JP7491703B2 - 粒子分析方法および粒子分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、粒子分析方法および粒子分析装置に関する。

従来、血液試料に含まれる粒子の分類・計数が行われている。例えば、光学式の自動血球分析装置では、フローサイトメータを用いて血液試料中の粒子分析を行っている。フローサイトメトリー法では、具体的には、セルを流れる蛍光色素等で染色された細胞に、レーザ等の光源からの光を照射することによって得られる散乱光や蛍光の情報を用いて、細胞の数や大きさに加えて、細胞内部の核酸量等の情報をも得ている。

ところで、組織成分が色素本来の色調と異なった染色性を示す変調現象（メタクロマジー）を示す蛍光色素（メタクロマジー性染色色素）であるアクリジンオレンジ（ＡＯ）を用いて染色した血液試料をフローサイトメトリー方式の自動血球分析装置で分析する技術が提案されている（特許文献１）。具体的に、特許文献１には、フローサイトメトリーの結果に基づき、ＡＯで染色した血球細胞の蛍光強度をそれぞれの散乱光による細胞の大きさや形状で規格化して各細胞の蛍光濃度を求め、このようにして求められた各細胞の蛍光濃度に基づいて血液試料中の細胞を分類する技術が開示されている。

米国特許出願公開第２００９／０１３０６４７Ａ１号

しかしながら、特許文献１に記載の技術においては、血液試料中の粒子の大きさや形状で規格化された各細胞の蛍光濃度に基づいて血液試料中の細胞を分類しているに留まっている。そのため、依然として臨床的に有用な情報を十分に取得できていないという。

そこで本発明は、メタクロマジー性染色色素を用いて血液試料に含まれる粒子を分析する際に、臨床的に有用な情報をより多く取得することを可能としうる手段を提供することを目的とする。

本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、血液試料に含まれる各粒子の大きさで規格化された蛍光濃度に基づいて血液試料中の粒子を複数の粒子クラスタに分類（クラスタリング）した後、当該複数の粒子クラスタに含まれる少なくとも１つの粒子クラスタについて、前記粒子クラスタに含まれる各粒子の大きさを階級とするヒストグラム（本明細書中、「サイズヒストグラム」とも称する）を作成することにより、上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明の一形態によれば、血液試料に含まれる粒子を分析する粒子分析方法が提供される。当該粒子分析方法は、メタクロマジー性染色色素を用いて前記粒子を染色することと、染色された前記粒子に光を照射することと、前記血液試料に含まれる各粒子が発光する、前記メタクロマジー性染色色素のスタッキング成分に由来する第１の蛍光および前記メタクロマジー性染色色素のインターカレーション成分に由来する第２の蛍光の強度を測定することと、前記各粒子が発光する前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の強度を、前記各粒子の大きさでそれぞれ規格化することにより、前記各粒子における前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の蛍光濃度をそれぞれ求めることと、前記規格化によって求められた前記蛍光濃度の２次元プロットにおいて、前記各粒子を赤血球クラスタ、血小板クラスタおよび有核細胞クラスタの少なくとも２つを含む複数の粒子クラスタにクラスタリングすることと、前記複数の粒子クラスタに含まれる少なくとも１つの粒子クラスタについて、前記粒子クラスタに含まれる各粒子の大きさを階級とするサイズヒストグラムを作成することとを含む点に特徴がある。

また、本発明の他の形態によれば、上述した本発明の一形態に係る粒子分析方法を実行可能な装置として、血液試料に含まれる粒子に光を照射する光源と、前記血液試料を流すフローセルと、波長の異なる第１の蛍光の強度および第２の蛍光の強度をそれぞれ検出する複数の蛍光検出部を含む光検出部と、前記血液試料に含まれる各粒子が発光する前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の強度を、前記各粒子の大きさでそれぞれ規格化することにより、前記各粒子における前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の蛍光濃度をそれぞれ求め、前記規格化によって求められた前記蛍光濃度の２次元プロットにおいて、前記各粒子を赤血球クラスタ、血小板クラスタおよび有核細胞クラスタの少なくとも２つを含む複数の粒子クラスタにクラスタリングし、前記複数の粒子クラスタに含まれる少なくとも１つの粒子クラスタについて、前記粒子クラスタに含まれる各粒子の大きさを階級とするサイズヒストグラムを作成する、データ処理部とを有する、粒子分析装置もまた、提供される。

本発明によれば、メタクロマジー性染色色素を用いて血液試料に含まれる粒子を分析する際に、臨床的に有用な情報をより多く取得することが可能となる。

図１は、測定試料の調製を示す概略図である。 図２は、本発明の一形態に係る粒子分析方法を実施するための装置のシステム構成を示す図である。 図３は、本形態に係る粒子分析方法を実施するための装置の一実施形態としてのフローサイトメータの概略を示す系統図である。 図４は、前方散乱光（ＦＳ）と側方散乱光（ＳＳ）との２次元スキャッタグラム（ＦＳ×ＳＳサイトグラム）の測定例である。 第１の蛍光（ＦＬ１）と第２の蛍光（ＦＬ２）との２次元スキャッタグラム（ＦＬ１×ＦＬ２サイトグラム）の測定例である。 図６は、「規格化」の処理によって各粒子における第１の蛍光（ＦＬ１）の蛍光濃度（ＣＲｃ）および第２の蛍光（ＦＬ２）の蛍光濃度（ＣＤｃ）をそれぞれ求め、得られた結果に基づき作成したＣＲｃとＣＤｃとの２次元プロット図（本明細書中、「ＲＮＰダイアグラム」とも称する）である。 図７は、図６に示すＲＮＰダイアグラムから赤血球クラスタ（ＲＢＣｎ）をゲーティングすることによって分離して作成された、赤血球クラスタ（ＲＢＣｎ）についてのサイズヒストグラムの一例（後述する実施例において、赤血球の形態所見を伴う血液試料について本発明を適用して測定した際に作成されたもの）である。 図８Ａは、赤血球クラスタ（ＲＢＣｎ）について、当該クラスタに含まれる各粒子の第１の蛍光（ＦＬ１）の強度を横軸とし、当該クラスタに含まれる各粒子の大きさ（前方散乱光（ＦＳ）の強度）を縦軸とした２次元プロット図である。 図８Ｂは、血小板クラスタ（ＰＬＴｎ）について、当該クラスタに含まれる各粒子の第１の蛍光（ＦＬ１）の強度を横軸とし、当該クラスタに含まれる各粒子の大きさ（前方散乱光（ＦＳ）の強度）を縦軸とした２次元プロット図である。 図８Ｃは、有核細胞クラスタ（ＮＣｎ）について、当該クラスタに含まれる各粒子の第１の蛍光（ＦＬ１）の強度を横軸とし、当該クラスタに含まれる各粒子の大きさ（ここでは、前方散乱光（ＦＳ）の強度）を縦軸とした２次元プロット図である。 図９Ａは、後述する実施例において、赤血球の形態所見を伴う血液試料について本発明を適用して測定した際に作成されたＲＮＰダイアグラムである。 図９Ｂは、後述する実施例において、赤血球の形態所見を伴わない血液試料について本発明を適用して測定した際に作成された、赤血球クラスタのサイズヒストグラムである。 図１０Ａは、後述する実施例において、血小板の形態所見を伴う血液試料について本発明を適用して測定した際に作成されたＲＮＰダイアグラムである。 図１０Ｂは、後述する実施例において、血小板の形態所見を伴う血液試料について本発明を適用して測定した際に作成された、血小板クラスタのサイズヒストグラムである。 図１０Ｃは、後述する実施例において、血小板の形態所見を伴わない血液試料について本発明を適用して測定した際に作成された、血小板クラスタのサイズヒストグラムである。

以下、添付した図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。

本発明の一形態（第１の形態）は、血液試料に含まれる粒子を分析する粒子分析方法であって、メタクロマジー性染色色素を用いて前記粒子を染色することと、染色された前記粒子に光を照射することと、前記血液試料に含まれる各粒子が発光する、前記メタクロマジー性染色色素のスタッキング成分に由来する第１の蛍光および前記メタクロマジー性染色色素のインターカレーション成分に由来する第２の蛍光の強度を測定することと、前記各粒子が発光する前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の強度を、前記各粒子の大きさでそれぞれ規格化することにより、前記各粒子における前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の蛍光濃度をそれぞれ求めることと、前記規格化によって求められた前記蛍光濃度の２次元プロットにおいて、前記各粒子を赤血球クラスタ、血小板クラスタおよび有核細胞クラスタの少なくとも２つを含む複数の粒子クラスタにクラスタリングすることと、前記複数の粒子クラスタに含まれる少なくとも１つの粒子クラスタについて、前記粒子クラスタに含まれる各粒子の大きさを階級とするサイズヒストグラムを作成することとを含む、粒子分析方法である。

以下、本形態に係る粒子分析方法を実施するための好ましい実施形態について、分析をフローサイトメータを用いたフローサイトメトリー法により行う場合を例に挙げて具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、下記の具体的な実施形態のみには限定されない。

図１は、測定試料の調製を示す概略図である。本発明に係る粒子分析方法においては、まず、血液中の粒子を含む試料（血液試料）を準備し、所定の染色色素（メタクロマジー性染色色素）を用いて（通常は当該色素と血液試料とを混合して）測定試料を調製する。これにより、上記所定の染色色素によって血液試料に含まれる粒子が染色される。フローサイトメトリー法による粒子の分析においては、上記で調製された測定試料に光を照射し、それによって試料に含まれる粒子から発生する散乱光および蛍光を電気信号として検出する。そして、検出された電気信号に基づいて、試料に含まれる粒子についての分析が行われる。

［測定試料の調製］
本形態においては、上述したように、測定を行う試料（測定試料）として、血液中の粒子を含む試料（血液試料）を準備し、所定の染色色素（メタクロマジー性染色色素）を用いて（通常は当該色素と血液試料とを混合して）測定試料を調製する。この場合、例えば、図１に示すように、所要量の染色色素１０を一定量に分注する際に、２０～５０℃の範囲に加温し、この加温され分注された染色色素１０Ａに、血液中の粒子を含む試料（血液試料）２０を添加して、５～１０秒間攪拌し、このようにして得られた測定試料３０を２０～５０℃の範囲に保温して、１０～４０秒間保持する。その結果、本発明においては、測定試料３０の調製を、１５～６０秒間で完了することができる。

ここでは、例えば、メタクロマジー性染色色素１０を１ｍＬずつ分注し、この分注されたメタクロマジー染色色素１０Ａに対して、測定目的粒子数が１×１０^７個／μＬ程度になるように調製された血液試料２０を２μＬずつ添加する。また、メタクロマジー性染色色素１０としては、例えば、ｐＨ７．４のトリス緩衝液を用いて調製した０．５～１．５ｍｇ／ｄＬのアクリジンオレンジが用いられうる。特に、色素濃度は０．７５ｍｇ／ｄＬ程度が好適であり、このメタクロマジー性染色色素１０を１ｍＬに分注するとともにその分注時に４５℃に加温し、加温した１ｍＬの染色色素１０Ａに２μＬの血液試料２０を添加して５秒間攪拌し、得られた試料を４５℃に保温して３０秒間保持することにより、適正な測定試料３０が調製されうる。また、別途凍結乾燥させたアクリジンオレンジにｐＨ６．４～ｐＨ８．２のリン酸緩衝液やトリス緩衝液などの緩衝液と血液試料２０とを順次加えることにより測定試料を調製してもよい。

「メタクロマジー（異調染色）」とはもともと、色素によって染色される成分が当該色素の本来の色調とは異なった染色性を示す変調現象を意味する語である。本明細書では、この用語を利用して、「メタクロマジー性染色色素」を、当該色素による染色の対象の種類または染色の方式に応じて異なる波長を有する複数の蛍光を発する性質を持った色素として定義する。メタクロマジー性染色色素の具体例としては、アクリジンオレンジ（ＡＯ）のほか、プロフラビン、アクリフラビン、アテブリンなどが挙げられるが、後述するスタッキング成分とインターカレーション成分とがそれぞれ発光する蛍光の波長が異なる色素であれば特に制限なく用いることが可能である。ただし、メタクロマジー性染色色素のスタッキング成分が発光する蛍光はオレンジ色の蛍光であることが好ましく、インターカレーション成分が発光する蛍光は緑色の蛍光であることが好ましい。この観点から、メタクロマジー性染色色素としてはアクリジンオレンジ（ＡＯ）が特に好ましく用いられる。

［調製された試料の測定および分析］
図２は、本発明の一形態に係る粒子分析方法を実施するための装置のシステム構成を示す図である。また、図３は、本形態に係る粒子分析方法を実施するための装置の一実施形態としてのフローサイトメータの概略を示す系統図である。

図２および図３に示すように、当該装置は、図１を参照しつつ上記で説明した測定試料３０の調製を実施する試料調製部４０と、測定試料３０についてフローサイトメトリー法による分析を実施するフローサイトメータ５０と、から構成されている。フローサイトメータ５０は、測定試料３０を流す検出領域としてのフローセル５１と、フローセル５１を流れる測定試料３０（具体的には、当該試料に含まれる粒子）に対して光を照射する光源であるレーザ光源５２とを有している。レーザ光源５２は、フローセル５１に対して照射光集光レンズ５３を介して配置されている。また、フローサイトメータ５０においては、フローセル５１における測定試料３０への光照射によって測定試料３０中の各粒子から発生する前方への散乱光を検出する前方小角散乱光検出器（ＦＳｓ）６１および前方大角散乱光検出器（ＦＬｓ）６２が、それぞれ散乱光集光レンズ５４を介して配置されている。なお、前方大角散乱光検出器（ＦＬｓ）６２の配置は必須ではない。さらに、フローサイトメータ５０においては、フローセル５１における測定試料３０への光照射によって測定試料３０中の各粒子から発生する側方への散乱光を検出する側方散乱光検出器（ＳＳ）６３がビームスプリッタ５５を介して配置されている。また、フローサイトメータ５０においては、フローセル５１における測定試料３０への光照射によって測定試料３０中の各粒子から発生する波長の異なる２つの蛍光をそれぞれ検出するための第１蛍光検出器（ＦＬ１）６４および第２蛍光検出器（ＦＬ２）６５が、それぞれビームスプリッタ５６，５７および波長選択フィルタ５８，５９を介して配置されている。なお、ビームスプリッタの代りにダイクロイックミラーを用いてもよい。上述した各検出器６１，６２，６３，６４，６５は、光照射された測定試料３０に含まれる各粒子から発生する散乱光および蛍光の強度を検出する光検出部（散乱光検出部、蛍光検出部）として機能する。

そして、フローサイトメータ５０は、プロセッサ（ＣＰＵ）７０を有している。このプロセッサ（ＣＰＵ）７０は、光検出部によって検出された各粒子から発生する散乱光および蛍光の強度に基づいて血液試料中に含まれる粒子の分析を行うデータ処理部としても機能し、本形態に係る粒子分析方法におけるデータ処理（蛍光強度の規格化による蛍光濃度の算出、試料に含まれる粒子のクラスタリング、サイズヒストグラムの作成）に関連する工程を実施する。

続いて、図２および図３に示す構成を有する装置を使用した、本発明に係る粒子分析方法について、詳細に説明する。

まず、上述した試料調製部４０により調製された測定試料３０を、フローサイトメータ５０のフローセル５１に供給して、分析を開始する。測定試料３０がフローセル５１に供給されると、レーザ光源５２は、フローセル５１を流れる測定試料３０（具体的には、当該試料に含まれる粒子）に対して光を照射する。ここで、照射光の波長について特に制限はないが、照射光の中心波長は、好ましくは４０８ｎｍ、４４５ｎｍ、４７３ｎｍまたは４８８ｎｍである。

測定試料３０に対して光が照射されると、測定試料３０中に含まれる各粒子から、前方への散乱光（前方散乱光（ＦＳ））が発生し、当該前方散乱光（ＦＳ）は前方小角散乱光検出器（ＦＳｓ）６１および前方大角散乱光検出器（ＦＬｓ）６２によって検出される。また、測定試料３０に対して光が照射されると、測定試料３０中に含まれる各粒子から、側方への散乱光（側方散乱光（ＳＳ））が発生し、当該側方散乱光（ＳＳ）は側方散乱光検出器（ＳＳ）６３によって検出される。さらに、測定試料３０に対して光が照射されると、測定試料３０中に含まれる各粒子からは蛍光が発生する。ここで、本形態に係る方法においては、メタクロマジー性染色色素を用いて血液試料中に含まれる粒子を染色している。したがって、測定試料３０に対する光の照射により、測定試料３０中に含まれる各粒子からは、波長の異なる複数（例えば、２つ）の蛍光が発生する。具体的に、当該複数の蛍光は、当該メタクロマジー性染色色素のスタッキング成分に由来する蛍光（本明細書中、「第１の蛍光（ＦＬ１）」とも称する）および当該メタクロマジー性染色色素のインターカレーション成分に由来する蛍光（本明細書中、「第２の蛍光（ＦＬ２）」とも称する）を含んでいる。上記スタッキング成分に由来する蛍光（第１の蛍光（ＦＬ１））は、メタクロマジー性染色色素が核酸に対して静電相互作用によりスタッキングすることによって発生する蛍光であり、当該色素としてアクリジンオレンジ（ＡＯ）を用いた場合には中心波長が約６４５～６５５ｎｍ程度の蛍光である。そして、第１の蛍光（ＦＬ１）の蛍光強度は、核酸のうち主としてリボ核酸（ＲＮＡ）の存在量と相関している。一方、上記インターカレーション成分に由来する蛍光（第２の蛍光（ＦＬ２））は、メタクロマジー性染色色素が核酸に対してインターカレートすることにより発生する蛍光であり、当該色素としてアクリジンオレンジ（ＡＯ）を用いた場合には中心波長が約５２０～５３０ｎｍ程度の蛍光である。そして、第２の蛍光（ＦＬ２）の蛍光強度は、核酸のうち主としてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の存在量と相関している。測定試料３０への光照射により、測定試料３０中に含まれる各粒子から発生した上記第１の蛍光（ＦＬ１）および第２の蛍光（ＦＬ２）は、第１蛍光検出器（ＦＬ１）６４および第２蛍光検出器（ＦＬ２）６５によってそれぞれ検出される。

上述したように各検出器による散乱光（前方散乱光（ＦＳ）および側方散乱光（ＳＳ））並びに蛍光（第１の蛍光（ＦＬ１）および第２の蛍光（ＦＬ２））の強度は、各検出器において電気信号に変換され、プロセッサ（ＣＰＵ）７０へと伝達される。そして、プロセッサ（ＣＰＵ）７０は、このようにして得られた電気信号を用いて、各種のデータ処理を行う。例えば、プロセッサ（ＣＰＵ）７０は、前方散乱光（ＦＳ）の強度に基づいて各粒子の大きさに関するパラメータを算出し、側方散乱光（ＳＳ）の強度に基づいて各粒子の大きさや各粒子に含まれる顆粒の量に関するパラメータを算出する。また、プロセッサ（ＣＰＵ）７０は、第１の蛍光（ＦＬ１）および第２の蛍光（ＦＬ２）の強度に基づいて、各粒子におけるスタッキング成分の量およびインターカレーション成分の量に関するパラメータをそれぞれ算出する。ここで、上述したように、第１の蛍光（ＦＬ１）の蛍光強度は、核酸のうち主としてリボ核酸（ＲＮＡ）の存在量と相関しており、第２の蛍光（ＦＬ２）の蛍光強度は、核酸のうち主としてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の存在量と相関している。したがって、第１の蛍光（ＦＬ１）および第２の蛍光（ＦＬ２）の強度に由来する電気信号から算出される、各粒子におけるスタッキング成分の量およびインターカレーション成分の量に関するパラメータは、それぞれ各粒子におけるＲＮＡ量およびＤＮＡ量に関するパラメータとみなすことができる。

本実施形態において、プロセッサ（ＣＰＵ）７０は、次いで、各粒子が発光する第１の蛍光（ＦＬ１）および第２の蛍光（ＦＬ２）の強度を、各粒子の大きさでそれぞれ規格化する。これにより、各粒子における第１の蛍光（ＦＬ１）および第２の蛍光（ＦＬ２）の蛍光濃度をそれぞれ求めることができる。なお、散乱理論によれば、前方散乱光（ＦＳ）の強度（散乱断面積）は当該前方散乱光を発光した粒子の大きさ（直径）に比例することが知られている。したがって、各粒子が発光する蛍光（ＦＬ１，ＦＬ２）の強度を、各粒子の大きさに関するパラメータ（前方散乱光（ＦＳ）の強度または当該強度に基づき算出される直径）で除算することにより、各粒子のサイズを揃えたと仮定した場合の蛍光強度（すなわち、蛍光濃度）が算出される。本明細書では、この処理を「規格化」と称しているのである。なお、本明細書では、便宜上、各粒子が発光する第１の蛍光（ＦＬ１）の蛍光濃度をＣＲｃ（Ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；細胞内ＲＮＡ濃度）と称し、各粒子が発光する第２の蛍光（ＦＬ２）の蛍光濃度をＣＤｃ（Ｃｅｌｌ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；細胞内ＤＮＡ濃度）と称する。以下ではまず、血液試料の測定により規格化の完了の時点までで得られるいくつかの情報について、説明する。

図４は、前方散乱光（ＦＳ）と側方散乱光（ＳＳ）との２次元スキャッタグラム（ＦＳ×ＳＳサイトグラム）の測定例である。図４において、紫色のイベントは赤血球成分を示しており、緑色のイベントは血小板成分を示しており、青色のイベントは有核細胞成分を示している。図４に示すように、ＦＳ×ＳＳサイトグラムにおいては紫色のイベント（赤血球成分）のクラスタと青色のイベント（有核細胞成分）のクラスタとは重なって表示されている。また、紫色のイベント（赤血球成分）の一部は緑色のイベント（血小板成分）のクラスタ内に存在している。したがって、ＦＳ×ＳＳサイトグラムをそのまま用いた場合には、どのようにゲーティングを施したとしても、特定の血球成分を他の血球成分から分離することはできない。

また、図５は、第１の蛍光（ＦＬ１）と第２の蛍光（ＦＬ２）との２次元スキャッタグラム（ＦＬ１×ＦＬ２サイトグラム）の測定例である。図５に示すように、ＦＬ１×ＦＬ２サイトグラムにおいても、紫色のイベント（赤血球成分）のクラスタと青色のイベント（有核細胞成分）のクラスタとは重なって表示されている。一方、青色のイベント（有核細胞成分）のクラスタはサイトグラムの右上に独立して存在している。したがって、図５に示すように青色のイベント（有核細胞成分）のクラスタに対してゲートを設定することで、有核細胞成分のみをゲーティングすることが可能である。

続いて、図６は、上述した「規格化」の処理によって各粒子における第１の蛍光（ＦＬ１）の蛍光濃度（ＣＲｃ）および第２の蛍光（ＦＬ２）の蛍光濃度（ＣＤｃ）をそれぞれ求め、得られた結果に基づき作成したＣＲｃとＣＤｃとの２次元プロット図（本明細書中、「ＲＮＰダイアグラム」とも称する）である。なお、図６に示すＲＮＰダイアグラムにおいては、上述したゲーティングによって削除されうる青色のイベント（有核細胞成分）についても、存在位置の確認のために表示されている。すなわち、上述した定義に基づき、ＲＮＰダイアグラムにおいては、横軸が各粒子の第１の蛍光（ＦＬ１）の蛍光濃度（ＣＲｃ）を示し、縦軸が各粒子の第２の蛍光（ＦＬ２）の蛍光濃度（ＣＤｃ）を示している。このことを反映して、粒子内のＲＮＡ濃度およびＤＮＡ濃度がともに比較的高い有核細胞成分（有核細胞クラスタ；ＰＣｎ）はＲＮＰダイアグラムの右上の領域にクラスタを形成していることがわかる。また、粒子内のＲＮＡ濃度およびＤＮＡ濃度がともに比較的低い赤血球成分（赤血球クラスタ；ＲＢＣｎ）はＲＮＰダイアグラムの左下の領域にクラスタを形成しており、粒子内のＲＮＡ濃度は比較的高い一方でＤＮＡ濃度は比較的低い血小板成分（血小板クラスタ；ＰＬＴｎ）はＲＮＰダイアグラムの右下の領域にクラスタを形成していることもわかる。

以上の通り、上述した「規格化」の処理を施して各粒子における第１の蛍光（ＦＬ１）および第２の蛍光（ＦＬ２）の蛍光濃度をそれぞれ求め、これらの蛍光濃度を２つの軸とする２次元プロット図を作成することにより、血液試料中に含まれる各粒子をクラスタリングすることができるのである。そして、本形態に係る粒子分析方法においては、血液試料中に含まれる各粒子を、赤血球クラスタ、血小板クラスタおよび有核細胞クラスタの少なくとも２つを含む複数の粒子クラスタにクラスタリングすることが必須であり、赤血球クラスタ（ＲＢＣｎ）、血小板クラスタ（ＰＬＴｎ）および有核細胞クラスタ（ＮＣｎ）をいずれも含む複数の粒子クラスタにクラスタリングすることが好ましい。

次に、本形態に係る粒子分析方法では、上記で作成したＲＮＰダイアグラム（図６）から、当該ＲＮＰダイアグラムを用いたクラスタリングによって生成した複数の粒子クラスタに含まれる少なくとも１つの粒子クラスタについて、当該粒子クラスタに含まれる各粒子の大きさを階級とするヒストグラム（サイズヒストグラム）を作成する。

図７は、図６に示すＲＮＰダイアグラムから赤血球クラスタ（ＲＢＣｎ）をゲーティングすることによって分離して作成された、赤血球クラスタ（ＲＢＣｎ）についてのサイズヒストグラムの一例である。このサイズヒストグラムは、赤血球クラスタ（ＲＢＣｎ）に含まれる各粒子について、サイズを階級とするヒストグラムである。なお、サイズヒストグラムを作成する際に用いられる各粒子の大きさに関する情報について、図７では前方散乱光（ＦＳ）の強度を採用しているが、これには制限されず、場合によっては側方散乱光（ＳＳ）の強度などを採用してもよい。

本形態に係る粒子分析方法では、上記で作成した少なくとも１つの粒子クラスタについてのサイズヒストグラムに基づいて、当該粒子クラスタに含まれる各粒子を分析することをさらに含むことが好ましい。なお、この分析は、フローサイトメータ５０が備えるプロセッサ（ＣＰＵ）７０（データ処理部）が行ってもよいし、他のコンピュータが行ってもよいし、医師や看護師、臨床検査技師等の医療従事者が行ってもよい。

具体的には、例えば、上記で作成したサイズヒストグラムにおける各粒子の大きさを示す軸を複数の領域に分割し、分割によって得られた前記複数の領域のそれぞれにおける前記粒子の数または比率に基づいて前記少なくとも１つの粒子クラスタを複数のサブクラスタに再分類することができる。これを図７に示す赤血球クラスタ（ＲＢＣｎ）についてのサイズヒストグラムについて見ると、図７においては、各粒子の大きさを示す軸（すなわち、横軸）が、所定の閾値を境界として２つの領域に分割されている。ここで、図７において境界として示されている閾値は、正常赤血球のサイズの下限値に対応する前方散乱光（ＦＳ）の強度の値である。これにより、赤血球クラスタ（ＲＢＣｎ）に含まれる粒子のうち、正常赤血球よりもサイズが小さい粒子（破砕赤血球、小型赤血球）の数または比率を測定することができる。ただし、分割は２つの領域への分割に限られず、３つ以上の領域への分割であってもよい。例えば、赤血球クラスタ（ＲＢＣｎ）に含まれる粒子を再分類する際には、例えば、正常赤血球のサブクラスタと、大赤血球サブクラスタ、破砕赤血球サブクラスタおよび／または小型赤血球サブクラスタと、を含む複数のサブクラスタに再分類することも好ましい。

また、上記で作成したサイズヒストグラムが血小板クラスタ（ＰＬＴｎ）についてのヒストグラムを含む場合には、当該サイズヒストグラムに基づき、当該血小板クラスタ（ＰＬＴｎ）を、正常血小板のサブクラスタと、巨大血小板サブクラスタ、大血小板サブクラスタおよび／または小型血小板サブクラスタと、を含む複数のサブクラスタに再分類することも好ましい。さらに、上記で作成したサイズヒストグラムが有核細胞クラスタ（ＮＣｎ）についてのヒストグラムを含む場合には、当該有核細胞クラスタ（ＮＣｎ）を、正常有核細胞のサブクラスタと、大有核細胞サブクラスタ、破砕有核細胞サブクラスタおよび／または小型有核細胞サブクラスタと、を含む複数のサブクラスタに再分類することも好ましい。

本形態に係る粒子分析方法の好ましい実施形態では、上記で説明したようにしてサイズヒストグラムを作成した粒子クラスタについて、当該粒子クラスタに含まれる各粒子の第１の蛍光（ＦＬ１）の強度または第２の蛍光（ＦＬ２）の強度を一方の軸とし、当該粒子クラスタに含まれる各粒子の大きさを他方の軸とした２次元プロット図を作成する。

そのような２次元プロット図の一例として、図８Ａは、赤血球クラスタ（ＲＢＣｎ）について、当該クラスタに含まれる各粒子の第１の蛍光（ＦＬ１）の強度を横軸とし、当該クラスタに含まれる各粒子の大きさ（ここでは、前方散乱光（ＦＳ）の強度）を縦軸とした２次元プロット図である。そして、当該２次元プロット図において、縦軸（前方散乱光（ＦＳ）の強度）は複数（ここでは、小さいほうからＲＣ０～ＲＣ３の４つ）の領域に分割されている。ここでは、赤血球クラスタが、粒子の大きさが大きいほうから大赤血球サブクラスタ（ＲＣ３）、正常赤血球サブクラスタ（ＲＣ２）、破砕赤血球サブクラスタ（ＲＣ１）および小型赤血球サブクラスタ（ＲＣ０）の４つのサブクラスタに再分類されている。なお、この２次元プロット図における複数の領域は、上述したサイズヒストグラムに基づく分析において当該サイズヒストグラムを分割することによって得られた複数の領域に相当することが好ましい。ただし、これらは異なっていてもよい。

ここで、図８Ａに示す２次元プロット図の横軸は各粒子におけるＲＮＡ量（言い換えれば、幼若度）の指標となる第１の蛍光（ＦＬ１）の強度を示すことから、図８Ａに示す赤血球クラスタ（ＲＢＣｎ）についての２次元プロット図に基づけば、赤血球クラスタに含まれる各粒子の幼若度に関する情報と大きさに関する情報とを同時に取得することが可能である。その結果、いずれか一方の情報（例えば、赤血球クラスタに含まれる粒子のサイズ分布）だけからは把握することができない臨床的に有用な知見（例えば、幼若網赤血球比率（ＩＲＦ）といった網赤血球の幼若度など）が得られる可能性が広がる。

図８Ｂおよび図８Ｃは、血小板クラスタ（ＰＬＴｎ）および有核細胞クラスタ（ＮＣｎ）について同様に作成した２次元プロット図である。具体的に、図８Ｂは、血小板クラスタ（ＰＬＴｎ）について、当該クラスタに含まれる各粒子の第１の蛍光（ＦＬ１）の強度を横軸とし、当該クラスタに含まれる各粒子の大きさ（ここでは、前方散乱光（ＦＳ）の強度）を縦軸とした２次元プロット図である。そして、当該２次元プロット図において、縦軸（前方散乱光（ＦＳ）の強度）は複数（ここでは、小さいほうからＰＣ０～ＰＣ３の４つ）の領域に分割されている。ここでは、血小板クラスタが、粒子の大きさが大きいほうから巨大血小板サブクラスタ（ＰＣ３）、大血小板サブクラスタ（ＰＣ２）、正常血小板サブクラスタ（ＰＣ１）および小型血小板サブクラスタ（ＰＣ０）の４つのサブクラスタに再分類されている。

ここで、図８Ｂに示す２次元プロット図の横軸は各粒子におけるＲＮＡ量（言い換えれば、幼若度）の指標となる第１の蛍光（ＦＬ１）の強度を示すことから、図８Ｂに示す血小板クラスタ（ＰＬＴｎ）についての２次元プロット図に基づけば、血小板クラスタに含まれる各粒子の幼若度に関する情報と大きさに関する情報とを同時に取得することが可能である。その結果、いずれか一方の情報（例えば、血小板クラスタに含まれる粒子のサイズ分布）だけからは把握することができない臨床的に有用な知見（例えば、幼若血小板比率（ＩＰＦ）といった血小板の幼若度など）が得られる可能性が広がる。

また、図８Ｃは、有核細胞クラスタ（ＮＣｎ）について、当該クラスタに含まれる各粒子の第１の蛍光（ＦＬ１）の強度を横軸とし、当該クラスタに含まれる各粒子の大きさ（ここでは、前方散乱光（ＦＳ）の強度）を縦軸とした２次元プロット図である。そして、当該２次元プロット図において、縦軸（前方散乱光（ＦＳ）の強度）は複数（ここでは、小さいほうからＮＣ０～ＮＣ３の４つ）の領域に分割されている。ここでは、有核細胞クラスタが、粒子の大きさが大きいほうから大有核細胞サブクラスタ（ＮＣ３）、正常有核細胞サブクラスタ（ＮＣ２）、破砕有核細胞サブクラスタ（ＮＣ１）および小型有核細胞サブクラスタ（ＮＣ０）の４つのサブクラスタに再分類されている。図８Ｃに示す有核細胞クラスタ（ＮＣｎ）についての２次元プロット図に基づけば、有核細胞クラスタに含まれる各粒子の幼若度に関する情報と大きさに関する情報とを同時に取得することが可能である。その結果、いずれか一方の情報だけからは把握することができない臨床的に有用な知見が得られる可能性が広がる。

なお、上述した２次元プロット図が示す結果に基づき、例えば小型赤血球サブクラスタ（ＲＣ０）、小型血小板サブクラスタ（ＰＣ０）および小型有核細胞サブクラスタ（ＮＣ０）における粒子の総数から、細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶ）の総数を把握することも可能である。また、その際に把握されたＥＶの幼若度の分布に関する情報も同時に得られることから、臨床的に有用な知見が提供されうる。また、図８Ａ～図８Ｃに示す２次元プロット図は、赤血球クラスタ、血小板クラスタおよび有核細胞クラスタのそれぞれに含まれる粒子に対応するイベントをそれぞれ表示するものである。ただし、後述する実施例のように、複数の粒子クラスタのそれぞれに含まれる粒子に対応するイベントを合わせて１つの２次元プロット図に表示するようにしてもよい。

図８Ａ～図８Ｃでは、各粒子の第１の蛍光（ＦＬ１）の強度を横軸とし、少なくとも１つの粒子クラスタに含まれる各粒子の大きさ（前方散乱光（ＦＳ）の強度）を縦軸とした２次元プロット図を例に挙げて説明したが、他の形態もまた、採用されうる。例えば、各粒子の大きさの指標として側方散乱光（ＳＳ）の強度を用いてもよい。また、各粒子の第２の蛍光（ＦＬ２）の強度を横軸として同様に作成された２次元プロット図もまた、臨床的に有用な知見を提供してくれる可能性がある。例えば、各粒子の第２の蛍光（ＦＬ２）の強度は、各粒子におけるＤＮＡ量を反映している。したがって、各粒子の第２の蛍光（ＦＬ２）の強度を横軸として同様に作成された２次元プロット図に基づくことで、各粒子クラスタにおける異常の有無を判定することができる。ここで、「異常」とは、その粒子クラスタに含まれる粒子におけるＤＮＡ量が正常な状態と比較して増加している状態をすべて含む概念である。当該「異常」としては、例えば、各粒子クラスタに含まれる粒子における各種の小体（ハウエル・ジョリー小体、パッペンハイマー小体など）、マラリア原虫、バベシア、タイレリア、トリパノソーマ、糸状虫のミクロフィリアの存在等が挙げられる。すなわち、これらの「異常」を有する粒子においては、通常の赤血球と比較して血球内のＤＮＡ量が多い。したがって、上記２次元プロット図において各粒子の第２の蛍光（ＦＬ２）の強度を一方の軸として設定し、当該軸に所定の閾値を設定することで、ＤＮＡ量が当該閾値以上である粒子が存在すれば、当該粒子は何らかの上記「異常」を有している可能性が高いと判定することができる。

以下、実施例を用いて本発明の実施形態を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例のみに限定されるわけではない。

［赤血球の形態所見を伴う血液試料の測定例］
成人男性から採取された血液試料について、本発明を適用して測定を行った。なお、顕微鏡観察による当該血液試料の血液形態検査では、赤血球に関する形態所見が見られた。具体的には、破砕赤血球および小型赤血球の存在が有意に増加していることが確認された。

メタクロマジー性染色色素であるアクリジンオレンジ（ＡＯ）の０．００６ｇ／Ｌ溶液２ｍＬに、当該血液試料５μＬを添加し、混合して測定試料を調製した。次いで、全自動血球計数器（日本光電工業株式会社製、ＭＥＫ－９０００シリーズ、セルタックＧ＋試作機）を用いて測定を行った。次いで、得られたＦＳ、ＳＳ，ＦＬ１（蛍光波長５２５ｎｍ）、ＦＬ２（蛍光波長６５０ｎｍ）のデータを用い、図６に示すようなＲＮＰダイアグラムを作成した。ここで、上記血液試料を用いて実際に作成されたＲＮＰダイアグラムを図９Ａに示す。そして、当該ＲＮＰダイアグラムから赤血球クラスタ（ＲＢＣｎ）にゲートを設定（ゲーティング）することによりデータを分離し、分離された赤血球クラスタに含まれる粒子について、図７に示すサイズヒストグラムを作成した。そして、正常赤血球のサイズの下限値を基準として、横軸（前方散乱光（ＦＳ）の強度）について閾値を設定し、横軸の値が当該閾値未満である粒子を破砕赤血球または小型赤血球であると判定した。図７に示す結果は、血液形態検査において破砕赤血球および小型赤血球の存在が観察されたことと符合するものである。

なお、顕微鏡観察による血液形態検査では赤血球に関する形態所見が見られなかった血液試料について、上記と同様の手法により赤血球クラスタについてのサイズヒストグラムを作成した例を図９Ｂに示す。図９Ｂに示すサイズヒストグラムにおいては、赤血球クラスタに含まれる粒子のうち、閾値未満のサイズを有する粒子はほとんど見られなかった。この結果は、血液形態検査において赤血球に関する形態所見が見られなかったことと符合するものである。

［血小板の形態所見を伴う血液試料の測定例（２）］
成人男性から採取された血液試料について、本発明を適用して測定を行った。なお、顕微鏡観察による当該血液試料の血液形態検査では、血小板に関する形態所見が見られた。具体的には、巨大血小板（Ｇｉａｎｔ Ｐｌａｔｅｌｅｔ）の存在が有意に増加していることが確認された。

上記で準備した血液試料を用いて、上記と同様の手法により測定試料を調製し、全自動血球計数器（日本光電工業株式会社製、ＭＥＫ－９０００シリーズ、セルタックＧ＋試作機）を用いて測定を行った。次いで、得られたＦＳ、ＳＳ，ＦＬ１（蛍光波長５２５ｎｍ）、ＦＬ２（蛍光波長６５０ｎｍ）のデータを用い、図６に示すようなＲＮＰダイアグラムを作成した。ここで、上記血液試料を用いて実際に作成されたＲＮＰダイアグラムを図１０Ａに示す。そして、当該ＲＮＰダイアグラムから赤血球クラスタにゲートを設定（ゲーティング）することによりデータを分離し、分離された赤血球クラスタに含まれる粒子について、図１０Ｂに示すサイズヒストグラムを作成した。そして、巨大血小板のサイズの下限値を基準として、横軸（前方散乱光（ＦＳ）の強度）について閾値を設定し、横軸の値が当該閾値以上である粒子を巨大血小板（Ｇｉａｎｔ Ｐｌａｔｅｌｅｔ）であると判定した。図１０Ｂに示す結果は、血液形態検査において巨大血小板の存在が観察されたことと符合するものである。

なお、顕微鏡観察による血液形態検査では血小板に関する形態所見が見られなかった血液試料について、上記と同様の手法により赤血球クラスタについてのサイズヒストグラムを作成した例を図１０Ｃに示す。図１０Ｃに示すサイズヒストグラムにおいては、血小板クラスタに含まれる粒子のうち、閾値以上のサイズを有する粒子はほとんど見られなかった。この結果は、血液形態検査において血小板に関する形態所見が見られなかったことと符合するものである。

以上の通り、メタクロマジー性染色色素を用いた本発明を適用して血液試料中の粒子を分析することで、臨床的に有用な情報をより多く取得することが可能となる。

１０ メタクロマジー性染色色素、
１０Ａ 分注されたメタクロマジー性染色色素、
２０ 血液試料、
３０ 測定試料、
４０ 試料調製部、
５０ フローサイトメータ、
５１ フローセル、
５２ レーザ光源、
５３ 照射光集光レンズ、
５４ 散乱光集光レンズ、
５５，５６，５７ ビームスプリッタ、
５８，５９ 波長選択フィルタ、
６１ 前方小角散乱光検出器（ＦＳｓ）、
６２ 前方大角散乱光検出器（ＦＬｓ）、
６３ 側方散乱光検出器（ＳＳ）、
６４ 第１蛍光検出器（ＦＬ１）、
６５ 第２蛍光検出器（ＦＬ２）、
７０ プロセッサ（ＣＰＵ）。

Claims (11)

1. 血液試料に含まれる粒子を分析する粒子分析方法であって、
   メタクロマジー性染色色素を用いて前記粒子を染色することと、
   染色された前記粒子に光を照射することと、
   前記血液試料に含まれる各粒子が発光する、前記メタクロマジー性染色色素のスタッキング成分に由来する第１の蛍光および前記メタクロマジー性染色色素のインターカレーション成分に由来する第２の蛍光の強度を測定することと、
   前記各粒子が発光する前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の強度を、前記各粒子の大きさでそれぞれ規格化することにより、前記各粒子における前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の蛍光濃度をそれぞれ求めることと、
   前記規格化によって求められた前記蛍光濃度の２次元プロットにおいて、前記各粒子を赤血球クラスタ、血小板クラスタおよび有核細胞クラスタの少なくとも２つを含む複数の粒子クラスタにクラスタリングすることと、
   前記複数の粒子クラスタに含まれる少なくとも１つの粒子クラスタについて、前記粒子クラスタに含まれる各粒子の大きさを階級とするサイズヒストグラムを作成することと、
   前記サイズヒストグラムを作成した前記少なくとも１つの粒子クラスタについて、前記粒子クラスタに含まれる各粒子の前記第１の蛍光の強度または前記第２の蛍光の強度を一方の軸とし、前記粒子クラスタに含まれる各粒子の大きさを他方の軸とした２次元プロット図を作成することと、
   前記２次元プロット図において、前記他方の軸を各粒子の大きさに基づいて複数のサブクラスタに再分類し、粒子の大きさが最も小さいサブクラスタにおける粒子の総数を細胞外小胞の総数として取得することと、
   を含む、粒子分析方法。
2. 前記サイズヒストグラムが赤血球クラスタについてのサイズヒストグラムを含み、
   前記赤血球クラスタを、正常赤血球のサブクラスタと、大赤血球サブクラスタ、破砕赤血球サブクラスタおよび／または小型赤血球サブクラスタと、を含む複数のサブクラスタに再分類することを含む、請求項１に記載の粒子分析方法。
3. 前記サイズヒストグラムが血小板クラスタについてのヒストグラムを含み、
   前記血小板クラスタを、正常血小板のサブクラスタと、巨大血小板サブクラスタ、大血小板サブクラスタおよび／または小型血小板サブクラスタと、を含む複数のサブクラスタに再分類することを含む、請求項１または２に記載の粒子分析方法。
4. 前記サイズヒストグラムが有核細胞クラスタについてのヒストグラムを含み、
   前記有核細胞クラスタを、正常有核細胞のサブクラスタと、大有核細胞サブクラスタ、破砕有核細胞サブクラスタおよび／または小型有核細胞サブクラスタと、を含む複数のサブクラスタに再分類することを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の粒子分析方法。
5. 前記第１の蛍光がオレンジ色の蛍光であり、前記第２の蛍光が緑色の蛍光である、請求項１～４のいずれか１項に記載の粒子分析方法。
6. 前記メタクロマジー性染色色素が、アクリジンオレンジ（ＡＯ）である、請求項５に記載の粒子分析方法。
7. 前記血液試料に含まれる粒子に照射される光の中心波長が、４０８ｎｍ、４４５ｎｍ、４７３ｎｍまたは４８８ｎｍである、請求項１～６のいずれか１項に記載の粒子分析方法。
8. 前記第１の蛍光の強度を前記一方の軸として得られた前記２次元プロット図に基づいて、前記少なくとも１つの粒子クラスタに含まれる各粒子の幼若度に関する情報と大きさに関する情報とを同時に取得することをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の粒子分析方法。
9. 前記第２の蛍光の強度を前記一方の軸として得られた前記２次元プロット図に基づいて、前記少なくとも１つの粒子クラスタにおける異常の有無を判定することをさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の粒子分析方法。
10. 前記細胞外小胞の幼若度の分布に関する情報を取得することをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の粒子分析方法。
11. 血液試料に含まれる粒子に光を照射する光源と、
    前記血液試料を流すフローセルと、
    波長の異なる第１の蛍光および第２の蛍光をそれぞれ検出する複数の蛍光検出部を含む光検出部と、
    前記血液試料に含まれる各粒子が発光する前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の強度を、前記各粒子の大きさでそれぞれ規格化することにより、前記各粒子における前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の蛍光濃度をそれぞれ求め、
    前記規格化によって求められた前記蛍光濃度の２次元プロットにおいて、前記各粒子を赤血球クラスタ、血小板クラスタおよび有核細胞クラスタの少なくとも２つを含む複数の粒子クラスタにクラスタリングし、
    前記複数の粒子クラスタに含まれる少なくとも１つの粒子クラスタについて、前記粒子クラスタに含まれる各粒子の大きさを階級とするサイズヒストグラムを作成し、前記サイズヒストグラムを作成した前記少なくとも１つの粒子クラスタについて、前記粒子クラスタに含まれる各粒子の前記第１の蛍光の強度または前記第２の蛍光の強度を一方の軸とし、前記粒子クラスタに含まれる各粒子の大きさを他方の軸とした２次元プロット図を作成し、前記２次元プロット図において、前記他方の軸を各粒子の大きさに基づいて複数のサブクラスタに再分類し、粒子の大きさが最も小さいサブクラスタにおける粒子の総数を細胞外小胞の総数として取得する、データ処理部と、
    を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法を実施するための粒子分析装置。