JP7493452B2 - オリゴヌクレオチド及び核酸の合成 - Google Patents

オリゴヌクレオチド及び核酸の合成 Download PDF

Info

Publication number
JP7493452B2
JP7493452B2 JP2020539253A JP2020539253A JP7493452B2 JP 7493452 B2 JP7493452 B2 JP 7493452B2 JP 2020539253 A JP2020539253 A JP 2020539253A JP 2020539253 A JP2020539253 A JP 2020539253A JP 7493452 B2 JP7493452 B2 JP 7493452B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
phosphoramidite
nucleoside
nucleotide
protecting group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020539253A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2019145713A5 (ja
JP2021510716A (ja
Inventor
スチュアート クロスビー
マシュー ジェニソン
ジョセフ ブレナン
イアン バーロウ
パスカル ラング
マシュー ヘイズ
キャサリン フィッツパトリック
ダニエル バイグレイブ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonetix Ltd
Original Assignee
Evonetix Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evonetix Ltd filed Critical Evonetix Ltd
Publication of JP2021510716A publication Critical patent/JP2021510716A/ja
Publication of JPWO2019145713A5 publication Critical patent/JPWO2019145713A5/ja
Priority to JP2023198864A priority Critical patent/JP2024023388A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7493452B2 publication Critical patent/JP7493452B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/073—Pyrimidine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H23/00—Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

本発明は、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを合成するための方法に関する。特に、本発明は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、並びにＤＮＡ及びＸＮＡ等の二本鎖ポリヌクレオチドを合成する方法に関する。
ポリヌクレオチドの人工的又は合成的合成の需要が高まってきている。分子生物学の容易に利用可能な技術を使用して、天然源からポリヌクレオチドを複製及び増幅することが可能である。加えて、そのような技術は、例えば、１又は２以上のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を通して、天然核酸配列の改変を可能にし、それ故、天然のままでは利用不可能な核酸配列へのアクセスを提供する。
しかしながら、そのようなアプローチは多くの場合、時間がかかり、労働集約的である。加えて、出発点として天然配列に依存すると、実際に実現可能な配列の範囲が限定される可能性がある。さらに、天然のポリヌクレオチド自体にアクセスすることの難しさは、追加の障害を生じさせ得る。
ポリヌクレオチドのデノボ合成は、理論的にあらゆる核酸配列への経路を与え、したがって、伝統的な分子生物学ベースのアプローチの課題のいくつかを克服し得る。
例えばホスホロアミダイト方法を使用する固相合成を介する、比較的短いオリゴヌクレオチドのインビトロ合成が周知である。確かに、伝統的な分子生物学は、多くの場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，polymerase chain reaction）及び部位特異的変異導入法において使用するために合成されたオリゴヌクレオチドプライマーに依拠する。
ポリヌクレオチドは、若干数の別個に合成されたオリゴヌクレオチドを接続することによって合成することができる。典型的には、このアプローチ下で、一群のオリゴヌクレオチドが、例えば自動固相合成を使用して合成され、精製され、次いで、個々のオリゴヌクレオチドが、その後、アニーリング及びライゲーション又はポリメラーゼ反応によって一緒に接続される。
しかしながら、化学反応を介する典型的な自動オリゴヌクレオチド合成技術は、意図しない副反応又は失敗した反応により、オリゴヌクレオチドにおけるランダム塩基エラーを生じる。例えば、カップリング失敗は、オリゴヌクレオチドが次のヌクレオシドビルディングブロックと反応せずに反応性５’－ＯＨを保持する場合に起こり、次いでこれが次のカップリングラウンドに関与し、塩基が欠けた（欠失エラー）オリゴヌクレオチドをもたらす。順次の各サイクルにわたって欠失エラーが蓄積し、精製する（purity）ことが極めて難しいであろうオリゴヌクレオチドの複雑な混合物を含有する最終生成物をもたらす。欠失エラーに対処するために、典型的には、ホスホロアミダイト方法は、サイクル中に「キャッピング」ステップを包含し、それにより、合成へのさらなる関与からカップリング失敗が除去される。これは、典型的には、無水酢酸及びＮ－メチルイミダゾールによる未反応の５’－ＯＨ基のアセチル化によって実現される。この試薬は、遊離ヒドロキシル基とのみ反応して、カップリングが失敗したオリゴヌクレオチドを不可逆的にキャッピングする。
典型的なオリゴヌクレオチド合成技術は、各ヌクレオチド付加ステップについて１００％収率を生じさせない。カップリングラウンド当たり９９．５％の収率であっても、収率
は、核酸配列の長さにわたって増加し、全長遺伝子及びゲノム等のより長いポリヌクレオチドの提供における著しい困難につながり、非常に低い全体的収率、並びに出発材料及び中間体の浪費、並びにオリゴヌクレオチド混合物を最後に形成する可能性をもたらす。
したがって、当技術分野において、ポリヌクレオチド、特に全遺伝子及びゲノム規模のものを、正確に及び効率的に提供する方法の必要性が大いに残っている。
したがって、高忠実度のポリヌクレオチド（high-fidelity polynucleotides）を生成するための新たな技術が差し迫って必要である。
その最も広範な態様において、本発明は、固体基板の表面上のＤＮＡ及びＸＮＡ等の複数のオリゴヌクレオチドの並列合成のための方法であって、５’－ＯＨ保護基の脱保護が、固体基板の選択された部位において熱制御下で行われ、それにより、それらの部位における、５’－ＯＨ保護ヌクレオシド又は５’－ＯＨ保護ヌクレオチドホスホロアミダイトビルディングブロックの、脱保護された５’－ＯＨとのカップリングを可能にする、方法に関する。選択された部位における脱保護を熱的に制御し、続いて、５’－ＯＨ保護ヌクレオシド又は５’－ＯＨ保護ヌクレオチドホスホロアミダイトを遊離５’－ＯＨ基とカップリングする方法は、所望のオリゴヌクレオチドが固体基板の各部位において形成されるまで繰り返される。したがって、本発明は、オリゴヌクレオチドを構築するための５’－ＯＨ保護ヌクレオシド又は５’－ＯＨ保護ヌクレオチドホスホロアミダイトビルディングブロックのカップリングが、ヌクレオシド／オリゴヌクレオチドの成長末端を選択的に脱保護することによって制御される、オリゴヌクレオチドの超並列合成を提供する。
本発明は、加えて、固体基板の表面上の複数の部位における同じ又は異なるオリゴヌクレオチドの並列合成のための方法であって、各部位に、５’－ＯＨにおいて熱的に開裂可能な保護基を含む複数のヌクレオシド（又はジ－若しくはトリ－ヌクレオチド等のヌクレオチド）を用意するステップであり、ヌクレオシド又はヌクレオチドが、固体基板の表面上に固定されるステップを含む方法；並びに、選択された部位において５’－ＯＨ基を脱保護するステップと、該部位における各遊離５’－ＯＨ基を、５’－ＯＨにおいて熱的に開裂可能な保護基を含有するヌクレオシド又は５’－ＯＨにおいて熱的に開裂可能な保護基を含有するヌクレオチドとカップリングするステップとを伴う方法に関する。好ましくは、方法は、各部位に、５’－ＯＨにおいて熱的に開裂可能な保護基を含む複数のヌクレオシドを用意するステップであり、ヌクレオシドが、固体基板の表面上に固定されるステップを含み；方法は、選択された部位において５’－ＯＨ基を脱保護するステップと、該部位における各遊離５’－ＯＨ基を、５’－ＯＨにおいて熱的に開裂可能な保護基を含有するヌクレオシドホスホロアミダイト又は５’－ＯＨにおいて熱的に開裂可能な保護基を含有するヌクレオチドホスホロアミダイト（好ましくは、５’－ＯＨにおいて熱的に開裂可能な保護基を含有するジ－又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト）とカップリングするステップとを伴う。選択的な熱的に制御された５’－ＯＨ脱保護及び５’－ＯＨにおいて熱的に開裂可能な保護基を含有する別のヌクレオシド（例えば、ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト、又はジ－若しくはトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト等のヌクレオチドホスホロアミダイト）と反応させる方法は、各部位において所望のオリゴヌクレオチド配列を生成するために繰り返される。
本発明のいずれかの態様において、熱的に開裂可能な保護基の選択的脱保護は、例えば溶媒の存在下、基板の選択された部位における熱の印加によって実現することができる。好ましくは、選択的脱保護は、追加の試薬を要しない。
本発明のいずれかの態様において、熱的に開裂可能なリンカーの選択的開裂は、例えば溶媒の存在下、基板の選択された部位における熱の印加によって実現することができる。好ましくは、選択的開裂は、追加の試薬を要しない。
本発明は、複数の熱的に対処可能な反応部位を含有する基板（例えば、フローセル）を使用する並列オリゴヌクレオチド合成の方法であって、個々のオリゴヌクレオチド成分が、熱的に制御された手法で成長することができ、熱的に制御された成長が、特異的な反応部位における５’－ＯＨ保護ヌクレオシドビルディングブロックの選択的な熱的に制御された脱保護を伴って、脱保護された５’－ＯＨにおける５’－ＯＨにおいて熱的に開裂可能な保護基ビルディングブロックを含有する５’－ＯＨ保護ヌクレオシド（又は５’－ＯＨ保護ジ－若しくはトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトのカップリングを可能にする、方法にも関する。選択的な熱的に制御された脱保護及びカップリングステップは、各部位において所望のオリゴヌクレオチド配列が生成されて、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを形成するまで、繰り返される。
熱的に対処可能な反応部位は、選択された部位における５’－ＯＨ保護ヌクレオシド（又は５’－ＯＨ保護ヌクレオチド）ビルディングブロックの選択的脱保護を可能にして、次の５’－ＯＨ保護ヌクレオシド（又は５’－ＯＨ保護ヌクレオチド）ビルディングブロックのカップリングをさせる、高度に制御された熱の局在化エリアを提供する。
熱的に制御された脱保護は、ヌクレオシド（又はヌクレオチド）ビルディングブロックのそれぞれの５’－ＯＨ基における熱的に開裂可能な保護基の提供によって実現される。
有利なことに、出発ヌクレオシド（又はヌクレオチド）は、熱的に開裂可能なリンカー基によって基板と結合している。この熱的に開裂可能なリンカー基は、好ましくは、オリゴヌクレオチド合成の終わりにのみ除去されるように保護されている（すなわち、セーフティキャッチリンカー基）。有利なことに、熱的に開裂可能なリンカーは、オリゴヌクレオチドの選択的な高度に制御されたハイブリダイゼーションを可能にして、二本鎖核酸又は核酸フラグメントを形成するために、オリゴヌクレオチドが熱制御下で選択的に放出されることを可能にする。
本発明の別の態様は、固体基板の表面上の複数の部位における１又は同じ若しくは異なる２以上のオリゴヌクレオチドの並列合成のための方法であって、
（ｉ）各部位に、５’－ＯＨ保護基を含む複数のヌクレオシド又はヌクレオチド（好ましくは、ジ－ヌクレオチド又はトリ－ヌクレオチド）を用意するステップであり、ヌクレオシド又はヌクレオチドが、固体基板の表面上に固定されるステップと；
（ii）固体基板の表面上の選択された部位におけるヌクレオシド又はヌクレオチドの５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行って、選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基を有するヌクレオシド（又はヌクレオチド）を形成するステップと；
（iii）選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基上に、５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト（又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト）をカップリングするステップと；得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
（iv）基板の表面上の選択された部位におけるヌクレオシド又はヌクレオチドの５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行うステップであり、選択された部位が、前のステップ(preceeding step)の選択された部位と同じであっても異なっていてもよいステップと、
（ｖ）選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基上に、５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト（又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト）をカップリングするステップと；得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
（vi）ステップ（iv）及び（ｖ）を１又は２回以上繰り返して、固体基板の表面上の各部位において所望のオリゴヌクレオチドを得るステップと
を含む、方法を包括する。
好ましくは、上記のステップ（ｉ）は、各部位に、５’－ＯＨ保護基を含む複数のヌクレオシドを用意し、ヌクレオシドを固体基板の表面に固定するステップを含む。
本発明のさらに別の態様は、チップの表面上の複数の部位における１又は同じ若しくは異なる２以上のオリゴヌクレオチドの並列合成のための方法であって、
（ｉ）各部位に、５’－ＯＨにおいて熱的に開裂可能な保護基を含む複数のヌクレオシド又はヌクレオチド（好ましくは、ヌクレオチドは、ジ－ヌクレオチド又はトリ－ヌクレオチドである）を用意するステップであり、ヌクレオシドが、熱的に開裂可能なリンカー基を介して３’位において固体基板の表面に結合しているステップと；
（ii）チップの表面上の選択された部位におけるヌクレオシドの５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行って、選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド）を形成するステップと；
（iii）選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基上に、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト（又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト）をカップリングするステップと；得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
（iv）基板の表面上の選択された部位におけるヌクレオシド又はヌクレオチドの５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行うステップであり、選択された部位が、前ステップの選択された部位と同じであっても異なっていてもよいステップと、
（ｖ）選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基上に、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト（又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト）をカップリングするステップと；得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
（vi）ステップ（iv）及び（ｖ）を１又は２回以上繰り返して、チップの表面上の各部位において所望のオリゴヌクレオチドを得るステップであり、チップが、個々に熱的に対処可能な部位を含むステップと
を含む、方法を提供する。
好ましくは、上記のステップ（ｉ）は、各部位に、５’－ＯＨ保護基を含む複数のヌクレオシドを用意し、ヌクレオシドを固体基板の表面に固定するステップを含む。
本発明の方法は、選択されたヌクレオシド又はヌクレオチドの熱的に制御された脱保護を利用することによって、基板の表面上における複数の異なるオリゴヌクレオチドの超並列合成を可能にし、それにより、それらのヌクレオシド又はヌクレオチドの、入ってくるヌクレオシド又はヌクレオチドビルディングブロックとの選択的反応を可能にする。各部位は独立して熱的に対処可能であるため、加熱されている部位におけるヌクレオシド又はヌクレオチドのみが脱保護され、それ故、カップリングステップにおける反応に利用可能である。その上、第１のヌクレオシド又はヌクレオチドが基板の表面に結合していることから、試薬を固体基板の上で洗浄することができ、そのため、カップリング反応は、加熱
された、故に脱保護された５’－ＯＨ基を有する部位のみで生じ、他の部位は影響を受けないままである。該方法は、各部位における所望のオリゴヌクレオチドの高忠実度並列合成を可能にする。
本発明はさらに、固体基板の表面上の複数の部位において、１又は２以上のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は核酸を含むマイクロアレイであって、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は二本鎖核酸が、熱的に開裂可能なリンカーによって表面に結合している、マイクロアレイを提供する。
さらなる態様において、本発明は、本明細書において記載されている方法のいずれかによって調製することができる又は得ることができるマイクロアレイを提供する。
本発明のさらに別の態様は、本明細書においていずれかの態様又は実施形態において記載されている通りの方法の使用、或いは、オリゴヌクレオチド、核酸、好ましくはＤＮＡ又はＸＮＡを調製するための、本明細書において開示されるいずれかの態様又は実施形態において記載されている通りのマイクロアレイの使用を提供する。
本発明は、加えて、本明細書において記載されている方法のいずれかによって調製することができる又は得ることができるオリゴヌクレオチド又は核酸を提供する。
方法は、加えて、選択された部位における得られたオリゴヌクレオチドの熱的に制御された放出をさらに含むことができ、選択的に放出されたオリゴヌクレオチドは、選択的に固定されたオリゴヌクレオチドと熱制御下でハイブリダイズして、核酸を形成する。
最終の核酸の純度をさらに増大させるために、方法を、ハイブリダイゼーションステップにおけるエラー検出操作とさらに組み合わせることができる。
９０℃及び２０℃における実施例１Ｃの脱保護されたリンカーの開裂についての時間経過研究結果の図である。 ｐＨ７．４ＰＢＳ及びアセトニトリル並びにｐＨ５緩衝液（ＴＥＥＡ）で異なる溶媒系を使用する、実施例１Ｃの脱保護されたリンカーの開裂についての時間経過研究結果の図である。 ９０℃において異なる比のＰＢＳ：ＭｅＣＮ（アセトニトリル）を使用する実施例１Ｃの脱保護されたリンカーの開裂についての時間経過研究結果の図である。 ９０℃における実施例２のＢｓｍｏｃ保護リンカーの脱保護（Ｂｓｍｏｃの除去）及び開裂についての時間経過研究結果の図である。 室温及び９０℃における実施例２のＢｓｍｏｃ保護リンカーの脱保護（すなわち、Ｂｓｍｏｃの除去）についての時間経過研究結果の図である。 ９０℃及び２０℃における遊離ＴＢＤＰＳ－チミジンを得るための実施例２のＢｓｍｏｃ保護リンカーの開裂を示す時間経過研究結果の図である（脱保護中間体の形成及び開裂は示されていない）。 ８０℃における異なるｐＨ条件下での実施例２のＢｓｍｏｃ保護リンカーについての安定性研究結果の図である。 異なる温度条件（室温対９０℃）下での実施例３の脱保護されたリンカーについての安定性研究結果の図である。 異なる温度条件（室温対９０℃下での１０％ジイソプロピルアミンを使用する実施例３のＦｍｏｃ保護リンカーについての安定性研究結果の図である。 異なる溶媒（ＤＭＦ対アセトニトリル）を使用し、９０℃において１０％ジイソプロピルアミンを使用する実施例３のＦｍｏｃ保護リンカーについての安定性研究結果の図である。 異なる温度（１０℃対９０℃）において２：１ ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，dimethylformamide）：Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰｓ，N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）緩衝液中の２０％ジイソプロピルアミンを使用する実施例３のＦｍｏｃ保護リンカーについての安定性研究結果の図である。 ９０℃における実施例１Ｃ及び実施例４Ｃの脱保護されたリンカーの開裂の図である。 異なる溶媒系中、９０℃における実施例４Ｃについての安定性研究結果の図である。 Ｂｏｃ保護リンカー（実施例１Ｂの化合物）の脱保護についての時間経過研究結果の図である。 無保護α－フェニルセーフティキャッチリンカー（実施例６Ｄの化合物）に対する時間経過研究の図である。 無保護二重セーフティキャッチリンカー（実施例８Ｃの化合物）対単一セーフティキャッチリンカー（実施例１Ｃの化合物）の開裂に対する時間経過研究の図である。 無保護５’－連結保護３’Ｏ－アセチル－チミジン（実施例１３Ｂの化合物）に対する時間経過研究の図である。 媒体内のそれぞれの部位において温度を制御するための温度制御デバイスの例の概略図である。 温度制御デバイスの上面図である。 温度制御デバイスのさらに詳細な断面図である。 流体が温度制御デバイスのアクティブ熱部位及びパッシブ熱領域上を流れる際の、流体における温度変化の例を示すグラフである。 アクティブ熱部位についての熱的モデルの図解である。 ４つのパッシブ熱領域で囲まれたアクティブ熱部位としてのシステムの一次近似の図解である。 熱的モデルと同様の電気回路モデルの図である。 図２２のモデルの圧縮版である。 媒体に供給された熱が、加熱体によって生成された熱により、どのように変動するかを示すプロットである。 所与のアクティブ部位において温度を制御するためのフィードバックループアーキテクチャの図解である。 媒体内のそれぞれの部位において温度を制御する方法を例証する流れ図である。 アクティブ部位の断熱層についての柱状構造の図解例である。 断熱層が、空隙を包含する柱状構造を有する、２つのアクティブ部位及びいくつかのパッシブ部位の断面図である。 柱状断熱層を持つ温度制御デバイスを製造する方法を例証する流れ図である。 図２９の製造方法のそれぞれの段階の図解である。
定義
本明細書において使用される用語は、別段の指示がない限り、当技術分野におけるそれらの普通の意味を有する。
用語「ヌクレオチド」は、糖基、ヘテロ環式塩基及びホスフェート基を包含する、核酸（好ましくは、ＤＮＡ又はそのアナログ）サブユニットを指す。
用語「ヌクレオシド」は、ヘテロ環式塩基と共有結合している糖基を含む化合物を指す。ヌクレオシド又はヌクレオチドのヘテロ環式塩基は、核酸塩基としても公知である。ヌクレオチドは、それぞれ核酸塩基を含む。用語「核酸塩基」又は「塩基」は、本明細書において使用される場合、プリン及びピリミジンを包含する窒素性塩基、例を挙げると、ＤＮＡ核酸塩基Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣ、ＲＮＡ核酸塩基Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧ、並びに非ＤＮＡ／ＲＮＡ核酸塩基、例を挙げると、５－メチルシトシン（ＭｅＣ）、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニルウラシル、５－プロピニル－６－フルオロウラシル、５－メチルチアゾールウラシル、６－アミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、２，６－ジアミノプリン、７－プロピン－７－デアザアデニン、７－プロピン－７－デアザグアニン及び２－クロロ－６－アミノプリンを指す。
核酸は、例えば、一本鎖又は二本鎖であってよい。
ゼノ核酸（ＸＮＡ，Xeno nucleic acid）は、ＤＮＡの人工的な代替物である合成核酸である。ＤＮＡと同じく、ＸＮＡは情報保存ポリマーであるが、ＸＮＡは、糖－リン酸主鎖の構造において、ＤＮＡ及びＲＮＡとは異なる。２０１１年までに、遺伝情報を保存及び検索することができるＸＮＡ主鎖を作成するために少なくとも６つの合成糖が使用されてきた。主鎖糖の置換は、ＸＮＡをＤＮＡと機能的に及び構造的に同様にする。
用語「ハイブリダイゼーション」は、対向する核酸鎖の水素結合、好ましくは、相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基間のWatson-Crick水素結合を指す。
いずれの場合も、別段の指示がない限り、ヌクレオシド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドへの言及は、適宜、活性化又は保護基を有するものを包含する。
いずれの場合も、別段の指示がない限り、ヌクレオシド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドへの言及は、天然プリン及びピリミジン塩基、特に、アデニン、チミン、シトシン、グアニン及びウラシル、並びに修飾プリン及びピリミジンアナログ、例を挙げると、アルキル化、アシル化又は保護されたプリン及びピリミジンを包含する。それ故、ヌクレオシド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、保護されていてもよい標準的な（canonical）又は保護されていてもよい非標準的（non-canonical）な核酸塩基を包含することができる。
いずれの場合も、別段の指示がない限り、用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は交換可能に使用され、天然、並びにヌクレオチドから形成された合成の、ポリマーを指す。これらは、一本鎖又は二本鎖であってよい。
用語「ヒドロカルビル」は、本明細書において使用される場合、炭化水素から水素原子を除去することによって形成された一価の基を指す。ヒドロカルビルという用語は、以下で定義される通り、アルキル、アリール、アルカリール及びアリールアルキル、アルケニル又はアルキニル基を包括する。アルキル基、及びヒドロカルビル基のアルキル部は、直鎖、分岐状又は環状アルキルを包含することができる。
アルキル基は、飽和、直鎖、分岐状、第一級、第二級若しくは第三級又は環状炭化水素に関する。アルキル基は、１～２０個の炭素原子、１～１５個の炭素原子、又は１～６個の炭素原子を含有することができる。特に好ましいアルキル基は、Ｃ１－６直鎖若しくは分岐状アルキル基、又はＣ３－６シクロアルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、１－メチルエチル、ブチル、１－メチルプロピル、２－メチルプロピル、１，１－ジメチルエチル、ペンチル、１－メチルブチル、２－メチルブチル、３
－メチルブチル、２，２－ジメチルプロピル、１－エチルプロピル、ヘキシル、１，１－ジメチルプロピル、１，２－ジメチルプロピル、１－メチルペンチル、２－メチルペンチル、３－メチルペンチル、４－メチルペンチル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１－エチル－１－メチルプロピル、１－エチル－２－メチルプロピル、ヘプチル、オクチル、２－エチルヘキシル、ノニル及びデシル並びにそれらの異性体である。より好ましくは、アルキル基は、１～６個の炭素原子、特に、メチル、エチル、プロピル、１－メチルエチル、ブチル、１－メチルプロピル、２－メチルプロピル、１，１－ジメチルエチル、ペンチル、１－メチルブチル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、２，２－ジメチルプロピル、１－エチルプロピル、ヘキシル、１，１－ジメチルプロピル、１，２－ジメチルプロピル、１－メチルペンチル、２－メチルペンチル、３－メチルペンチル、４－メチルペンチル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１－エチル－１－メチルプロピル及び１－エチル－２－メチルプロピルを含有することができる。アルキルは、単一又は複数の縮合環を有する３～１０個の炭素原子を含有することができるシクロアルキル基も包括する。好ましいシクロアルキル基は、アダマンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はヘキシルを包含する。
アリール基は、６～２０個、好ましくは６～１５個、より好ましくは６～１０個の炭素原子を含有する芳香族環に関し、単環式、二環式及び多環式、縮合又は分岐状アリール基を包含する。好ましいアリール基は、フェニル、ビフェニル及びナフチルである。特に好ましいアリール基は、フェニルである。
アルカリール基は、７～２１個の炭素原子、好ましくは７～１６個の炭素原子、より好ましくは７～１１個の炭素原子を含有することができ、単環式、二環式及び多環式又は分岐状アリール基、並びに直鎖、分岐状又は環状アルキル基を含有する、アルカリール基を包含する。好ましいアルカリール基は、トリル及びキシリルである。
アリールアルキル基は、７～２１個の炭素原子、好ましくは７～１６個の炭素原子、より好ましくは７～１１個の炭素原子を含有することができ、単環式、二環式及び多環式又は分岐状アリール基、並びに直鎖、分岐状又は環状アルキル基を含有する、アリールアルキル（aryalkyl）基を包含する。好ましいアリールアルキル基は、ベンジル、フェネチル、フェンプロピル、フェンブチル、ナフチルメチル及びナフチルメチルである。
アルケニルは、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する、直鎖、分岐状及び環状炭化水素を指す。好ましくは、アルケニル基は、２～１２個、２～８個、２～６個又は２～４個の炭素原子を含有する。好ましくは、アルケニルは、１～３つの二重結合、より好ましくは１つの二重結合を指す。アルケニル基は、好ましくは、エテニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－メチル－エテニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１－メチル－１－プロペニル、２－メチル－１－プロペニル、１－メチル－２－プロペニル、２－メチル－２－プロペニル；１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－ペンテニル、４－ペンテニル、１－メチル－１－ブテニル、２－メチル－１－ブテニル、３－メチル－１－ブテニル、１－メチル－２－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、３－メチル－２－ブテニル、１－メチル－３－ブテニル、２－メチル－３－ブテニル、３－メチル－３－ブテニル、１，１－ジメチル－２－プロペニル、１，２－ジメチル－１－プロペニル、１，２－ジメチル－２－プロペニル、１－エチル－１－プロペニル、１－エチル－２－
プロペニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、４－ヘキセニル、５－ヘキセニル、１－メチル－１－ペンテニル、２－メチル－１－ペンテニル、３－メチル－１－ペンテニル、４－メチル－１－ペンテニル、１－メチル－２－ペンテニル、２－メチル－２－ペンテニル、３－メチル－２－ペンテニル、４－メチル－２－ペンテニル、１－メチル－３－ペンテニル、２－メチル－３－ペンテニル、３－メチル－３－ペンテニル、４－メチル－３－ペンテニル、１－メチル－４－ペンテニル、２－メチル－４－ペンテニル、３－メチル－４－ペンテニル、４－メチル－４－ペンテニル、１，１－ジメチル－２－ブテニル、１，１－ジメチル－３－ブテニル、１，２－ジメチル－１－ブテニル、１，２－ジメチル－２－ブテニル、１，２－ジメチル－３－ブテニル、１，３－ジメチル－１－ブテニル、１，３－ジメチル－２－ブテニル、１，３－ジメチル－３－ブテニル、２，２－ジメチル－３－ブテニル、２，３－ジメチル－１－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－３－ブテニル、３，３－ジメチル－１－ブテニル、３，３－ジメチル－２－ブテニル、１－エチル－１－ブテニル、１－エチル－２－ブテニル、１－エチル－３－ブテニル、２－エチル－１－ブテニル、２－エチル－２－ブテニル、２－エチル－３－ブテニル、１，１，２－トリメチル－２－プロペニル、１－エチル－１－メチル－２－プロペニル、１－エチル－２－メチル－１－プロペニル及び１－エチル－２－メチル－２－プロペニル、並びにシクロペンテン－４－イルを包含する。
アルキニルは、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する、好ましくは１～２つの三重結合、より好ましくは１つの三重結合を有する、直鎖、分岐状及び環状炭化水素に関する。好ましくは、アルキニル基は、２～１２個の炭素原子、好ましくは２～８個又はより好ましくは２～４個の炭素原子を包含する。好ましいアルキニル基は、エチニル、プロパ－１－イン－１－イル、プロパ－２－イン－１－イル、ｎ－ブタ－１－イン－１－イル、ｎ－ブタ－１－イン－３－イル、ｎ－ブタ－１－イン－４－イル、ｎ－ブタ－２－イン－１－イル、ｎ－ペンタ－１－イン－１－イル、ｎ－ペンタ－１－イン－３－イル、ｎ－ペンタ－１－イン－４－イル、ｎ－ペンタ－１－イン－５－イル、ｎ－ペンタ－２－イン－１－イル、ｎ－ペンタ－２－イン－４－イル、ｎ－ペンタ－２－イン－５－イル、３－メチルブタ－１－イン－３－イル、３－メチルブタ－１－イン－４－イル、ｎ－ヘキサ－１－イン－１－イル、ｎ－ヘキサ－１－イン－３－イル、ｎ－ヘキサ－１－イン－４－イル、ｎ－ヘキサ－１－イン－５－イル、ｎ－ヘキサ－１－イン－６－イル、ｎ－ヘキサ－２－イン－１－イル、ｎ－ヘキサ－２－イン－４－イル、ｎ－ヘキサ－２－イン－５－イル、ｎ－ヘキサ－２－イン－６－イル、ｎ－ヘキサ－３－イン－１－イル、ｎ－ヘキサ－３－イン－２－イル、３－メチルペンタ－１－イン－１－イル、３－メチルペンタ－１－イン－３－イル、３－メチルペンタ－１－イン－４－イル、３－メチルペンタ－１－イン－５－イル、４－メチルペンタ－１－イン－１－イル、４－メチルペンタ－２－イン－４－イル及び４－メチルペンタ－２－イン－５－イルである。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、ヒドロカルビルは、好ましくは、アルキル、アリール又はアリールアルキル、より好ましくは、Ｃ１－６アルキル、Ｃ６－１０アリール又はＣ７－１２アリールアルキルを指す。さらに一層好ましくは、ヒドロカルビルは、Ｃ６－１０アリール又はＣ７－１２アリールアルキル、最も好ましくは、フェニル又はベンジルを指す。
ヘテロ環式基は、例えば、環Ａの文脈において、少なくとも１個の環窒素原子、すなわち、

部分の一部である窒素原子を含有する非芳香族環式基を指す。

によって表される環Ａヘテロ環式基は、単環式、二環式又は三環式であってよく、好ましくは、単環式又は二環式、より好ましくは単環式である。
ヘテロ環式基は、不飽和環炭素原子を含有してよいが、好ましくは飽和である。好ましくは、環Ａのヘテロ環式基は、少なくとも１個の環窒素原子を含有する４～１２員のヘテロ環式環である。
適切な環Ａヘテロ環式基は、アゼチジニル、ピロリジニル、２，５－ジヒドロピロール、ピラゾリニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、２－オキソピペラジニル、２－オキソピペリジニル、２－オキソアゼピニル、アゼピニル、４－ピペリドニル、モルホリニル、チアモルホリニル及びトリアゾリルを包含する。二環式ヘテロ環式基は、テトラ－ヒドロイソキノリニル及びテトラヒドロキノリニルを包含するがこれらに限定されない。好ましいヘテロ環式基は、少なくとも１個の環窒素原子を含有するもの、最も好ましくは、１個の環窒素原子を含有する５又は６員のヘテロ環式環である。特に、環Ａは、ピペリジニル、ピロリジニル、アゼパニル（ホモピペリジニル）及びアゾカニルからなる群から選択されるヘテロ環式基であり、より好ましくは、環Ａは、ピペリジニル、ピロリジニル及びアゼパニルからなる群から選択されるヘテロ環式基であり、最も好ましくは、環Ａは、ピペリジニル又はピロリジニルである。環Ａヘテロ環式基は、非置換であることもでき、又は１若しくは２以上の環原子で（好ましくは、アルキル、アリール、アリールアルキル又はアルキルアリール等の不活性置換基で）置換されることもできる。故に、環Ａ及び特異的な環Ａ基への言及は、１又は２以上の環原子上に置換基を有するものを包含する。好ましくは、環Ａは、非置換である。
用語「保護基」は、分子の別の部分において化学転換を可能にするために分子上の反応性基を一時的にマスクするために使用され、その後除去することができる、部分を指す。異なる官能基及び反応条件のための保護基は、例えば、Greene's "Protective Groups in
Organic Synthesis" , Fifth edition (2014), Peter G.M. Wuts,Wileyから周知である。
用語「熱的に開裂可能な」は、リンカー基又は保護基の文脈において使用される場合、リンカー基又は保護基が、熱の印加によって、好ましくは溶媒の存在下、容易に開裂の影響を受けやすいことを意味する。
用語「フラグメント」、「部分」、「基」、「置換基」及び「ラジカル」は、本明細書において使用される場合、交換可能に、例えば特定の官能基を有する分子の一部を指す。
本発明のある特定の化合物は、１又は２以上のキラル中心を含有し得ることが分かるであろう。別段の指示がない限り、未指定の立体化学の化合物への言及は、単一の異性体若しくは単一のエナンチオマー、又はそれらのラセミ体を包含する混合物を包含することが意図されている。
本発明の態様は、ＤＮＡ又はＸＮＡを調製するための方法、好ましくはＤＮＡ又はＸＮＡに関する。しかしながら、技術は、他のポリヌクレオチドの調製に容易に適用され得る。
本発明のある態様は、固体基板の表面上の複数の部位における１又は同じ若しくは異なる２以上のオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＸＮＡ）の並列合成のための方法であって、
（ｉ）各部位に、５’－ＯＨ保護基を含む複数のヌクレオシド又はヌクレオチド（好ましくは、ヌクレオチドは、ジ－ヌクレオチド又はトリ－ヌクレオチドである）を用意するステップであり、ヌクレオシド又はヌクレオチドが、固体基板の表面上に固定されるステップと；
（ii）固体基板の表面上の選択された部位におけるヌクレオシド又はヌクレオチドの５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行って、選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基を有するヌクレオシドを形成するステップと；
（iii）選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基上に、ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト（好ましくは、ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトは、ジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトである）をカップリングするステップであり、ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトが、５’－ＯＨ保護基を含むステップと；得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
（iv）基板の表面上の選択された部位におけるヌクレオシド又はヌクレオチドの５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行うステップであり、選択された部位が、前ステップの選択された部位と同じであっても異なっていてもよいステップと、
（ｖ）選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基上に、ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト（好ましくは、ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトは、ジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトである）をカップリングするステップであり、ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトが、５’－ＯＨ保護基を含むステップと；得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
（vi）ステップ（iv）及び（ｖ）を１又は２回以上繰り返して、固体基板の表面上の各部位において所望のオリゴヌクレオチドを得るステップと
を含む、方法を提供する。
ステップ（ｉ）において、固体基板の表面には、ヌクレオシド又はヌクレオチド（好ましくは、ジ－又はトリ－ヌクレオチド）（「出発ヌクレオシド」又は「出発ヌクレオチド」）が用意され、これらは、表面に結合して「反応部位」を形成する。単一の反応部位内
には、基板の表面とそれぞれ結合している、複数の同じ出発ヌクレオシドがあってよい。異なる反応部位は、合成される所望のオリゴヌクレオチドに応じて、異なる表面結合したヌクレオシド又はヌクレオチドを含んでよい。反応部位は独立した熱制御下にあるため、各反応部位を使用して、他の反応部位とは独立して、異なるオリゴヌクレオチドを合成してよい。好ましくは、ステップ（ｉ）において、固体基板の表面にヌクレオシド（「出発ヌクレオシド」）を用意する。
ステップ（ｉ）の５’－ＯＨ保護ヌクレオシド又はヌクレオチドは、好ましくは、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含む。熱的保護基は、セーフティキャッチ型のものであってよく、それにより、保護基を除去するために、２つの別個のステップ（活性化及び開裂）が要される。熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基－は、好ましくは、アクチベーター部分及び開裂可能なリンカー部分を含む。アクチベーター部分は、典型的には、熱的に開裂可能な脱保護アクチベーター及びリンカー基を露出させるように、所定の条件下で最初に除去される保護基によって保護されており、それにより、加熱時にアクチベーター及びリンカー基が保護基を開裂させ、５’－ＯＨ基の脱保護をもたらす。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基は、好ましくは、１又は２つのアクチベーター部分と、１又は２つの開裂可能なリンカー部分とを有するセーフティキャッチ保護基を含み、各アクチベーター部分は保護基で保護されており、各アクチベーター部分上の保護基は、アクチベーター部分を露出させるための所定の条件下で脱保護の影響を受けやすく、それにより、アクチベーター部分及び開裂可能なリンカー部分を、加熱時に開裂の影響を受けやすいものにする。
ステップ（ｉ）における出発ヌクレオシド又はヌクレオチドは、好ましくは、熱的に開裂可能なリンカー基を介して３’位において固体基板の表面に結合している。熱的に開裂可能なリンカー基は、セーフティキャッチ型のものであってもよい。熱的に開裂可能なリンカー基は、好ましくは、アクチベーター部分及び開裂可能なリンカー部分を含んでいてよく、アクチベーター部分は、アクチベーター部分を露出させるための所定の条件下で除去される保護基によって保護され得、それにより、アクチベーター部分及び開裂可能なリンカー部分を、加熱時に開裂の影響を受けやすいものにする。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、熱的に開裂可能なリンカー基は、１又は２つのアクチベーター部分と、加熱時にリンカー基を開裂させ、それにより、固体基板の表面からの離脱を引き起こす、１又は２つの開裂可能なリンカー部分とを含む。
より好ましくは、熱的に開裂可能なリンカー基は、１又は２つのアクチベーター部分と、１又は２つの開裂可能なリンカー部分とを有するセーフティキャッチリンカーを含み、アクチベーター部分は保護基で保護されており、各アクチベーター部分上の保護基は、アクチベーター部分を露出させるための所定の条件下で脱保護の影響を受けやすくなり、それにより、アクチベーター部分及び開裂可能なリンカー部分を、加熱時に開裂の影響を受けやすいものにする。
出発ヌクレオシド又はヌクレオチドの、固体基板の表面との結合は、開裂可能なリンカー基を介するものである。
本発明のオリゴヌクレオチド合成は固体表面上で行われることから、基板の表面との結合のための熱的に開裂可能なリンカー基は、好ましくは、オリゴヌクレオチド合成ステップにおいて使用されるすべての条件に直交性である条件下で除去される保護基を含有し、何故なら、リンカー基は、合成全体の間、インタクトなままであるべきだからである。セーフティキャッチリンカーの利点は、ひとたびオリゴヌクレオチドが調製されると、アク
チベーター部分を保護する保護基は、すべての部位において除去され得、熱的に開裂可能な保護基によって基板の表面に結合している複数のオリゴヌクレオチドをもたらすことである。これらのオリゴヌクレオチドは、熱的手段下、高度に選択的に放出され得、それにより、いかなるその後のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプロセスに関しても高度の制御を可能にする。
ステップ（ii）及び（iv）において、出発ヌクレオシド若しくはヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの成長末端のいずれかにおける５’－ＯＨ保護は、オリゴヌクレオチドを成長させるためのカップリング反応が所望される場合、選択された部位において熱を印加することによって実現することができる。出発ヌクレオシド若しくはヌクレオチドの５’－ＯＨ又はオリゴヌクレオチドの成長末端における熱的に開裂可能な保護基により、各部位は、熱の印加によって選択的に脱保護され得る。選択された反応部位への熱の高度に選択的な印加は、カップリング反応を高忠実度で実施することを可能にする。好ましくは、選択された部位以外の部位において、５’－ＯＨ保護基の脱保護は実質的にない。「脱保護は実質的にない」は、選択された部位以外の部位における５’－ＯＨ保護基の、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満が脱保護される、又はいずれも脱保護されないことを意味する。
カップリングステップ（iii）及び（ｖ）において、選択された部位における、出発ヌクレオシド若しくはオリゴヌクレオチドの脱保護された５’－ＯＨ基、又はオリゴヌクレオチドの成長末端は、それぞれ、５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシド／ヌクレオシドビルディングブロック又はヌクレオチドビルディングブロックとのカップリング反応に供される。脱保護は選択された部位に対して選択的であるため、選択された部位以外の部位における意図しないカップリング又は副反応の可能性は、大きく低減される、又はさらには排除される。好ましくは、カップリングステップ（iii）及び（ｖ）は、５’－ＯＨ保護基を含む入ってくるヌクレオシド／ヌクレオシド又はヌクレオチドビルディングブロックを含有する溶液を、基板の表面と接触させるステップを含み、ヌクレオシド、ヌクレオシドビルディングブロック又はヌクレオチドビルディングブロックは、選択された部位において脱保護された５’－ＯＨ基と反応する。選択された部位以外の部位は、加熱されないか、又は、それらの部位における意図しない反応の可能性をさらに最小化するために、冷却に供されてよい。好ましくは、選択された部位以外の部位において、入ってくるヌクレオシド／ヌクレオシドビルディングブロック又はヌクレオチドビルディングブロックとの反応は実質的にない。「反応は実質的にない」は、選択された部位以外の部位の、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満が、入ってくるヌクレオシド、ヌクレオシドビルディングブロック若しくはヌクレオチドビルディングブロックと反応する、又はいずれも反応しないことを意味する。
第１のヌクレオシドの結合
ステップ（ｉ）において、固体基板の表面上の各部位に、５’－ＯＨ保護基を含む複数のヌクレオシド又はヌクレオチド（好ましくはヌクレオシド）を用意し、ヌクレオシド又はヌクレオチドを固体基板の表面に固定する。上記で指し示した通り、固体基板の表面に、ヌクレオシド（「出発ヌクレオシド」）又はヌクレオチド（「出発ヌクレオチド」－ジ又はトリヌクレオチドであってもよい）を用意し、これらが表面に結合して「反応部位」を形成する。単一の反応部位内に、それぞれ基板の表面に結合している複数の同じ出発ヌクレオシド又はヌクレオチドがあってよい。異なる反応部位は、合成される所望のオリゴヌクレオチドに応じて、異なる表面結合したヌクレオシド又はヌクレオチドを含んでいてよい。
好ましくは、ステップ（ｉ）の５’－ＯＨ保護ヌクレオシド又はヌクレオチドは、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含み、ヌクレオシド又はヌクレオチドは、熱的に開裂可
能なリンカー基を介してヌクレオシド３’位（又はヌクレオチド３’位）において固体基板の表面に結合しており、第１のヌクレオシドを表面に結合している熱的に開裂可能なリンカーは、オリゴヌクレオチド合成ステップ中の除去に対して安定である。
ステップ（ｉ）は、好ましくは、各部位において、固体表面に固定された複数のヌクレオシドを用意するステップを含み、各固定されたヌクレオシドは、

によって表される
［式中、
－ Ｌ１－Ａ１－Ｐ１は、一緒になって、ヌクレオシドの３’－ＯＨ基における表面との結合のためのセーフティキャッチリンカーを表し、
－ Ｐ１は、保護基を表し、
－ Ｌ１は、熱的に開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ１は、Ｐ１の除去時に、固体表面からの開裂可能なリンカーの開裂を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ Ｐ２－Ａ２－Ｌ２は、一緒になって、セーフティキャッチ５－ＯＨ保護基を表し、
－ Ｐ２は、保護基を表し、
－ Ｌ２は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ２は、Ｐ２の除去時に、５’－ＯＨ保護基の除去を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ ｍは、各出現において、同じであるか又は異なり、１又は２を表し；
－ Ｌ０は、第１のヌクレオシドの、開裂可能なリンカー基を介する表面との結合のための部分を表し；
－ Ｂ１は、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基を表し、
Ａ１、Ａ２、Ｌ１及びＬ２は、同じであっても異なっていてもよく、Ｐ１及びＰ２は、異なり、異なる条件又は試薬下で除去可能である］。好ましくは、核酸塩基上の保護基は、存在する場合、オリゴヌクレオチド合成中の除去に対して安定である。同じように、ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト上の保護基Ｐ４は、オリゴヌクレオチド合成中の除去に対して安定である。核酸塩基保護基は、好ましくは、オリゴヌクレオチド合成の終わりに、ホスフェート保護基（例えば、Ｐ４）とともに除去されてよい。
本発明のいずれかの実施形態又は態様において、Ｌ０部分を介する出発ヌクレオシド又はヌクレオチドの固体表面への結合又は固定は、オリゴヌクレオチド合成の終わりに基板の表面からオリゴヌクレオチドを開裂させるセーフティキャッチリンカーＬ１－Ａ１－Ｐ１の任意の適切な部分における、例えば、Ｌ１又はＡ１におけるものであってよい。Ｌ０部分を介する基板との結合は、好ましくは、Ｌ１又はＡ１部分における任意の適切な原子を介するものである。例えば、ｍが２を表す場合、上記で描写した通りのＬ０部分～Ａ１を介する出発ヌクレオシド又はヌクレオチドの固体表面への結合又は固定は、Ａ１基の１つ上の単一の点／原子におけるものであり、両方のＡ１基におけるものではないことが分かるであろう。故に、オリゴヌクレオチド合成の終わりにおいて、セーフティキャッチリンカーは、基板の表面からのオリゴヌクレオチドの完全離脱、すなわち、好ましくは３’－ヒドロキシル基を含有するオリゴヌクレオチドを放出することを可能にする。好ましくは、セーフティキャッチリンカーも、基板から完全に離脱される。
固体表面の各反応部位において、複数の同じ固定されたヌクレオシド又はヌクレオチド（好ましくは、ジ又はトリヌクレオチド）があってよい。固体表面の隣接する反応部位において、固定されたヌクレオシド又はヌクレオチドは、同じであっても異なっていてもよい。
ステップ（ｉ）に従って固体表面に固定された複数のヌクレオシドの調製は、好ましくは、各異なるヌクレオシドの表面への段階的結合を含む。特に、ステップ（ｉ）は、好ましくは、
（ａ）各部位が熱的に不安定なリンカー基で官能基化されている複数の部位を含む固体表面を用意するステップであり、そのそれぞれが、

［式中、
－ Ｌ’－Ａ’－Ｐ’は、一緒になって、表面とＬ０を介して結合しているセーフティキャッチリンカーを表し、
－ Ｐ’は、アクチベーター部分のための保護基を表し、
－ Ｌ’は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ’は、Ｐ’の除去時に、固体表面からの開裂可能なリンカー基の開裂を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ ｍ＝１又は２であり；
－ Ｌ０は、開裂可能なリンカー基の、表面との結合のための部分を表す］
によって表されるステップと；
（ｂ）保護基Ｐ’を除去して、それにより、

によって表される複数の部位を含む固体表面をもたらすステップと、
（ｃ）固体表面上の選択された部位におけるアクチベーター部分Ａ’を介する開裂可能なリンカーＬ’の熱的に制御された脱保護、及び、脱保護部位を、式：

［式中、
－ Ｌ１－Ａ１－Ｐ１は、一緒になって、第１のヌクレオシドの３’－ＯＨ基における表面との結合のためのセーフティキャッチリンカーを表し、
－ Ｐ１は、保護基を表し、
－ Ｌ１は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ１は、Ｐ１の除去時に、固体表面からの開裂可能なリンカーの開裂を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ Ｐ２－Ａ２－Ｌ２は、一緒になって、セーフティキャッチ５’－ＯＨ保護基を表し、
－ Ｐ２は、保護基を表し、
－ Ｌ２は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ２は、Ｐ２の除去時に、５’－ＯＨ保護基の除去を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ ｍは、各出現において、同じであるか又は異なり、１又は２を表し；
－ Ｂ１は、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基を表し［好ましくは、核酸塩基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）のうちの１つである］
によって表されるヌクレオシド（「出発ヌクレオシド」）とカップリングするステップと、
（ｄ）前ステップにおいて脱保護されなかった、選択された部位におけるアクチベーター部分Ａ’を介する開裂可能なリンカーＬ’の熱的に制御された脱保護、及び、脱保護部位を、別のヌクレオシド、好ましくは他の３つの標準的な核酸塩基のうちの１つを含むヌクレオシドとカップリングするステップと、
（ｅ）他の残りのヌクレオシドを用いてステップ（ｄ）を繰り返し；
それにより、固体表面上に複数の部位を形成するステップであり、固体表面が、核酸塩基を含有する複数の５’－ＯＨ保護ヌクレオシド（セーフティキャッチ保護基－Ｌ２－Ａ２－Ｐ２で保護されている）を含み、核酸塩基が、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基であり［好ましくは、核酸塩基は、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴである］、ヌクレオシドが、開裂可能なリンカー基－Ｌ１－Ａ１－Ｐ１－を介して固体表面と３’－ＯＨにおいてそれぞれ結合しているステップと
を含む。
ステップ（ｉ）に従う固体表面に固定された複数のヌクレオシドの調製は、好ましくは、
（ａ）各部位が熱的に不安定なリンカー基で官能基化されている複数の部位を含む固体表面を用意するステップであり、そのそれぞれが、

［式中、
－ Ｌ’－Ａ’－Ｐ’は、一緒になって、表面とＬ０を介して結合しているセーフティキャッチリンカーを表し、
－ Ｐ’は、アクチベーター部分のための保護基を表し、
－ Ｌ’は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ’は、Ｐ’の除去時に、固体表面からの開裂可能なリンカー基の開裂を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ ｍ＝１又は２であり；
－ Ｌ０は、開裂可能なリンカー基の、表面との結合のための部分を表す］
によって表されるステップと；
（ｂ）保護基Ｐ’を除去して、それにより、

によって表される複数の部位を含む固体表面をもたらすステップと、
（ｃ）固体表面上の選択された部位におけるアクチベーター部分Ａ’を介する開裂可能なリンカーＬ’の熱的に制御された脱保護、及び、脱保護部位を、式：

［式中、
－ Ｌ１－Ａ１－Ｐ１は、一緒になって、第１のヌクレオシドの３’－ＯＨ基における表面との結合のためのセーフティキャッチリンカーを表し、
－ Ｐ１は、保護基を表し、
－ Ｌ１は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ１は、Ｐ１の除去時に、固体表面からの開裂可能なリンカーの開裂を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ Ｐ２－Ａ２－Ｌ２は、一緒になって、セーフティキャッチ５’－ＯＨ保護基を表し、
－ Ｐ２は、保護基を表し、
－ Ｌ２は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ２は、Ｐ２の除去時に、５’－ＯＨ保護基の除去を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ ｍは、各出現において、同じであるか又は異なり、１又は２を表し；
－ Ｂ１は、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基を表し［好ましくは、核酸塩基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）のうちの１つである］
によって表されるヌクレオシド（「出発ヌクレオシド」）とカップリングするステップと、
（ｄ）前ステップにおいて脱保護されなかった、選択された部位におけるアクチベーター部分Ａ’を介する開裂可能なリンカーＬ’の熱的に制御された脱保護、及び、脱保護部位を、別のヌクレオシド、好ましくは他の３つの標準的な核酸塩基のうちの１つを含むヌクレオシドとカップリングするステップと、
（ｅ）他の残りのヌクレオシドを用いてステップ（ｄ）を繰り返し；
それにより、固体表面上に複数の部位を形成するステップであり、固体表面が、核酸塩基を含有する複数の５’－ＯＨ保護ヌクレオシド（セーフティキャッチ保護基－Ｌ２－Ａ２－Ｐ２で保護されている）を含み、核酸塩基が、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基であり［好ましくは、核酸塩基は、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴである］、ヌクレオシドが、開裂可能なリンカー基－Ｌ１－Ａ１－Ｐ１－を介して固体表面と３’－ＯＨにおいてそれぞれ結合しているステップと
を含む。
代替として、上記の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｃ）は、固体表面上の選択された部位におけるアクチベーター部分Ａ’を介する開裂可能なリンカーＬ’の熱的に制御された脱保護と、脱保護部位を、式：

［式中、
－ Ｌ１－Ａ１－Ｐ１は、一緒になって、第１のヌクレオシドの３’－ＯＨ基における表面との結合のためのセーフティキャッチリンカーを表し、
－ Ｐ１は、保護基を表し、
－ Ｌ１は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ１は、Ｐ１の除去時に、固体表面からの開裂可能なリンカーの開裂を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ Ｐ２－Ａ２－Ｌ２は、一緒になって、セーフティキャッチ５’－ＯＨ保護基を表し、
－ Ｐ２は、保護基を表し、
－ Ｌ２は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ２は、Ｐ２の除去時に、５’－ＯＨ保護基の除去を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ Ｐ４は、ホスフェート保護基を表し；
－ ｍは、各出現において、同じであるか又は異なり、１又は２を表し；
Ｂ１及びＢ２は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれ独立して、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基を表し、好ましくは、核酸塩基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）のうちの１つである］
によって表されるジ－ヌクレオチドであってよいヌクレオチド（「出発ヌクレオチド」）とカップリングさせるステップとを含んでよい。
代替として、上記の実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｃ）は、固体表面上の選択された部位におけるアクチベーター部分Ａ’を介する開裂可能なリンカーＬ’の熱的に制御された脱保護と、脱保護部位を、式：

［式中、
－ Ｌ１－Ａ１－Ｐ１は、一緒になって、第１のヌクレオシドの３’－ＯＨ基における表面との結合のためのセーフティキャッチリンカーを表し、
－ Ｐ１は、保護基を表し、
－ Ｌ１は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ１は、Ｐ１の除去時に、固体表面からの開裂可能なリンカーの開裂を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ Ｐ２－Ａ２－Ｌ２は、一緒になって、セーフティキャッチ５’－ＯＨ保護基を表し、
－ Ｐ２は、保護基を表し、
－ Ｌ２は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ２は、Ｐ２の除去時に、５’－ＯＨ保護基の除去を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ 各Ｐ４は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれ独立して、ホスフェート保護基を表し；
－ ｍは、各出現において、同じであるか又は異なり、１又は２を表し；
－ Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれ独立して、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基を表し、好ましくは、核酸塩基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）のうちの１つである］
によって表されるトリ－ヌクレオチドであってよいヌクレオチド（「出発ヌクレオチド」）とカップリングするステップとを含んでよい。
上述した態様及び実施形態のいずれかにおいて、ステップ（ｂ）で、保護基Ｐ’は、好ましくは、表面のすべての部位から除去される。得られた表面は、反応が所望される部位において（最初は第１のヌクレオシド又はヌクレオチドがカップリングされる部位において）、熱制御下で開裂され得る複数の熱的に開裂可能な保護基（Ｌ’－Ａ’）を含むことになる。次いで、表面結合した５’－ＯＨ保護ヌクレオシド又は５’－ＯＨ保護ヌクレオ
チドを調製するように、選択された部位における脱保護された５’－ＯＨ基を、５’－ＯＨ保護ヌクレオシド又は５’－ＯＨ保護ヌクレオチドとカップリングする［ステップ（ｃ）］。その後のステップにおいて、表面上の他の選択された部位を、５’－ＯＨ基の熱的脱保護に供し、得られた脱保護基を、異なる５’－ＯＨ保護ヌクレオシド又は５’－ＯＨ保護ヌクレオチドと反応させる［ステップ（ｄ）］。基板の表面上のすべての所望の部位が、所望の５’－ＯＨ保護ヌクレオシド又は５’－ＯＨ保護ヌクレオチドを装着して、オリゴヌクレオチドの独立した並列合成のための出発ヌクレオシド／ヌクレオチドを形成するまで、脱保護／カップリングステップを繰り返す。
本発明のオリゴヌクレオチド合成の好ましい実施形態において、ステップ（ｉ）は、固体表面に固定された複数のヌクレオシドを調製するステップを含む。
表面結合
オリゴヌクレオチド合成プロセスの種々の段階（第１のヌクレオシド又はヌクレオチドの基板の表面への結合、ヌクレオシド／オリゴヌクレオチドの第１及びその後の５’－ＯＨ成長末端の脱保護並びに／又は合成されたオリゴヌクレオチドの放出）において熱制御を提供するために、基板の表面は、好ましくは、金又はシリコン等の導電性材料でコーティングされている。基板は、チップ上に個々に熱的に対処可能な部位を持つ、金又はシリコン表面を備えてよい。シリコン表面を備える基板が特に好ましい。
官能基化部分を金又はシリコン表面に結合する方法は公知である。例えば、金又はシリコン表面との結合は、官能基化カルベン又は官能基化アルキン、好ましくは官能基化アルキンとの会合を介して実現することができる。好ましくは、結合は、官能基化アルキンを介するシリコン表面とのものである。適切な表面結合の例を以下で詳細に記載する。
（Ａ）シリコン表面との結合
（Ａ１）水素不動態化シリコンとの結合
１つのアプローチは、水素不動態化した無酸化物シリコン（酸化シリコンは効率的な断熱材であるため、反応部位間の熱制御に有害である）上における自己集合単分子層の形成を使用する。アルキル又はアルケニル単分子層は、熱的条件、光化学的条件下での１－アルケニル又は好ましくは１－アルキニル種のグラフティング［例えば、米国特許第６，４６５，０５４Ｂ２号明細書において記載されている通り］、又は好ましくは３％ＨＦ水溶液又は４０％ＮＨ４Ｆ水溶液への曝露によるネイティブ酸化シリコンの除去後のエレクトログラフティング条件［例えば、Buriak Chem. Rev.2002, 102, 1271、米国特許第６，４８５，９８６Ｂ１号明細書、米国特許第７，５２１，２６２Ｂ２号明細書、米国特許第６，８４６，６８１Ｂ２号明細書において記載されている通り］によって、下記のスキーム１に従って、形成される。

熱及び光化学的開始反応は、フリーラジカル機構を介して進み、無酸素条件下、未希釈の脱気した１－アルキン若しくは１－アルケン（光化学的及び熱的経路）を使用して、又はトルエン若しくはメシチレン等の高沸点芳香族溶媒中溶液（熱的経路）を使用して実施される。
４４７ｎｍの照射を使用する１－アルキン及び１－アルケンからの光化学単分子層形成［J.Am.Chem.Soc. 2005, 127, 2514］は、水接触角、Ｘ線反射率及びＸＰＳによって評価される通り、熱開始反応によって得られるものと同等の品質の単分子層を得ることが分かった。未反応のＳｉ－Ｈ表面種の酸化を指し示す、観察可能なＳｉ－Ｏ形成はなかった。３７１～６５８ｎｍの照射下での１－アルケン及び１－アルキン単分子層の光化学的形成の、２５４ｎｍの光を使用したものとの比較により、同等の単分子層品質を得たが、観察可能な光化学副産物はなかった。
（Ａ２）予め合成されたオリゴヌクレオチドの固定化によるＨ－不動態化シリコン上におけるＤＮＡ表面の形成
化学的に誘導可能な基を含有する１－アルケン及び１－アルキン単分子層の光化学的形成は、予め合成されたオリゴヌクレオチドの結合のための適切なプラットフォームを提供することが示されている。米国特許第６，６７７，１６３Ｂ１号は、下記の単分子層形成に従う１－アルケンのＨ－Ｓｉ表面との熱及び光化学反応による、保護された化学的に誘導可能な基（ＯＨ、ＮＨ２、ＣＯ２Ｈ）を含有する単分子層の形成について記載しており、化学的に誘導可能な末端基は、脱保護されるか又は活性化されるか（例えば、スクシンイミジルエステルの形成によって）のいずれかであり、その後、反応性カップリング基を担持する生体分子（ｓｓＤＮＡ等）と反応して、オリゴヌクレオチド及び他の生体分子担持表面を形成する（スキーム２）。

このアプローチは、Ｓｉ（１００）上の極微細パターンでのアミノ官能基化オリゴヌクレオチドとの反応［Nucl. Acids. Res. 2004, 32, e118］、並びに２４８ｎｍの光化学的官能基化を使用するメチル－エステル終端膜の設置及び脱保護［Microelectronic Eng. 2004, 73-74, 830］による同じ活性化エステルの形成のための活性化スクシンイミジルエステル単分子層を設置するために用いられた。同じように、末端カルボキシレート官能性を含有する１－アルキンのエレクトログラフティング［Nucl Acid Res.2006, 34, e32］は、中間体スクシンイミジル（succimidyl）活性エステルの形成を介して、反応性オリゴヌクレオチドを固定するためのプラットフォームとして使用されてきた。末端カルボキシレートの使用は、中間体ポリ（リジン）膜に結合官能性を提供することもでき、次いでこれは、マレイミド含有架橋剤ＳＳＭＣＣを使用して活性化された［J.Am.Chem.Soc.2000,
122, 1205］。得られたマレイミド官能基化表面は、チオール化ｓｓＤＮＡを蛍光研究のために捕捉することができる。熱開始膜形成による反応性末端エポキシド基を用いた非生物付着オリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ，oligo(ethylene glycol)）単分子層の直接設置を使用して、高度に熱的に安定な膜を生成した。エポキシド末端のチオール化ｓｓ－ＤＮＡとの反応は、Ｓｉ上でのＤＮＡ膜の形成を可能にし、これを、相補的蛍光標識３’－ＴＡＭＲＡ ｓｓＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって調査した［Langmuir 2006, 22, 3494］。
同じように、ＯＥＧ－終端１－アルケンのＨ－不動態化シリコンとの光化学的グラフティングによって形成された非付着ＯＥＧ終端アルキル単分子層を、生体分子（オリゴヌクレオチドを包含する）固定化のためのプラットフォームとして使用した［米国特許第９，３０２，２４２Ｂ２号明細書］。このアプローチにおいて、不連続の空間的に分解されたナノウェルは、ＯＥＧ部分の鎖切断による伝導性ＡＦＭプローブを使用する陽極リソグラ
フィーによって作成された。次いで、これらの領域は、さらなる誘導体化の影響を受けやすく、オリゴヌクレオチド、タンパク質及びアビジンの結合を可能にした。
さらなる例において、反応性末端を含有する１－アルケン及び１－アルキン単分子層のグラフティングによる、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ，field-effect transistor）ゲート電極の修飾に基づくバイオセンサーが実証されている［米国特許第７，５０７，６７５Ｂ２号明細書］。このアプローチは、結晶性シリコン基板に限定されず、さらなる例［米国特許出願公開第２０１２／０１４２０４５号パンフレット］において、化学的に官能基化可能な１－アルケンの、Ａｕプラズモンナノ構造にコーティングされた無酸化物アモルファスシリコン（ａ－Ｓｉ，amorphous silicon）及び炭化シリコン（ＳｉＣ，silicon
carbide）膜とのグラフティングである。例として、オリゴヌクレオチド等の生体分子リガンドを導入するための、グラフト鎖末端のさらなる誘導体化が実証される。
（Ａ３）水素不動態化シリコン上での直接オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は、無酸化物Ｓｉ表面上の末端ジメトキシトリチル（ＤＭＴ，dimethoxytrityl）保護アルキルヒドロキシル単分子層を使用して予め実施した［ACIE. 2002, 41, 615］（スキーム３）：

末端ＤＭＴ－Ｏ単分子層は、対応する１１－ＤＭＴオキシ－１－アルケンから、熱開始反応下で形成した。次いで、得られたＤＭＴ－Ｏ終端単分子層膜を、自動ホスホロアミダ
イト合成に曝露して、最初に塩基開裂可能なリンカーを設置し、次いで、脱保護中に開裂される１７－ｍｅｒオリゴヌクレオチド（5'-CGGCATCGTACGATTAT）を合成した。ｓｓＤＮＡ表面密度を、Ｒｕ［（ＮＨ３）］３＋結合研究によって３．１９×１０１２鎖／ｃｍ２として測定した。相補的１８－ｍｅｒの表面ハイブリダイゼーション、続いて、メチレンブルーのインターカレーションは、ｄｓＤＮＡ表面密度の決定を可能にした。１．０５×１０１２鎖／ｃｍ２のｄｓＤＮＡ表面密度は、表面結合したｓｓＤＮＡの３３％がハイブリダイゼーションを受けたことを示した。この戦略は、３’－末端においてＣ５－エチニルフェロセン－ｄＣを設置するためにも使用され［Chem.Eur.J. 2005,11, 344; J.Electroanalytical Chem. 2007, 603, 67］、これにより、表面結合したオリゴヌクレオチドの電荷移動研究を可能にした。Ｈ－Ｓｉ上における表面結合したｓｓ－及びｄｓ－ＤＮＡの直接画像化は、この方法論を使用して合成したオリゴヌクレオチドを使用しても実施された［Langmuir 2003, 19, 5457］。
（Ａ４）水素不動態化シリコン基板との結合のための候補化合物の合成
提案される戦略は、単分子層末端におけるセーフティキャッチの熱的に開裂可能な保護基を含有する単分子膜の形成を伴う（スキーム４）：

候補アルキンは、下記のスキーム５を介して水素不動態化シリコン上に堆積させることができる：

化学的に誘導可能な基Ｚ２を露わにするための塩基性条件下でのセーフティキャッチの除去及び脱保護は、次いで、活性化エステル形成又はペプチドカップリング等の適切なカップリング化学を経由して、セーフティキャッチの熱的に開裂可能なリンカー－第一塩基コンジュゲートの設置を可能にする。
さらなる戦略（スキーム６）において、化合物（ＩＡ）［式中、Ｚ＝Ｎ３である］の誘導体化は、クリックケミストリーを介して、セーフティキャッチの熱的に開裂可能なリン
カー－第一塩基コンジュゲートの設置を可能にする［例えば、J.Am.Chem.Soc. 2005, 127, 210; Langmuir 2006, 22, 2457］：

（Ｂ）金表面との結合
（Ｂ）金基板上のカルベン及びチオール
金等の金属は、それらの熱伝導率により、自己集合単分子層（ＳＡＭ，self-assembled
monolayer）を成長させるための基板として魅力的であるとされてきており、それらの幅広い潜在性について、とりわけバイオセンサーの分野において記載されてきた。特に、カ
ルベン金［Crudden, Nat. Chem., vol. 6, 409-414, 2014］は、それらのチオール対応物と比較したそれらの安定性の向上について記載されてきた［C. Vericat, et al. Chem Soc. Rev. 39, 1805(2010)；Johnson、国際公開第２０１４／１６０４７１Ａ２号パンフレット］。
（Ｂ１）金とのカルベン結合のための候補構造
提案される反応スキームは、金基板との結合のための適切な候補化合物の合成について以下で見られる。詳細な戦略は、単分子層末端におけるセーフティキャッチの熱的に開裂可能な保護基を含有するＳＡＭの設置を伴う。塩基性条件下でのセーフティキャッチの除去及び脱保護により、化学的に誘導可能な基Ｚ２を露わにする（スキーム７）。

次いで、第１のヌクレオシドを、下記のスキーム８によって例示されている通りの様式に従って結合してよい：

（Ｂ２）金とのチオール結合のための候補構造
官能基化チオールの金表面との結合は、下記のスキーム９を介して実現され得る：

次いで、第１のヌクレオシドを、下記のスキーム１０によって例示されている通りの様式に従って結合してよい：

オリゴヌクレオチド合成プロセス
上記で説明した通り、第１のヌクレオシド又はヌクレオチドの、反応部位の表面への熱的に制御された付加を可能にするために、各反応部位を、成長中のオリゴヌクレオチドフラグメントの結合を可能にするがＤＮＡ合成プロセスに使用されるプロセスのすべてに対
して化学的に不活性である表面でコーティングする。
次いで、すべての反応部位の表面の非熱的に制御された官能基化を行う。この官能基化は、熱的に不安定な保護基で保護された反応性部分を含有する基を、表面に結合させる。
熱的に不安定な保護基の脱保護後、次いで、表面結合した反応性部分は、３’位において結合している熱的に開裂可能なリンカーを介して第１のヌクレオシド又はヌクレオチドと結合している相補的（complimentary）反応性部分を含む入ってくる分子と反応することができ、この場合、５’－ヒドロキシ基は、熱的に開裂可能な保護基で保護されている。
表面結合した反応性部分を脱保護するために使用される条件は、熱的に開裂可能なリンカーを開裂する及び５’－ヒドロキシル保護基を脱保護するために使用される条件に直交性（orthogonal）であるが、冷温でのみである。すべての所要の第１のヌクレオシド又はヌクレオチドが反応部位を官能基化するまで、このプロセスを繰り返すことができる。例えば、ヌクレオシド又はヌクレオチドによる反応部位の官能基化後、すべての所望の反応部位に所要のヌクレオシド又はヌクレオチドを装着するまで、プロセスを繰り返してよい。この相が完了すると、オリゴヌクレオチドフラグメント合成は開始することができる。好ましくは、反応部位は、ヌクレオシドで官能基化されている。
表面結合及び保護された第１のヌクレオシド又はヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドフラグメントの熱的に制御された合成は、第１のヌクレオシド又はヌクレオチドの５’－ヒドロキシ上の熱的に不安定な保護基を最初に脱保護することによって実現される。故に、本発明のオリゴヌクレオチド合成プロセスにおいて、ステップ（ii）は、開裂可能なリンカー基Ｐ２－Ａ２－Ｌ２を保護しているセーフティキャッチ５’－ＯＨの熱的に制御された除去を含む。
加熱された反応部位は、この後、脱保護された５’－ヒドロキシ基を持つヌクレオシド又はヌクレオチドを含有することになり、次いでこれは、熱的に敏感な保護基を持つ５’－ヒドロキシ基上で保護されている入ってくるヌクレオシド又はヌクレオチドと反応することができる。すべての所要のオリゴヌクレオチドが生成されるまで、このプロセスを繰り返すことができる。
好ましくは、入ってくるヌクレオシド又はヌクレオチドは、ステップ（iii）及びステップ（ｖ）における５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシド又はヌクレオチドであり、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト、ジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトである。好ましくは、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基は、１又は２つのアクチベーター部分と、加熱時に保護基を開裂させ、それにより、５’－ＯＨ基の脱保護をもたらす、１又は２つの開裂可能なリンカー部分とを含む。より好ましくは、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基は、１又は２つのアクチベーター部分及び１又は２つの開裂可能なリンカー部分を有するセーフティキャッチリンカーを含み、各アクチベーター部分は、保護基で保護されており、各アクチベーター部分上の保護基は、アクチベーター部分を露出させるための所定の条件下で脱保護の影響を受けやすく、それにより、アクチベーター部分及び開裂可能なリンカー部分を、加熱時に開裂の影響を受けやすいものにする。
好ましくは、本発明のいずれかの態様又は実施形態において、ステップ（iii）及びステップ（ｖ）における５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシドは、

［式中、
－ Ｐ３－Ａ３－Ｌ３は、一緒になって、セーフティキャッチ５－ＯＨ保護基を表し、
－ Ｐ３は、保護基を表し、
－ Ｌ３は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ３は、Ｐ３の除去時に、５’－ＯＨ保護基の除去を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ ｍ＝１又は２であり；
－ Ｐ４は、ホスホロアミダイト保護基を表し；
－ Ｂ２は、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基を表し；
－ Ｒａ及びＲｂは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれアルキルを表す］
によって表される熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシド３’－ホスホロアミダイトである。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、ステップ（iii）及びステップ（ｖ）における５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオチドは、

［式中、
－ Ｐ３－Ａ３－Ｌ３は、一緒になって、セーフティキャッチ５’－ＯＨ保護基を表し、
－ Ｐ３は、保護基を表し、
－ Ｌ３は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ３は、Ｐ３の除去時に、５’－ＯＨ保護基の除去を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ ｍ＝１又は２であり；
－ 各Ｐ４は、同じであっても異なっていてもよく、ホスホロアミダイト又はホスフェート保護基を表し；
－ Ｂ２及びＢ３は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれ独立して、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基を表し；
－ Ｒａ及びＲｂは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれアルキルを表す］
によって表される熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含むジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトであってよい。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、ステップ（iii）及びステップ（ｖ）における５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオチドは、

［式中、
－ Ｐ３－Ａ３－Ｌ３は、一緒になって、セーフティキャッチ５’－ＯＨ保護基を表し、
－ Ｐ３は、保護基を表し、
－ Ｌ３は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ３は、Ｐ３の除去時に、５’－ＯＨ保護基の除去を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ ｍ＝１又は２であり；
－ 各Ｐ４は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれホスホロアミダイト又はホスフェート保護基を表し；
－ Ｂ２、Ｂ３及びＢ４は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれ独立して、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基を表し；
－ Ｒａ及びＲｂは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれアルキルを表す］
によって表される熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含むトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトである。
好ましくは、ステップ（iii）における５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシド３’－ホスホロアミダイトの、固定されたヌクレオシドの脱保護された５’－ＯＨ基へのカップリングとそれに続く酸化は、

［式中、
－ Ｌ１－Ａ１－Ｐ１は、一緒になって、ヌクレオシドの３’－ＯＨ基における表面との結合のためのセーフティキャッチリンカーを表し、
－ Ｐ１は、保護基を表し、
－ Ｌ１は、熱的に開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ１は、Ｐ１の除去時に、固体表面からの開裂可能なリンカーの開裂を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ Ｐ３－Ａ３－Ｌ３は、一緒になって、セーフティキャッチ５－ＯＨ保護基を表し、
－ Ｐ３は、保護基を表し、
－ Ｌ３は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ３は、Ｐ３の除去時に、５’－ＯＨ保護基の除去を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ ｍは、各出現において、同じであるか又は異なり、１又は２を表し；
－ Ｌ０は、第１のヌクレオシドの、開裂可能なリンカー基を介する表面との結合のための部分を表し；
－ 各Ｂ１及びＢ２は、独立して、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基を表し、
Ａ１、Ａ３、Ｌ１及びＬ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｐ１及びＰ３は、異なり、異なる条件又は試薬下で除去可能であり；
－ Ｐ４は、ホスホロアミダイト保護基を表す］
によって表される構造を形成する。
代替として、ステップ（iii）における５’－ＯＨ保護基を含むジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトの、固定されたヌクレオシドの脱保護された５’－ＯＨ基へのカップリングとそれに続く酸化は、



によって表される構造を形成するか、或いは
ステップ（iii）における５’－ＯＨ保護基を含むトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトの、固定されたヌクレオシドの脱保護された５’－ＯＨ基へのカップリングとそれに続く酸化は、



［式中、
－ Ｌ１－Ａ１－Ｐ１は、一緒になって、ヌクレオシドの３’－ＯＨ基における表面との結合のためのセーフティキャッチリンカーを表し、
－ Ｐ１は、保護基を表し、
－ Ｌ１は、熱的に開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ１は、Ｐ１の除去時に、固体表面からの開裂可能なリンカーの開裂を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ Ｐ３－Ａ３－Ｌ３は、一緒になって、セーフティキャッチ５’－ＯＨ保護基を表し、
－ Ｐ３は、保護基を表し、
－ Ｌ３は、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ａ３は、Ｐ３の除去時に、５’－ＯＨ保護基の除去を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ ｍは、各出現において、同じであるか又は異なり、１又は２を表し；
－ Ｌ０は、第１のヌクレオシドの、開裂可能なリンカー基を介する表面との結合のため
の部分を表し；
－ 各Ｂ１又はＢ２又はＢ３又はＢ４は、独立して、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基を表し、
Ａ１、Ａ３、Ｌ１及びＬ３は、同じであっても異なっていてもよく、Ｐ１及びＰ３は、異なり、異なる条件又は試薬下で除去可能であり、
－ 各Ｐ４は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれホスフェート保護基を表す］
によって表される構造を形成する。
ステップ（ii）及び（iii）を繰り返して、

［式中、
－ Ｐｘ－Ａｘ－Ｌｘは、一緒になって、入ってくるヌクレオシドの５’－ＯＨ基を保護する開裂可能な５’－ＯＨ保護基を表し、
－ Ｌｘは、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ｐｘは、保護基を表し、
－ Ａｘは、Ｐｘの除去時に、５’－ＯＨ保護基の除去を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ ｍ＝１又は２であり；
－ Ｐ４は、ホスホロアミダイト保護基を表し；
－ Ｂｘは、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基を表し；
－ Ｒａ及びＲｂは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれアルキルを表す］
によって表されるヌクレオシドの５’－ＯＨにおける順次の熱的に制御された脱保護及び入ってくるヌクレオシドのカップリングにより、各部位におけるオリゴヌクレオチドを逐次成長させる。
好ましくは、ステップ（iii）及びステップ（ｖ）における５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシドは、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシド３’－ホスホロアミダイトであり、各カップリングステップの後、得られた亜リン酸トリエステルを、酸化によってリン酸トリエステルに変換する。ホスファイトの酸化は、水及びピリジン、ルチジン又はコリジン等の弱塩基の存在下、ヨウ素酸化によって［Matteucci, M. D.;Carruthers, M. H. (1981). "Synthesis of deoxyoligonucleotideson a polymer support". J. Am. Chem. Soc. 103 (11): 3185参照］又はｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド及び（１Ｓ）－（＋）－（１０－カンファースルホニル）オキサジリジンを使用して、実現することができる。
代替として、ステップ（ii）及び（iii）を繰り返して、

,又は
［式中、
－ Ｐｘ－Ａｘ－Ｌｘは、一緒になって、入ってくるヌクレオシド又はヌクレオチドの５’－ＯＨ基を保護する開裂可能な５’－ＯＨ保護基を表し、
－ Ｌｘは、開裂可能なリンカー部分を表し、
－ Ｐｘは、保護基を表し、
－ Ａｘは、Ｐｘの除去時に、５’－ＯＨ保護基の除去を引き起こすことができる、アクチベーター部分を表し；
－ ｍ＝１又は２であり；
－ 各Ｐ４は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれホスホロアミダイト又はホスフェート保護基を表し；
－ 各Ｂｘは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれ独立して、保護されていてもよい標準的な又は保護されていてもよい非標準的な核酸塩基を表し、
－ Ｒａ及びＲｂは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれアルキルを表す］
によって表されるヌクレオシド／ヌクレオチドの５’－ＯＨにおける順次の熱的に制御された脱保護及び入ってくるヌクレオチドのカップリングにより、各部位におけるオリゴヌクレオチドを逐次成長させる。
５’－ヒドロキシ保護基、開裂可能なリンカー及び他の保護基
表面結合した及び保護された第１のヌクレオシド又は保護された第１のヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドフラグメントの熱的に制御された合成は、ホスホロアミダイト化学サイクルの修正版として見ることができる。
ホスホロアミダイト方法において、５’－保護ヌクレオシドは、最初に、固体支持体、例えばポリマー支持体と共有結合する。５’－保護基（典型的には標準ホスホロアミダイト合成におけるトリチル）を除去し、ヌクレオシド－３’－ホスホロアミダイトを５’－ヒドロキシル基とカップリングして、支持体結合亜リン酸トリエステルを形成する。失敗した配列／未反応のヌクレオシドを典型的にはアセチル化によって除去するために、得られた生成物をキャッピング剤で処理してもよい。次いで、亜リン酸トリエステルを酸化して、対応するホスホトリエステルとする。所望のオリゴヌクレオチドが調製されるまで、脱保護、カップリング及び酸化ステップを繰り返す。得られた生成物は、支持体結合オリゴヌクレオチドであり、次いでこれを、支持体からオリゴヌクレオチドを放出するために、その後、支持体からのオリゴヌクレオチドの分離のために例えば濾過によって、処理する。本発明は、出発第１のヌクレオシド又は出発ヌクレオチド（例えば、ジ－又はトリ－ヌクレオチド）のための、及び、その後の入ってくるヌクレオシドビルディングブロック（例えば、ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト）のための熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基、並びに有利なことに、３’－ＯＨにおける第１のヌクレオシド又は第１のヌクレオチドの基板との結合のための熱的に開裂可能なリンカー基を用いる。
支持体とオリゴヌクレオチドとの間の開裂可能なリンカーは、オリゴヌクレオチド合成手順に安定でなくてはならず、一方で、合成の終わりに、要される場合、熱制御下での容易な放出ができる。
５’－ＯＨ保護基は、好ましくは、セーフティキャッチ型感熱性保護基である。セーフティキャッチ型システムは、有利なことに、保存、輸送及び合成安定性を提供し、第１の別個の活性化ステップ後のみ、熱誘導された開裂の影響を受けやすい。
好ましくは、５’－ＯＨ保護基は、ヌクレオシド又はヌクレオチドビルディングブロック（５’－ＯＨ保護ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又は５’－ＯＨ保護ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト）のそれぞれについて同じである。
故に、第１のヌクレオシド又はヌクレオチド及びその後の入ってくるヌクレオシドビルディングブロック（例えば、ジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト等の、ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト試薬）は、有利なことに、５’位において感熱性セーフティキャッチ保護基で保護される。この保護基のアンロック及び除去のための条件は、望ましくは、下記の化学プロセス：ヌクレオシド間ホスフェート部分上のホスフェート保護基の除去；アデニン、シトシン及びグアニン等の塩基に要される環外窒素保護基の除去；並びにオリゴヌクレオチドフラグメントを表面に結合させているリンカーのアンロック及び開裂と直交性である。保護基は、成長中のオリゴヌクレオチドフラグメント上にお
けるホスホロアミダイト試薬の５’－ヒドロキシ基との緩酸触媒反応；及びその後の、所望のホスフェートとの新たに作製されたホスファイト結合の酸化である、ホスホロアミダイトサイクルにおいて使用される条件にも安定でなくてはならない。アンロック及び脱保護に使用される加熱又は非加熱条件は、好ましくは、オリゴヌクレオチドフラグメント合成にとって取るに足りないとみなされ得るよりも、成長中のオリゴヌクレオチドフラグメントにこれ以上いかなる損傷も引き起こさないものであるべきである。脱保護の熱制御は、冷たい部位における不要な脱保護又は熱い部位における不十分な脱保護のいずれかによる、成長中のオリゴヌクレオチドフラグメントにおけるヌクレオシド又はヌクレオチドの誤取込を最小化するように、十分なレベルのものでなくてはならない。
セーフティキャッチリンカー基及び保護基は、２ステップ除去プロセスを要する。第１のステップ、すなわち活性化ステップにおいて、保護基ＰＧは、脱保護活性化基及びリンカー部分を露出させるための特異的な反応条件下で除去される。第２のステップ、すなわち開裂ステップは、第２の反応条件（酸又は塩基の存在下であってもよい温度上昇）を伴い、それにより、脱保護活性化基は、二酸化炭素の付随する放出による分子内環化を引き起こす。それ故、次いで、加熱された、選択された反応部位は、脱保護部分との表面結合を含有することになり、次いでこれが、３’位において結合している熱的に開裂可能なリンカーを介して５’－ヒドロキシ保護第１のヌクレオシド（又は、５’－ヒドロキシ保護ジ－ヌクレオチド若しくは５’－ヒドロキシ保護トリ－ヌクレオチド等の５’－ヒドロキシ保護ヌクレオチド）と結合している相補的反応性部分を含む、入ってくる分子と反応することができる。第１のヌクレオシド又はヌクレオチドを表面に結合させるリンカー基は、好ましくは、セーフティキャッチ型と同様のものである。保護基ＰＧは、オリゴヌクレオチド合成プロセス中の除去に対して安定であるべきであり、すなわち、セーフティキャッチリンカーは、オリゴヌクレオチド合成の終わりまでそのロックされた（保護された）形態であるべきである。アンロック時に、表面は、アンロックされた熱的に開裂可能なリンカー基を介して表面に結合している複数のオリゴヌクレオチドを含有することになる。次いで、特異的な部位を加熱することにより、それらの部位においてオリゴヌクレオチドを表面から開裂させ、それにより、オリゴヌクレオチドの制御放出を可能にする（例えば、ハイブリダイゼーションのため）。
表面結合した反応性部分上における保護基のアンロックは、熱的に又は非熱的に制御された方式のいずれかで行うことができる。表面結合した反応性部分上のアンロックされた保護基が、入ってくるリンカー結合した第１のヌクレオシド又はヌクレオチド上の反応性部分と反応することができる場合、熱的に制御されたアンロックが要される。これは、熱制御がなければ、表面結合した保護基のすべてが同時にアンロックされることになるためである。表面結合した反応性部分上のアンロックされた保護基が、入ってくるリンカー結合した第１のヌクレオシド（又はヌクレオチド）上の反応性部分と反応することができない場合、熱制御は要されない。
表面結合した反応性部分上の５’－ＯＨ保護基をアンロックするために使用される条件は、熱的に開裂可能なリンカー及び５’－ＯＨ保護基をアンロックするために使用される条件に直交性であることが要されるが、冷温でのみである。
表面結合した及び保護された第１のヌクレオシドからのオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドフラグメントの熱的に制御された合成は、最初に第１のヌクレオシド（又はヌクレオチド）上の保護基をアンロックすることによって実現され、それによって、高温条件に供した場合に除去の影響を受けやすい。加熱された反応部位は、次いで、脱保護された５’－ヒドロキシ基を持つヌクレオシド又は（ヌクレオチド）を含有することになり、次いでこれが、入ってくる５’－ヒドロキシ保護ヌクレオシド又は５’－ヒドロキシ保護ヌクレオチドと反応することができる。
脱保護された５’－ヒドロキシ基は、入ってくるヌクレオシド又はヌクレオチドと、任意の公知の手法で反応し得る。好ましくは、入ってくるヌクレオシド又はヌクレオチドは、ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト試薬、ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト試薬（特に、ジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト試薬又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト（phosphoramidete）試薬）であり、カップリング反応に続いて、ホスフェート基との新たに作製されたホスファイト結合の酸化を行う。
好ましくは、ホスホロアミダイト試薬は、アデニン、シトシン及びグアニンの場合等、任意の環外窒素において保護され、ホスファイト基に含有される求核酸素で保護され、５’－ＯＨ基において本明細書において記載されている熱的に開裂可能な保護基で保護されている、ヌクレオシド又はヌクレオチドの３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジアルキルホスホロアミダイト）［好ましくは、３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト］誘導体である。
カップリング反応のためのホスホロアミダイトの活性化は、ホスホロアミダイトをプロトン化するための弱酸として作用することができる上に、ジアルキルアミノ基を置きかえる求核試薬でもある、酸性分子の０．２～０．７Ｍアセトニトリル溶液を添加することによって行われてよい。そのような試薬の例は、テトラゾール及びその誘導体、例えば、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ，4,5-Dicyanoimidazole）、エチルチオテトラゾール（ＥＴＴ，Ethylthiotetrazole）、５（４－ニトロフェニル）－１Ｈ－テトラゾール及び５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾールである。
本発明のいずれかの態様において、熱的に開裂可能なリンカー基は、式（Ｌ－１）：

［式中、
－ ＊は、ヌクレオシド又はヌクレオチドの３’－ＯＨとの結合点を表し；
－ Ｘは、水素又はヒドロカルビルを表し；
－ Ｙは、ヒドロカルビル又は

を表し；
－ Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ７のそれぞれは、同じであるか又は異なり、それぞれ独立して、水素又はヒドロカルビルを表し；
－ ＰＧは、窒素のための開裂可能な保護基を表し；
－ ｎは、０、１、２又は３を表し；
－ 環Ａは、窒素含有ヘテロ環式基を表し；
各出現において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ＰＧ及びＡは、同じであっても異なっていてもよく、
これは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｘ、Ｙ又はＡのうちの１つにおいて基板と結合しており、好ましくは、Ｒ７又はＹにおいて基板と結合しており、好ましくは、Ｙが

である場合、Ｒ７において基板と結合しているか、
或いは、開裂可能なリンカーは、Ｙがヒドロカルビルである場合、Ｙにおいて基板と結合している］
によって表される。
好ましくは、Ｙは、ヒドロカルビルである。
好ましくは、開裂可能なリンカー（Ｌ－１）の保護基ＰＧの少なくとも１つは、第１の反応条件下で開裂可能であり、それにより脱保護されたリンカーを生成し、脱保護されたリンカーは、第２の異なる反応条件下で、熱制御下で分子内環化及び開裂を受けることができ、二酸化炭素を放出して、式（II）：

の化合物を生成し、それにより、表面からオリゴヌクレオチドを放出し；
式中、ＰＧ’は、水素、又は窒素のための開裂可能な保護基であり、但し、少なくとも１つのＰＧ’は、水素であり；
－ Ｙ’は、ヒドロカルビル、又は

を表し；
式中、Ｘ、Ｒ１～Ｒ５、Ｒ７、Ａ及びｎは、上記で定義されている通りである。
本発明のいずれかの態様において、５’－ＯＨ保護基は、式（Ｌ－１’）：

［式中、
－ ＊は、ヌクレオシド又はヌクレオチドの５’－ＯＨとの結合点を表し；
－ Ｘは、水素又はヒドロカルビルを表し；
－ Ｙは、ヒドロカルビル又は

を表し；
－ Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ７のそれぞれは、同じであるか又は異なり、それぞれ独立して、水素又はヒドロカルビルを表し；
－ ＰＧは、式Ｌ－１におけるＰＧ基とは異なる窒素のための開裂可能な保護基を表し；－ ｎは、０、１、２又は３を表し；
－ 環Ａは、窒素含有ヘテロ環式基を表し；
各出現において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ＰＧ及びＡは、同じであっても異なっていてもよい］
によって表される。
好ましくは、保護基Ｌ－１’において、保護基ＰＧの少なくとも１つは、第１の反応条件下で開裂可能であり、それにより脱保護されたリンカーを生成し、脱保護されたリンカーは、第２の異なる反応条件下で、熱制御下で分子内環化及び開裂を受けることができ、二酸化炭素を放出して、式（II）：

の化合物を生成し、それにより、ヌクレオシド又はヌクレオチドの５’－ＯＨ基を脱保護し；
式中、
－ ＰＧ’は、水素、又は窒素のための開裂可能な保護基であり、但し、少なくとも１つのＰＧ’は、水素であり；
－ Ｙ’は、ヒドロカルビル、又は

を表し；
式中、Ｘ、Ｒ１～Ｒ５、Ｒ７、Ａ及びｎは、上記で定義されている通りである。
式Ｌ－１’において、Ｙは、好ましくは、

である。
式（Ｌ－Ｉ’）の保護基は、アクチベーター基（環Ａ）を含有し、これは、適切な条件において加熱時に、分子をフラグメント化させて、成長中のオリゴヌクレオチド上の５’－ヒドロキシ基を、入ってくるホスホロアミダイト試薬と自由に反応させておく。フラグメンテーション反応は、高度に熱的に敏感であり、アクチベーター及びアクセプター基が互いに近接して連結されていることから、緩やかな条件下で生じる。これは、加熱プロセスには他の試薬を要さず、熱が印加されている間に生じ得る副反応の数を劇的に低減させることを意味する。
第１のヌクレオシド又はヌクレオチド上の熱的に開裂可能な保護基のためのＰＧは、第１のヌクレオシド又はヌクレオチド上の任意の他の保護基に及び熱的に開裂可能なリンカーのためのＰＧに直交性でなくてはならない。好ましくは、熱的に開裂可能なリンカーのためのＰＧは、オリゴヌクレオチド合成反応に安定であり、何故なら、開裂可能なリンカーのためのＰＧは、好ましくは、オリゴヌクレオチド合成の終わりにのみ除去されるからである。好ましくは、熱的に開裂可能な保護基のためのＰＧは、Ａｄｐｏｃ又はＤｄｚ等の酸に不安定な保護基である。
５’－ＯＨ保護ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又は５’－ＯＨ保護ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトは、好ましくは、セーフティキャッチ型（式Ｌ－１’）の５’－ＯＨ保護基を含有する。５’－ＯＨ保護基上のＰＧは、好ましくは、Ｆｍｏｃ又はＢｓｍｏｃ等の塩基に不安定な保護基であってよい。
アデニン、シトシン及びグアニン塩基等の環外窒素を包含する核酸塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドについて、環外窒素は、熱的に開裂可能なリンカーのためのＰＧに直交性である保護基によって保護されてよい。好ましくは、環外窒素のための保護基は、アロック又はフッ化物に不安定な基、例を挙げると、国際公開第２０１４／０２２８３９号パンフレット、Matteucci, M. D.;Carruthers, M. H. (1981) - "Synthesis of deoxyoligonucleotideson a polymer support, J. Am. Chem. Soc. 103 (11): 3185において開示されているもの、ビス－ｔｅｒｔ－ブチルイソブチルシリル（butyliosbutylsilyl）（ＢＩＢＳ，bis-tert-butylisobutylsilyl）[Huan Liang, Lin Hu, and E. J. Corey - Org. Lett., 2011, 13 (15), pp4120-4123]等のパラジウムに不安定な保護基である。代替として、環外窒素は保護されていない。この場合において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト化学及び環外アミンがホスホロアミダイト試薬と反応することを防止する「プロトンブロッキング」戦略を使用して、合成されてよい。「プロトンブロッキング」戦略は、適切に低いｐＫａを持つアクチベーター酸を使用して、ホスホロアミダイトに対して求核試薬として作用することができないような程度まで、環外アミンをプロトン化することを伴う。この方法に使用されるアクチベーターは、５－ニトロベンズイミダゾリウムトリフレート及び他のアナログを包含する［Sekine, J. Org.Chem. 2003, 68, 5478］。
入ってくるヌクレオシド（ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト）又は入ってくるヌクレオチド（ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト）（例えば、Ｐ４）上のホスフェート基は、核酸塩基上の環外窒素を保護するために使用した保護基と同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、Ａｌｌｏｃ、Ｎｏｃ、Ｃｏｃ又はプレニルカルバメート等のパラジウムに不安定な保護基を、ホスフェート／ホスホロアミダイトの保護に使用してよい。ホスフェート又はホスホロアミダイトの保護のための他の適切なＰ４基は、トリメチルシリルエチル等のフッ化物に不安定な基を包含する。
合成中に第１のヌクレオシド又はヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを結合する式（Ｌ－Ｉ）の開裂可能なリンカー基は、好ましくは、第１のヌクレオシド又はヌクレオチドの３’－ＯＨにおいて結合しており、他端において基板の表面に結合している。開裂可能なリンカー基は、同じように、アクチベーター基（環Ａ）を含有し、これは、適切な条件において加熱時に、分子をフラグメント化させて、それにより、基板の表面からオリゴヌクレオチドを離脱させる。フラグメンテーション反応は、高度に熱的に敏感であり、アクチベーター及びアクセプター基が互いに近接して連結されていることから、緩やかな条件下で生じる。これは、加熱プロセスには他の試薬を要さず、熱が印加されている間に生じ得る副反応の数を劇的に低減させることを意味する。熱的に開裂可能なリンカー又は熱的に開裂可能な保護基上のアクチベーター基（例えば、Ｎ）が十分に中和されると、溶媒の存在下で加熱することによって熱的開裂を達成することができる。
熱的に開裂可能なリンカーは、任意の適切な位置において、例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｘ、Ｙ又はＡ基のうちの１つにおいて、基板の表面に結合することができる。好ましくは、熱的に開裂可能なリンカーは、Ｒ７又はＹにおいて、より好ましくはＹにおいて表面と共有結合している。特に、熱的に開裂可能なリンカーは、Ｙが

である場合、
好ましくはリンカー基Ｌ０を介して、Ｙにおいて表面と共有結合している。好ましくは、各Ｒ１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ＰＧ及びＡは、同じである。
本発明のいずれかの態様において、熱的に開裂可能な保護基Ｌ－１’又は式（Ｌ－１）の熱的に開裂可能なリンカーは、好ましくは、式（Ｌ－ＩＡ）又は（Ｌ－ＩＢ）：

を有する。
成長中のオリゴヌクレオチド上のホスホロアミダイト試薬及びその後のホスフェートは、ホスホロアミダイト試薬上の熱的に開裂可能な保護基のためのＰＧに直交性である保護基によって保護される。好ましくは、ホスホロアミダイトのための保護基は、２－シアノエチル等の塩基に不安定な保護基、アリル等のパラジウムに不安定な保護基、又はトリメチルシリルエチル［Wada, T.; Sekine, M. Tetrahedron Lett.1994, 35, 757-760を参照］、２－ジフェニルメチルシリルエチル［（ａ）Hayakawa, Y.;Uchiyama, M.; Kato, H.; Noyori, R. Tetrahedron Lett.1985, 26, 6505-6508. （ｂ）Hayakawa, Y.; Kato, H.;Uchiyama, M.; Kajino, H.; Noyori,R. J. Org. Chem. 1986, 51, 2400-2402. （ｃ）Hayakawa, Y.;Kato, H.; Nobori, T.; Noyori,R.; Imai, J. Nucleic Acids Res. Ser.
1986, 17, 97-100. （ｄ）Hayakawa, Y.; Wakabayashi, S.;Kato, H.; Noyori, R. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112,1691-1696. （ｅ）Hayakawa, Y.; Hirose, M.; Noyori, R. J. Org. Chem. 1993, 58, 5551-5555. （ｆ）Hayakawa, Y.; Hirose, M.; Noyori, R.Nucleosides Nucleotides 1994, 13, 1337-1345. （ｇ）Bergmann,F.; Kueng, E.; Laiza,
P.; Bannwarth, W. Tetrahedron Lett. 1995, 51,6971-6976を参照］等のフッ化物に不安定な基である。好ましくは、保護基は、パラジウムに不安定な保護基である。
好ましくは、ホスフェート上の保護基は、脱保護／カップリングサイクル中、安定である。
この式（Ｉ）の化合物は、アクチベーター基（環Ａ）を含有し、これは、適切な条件において加熱時に、分子をフラグメント化させて、成長中のオリゴヌクレオチドフラグメント上の５’－ヒドロキシ基を、入ってくるホスホロアミダイト試薬と自由に反応させておく。フラグメンテーション反応は、高度に熱的に敏感であり、アクチベーター及びアクセプター基が互いに近接して連結されていることから、緩やかな条件下で生じる。これは、加熱プロセスには他の試薬を要さず、熱が印加されている間に生じ得る副反応の数を劇的に低減させることを意味する。さらに、このアクチベーター基は、それ自体が保護され得、故に、保護基を非反応性状態でロックする。相Ｉについて上記で論じた通り、保護基のアンロックは、熱的に又は非熱的に制御された方式のいずれかで行うことができる。アンロックされた保護基が、入ってくるホスホロアミダイト試薬と反応することができる場合、熱的に制御されたアンロックが要される。これは、熱制御がなければ、表面結合した５
’－ヒドロキシ保護基のすべてが同時にアンロックされることになるためである。アンロックされた保護基が、入ってくるホスホロアミダイトと反応することができない場合、熱制御は要されない。プロセスの全体長さの観点から、反応の高レベルの熱制御がより長い反応時間と本質的に関係しているため、熱的に制御されたアンロックステップを有さないことが有利である。したがって、好ましいアクチベーター基は、十分に塩基性、つまり主にプロトン化形態であり、したがって、ホスホロアミダイト反応を触媒するために使用される酸性条件下で非求核性である。
ヌクレオシド間ホスフェート部分上の保護基は、好ましくは、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ，allyloxycarbonyl）、ｐ－ニトロシンナミルオキシカルボニル（Ｎｏｃ，p-Nitrocinnamyloxycarbonyl）、シンナミルオキシカルボニル（Ｃｏｃ，cinnamyloxycarbonyl）又はプレニルカルバメート等のパラジウムに不安定な保護基である。加えて、環外窒素保護基は、同時に、すなわちオリゴヌクレオチドフラグメント合成が完了した後であるが表面からの開裂前に除去を要するため、好ましいアンロック条件は、両方の合わせた除去に直交性である。従来のホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドフラグメント合成において使用される環外窒素保護基は、強塩基性条件下で除去され、これは、提案されるリンカーも開裂する。したがって、好ましい環外窒素保護基は、ホスフェート保護基と同じ条件下で除去される保護基（例えば、Ａｌｌｏｃ、Ｎｏｃ、Ｃｏｃ又はプレニルカルバメート等のパラジウムに不安定な保護基）である。それ故、好ましいアンロックステップは、ホスフェート又は環外保護基のいずれの時期尚早の除去も引き起こさない非塩基性条件下で行われる。したがって、ロックのために示唆される保護基は、例えば、有意な脱プリン化を引き起こさない適度な酸性条件下で開裂され得る（１－（１－アダマンチル）－１－メチルエトキシカルボニル（Ａｄｐｏｃ，(1-(1-Adamantyl)-1-methylethoxycarbonyl)、α，α－ジメチル－３．５－ジメトキシベンジルオキシカルボニル（Ｄｄｚ，α,α-dimethyl-3.5-dimethoxybenzyloxycarbonyl）又は同様の保護基等）。最も好ましいアンロックステップは、酸性条件下で行われる。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、環Ａは、各出現において、同じであっても異なっていてもよく、それぞれ上記で定義されている通りのヘテロ環式基を表す。より好ましくは、環Ａは、４～１２員の単、二又は三環式、好ましくは単又は二環式窒素含有ヘテロ環式基を表し、これは、窒素に加えて、Ｎ、Ｏ又はＳ、好ましくはＯ又はＮから選択される１又は２以上の他のヘテロ原子を含有していてよい。好ましくは、環Ａは、４～８員の単環式ヘテロ環式基を表す。より好ましくは、環Ａは、５、６又は７員の単環式ヘテロ環式基を表す。他の好ましい実施形態において、環Ａは、ピペリジル、モルホリニル、ピロリジニル、チオモルホリニル及びイミダゾリルから選択されるヘテロ環を表す。さらに一層好ましくは、環Ａは、ピペリジル、ピロリジニル又はイミダゾリルを表す。本発明のとりわけ好ましい実施形態において、環Ａは、ピペリジル又はピロリジニルを表す。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、－Ｃ（Ｒ３）（Ｒ４）の各出現において、Ｒ３又はＲ４の両方がヒドロカルビルであるか、或いはＲ３又はＲ４の一方がヒドロカルビルであり、他方がＨであるか、或いはＲ３及びＲ４の両方がＨを表す。好ましくは、Ｒ３又はＲ４の一方がヒドロカルビルであり、他方がＨであるか、或いはＲ３及びＲ４の両方がＨを表す。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、ｎは、０、１又は２、好ましくは、０又は１を表す。最も好ましくは、ｎは、１を表す。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、基Ｘは、Ｈ又はヒドロカルビルであり、ヒドロカルビルは、上記で定義されている通りのアルキル、アリール及びアリールアル
キルからなる群から選択される。好ましくは、Ｘは、Ｈ又はアリールであり、より好ましくは、Ｘは、Ｈ又はフェニルである。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、好ましくは、基Ｒ７は、Ｈである。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、好ましい基Ｒ１及びＲ２は、好ましくは、Ｈである。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、好ましくは、基Ｒ３及びＲ４は、Ｈである。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、好ましくは、基Ｒ５は、Ｈである。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、保護基ＰＧの少なくとも１つが開裂される活性化ステップは、好ましくは、ｐＨの変化、温度、放射線によって、若しくは化学的活性剤によって、又はそれらの組合せによって達成される。好ましくは、少なくとも１つの保護基ＰＧの開裂は、ｐＨ、温度、化学的活性化剤によって、又はそれらの組合せによって活性化することができる。
好ましい実施形態において、少なくとも１つの保護基ＰＧは、活性剤の存在下で、熱的に開裂可能である。典型的には、少なくとも１つの保護基ＰＧは、活性剤の非存在下で、熱的に開裂可能ではない。好ましくは、活性剤は、酸又は塩基である。本発明のいずれかの態様又は実施形態に従い、ＰＧ基が開裂され得る条件は、熱的に開裂可能なリンカー又は保護基を開裂する分子内環化を達成する条件とは異なる。保護基は、活性化及び放出のための２つの異なる条件を可能にするように選択され得る。
一実施形態において、少なくとも１つの保護基ＰＧは、酸の存在下で熱的に開裂可能であり、リンカーの分子内環化及び開裂は、塩基の存在下で加熱することによって達成される。この実施形態において、酸開裂可能な保護基ＰＧは、Ｎ－プロトン化中間体をもたらすＰＧ基の脱保護につながる。それからＮ－プロトン化中間体は、脱プロトン化がすなわち塩基との反応によって生じるまで、リンカー開裂を達成することができない。溶液相プロセスにおいて、脱プロトン化は、緩緩衝液中でのプロセスの第２のステップを行う前に、例えば、塩基性冷水溶液後処理を用いて行うことができる。代替として、プロセスの第２のステップに使用される塩基は、脱プロトン化を達成するため並びにリンカーの分子内環化及び開裂を容易にするための両方に十分塩基性であることができる。固相プロセスにおいて、Ｎ－プロトン化中間体を脱プロトン化するために十分強い過剰の有機塩基を、第２のステップに使用する緩衝溶液に添加することができ、又はより塩基性の緩衝液を使用することができる。故に、酸開裂可能な保護基の使用は、脱保護（すなわち、ＰＧ除去）及び開裂（分子内環化）ステップのそれぞれにおいて、異なるレベルの直交度を与える。好ましくは、酸開裂可能な保護基ＰＧが除去されるｐＨ（ｐＨ１、ｐＨ１は７未満である）及び塩基媒介分子内環化が達成されるｐＨ（ｐＨ２、ｐＨ２は７を超える）は、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、又は少なくとも約１０ｐＨ単位だけ異なる。好ましくは、保護基ＰＧが除去される及びリンカーの分子内環化／開裂が達成されるｐＨにおける差異は、約２～約１０、約３～約７、約３～約７又は約４～約７又は約５～約６ｐＨ単位である。
酸の存在下で開裂可能である好ましいＰＧ基は、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ，tert-butyloxycarbonyl）、トリチル（Ｔｒｔ，trityl）、ベンジルオキシカルボニル、α，α－－ジメチル－３，５－ジメトキシベンジルオキシカルボニル（Ｄｄｚ，
dimethoxybenzyloxycarbonyl）、２－（４－ビフェニル）イソプロポキシカルボニル（Ｂｐｏｃ，2-(4-biphenyl)isopropoxycarbonyl）、２－ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ，2-nitrophenylsulfenyl）、トシル（Ｔｓ，tosyl）から選択される。より好ましくは、酸開裂可能な保護基は、Ｂｏｃ及びＴｒｔから選択される。
代替として、別の実施形態において、少なくとも１つの保護基ＰＧは、塩基の存在下で（例えば、温度Ｔ１で）熱的に開裂可能であり、リンカーの分子内環化及び開裂は、さらに加熱することによって（例えば、温度Ｔ２で）達成される。温度における差異（すなわち、Ｔ２－Ｔ１）は、少なくとも約２０℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約３０℃、少なくとも約３５℃、少なくとも約４０℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、少なくとも約７０℃又は少なくとも約７５℃であってよい。好ましくは、保護基ＰＧが除去される及びリンカーの分子内環化／開裂が生じる温度における差異は、約３０℃～約１００℃、約４０℃～約９０℃、約５０℃～約８０℃又は約５５℃～約７５℃である。
塩基の存在下で開裂可能な好ましいＰＧ基は、（１，１－ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン－２－イル）メチルオキシカルボニル（Ｂｓｍｏｃ，1,1-dioxobenzo[b]thiophene-2-yl)methyloxycarbonyl）、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ，9-fluorenylmethoxycarbonyl）、（１，１－ジオキソナフト［１，２－ｂ］チオフェン－２－イル）メチルオキシカルボニル（α－Ｎｓｍｏｃ，1,1-dioxonaphtho[1,2-b]thiophene-2-yl)methyloxycarbonyl）、２－（４－ニトロフェニルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｎｓｃ，2-(4-nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl）、２，７－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｆｍｏｃ、２－フルオロ－Ｆｍｏｃ、２－モノイソオクチル－Ｆｍｏｃ（ｍｉｏ－Ｆｍｏｃ，2-monoisooctyl-Fmoc）及び２，７－ジイソオクチル－Ｆｍｏｃ（ｄｉｏ－Ｆｍｏｃ，2,7-diisooctyl-Fmoc）、２－［フェニル（メチル）スルホニオ］エチルオキシカルボニルテトラフルオロボレート（Ｐｍｓ，2-[phenyl(methyl)sulfonio]ethyloxycarbonyl tetrafluoroborate）、エタンスルホニルエトキシカルボニル（Ｅｓｃ，ethanesulfonylethoxycarbonyl）、２－（４－スルホフェニルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｓｐｓ，2-(4-sulfophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl）、アセチル（Ａｃ，Acetyl）、ベンゾイル（Ｂｚ，benzoyl）、ＣＦ３Ｃ（＝Ｏ）－トリフルオロアセトアミドから選択され、好ましくは、塩基開裂可能な保護基は、Ｂｓｍｏｃ、Ｆｍｏｃ、α－Ｎｓｍｏｃ、ｍｉｏ－Ｆｍｏｃ、ｄｉｏ－Ｆｍｏｃから選択され、より好ましくは、Ｂｓｍｏｃである。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、ＰＧは、好ましくは、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ及びＢｓｍｏｃからなる群から選択される。
本発明の別の実施形態において、ＰＧは、開裂可能な保護基であることができ、これは、好ましくは、パラジウム触媒及びアリルスカベンジャーの存在下で開裂可能であり、好ましくは、ＰＧは、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）である。
本発明のいずれかの態様又は実施形態に従い、基Ｙは、好ましくは、上述した通りのヒドロカルビルである。好ましくは、本発明は、少なくとも１つのＹ基がヒドロカルビルである化合物を包括し、少なくとも１つのＹは、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アルカリールであり、前記アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル又はアルカリール基は、末端アルキニル基で置換されている。アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アルカリール及びアルキニルという用語は、定義されている通りである。特に、この実施形態において、少なくとも１つのＹ基は、末端アルキニル基で置換されている、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アルカリールであり、末端アルキン基は、Ｃ２－Ｃ６アルキニル基、より好ましくはＣ２－Ｃ４アルキニル基、最も好ましくはエチニルである。別の実施形態において、少なくとも１つのＹ基は、アルキニル基で置
換されているアラルキルであり、より好ましくは、１つのＹ基は、ＣＨ２－（Ｃ６Ｈ４）ＣＨ≡ＣＨである。
本発明において使用される開裂可能な保護基及び開裂可能なリンカーは、第１の反応条件下で開裂可能であり、それにより脱保護されたリンカーを生成し、脱保護されたリンカーが、第２の異なる反応条件下で分子内環化及び開裂を受けることができ、二酸化炭素を放出して、式（II）：

の化合物を生成し、それにより、開裂可能なリンカーから有機部分を放出する、保護基ＰＧの少なくとも１つを含む。
好ましくは、本発明で使用される開裂可能な保護基又は開裂可能なリンカーにおいて、Ｘは、Ｈ、又はアルキル、アリール及びアリールアルキルからなる群から選択されるヒドロカルビルであり、好ましくは、Ｘは、アリールであり、より好ましくは、Ｘは、フェニルであり、アルキル、アリール又はアリールアルキルは、上記で定義されている通りである。好ましくは、Ｙは、ベンジルである。代替として、Ｙは、

［式中、各Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、水素を表し、両方の保護基ＰＧは、同じであり、両方の環Ａは、同じである］であってよい。Ｙは、好ましくは、５’－ＯＨ保護基において、

である。Ｙは、好ましくは、開裂可能なリンカーのためのヒドロカルビルである。
好ましい実施形態において、開裂可能な保護基又は開裂可能なリンカーの環Ａは、ピペリジニル又はピロリジニルを表す。
好ましい開裂可能なリンカーは、（Ｌ－ＩＡ）及び（Ｌ－ＩＢ）：

からなる群から選択される。
熱的に開裂可能なリンカー基については、とりわけＹがヒドロカルビルであるＬ－ＩＡが好ましい。
熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基については、（Ｌ－ＩＢ）が好ましい。
好ましくは、上記の開裂可能な保護基又は開裂可能なリンカーにおいて、保護基ＰＧの少なくとも１つは、第１の反応条件下で開裂可能であり、それにより脱保護されたリンカーを生成し、脱保護されたリンカーは、第２の異なる反応条件下で分子内環化及び開裂を受けることができ、二酸化炭素を放出して、それぞれ式（IIＡ）及び（IIＢ）：

［式中、（IIＢ）におけるＰＧ’は、水素、又は窒素のための開裂可能な保護基である］の対応する化合物を生成し、それにより、オリゴヌクレオチドを脱保護する又は表面からオリゴヌクレオチドを放出する。
好ましくは、化合物（IIＢ）中のＰＧ’は、水素である。
好ましくは、環Ａは、４～１２員の単、二又は三環式、好ましくは単又は二環式窒素含有ヘテロ環式基を表し、これは、窒素に加えて、Ｎ、Ｏ又はＳ、好ましくはＯ又はＮから選択される１又は２以上の他のヘテロ原子を含有してよい。より好ましくは、環Ａは、４～８員の単環式ヘテロ環式基を表す。特に、環Ａは、５、６又は７員の単環式ヘテロ環式基を表す。
具体的には、環Ａに好ましい基は、ピペリジル、モルホリニル、ピロリジニル、チオモルホリニル及びイミダゾリルからなる群から選択されるヘテロ環式基である。さらなる好ましい実施形態において、環Ａは、ピペリジル、ピロリジニル又はイミダゾリルを表す。最も好ましくは、環Ａは、ピペリジル又はピロリジニルを表す。
好ましい実施形態において、上記の開裂可能な保護基又は開裂可能なリンカーは、すべてＨである、Ｒ３及びＲ４基を含む。
好ましくは、本発明のいずれかの態様に従う開裂可能な保護基又は開裂可能なリンカーにおいて、ｎは、０、１又は２であり、好ましくは、ｎは、０又は１であり、最も好ましくは、ｎは、１である。
開裂可能な保護基又は開裂可能なリンカーの好ましい実施形態において、Ｘは、Ｈ又はヒドロカルビルであり、ヒドロカルビルは、アルキル、アリール及びアリールアルキルか
らなる群から選択され、アルキル、アリール及びアリールアルキル（arylkyl）は、上述されている。好ましくは、Ｘは、アリールであり、より好ましくは、Ｘは、フェニルである。
開裂可能な保護基又は開裂可能なリンカーの好ましい実施形態において、Ｒ５は、好ましくは、水素である。
開裂可能な保護基又は開裂可能なリンカーの好ましい実施形態において、Ｘは、Ｈ又はヒドロカルビルであり、ヒドロカルビルは、上記で定義されている通り、アルキル、アリール及びアリールアルキルからなる群から選択され、好ましくは、Ｘは、アリールであり、より好ましくは、Ｘは、フェニルである。
開裂可能な保護基又は開裂可能なリンカーの好ましい実施形態において、Ｒ７は、Ｈである。
本発明のこの態様の開裂可能な保護基又は開裂可能なリンカーの好ましい実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、Ｈである。
本発明のこの態様の開裂可能な保護基又は開裂可能なリンカーの好ましい実施形態において、Ｒ３及びＲ４は、両方とも水素である。
本発明において使用される化合物は、後述するプロセスによって調製することができる。プロセスは、多種多様な異なる保護基ＰＧを有する化合物の効率的な及び容易な調製を可能にする。上記で論じた通り、異なる保護基の使用は、活性化及び開裂ステップの微細な制御を可能にし、リンカー基のみが活性化され、その後、特異的な反応条件下で放出されることを確実にする。
以下に提示する通り、本発明において使用される化合物の調製のためのプロセスは、共通中間体からの保護基ＰＧの好都合な修飾を可能にするために開発された。プロセスは、ケトン又は保護されたアルコールを含有するヘテロ環式化合物から出発する（下記のスキーム１１～１３を参照）。ケトン置換ヘテロ環式化合物の使用は、Ｒ３若しくはＲ４置換基の一方がヒドロカルビルであり、他方が水素である、又はＲ３及びＲ４の両方が水素である、本発明において使用される化合物の調製を可能にする。Ｒ３及びＲ４の両方がヒドロカルビルである化合物は、保護された第三級アルコールを含有するヘテロ環式出発材料から調製することができる。
ケトンを含有する出発ヘテロ環式化合物は、対応するワインレブアミドのグリニャール反応により、２ステップで調製することができる。ワインレブアミドは、対応するカルボン酸の、Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩との、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ，benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphate)又は１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ，1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）等のペプチドカップリング試薬の存在下での反応［Nahm, S.; Weinreb, S. M. (1981), "N-methoxy-n-methylamides as effective acylating agents",Tetrahedron Letters, 22: 3815, doi:10.1016/s0040-4039(01)91316-4を参照］、続いて、アルキルマグネシウムブロミド（例えば、メチルマグネシウムブロミド）等の適切なグリニャール試薬との反応により、以下：

で描写される通りに調製することができる。
出発材料は、環窒素において、適切な保護基ＰＧ＊で保護される。保護基ＰＧ＊は、適当な場合、最終化合物におけるＰＧ保護基に対応し得る。しかしながら、典型的には、保護基ＰＧ＊は、以下のスキームに示される通り、最終化合物又は組成物において、除去され得る及び所望の保護基ＰＧで置きかえられ得るようなものが選択される。
特に、ＰＧ＊保護基は、出発ヌクレオシド又はヌクレオチドが開裂可能なリンカーとカップリングされるその後のカップリング反応に安定であるべきである。ＰＧ＊保護基は、その後のカップリング反応において用いられる条件に不安定であるべきではない。典型的には、開裂可能なリンカーと結合している出発ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む化合物を形成するためのカップリング反応は、塩基性条件で行われる。それ故、ＰＧ＊保護基は、好ましくは、塩基性条件に不安定ではない。例えば、ＰＧ＊保護基は、好ましくは、Ｂｏｃ又はＡｌｌｏｃであってよい。
Ｒ３及びＲ４が両方ともヒドロカルビルである化合物について、第三級アルコールを含有するヘテロ環式出発材料が用いられる。環窒素は、保護基ＰＧ＊で保護され、その後、ヒドロキシル基は、適切な脱離基、例えば、トシレート又はメシレート：

に誘導体化される。
下記のスキームは、本発明において使用するための熱的に開裂可能なリンカー及び保護基を調製するための好ましいプロセスについて記載する。
スキーム１１：Ｙ＝ヒドロカルビルである、式（Ｌ－Ｉ）の化合物

上記のスキーム１１は、Ｙがヒドロカルビルである、単一の活性化基（ＰＧ）を含有する化合物の合成を例証するものである。合成は、ケトン又は保護されたアルコール（最終化合物中のＲ３／Ｒ４置換基に応じて）を含有するヘテロ環式出発材料の、アミンアルコールとの還元的アミノ化又は置換反応を含む。
次いで、還元的アミノ化又は置換反応から得られた化合物を、３’位において適切に保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドに、カップリング剤を使用して［例えば、好ましくは、１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ，1,1'-carbonyldiimidazole）／１
，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ，1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene）カップリング系を使用して］、カップリングする。次いで、３’－保護基を除去し、化合物をホスホロアミダイト試薬に変換する。
スキーム１２：Ｙ＝

であり、Ｒ３－５、ＰＧ及びＡが同じである、式（Ｌ－Ｉ）の化合物

上記のスキーム１２は、Ｙが

であり、Ｒ３～Ｒ５、ＰＧ及びＡが同じである、２つの活性化基（ＰＧ）を含有する式Ｌ－Ｉの化合物の合成について例証するものである。
合成は、ケトン又は保護されたアルコール（最終化合物中のＲ３／Ｒ４置換基に応じて）を含有するヘテロ環式出発材料の、アミンアルコールとの還元的アミノ化又は置換反応を含む。還元的アミノ化又は置換は、２当量のヘテロ環式出発材料を用いて行われる。
次いで、還元的アミノ化又は置換反応から得られた化合物を、３’位において適切に保護されたヌクレオシド又はヌクレオチドに、カップリング剤を使用して［例えば、好ましくは、１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）／１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）カップリング系を使用して］、カップリングする。次いで、３’－保護基を除去し、化合物をホスホロアミダイト試薬に変換する。
スキーム１３：Ｙ＝

であり、Ｒ３－５、ＰＧ及びＡが異なる、式（Ｌ－Ｉ）の化合物

上記のスキーム１３は、Ｙが

であり、Ｒ３－５、ＰＧ及びＡが異なる、２つの活性化基（ＰＧ）を含有する式Ｌ－Ｉの化合物の合成を例証するものである。
合成は、ケトン又は保護されたアルコール（最終化合物中のＲ３／Ｒ４置換基に応じて）を含有するヘテロ環式出発材料の、アミンアルコールとの還元的アミノ化又は置換反応を含む。
ヘテロ環式出発材料は、環窒素において、適切な保護基ＰＧ１（好ましくは、その後のカップリング反応に安定である、ＢＯＣ又はＡｌｌｏｃ）で保護される。
得られた化合物を、第１のステップのようにケトン又は保護されたアルコールを含有するが保護基ＰＧ１が異なる（例えば、ＢＯＣ又はＡｌｌｏｃの他方）、ヘテロ環式出発材料を使用する第２の還元的アミノ化又は置換ステップに供する。
得られた化合物の、ヌクレオシド又はヌクレオチドとのカップリングは、２つの異なるＰＧ保護基を含有する化合物をもたらす。次いで、３’－保護基を除去し、化合物をホスホロアミダイト試薬に変換する。
上記のプロセスは、例えば、熱的に開裂可能なリンカーの表面との結合を可能にするために、適切な官能基の適当な誘導体化及び組み込みによって修正することができる。加えて、熱的に開裂可能なリンカーとの又は反応性部分とのその結合を可能にするために、表面を適切な官能基で誘導体化してよい。
以下のスキーム１３Ａは、５’－ＯＨ保護基を含む二量体ホスホロアミダイト試薬（すなわち、ジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト）の合成について例証するものであり、これは、本発明のオリゴヌクレオチド合成プロセスのステップ（iii）及び／又は（ｖ）において使用され得る：
スキーム１３Ａ：５’－ＯＨ保護ジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトの合成



上記のスキーム１３Ａにおいて、ホスホロアミダイト（phoshoramidite）／ホスフェート上の保護基Ｐ４は、好ましくは、アリル等のパラジウムに不安定な保護基である。故に、ＰＧ２基の脱保護の後、化合物は、例えば、ジクロロリン酸アリルエステルと反応して、感熱的に（therosensitively）保護された塩基との反応により、アリルリン酸トリエチルアンモニウム塩を形成し得る。得られたホスホロアミダイトの、塩基との、１－メシチレンスルホニル－３－ニトロ－１，２，４－トリアゾール（ＭＳＮ，1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole）の存在下での反応により、ジ－ヌクレオチドを提供し、これを、例えばアリルオキシ［ビス（ジアルキルアミノ）］ホスフィン（好ましくは、アリルオキシ［ビス（ジイソプロピルアミノ）］ホスフィン）との反応によって、ホスホロアミダイトに変換する。三量体（５’－ＯＨ保護トリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトは、２つのヌクレオチド間結合反応、続いて、ホスホロアミダイトへの変換を行うことによって、同じように行われ得る。
熱的に開裂可能なリンカーの、表面との結合は、上述した表面結合手段によって実現することができる。
リンカー結合のために、適当な熱的に開裂可能なリンカーを調製し、リンカーフラグメントには、上記の反応スキームに従い、適当に置換されている出発材料の使用により、適当な位置においてアルキニル置換基を用意する。上記で述べた通り、基板は、置換基群のいずれかを介してリンカーと結合することができる。例えば、基板は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｘ、Ｙ又はＡ位のいずれか１つにおいて結合してよい。
下記の反応スキーム（スキーム１４）は、３’位において表面に結合された開裂可能なリンカーを用いる、５’－ヒドロキシ保護第１のヌクレオシド又はヌクレオチドの付加に使用され得るプロセスを例証するものである。プロセスは、異なる５’－ヒドロキシ保護基及び異なるヌクレオシド又はヌクレオチド又は核酸塩基に合わせて容易に修正され得る。

下記の反応スキーム（スキーム１５）は、３’位において結合した熱的に開裂可能なリンカーを介して結合している反応性部分を用いる、市販されている又はその合成が文献において公知である出発材料からの、５’－ヒドロキシ保護第１のヌクレオシド又はヌクレ
オチドの調製のためのプロセスを例証するものである。プロセスは、異なる５’－ヒドロキシ保護基及び異なるヌクレオシド又はヌクレオチド又は核酸塩基に合わせて容易に修正され得る。

下記の反応スキーム（スキーム１６）は、成長中のオリゴヌクレオチドへのヌクレオシドビルディングブロック（好ましくは、５’－ＯＨ保護ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト）の付加、続いて、核酸塩基保護及びホスフェート保護の最後から２番目の脱保護、並びに最終的にリンカー開裂の前の開裂可能なリンカー基の熱的アンロックのためのプロセスを例証するものである。熱制御下でのリンカーの開裂は、基板の所定の部位におけるオリゴヌクレオチドの選択的及びクリーンな分離をもたらす。

下記の反応スキーム（スキーム１７）は、５’位において熱的に開裂可能な保護基で保護されたヌクレオシドからのヌクレオシドホスホロアミダイト試薬の調製のためのプロセスを例証するものである。得られたヌクレオシドホスホロアミダイト試薬を、例えば、ス
キーム１６において使用してよい。

熱制御
したがって、本発明は、複数の個々のオリゴヌクレオチドフラグメントからの核酸の合成を可能にする。これを実現するために、プロセスは、２つの別個の熱的に制御された化学プロセスを含むことができる。第一に、所要のオリゴヌクレオチドフラグメントのための各出発ヌクレオシド又はヌクレオチドを、熱的に開裂可能なリンカーを介して反応部位の表面に結合する［ステップ（ｉ）］。第二に、所望のポリヌクレオチドを構成している個々のオリゴヌクレオチドフラグメントを、熱制御（ステップ（ii）及び（iii）－熱的に制御された５’－ＯＨ脱保護及び５’－ＯＨ脱保護部位におけるカップリング）で合成する。本発明のいずれかの態様において、この相は、複数のポリヌクレオチドの並列合成のために行われてよい。第３の熱的に制御されたプロセスは、オリゴヌクレオチドフラグメント合成の完了時に、完成したオリゴヌクレオチドフラグメントの熱的に制御された放出を含み、これは、逐次輸送、精製及びライゲーションを、それ故、所望の核酸の合成を可能にする。
プロセス全体を通してすべて同じ化学試薬に曝露され得る基板の表面上の反応部位間の化学的分化を可能にするために、各部位において熱い又は冷たい温度を適用して、反応が生じるか否かを制御することができる。合成の終わりに、合成された有機化合物を単離するために、開裂可能なリンカーを基板と一緒に急速に及び選択的に除去することができる。
高度に選択的な５’－ＯＨ保護基除去を可能にする高度の熱制御、及び所望の部位のみにおける高度に制御されたカップリングにより、本発明の方法は、オリゴヌクレオチド配列の高度に正確な合成を可能にする。その上、欠失及びカップリングエラーは最小化される。したがって、本発明の方法は、例えば、欠失エラーを除去するために標準ホスホロアミダイト合成において用いられる通りの通常の「キャッピング」ステップを有することなく行われ得る。キャッピングステップの除去は、さらなる試薬へのオリゴヌクレオチドの曝露も低減させ、プロセスの全体時間及び効率も改善する。
温度制御デバイス
オリゴヌクレオチド合成及び放出の前述の熱制御を実現するために、基板は、チップ上に個々に熱的に対処可能な部位を含んでよく、それにより、
基板上のそれぞれの場所に位置する複数のアクティブ熱部位であり、各アクティブ熱部位が、前記媒体の対応する部位に可変量の熱を印加するように構成された加熱体、及び加熱体と基板の間に位置する断熱層を備える、複数のアクティブ熱部位と、
基板上の複数のアクティブ熱部位の間に位置する１又は２以上のパッシブ熱領域であり、各パッシブ熱領域が、媒体の対応部から基板へ熱を伝導するように構成された熱伝導層を備える、１又は２以上のパッシブ熱領域と
を含む、基板の複数の部位において温度を制御するための温度制御デバイスを提供し、
前記１又は２以上のパッシブ熱領域の熱伝導層は、前記複数のアクティブ熱部位の断熱層よりも基板の平面に垂直な方向において、より低い熱抵抗を有する。
基板の複数の部位において温度を制御するための方法は、
基板上のそれぞれの場所に位置する複数のアクティブ熱部位及び基板上の複数のアクティブ熱部位間に位置する１又は２以上のパッシブ熱領域を備える温度制御デバイス上に、媒体を用意するステップであり；
各アクティブ熱部位が、前記媒体の対応する部位に可変量の熱を印加するように構成された加熱体、及び加熱体と基板の間に位置する断熱層を備え；
各パッシブ熱領域が、媒体の対応部から基板へ熱を伝導するように構成された熱伝導層を備え；
前記１又は２以上のパッシブ熱領域の熱伝導層が、前記複数のアクティブ熱部位の断熱層よりも基板の平面に垂直な方向において、より低い熱抵抗を有する
ステップと；
複数のアクティブ熱部位の加熱体によって印加される熱の量を制御して、媒体の前記複数の部位において温度を制御するステップと
を含むことができる。
本発明のいずれかの態様又は実施形態において、温度制御デバイスは、
基板上のそれぞれの場所に複数のアクティブ熱部位及び基板上の複数のアクティブ熱部位間に位置する１又は２以上のパッシブ熱領域を形成するステップであり；
各アクティブ熱部位が、前記媒体の対応する部位に可変量の熱を印加するように構成された加熱体、及び加熱体と基板の間に位置する断熱層を備え；
各パッシブ熱領域が、媒体の対応部から基板へ熱を伝導するように構成された熱伝導層を備え；
前記１又は２以上のパッシブ熱領域の熱伝導層が、前記複数のアクティブ熱部位の断熱層よりも基板の平面に垂直な方向において、より低い熱抵抗を有する
ステップを含むプロセスによって製造することができる。
図１６～３０は、温度制御デバイスについてより詳細に記載する。
媒体の複数の部位において温度を制御するための温度制御デバイスは、基板上のそれぞれの場所に位置する若干数のアクティブ熱部位であり、各アクティブ熱部位が、媒体の対応する部位に可変量の熱を印加するための加熱体を備える若干数のアクティブ熱部位、及び加熱体と基板の間に位置する断熱層を備える。１又は２以上のパッシブ熱領域は、基板上のアクティブ熱部位間に位置し、各パッシブ熱領域が、媒体の対応部から基板へ熱を伝導するための熱伝導層を備える。パッシブ冷却領域の熱伝導層は、アクティブ熱部位の絶縁層よりも基板の平面に垂直な方向において、より低い熱抵抗を有する。使用中に、基板は、ヒートシンクとして作用することができる（基板を室温に曝露させることによって、又は、より低い温度が要される場合、基板の冷却を提供することによってのいずれかで）
。それ故、パッシブ領域内の熱伝導層は、パッシブ領域がアクティブ熱部位間の領域において媒体の冷却を提供できるようにし、そのため、アクティブ熱部位自体によって提供される冷却の必要性が少ない。これは、アクティブ熱部位を加熱するためにより効率的であるように設計することを可能にし、何故なら、より高い熱抵抗を有する断熱層は、冷却を支持するためにそれほど多くの熱を基板に通過させることをもはや要しないため、加熱体及び基板の間で使用され得るからである。これは、加熱中に基板へ失われる熱が少なくなり、したがって、デバイスによって支持される温度範囲全体がより高くなり得ることを意味する。
これは、加熱／冷却の唯一の供給源であり、各部位が、可変熱出力を持つ加熱器を有し、加熱器からの熱が、ヒートシンクとして作用する基板へ失われる熱よりも少ない場合に冷却が提供される（アクティブ部位と同じ又はそれよりも高い熱抵抗を有するアクティブ部位間に境界がある）、若干数のアクティブ部位を提供するであろう代替的アプローチと対比され得る。しかしながら、このアプローチに関連する問題は、所与のアクティブ部位より上の媒体が比較的低温であるがさらなる冷却が依然として要される場合、アクティブ部位から基板への熱流が比較的低いであろうこと（熱流は熱流路全体にわたる温度差によって決まるため）、及び、さらなる冷却を実現するために、アクティブ部位の材料は、低温で基板への十分な熱流がある十分に低い熱抵抗を必要とするであろうことである。他方で、媒体上の対応する部位における温度が比較的高い場合、加熱部位全体にわたる温度差は、はるかに高いであろうから、基板へ失われる熱の量も大きいであろう。したがって、媒体の対応する部位をさらに高温まで加熱するために、これは、下の基板へ失われる熱を相殺するために加熱体に印加される多量の動力を要するであろう。実際に、加熱体によって支持される最大動力は、設計制約により限定され得る。それ故、完全加熱／冷却機能性を提供するために同じ部位を使用するアプローチは、媒体の所与の部位において制御され得る温度の範囲内に限定されることになる。
対照的に、本発明の技術により、アクティブ熱部位間のパッシブ熱領域は、アクティブ部位における加熱体及び基板間の断熱層よりも熱伝導性である層を包含する。冷却はパッシブ熱領域によって提供され得るため、これは、アクティブ部位が、それほど多くの冷却を提供する必要がないのであるから、より断熱性の高い材料から作製することができ、そのため、アクティブ部位における基板へ失われる熱が少なくなることから、加熱体のより多くの動力を媒体自体を加熱するために使用できることを意味する。それ故、提供される所与の量の冷却及び加熱体から利用可能な所与の動力について、実現可能な最高温度は、上記で論じた代替的アプローチと比較して、上昇させることができる。それ故、温度制御デバイスを使用して、より広範囲の温度を、各部位において制御することができる。
パッシブ部位は、パッシブ部位において提供される冷却の量はそれら全体にわたる温度差によって決まることになる（これは、近隣のアクティブ部位における温度設定によって間接的に決まり得る）が、温度制御デバイスは、パッシブ部位における熱流の量を直接的に制御せず、代わりに、熱伝導層が、所与の量の熱抵抗を熱流に単純に提供し、これは、アクティブ部位における断熱層よりも低い抵抗であるという意味で、パッシブである。アクティブ部位を使用して実現可能な温度の範囲を改善するのを助けるだけでなく、デバイスが流動流体内の温度を制御するために使用される場合、パッシブ領域は、流体が通過した先の部位における加熱の「履歴」効果を低減させるのを助けることもでき、これは、パッシブ領域が、流体を基板温度近くまで冷却して、所与のアクティブ部位に入る流体の温度の変動を低減させることができるからである。これは、各部位において加熱器を制御するための制御ループの必要なループゲインを低減させる（以下のさらなる考察を参照）。
他方で、アクティブ部位は、提供される加熱又は冷却の量が、加熱体によって提供される動力を変動させることによって制御され得るという意味で、アクティブである。それに
もかかわらず、アクティブ部位における媒体への又は媒体からの熱流の量は、加熱体によって提供される熱の量だけでなく、アクティブ部位周辺の温度によっても決まり、これは、加熱体からの熱がどの程度、基板へ又は周囲のパッシブ熱部位へ失われるかに影響し得る。
それ故、そのアクティブ熱部位において加熱体によって生成される熱の量が閾値よりも大きいか又は小さいかに依存して、選択されたアクティブ熱部位が、加熱体を使用する媒体の対応する部位の加熱又は断熱層を経由する基板への熱流による対応する部位の冷却のいずれを提供するかを制御するために、制御回路が提供されてよい。閾値は、基板又は周囲のパッシブ熱部位へ失われる熱を相殺するために、加熱体によって生成されなくてはならない熱の量を有効に表し得る。
この閾値は、基板の平面に垂直な方向におけるアクティブ熱部位の断熱層の熱抵抗を包含する、若干数の要因によって決まり得る。所与の最大加熱器動力について、支持される温度の範囲は、断熱層がより高い熱抵抗を有する場合よりもより低い熱抵抗を有する場合に、より低温の方へシフトされる傾向があるであろう。それ故、加熱体が媒体ヒートシンク以外の周囲のエリアへ失われる熱を相殺するバイアス点は、所与の熱抵抗を持つ絶縁層を選択することによって、慎重に制御することができる。それ故、異なる実施形態は、異なる熱抵抗を持つ絶縁材を選ぶことによって（例えば、それ自体異なる材料を選ぶことによって、又は、空隙を包含することによって等、所与の絶縁材の物理的構造を変動させることによって）、異なる用途（所要の温度範囲に応じて）のために設計されてよい。
閾値は、温度依存性であってもよく、例えば、より熱いアクティブ部位は、その全体にわたってより大きい温度差があることから、より冷たいアクティブ部位よりも基板へより多くの熱が失われる傾向があるであろう。それ故、アクティブ部位の温度に応じて、媒体への所与の量の熱流を実現するために、異なる量の動力が加熱体によって送達されることが必要な場合がある。これは、所与の温度設定を提供するための加熱体の制御をより複雑にする。
それ故、各アクティブ熱部位は、対応するアクティブ熱部位において温度を感知するための温度センサーを備えてよい。そのアクティブ熱部位の加熱体を制御するためのアクティブ熱部位の１つにそれぞれ対応する、若干数のフィードバックループが提供されてよい。各フィードバックループは、対応するアクティブ熱部位の温度センサーによって感知された温度及び媒体の対応する部位のために指定された目標温度に依存して、媒体の対応する部位に印加すべき熱の目標量を決定するための、伝達関数を実装してよい。次いで、さらなる関数（以下ではリニアライザ関数と称する）が、伝達関数によって決定された熱の目標量を、対応するアクティブ熱部位の加熱体を制御するための入力シグナルにマッピングし得る。リニアライザ関数は、対応するアクティブ熱部位の温度センサーによって感知された温度の関数であってよく、熱の目標量並びにアクティブ熱部位の加熱体から基板及び周囲のパッシブ熱領域へ失われる熱の量の和に依存して、入力シグナルを決定し得る。
アクティブ部位において測定された温度に依存して加熱器を制御するためのフィードバックループは、目標及び測定された温度間のエラーを加熱器入力シグナルに直接的にマッピングする単一の伝達関数を単純に実装するべきであると期待されるかもしれない。しかしながら、そのような制御ループを実際に実装することは極めて難易度が高いであろう。加熱器によって供給されたすべての熱が媒体自体に供給されるとは限らず、これは、アクティブ熱部位における断熱層を介して基板へ又はアクティブ熱部位周囲のパッシブ熱領域へ、若干の熱が失われるからである。周囲のエリアへ失われる熱の量は温度依存性であり、各部位は異なる温度であることができるため、失われる熱は部位によって変動する。それ故、プラントが、媒体への熱流よりもむしろ、加熱器によって提供される熱である伝達
関数において、ループゲインはアクティブ部位温度の関数となるであろうし、そのため、すべての考えられるアクティブ部位温度にわたって安定性及び正確さを確実にする独自のコントローラー（伝達関数）は存在しないであろう。
対照的に、加熱器の制御を２つの部分に分離することによって、安定な制御ループを設計することができる。制御の第１の部分は、測定された及び目標温度の間のエラーを、流体に供給される熱の目標量にマッピングする伝達関数である（その目標量の熱を提供するために加熱器をどのように制御するかは考慮せずに）。プラントが、加熱器によって供給される熱の量よりもむしろ媒体に供給される熱の目標量である場合、閉ループ制御伝達関数を提供することによって、部位の温度とは無関係にループゲインを作ることができ、これは、古典的制御理論に従って、ループを線形時不変系としてモデル化することを可能にする。他方で、その後のリニアライザ関数は、伝達関数によって決定された熱の目標量を、加熱器制御入力にマッピングする。リニアライザ関数は、所与のアクティブ部位における熱流のモデルに従って設計され得る（アクティブ部位の測定された温度に依存する）。温度依存性の熱損失を閉ループ伝達関数から引き出すことにより、ループゲインは、有効に「線形化される」（線形時不変系に近似される）ことができ、それ故、「リニアライザ関数」という用語である。これは、安定な制御ループの設計を可能にする。
リニアライザ関数を使用してアクティブ部位における熱流を既にモデル化することができるならば、何故閉ループコントローラーが提供されるのか－目標温度と加熱器によって供給される動力との間の関係を表す熱流モデルを閉ループ伝達関数なしに使用できるのだろうかと質問する人がいるかもしれない。しかしながら、所与の目標温度を設定するために媒体に供給されることが要される熱の量は、目標温度によってだけでなく、加熱される媒体の以前の温度によっても決まる（説明すべき若干の「履歴」がある）。固体媒体の加熱について、履歴は、所与のアクティブ部位における以前の温度設定によって決まる（経時的に変化し得る）。アクティブ及びパッシブ部位上を流れる流体媒体の加熱について、履歴は、現在のアクティブ部位に到達する前に流体が通過した他の部位において印加された加熱によって決まる。例えば、流体の所与の部分がより熱い部位からより冷たい部位へ流れる場合、温度を上昇させるための加熱よりもむしろ温度を低減させるための冷却を提供する必要があると予期するであろうし、一方で、さらに冷たい部位に続く場合には、第２の部位のための同じ目標温度設定は加熱を要し得る。パッシブ部位は、媒体を基板温度近くまで冷却することによって、温度履歴を「リセットする」のを助けることができるが、単純な熱流モデル単独では説明するのが難しいであろう履歴依存効果が依然としてある。目標／測定された温度間のエラーに依存するある特定の伝達関数に従って流体への熱の目標量が継続的に調整される、閉ループアプローチを使用することにより、これは、我々がより良好な温度制御を実現することを可能にする（媒体の以前の温度に関する実際の知識がないとしても、例えば、閉ループ伝達関数は、アクティブ部位に到着する流体の実際の温度を説明する必要がなく、これは依然として不明であってよい）。
リニアライザ関数に使用される関係は、以下の例においてより詳細に記載される通り、温度制御デバイスの熱的モデルの解析的インバージョンを表す関数として導出され得る。熱的モデルは、熱流、熱抵抗及び熱的質量の熱的特性が、電流、電気抵抗及び電気容量によってそれぞれ表されて、所要の非線形制御関数が電気回路への類推によって導出されることを可能にする、モデルであってよい。
特に、リニアライザ関数は、熱の目標量ｑｆｉを、所与のアクティブ熱部位の加熱体によって供給される熱の実際量ｑに、下記の関係：

［式中、
ｑｆｉは、所与のアクティブ熱部位において媒体に供給される熱の目標量（所与のアクティブ熱部位についての目標温度と所与のアクティブ熱部位の温度センサーによって感知された温度との間の差異の関数として決定される）を表し；
Ｔｉは、所与のアクティブ熱部位の温度センサーによって感知された温度を表し；
ＴＨＳは、基板（ヒートシンクとして作用する）の温度を表し；
Ｒｉｚは、基板の平面に垂直な方向におけるアクティブ熱部位の断熱層の熱抵抗を表す］；

［Ｒｉｘ及びＲｉｙは、基板の平面に平行な２つの直交性方向におけるアクティブ熱部位の断熱層の熱抵抗を表し；
Ｒｃｘ及びＲｃｙは、基板の平面に平行な２つの直交性方向におけるパッシブ熱領域の熱伝導層の熱抵抗を表し；
Ｒｃｚは、基板の平面に垂直な方向におけるパッシブ熱領域の熱伝導層の熱抵抗を表す］にしたがってマッピングし得る。
一部の例において、加熱体は、抵抗加熱体を含んでよい。熱電デバイス又は他の種類の加熱を使用してもよいが、抵抗加熱体は、より簡単に製造及び制御することができる。抵抗加熱体について、加熱体に印加される電流Ｉは、

［式中、ｑは、上記で定義されている通りのリニアライザ関数に従って決定され、ｒは、加熱体の抵抗である］
に従って決定されてよい。
一部の例において、アクティブ熱部位における断熱層は、基板の平面に垂直な方向よりも基板の平面に平行な方向において、より大きい熱抵抗を有し得る。断熱層を基板の厚さ全体にわたってよりも横方向に「漏れ」にくくすることは、断熱層が、基板への熱流によってアクティブ熱部位における所与の量の冷却を支持することを可能にするのに対し、周囲のパッシブ熱領域を介して寄生路を通って失われる熱の量を低減させる。パッシブ領域へ失われる熱の量を低減させることは、アクティブ素子における加熱をより効率的にする（所与の最大動力を支持する加熱器は、したがって、媒体のより高温を支持することができる）だけでなく、上記で論じた非線形制御関数を導出するための熱的モデルも単純化し、そのため、マッピング回路において実装することがそれほど複雑ではない、より簡単な方程式を使用することができる。断熱層が、横断方向よりも基板の平面に流れ込む方向においてより大きい熱抵抗を有するようにコンストラクトされ得る、若干数の手法がある。
例えば、絶縁層は、基板の平面に垂直な方向における断熱層の厚さｚが基板の平面に平行な方向におけるアクティブ熱部位の断熱層の最小寸法Ｌよりも実質的に小さい、薄膜構造を有し得る。例えば、ｚ／Ｌは、０．１未満であり得る。実際に、ｚ／Ｌは、０．１よりも小さく、例えば、０．０５未満又は０．０１未満とされ得る。概して、厚さが横寸法と比較して小さい場合、断熱層は、基板への熱流のために比較的大きいエリアを提示するが、周囲のパッシブ熱領域への熱流のためにははるかに小さいエリアを提示し、より効率的な加熱及びより簡単な非線形制御関数を提供することになる。薄膜アプローチは、いくつかの種類の絶縁材料に適切であることができる。
しかしながら、他の種類の絶縁材料は、厚さが低減された場合、平面に垂直な方向において十分な絶縁を提供するための十分な熱抵抗を有さない場合がある。例えば、二酸化ケイ素が絶縁体として使用される場合、その固有の熱伝導率は、断熱層が十分な絶縁を提供するためのものである場合、層をいかに薄くできるかを限定する場合がある。他の材料を選んでもよいが、二酸化ケイ素は、デバイスの他の部分のための基板として使用されるシリコンの酸化によって絶縁体を形成させることができるため、より簡単に製造することができる。同じように、所要の断熱特性を考慮すると薄膜アプローチ（単一の固体材料製）が実用的ではない場合がある他の材料もあり得る。
これは、少なくとも１つの空隙を備える断熱層を提供することによって対処され得る。空隙は、温度制御デバイスの筐体内の空気、別のガス又は真空の、孔又はポケットであることができる。空気又は真空の熱伝導率は固体絶縁体材料と比較して比較的高くなり得るため、若干の空隙を設けることは、面内及び交差面方向における熱抵抗を、固体材料の層において可能であるよりも慎重に制御させることができる。
一例において、空隙は、基板に実質的に垂直に伸長することができ、断熱層の他部は固体絶縁体材料製である。例えば、断熱層は、加熱体と基板との間のアクティブ熱部位のエリアにおいて基板の平面に実質的に垂直に伸長する第１の断熱材料の１又は２以上の支柱を備えてよく、空隙は、支柱の間又は周辺に位置していてよい。空隙及び支柱は、多種多様な外形を有してよく、絶縁層の全体の厚さを、又は厚みの一部を部分的にのみ、通過し得る。基板の平面に実質的に垂直に伸長する空隙及び支柱を設けることにより、これは、基板の平面に垂直な方向における比較的効率的な熱伝達を可能にすることができる（熱が、より伝導性の支柱をより簡単に通過することができるため）が、熱がパッシブ冷却領域の方へ横に流れることはより難しくなる場合があり、何故なら、横熱流は、空気、ガス又は真空の１又は２以上の空隙の交差を要するであろうからである。充填比率（支柱又は空隙が占める総面積の割合）を、面内及び交差面熱抵抗間に異なる比率を提供するように変動させて、加熱／冷却のためのバイアス点にわたる厳密な制御を得ることができる。
他方で、他の例は、加熱体と基板との間のアクティブ熱部位の実質的にエリア全体にわたって伸長する空隙を備える断熱層を提供し得る。それ故、いかなる支柱のいかなる必要性もない場合がある。断熱層は、全体がガス又は真空でできている層（アクティブ熱部位の縁における一部の固体境界以外）を本質的に含み得る。
空隙を持つ層を包含するデバイスの製造は、一次ウエハの第１の表面に設けられているデバイス層内に１又は２以上の空隙を形成すること、並びに、一次ウエハの第１の表面を、各アクティブ熱部位の加熱体及び各パッシブ熱領域の熱伝導層の少なくとも一部等の熱制御デバイスの他の素子を支持するための二次ウエハと結合することによって、実現することができる。空隙は、一次及び二次ウエハの結合の前又は後のいずれかに形成され得る。それ故、一次及び二次ウエハを結合することにより、温度制御デバイスの筐体内に空隙を形成することが可能である。
しかしながら、断熱層が支柱及び空隙を備える場合、支柱は、それを二次ウエハと結合する前に一次ウエハのデバイス層において形成することができ、一次ウエハ及び二次ウエハを結合した後、空隙は、デバイス層の反対側から第１の表面への支柱間のデバイス層部をエッチング除去することによって形成することができる。例えば、第１の断熱材料は、酸化物（例えば、二酸化ケイ素）を含んでよく、支柱は、デバイス層内において、デバイス層内に孔をエッチングし、孔の縁におけるデバイス層の材料を酸化して、支柱の壁を画定することによって形成され得る。一次ウエハは、第１の表面からデバイス層の反対側に埋め込み酸化物層を備えてよく、一次ウエハ及び二次ウエハを結合した後、一次ウエハを埋め込み酸化物層にエッチバックすることができ、孔を埋め込み酸化物層内の空隙の場所にエッチングすることができ、次いで、デバイス層の一部を、埋め込み酸化物層内の孔を介してエッチング除去して、空隙を形成することができる。次いで、埋め込み酸化物層内の孔を、さらなる酸化物を堆積させることによって充填して、孔を覆うことができる。このアプローチは、利用可能なシリコンＣＭＯＳ及びシリコンＭＥＭＳ工業プロセスを使用して柱状構造を製造することを可能にする。このアプローチにより、一次ウエハの第１の表面と埋め込み酸化物層との間のデバイス層の厚さは、断熱層における支柱の高さを決定することになり、一次ウエハ内にエッチングされた孔のサイズは、支柱のサイズ及びそれ故、支柱の空隙に対する充填比率を決定する。エッチング孔のサイズは、マスクを使用して変動させることができ、基板の平面に垂直及び平行な方向における熱抵抗間の比率に対する慎重な制御を可能にする。
温度制御デバイスは、基板を冷却してヒートシンクとして作用するための冷却機構を備えてよい。代替として、温度制御デバイスは、冷却機構なしに提供されてよく、外部冷却機構を使用してよい（例えば、温度制御デバイスは、基板を所与の温度に維持するための冷却デバイスと接触させた基板とともに置くことができる）か、又は基板を単純に室温で保持してよい。概して、基板の温度は、アクティブ熱部位において制御され得る最低温度を限定することから、特定の用途に応じて、異なる量の冷却が要され得る。
温度制御デバイスを使用して、固体表面内（例えば、半導体温度制御のため）又は静止流体中の部位を加熱することができるが、これは、流動流体内の種々の部位において温度を制御するために特に有用である。それ故、温度制御デバイスは、複数のアクティブ熱部位及び１又は２以上のパッシブ熱領域上の流体の流れを制御するための流体流動制御素子を備えてよい。例えば、化学反応を支持するために、流体の流れは反応のための試薬を供給してよく、試薬が種々のアクティブ熱部位及びパッシブ熱領域上を流れるにつれて、各部位における反応に合わせた所望の温度に加熱又は冷却され得る。例えば、温度を使用して、所与の部位における反応を誘引する否かを制御することができる。
一例において、アクティブ熱部位は、流体流動制御素子によって制御される流体流動の
方向に実質的に平行に配向された１又は２以上の列に位置してよい。各列は、２又は３以上のアクティブ熱部位を含んでよく、列の隣接するアクティブ熱部位の各対間にパッシブ冷却領域が位置している。列内に部位を位置させることで、デバイスの製造をより簡潔にすることができる。特に、２又は３以上の列がある場合、アクティブ熱部位をマトリックス構造内に配置することができ、これにより、制御シグナルを各部位に転送し、各部位において測定された温度を読み出すための個々の部位のアドレス指定を単純化することができる（例えば、列／カラムアドレス指定スキームを使用することができる）。
それ故、流体が温度制御デバイス全体にわたって流れる場合、流体の所与の部分は、流体流動方向に平行に配向されている列の１つに沿って流れることになる。流体のその部分は、所与のアクティブ熱部位と遭遇することになり、所与の温度まで加熱又は冷却され、次いで、パッシブ部位上を流れて冷却に供され、次いで、別のアクティブ熱部位と遭遇し、列に沿って通過するにつれて、第１のアクティブ熱部位等とは異なる温度まで加熱又は冷却され得る。各アクティブ熱部位は、列方向に沿って、列の隣接するアクティブ熱部位間に位置する各パッシブ冷却領域の列方向に沿った長さよりも大きい長さを有してよい。アクティブ熱部位を、介在するパッシブ領域よりも長くすることにより、基板の総面積（及びそれ故、単位面積当たりのより多数の制御部位）のより効率的な使用を可能にし、アクティブ熱部位に関しては、ひとたび流体が所望の温度になると、流体は反応を起こすためにしばらくの間その温度で保持するはずであるが、流体がパッシブ部位上を通過する場合、唯一の機能は冷却である（反応を支持しない）ことから、アクティブ部位間に、流体が次のアクティブ部位に到達する前に十分な冷却を提供するために十分な間隙が提供され、パッシブ領域の一部内で温度を一定のままにする必要はない。それ故、パッシブ領域をアクティブ領域よりも小さくすることにより、より多くの反応部位を所与の量の空間内に装着することができる。
一部の実施形態において、各アクティブ熱部位は、媒体と接触している表面に、反応表面を包含してよい。例えば、反応表面は、金製であってよく、これは、多くの化学又は生物学的反応のためのニュートラルなプラットフォームを提供することができる。
流動又は静止流体の伸長体の空間的に局所化された領域「仮想ウェル」内において温度を厳密に制御するための方法を記載する。本発明者らは、仮想ウェル内の温度の高速双方向制御を可能にするパッシブ冷却及び抵抗加熱の組合せによって、温度制御を実現する。温度を効率的に制御し、広範囲の液体温度を可能にするために、本発明者らは、加熱器基板チップ内の熱流を改変することも、温度のフィードバック制御を可能にする熱流モデルを開発することも両方行う。
多くの化学的又は生物学的プロセスのために、流体内の特異的な場所における化学反応を制御することが有用となり得る。化学反応が生じる速度は、温度に対して指数関数的に敏感であり、反応速度を熱的に制御する能力を可能にする。熱的に制御された化学反応の空間的制御を実現するために、本発明者らは、熱部位の二次元マトリックスについて記載する（図１６及び１７を参照）。流体内の温度に対する双方向制御を実現するためには、熱をポンプで流体に出し入れすることの両方を要する。ここで、本発明者らは、熱部位の２つの種を使用することによる、この熱の双方向制御を実装し、一方の主目的は熱を流体中に伝達することであり、他方の主目的は熱を流体から伝達することである。
図１６は、媒体内のそれぞれの部位において温度を制御するための温度制御デバイス２の例を示す。流体流動素子（例えば、ポンプ）は、温度制御デバイス２の頂部を越えて流体流路４を通る流体の流れを制御するために設けられる。若干数のアクティブ熱部位６が、温度制御デバイス２の平面全体にわたる種々の場所に設けられる。各アクティブ熱部位６の頂部は、反応が起こり得る反応表面（例えば、金キャップ）を包含してよい。各アク
ティブ熱部位６は、該部位上を流れる流体の対応する部分に熱を印加して、流体の温度を制御するための、加熱体を包含する。図１７に示される通り、アクティブ熱部位６は、二次元マトリックス（格子）に配置され、列方向が、流体が流体流路４を通って流れる方向に平行である場合には、２又は３以上の列に配置される。アクティブ熱部位６の間にある領域は、いかなる加熱体も含まないが、流体から離れた熱をデバイス２の基板１０の方へ伝導することによってパッシブ冷却を提供する、１又は２以上のパッシブ熱領域８を形成する。列方向における各熱部位６の長さｘは、同じ列における隣接するアクティブ熱部位６の対の間にある各パッシブ熱領域８の長さｙよりも長い。図１６に示される通り、基板１０を冷却してヒートシンクとして作用するために、冷却機構１２が設けられてよい。
原理上、同じ熱部位が、熱を流体中に伝達すること及び熱を流体から伝達することの両方を行い得る。例えば、これは、双方向熱ポンピングができる熱電素子によって実現され得る。しかしながら、ここで記載されているアプローチは、本発明者らがアクティブ及びパッシブ部位６、８と称する熱部位の２つの別個の種を定義する。分離したアクティブ及びパッシブ部位の望ましい属性は、標準半導体加工技術によって及び当業界内で利用可能な材料を使用することによって、製作できることである。
図１８は、温度制御デバイス２の断面図をさらに詳細に示す（図１８は概略であり、縮尺通りであることを意図していない）。アクティブ熱部位６は、加熱器１３及び温度計（温度センサー）１４を包含する。加熱器１３は、閉ループ制御下で操作され、その出力は、該部位より上の流体においてある特定の温度を維持するように設定される。アクティブ部位における温度計１４は、閉ループ制御の測定を提供する。アクティブ部位は、主として、小さい加熱器動力で流体を加熱するために使用されるが、基板１０への熱流により、（その加熱する能力に比べて）少量の冷却も可能である。基板１０へ失われる熱の量を制御するために、加熱器１３と基板１０との間に断熱層１６が設けられる。アクティブ部位の頂部において、流体は、電気絶縁体２０又は電気絶縁体上に置かれた金パッド２２のいずれかと接触している。
それに反して、パッシブ部位８は、閉ループ制御下では動作せず、流体から基板１０又はその下のヒートシンクへ熱を伝達することを司り、パッシブ部位の主な役割は、良好な熱導体として作用することである。それ故、パッシブ領域８は、流体から基板１０へ熱を伝導するための熱伝導層１８を包含する。基板１０の温度は、別個の冷却機構１２によって維持され、一定値であると想定され得る。パッシブ部位は、電気的絶縁領域２０によっても覆われる。パッシブ部位８の熱伝導層１８は、アクティブ部位６の断熱層１６よりも、基板の平面に垂直な方向において、より低い熱抵抗を有する。
図１８に示されていない追加の層もデバイス２に包含され得ることが分かるであろう。例えば、加熱器１３からの熱をアクティブ熱部位全体にわたって拡散し、対応する部位への熱のより均一な印加を提供するために、熱拡散層が設けられてよい。
流体素子がチップ２の表面上を動くにつれて、アクティブ及びパッシブ部位６、８の上を交互に通過する。アクティブ部位を越えて、熱は流体中に流れ、流体素子の温度は、所望の「熱い」値に落ち着く。しばらくすると、流体素子はパッシブ部位上を通過し、熱が今度はヒートシンクに向かって流れ、流体素子を「冷たい」温度のまま放置する。次いで、流体素子は、次のアクティブ部位等に移る。
それ故、本発明者らは、抵抗加熱器ベースのアクティブ部位が相応の冷却及び加熱能力を有するのは実現困難であることを想定して、各アクティブ部位に入る流体を予冷するためのパッシブ熱部位を包含する。パッシブ部位８は、流体から離れた熱を伝導する役割を有し、そのため、アクティブ部位より上の空間に入る流体は、ヒートシンク温度に近い。
合わせたアクティブ及びパッシブ部位の挙動を例証するために、図１９は、アクティブ－パッシブ－アクティブ配列を上回る温度の略図を示す。左端のアクティブ部位は、熱をポンプで流体に入れて、その温度を８０℃の最大値まで上昇させる。次いで、流体がパッシブ部位の上を通過する際に、２０℃まで冷却する。最後に流体が右端のアクティブ部位を通過すると熱が流入し、その温度は４０℃に上昇する。これらの温度は恣意的であるが、動作条件を代表するものである。図１７に示される通り、アクティブ部位は、パッシブ部位よりも大きい空間広がりを有し得る（長さｘ＞長さｙ）。アクティブ部位は、化学反応が起こる一定温度の領域を提供するが、パッシブ部位の唯一の要件は、それらがアクティブ部位に入る流体を冷却することである。この予冷は、アクティブ部位の冷却要件を低減させ、それらにより効率的に熱を流体に伝達させることができる。
アクティブ及びパッシブ部位の熱的特性を設計するために、本発明者らは、熱的モデルによるシステムについて記載する。ここで、本発明者らは、熱抵抗を電気抵抗で；熱容量をコンデンサで；及び温度を電圧で置きかえた、電気的類推を開発する。構造を離散化し、電気回路の構築を可能にするために、本発明者らは、図２０に示される通り、それをブロックに分割する。ブロックは、アクティブ若しくはパッシブ熱部位、又はこれらの部位の１つよりも上の流体のブロックからなるものであってよい。
我々のシステムの一次近似として、本発明者らは、各アクティブ部位が４つのパッシブ部位で囲まれているとみなす（図２１）。各アクティブ及びパッシブ部位を単一の熱ブロックとして記載することにより、アクティブ部位の熱的挙動の電気的モデルを記載する回路図を描くことが可能であり（図２２）、図中、「導体」又は「伝導性部位」は、パッシブ熱領域８を指し、「絶縁体」又は「絶縁部位」は、アクティブ熱部位６を指し、
Ｃｃ及びＣｉ－ それぞれ導体及び絶縁体の熱容量
Ｒｃｘ、Ｒｃｙ、Ｒｃｚ－ ｘ、ｙ、ｚ方向における導体の熱抵抗（ｚは、基板１０の平面に垂直な方向であり、ｘ及びｙは、基板の平面に平行な直交性方向である）
Ｒｉｘ、Ｒｉｙ、Ｒｉｚ－ ｘ、ｙ、ｚ方向における絶縁体の熱抵抗
ＴＨＳ－ ヒートシンクの温度
Ｔｃ及びＴｉ－ 伝導性及び絶縁部位の温度
である。
物理的構造の対称性により及び等温基板を理由として、本発明者らは、絶縁領域から４つの伝導性領域へ等しい熱が流れるとみなし、それらを一緒に検討することを可能にする。図２３において、本発明者らは、この単純化を包含する圧縮熱的モデルを示し、この中に、加熱器によって生成された熱流又は熱電流（ｑ）も包含する。
ｑ－ 加熱器によって生成された熱電流。
ｑｆｃ、ｑｆｉ－ それぞれ伝導性部位及び絶縁部位を通して流体によって吸収された熱電流。
Ｃｆ－ 流体のブロックの熱的容量。これは、伝導性（又は絶縁）部位の面積及び流体の高さｈｆによって与えられた容積を有する。
Ｒｆ－ 流体のブロックの熱抵抗。これは、伝導性（又は絶縁）部位の面積及び流体の高さｈｆによって与えられた容積を有する。
Ｔｆｃ、Ｔｆｉ－ それぞれ伝導性及び絶縁部位よりも上の流体の温度。
熱回路の電気的モデルを使用して、絶縁部位から流体への熱流ｑｆｉを決定することができる。図２３における回路を例にとると、本発明者らは、抵抗を

［式中、｜｜は、並列抵抗に対する等価合成抵抗の省略表現、例えば、

である］
として単純化する。Ｒ１を通る熱的電流は、Ｒ２及びＲ３への熱的電流の和：

である。したがって、本発明者らは、Ｒ１を通過する熱的電流（ｑ１）を、

として書くことができる。本発明者らは、温度センサーで測定しているため温度Ｔｉを知っており、絶縁体から流体への熱流ｑｆｉを計算することができる。

シリコン（ｋＳｉ＝１３０Ｗ／ｍ／Ｋ）と比較した流体（ｋｆ＝０．６Ｗ／ｍ／Ｋ）の比較的低い熱伝導率により、ヒートシンクに対する導体の熱抵抗は、流体に対する導体の熱抵抗よりもはるかに低い。それ故、
Ｒ２＞＞Ｒ３
である。この想定により、絶縁体から流体への熱流は、

となる。
図２４は、流体温度のいくつかの一定値について流体への熱流（ｑｆｉ）をプロットするものである。加熱器によるゼロ熱出力の場合において（Ｔｆ＞ＴＨＳであることを想定する）、絶縁体から流体への熱流（ｑｆｉ）は負である：すなわち、アクティブ部位は流体を冷却する。アクティブ部位によって提供される冷却の最大量は、基板の平面に垂直な方向におけるアクティブ部位とヒートシンクとの間の断熱層１６の熱抵抗Ｒｉｚによって調節され、したがって、その抵抗Ｒｉｚは、アクティブ部位についての主な設計パラメータである。図２４に示される通り、加熱器からの熱ｑが基板１０及び周囲のパッシブ領域８への熱の損失を正確に相殺するバイアス点は、絶縁体熱抵抗Ｒｉｚが増大するにつれて減少する。それ故、絶縁体抵抗Ｒｉｚを調節して、アクティブ熱部位６における加熱と冷却との間のバランスを変更することができる。
加熱器が停止しており、流体の温度が最小である場合に生じる最小利用可能冷却力は、ヒートシンク温度及び部位の熱抵抗によって設定される。しかしながら、ヒートシンク温度が非現実的に低い値で保持されているのでない限り、部位を通って流れる熱の量は、流体の温度とともに上昇する、すなわち、ｑＨＳ，ｍａｘ＞＞ｑＨＳ，ｍｉｎである。この非効率性は、廃熱を除去するヒートシンクの有限容量により、アクティブ部位によって印加され得る冷却力を最終的に限定する。これが、アクティブ部位間に流体を予冷するためのパッシブ部位を提供することにより、より効率的な加熱及び所与の量の加熱器動力のためのより大きい温度範囲が可能になる理由である。
前項で論じた通り、本明細書において記載されている熱流体チップは、アクティブ部位より上の流体の可変温度によって引き起こされる本質的な非線形性を有する。それ故、本発明者らは、熱制御システムについて記載しており（図２５を参照）、これは、必要な温度制御を実現するために、非線形制御関数（「リニアライザ」）を包含する。このようにして、加熱器１３を通過する電流は、流体における一定温度を維持するために、制御され得る。
図２５は、単一のアクティブ部位６についてのフィードバックループを示す。各アクティブ部位６は、そのようなフィードバックループの別個のインスタンスを有してよい。目標温度Ｔｔａｒｇｅｔは、コントローラー３０に入力され、これは、対応するアクティブ部位の温度センサー１４によって測定された温度Ｔｉも受け取る。コントローラー３０は、アクティブ部位６によって流体に供給される熱ｑｆｉの目標量を、形態Ｃ（ｓ）．（Ｔｔａｒｇｅｔ－Ｔｉ）の伝達関数に基づいて決定し、Ｃ（ｓ）は、その極及びゼロが古典的制御理論に従って置かれた伝達関数である。
リニアライザ３２は、コントローラー３０によって供給された熱ｑｗｉの目標量を、基板１０の温度Ｔｉ及びＴＨＳに依存して、電流駆動装置３４によって加熱器１３へ供給される電流の量を定義する入力シグナルＩにマッピングする、マッピング回路を備える。基板温度ＴＨＳは、すべてのアクティブ部位６間で共有される単一のセンサー３６によって又は各アクティブ部位６に局部的な個々のセンサーによって測定することができる。リニアライザ３２は、コントローラー３０が線形伝達関数を使用できるようにする非線形マッピング関数を提供する（それ故、「リニアライザ」という用語である）。リニアライザ３２によって提供される非線形関数は、熱的モデルの解析的インバージョンを表す関数であってよい。上述したモデルから、流体への需要温度を実現するために加熱器内に生成される総動力は、

である。加熱器がある特定の温度に到達するために必要な電流は、

［式中、ｒは、加熱器の電気抵抗である］
である。前の２つの方程式を組み合わせると、リニアライザの形態が得られ、これが、熱需要を所要の電流に変換する：

図２６は、温度制御方法を例証する流れ図である。ステップ５０において、温度が制御
される媒体を、温度制御デバイス上に用意する。例えば、媒体は、温度制御デバイス上を流れる流体であることができる。ステップ５２において、温度Ｔｉをアクティブ熱部位６において測定する。ステップ５４において、媒体の対応する部位に送達される熱の目標量を、ｑｆｉ＝Ｃ（ｓ）．（Ｔｔａｒｇｅｔ－Ｔｉ）に従って決定する。ステップ５６において、抵抗加熱器１３に供給される電流を、Ｉ＝ｆ（ｑｆｉ、Ｔｉ、ＴＨＳ）［式中、ｆは、上記で示したリニアライザ方程式を表す関数である］に従って決定する。ステップ５８において、決定された電流の量Ｉを、電流駆動装置３４によって加熱体１３に供給して、媒体の対応する部位における温度を制御する。次いで、方法は、ステップ５２に戻って、上記で論じた熱的モデルに従い、アクティブ部位６から媒体自体以外の領域への熱流を考慮に入れて、測定された温度Ｔｉ及び目標温度Ｔｔａｒｇｅｔに基づき、部位における温度を制御し続ける。ステップ５２～５８を、並行してＮ回、温度制御デバイス２における各アクティブ部位について１回ずつ実施する。
アクティブ部位の温度制御を実現するために、適切な材料及び形状を選ぶことができるようにアクティブ及びパッシブ領域６、８の所要の熱抵抗を決定する。アクティブ部位の３Ｄブロックが満たすべき２つの条件がある：
１－ 加熱器によって生成される動力は、ほとんどが流体を加熱するべきであり、ごく一部のみがヒートシンク中へ鉛直に漏れるべきである、すなわち、アクティブ部位は、高い熱力学的効率、ηを有するべきである。

２－ 加熱器によって生成される動力は、他の熱部位の方へ水平に流れるべきではない、すなわち、

この不等式は、アクティブ部位の断熱層１６に薄膜材料を使用することによって（ｚ＜＜ｘ、ｙであり、ｚは、基板の平面に垂直な方向における厚さであり、ｘ、ｙは、断熱層の面内長さ／幅であるようなもの）、又は基板の平面に沿うものよりも基板の厚さを通る方向において熱伝導性である異方性熱材料の使用によって（ｋｚ＞＞ｋｘ、ｋｙ）のいずれかで満足することができる。
本発明者らは、主に熱流のモデルを単純化して、リニアライザ関数を単純に決定できるようにするために、この第２の要件を求める。他の限界のためにアクティブ部位を設計することも可能であろうし、その場合、アクティブ部位からヒートシンクへの熱の鉛直輸送はない。本発明者らが鉛直輸送限界を考慮する理由は、そうすることで流体への熱流についてのより良好な知識が得られることである。水平輸送限界において、温度勾配のあるチップの表面の追加の領域があり、ここから熱は流体へ流れることができる。
アクティブ部位を製作することができる若干数の材料があるが、例として、低い熱伝導率（ｋＳｉＯ２＝１．３Ｗ／ｍ／Ｋ）を持つ一般的な材料であるＳｉＯ２を検討してみよ
う。ｚ方向におけるアクティブ部位材料についての熱抵抗は、ヒートシンクへ漏れる最大熱の関数：

として表現することができる。ここから、材料の所要の高さを推測することができる：

ヒートシンクへの最大許容熱漏れ、ｑＨＳ，ｍａｘはまだ決定されていない。寸法１００μｍ×２００μｍの長方形のアクティブ部位について、本発明者らは、６ｍＷの最大加熱器動力を想定している。最大加熱器動力において、動力の半分がヒートシンクへ行くことを可能にする。さらに、Ｔｆ，ｍａｘ＝９０Ｃの最大流体温度、ＴＨＳ＝１０Ｃのヒートシンク温度、及び熱部位の温度が流体の温度とほぼ同じであること（Ｔｆ，ｍａｘ≒Ｔｉ，ｍａｘ）を想定している。アクティブ部位のすべての材料が、異方性熱伝導率を持つ材料であるＳｉＯ２製である場合、その高さは、≒７００μｍとなる必要があるであろう。そのようなブロックについて、鉛直方向における熱抵抗は、Ｒｉｚ≒２７，０００Ｋ／Ｗである。ｚ＞ｘ、ｙであるそのようなブロックは、熱部位間の小さな熱漏れの第２の条件を満足しない。
部位間の小さな熱漏れについての条件を満足するための１つの手法は、パターニングによって、アクティブ部位材料を熱的に異方性にすることである。例えば、ＳｉＯ２の鉛直支柱が空気の空間によって分離されている構造を生成することができる（ｋａｉｒ＝０．０２４Ｗ／ｍ／Ｋ）。材料の所要の鉛直高さ、この場合、支柱の高さには、支柱曲線因子を乗じる。例えば、１０％の曲線因子では、支柱高さは７０μｍとなる。絶縁支柱は、若干数の異なる形状をとってよく、そのいくつかの例を図２７に示す。支柱６０は、空気、ガス又は真空を含む空隙で囲まれている。他の例において、支柱は、空隙を包囲し得る。
基板に垂直な方向に伸長する支柱及び支柱の周辺又は間の空隙を備える柱状構造を提供することにより、鉛直方向において同じ熱抵抗を維持する（Ｒｉｚ≒２７，０００Ｋ／Ｗ）が、横抵抗は低減されることが明確であり、これは、主にｋａｉｒ＜ｋＳｉＯ２であることによるだけでなく、アクティブ材料のより低い高さも理由とするものである。
１０％曲線因子についての横熱抵抗を計算すると、

であることが分かる。
これにより、

の総横熱抵抗が得られる。
横熱抵抗は、支柱高さを低減させ、同時に曲線因子を低減させることによって、さらに増大できることに留意されたい。代替として、シリコン支柱は、真空によって分離されて、横抵抗の有意なさらなる増大を提供することができる。
しかしながら、アクティブ材料のバルクにおける横熱抵抗が大きくなるにつれて、キャッピング層の横熱抵抗を考慮することが重要になる。例えば、２μｍ厚さの二酸化ケイ素キャッピング層は、

の総横熱抵抗に寄与する。
要約すると、空気（又は真空）によって分離された絶縁支柱からなるように断熱材をパターニングすることにより、アクティブ部位の熱的条件を満足する方法を提供する。この場合の限界（曲線因子がゼロになり、空隙がアクティブ部位のエリア全体を覆う）は、熱的要件を満足するための代替的アプローチとしてみなされ得る自立膜をもたらす。
図２８は、柱状アプローチがどのようにして完全なデバイスに統合され得るかを示す。図は、２つのアクティブ及びいくつかのパッシブ熱部位を通過する、デバイス基板の断面図を示す。シリコン７０は鉛直陰影を、二酸化ケイ素７２は斜め陰影を使用して示され、金属層７４は水平陰影を使用して示されている。空隙は白色で示されている。図は縮尺通りでなく、上部層は鉛直方向に拡大されて示されていることに留意されたい。シリコンは、高度に熱伝導性の材料を基板に提供し、支柱間に空隙６２を持つ断熱性支柱６０を生成するために熱的に酸化することができる。支柱構造を含有する基板の頂部には、加熱器；熱拡散器（生成した熱を均等に分配するため）；温度計（熱制御を可能にするため）；及び表面キャッピング層を含有する、若干数の層がある。
図２８のデバイス２は、シリコンＣＭＯＳ及びシリコンＭＥＭＳ業界に利用可能なプロセスを使用して構築され得る。図２９及び３０は、パッシブ及びアクティブ領域において所要の熱抵抗を実現するプロセスフローを示す。図２９（図３０の一部）のステップ８０において、プロセスは、比較的厚いシリコンハンドル１０２、埋め込み酸化物層１０４及びシリコンデバイス層１０６を備えるシリコン・オン・インシュレータ（ＳＯＩ，silicon-on-insulator）ウエハ１００から出発する。シリコンデバイス層１０６の厚さは、二酸化ケイ素支柱の高さを与え、埋め込み酸化物の厚さは、およそ１μｍである。第２のウエ
ハは加工において後で使用されるため、ＳＯＩウエハを「一次」と称する。デバイス層１０６が形成される一次ウエハ１００の表面を、以下で「第１の表面」と称する。
ステップ８２（図３０の部分ｂ）において、一次ウエハ１００をフォトリソグラフィでパターン化し、フォトレジストをエッチングマスクとして使用して、シリコンデバイス層１０６を埋め込み酸化物１０４に異方的にエッチングして、孔１０８を形成する。エッチング異方性を実現するために、ディープ反応性イオンエッチングを使用する。
ステップ８４（図３０の部分ｃ）において、ウエハを酸化して、例えばおよそ１μｍの厚さを持つ熱酸化物を得る。孔１０８の縁を酸化して、二酸化ケイ素支柱１１０の壁を形成する。
ステップ８６において、二次ウエハ１２０を用意する。二次ウエハ１２０は、加熱及び制御機能性のために必要とされる電気的にアクティブ及び電気的にパッシブなデバイス（例えば、加熱器１３、温度センサー１４、及びパッシブ部位８の熱導体層の上方部分）を含有する、加工されたＣＭＯＳウエハを備える。二次ＣＭＯＳウエハ１２０内のこれらの金属層及びデバイスは、図３０には示されていないが、図２８に示される通り、用意され得る。
ステップ８８（図３０の部分ｄ）において、一次ウエハ１００を上下逆にし、一次ウエハ１００の第１の表面を二次ウエハ１２０と結合する。ウエハ結合は、熱圧着結合によって実現でき、この場合において、金属（例えば、金）層が一次及び二次ウエハ両方の表面上で必要とされる。
ステップ９０（図３０の部分ｅ）において、結合した一次ウエハの裏側（ＳＯＩウエハの元のハンドル層１０２）をエッチバックして、そのＳＯＩウエハ１００の埋め込み酸化物１０４をスタックの頂部に残しておく。このステップの後、加熱器／温度計／熱拡散器スタックのための金属トラックが二次ウエハ１２０上に構築され得る（図３０には示されていない）。
元のＳＯＩウエハからのシリコンデバイス層における空隙を除去する必要が依然としてあるため、ステップ９２（図３０の部分ｆ）において、エッチング孔１２２をフォトリソグラフィでパターン化し、上部二酸化ケイ素層１０４においてエッチングする。次いで、その後のプロセスステップ９４（図３０の部分ｇ）において、これらのシリコン領域の異方性ドライエッチング（例えば、ＸｅＦ２で）を実施して、酸化物１０４中のエッチング孔１２２を介してシリコンデバイス層１０６の一部をエッチング除去することにより、空隙１２４を形成する。ステップ９６において、酸化物層１０４中のエッチング孔１２２を誘電体で充填して（図３０の部分ｈ）、アクティブ及びパッシブ熱部位の加工を完了する。
本出願において、語「・・・ように構成された」は、装置の素子が、定義された動作を行うことができる構成を有することを意味するために使用される。この文脈において、「構成」は、ハードウェア又はソフトウェアの相互接続の配置又は様式を意味する。例えば、装置は、定義された動作を提供する専用ハードウェアを有してもよいし、或いはプロセッサー又は他のプロセッシングデバイスが機能を実施するようにプログラムされていてもよい。「ように構成された」は、定義された動作を提供するために装置素子をいかようにも変更する必要があることを暗示しない。
本発明の方法の好ましい態様において、基板に、媒体の複数の部位において温度を制御するための温度制御デバイスであって、
基板上のそれぞれの場所に位置する複数のアクティブ熱部位であり、各アクティブ熱部位が、前記媒体の対応する部位に可変量の熱を印加するように構成された加熱体、及び加熱体と基板の間に位置する断熱層を備える、複数のアクティブ熱部位と；
基板上の複数のアクティブ熱部位の間に位置する１又は２以上のパッシブ熱領域であり、各パッシブ熱領域が、媒体の対応部から基板へ熱を伝導するように構成された熱伝導層を備える、１又は２以上のパッシブ熱領域と
を備え；
前記１又は２以上のパッシブ熱領域の熱伝導層が、前記複数のアクティブ熱部位の断熱層よりも基板の平面に垂直な方向において、より低い熱抵抗を有する、
温度制御デバイスを用意する。
好ましくは、温度制御デバイスは、前記選択されたアクティブ熱部位の加熱体によって生成される熱の量が閾値よりも大きいか又は小さいかに依存して、選択されたアクティブ熱部位が、加熱体を使用する媒体の対応する部位の加熱又は前記断熱層を経由する前記基板への熱流による対応する部位の冷却のいずれを提供するかを制御するように構成された制御回路を備える。好ましくは、閾値は、基板の平面に垂直な方向における断熱層の熱抵抗に依存する。
好ましくは、温度制御デバイスにおいて、各アクティブ熱部位は、対応するアクティブ熱部位において温度を感知するように構成された温度センサーを備える。より好ましくは、温度制御デバイスは、それぞれのアクティブ熱部位にそれぞれ対応する複数のフィードバックループであって；
各フィードバックループが、対応するアクティブ熱部位の温度センサーによって感知された温度及び媒体の対応する部位のために指定された目標温度に依存して、媒体の対応する部位に印加すべき熱の目標量を決定するための、伝達関数を実装するように構成された、複数のフィードバックループを備える。
さらに一層好ましくは、各フィードバックループは、伝達関数によって決定された熱の前記目標量を、対応するアクティブ熱部位の加熱体を制御するための入力シグナルにマッピングするためのリニアライザ関数を実装するように構成される。好ましくは、リニアライザ関数は、対応するアクティブ熱部位の温度センサーによって感知された温度の関数である。好ましい実施形態において、リニアライザ関数は、熱の目標量並びにアクティブ熱部位の加熱体から基板及び周囲のパッシブ熱領域へ失われる熱の量の和に依存して、入力シグナルを決定する。
温度制御デバイスは、好ましくは、抵抗加熱体を備える。
好ましくは、温度制御デバイスにおける前記複数のアクティブ熱部位の断熱層は、基板の平面に平行な方向において、基板の平面に垂直な方向よりも大きい熱抵抗を有する。
より好ましくは、温度制御デバイスの所与のアクティブ熱部位の断熱層は、基板の平面に垂直な方向において、基板の平面に平行な方向におけるアクティブ熱部位の断熱層の最小寸法Ｌよりも実質的に小さい厚さｚを有する薄膜材料を含む。
断熱層は、１又は２以上の空隙を備えていてよい。好ましくは、空隙は、基板の平面に実質的に垂直な方向に伸長する。
温度制御デバイスの断熱層は、特に、加熱体と基板との間のアクティブ熱部位のエリア内に、基板の平面に実質的に垂直に伸長する第１の断熱材料の１又は２以上の支柱を備えてよく、前記１又は２以上の空隙は、支柱の間又は周辺に位置する。
断熱層は、加熱体と基板との間のアクティブ熱部位のエリア全体にわたって伸長する空隙を備えることができる。
温度制御デバイスは、基板を冷却してヒートシンクとして作用するための冷却機構を備えてよい。
好ましくは、媒体は流体を含み、温度制御デバイスは、複数のアクティブ熱部位及び１又は２以上のパッシブ熱領域上の流体の流れを制御するように構成された流体流動制御素子を備える。好ましくは、アクティブ熱部位は、流体流動制御素子によって制御された流体流動の方向に実質的に平行に配向された１又は２以上の列内に位置し；
各列は、２又は３以上のアクティブ熱部位を備え、列の隣接するアクティブ熱部位の各対間にパッシブ冷却領域が位置している。より特定すれば、各アクティブ熱部位は、列の隣接するアクティブ熱部位間に位置する各パッシブ冷却領域の列方向に沿った長さよりも大きい、列方向に沿った長さを有する。
使用中、温度制御デバイスを使用して、基板の複数の部位において温度を制御することができ、
基板上のそれぞれの場所に位置する複数のアクティブ熱部位及び基板上の複数のアクティブ熱部位間に位置する１又は２以上のパッシブ熱領域を備える温度制御デバイス上に、媒体を用意するステップであり；
各アクティブ熱部位が、前記媒体の対応する部位に可変量の熱を印加するように構成された加熱体、及び加熱体と基板の間に位置する断熱層を備え；
各パッシブ熱領域が、媒体の対応部から基板へ熱を伝導するように構成された熱伝導層を備え；
前記１又は２以上のパッシブ熱領域の熱伝導層が、前記複数のアクティブ熱部位の断熱層よりも基板の平面に垂直な方向において、より低い熱抵抗を有する
ステップと；
複数のアクティブ熱部位の加熱体によって印加される熱の量を制御して、媒体の前記複数の部位において温度を制御するステップと
を含む。
温度制御デバイスは、任意の適切な方法によって製造することができる。好ましくは、方法は、
基板上のそれぞれの場所に複数のアクティブ熱部位を及び基板上の複数のアクティブ熱部位間に位置する１又は２以上のパッシブ熱領域を形成するステップであり；
各アクティブ熱部位が、前記媒体の対応する部位に可変量の熱を印加するように構成された加熱体、及び加熱体と基板の間に位置する断熱層を備え；
各パッシブ熱領域が、媒体の対応部から基板へ熱を伝導するように構成された熱伝導層を備え；
前記１又は２以上のパッシブ熱領域の熱伝導層が、前記複数のアクティブ熱部位の断熱層よりも基板の平面に垂直な方向において、より低い熱抵抗を有する
ステップを含む。
好ましくは、本発明の方法のいずれかの実施形態において、固体基板は、固体基板の複数の部位において温度を制御するための温度制御デバイスを備え、温度制御デバイスは、（Ａ）
（ｉ）基板上のそれぞれの場所に位置する複数のアクティブ熱部位であり、各アクティブ熱部位が、前記媒体の対応する部位に可変量の熱を印加するように構成された加熱体、及び加熱体と基板の間に位置する断熱層を備える、複数のアクティブ熱部位と；
（ii）基板上の複数のアクティブ熱部位の間に位置する１又は２以上のパッシブ熱領域であり、各パッシブ熱領域が、媒体の対応部から基板へ熱を伝導するように構成された熱伝導層を備える、１又は２以上のパッシブ熱領域と
を備え；
前記１又は２以上のパッシブ熱領域の熱伝導層が、前記複数のアクティブ熱部位の断熱層よりも基板の平面に垂直な方向において、より低い熱抵抗を有する。
温度制御デバイスのさらなる実施形態を、以下の（Ｂ）～（Ｒ）に提示する：
（Ｂ）温度制御デバイスは、前記選択されたアクティブ熱部位の加熱体によって生成される熱の量が閾値よりも大きいか又は小さいかに依存して、選択されたアクティブ熱部位が、加熱体を使用する媒体の対応する部位の加熱又は前記断熱層を経由する前記基板への熱流による対応する部位の冷却のいずれを提供するかを制御するように構成された制御回路をさらに備えてよく、好ましくは、閾値は、基板の平面に垂直な方向における断熱層の熱抵抗に依存する。
（Ｃ）各アクティブ熱部位が、対応するアクティブ熱部位において温度を感知するように構成された温度センサーを備えることができる、温度制御デバイス。
（Ｄ）（Ｃ）の温度制御デバイスは、それぞれのアクティブ熱部位にそれぞれ対応する複数のフィードバックループであって；
各フィードバックループが、対応するアクティブ熱部位の温度センサーによって感知された温度及び媒体の対応する部位のために指定された目標温度に依存して、媒体の対応する部位に印加すべき熱の目標量を決定するための、伝達関数を実装するように構成された、複数のフィードバックループを備えてよい。
（Ｅ）各フィードバックループが、伝達関数によって決定された熱の前記目標量を、対応するアクティブ熱部位の加熱体を制御するための入力シグナルにマッピングするためのリニアライザ関数を実装するように構成された、（Ｄ）の温度制御デバイス。
（Ｆ）リニアライザ関数が、対応するアクティブ熱部位の温度センサーによって感知された温度の関数である、（Ｅ）の温度制御デバイス。
（Ｇ）リニアライザ関数が、熱の目標量並びにアクティブ熱部位の加熱体から基板及び周囲のパッシブ熱領域へ失われる熱の量の和に依存して、入力シグナルを決定する、（Ｅ）又は（Ｆ）の温度制御デバイス。
（Ｈ）加熱体が、抵抗加熱体を備える、（Ａ）～（Ｇ）のいずれかの温度制御デバイス。
（Ｉ）前記複数のアクティブ熱部位の断熱層が、基板の平面に平行な方向において、基板の平面に垂直な方向よりも大きい熱抵抗を有する、（Ａ）～（Ｈ）のいずれかに従う温度制御デバイス。
（Ｊ）所与のアクティブ熱部位の断熱層が、基板の平面に垂直な方向において、基板の平面に平行な方向におけるアクティブ熱部位の断熱層の最小寸法Ｌよりも実質的に小さい厚さｚを有する薄膜材料を含む、（Ａ）～（Ｉ）のいずれかの温度制御デバイス。
（Ｋ）断熱層が、１又は２以上の空隙を備える、（Ａ）～（Ｉ）のいずれかに従う温度制御デバイス。
（Ｌ）空隙が、基板の平面に実質的に垂直な方向に伸長する、（Ｋ）に従う温度制御デバイス。
（Ｍ）断熱層が、加熱体と基板との間のアクティブ熱部位のエリア内に、基板の平面に実質的に垂直に伸長する第１の断熱材料の１又は２以上の支柱を備え、前記１又は２以上の空隙が、支柱の間又は周辺に位置する、（Ｋ）又は（Ｌ）に従う温度制御デバイス。
（Ｎ）断熱層が、加熱体と基板との間のアクティブ熱部位のエリア全体にわたって伸長する空隙を備える、（Ｋ）又は（Ｌ）のいずれかに従う温度制御デバイス。
（Ｏ）基板を冷却してヒートシンクとして作用するための冷却機構を備える、（Ａ）～（Ｎ）のいずれかに従う温度制御デバイス。
（Ｐ）媒体が流体を含み、温度制御デバイスが、複数のアクティブ熱部位及び１又は２以上のパッシブ熱領域上の流体の流れを制御するように構成された流体流動制御素子を備える、（Ａ）～（Ｏ）のいずれかに従う温度制御デバイス。
（Ｑ）アクティブ熱部位が、流体流動制御素子によって制御された流体流動の方向に実質的に平行に配向された１又は２以上の列内に位置し；
各列が、２又は３以上のアクティブ熱部位を備え、列の隣接するアクティブ熱部位の各対間にパッシブ冷却領域が位置している、（Ｐ）に従う温度制御デバイス。
（Ｒ）各アクティブ熱部位が、列の隣接するアクティブ熱部位間に位置する各パッシブ冷却領域の列方向に沿った長さよりも大きい、列方向に沿った長さを有する、（Ｐ）に従う温度制御デバイス。
下記の例は、本発明をさらに例証するために提供される。
時間経過研究の結果は、異なる開裂条件下で広範囲の特性を有する、本発明において使用するための開裂可能なリンカー又は保護基を考案することが可能であることを示す。故に、本発明において使用するためのリンカー及び保護基は、開裂及び脱保護の制御を可能にするように細かく調節され得る。
［実施例］
分析方法
ＬＣ－ＭＳ方法
以下で論じる時間経過研究及び反応物の分析は、以下で概説するＬＣ－ＭＳを使用して行った：
Acquity Arcシステム；2498 UV/Vis検出器、QDa検出器
カラム；XSelect CSH C18 XPカラム、１３０Å、２．５μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ
方法Ａ（酸性）
成分１：Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸
成分２：ＭｅＣＮ（アセトニトリル）

方法Ｂ（塩基性）
成分１：Ｈ２Ｏ＋Ｈ２Ｏ中０．１％～２５％ギ酸アンモニウム
成分２：ＭｅＣＮ

方法Ｃ（長時間酸性）
成分１：Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸
成分２：ＭｅＣＮ

保護された活性化基を持つ化合物への経路：

実施例１Ａ： ｔｅｒｔ－ブチル２－（（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（１）

１－Ｎ－Ｂｏｃ－２－ピペリジンカルボアルデヒド（２ｇ、９．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解し、酢酸（２．４ｍＬ）及び２－ベンジルアミノエタノール（１．６ｇ、１０ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。室温で１０分後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、溶液を終夜撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３００ｍＬ）及び酢酸エチル（５００ｍＬ）を添加し、層を分離した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去した。残留物をシリカクロマトグラフィー（０～１０％ＭｅＯＨ－ＤＣＭ）によって精製して、生成物を無色油状物（２．３３ｇ、７１％として得た。ＬＣ－ＭＳ方法Ｂ（塩基性）；保持時間＝１．６０、ｍ／ｚ３４９．２（ＭＨ＋）。
実施例１Ｂ： ｔｅｒｔ－ブチル２－（（ベンジル（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（２）

５’－Ｏ－ＴＢＤＰＳ－チミジン（１．３ｇ、２．９ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＣＤＩ（５３４ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ、１．２当量）を無水アセトニトリル（４０ｍＬ）に溶解し、溶液を、Ｎ２下、室温で終夜撹拌した。この時間の後、ｔｌｃ（１０％ＭｅＯＨ－ＤＣＭ、ｕｖ）により反応は完了した。次いで、ｔｅｒｔ－ブチル２－（（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（１）（１ｇ、２．２９ｍｍｏｌ）及び１，１，３，３－テトラメチルグアニジン（０．７２ｍＬ、５．８ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、溶液をさらに２時間にわたって撹拌した。水（２００ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）を添加し、層を分離した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を除去した。得られた油状物を、０～５０％ＥｔＯＡｃ－ガソリンで溶離するシリカクロマトグラフィーによって精製して、生成物を無色油状物、８９０ｍｇ、３７％として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ｂ（塩基性）；保持時間＝３．４７、ｍ／ｚ８５５．４６（ＭＨ＋）。
実施例１Ｃ： ２－（ベンジル（ピペリジン－２－イルメチル）アミノ）エチル（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）カーボネート（３）

ｔｅｒｔ－ブチル２－（（ベンジル（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（２）（１００ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）及びトリ
フルオロ酢酸（２ｍＬ）に溶解し、溶液を室温で１時間にわたって撹拌した。この時間の後、ＬＣ－ＭＳにより反応は完了した。溶媒を除去し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）を添加し、層を分離した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下、２０℃で除去した。残留物をシリカクロマトグラフィー（０～１０％ＭｅＯＨ－ＤＣＭ）によって精製して、生成物を無色油状物（６３ｍｇ、７１％）として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ｂ（塩基性）；保持時間＝２．２０、ｍ／ｚ７５５．４６（ＭＨ＋）。
（１，１－ジオキシドベンゾ［ｂ］チオフェン－２－イル）メチル２－（（ベンジル（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（４）

ｔｅｒｔ－ブチル２－（（ベンジル（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（２）（２９０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を１：１ ＴＦＡ－ＤＣＭ（１０ｍＬ）に室温で溶解した。１時間後、ｔｌｃ（１０％ＭｅＯＨ－ＤＣＭ、ｕｖ）により反応は完了した。過剰なＴＦＡを減圧下で除去し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）及びＤＣＭ（５０ｍＬ）を添加した。層を分離し、有機層をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を除去して、遊離アミンを無色油状物として得た。この油状物をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、ヒューニッヒ塩基（０．１３ｍＬ、０．７６ｍｍｏｌ、２当量）、続いて、１，１－ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン－２－イルメチルクロリド（１００ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。１時間後、ｔｌｃ（１０％ＭｅＯＨ－ＤＣＭ）により反応は完了した。水（５０ｍＬ）及びＤＣＭ（５０ｍＬ）を添加し、層を分離し、有機層を乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカクロマトグラフィー（０～６０％ＥｔＯＡＣ－ガソリン）によって精製して、生成物を無色油状物（２５０ｍｇ、６７％）として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ｂ（塩基性）；保持時間＝２．８５、ｍ／ｚ９７７．４０（ＭＨ＋）。
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル２－（（ベンジル（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５
－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（５）

ｔｅｒｔ－ブチル２－（（ベンジル（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）アミノ）－メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（２）（８００ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を１：１ ＴＦＡ－ＤＣＭ（２０ｍＬ）に室温で溶解した。１時間後、ｔｌｃ（１０％ＭｅＯＨ－ＤＣＭ、ｕｖ）により反応は完了した。過剰なＴＦＡを減圧下で除去し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）及びＤＣＭ（５０ｍＬ）を添加した。層を分離し、有機層をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を除去して、遊離アミンを無色油状物として得た。この油状物をＤＣＭ（６０ｍＬ）に溶解し、ヒューニッヒ塩基（０．２６ｍＬ、１．８６ｍｍｏｌ、２当量）、続いて、９－フルオレニルメトキシカルボニルクロリド（３４２ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。１時間後、ｔｌｃ（１０％ＭｅＯＨ－ＤＣＭ）により反応は完了した。水（５０ｍＬ）及びＤＣＭ（５０ｍＬ）を添加し、層を分離し、有機層を乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカクロマトグラフィー（０～６０％ＥｔＯＡＣ－ガソリン）によって精製して、生成物を無色油状物（２５０ｍｇ、６７％）として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ｂ（塩基性）；保持時間＝３．３１、ｍ／ｚ９７８．６１．４０（ＭＨ＋）。
実施例４Ａ： ｔｅｒｔ－ブチル２－（（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）アミノ）メチル）ピロリジン－１－カルボキシレート（６）

Ｎ－Ｂｏｃ－Ｌ－プロリナール（３ｇ、１５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解し、酢酸（３ｍＬ ７５ｍｍｏｌ、５当量）及び２－ベンジルアミノエタノール（２．３ｇ、１６ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。室温で１０分後、トリアセトキシ水素化ホ
ウ素ナトリウムを添加し、溶液を３時間にわたって撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加し、層を分離した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去した。残留物をシリカクロマトグラフィー（０～１０％ＭｅＯＨ－ＤＣＭ）によって精製して、生成物を無色油状物（３．１ｇ ｍｇ、６３％）として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ｂ（塩基性）；保持時間＝１．５３、ｍ／ｚ３３５．３（ＭＨ＋）。
実施例４Ｂ： ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－２－（（ベンジル（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）アミノ）メチル）ピロリジン－１－カルボキシレート（７）

５’－Ｏ－ＴＢＤＰＳ－チミジン（１．４ｇ、３ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＣＤＩ（５３０ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ、１．２当量）を無水アセトニトリル（４０ｍＬ）に溶解し、溶液を、Ｎ２下、４０℃で２時間にわたって加熱した。ｔｅｒｔ－ブチル２－（（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）アミノ）メチル）ピロリジン－１－カルボキシレート（６）（１ｇ、３ｍｍｏｌ）及び１，１，３，３－テトラメチルグアニジン（１ｍＬ、８．４ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、溶液を室温で２時間にわたって撹拌した。水（２００ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）を添加し、層を分離した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を除去した。得られた油状物を、０～５０％ＥｔＯＡｃ－ガソリンで溶離するシリカクロマトグラフィーによって精製して、生成物を無色油状物、１ｇ、４０％として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ｂ（塩基性）；保持時間＝３．３０、ｍ／ｚ８４１．０９（ＭＨ＋）。
実施例４Ｃ： ２－（ベンジル（（（Ｓ）－ピロリジン－２－イル）メチル）アミノ）エチル（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）カーボネート

ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－２－（（ベンジル（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）アミノ）メチル）ピロリジン－１－カルボキシレート（７）（１００ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）に溶解し、溶液を室温で１時間にわたって撹拌した。この時間の後、ＬＣ－ＭＳにより反応は完了した。溶媒を除去し、ジクロロメタン（１００ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）を添加し、層を分離した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去した。残留物をシリカクロマトグラフィー（０～１０％ＭｅＯＨ－ＤＣＭ）によって精製して、生成物を無色油状物（６０ｍｇ、６９％）として得た。
時間経過実験
一般的な手順－高温における反応
試験される化合物を、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の所要の溶液に室温で溶解した。この溶液を十分なＬＣ－ＭＳバイアル間で分割（１バイアル当たり０．５～０．７５ｍＬ）して、所要の数の時点における反応過程及び室温測定のためのものを測定した。加熱実験用のバイアルを、９０℃（±０．１℃）に設定した湯浴に直ちに入れ、それによって、バイアル内の液体のレベルは湯の表面下となった。実験内の各時点で、ＬＣ－ＭＳバイアルを取り出し、次いで、３℃の温度のブライン氷浴中で直ちに冷却した。次いで、冷却によって反応物をクエンチして１０分以内に、ＬＣ－ＭＳ実験を行った。ＬＣ－ＭＳのＵＶトレースにおいて対応するピークを積分することによって、出発材料と開裂したＴＢＤＰＳ－チミジンとの比を測定した。
一般的な手順－室温における反応
高温実験に使用したのと同じ溶液を含有するＬＣ－ＭＳバイアルを、室温、すなわち、２０±３℃に保ち、溶液を適切な時点でＬＣ－ＭＳによって分析した。
１０℃における反応
高温実験に使用したのと同じ溶液を含有するＬＣ－ＭＳバイアルを、１０℃に設定したＬＣ－ＭＳマシンの予め冷やしたオートサンプラーチャンバーに入れ、溶液を適切な時点でＬＣ－ＭＳによって繰り返し分析した。
実施例５Ａ： 実施例１Ｃの保護されていないリンカーの開裂に対する時間経過研究：

ＴＢＤＭＳ保護チミジンからの上記の（保護されていない）リンカーの開裂に対する時間経過研究を、上記の一般的な手順に従って行った：
（ｉ）９０℃及び２０℃（室温）において（図１）［１：１ ｐＨ７．４リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，phosphatebuffered saline）及びアセトニトリル］；
（ii）異なる溶媒系［ｐＨ７．４ ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）］；アセトニトリル及びｐＨ５緩衝液（酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＥＡ，triethylammonium acetate）緩衝液］を使用する（図２）
（iii）異なる比のＰＢＳ：ＭｅＣＮ（アセトニトリル）を９０℃において使用する（図３）
９０℃及び室温（２０℃）におけるＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）及びＭｅＣＮ（アセトニトリル）中の上記の化合物に対する時間経過研究の結果を、図１に示す。
図１に示される通り、保護されていないリンカーは、２０℃対９０℃における開裂の明確な差別化を示す。このように、２０℃において、出発材料のみが検出され、一方で、９０℃においては、リンカーがヌクレオチドから開裂された。さらに、９０℃において、開裂は迅速であり、約１３分後に残っている出発材料はなかった。
実施例５Ｂ： Ｂｓｍｏｃ保護活性化基の脱保護、続いて、リンカー開裂（実施例２の化合物）に対する研究

ＴＢＤＭＳ保護チミジン（すなわち、実施例２の化合物）からの上記のＢｓｍｏｃ保護リンカーの開裂に対する時間経過研究は、上記の一般的な手順に従って行った。
Ｂｓｍｏｃ保護基を９０℃で加熱し、出発材料、Ｂｓｍｏｃ脱保護中間体及び開裂したチミジンの濃度を測定した（図４Ａ）。図４Ｂは、２０℃及び９０℃におけるＢｓｍｏｃ基の脱保護の程度を経時的に示す。
図４Ｃは、Ｂｓｍｏｃ保護リンカーを塩基により室温で処理する場合、これはリンカーの即時開裂につながらず、何故なら、脱保護ステップは室温において適度に急速に生じるが、第２のステップ（すなわち、開裂）は加熱を要するからであることを示す。
実施例５Ｃ： 実施例２のＢｓｍｏｃ保護リンカーに対する安定性研究
安定性研究は、異なるｐＨ条件下、８０℃で行った：
（ｉ）ｐＨ７．４リン酸緩衝食塩水；
（ii）ｐＨ９リン酸緩衝食塩水
（iii）ｐＨ５ＴＥＥＡ（酢酸トリエチルアンモニウム）緩衝液
結果を図５に示す。結果は、Ｂｓｍｏｃ保護リンカーの最小限の開裂が、加熱（８０℃）条件下で数時間にわたり観察されたことを示す。さらに、最小限の副産物形成がこれらの条件下で観察された。比較すると、先の研究（図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃ）に示される通り、９０℃における０．１％モルホリンの条件は、容易な及び迅速な２ステップ脱保護及びリンカー開裂を可能にした。
実施例５Ｄ： Ｆｍｏｃ保護活性化基の脱保護、続いて、リンカー開裂（実施例３の化合物）に対する研究

実施例３の化合物のＦｍｏｃ保護基による研究は、Ｂｓｍｏｃ保護基と同様のレベルの制御を実証した。主な差異は、ピペリジンと同様に、ジイソプロピルアミン等の非求核性塩基を使用して、Ｆｍｏｃ基を除去することもできることであった（図６、７及び９）。溶媒をＤＭＦからアセトニトリルに変更すると、反応速度の顕著な減速が観察された（図
８）。それ故、異なる保護基を組み込むと、脱保護－開裂条件がさらに制御されることが分かる。加えて、反応条件を調整すると、リンカーの脱保護及び開裂を細かく調節することが簡単になる。
実施例５Ｅ： ピロリジン（実施例４Ｃの化合物）とピペリジン（実施例１Ｃの化合物）活性化基との間の比較研究
ピロリジン活性化基による研究は、ピロリジン窒素の求核性増大にもかかわらず、ピペリジン活性化と比較して反応スピードの減速があったことを示した（図１０）。これらの研究は、環化生成物の配座が、反応スピードを決定する際により重要である可能性が高く、故に、リンカー脱保護－開裂の微細な制御を実現することができるさらなる方法を提供することを指し示す。

実施例５Ｆ： ピロリジンリンカー（実施例４Ｃの化合物）による共溶媒研究
反応スピードに対する共溶媒の効果を探究した。図１１に示される通り、ＤＭＳＯによりこのシステムにおいて最速の反応スピードが得られることが分かった。
実施例５Ｇ： Ｂｏｃ保護リンカー（実施例１Ｂの化合物）の脱保護についての時間経過研究
ブライン－氷浴中でＬＣ－ＭＳバイアルを冷却し、次いで、過剰のトリエチルアミン（５０μＬ、約３当量）を添加することによって、各時点において反応物をクエンチするという変更を加えて、時間経過実験を２０℃及び９０℃で行うための一般的な手順を使用した。
酸開裂した保護基を使用する狙いは、酸による活性化基の脱保護は脱プロトン化が生じるまでリンカー開裂を達成することができないプロトン化活性化基をもたらすため、各ステップにおいて異なるレベルの直交度で２ステップ脱保護－開裂プロセスを実証すること
であった。研究は、活性化基の１００％脱保護が生じているにもかかわらず、これらの条件下ではリンカー開裂が観察されないことを実証した（図１２）。
α－炭素置換化合物の合成

実施例６Ａ： ２－（ベンジルアミノ）－１－フェニルエタン－１－オール

２－ヒドロキシ－２－フェニルエチルアミン（４．７ｇ、３４ｍｍｏｌ、１．２当量）及びベンズアルデヒド（３．６ｇ、３４ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍｌ）に溶解し、室温で１０分間にわたって撹拌した。この時間の後、溶液を０℃に冷却し、水素化ホウ素ナトリウム（１．６ｇ、３４ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温に加温し、２時間にわたって撹拌し、この時間の後に、ＬＣ－ＭＳ及びｔｌｃにより反応は完了した。酢酸エチル－水後処理を行い、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去して、オフホワイトの結晶性固体を得た。これをガソリン及び酢酸エチルでトリチュレートして、白色固体、５ｇ、６５％を得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ｂ（塩基性）；保持時間＝１．９４、ｍ／ｚ２２８．２（ＭＨ＋）。
実施例６Ｂ： ｔｅｒｔ－ブチル２－（（ベンジル（２－ヒドロキシ－２－フェニルエチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート

２－（ベンジルアミノ）－１－フェニルエタン－１－オール（１．９６、８．６ｍｍｏｌ）及び１－Ｎ－ｂｏｃ－２－ピペリジンカルボアルデヒド（１．８ｇ、８．６ｍｍｏｌ）を１，２－ジクロロエタン（１００ｍＬ）に溶解し、酢酸を添加した（３ｍＬ）。１０分後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２．７ｇ、１２ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、溶液を終夜撹拌した。この時間の後、ＬＣ－ＭＳにより生成物へのクリーンな変換があった。ジクロロメタン／飽和ＮａＨＣＯ３水溶液後処理を行い、有機溶液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を除去して、ジアステレオマー生成物を無色油状物、３．７ｇ、１００％として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ｂ（塩基性）；保持時間＝２．８８及び２．９３、ｍ／ｚ４２５．３（ＭＨ＋）。
実施例６Ｃ： ｔｅｒｔ－ブチル２－（（ベンジル（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）－メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）－２－フェニルエチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート

ｉ）ｔｅｒｔ－ブチル２－（（ベンジル（２－ヒドロキシ－２－フェニルエチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（５００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）及びＣＤＩ（２８３ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ、１．２当量）の混合物を無水アセトニトリル（６０ｍＬ）に溶解し、溶液を、Ｎ２下、５０℃で１時間にわたって加熱して、ＬＣ－ＭＳによりジアステレオマー中間体へのクリーンな変換を得た。ii）次いで、５’－Ｏ－ＴＢＤＰＳ－チミジン（５６０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（０．４４ｍＬ、２．９２ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、溶液を終夜撹拌した。水／ＥｔＯＡｃ／ブライン後処理を行い、有機溶液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去した。次いで、生成物を、
０～６０％酢酸エチル－ガソリンで溶離するシリカクロマトグラフィーによって精製して、ジアステレオマー生成物を白色泡状物、７００ｍｇ、６３％として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ｃ（長時間酸性）；保持時間＝２．８８及び２．９３、ｍ／ｚ９３１．６（ＭＨ＋）。構造と一致する１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）。
実施例６Ｄ：２－（ベンジル（ピペリジン－２－イルメチル）アミノ）－１－フェニルエチル（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）カーボネート

ｔｅｒｔ－ブチル２－（（ベンジル（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）－メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）－２－フェニルエチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（２００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を２：１ ＤＣＭ：ＴＦＡ（５ｍＬ）に溶解し、溶液を室温で３時間にわたって撹拌した。この時間の後、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３×５０ｍＬ）を添加し、層を分離した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下、２０℃で除去して、ジアステレオマー生成物を白色泡状物、１６０ｍｇ、８８％として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ｃ（長時間酸性）；保持時間＝２．３１、２．３３及び２．３６、ｍ／ｚ８３１．６（ＭＨ＋）。構造と一致する１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）。
無保護α－フェニルセーフティキャッチリンカー（実施例６Ｄの化合物）に対する時間経過研究

この研究の狙いは、α－炭素における置換が容認されるか否かを決定することであった。反応は、非置換アナログについてはより緩徐であったが、クリーンに進んだことが観察された（図１３）。したがって、置換基の存在を使用して、リンカー／保護基の開裂の速度の追加の制御を提供することができる。
二重セーフティキャッチ保護基

実施例８Ａ： ジ－ｔｅｒｔ－ブチル２，２’－（（（２－ヒドロキシエチル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（ピペリジン－１－カルボキシレート）

１－Ｎ－Ｂｏｃ－２－ピペリジンカルボアルデヒド（１ｇ、２．３ｍｍｏｌ）及びエタノールアミン（０．１４３ｍＬ、２．３ｍｍｏｌ）を１，２－ジクロロエタン（１００ｍＬ）に溶解し、酢酸（６ｍＬ、８５ｍｍｏｌ、５当量）を添加した。１０分後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２．７ｇ、３．４５ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した
。１時間後、中間体及び生成物の両方の混合物がＬＣ－ＭＳによって可視であった。それ故、他の当量のアルデヒド、続いて、別の当量のトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、次いで、溶液を終夜撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液／ＤＣＭ後処理を行い、有機溶液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去した。次いで、粗生成物を、ＤＣＭ－ＥｔＯＡｃ（０～５０％）で溶離するシリカクロマトグラフィーによって精製して、生成物を淡黄色油状物、１ｇ、９５％として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ａ（酸性）；保持時間＝１．８４、ｍ／ｚ４５６．４（ＭＨ＋）。
実施例８Ｂ： ジ－ｔｅｒｔ－ブチル２，２’－（（（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）アザンジイル）ビス（メチレン））－ビス（ピペリジン－１－カルボキシレート）

ｉ）５’－Ｏ－ＴＢＰＤＳ－チミジン（３４０ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）及びＣＤＩ（１３０ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ、１．２当量）を乾燥アセトニトリル（６０ｍＬ）に溶解し、溶液を５０℃で４時間にわたって加熱し、次いで、週末にかけて放置した。ii）ジ－ｔｅｒｔ－ブチル２，２’－（（（２－ヒドロキシエチル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（ピペリジン－１－カルボキシレート）（３２３ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（０．２ｍＬ、１．４２ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、溶液を４０℃で２時間にわたって撹拌し、この時間の後に、ＬＣ－ＭＳにより反応は完了していた。水／ＥｔＯＡｃ後処理を行い、有機溶液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、ＤＣＭ中０～８０％ＥｔＯＡｃで溶離するシリカクロマトグラフィーによって精製して、生成物を白色泡状物、２８０ｍｇ、４１％として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ｃ（長時間酸性）保持時間＝４．０３、ｍ／ｚ９６２．７（ＭＨ＋）。
実施例８Ｃ： ２－（ビス（ピペリジン－２－イルメチル）アミノ）エチル（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）カーボネート

ジ－ｔｅｒｔ－ブチル２，２’－（（（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）アザンジイル）ビス（メチレン））ビス（ピペリジン－１－カルボキシレート）（５０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）を１：１ ＴＦＡ：ＤＣＭ（２ｍＬ）に室温で溶解した。３０分後、ＬＣ－ＭＳにより反応は完了した。ＤＣＭ及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を添加し、層を分離した。ＤＣＭ層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下、２０℃で除去して、生成物を白色泡状物、３０ｍｇ、７６％として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ａ（酸性）；保持時間＝１．７３、ｍ／ｚ７６２．４（ＭＨ＋）。
二重セーフティキャッチリンカー（実施例８Ｃの化合物）の時間経過研究

この研究の狙いは、単活性化基化合物（実施例１Ｃの化合物）のリンカー開裂と比較して、２つの活性化基を含有するリンカー（実施例８Ｃの化合物）がリンカー開裂時間の加速を有するか否かを調査することであった。この研究の結果を図１４に示す。余分な活性化基は、リンカー開裂のスピードを大幅に増大させることが分かった。さらに、２つの活性化基（すなわち、環Ａ）の存在は、両方の保護基の１００％脱保護を行うこと、又は分子当たり少なくとも１つの活性化基が脱保護されるまで脱保護ステップのみを行うことのいずれかによって、リンカー開裂の２ステップのより優れた制御を可能にする。
表面に結合するための官能性を持つリンカーの合成

実施例１０Ａ： ２－（（４－エチニルベンジル）アミノ）エタン－１－オール

４－エチニルベンズアルデヒド（５ｇ、３８ｍｍｏｌ）及びエタノールアミン（２．３ｇ、３８ｍｍｏｌ）をメタノール（２００ｍＬ）に溶解し、水素化ホウ素ナトリウム（１．４ｇ、３８ｍｍｏｌ）を１０分後に添加した。反応溶液を終夜撹拌した。この時間の後、水／酢酸エチル後処理を行い、有機溶液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカクロマトグラフィー（０～１０％ＭｅＯＨ－ＤＣＭ）によって精製して、無色油状物を得、これを静置して結晶化させ、全体で３ｇ、４５％とした。ＬＣ－ＭＳ；方法Ｂ（塩基性）；保持時間＝１．５５、ｍ／ｚ１７６．１（ＭＨ＋）。
実施例１０Ｂ： ｔｅｒｔ－ブチル２－（（（４－エチニルベンジル）（２－ヒドロキシエチル）アミノ）－メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート

２－（（４－エチニルベンジル）アミノ）エタン－１－オール（１．６ｇ、８．５ｍｍｏｌ）及び１－Ｎ－Ｂｏｃ－２－ピペリジンカルボアルデヒド（２ｇ、９ｍｍｏｌ、１．１当量）を１，２－ジクロロエタン（８０ｍＬ）に溶解し、酢酸（３ｍＬ、８５ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、溶液を室温で１０分間にわたって撹拌した。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、３時間後、ＬＣ－ＭＳにより生成物へのクリーンな変換があった。ＤＣＭ／飽和ＮａＨＣＯ３水溶液後処理を行い、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去して、淡黄色油状物、３．４ｇ、１００％を得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ａ（酸性）；保持時間＝１．６４、ｍ／ｚ３７３．３（ＭＨ＋）。
実施例１０Ｃ： ｔｅｒｔ－ブチル２－（（（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－
（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）（４－エチニルベンジル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート

ｉ）５’－Ｏ－ＴＢＤＰＳ－チミジン（２ｇ、４．１ｍｍｏｌ）及びＣＤＩ（７９７ｍｇ、４．９２ｍｍｏｌ、１．２当量）を、Ｎ２下、乾燥アセトニトリル（１００ｍＬ）に溶解した。次いで、溶液を室温で終夜撹拌した。この時間の後、ＬＣ－ＭＳにより活性中間体へのクリーンな変換があった。ｔｅｒｔ－ブチル２－（（（４－エチニルベンジル）（２－ヒドロキシエチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（１．５５ｇ、４．１ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（１．２ｍＬ、８．１ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、溶液を室温で撹拌した。３０分後、反応は完了していた。酢酸エチル／水後処理を行い、粗生成物をシリカクロマトグラフィー（０～１００％ＥｔＯＡｃ－ＤＣＭ）によって精製して、淡黄色油状物、２．２ｇ、６１％を得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ａ（酸性）；保持時間＝３．２９、ｍ／ｚ８７９．６（ＭＨ＋）。

実施例１１Ａ： １－（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－５－ヨードピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン

２’－デオキシ－５－ヨードウリジン（５ｇ、１４ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（２．９ｇ、４２ｍｍｏｌ、３当量）をＤＭＦ（８０ｍＬ）に溶解し、溶液を氷浴中で冷却し、ＴＢＤＰＳＣｌ（４．２ｇ、１７ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。溶液を室温に加温し、２時間にわたって撹拌し、この時間の後に、ＬＣ－ＭＳにより反応は完了していた。水／ＥｔＯＡｃ／ブライン後処理を行い、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を除去して、淡黄色油状物を得た。ＥｔＯＡｃ及びガソリンを添加して、結晶化を誘発し、得られた固体をガソリン－ＥｔＯＡｃ洗浄により濾過除去して、生成物を白色結晶性固体、５．５ｇ、６９％として得た。２０１６＿０６＿０１＿０１２、保持時間２．５４、実測値５９３．０、純度９８％。ＬＣ－ＭＳ；方法Ａ（酸性）；保持時間＝２．５２、ｍ／ｚ５９３．０（ＭＨ＋）。
実施例１１Ｂ： Ｎ－（３－（１－（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－イル）プロパ－２－イン－１－イル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド

１－（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－５－ヨードピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン（５ｇ、８．４ｍｍｏｌ）、２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－（プロパ－２－イン－１－イル）アセトアミド（３．８ｇ、２５．２ｍｍｏｌ、３当
量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１ｇ、０．８４ｍｍｏｌ、０．１当量）、トリエチルアミン（２ｍＬ、１６．８ｍｍｏｌ、２当量）及びヨウ化銅（３２５ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ、０．２当量）を、Ｎ２下、無水ＤＭＦ（８０ｍＬ）に溶解し、反応混合物を湯浴（４０℃）中で短時間加熱し、次いで、室温で３０分間にわたって撹拌した。この時間の後、ＬＣ－ＭＳにより反応は完了した。水／ＥｔＯＡｃ／ブライン後処理を行い、有機溶液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下で除去した。得られた油状物をシリカクロマトグラフィー（０～１００％ＥｔＯＡｃ－ガソリン、次いで０～５％ＤＣＭ－メタノール）によって精製して、生成物をオフホワイトの固体、３ｇ、６０％として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ａ（酸性）；保持時間＝２．４５、ｍ／ｚ６１６．２（ＭＨ＋）。
実施例１１Ｃ： ｔｅｒｔ－ブチル２－（（（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（２，４－ジオキソ－５－（３－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）プロパ－１－イン－１－イル）－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）（４－エチニルベンジル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート

Ｎ－（３－（１－（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－イル）プロパ－２－イン－１－イル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド（２．３ｇ、３．７ｍｍｏｌ）及びＣＤＩ（７２０ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ、１．２当量）をアセトニトリル（１００ｍＬ）に溶解し、溶液をＮ２下で終夜撹拌した。この時間の後、ｔｅｒｔ－ブチル２－（（（４－エチニルベンジル）（２－ヒドロキシエチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（１．４ｇ、３．７ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（１．１ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、溶液を室温で撹拌した。３０分後、ＬＣ－ＭＳにより反応は完了していた。酢酸エチル／水後処理を行い、粗生成物をシリカクロマトグラフィー（０～１００％ＥｔＯＡｃ－ＤＣＭ）によって精製して、淡黄色泡状物、９００ｍｇ、２３％を得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ａ（酸性）；保持時間＝３．２２、ｍ／ｚ１０１４．５（ＭＨ＋）。
実施例１１Ｄ： ｔｅｒｔ－ブチル２－（（（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－５－（５－（３－アミノプロパ－１－イン－１－イル）－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）（４－エチニルベンジル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート

ｔｅｒｔ－ブチル２－（（（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）－５－（２，４－ジオキソ－５－（３－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）プロパ－１－イン－１－イル）－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）（４－エチニルベンジル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（５００ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を１：１ ２５％アンモニア水溶液：アセトニトリル（２０ｍＬ）に溶解した。室温で４時間後、溶媒を減圧下で除去し、残留物をシリカクロマトグラフィー（０～７０％ＥｔＯＡｃ－ＤＣＭ、次いで０～１０％ＭｅＯＨ－ＤＣＭ）によって精製して、生成物を淡黄色泡状物、２８０ｍｇ、６２％として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ａ（酸性）；保持時間＝２．３２、ｍ／ｚ９１８．６（ＭＨ＋）。
実施例１１Ｅ： ｔｅｒｔ－ブチル２－（（（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－５－（５－（３－（３’，６’－ビス（ジメチルアミノ）－３－オキソ－３Ｈ－スピロ［イソベンゾフラン－１，９’－キサンテン］－６－カルボキサミド）プロパ－１－イン－１－イル）－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）（４－エチニルベンジル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート

ｔｅｒｔ－ブチル２－（（（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－５－（５－（３－アミノプロパ－１－イン－１－イル）－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）（４－エチニルベンジル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（１１０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、６－ＴＡＭＲＡ Ｎ－スクシンイミジルエステル（６３ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ）及びヒューニッヒ塩基（５０μＬ、０．２４ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。溶液を終夜撹拌し、この時間の後に、ＬＣ－ＭＳにより反応はクリーンに完了していた。溶媒を減圧下で除去し、残留物をシリカクロマトグラフィー（０～２０％メタノール－ＤＣＭ）によって精製して、生成物を紫色固体、１４６ｍｇ、９１％として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ａ（酸性）；保持時間＝２．５７、ｍ／ｚ６６６．２（１／２Ｍ＋）。
実施例１１Ｆ： Ｂｏｃ保護リンカーを介して磁気ビーズと結合しているＴＡＭＲＡ色素タグ付き５’－Ｏ－ＴＢＤＰＳ－チミジン

ビーズ（Kerafast社製アジド磁気ビーズ、１μｍ、１ｍｇ当たり３０～５０ｎｍｏｌのアジド基）を、ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル２－（（（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－５－（５－（３－（３’，６’－ビス（ジメチルアミノ）－３－オキソ－３Ｈ－スピロ［イソベンゾフラン－１，９’－キサンテン］－６－カルボキサミド）プロパ－１－イン－１－イル）－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－２－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）カルボニル）オキシ）エチル）（４－エチニルベンジル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（６．６ｍｇ、５μｍｏｌ、１０当量）の溶液に懸濁し、一部を除去して、クリック試薬を添加しない対照反応として使用した。主な反応混合物に、硫酸銅水溶液（０．１Ｍ、２５μＬ、２．５μｍｏｌ）及びアスコルビン酸ナトリウム水溶液（０．１Ｍ、５０μＬ、５μｍｏｌ）を添加し、この混合物を３日間にわたって激しく撹拌した。この時間の後、ビーズの両方のセットに対して、同一な一連の洗浄を行った；３×ＴＨＦ、３×ＤＣＭ、３×ＭｅＯＨ、２×ＴＨＦ、
２×ＭｅＯＨ及び２×ＤＣＭ。蛍光顕微鏡による検査により、銅触媒の存在下ではクリック反応が首尾よく起こったが、銅なしでは起こらず、したがって反応したビーズは強く蛍光であったことを確認した。さらに、アルキン及び触媒で処理したビーズは赤色であり、一方で、未処理のビーズは褐色のままであった。
ビーズの表面からのＴＡＭＲＡ色素タグ付き５’－Ｏ－ＴＢＤＰＳ－チミジンの熱的に媒介された開裂

ｉ）コーティングされたビーズを、ＴＦＡＡ：ＤＣＭ（１：２）中、室温で２時間にわたって激しく撹拌した。この時間の後、ビーズは依然として赤色であり、開裂したＴＡＭＲＡタグ付きＴＢＰＤＳ－チミジンは、反応溶液のＬＣ－ＭＳ試料中で検出されなかった。次いで、いかなる過剰なＴＦＡＡも除去するために、ビーズを、３×ＤＣＭ、３×ＭｅＯＨ及び次いで１０％ヒューニッヒ塩基－ＤＣＭで洗浄した。
ii）１ｍＬのＰＢＳ緩衝液及びアセトニトリルの１：１ ｐＨ７．４溶液プラス２～３滴のヒューニッヒ塩基をビーズに添加し、それらを、湯浴中、９０℃で４０分間にわたって加熱した。この時間の後、反応溶液のＬＣ－ＭＳは、開裂したＴＡＭＲＡタグ付きＴＢＰＤＳ－チミジンを表す明確なシグナルを示した。ビーズを洗浄し（３×アセトニトリル、３×ＭｅＯＨ）、蛍光顕微鏡で検査し、これは、蛍光シグナルが今やはるかに低減されたことを示した。さらに、ビーズは、それらの元の褐色に戻っていた。
５’－保護チミジンに対する実験

実施例１３Ａ： ｔｅｒｔ－ブチル２－（（（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－３－アセトキシ－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）カルボニル）オキシ）エチル）－（ベンジル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート

３’－Ｏ－アセチル－チミジン（５００ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＣＤＩ（３０７ｍｇ、１．９３ｍｍｏｌ、１．１当量）を無水アセトニトリル（４０ｍＬ）に溶解し、溶液を、Ｎ２下、４０℃で２時間にわたって撹拌した。この時間の後、ＬＣＭＳにより反応は完了し、室温に冷却した。次いで、ｔｅｒｔ－ブチル２－（（ベンジル（２－ヒドロキシエチル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（６７３ｍｇ、１．９３ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（０．２８ｍＬ、１．９３ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、溶液を室温で１８時間にわたって撹拌した。溶媒を真空で除去して、褐色油状物を得、これを水（５０ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）との間に分配し、層を分離した。水性層をＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を除去した。得られた油状物を、０～５０％ＥｔＯＡｃ－ガソリンで溶離するシリカクロマトグラフィーによって精製して、生成物を無色油状物、（２４０ｍｇ、３７％として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ａ（酸性）；保持時間＝１．９８、ｍ／ｚ６５８．３（ＭＨ＋）。
実施例１３Ｂ： （２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（（２－（ベンジル（ピペリジン－２－イルメチル）アミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イルアセテート

ｔｅｒｔ－ブチル２－（（（２－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－３－アセトキシ－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）カルボニル）オキシ）エチル）（ベンジル）アミノ）メチル）ピペリジン－１－カルボキシレート（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）に溶解し、溶液を室温で１時間にわたって撹拌した。この時間の後、ＬＣ－ＭＳにより反応は完了した。溶媒を除去し、ジクロロメタン（５０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）を添加し、層を分離した。有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を減圧下、２０℃で除去して、無色油状物を得、これをジエチルエーテルと共蒸発させて、生成物を白色固体（４０ｍｇ、４７％として得た。ＬＣ－ＭＳ；方法Ｂ（塩基性）；保持時間＝１．５１、ｍ／ｚ５５８（ＭＨ＋）。
５’－保護３’Ｏ－アセチル－チミジン（実施例１３Ｂの化合物）の開裂についての時間経過実験

ＭｅＣＮ中の（２Ｒ，３Ｓ，５Ｒ）－２－（（（（２－（ベンジル（ピペリジン－２－イルメチル）アミノ）エトキシ）カルボニル）オキシ）メチル）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）テトラヒドロフラン－３－イルアセテートの濃度が１０ｍｇ／ｍｌであることを除いて、高温及び低温における時間経過実験のための標準条件を順守した。
この研究の狙いは、熱的及びｐＨ制御されたセーフティキャッチ分子が、ヌクレオシド
の５’位のための保護基として使用され得ることを実証することであった。この研究は、分子が、この位置における有効なセーフティキャッチ保護基であり、したがって、オリゴヌクレオチド合成において使用するために適切となり得ることを示した。故に、図１５に示される通り、化合物は室温において安定であり、３’－Ｏ－アセチル－チミジンを放出するための高速及びクリーンな開裂は、９０℃において容易に達成される。

Claims (56)

  1. 固体基板の表面上の複数の部位における１又は同じ若しくは異なる２以上のオリゴヌクレオチドの並列合成のための方法であって、
    （ｉ）各部位に、複数のヌクレオシド又はヌクレオチドを用意するステップであって、各ヌクレオシド又はヌクレオチドが、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含み、前記ヌクレオシド又はヌクレオチドが、固体基板の表面上に固定されるステップと；
    （ii）前記固体基板の前記表面上の選択された部位における前記ヌクレオシド又はヌクレオチドの５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行って、前記選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドを形成するステップと；
    （iii）前記選択された部位のそれぞれにおいて、前記脱保護された５’－ＯＨ基上に、
    ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトをカップリングするステップであって、前記ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトが、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含むステップと；得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
    （iv）前記基板の前記表面上の選択された部位における前記ヌクレオシド又はヌクレオチドの前記５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行うステップであって、前記選択された部位が、前ステップの前記選択された部位と同じであっても異なっていてもよいステップと、
    （ｖ）前記選択された部位のそれぞれにおいて、前記脱保護された５’－ＯＨ基上に、ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトをカップリングするステップであって、前記ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトが、５’－ＯＨ保護基を含むステップと、得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
    （vi）ステップ（iv）及び（ｖ）を１又は２回以上繰り返して、固体基板の表面上の各部位において所望のオリゴヌクレオチドを得るステップとを含み、
    前記５’－ＯＨ保護基が、式（L－１’）で表され、

    ＊は、前記ヌクレオシドの５’－ＯＨ基への接続ポイントを表し、
    Ｘは、水素又はヒドロカルビルを表し、
    Ｙは、ヒドロカルビル又は

    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ７のそれぞれは、同一又は異なっており、かつ独立して、水素又はヒドロカルビルを表し、
    ＰＧは、窒素のための開裂可能な保護基を表し、
    ｎは、０、１、２、または３を表し、かつ
    環Ａは、窒素含有複素環基を表し、
    それぞれの事象においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ＰＧ及びＡは、同一又は異なっていてもよい、
    前記方法。
  2. （ｉ）各部位に、複数のヌクレオシドを用意するステップであって、各ヌクレオシドが、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含み、前記ヌクレオシドが、固体基板の表面上に固定されるステップと；
    （ii）前記固体基板の前記表面上の選択された部位における前記ヌクレオシドの５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行って、前記選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基を有するヌクレオシドを形成するステップと；
    （iii）前記選択された部位のそれぞれにおいて、前記脱保護された５’－ＯＨ基上に、
    ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトをカップリングするステップであって、前記ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトが、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含むステップと；得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
    （iv）前記基板の前記表面上の選択された部位における前記ヌクレオシドの前記５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行うステップであって、前記選択された部位が、前ステップの前記選択された部位と同じであっても異なっていてもよいステップと、
    （ｖ）前記選択された部位のそれぞれにおいて、前記脱保護された５’－ＯＨ基上に、ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトをカップリングするステップであって、前記ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトが、５’－ＯＨ保護基を含むステップと、得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
    （vi）ステップ（iv）及び（ｖ）を１又は２回以上繰り返して、固体基板の表面上の各部位において所望のオリゴヌクレオチドを得るステップとを含み、
    前記５’－ＯＨ保護基が、式（L－１’）で表され、

    ＊は、前記ヌクレオシドの５’－ＯＨ基への接続ポイントを表し、
    Ｘは、水素又はヒドロカルビルを表し、
    Ｙは、ヒドロカルビル又は

    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ７のそれぞれは、同一又は異なっており、かつ独立して、水素又はヒドロカルビルを表し、
    ＰＧは、窒素のための開裂可能な保護基を表し、
    ｎは、０、１、２、または３を表し、かつ
    環Ａは、窒素含有複素環基を表し、
    それぞれの事象においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ＰＧ及びＡは、同一又は異なっていてもよい、
    請求項１に記載の固体基板の表面上の複数の部位における１又は同じ若しくは異なる２以上のオリゴヌクレオチドの並列合成のための方法。
  3. （ｉ）各部位に、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含む複数のヌクレオシドを用意するステップであって、前記ヌクレオシドが、固体基板の表面上に固定されるステップと；
    （ii）前記固体基板の前記表面上の選択された部位における前記ヌクレオシドの５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行って、前記選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基を有するヌクレオシドを形成するステップと；
    （iii）前記選択された部位のそれぞれにおいて、熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を
    含むヌクレオシド３’－ホスホロアミダイトを、前記脱保護された５’－ＯＨ基上にカップリングするステップと；得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
    （iv）前記基板の前記表面上の選択された部位における前記ヌクレオシドの前記５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行うステップであって、前記選択された部位が、前ステップの前記選択された部位と同じであっても異なっていてもよいステップと；
    （ｖ）前記選択された部位のそれぞれにおいて、５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシド３’－ホスホロアミダイトを、前記脱保護された５’－ＯＨ基上にカップリングするステップと、得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
    （vi）ステップ（iv）及び（ｖ）を１又は２回以上繰り返して、固体基板の表面上の各部位において所望のオリゴヌクレオチドを得るステップとを含み、
    前記５’－ＯＨ保護基が、式（L－１’）で表され、

    ＊は、前記ヌクレオシドの５’－ＯＨ基への接続ポイントを表し、
    Ｘは、水素又はヒドロカルビルを表し、
    Ｙは、ヒドロカルビル又は

    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ７のそれぞれは、同一又は異なっており、かつ独立して、水素又はヒドロカルビルを表し、
    ＰＧは、窒素のための開裂可能な保護基を表し、
    ｎは、０、１、２、または３を表し、かつ
    環Ａは、窒素含有複素環基を表し、
    それぞれの事象においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ＰＧ及びＡは、同一又は異なっていてもよい、
    請求項１又は２に記載の固体基板の表面上の複数の部位における１又は同じ若しくは異なる２以上のオリゴヌクレオチドの並列合成のための方法。
  4. ステップ（ｉ）におけるヌクレオシド又はヌクレオチドが、熱的に開裂可能なリンカー基を介して３’位において固体基板の表面に結合している、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. ステップ（ii）及び（iv）における熱的に制御された脱保護が、選択された部位における局部加熱によって実現される、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 選択された部位以外の部位において、５’－ＯＨ保護基の０．５％未満がステップ（ii）及び（iv）において脱保護される、請求項５に記載の方法。
  7. カップリングステップ（iii）及び（ｖ）が、５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトを含有する溶液を、基板の表面と接触させることを含み、前記ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトが、選択された部位において脱保護された５’－ＯＨ基と反応する、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 選択された部位以外の部位の０．５％未満において、ステップ（iii）及び（v）におけるヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト又はジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトと反応する、請求項７に記載の方法。
  9. ステップ（ｉ）の５’－ＯＨ保護ヌクレオシドが、熱的に開裂可能なリンカー基を介して３’位において固体基板の表面に結合しており、第１のヌクレオシドを前記表面に結合している前記熱的に開裂可能なリンカーが、オリゴヌクレオチド合成ステップ中の除去に対して安定である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. オリゴヌクレオチドの脱保護の熱制御が、チップ上の個々に熱的に対処可能な部位によって提供される、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. 固体基板が、チップを備え、方法が、
    （ｉ）各部位に、式（L－１’）で表される前記５’－ＯＨにおいて熱的に開裂可能な保護基を含む複数のヌクレオシドを用意するステップであって、前記ヌクレオシドが、熱的に開裂可能なリンカー基を介して３’位において固体基板の表面に結合しているステップと；
    （ii）前記チップの表面上の選択された部位における前記ヌクレオシドの前記５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行って、前記選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基を有するヌクレオシドを形成するステップと；
    （iii）前記選択された部位のそれぞれにおいて、前記脱保護された５’－ＯＨ基に、ヌ
    クレオシド３’－ホスホロアミダイト、ジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトをカップリングするステップであって、前記ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト、ジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトが、式（L－１’）で表される前記熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含むステップと；得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
    （iv）前記基板の前記表面上の選択された部位における前記ヌクレオシドの前記５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行うステップであって、前記選択された部位が、前ステップの前記選択された部位と同じであっても異なっていてもよいステップと、
    （ｖ）前記選択された部位のそれぞれにおいて、前記脱保護された５’－ＯＨ基上に、ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト、ジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトをカップリングするステップであって、前記ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト、ジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトが、式（L－１’）で表される前記熱
    的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含むステップと；得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
    （vi）ステップ（iv）及び（ｖ）を１又は２回以上繰り返して、前記チップの前記表面上の各部位において所望のオリゴヌクレオチドを得るステップであって、前記チップが、個々に熱的に対処可能な部位を含むステップと
    を含む、請求項１又は２に記載の固体基板の表面上の複数の部位における１又は同じ若しくは異なる２以上のオリゴヌクレオチドの並列合成のための方法。
  12. 固体基板が、チップを備え、方法が、
    （ｉ）各部位に、式（L－１’）で表される前記５’－ＯＨにおいて熱的に開裂可能な保護基を含む複数のヌクレオシドを用意するステップであって、前記ヌクレオシドが、熱的に開裂可能なリンカー基を介して３’位において固体基板の表面に結合しているステップと；
    （ii）前記チップの表面上の選択された部位における前記ヌクレオシドの前記５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行って、前記選択された部位のそれぞれにおいて、脱保護された５’－ＯＨ基を有するヌクレオシドを形成するステップと；
    （iii）前記選択された部位のそれぞれにおいて、ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト、ジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトであって、式（L－１’）で表される前記熱的に開裂可能な５’－ＯＨ保護基を含む前記ヌクレオシド３’－ホスホロアミダイト、ジ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイト又はトリ－ヌクレオチド３’－ホスホロアミダイトを、前記脱保護された５’－ＯＨ基上にカップリングするステップと；得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
    （iv）前記基板の前記表面上の選択された部位における前記ヌクレオシドの前記５’－ＯＨにおいて熱的に制御された脱保護を行うステップであって、前記選択された部位が、前ステップの前記選択された部位と同じであっても異なっていてもよいステップと、
    （ｖ）前記選択された部位のそれぞれにおいて、式（L－１’）で表される前記熱的に開
    裂可能な５’－ＯＨ保護基を含むヌクレオシド３’－ホスホロアミダイトを、前記脱保護された５’－ＯＨ基上にカップリングするステップと；得られた亜リン酸トリエステル基を酸化して、リン酸トリエステル基とするステップと；
    （vi）ステップ（iv）及び（ｖ）を１又は２回以上繰り返して、前記チップの前記表面上の各部位において所望のオリゴヌクレオチドを得るステップであって、前記チップが、個々に熱的に対処可能な部位を含むステップと
    を含む、請求項２に記載の固体基板の表面上の複数の部位における１又は同じ若しくは異なる２以上のオリゴヌクレオチドの並列合成のための方法。
  13. 固体基板が、前記固体基板の複数の部位において温度を制御するための温度制御デバイスを備え、前記温度制御デバイスが、
    （ｉ）前記基板上のそれぞれの場所に位置する複数のアクティブ熱部位であって、各アクティブ熱部位が、前記媒体の対応する部位に可変量の熱を印加するように構成された加熱体、及び前記加熱体と前記基板の間に位置する断熱層を備える、前記複数のアクティブ熱部位と；
    （ii）前記基板上の前記複数のアクティブ熱部位間に位置する１又は２以上のパッシブ熱領域であり、各パッシブ熱領域が、前記媒体の対応部から前記基板へ熱を伝導するように構成された熱伝導層を備える、１又は２以上のパッシブ熱の領域とを備え；
    前記１又は２以上のパッシブ熱領域の前記熱伝導層が、前記複数のアクティブ熱部位の前記断熱層よりも前記基板の平面に垂直な方向において、より低い熱抵抗を有する、
    請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 熱的に開裂可能なリンカー基が、式（Ｌ－１）：
    ［式中、
    － ＊は、ヌクレオシドの３’－ＯＨとの結合点を表し；
    － Ｘは、水素又はヒドロカルビルを表し；
    － Ｙは、ヒドロカルビル又は
    Figure 0007493452000135
     を表し；
    － Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ７のそれぞれは、同じであるか又は異なり、それぞれ独立して、水素又はヒドロカルビルを表し；
    － ＰＧは、窒素のための開裂可能な保護基を表し、式（L－１’）における前記ＰＧ基とは異なり、；
    － ｎは、０、１、２又は３を表し；
    － 環Ａは、窒素含有ヘテロ環式基を表し；
    各出現において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ＰＧ及びＡは、同じであっても異なっていてもよく、
    これは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｘ、Ｙ又はＡの１つにおいて前記基板と結合しており、又は、Ｙが
    Figure 0007493452000136
     である場合、Ｒ７において前記基板と結合しているか、
    或いは、前記開裂可能なリンカーは、Ｙがヒドロカルビルである場合、Ｙにおいて前記基板と結合している］
    によって表される、請求項４～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 保護基ＰＧの少なくとも１つが、第１の反応条件下で開裂可能であって、それにより脱保護されたリンカーを生成し、前記脱保護されたリンカーが、第２の異なる反応条件下で分子内環化及び開裂を受けることができ、二酸化炭素を放出して、式（II）：
    の化合物を生成し、それにより、表面からオリゴヌクレオチドを放出し；
    式中、ＰＧ’は、水素、又は窒素のための開裂可能な保護基であり、但し、少なくとも１つのＰＧ’は、水素であり；
    － Ｙ’は、ヒドロカルビル、又は
    Figure 0007493452000138
     を表し；
    式中、Ｘ、Ｒ１～Ｒ５、Ｒ７、Ａ、及びｎは、請求項１４で定義されている通りである、請求項１４に記載の方法。
  16. Ｙが、ヒドロカルビルを表し、又は、Ｙが、Ｃ１－２０ヒドロカルビル若しくはＣ１－１０若しくはＣ１－６ヒドロカルビルを表し、又は、前記Ｃ１－２０若しくはＣ１－１０若しくはＣ１－６ヒドロカルビルが、アルキル、アリール、アルカリール及びアリールアルキル、アルケニル若しくはアルキニルであり、又は、Ｙが、Ｃ１－１０アルキル又はＣ６－１０アリールである、請求項１４又は１５に記載の方法。
  17. 保護基ＰＧの少なくとも１つが、第１の反応条件下で開裂可能であり、それにより脱保護されたリンカーを生成し、前記脱保護されたリンカーが、第２の異なる反応条件下で分子内環化及び開裂を受けることができ、二酸化炭素を放出して、式（II）：
    の化合物を生成し、それにより、ヌクレオシドの５’－ＯＨ基を脱保護し；
    式中、
    － ＰＧ’は、水素、又は窒素のための開裂可能な保護基であり、但し、少なくとも１つのＰＧ’は、水素であり；
    － Ｙ’は、ヒドロカルビル、又は
    Figure 0007493452000140
     を表し；
    式中、Ｘ、Ｒ１～Ｒ５、Ｒ７、Ａ、及びｎは、請求項１で定義されている通りである、請求項１～１６に記載の方法。
  18. ５’－ＯＨ保護基が、式（ＩＢ’）：
    Figure 0007493452000141
     ［式中、＊、Ｘ、Ｒ１～Ｒ５、Ｒ７、ＰＧ、Ａ、及びｎは、請求項１で定義されている通りである］
    を有する、請求項１～１７に記載の方法。
  19. Ｒ１～Ｒ５、ＰＧ及びＡが、式（ＩＢ）における各出現において同じである、請求項１８に記載の方法。
  20. 保護基ＰＧの少なくとも１つが、第１の反応条件下で開裂可能であり、それにより式（ＩＢ＊’）：
    Figure 0007493452000142
     ［式中、
    － ＰＧ’は、水素、又は窒素のための開裂可能な保護基であり、但し、少なくとも１つのＰＧ’は、水素であり；
    ＊、Ｘ、Ｒ１～Ｒ５、Ｒ７、Ａ、及びｎは、請求項１で定義されている通りである］の化合物を生成し；
    式（ＩＢ＊）の化合物が、第２の異なる反応条件下で分子内環化及び開裂を受けることができ、二酸化炭素を放出して、式（IIＢ’）：
    Figure 0007493452000143
     の化合物を生成し、それにより、５’－ＯＨにおける前記保護基を除去する、
    請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 環Ａが、４～１２員の単環式、二環式又は三環式窒素含有ヘテロ環式基を表し、これが、窒素に加えて、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される１又は２以上の他のヘテロ原子を含有してよい、請求項１４～２０のいずれかに記載の方法。
  22. 環Ａが、４～８員の単環式ヘテロ環式基を表す、請求項１４～２１のいずれかに記載の方法。
  23. 環Ａが、５、６又は７員の単環式ヘテロ環式基を表す、請求項１４～２２のいずれかに記載の方法。
  24. 環Ａが、ピペリジル、モルホリニル、ピロリジニル、チオモルホリニル及びイミダゾリルから選択されるヘテロ環を表す、請求項１４～２３のいずれかに記載の方法。
  25. 環Ａが、ピペリジル、ピロリジニル又はイミダゾリルを表す、請求項１４～２４のいずれかに記載の方法。
  26. 環Ａが、ピペリジル又はピロリジニルを表す、請求項１４～２５のいずれかに記載の方法。
  27. －Ｃ（Ｒ３）（Ｒ４）の各出現において、Ｒ３又はＲ４の一方がヒドロカルビルであり、他方がＨであるか、或いはＲ３及びＲ４が、各出現において、Ｈを表す、請求項１４～２６のいずれかに記載の方法。
  28. ｎが、０、１又は２である、請求項１４～２７のいずれかに記載の方法。
  29. ｎが、１である、請求項１４～２８のいずれかに記載の方法。
  30. Ｘが、Ｈ又はヒドロカルビルであって、前記ヒドロカルビルが、アルキル、アリール及びアリールアルキルからなる群から選択され、又は、前記アルキル、アリール若しくはアリールアルキルが、Ｃ１－２０、Ｃ１－１０若しくはＣ１－８であり、又は、Ｘが、Ｈ、Ｃ１－１０アルキル、Ｃ６－１０アリール若しくはＣ７－１２アリールアルキルであり；又は、Ｘが、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ６－１０アリール若しくはＣ７－１２アリールアルキルであり；又は、Ｘが、Ｈである、請求項１４～２９のいずれかに記載の方法。
  31. Ｘが、Ｈ若しくはアリールであり、又は、Ｘが、Ｈ若しくはフェニルである、請求項３０に記載の方法。
  32. Ｒ１及びＲ２が、Ｈ、アルキル、アリール若しくはアリールアルキルから独立して選択され、又は、前記アルキル、アリール若しくはアリールアルキルが、Ｃ１－２０、Ｃ１－１０若しくはＣ１－６であり、又は、Ｒが、Ｈ、Ｃ１－１０アルキル、Ｃ６－１０アリール若しくはＣ７－１２アリールアルキルであり、又は、Ｒ１及びＲ２が、Ｈである、請求項１４～３１のいずれかに記載の方法。
  33. Ｒ３及びＲ４が、Ｈ、アルキル、アリール若しくはアリールアルキルから独立して選択され、又は、前記アルキル、アリール若しくはアリールアルキルが、Ｃ１－２０、Ｃ１－１０若しくはＣ１－６であり、又は、Ｒが、Ｈ、Ｃ１－１０アルキル、Ｃ６－１０アリール若しくはＣ７－１２アリールアルキルであり、又は、Ｒ１及びＲ２が、Ｈである、請求項１４～３２のいずれかに記載の方法。
  34. Ｒ５が、Ｈである、請求項１４～３３のいずれかに記載の方法。
  35. 少なくとも１つの保護基ＰＧの開裂が、ｐＨ、温度、放射線によって、若しくは化学的活性剤によって、又はそれらの組合せによって活性化され得る、請求項１４～３４のいずれかに記載の方法。
  36. 少なくとも１つの保護基ＰＧの開裂が、ｐＨ、温度、化学的活性化剤によって、又はそれらの組合せによって活性化され得る、請求項１４～３５のいずれかに記載の方法。
  37. 少なくとも１つの保護基ＰＧが、熱的に開裂可能であり、活性剤の存在下であってもよい、請求項１４～３６のいずれかに記載の方法。
  38. 少なくとも１つの保護基ＰＧが、活性剤の非存在下で熱的に開裂可能ではない、請求項１４～３７のいずれかに記載の方法。
  39. 活性剤が、酸又は塩基である、請求項１４～３８のいずれかに記載の方法。
  40. ＰＧが、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリチル（Ｔｒｔ）、ベンジルオキシカルボニル、α，α－ジメチル－３，５－ジメトキシベンジルオキシカルボニル（Ｄｄｚ）、２－（４－ビフェニル）イソプロポキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、２－ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）、トシル（Ｔｓ）から選択される、請求項１４～３９のいずれかに記載の方法。
  41. ＰＧが、（１，１－ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン－２－イル）メチルオキシカルボニル（Ｂｓｍｏｃ）、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、（１，１－ジオキソナフト［１，２－ｂ］チオフェン－２－イル）メチルオキシカルボニル（α－Ｎｓｍｏｃ）、２－（４－ニトロフェニルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｎｓｃ）、２，７－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｆｍｏｃ、２－フルオロ－Ｆｍｏｃ、２－モノイソオクチル－Ｆｍｏｃ（ｍｉｏ－Ｆｍｏｃ）及び２，７－ジイソオクチル－Ｆｍｏｃ（ｄｉｏ－Ｆｍｏｃ）、２－［フェニル（メチル）スルホニオ］エチルオキシカルボニルテトラフルオロボレート（Ｐｍｓ）、エタンスルホニルエトキシカルボニル（Ｅｓｃ）、２－（４－スルホフェニルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｓｐｓ）、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ＣＦ３Ｃ（＝Ｏ）－トリフルオロアセトアミドから選択される、請求項１４～４０のいずれかに記載の方法。
  42. ＰＧが、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ及びＢｓｍｏｃからなる群から選択される、請求項１４～４１のいずれかに記載の方法。
  43. ＰＧが、Ａｌｌｏｃである、請求項１４～４２のいずれかに記載の方法。
  44. 少なくとも１つのＹ基が、ヒドロカルビルであり、又は、少なくとも１つのＹが、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アルカリールであり、前記アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル若しくはアルカリール基が、末端アルキン基で置換されている、請求項１４～４３のいずれかに記載の方法。
  45. 少なくとも１つのＹ基が、末端アルキニル基で置換されている、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アルカリールであり、末端アルキン基が、Ｃ２－Ｃ６アルキニル基である、請求項１４～４４のいずれかに記載の方法。
  46. 少なくとも１つのＹ基が、アルキニル基で置換されているアラルキルであって、又は、１つのＹ基が、ＣＨ２－（Ｃ６Ｈ４）ＣＨ≡ＣＨである、請求項１４～４５のいずれかに記載の方法。
  47. 表面が、導電性材料を含む、又は、表面が、金若しくはシリコンを含む、請求項１～４６のいずれかに記載の方法。
  48. ヌクレオシドの、表面との結合が、官能基化カルベン又は官能基化アルキンとの会合を介する、ものである、請求項１～４７のいずれかに記載の方法。
  49. キャッピングステップを伴わない、請求項１～４８のいずれかに記載の方法。
  50. オリゴヌクレオチド合成の終わりにオリゴヌクレオチドを脱保護して、各部位において複数の固定されたオリゴヌクレオチドを形成するステップであって、前記オリゴヌクレオチドが、熱的に開裂可能なリンカー基を介して３’位において固体基板の表面に結合しているステップをさらに含む、請求項１～４９のいずれかに記載の方法。
  51. 熱的に開裂可能なリンカー基の開裂をさらに含み、それにより、オリゴヌクレオチドを表面から放出する、請求項５０に記載の方法。
  52. 熱的に開裂可能なリンカー基の開裂が、固体基板の表面上の選択された部位において行われ、それにより、オリゴヌクレオチドの選択的放出を提供する、請求項５１に記載の方法。
  53. オリゴヌクレオチドを放出及びハイブリダイズして核酸を形成するステップと、前記核酸を表面から放出するステップとをさらに含む、請求項１～５２のいずれかに記載の方法。
  54. 固体基板の表面上の複数の部位において、１又は２以上のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は核酸を含むマイクロアレイであって、
    前記ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は二本鎖核酸が、熱的に開裂可能なリンカーによって前記表面に結合している、
    前記熱的に開裂可能なリンカーが、式（L－１）で表される、

    ＊は、前記ヌクレオシドの３’－ＯＨ基への接続ポイントを表し、
    Ｘは、水素又はヒドロカルビルを表し、
    Ｙは、ヒドロカルビル又は
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ７のそれぞれは、同一又は異なっており、かつ独立して、水素又はヒドロカルビルを表し、
    ＰＧは、窒素のための開裂可能な保護基を表し、
    ｎは、０、１、２、または３を表し、かつ
    環Ａは、窒素含有複素環基を表し、
    それぞれの事象においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ＰＧ及びＡは、同一又は異なっていてもよい、
    マイクロアレイ。
  55. オリゴヌクレオチド、核酸、若しくは、ＤＮＡ又はＸＮＡを調製するための、請求項１～５３のいずれかに記載の方法の使用。
  56. オリゴヌクレオチド、核酸、若しくは、ＤＮＡ又はＸＮＡを調製するための、請求項５４に記載のマイクロアレイの使用。
JP2020539253A 2018-01-24 2019-01-23 オリゴヌクレオチド及び核酸の合成 Active JP7493452B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023198864A JP2024023388A (ja) 2018-01-24 2023-11-24 オリゴヌクレオチド及び核酸の合成

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1801182.5A GB201801182D0 (en) 2018-01-24 2018-01-24 Oligonucleotide and nucleic acid synthesis
GB1801182.5 2018-01-24
PCT/GB2019/050192 WO2019145713A1 (en) 2018-01-24 2019-01-23 Oligonucleotide and nucleic acid synthesis

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023198864A Division JP2024023388A (ja) 2018-01-24 2023-11-24 オリゴヌクレオチド及び核酸の合成

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2021510716A JP2021510716A (ja) 2021-04-30
JPWO2019145713A5 JPWO2019145713A5 (ja) 2022-02-24
JP7493452B2 true JP7493452B2 (ja) 2024-05-31

Family

ID=61283585

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020539253A Active JP7493452B2 (ja) 2018-01-24 2019-01-23 オリゴヌクレオチド及び核酸の合成
JP2023198864A Pending JP2024023388A (ja) 2018-01-24 2023-11-24 オリゴヌクレオチド及び核酸の合成

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023198864A Pending JP2024023388A (ja) 2018-01-24 2023-11-24 オリゴヌクレオチド及び核酸の合成

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20210047361A1 (ja)
EP (1) EP3743433A1 (ja)
JP (2) JP7493452B2 (ja)
KR (1) KR20200115561A (ja)
CN (1) CN111770928A (ja)
AU (1) AU2019213203B2 (ja)
CA (1) CA3088583A1 (ja)
GB (1) GB201801182D0 (ja)
IL (1) IL276149B (ja)
SG (1) SG11202006741WA (ja)
WO (1) WO2019145713A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11970696B1 (en) 2019-08-27 2024-04-30 Leidos, Inc. Optical methods and systems for DNA assembly for computer data storage
EP4298246A1 (en) 2021-02-26 2024-01-03 Avery Digital Data, Inc. Semiconductor chip devices and methods for polynucleotide synthesis
CN113004360A (zh) * 2021-03-03 2021-06-22 通用生物系统（安徽）有限公司 一种用于膜杂交检测的氨基修饰引物的生产方法
CN114621307A (zh) * 2022-04-12 2022-06-14 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种寡核苷酸空间坐标编码方法及其微流控装置
CN116333006A (zh) * 2023-04-07 2023-06-27 苏州欧利生物医药科技有限公司 一种带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004101582A2 (en) 2003-05-09 2004-11-25 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Thermolabile hydroxyl protecting groups and methods of use
US20080064867A1 (en) 2006-09-11 2008-03-13 Sigma Aldrich Company Process for the synthesis of oligonucleotides
JP2010248084A (ja) 2009-04-10 2010-11-04 Invitrogen Japan Kk 新規洗浄溶媒を用いるオリゴヌクレオチド合成法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6270391A (ja) * 1985-09-25 1987-03-31 Nippon Zeon Co Ltd 保護されたオリゴヌクレオチドの製造法
US5419874A (en) * 1992-07-06 1995-05-30 Beckman Instruments, Inc. Synthesis reaction column
EP1176151B1 (en) * 2000-07-28 2014-08-20 Agilent Technologies, Inc. Synthesis of polynucleotides using combined oxidation/deprotection chemistry

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004101582A2 (en) 2003-05-09 2004-11-25 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Thermolabile hydroxyl protecting groups and methods of use
US20080064867A1 (en) 2006-09-11 2008-03-13 Sigma Aldrich Company Process for the synthesis of oligonucleotides
JP2010248084A (ja) 2009-04-10 2010-11-04 Invitrogen Japan Kk 新規洗浄溶媒を用いるオリゴヌクレオチド合成法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J． Org. Chem.，2003年，68(26)，10003-10012
Tetrahedron Letters，2012年，53(6)，666-669

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019145713A1 (en) 2019-08-01
GB201801182D0 (en) 2018-03-07
IL276149A (en) 2020-09-30
US20240199681A1 (en) 2024-06-20
AU2019213203A1 (en) 2020-08-06
SG11202006741WA (en) 2020-08-28
WO2019145713A9 (en) 2020-08-06
CA3088583A1 (en) 2019-08-01
AU2019213203A9 (en) 2020-08-27
US20210047361A1 (en) 2021-02-18
JP2024023388A (ja) 2024-02-21
KR20200115561A (ko) 2020-10-07
IL276149B (en) 2022-08-01
EP3743433A1 (en) 2020-12-02
JP2021510716A (ja) 2021-04-30
AU2019213203B2 (en) 2023-02-23
CN111770928A (zh) 2020-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7493452B2 (ja) オリゴヌクレオチド及び核酸の合成
JP5274852B2 (ja) 光分解性化合物と前記化合物がカップリングしたオリゴマープローブアレイ用基板、オリゴマープローブアレイおよびその製造方法
AU2007315190B2 (en) Click chemistry for the production of reporter molecules
EP0746326A1 (en) Oligomeric compounds having nitrogen-containing linkages
McGall et al. Photolithographic synthesis of high-density oligonucleotide arrays
JP2022061994A (ja) 核酸アレイ合成のための、支持体、システム、および方法
CN106459128B (zh) 经修饰的胸腺嘧啶多核苷酸寡聚物和方法
US6756492B1 (en) Nucleoside derivatives with photo-unstable protective groups
WO2006076102A2 (en) Fluorescent nucleoside analogs that mimic naturally occurring nucleosides
US6121433A (en) Oligomeric compounds having nitrogen-containing linkages
US6184389B1 (en) Combinatorial libraries having aminodiol monomer subunits
KR20080015338A (ko) 광분해성 화합물 및 상기 화합물이 결합된 올리고머 프로브어레이용 기판
US11161869B2 (en) Thermally-cleavable protecting and linker groups
Burgin Synthesis and use of DNA containing a 5′-bridging phosphorothioate as a suicide substrate for type I DNA topoisomerases
Sinyakov et al. Linkers for oligonucleotide microarray synthesis
KR100228606B1 (ko) 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성 방법
US6207826B1 (en) Macrocyclic compounds having nitrogen-containing linkages
Agrawal et al. Oligonucleotides containing degenerate bases: synthesis and uses
Szmanda et al. Polyaminooligonucleotides and their combinatorial libraries
EP1517910A1 (en) Phosphoramidites for coupling oligonucleotides to (2 + 2) photoreactive groups
WO2022204102A1 (en) Universal linker reagents for dna synthesis
Flickinger Design, synthesis, and evaluation of safety-catch photolabile linkers: Applications for gene synthesis
WO2006127009A1 (en) Reagent for the improved synthesis of isoguanosine-containing oligonucleotides

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220120

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220120

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230111

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230407

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20230724

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20230913

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20230913

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231124

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20231227

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240213

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240403

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20240507

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240521

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7493452

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150