、８週目および１２週目に０．０５未満のｐ値に達した（ｐ値：それぞれ０．０２２と０．０１９）。ＮＴ２０１１００ＵおよびＮＴ２０１７５Ｕの両群で観察された治療効果は臨床的関連性と見なすことができる。

実施例２：プラセボ対照主期間（ＧＩＣＳ）の結果
他の共一次有効性評価項目は、４週目に変化スケールの全体的印象（ＧＩＣＳ）により測定された被験者の全体的機能的スケールの改善であった。ＧＩＣＳは７ポイントのリッカート尺度で、「唾液腺への最後の注射の直前と比較して、治療結果として現在どのように機能しているかの全体的印象はどうですか？」の質問に被験者が答えることで完結し、どちらの用量群も改善に達した。プラセボを上回る１００Ｕ処置群が有利な統計的有意差は４週目で見られた（ｐ＝０．００２、表２、図２）。７５Ｕ群は４週目にプラセボと比較して数値的に良好な結果を示したが、その差は統計的有意差を間もなく失った（ｐ＝０．０５５）。それにもかかわらず、図２に提示したように０．０５未満のｐ値は、両群では８週目と１２週目、１００Ｕの用量群で１６週目に達した。

実施例３：プラセボ対照主期間（ＧＩＣＳ）の結果
流涎に関して臨床的に有意な改善と考えられているＧＩＣＳ評価項目の前定義効果基準はスルールで少なくとも１点の改善（最小改善）であった。全ての処置群についてのレスポンダー解析の結果を表３および図３に示す。

プラセボ群の奏効率は、主期間を通じて、両ＮＴ２０１処置群の奏効率より低かった。奏効率は２８．６％（８週目）から２週目の４８．６％まで変化した。２つのＮＴ２０１群において、最大の被験者のＧＩＣＳ奏効率は、８週目にＮＴ２０１７５Ｕ群で６８．１％およびＮＴ２０１１００Ｕ群で７６．４％に達した。本発明者らは、これらの奏効率をＮＴ２０１７５Ｕおよび１００Ｕ用量群の両方の臨床的に有意な証拠と考える。

実施例４：プラセボ対照主期間（ＤＳＦＳ）の結果
主観的評価項目のドローリング重症度および頻度スケール（ＤＳＦＳ）も評価した。ＤＳＦＳは、２つのサブスケール、すなわちドローリング頻度の４ポイントのリッカート尺度および流唾重症度の５ポイントのリッカート尺度からなる。ＤＳＦＳの記述統計は、プラセボ群では臨床的に関連した改善が見られなかったのに対し、両ＮＴ２０１処置群では関連した唾液腺炎症の改善を示した。表４および図４に示したように、ベースラインからの経時の平均合計スコア変化は８週目に１００Ｕ処置群で－１．８９の最大改善、次が１２週目に７５Ｕ処置群で－１．７６の改善が続いた。混合モデル反復測度解析（ＭＭＲＭ）による治療比較から、４、８、および１２週目でプラセボと比較したときに両ＮＴ２０１群の０．０５未満のｐ値が明らかである。

実施例５：プラセボ対照主期間（ｍＲＯＭＰ）の結果
最後に、パーキンソン病の修正ＲａｄｂｏｕｄＯｒａｌＭｏｔｏｒＩｎｖｅｎｔｏｒｙ（ｍＲＯＭＰ）は、５ポイントのリッカート尺度の９項目の質問表を含むドローリングサブスケールを用いて評価した。両方のＮＴ２０１処置群は、表５および図５に示したプラセボ群と比較して、ｍＲＯＭＰドローリングで優れた有効性を示した。ベースラインからの経時的平均変化は、８週目に１００Ｕ処置群で－６．５８、１２週目に７５Ｕ処置群で－６．７７の最大改善に達する。本発明者らは、両方の用量群で見られた治療効果はプラセボの効果より優れており、ＮＴ２０１効果は全ての測定間で一貫し、また観察全体で安定し、両用量の適切な臨床的関連性が確認されると結論した。

実施例６：プラセボ対照主期間（ｍＲＯＭＰ）の結果のサブグループ解析
病因によるサブグループ解析は、ＮＴ２０１１００Ｕ群における脳卒中後の唾液腺炎を有する被験者がパーキンソン病または非定型パーキンソニズムに関連する唾液腺炎を有する被験者よりｕＳＦＲの平均減少がより大きいことを示した（表６）。

実施例７：１６週間の間隔による３回の連続治療サイクルにおける効力
１６週間の間隔による３回の連続治療サイクルにおける有効性は、さらに唾液腺炎改善の証拠を提供した。２回目の注射後の全観察時間点についての試験ベースラインからのｕＳＦＲ変化、および各注射（１回目の注射後１６、３２および４８週）からそれぞれの評価時点（１回目の注射後２０、３６および５２週）までの変化、ならびに各サイクルにおけるサイクルの終了／試験の終了訪問（１回目の注射後３２、４８および６４週）までの変化も評価した。

プラセボ対照群以外の延長期間（ＥＰ）のサイクルベースラインにおけるｕＳＦＲの要約統計量を表７に示す。（ＭＰでプラセボ群に無作為化した被験者は、ＥＰではランダム化比が１：１で７５Ｕまたは１００Ｕ用量群に同じ設定内でランダム化した。ＭＰでの７５Ｕまたは１００Ｕ用量群の被験者をＥＰでもそれらの用量で維持した。）両方のＮＴ２０１処置群におけるＥＰでの平均ｕＳＦＲは、サイクル２のベースラインが最も高く、サイクル４のベースラインが最も低かった。さらに、各サイクルベースラインでの平均ｕＳＦＲは、ＮＴ２０１７５Ｕ群がＮＴ２０１１００Ｕ群よりもわずかに高かった。ＧＩＣＳ、ＤＳＦＳ、およびｍＲＯＭＰを延長期間にわたりＮＴ２０１１００ＵおよびＮＴ２０１７５Ｕを解析したときに、同様の唾液腺炎症の改善が観察された。

Claims

ボツリヌス神経毒素を含有する唾液腺炎または唾液分泌亢進の治療剤であって、前記治療剤は耳下腺および顎下腺に注射により投与され、ここで各耳下腺と各顎下腺に投与される前記ボツリヌス神経毒素の用量の間の比が１．４５対１～１．７対１であり、前記治療剤は、前記ボツリヌス神経毒素を４５～５５Ｕ／ｍＬの濃度で含む水性組成物の形態にあり、少なくとも２回の連続治療サイクルで投与され、かつ、２回の連続投与の間の時間間隔は１０週～２０週であり、投与されるボツリヌス神経毒素の総用量は、０．５～２．３５Ｕ／Ｋｇ体重であり、前記ボツリヌス神経毒素は、複合体形成タンパク質を含まないボツリヌス毒素血清型Ａである、治療剤。
耳下腺及び顎下腺に投与されるボツリヌス神経毒素の総用量が７０Ｕ～１１０Ｕである、請求項１記載の治療剤。
前記治療剤は、顎下腺の１箇所当り０．３ｍＬ～０．５ｍＬ投与され、耳下腺の１箇所当り０．５ｍＬ～０．７ｍＬ投与される、請求項１又は２記載の治療剤。
各顎下腺の１箇所および／または各耳下腺の１箇所に注入される、請求項１～３のいずれか１項に記載の治療剤。
超音波ガイダンスを使用してまたは超音波ガイダンスを使用せずに耳下腺および顎下腺に注入される、請求項１～４のいずれか一項に記載の治療剤。
少なくとも２回、または少なくとも３回、または少なくとも４回の治療サイクルで耳下腺および顎下腺に投与される、請求項１～５のいずれかに一項に記載の治療剤。
耳下腺及び顎下腺にボツリヌス神経毒素を投与する、２つの連続する治療サイクル間の時間間隔が１２～２０週間、１４～１８週間、１５週間、１６週間又は１７週間である、請求項６記載の治療剤。
前記唾液腺炎または唾液分泌亢進が、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳性麻痺、脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、クロザピン誘発性過唾液分泌、レット症候群、アンジェルマン症候群、てんかん性脳症および脳腫瘍、咽頭喉頭全摘術、喉頭亜全摘出術および声門上喉頭切除術、認知症もしくは知的障害により引き起こされる、請求項１～７のいずれかに一項に記載の治療剤。
前記唾液腺炎または唾液分泌亢進が脳卒中により引き起こされる、請求項８に記載の治療剤。
ボツリヌス神経毒素及び薬剤的に許容できる担体を含有する唾液腺炎または唾液分泌亢進の治療用の医薬組成物であって、該医薬組成物は耳下腺および顎下腺に注射により投与され、ここで各耳下腺と各顎下腺に投与される前記ボツリヌス神経毒素の用量の間の比が１．４５対１～１．７対１であり、前記医薬組成物は、前記ボツリヌス神経毒素を４５～５５Ｕ／ｍＬの濃度で含む水性組成物の形態にあり、少なくとも２回の連続治療サイクルで投与され、かつ、２回の連続投与の間の時間間隔は１０週～２０週であり、投与されるボツリヌス神経毒素の総用量は、０．５～２．３５Ｕ／Ｋｇ体重であり、前記ボツリヌス神経毒素は、複合体形成タンパク質を含まないボツリヌス毒素血清型Ａである、医薬組成物。