JP7476164B2 - 組成物及び治療方法 - Google Patents

Description

本発明は、炎症及び／又は疼痛の局所治療のための組成物に関する。

医薬処方物において多くの開発がなされてきたが、局所的に施用される抗炎症剤及び鎮痛剤は、浸透の低さ及びそれゆえの有効性の低さという問題をいまだ抱えている。局所医薬の投与量レベルが上昇することは、アレルギー反応を頻繁に引き起こす可能性があり、そして、活性医薬成分（ＡＰＩ）のより高い投与量に付随する製造コストの上昇のため、望ましくない。抗炎症剤及び鎮痛剤を局所投与することによって生じる上記問題はあるものの、炎症又は疼痛に罹患している個体の筋肉又は関節に抗炎症剤及び鎮痛剤を送達できるようにＡＰＩの浸透だけを改善することができれば、局所投与は、いまだ、理想的な投与経路を代表する。

炎症及び／又は疼痛の治療並びに管理に関連する上記の問題のうちの１つ以上に対処することが本発明の目的である。炎症及び／又は疼痛の治療を提供することも本発明の目的である。さらに、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤のより良好な浸透又は送達を可能にする治療を提供することが本発明の目的である。

本発明の第１の態様によれば、ナノ粒子を形成することができるポリマーと、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とが提供される。

上記ポリマーは、直鎖状及び／若しくは分枝状若しくは環状のポリモノグアニド／ポリグアニジン、ポリビグアニド、それらの類似体又は誘導体を含む。

ポリマー並びに抗炎症剤及び／又は鎮痛剤からナノ粒子を形成することにより、本発明者らは、有利にも、角質層への及び角質層を通る、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤の送達を高めることが可能であるということを見出した。

上記ポリマーは、直鎖状及び／若しくは分枝状若しくは環状のポリモノグアニド／ポリグアニジン、ポリビグアニド、それらの類似体又は誘導体を含むことが好ましい。この直鎖状及び／若しくは分枝状若しくは環状のポリモノグアニド／ポリグアニジン、ポリビグアニド、それらの類似体又は誘導体は、下記式１ａ又は式１ｂに従うものであってよく、それらの例は下記表Ａ及び表Ｂに提供されている。

上記式中、
「ｎ」は、上記ポリマーにおける繰り返し単位の数を指し、ｎは、２～１０００、例えば２又は５から１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００又は９００まで変化することができ、
Ｇ_１及びＧ_２は、独立に、ビグアニド又はグアニジンを含むカチオン性基を表し、Ｌ_１及びＬ_２は、上記グアニドの窒素原子に直接結合されている。従って、上記ビグアニド基又はグアニジン基は、上記ポリマー骨格に不可欠である。このビグアニド基又はグアニジン基は、式１ａにおける側鎖部分ではない。

カチオン性基の例：

本発明では、Ｌ_１及びＬ_２は、上記ポリマー中のＧ_１及びＧ_２のカチオン性基の間の連結基である。Ｌ_１及びＬ_２は、独立に、Ｃ_１～Ｃ_１４０個の炭素原子を含有する脂肪族基、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９若しくはＣ_１０；Ｃ_１～Ｃ_１０、～Ｃ_２０、～Ｃ_３０、～Ｃ_４０、～Ｃ_５０ ～Ｃ_６０、～Ｃ_７０、～Ｃ_８０、～Ｃ_９０、～Ｃ_１００、～Ｃ_１１０、～Ｃ_１２０、～Ｃ_１３０若しくは～Ｃ_１４０のアルキル等のアルキル基を表すことができるし、又はＬ_１及びＬ_２は、（独立に）Ｃ_１～Ｃ_１４０（例えばＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９若しくはＣ_１０；Ｃ_１～Ｃ_１０、～Ｃ_２０、～Ｃ_３０、～Ｃ_４０、～Ｃ_５０ ～Ｃ_６０、～Ｃ_７０、～Ｃ_８０、～Ｃ_９０、～Ｃ_１００、～Ｃ_１１０、～Ｃ_１２０、～Ｃ_１３０若しくは～Ｃ_１４０）の、脂環式ラジカル、複素環式ラジカル、芳香族ラジカル、アリールラジカル、アルキルアリールラジカル、アリールアルキルラジカル、オキシアルキレンラジカルであることができるし、又はＬ_１及びＬ_２は、（独立に）任意に１以上の、好ましくは１個の、酸素原子、窒素原子若しくは硫黄原子、官能基及び飽和若しくは不飽和の環状部分が介在していてもよいポリアルキレンラジカルであることができる。好適なＬ_１及びＬ_２の例は表Ａに列挙されている基である。

Ｌ_１、Ｌ_２、Ｇ_１及びＧ_２は、脂肪族ラジカル、脂環式ラジカル、複素環式ラジカル、アリールラジカル、アルカリールラジカル、及びオキシアルキレンラジカルを使用して修飾されたものであってもよい。

Ｎ及びＧ_３は、好ましくは末端基である。典型的には、本発明における使用のポリマーは、末端アミノ（Ｎ）及びシアノグアニジン（Ｇ_３）又はグアニジン（Ｇ_３）末端基を有する。このような末端基は、脂肪族ラジカル、脂環式ラジカル、複素環式ラジカル、複素環式ラジカル、アリールラジカル、アルキルアリールラジカル、アリールアルキルラジカル、オキシアルキレンラジカルへの連結によって（例えば１，６－ジアミノヘキサン、１，６ジ（シアノグアニジノ）ヘキサン、１，６－ジグアニジノヘキサン、４－グアニジノ酪酸で）修飾されていてもよい。加えて、末端基は、受容体リガンド、デキストラン、シクロデキストリン、脂肪酸若しくは脂肪酸誘導体、コレステロール若しくはコレステロール誘導体又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）への連結によって修飾されていてもよい。任意に、上記ポリマーは、Ｎ及びＧ_３の位置でグアニジン若しくはビグアニド若しくはシアノアミン若しくはアミン又はシアノグアニジンで終わることができるし、又はＮ位置でシアノアミン及びＧ_３位置でシアノグアニジンで終わることができるし、又はＮ位置でグアニジン及びＧ_３位置でシアノグアニドで終わることができるし、又はＧ３でＬ１アミン及びＮでシアノグアニジンで終わることができる。Ｇ３はＬ_１－アミン、Ｌ_２－シアノグアニジン又はＬ_２－グアニジンであることができる。合成の際の重合の数（ｎ）又はポリマー鎖の切断及び副反応によっては、一例として上に記載したような末端基の不均一な混合物が生じうる。従って、Ｎ及びＧ３の基は、上記のように、不均一な混合物として相互変換／存在することができる。あるいは、Ｎ及びＧ_３は存在しなくてもよく、上記ポリマーは環状であってもよく、この場合は、それぞれの末端のＬ_１基及びＧ_２基は互いに直接連結されている。

式１ｂでは、Ｘは存在してもよいし存在しなくてもよい。Ｌ_３、Ｌ_４及びＸは、「Ｌ_１又はＬ_２」について上に記載されたとおりである。従って、Ｌ_３及びＬ_４及びＸは、上記ポリマー中のＧ_４及びＧ_５のカチオン性基の間の連結基である。Ｌ_３及びＬ_４及びＸは、独立に、Ｃ_１～Ｃ_１４０個の炭素原子を含有する脂肪族基、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９若しくはＣ_１０；Ｃ_１～Ｃ_１０、～Ｃ_２０、～Ｃ_３０、～Ｃ_４０、～Ｃ_５０ ～Ｃ_６０、～Ｃ_７０、～Ｃ_８０、～Ｃ_９０、～Ｃ_１００、～Ｃ_１１０、～Ｃ_１２０、～Ｃ_１３０若しくは～Ｃ_１４０のアルキル等のアルキル基を表すことができるし、又はＬ_３及びＬ_４及びＸは、独立に、Ｃ_１～Ｃ_１４０（例えばＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９若しくはＣ_１０；Ｃ_１～Ｃ_１０、～Ｃ_２０、～Ｃ_３０、～Ｃ_４０、～Ｃ_５０ ～Ｃ_６０、～Ｃ_７０、～Ｃ_８０、～Ｃ_９０、～Ｃ_１００、～Ｃ_１１０、～Ｃ_１２０、～Ｃ_１３０若しくは～Ｃ_１４０）の、脂環式ラジカル、複素環式ラジカル、芳香族ラジカル、アリールラジカル、アルキルアリールラジカル、アリールアルキルラジカル、オキシアルキレンラジカルであることができるし、又はＬ_３及びＬ_４及びＸは、独立に、任意に１以上の、好ましくは１個の、酸素原子、窒素原子若しくは硫黄原子、官能基及び飽和若しくは不飽和の環状部分が介在していてもよいポリアルキレンラジカルであることができる。好適なＬ_３及びＬ_４及びＸの例は表Ｂに列挙されている基である。

「Ｇ_４」及び「Ｇ_５」はカチオン性部分であり、同一であってもよいし異なっていてもよい。Ｇ_４及びＧ_５のうちの少なくとも１つは、ビグアニジン部分又はカルバモイルグアニジンであり、他方の部分は上記のとおり（ビグアニジン若しくはカルバモイルグアニジン）又はアミンであってよい。誤解を避けるために、式１ｂでは、カチオン性部分Ｇ_４及びＧ_５は、ただ１つのグアニジン基しか含有しないわけではない。例えば、Ｇ_４及びＧ_５は、典型的には、ただ１つのグアニジン基を含有するわけではない。このような化合物の例は、表Ｂに列挙されているように、ポリアリルビグアニド、ポリ（アリルビグアニジノ－ｃｏ－アリルアミン）、ポリ（アリルカルバモイルグアニジノ－ｃｏ－アリルアミン）、ポリビニルビグアニドである。

ポリアリルビグアニドの例は下に示されているとおりである。

ポリアリルビグアニジンの場合、Ｌ_３及びＬ_４は同一であり、Ｇ_４及びＧ５は同様であり、従ってポリアリルビグアニドは、下記のように単純化できる。

ポリ（アリルカルバモイルグアニジノ－ｃｏ－アリルアミン）の例は下に示されているとおりである。

本発明において使用するためのポリマーは、一般に、それらと会合した対イオンを有する。好適な対イオンとしては、以下の、ハロゲン化物（例えば塩化物）、リン酸イオン、乳酸イオン、ホスホン酸イオン、スルホン酸イオン、アミノカルボン酸イオン、カルボン酸イオン、ヒドロキシカルボキン酸イオン、有機リン酸イオン、有機ホスホン酸イオン、有機スルホン酸イオン及び有機硫酸イオンが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明において使用するためのポリマーは、異なる「ｎ」数のポリマーの不均一な混合物、又は標準的な精製方法によって精製された特定の「ｎ」数を含む均質な画分のいずれかであることができる。上記のように、上記ポリマーはまた、環状であってもよく、加えて、分岐していてもよい。

「ｎ」についての好ましい数としては、２～２５０、２～１００、２～８０及び２～５０が挙げられる。

本発明の方法において使用されるポリマーは、直鎖状、分枝状又はデンドリマー状の分子を含んでもよい。このポリマーは、直鎖状、分枝状又はデンドリマー状の分子の組み合わせを含んでもよい。このポリマーは、例えば、上記のように、式１ａ又は式１ｂの分子の１つ又は任意の組み合わせを含んでもよい。

例えば、上記ポリマーは、ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）、ポリヘキサメチレンモノグアニド（ＰＨＭＧ）、ポリエチレンビグアニド（ＰＥＢ）、ポリテトラメチレンビグアニド（ＰＴＭＢ）又はポリエチレンヘキサメチレンビグアニド（ＰＥＨＭＢ）のうちの１以上を含むことができる。いくつかの例は、表Ａ及び表Ｂに列挙されている。

従って、上記ポリマーは、ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）、ポリヘキサメチレンモノグアニド（ＰＨＭＧ）、ポリエチレンビグアニド（ＰＥＢ）、ポリテトラメチレンビグアニド（ＰＴＭＢ）、ポリエチレンヘキサメチレンビグアニド（ＰＥＨＭＢ）、ポリメチレンビグアニド（ＰＭＢ）、ポリ（アリルビグアニジノ－ｃｏ－アリルアミン）、ポリ（Ｎ－ビニルビグアニド）、ポリアリルビグアニドのうちの１以上の均一な又は不均一な混合物を含んでもよい。

上記ポリマーがポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）を含むことが最も好ましい。

１つの実施形態では、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤は、同じ活性医薬成分を含む。特定の抗炎症剤が鎮痛特性も有すると示されていることは、当業者には明らかであろう。他の実施形態では、当該組成物は、別個の抗炎症剤及び別個の鎮痛剤を含む。

上記抗炎症剤は、ステロイド系抗炎症剤（ＳＡＩＤ）及び非ステロイド系抗炎症剤を含めて、いくつかの異なる種類の抗炎症剤を含んでもよい。ある実施形態では、抗炎症剤が非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を含むことが好ましい。そのようなＮＳＡＩＤは、以下のもののうちの１以上から選択されてもよい：アスピリン（Ａｎａｃｉｎ、Ａｓｃｒｉｐｔｉｎ、Ｂａｙｅｒ、Ｂｕｆｆｅｒｉｎ（バファリン）、Ｅｃｏｔｒｉｎ、Ｅｘｃｅｄｒｉｎ（エキセドリン））；コリン及びジサリチル酸マグネシウム（ＣＭＴ、Ｔｒｉｃｏｓａｌ、Ｔｒｉｌｉｓａｔｅ）；サリチル酸コリン（Ａｒｔｈｒｏｐａｎ）；セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）；ジクロフェナクカリウム（Ｃａｔａｆｌａｍ（カタフラム））；ジクロフェナクナトリウム（Ｖｏｌｔａｒｅｎ（ボルタレン）、Ｖｏｌｔａｒｅｎ ＸＲ）；ジクロフェナクナトリウム・ミソプロストール合剤（Ａｒｔｈｒｏｔｅｃ（オルソテック））；ジフルニサル（Ｄｏｌｏｂｉｄ）；エトドラク（Ｌｏｄｉｎｅ（ロジン）、Ｌｏｄｉｎｅ ＸＬ）；フェノプロフェンカルシウム（Ｎａｌｆｏｎ）；フルルビプロフェン（Ａｎｓａｉｄ）；イブプロフェン（Ａｄｖｉｌ（アドビル）、Ｍｏｔｒｉｎ（モトリン）、Ｍｏｔｒｉｎ ＩＢ、Ｎｕｐｒｉｎ）；インドメタシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ、Ｉｎｄｏｃｉｎ ＳＲ）；ケトプロフェン（Ａｃｔｒｏｎ、Ｏｒｕｄｉｓ（オルヂス）、Ｏｒｕｄｉｓ ＫＴ、Ｏｒｕｖａｉｌ）；サリチル酸マグネシウム（Ａｒｔｈｒｉｔａｂ、Ｂａｙｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ、Ｄｏａｎ’ｓ Ｐｉｌｌｓ、Ｍａｇａｎ、Ｍｏｂｉｄｉｎ、Ｍｏｂｏｇｅｓｉｃ）；メクロフェナム酸ナトリウム（Ｍｅｃｌｏｍｅｎ）；メフェナム酸（Ｐｏｎｓｔｅｌ）；メロキシカム（Ｍｏｂｉｃ（モービック））；ナブメトン（Ｒｅｌａｆｅｎ（レラフェン））；ナプロキセン（Ｎａｐｒｏｓｙｎ、Ｎａｐｒｅｌａｎ）；ナプロキセンナトリウム（Ａｌｅｖｅ、Ａｎａｐｒｏｘ）；オキサプロジン（Ｄａｙｐｒｏ）；ピロキシカム（Ｆｅｌｄｅｎｅ（フェルデン））；ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ（バイオックス））；サルサラート（Ａｍｉｇｅｓｉｃ、Ａｎａｆｌｅｘ ７５０、Ｄｉｓａｌｃｉｄ、Ｍａｒｔｈｒｉｔｉｃ、Ｍｏｎｏ－Ｇｅｓｉｃ、Ｓａｌｆｌｅｘ、Ｓａｌｓｉｔａｂ）；サリチル酸ナトリウム（種々のジェネリック）；スリンダク（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ（クリノリル））；トルメチンナトリウム（Ｔｏｌｅｃｔｉｎ）；及びバルデコキシブ（Ｂｅｘｔｒａ）。

好ましくは、上記抗炎症剤及び／又は鎮痛剤は、以下の、ラパマイシン、タクロリムス、イブプロフェン、シクロスポリン、ジクロフェナク、ナプロキセン並びにこれらの関連する誘導体及び塩から選択される１以上を含む。

上記抗炎症剤及び／又は鎮痛剤がジクロフェナク並びにその関連する誘導体及び塩であることが最も好ましい。このジクロフェナクは、ジクロフェナクカリウム（Ｃａｔａｆｌａｍ）、ジクロフェナクナトリウム（Ｖｏｌｔａｒｅｎ、Ｖｏｌｔａｒｅｎ ＸＲ）、又はジクロフェナク塩とミソプロストール（Ａｒｔｈｒｏｔｅｃブランドで市販されている）等の別の薬学的に活性な成分との合剤の形態であってもよい。

上記抗炎症剤及び／又は鎮痛剤がジクロフェナク並びにこの関連する誘導体及び塩を含む場合、平均直径は、５０～２５０ｎｍのおよその範囲にあってもよい。好ましくは、上記ナノ粒子は１００～２００ｎｍの範囲の平均直径を有し、より好ましくは上記ナノ粒子は１２５～１７５ｎｍの範囲の平均直径を有し、最も好ましくは約１５０ｎｍの平均直径及び／又は約１３８ｎｍの平均モード径を有する。

上記ナノ粒子は、抗炎症剤及び／若しくは鎮痛剤と共に、並びに／又はその存在下で形成されてもよい。上記ナノ粒子を形成するために種々の方法が使用されてよく、ナノ粒子は、ポリマーと抗炎症剤及び／又は鎮痛剤との複合体として形成されることが想定される。しかしながら、ポリマーナノ粒子は、独立して形成されて、次いで、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤がこのナノ粒子に吸収され又は付着するように、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とインキュベートされてもよい。あるいは、ナノ粒子は、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とのインキュベーション中に形成されてもよい。

当該組成物が以下の成分の１つ以上をさらに含み得ることは、当業者に明らかである：緩衝剤、賦形剤、結合剤、油、水、乳化剤、グリセリン、酸化防止剤、防腐剤及び芳香剤、又は局所クリーム、ゲル、軟膏剤、スプレー、粉末、泡沫若しくはムースに通常見られる任意のさらなる成分。さらには、当該組成物は、スプレー装置と共に使用するためのペースト又は懸濁液などの多くの形態であることもできよう。好ましくは、当該組成物は、局所投与用である。

当該組成物は、医薬として使用するためのものであってもよい。そのような医薬は、局所医薬を含んでもよい。

当該組成物は、炎症及び／若しくは疼痛の治療又は管理において使用するためのものであってもよい。

本発明の関連する態様では、炎症及び／若しくは疼痛の治療又は管理において使用するための組成物であって、ナノ粒子を形成することができるポリマーと、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とを含む組成物が提供される。

本発明の別の関連する態様では、炎症及び／若しくは疼痛の治療又は管理のための組成物であって、ナノ粒子を形成することができるポリマーと、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とを含む組成物が提供される。

本発明の第１の態様にさらに関連して、炎症及び／若しくは疼痛の治療若しくは管理のための医薬の製造又は調製における、ナノ粒子を形成することができるポリマーと、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とを含む組成物の使用が提供される。

このような炎症及び／又は疼痛は、筋肉又は骨格（骨）のものであってもよい。上記組成物は、腱、靱帯、筋肉及び関節の外傷、リウマチ、関節痛若しくは関節炎の治療又は管理において使用するためのものであってもよい。

本発明の別の態様によれば、医薬の調製における、抗炎症剤及び／若しくは鎮痛剤を有する、又は抗炎症剤及び／若しくは鎮痛剤と会合する１以上のナノ粒子を形成するためのポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）の使用が提供される。

上記ナノ粒子は、患部への抗炎症剤及び／又は鎮痛剤のための送達用媒体（ビヒクル）として使用されてもよい。患部は筋肉領域又は骨格領域であってもよい。上記炎症及び／又は疼痛は、腱、靱帯、筋肉及び関節の外傷、リウマチ、関節痛又は関節炎を含んでもよい。

本発明のさらなる態様によれば、炎症及び／若しくは疼痛の治療又は管理のための組成物の製造方法であって、ナノ粒子の形成を可能にするのに好適な条件下で、ナノ粒子を形成することができるポリマーを抗炎症剤及び／又は鎮痛剤と混合する工程を備える方法が提供される。

当該方法は、本明細書において上記したような組成物を製造するために使用されることが好ましい。

本発明のさらなる態様によれば、ＰＨＭＢと抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とから形成されるナノ粒子又はナノ粒子結合体を含む、炎症及び／若しくは疼痛の治療又は管理に使用するための組成物が提供される。

本発明の関連する第１の態様では、炎症及び／若しくは疼痛の治療若しくは管理のための医薬の製造又は調製のための、ＰＨＭＢと抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とから形成されるナノ粒子又はナノ粒子複合体の使用が提供される。

ＰＨＭＢ（ポリヘキサメチレンビグアニド）は安全で有効な殺生物剤として知られており、消毒剤及び防腐剤として使用されている：米国特許第７８９７５５３号明細書、米国特許第４７５８５９５号明細書、米国特許出願公開第２００８２６１８４１号明細書；米国特許出願公開第２００４０００９１４４号明細書。ＰＨＭＢ及び関連分子は、有用な侵入促進剤であることも見出されている。驚くべきことに、ＰＨＭＢ（例えば）自体が、細菌、真菌及び哺乳動物細胞を含む広範囲の細胞に侵入することが観察された。より驚くべきことに、ＰＨＭＢ（例えば）は、広範囲の分子とナノ粒子を形成することができ、これらの分子をそのような細胞中に送達することができる（ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５２６）。最後に、核酸から小分子に及ぶ送達された分子は、細胞内で機能的であることが見出された。さらに、レチノイン酸及びビタミンＣ等のいくつかの天然物分子を用いて実施された研究により、その天然物に対する増強された安定化効果が実証されているため、この天然物はＰＨＭＢと組み合わせた場合に分解しにくい。

ここでは、本発明者らは、全体として、角質層への及び角質層を通る浸透を可能にするナノ粒子を形成するＰＨＭＢを用いた抗炎症剤及び／又は鎮痛剤の配合物の発明を記載する。

図１は、例１で説明したような、ジクロフェナク及びＮａｎｏｃｉｎの配合物粒子サイズ（ｚ平均）対多分散性指数（ＰＤＩ）を示すグラフである。 図２ａは、ＬＭ１０捕捉ジクロフェナク及びＰＨＭＢ粒子の画像である。 図２ｂは、例１で説明したような、２０％エタノール中のジクロフェナク／Ｎａｎｏｃｉｎ配合物に関する粒子集団対サイズのＬＭ１０プロファイルを示すグラフである。 図３は、例１で説明したような、脱水したジクロフェナクナノ粒子のＳＥＭ顕微鏡写真（１０ｋＶ、１０Ｋｘ倍率で画像化）を示す。 図４は、例１で説明したような、ＷＥＴＳＥＭカプセル中のナノ粒子の後方散乱画像（３０ｋＶ、４．６ｋｘ倍率で画像化）を示す。 写真を示す。 写真を示す。 写真を示す。 写真を示す。 グラフを示す。 グラフを示す。 グラフを示す。 グラフを示す。 グラフを示す。 グラフである。 グラフである。 グラフである。 グラフである。 グラフである。 グラフである。 グラフである。 図５は、例１で説明したような、２時間、４時間及び２４時間の時間にわたるＴＮＦ－α、ＩＬ－８及びＩＬ－１α応答について検討したＬＰＳ用量（０～１μｇ／ｍｌ）を示すグラフである。 図６は、例１で説明したような、２時間、４時間及び２４時間にわたるＴＨＰ－１細胞におけるＬＰＳに対するＩＬ－８応答を示すグラフである。 図７は、例１で説明したような、２時間、４時間及び２４時間にわたるＴＨＰ－１細胞におけるＬＰＳ刺激に対するＴＮＦ－ａ応答を示すグラフである。 図８ａは、２４時間にわたるＬＰＳによるＴＨＰ－１細胞に対する刺激の後のすべてのＡＰＩの用量反応を伴うＩＬ－８レベルを示すグラフである。 図８ｂは、ＡＰＩの存在下（ここでは試料は１／５に希釈されている）でのＴＨＰ－１細胞に対する２４時間のＬＰＳ曝露後のＩＬ－８刺激を示すグラフである。 図８ｃは、１０μｇ／ｍｌ ＬＰＳの存在下での種々の抗炎症剤（３０μｇ／ｍｌ）の２４時間インキュベーション後のＴＨＰ－１細胞におけるＩＬ－８の放出を示すグラフである（ＩＬ－８レベルは細胞数で規格化されている）。 図８ｄは、Ｎａｎｏｃｉｎを伴う及び伴わない種々のＡＰＩの存在下でのＴＨＰ－１細胞に対する２４時間のＬＰＳ曝露後のＩＬ－８刺激を示すグラフである。 図８ｅは、Ｎａｎｏｃｉｎ（１００μｇ／ｍｌ）を伴う及び伴わない３０μｇ／ｍｌの種々のＡＰＩの存在下でのＬＰＳ刺激ＴＨＰ－１細胞に対する２４時間インキュベーション後の生細胞の数を示すグラフである。 図８ｆは、２時間及び２４時間におけるＮａｎｏｃｉｎを用いた場合の経時的なＴＨＰ－１細胞生存率を示すグラフである。 図９は、例１で説明したような、Ｎａｎｏｃｉｎを伴う及び伴わないジクロフェナクの存在及び不存在下でのＬＰＳ刺激に対するＴＨＰ－１応答を示すグラフである（細胞数で規格化した後のＩＬ－８応答）。 図１０は、例１で説明したような、ＩＬ－８分泌（応答順）を示すグラフである。 図１１は、例１で説明したような、Ｎａｎｏｃｉｎを伴う及び伴わないジクロフェナクの存在及び不存在下でのＬＰＳ刺激に対するＴＨＰ－１応答を示すグラフである（細胞数で規格化した後のＴＮＦ－ａ応答）。 図１２は、例１で説明したような、ＴＮＦ－α分泌（応答順）を示すグラフである。 図１３は、例１で説明したような、ＮａＣｌ_２試料強度を示すグラフである。 図１４は、例１で説明したような、平均ＮａＣｌ_２試料強度を示すグラフである。 図１５は、例１で説明したような、ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ及びジクロフェナク単独の角質層への浸透を示す断面画像である。 図１６は、例２で利用した化学イメージングのための試料調製の概略図を示す。 図１７は、例２で利用した、断面分析対テープストリップ分析を示す。 図１８は、例２で説明した、断面画像（Ｈ＆Ｅ染色後）の例を示す。 図１９は、例２で説明した、ＡＰＩ＋ＮａｎｏｃｉｎについてのＴｏＦ－ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。 図２０は、例２で説明した、タクロリムス＋ＮａｎｏｃｉｎについてのＴｏＦ－ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。 図２１は、例２で説明した、ジクロフェナク＋ＮａｎｏｃｉｎについてのＴｏＦ－ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。 図２２ａ～図２２ｃは、例２で説明したＡＰＩ＋テープストリップ分析を示すグラフを示す。図２２ａは、ポジティブスペクトル及びネガティブスペクトルにおけるシクロスポリン＋Ｎａｎｏｃｉｎを示す。 図２２ａ～図２２ｃは、例２で説明したＡＰＩ＋テープストリップ分析を示すグラフを示す。図２２ｂは、ポジティブスペクトル及びネガティブスペクトルにおけるラパマイシン＋Ｎａｎｏｃｉｎを示す。 図２２ａ～図２２ｃは、例２で説明したＡＰＩ＋テープストリップ分析を示すグラフを示す。図２２ｃは、ポジティブスペクトル及びネガティブスペクトルにおけるタクロリムス＋Ｎａｎｏｃｉｎを示す。 図２３ａ～図２３ｃは、例２で説明したＡＰＩ＋ＦＩＴＣ－Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ分析の蛍光顕微鏡写真を示す。図２３ａは、対照ＴＳ１及びＴＳ２についての顕微鏡写真を示す。 図２３ａ～図２３ｃは、例２で説明したＡＰＩ＋ＦＩＴＣ－Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ分析の蛍光顕微鏡写真を示す。図２３ｂは、ＴＳ１及びＴＳ２に対するタクロリムス＋ＦＩＴＣ－Ｎａｎｏｃｉｎについての顕微鏡写真を示す。 図２３ａ～図２３ｃは、例２で説明したＡＰＩ＋ＦＩＴＣ－Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ分析の蛍光顕微鏡写真を示す。図２３ｃは、ＴＳ１及びＴＳ２に対するジクロフェナク＋ＦＩＴＣ－Ｎａｎｏｃｉｎについての顕微鏡写真を示す。 図２４は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ ＴＳ１についてのＴｏＦ－ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。図２４は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ ＴＳ２についてのＴｏＦ－ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。 図２５は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ ＴＳ２についてのＴｏＦ－ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。 図２６は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ ＴＳ３についてのＴｏＦ－ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。 図２７は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナクＴＳ１についてのＴｏＦ－ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。 図２８は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナクＴＳ２についてのＴｏＦ－ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。 図２９は、例２で説明した、３つのリピートとしてのジクロフェナクＴＳ３についてのＴｏＦ－ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。 図３０は、例２で説明した、ａ）対照試料（ブランク）１、ｂ）対照試料（ブランク）２、ｃ）ジクロフェナク試料１、ｄ）ジクロフェナク試料２、ｅ）ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ１、ｆ）ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ２、ｇ）ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ３、及びｈ）ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ４についてのＴｏＦ－ＳＩＭＳ化学イメージングを使用する断面分析を示す。 図３０の続きである。 図３０の続きである。 図３０の続きである。 図３１は、ヒト対ブタのジクロフェナク及びｎａｎｏｃｉｎの分布の％によるグラフを示す。試料は、ジクロフェナクの存在について定量ＬＣ－ＭＳにより分析された。各試料中で見出された薬物の割合は、フランツセルの上側チャンバーに施用された全量と比べて算出された（％）。 図３２は、ヒトの皮膚の研究におけるシクロオキシゲナーゼ１の阻害を示すグラフである。シクロオキシゲナーゼ－１（Ｃｏｘ－１）阻害は、Ａｂｃａｍ（アブカム）製のアッセイキットを使用して製造業者の使用説明書に従って決定された。Ｃｏｘ－１の％阻害は、決定されて、平均のビヒクル単独処置に対して規格化された。

本発明の実施形態は、これより以下の実験及び添付の図面を参照して、例としてのみ記載される。

例１ － 治療剤としての抗炎症剤とＮａｎｏｃｉｎとの薬物再配合
背景
炎症及び／又は疼痛の治療並びに管理のための治療剤としてどれを進めるのが最良かを決定するために、研究プログラムを、Ｎａｎｏｃｉｎ（登録商標）（Ｔｅｃｒｅａ Ｌｔｄ（テクレア）、英国）（ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ））と配合したいくつかの抗炎症剤をスクリーニングするように選んだ。活性医薬成分（ＡＰＩ）／Ｎａｎｏｃｉｎ選択プロセスを以下の研究プログラムによって決定した。
・水及びエタノールのビヒクルの中での溶解度。
・粒子形成、サイズ及び品質に注目したときの選んだＡＰＩとＮａｎｏｃｉｎとの配合。
・注目する配合物のナノ粒子形成を確認するための電子顕微鏡観察の使用。
・ＡＰＩの抗炎症活性の測定及びｎａｎｏｃｉｎがこの効果に拮抗しないことの確認。

ＡＰＩを配合することが皮膚へのＡＰＩの送達を高めるか否かを判定するために、局所的皮膚塗布研究も使用した。

初期スクリーニングのために、異なる分類の５種の抗炎症剤を選んだ。それらを下記表１に詳述する。

エタノール及び水の中の各化合物の溶解度を求めた。それを下記表２に示す。

この後、Ｃｅｌｃｏｘｉｂはその不溶性のためこのプログラムから脱落したが、イブプロフェン（水及びエタノールの中でより良好な溶解度を持つ非選択的なＣＯＸ阻害剤）を代わりのものとして試験した。

配合研究
ジクロフェナク（Ｄ）が最も可溶性であったので、ジクロフェナク（Ｄ）を最初にＮａｎｏｃｉｎと配合した。Ｎａｎｏｃｉｎに対するジクロフェナクの比（Ｄ：Ｎ）を試験し、比が異なると粒子サイズが変化することが示された。しかしながら、図１に示すように、多分散性指数（混合物中のナノ粒子サイズのばらつきの尺度）は、１：１ｍｇ／ｍｌの混合物においてのみ「良好」として報告された。

２０％エタノール中のジクロフェナクとＮａｎｏｃｉｎの１：１ｍｇ／ｍｌ比は不透明な溶液を生成した。これは最初は不溶性によると考えられたが、３０％エタノールビヒクルと水でも起こった。

上記複合配合物をＮａｎｏｓｉｇｈｔ ＬＭ１０（ナノ粒子検出機）を通して処理したところ、この試料は明るすぎて読み取れなかったが、試料をフラッシュアウトする（流し出す）と多くのナノ粒子の兆候が見られた。この配合物は、走査することができるレベルのナノ粒子を得るために、１００対１に希釈する必要があった。この希釈でさえ、粒子の数は、数十億個／ｍｌで測定された（図２ａ参照）。

ＬＭ１０及びＤＬＳのデータから、この配合物の平均粒子サイズはおよそ１５０ｎｍであり、モード（ＬＭ１０から）は１３８ｎｍであることが示された。１：１ｍｇ／ｍｌ溶液の１：１００希釈で、粒子の数は７×１０^９粒子／ｍｌであった。多分散性指数はＤＬＳで良好と記載された。個体数プロファイルは、図２ｂに見ることができる。

ジクロフェナク配合物のＥＭ分析
上記配合物を、ＥＭ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ（イーエム・サポート・システムズ）（英国）によって走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いても調べた。最初に、乾燥試料として金でコーティングし、ＷＥＴ ＳＥＭも使用した。

図３に示した電子顕微鏡写真は、粒子が脱水後に１００～３００ｎｍの間にあったことを示している。脱水過程で起こるナノ粒子間の架橋が存在したが、これは、一部には、ナノ粒子に形成されていない残渣ポリマーによっても引き起こされた可能性もあった。

上記ナノ粒子のＷＥＴＳＥＭイメージングは成功裏に完了し、画像が得られた。図４は、溶液中のナノ粒子の後方散乱画像を示す。予想されるように、ナノ粒子がポリマーのみからなり、より大きなコントラストを与えることができるより重い元素がないので、コントラストは非常に低かったが、しかしながら、個々の粒子を見ることができる。加えて、いくつかの凝集又はより密な領域が観察されたが、これは、遊離ポリマーの存在によるものであった可能性がある。この遊離ポリマーもまた帯電しており、カプセルの表面に引き付けられるであろう。

他のＡＰＩとの配合物
他のＡＰＩを０．３３：１ｍｇ／ｍｌ又は１：１ｍｇ／ｍｌ（ＡＰＩ：Ｎａｎｏｃｉｎ）の濃度でＮａｎｏｃｉｎと配合した場合、両方においてナノ粒子が形成される証拠があった。

下記表３は、０．３３：１ｍｇ／ｍｌ ＡＰＩ：ＮａｎｏｃｉｎについてのＤＬＳデータを示す。

下記表４は、１：１ｍｇ／ｍｌ ＡＰＩ：ＮａｎｏｃｉｎについてのＤＬＳデータを示す。

ＰＤＩはラパマイシンで高く、１：１ｍｇ／ｍｌのＤ：Ｎ配合物のみがこれと共に「良好」との報告を与えたが、０．３３：１ｍｇ／ｍｌでは与えなかった。

炎症アッセイ
図５～図７は、ＴＨＰ－１細胞（ヒト単球細胞株）を用いて確立された抗炎症アッセイの結果を示す。リポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した後のサイトカイン（特に炎症に関連するものであるＴＮＦ－α、ＩＬ－８、ＩＬ－１αに注目）の放出は、化合物がもつ抗炎症作用の潜在的能力を試験するための有効なモデル系である（参考文献１）。

アッセイのための条件を標準化するために、ＬＰＳ用量（０～１μｇ／ｍｌ）を、２時間、４時間及び２４時間の時間にわたって、ＴＮＦ－α、ＩＬ－８及びＩＬ－１α応答について調べた。その結果、ＩＬ－１αとＩＬ－８は２４時間後に最大の発現を示したが、ＴＮＦ－αは２～４時間の間でより早期に応答した。このことは炎症カスケードで周知である。ＩＬ－８とＩＬ－１αはともに炎症反応の後期を示し、ＩＬ－８はより明瞭な応答曲線を示したので、ＩＬ－８はスクリーニング過程に進み、ＩＬ－１αは中止した。

ＩＬ－８による応答に対するＡＰＩ用量範囲
各ＡＰＩの０～３０μｇ／ｍｌの用量範囲をＴＨＰ－１細胞アッセイで試験した（図８ａ参照）。ラパマイシン、ジクロフェナク、シクロスポリン及びタクロリムスは、ＬＰＳ炎症反応の阻害においてイブプロフェンよりも強力であると思われた。タクロリムス及びシクロスポリンのＭＩＣは０．３μｇ／ｍｌであり、ジクロフェナク及びラパマイシンは１μｇ／ｍｌであった。

その後、ＡＰＩを、Ｎａｎｏｃｉｎ配合を伴う及び伴わずに、３０μｇ／ｍｌのＡＰＩ及び１００μｇ／ｍｌのＮａｎｏｃｉｎの濃度で試験した。先に示したように、イブプロフェン（Ｉ）はＩＬ－８放出の減少にほとんど影響を及ぼさなかったが、他のＡＰＩは影響を及ぼした（図８ｂ）。

図８ｂからの結果を各試料の細胞数で規格化し（図８ｃ）、これにより、タクロリムスを３０μｇ／ｍｌでより効果的な抗炎症剤として特定した。

配合した試料及びＮａｎｏｃｉｎ単独を用いると、ＩＬ－８のレベルはほぼゼロに低下した（図８ｃ）が、これはＩＬ－８の放出を阻害したからではなく、Ｎａｎｏｃｉｎによる細胞死（図８ｄ）によるものであった。

ＴＨＰ－１細胞は、Ｎａｎｏｃｉｎ濃度に敏感であるので、この細胞に対してＮａｎｏｃｉｎ用量を実施した（図８ｅ）。２時間後では１０μｇ／ｍｌの濃度で、２４時間後では１μｇ／ｍｌの濃度で、Ｎａｎｏｃｉｎは細胞生存率に有意な影響を及ぼした。

図９～図１２に示されるように、配合物を、細胞生存率に影響を及ぼさない十分に低い濃度のＮａｎｏｃｉｎで試験した。１：１ｍｇ／ｍｌ（Ｎａｎｏｃｉｎ：ＡＰＩ）を最初に２０％エタノール中で配合し、次いで、ストック配合物を無血清培地で希釈し、１μｇ／ｍｌ又は０．１μｇ／ｍｌの最終濃度で試験した。

まとめ
両方のサイトカイン測定で、ジクロフェナク単独及びＮａｎｏｃｉｎ単独がＬＰＳ刺激性炎症反応を低下させることが示された。一緒に処方した場合、分泌されたサイトカインのレベルは、ＬＰＳ刺激応答よりも依然としてかなり少なかった。このデータは、Ｎａｎｏｃｉｎが単独である程度の抗炎症作用を有し得ることを示唆する。

局所的皮膚研究
例２でより詳細に記載されているように、ブタの耳の皮膚を用いて、インビトロ浸透研究を実施した。

実験的研究は、フランツ（Ｆｒａｎｚ）セル中で皮膚に種々の配合物を施用し、無限用量として２４時間それを放置することを含んだ。最初の配合物は２０％エタノール中の１ｍｇ／ｍｌのＮａｎｏｃｉｎと３００μｇ／ｍｌのＡＰＩであった。ＦＩＴＣ標識Ｎａｎｏｃｉｎを使用する同じ濃度の配合物も使用した。検出方法は、フランツセル方法１：完全ＯＣＴ包埋方法及び凍結切片化（Ｆｕｌｌ ＯＣＴ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｃｒｙｏ－Ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）；フランツセル方法２：部分ＯＣＴ包埋及び凍結切片化（Ｐａｒｔｉａｌ ＯＣＴ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ａｎｄ Ｃｒｙｏ－Ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）；フランツセル方法３：部分ＯＣＴ包埋及びテープストリッピング（Ｐａｒｔｉａｌ ＯＣＴ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｐｅ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）；及び飛行時間型二次イオン質量分析（ＴｏＦ－ＳＩＭＳ）蛍光顕微鏡法により行った。

簡単に述べると、この濃度では、角質層内に新たな二次イオンを有するＮａｎｏｃｉｎを配合したジクロフェナクを除いて、全ての方法でＡＰＩのいずれも検出できなかった。ジクロフェナクとｎａｎｏｃｉｎとの共配合物が、異なるフィンガープリントをもたらす化合物のイオン化パターンの実質的な変化を引き起こしていると仮定された。

ジクロフェナクはシグナルの徴候を示しているので、既に皮膚治療に使用されている別のクラスの抗炎症剤としてタクロリムスを進行させることを決定し、次いでＩＳＡＣには、ＴｏＦ ＳＩＭＳにおけるシグナルを改善するために、１：１ｍｇ／ｍｌ ＡＰＩ：Ｎａｎｏｃｉｎとしてより高い用量の配合物を提供した。

３つのジクロフェナク及び３つのジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎからの上から３つのテープストリップのＴｏＦ－ＳＩＭＳ分析は、上記組み合わせ配合物が、活性物のみでは浸透しない角質層の最上層への活性成分の浸透を誘発することを示唆しているように思われた。

ここでは、ＣＮ－（皮膚化学のマーカー）とジクロフェナク（塩）のマーカーとして用いたＣｌ－、ＮａＣｌ_２－及びＮａ_２Ｃｌ_３－の分布を提示する。これらは、２つの試料タイプと対照（ブランク）との間の分散を探すピーク検索に基づいて使用した。

ＣＮ－マーカーは、皮膚組織の剥がしが成功し、この組織がそれぞれテープストリップ上に局在化されたことを示すために使用される。Ｃｌ－はある程度遍在していると見られ、限定的にしか本来の皮膚化学に関連しないが、ＮａＣｌ_２－及びＮａ_２Ｃｌ_３－のイオンマーカーは、対照試料と比較して強い分散を示し、活性成分と相関しているように見える。それらは上記化合物の塩構造の論理的フラグメントである。

ジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎをジクロフェナク単独の試料と比較すると、前者のすべての試料のテープストリップ１～３にＮａＣｌ_２－イオン及びＮａ_２Ｃｌ_３－イオンが不均一ではあるが実質的に存在しているが、後者のいずれにも存在しないと簡単に判断できる。Ｃｌ－は、両方の試料シリーズからの全てのテープストリップに存在するが、組み合わせ配合物において強度の顕著な増加を示す。

すべての試料からのイオン強度データをプロットし、それぞれの群に結合することで、この主張が支持される。

ジクロフェナクとｎａｎｏｃｉｎの結果の一例を図１５に示す。１ｍｇ／ｍｌのジクロフェナクと１ｍｇ／ｍｌのジクロフェナク＋ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎを比較したＴｏＦ－ＳＩＭＳ断面分析は、ｎａｎｏｃｉｎ配合物が角質層への（不均一に分布した）浸透を促進し、ジクロフェナクのみの配合物に関する浸透の証拠が減少したことを示唆することが分かった。

部分包埋法による試料調製は、より良好な試料安定性（下にある軟骨を残す）を提供するようであり、画像解析に対するＯＣＴの影響を減少させた。

ＣＮ－及びＰＯ２－を皮膚化学のマーカーとして使用し、Ｃｌ－、ＮａＣｌ２－及びＮａ２Ｃｌ３－をジクロフェナク（塩）のマーカーとして使用した。

特に、対照試料は、角質層に蓄積されたこれらのマーカーの証拠を示さない。ジクロフェナク単独試料は、角質層領域、及び表皮全般において、これらのイオンの強度のわずかな上昇を示した。しかしながら、ジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎ試料は、角質層において有意な上昇を示し、強度において一貫性のない不均一なスパイクとして提示される。これらは、局在を確認するのに役立つＰＯ２－シグナルの抑制としばしば相関する。

例２ － 浸透促進剤を伴う及び伴わない局所的に送達される活性医薬成分のインビトロ浸透評価
背景
これらの実験の目的は、浸透促進剤としてのＮａｎｏｃｉｎを伴う及び伴わない、ブタ皮膚切片上の選択された活性医薬成分（ＡＰＩ）の「インビトロ」浸透を評価することであった。

実験中、ラパマイシン、タクロリムス、イブプロフェン、シクロスポリン及びジクロフェナクＡＰＩの局所送達及びその後の透過をモデル化するために、フランツセルプロトコルを開発することを計画した。次いで、これらのＡＰＩを、単独及び同時配合したＮａｎｏｃｉｎの両方でブタ皮膚に局所施用した。次いで、フランツセルから回収した皮膚切片を凍結ブロックし、続いて凍結切片を作製して、組織の断面スライスを得た。次いで、切片を飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴｏＦ－ＳＩＭＳ）及び蛍光顕微鏡法（ＦＭ）によって化学的に画像化し、ＡＰＩの位置を突き止め、それらが皮膚切片に浸透した程度を評価した。純物質としてのＡＰＩを表す二次イオンピークを、本プロジェクトの初期段階で特徴付けることにした。これらは、ＡＰＩ分布を特定するために最初に使用された。（追加の）ＦＩＴＣ標識ｎａｎｏｃｉｎ変形体を使用して、蛍光活性浸透促進剤を提供し、この蛍光活性浸透促進剤を、次いで、ＦＭによって検出して、配合物の範囲の浸透及び組織局在を決定することができた。蛍光ワークアップは、本プロジェクトの最初の部分で実施した。

フランツセル方法１：完全ＯＣＴ包埋方法及び凍結切片化
フランツセル分析に用いたブタの耳は、地元の食肉処理場から入手した。屠殺されたブタの月齢は４～６ケ月齢の間であった。耳を脱イオン水で洗浄し、外側の皮膚を下にある軟骨から注意深く取り外した。次いで、切除した皮膚を、使用するまで－２０℃で保存した。浸透実験に使用した全ての耳は、調達後６か月以内であった。

フランツセルを設定する前に、室温及び室内圧力で上記皮膚を放置することによってその皮膚を解凍した。この場合、ブタ皮膚上の過剰な毛は、トリミングしなかった（濾胞送達を特定する能力を促進するために）。この皮膚切片を、直径３ｃｍのより小さな切片サイズに直接切断して、皮膚がフランツ拡散セルのドナーチャンバーとレセプターチャンバーとの間に装着され得ることを確実にした。

レセプターチャンバーは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０％エタノール３ｍｌで満たされた。フランツセルを組み立てる際に、皮膚を３７℃水浴中で３０分間平衡化させた。これは、皮膚が生理的温度（３２℃）に到達することを確実にするために実施した。次いで、この皮膚を、所望のＡＰＩ配合物で処理した。

２３時間後、過剰の配合物を皮膚から取り除き、非引っ掻き性のスポンジを用いて３％Ｔｅｅｐｏｌ（ティーポール）溶液で洗浄した。次いで、この皮膚切片を１ｃｍ×１ｃｍの正方形（処理した皮膚部位の有効面積に対応する）に切断した。次いで、この皮膚切片を、最適切断温度（ＯＣＴ）樹脂を含有するベースモールドに適合することができるように半分に切断した。この皮膚切片を、切片化したときに垂直断面が得られるように直立して配置した。ベースモールドを液体窒素浴中の冷却したアルミニウムブロック上に置き、ＯＣＴを硬化させた。次いで、このモールドを、断面にするまで－８０℃で保存した。次いで、画像解析のためにいくつかの断面スライスを生成するために、Ｌｅｉｃａ ＣＭ ３０５０ Ｓクライオスタットを使用して、連続的断面切片化を行った。

フランツセル方法２：部分ＯＣＴ包埋及び凍結切片化
ブタの皮膚を入手し、上記の方法１と同じ様式で予備調製を行った。耳を脱イオン水で洗浄し、次いで使用まで－２０℃で保存した。浸透実験に使用した全ての耳は、調達後６か月以内であった。この実験設定のために、軟骨に付着した内側皮膚を使用して、安定性が増強された切片を作製した。

フランツセルを設定する前に、室温及び室内圧力で上記皮膚を放置することによってその皮膚を解凍した。ブタ皮膚上の過剰な毛は、（濾胞送達を特定する能力を促進するために）標準プロトコルに従ってここでもトリミングせず、皮膚切片は、フランツ拡散セルのドナーチャンバーとレセプターチャンバーとの間に装着するために、直径３ｃｍのより小さな切片に切断した。レセプターチャンバーは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０％エタノール３ｍｌで満たした。

フランツセルを組み立てる際に、皮膚を３７℃水浴中で３０分間平衡化させた。これは、皮膚が生理的温度（３２℃）に到達することを確実にするために実施した。次いで、この皮膚を、選択した配合物で処理した。２３時間後、過剰の配合物を皮膚から取り除き、その切片を、非引っ掻き性のスポンジを使用して３％ Ｔｅｅｐｏｌ溶液で洗浄した。

上記皮膚切片を１ｃｍ×１ｃｍの正方形（処理した皮膚部位面積に対応する）に切断した。次いで、この小さくした皮膚切片を半分に切断して液体窒素浴中の冷却されたアルミニウムブロック上に置き、皮膚固体を凍結した。次いで、切片化のための皮膚の部分がＯＣＴに埋め込まれないことを確実にする目的で、これらの凍結皮膚切片を、ＯＣＴを部分的に満たしたベースモールドに直立して配置した。

次いで、上記皮膚切片を、断面にするまで－８０℃で保存した。凍結切片化は、２０μｍの厚さまでＬｅｉｃａ ＣＭ ３０５０ Ｓクライオスタットを使用して行った。得られた切片をガラス顕微鏡スライド上に移し、画像解析に進んだ。

フランツセル方法３：部分ＯＣＴ包埋及びテープストリッピング
ブタの皮膚を入手し、処理後にフランツセルから試料を取り出すまで、方法１（上記）に記載したのと同じステップに従って、標準調製及びフランツセル処理を行った。

試料をフランツセル抽出に続いて１ｃｍ×１ｃｍに切断したとき、その試料を標準化されたプロトコルに従って連続テープストリッピングに供した。粘着フィルムストリップを処理した皮膚領域に連続的に貼付し除去した。粘着テープをローラーを用いて皮膚上に押し付けて、皮膚表面を伸ばした。この方法に従って調製した各試料について、１５本のテープストリップ層を収集した。得られたテープストリップを画像解析に進行させた。

飛行時間型二次イオン質量分析法（ＴｏＦ－ＳＩＭＳ）
全てのＴｏＦ－ＳＩＭＳ試料切片分析は、以下のような操作パラメーターを用いて超高真空条件下でＴｏＦ－ＳＩＭＳ ＩＶ機器（ＩＯＮ－ＴＯＦ ＧｍｂＨ（イオン－トフ）、ミュンスター（Ｍｕｅｎｓｔｅｒ）、ドイツ）上で実施した。
・一次イオンビーム：ビスマス液体金属イオンガン（Ｂｉ３＋） ２５ｋＶ（約１．０のパルスターゲット電流）
・スパッタイオンビーム：ＮＡ
・分析装置：単段リフレクトロン
・電荷補償：ｐＡ。低エネルギー電子（２０ｅＶ）
・データの取得及び分析：ＳｕｒｆａｃｅＬａｂ６ソフトウェア（ＩＯＮＴＯＦ ＧｍｂＨ）を使用して実施した。

イメージングに関する詳細
・分析した面積：５００μｍ×５００μｍの面積にわたってデータを取得した。
・解像度：２５６×２５６画素
・走査数：２０スキャン

蛍光顕微鏡法
ＣｏｏｌＬＥＤ ｐＥ－４０００蛍光照明、ｐＥ－１００明視野照明及びニコンプランフルオール（ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ）１０ｘ（０．３０ ＮＡ）対物レンズを装着した倒立型ニコンＥｃｌｉｐｓｅ Ｔ１及びＱＩＭＡＧＩＮＧ ｏｐｔｉＭＯＳカメラを用いて、蛍光顕微鏡法用の試料断面を撮像した。蛍光は、４９０ｎｍでの励起によって、４１０～５００（露光時間５０μｓ）、５００～５５０（露光時間２００μｓ）、５５０～６５０（露光時間２００μｓ）、６５０～７５０（露光時間２００μｓ）の発光を収集することで捕捉した。１０μｓの露光時間で明視野を捕捉した。全ての蛍光画像及び明視野画像を１２ビット画像（０～４０９５）に補正した。

図１６は、化学イメージングのための試料調製を概略的に示し、図１７は、断面分析対テープストリップ分析を示す。図１８は、断面画像（Ｈ＆Ｅ染色後）の例を示す。

実験計画
プロジェクトの開始時の実験計画は、以下の項目を調製し分析することであった。
１． ＴｏＦ－ＳＩＭＳのためのＡＰＩ＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞ シクロスポリン＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞ イブプロフェン＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞ ラパマイシン＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞ タクロリムス＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞ ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
２． ＴｏＦ－ＳＩＭＳのためのＡＰＩ断面
＞ シクロスポリン断面
＞ イブプロフェン断面
＞ ラパマイシン断面
＞ タクロリムス断面
＞ ジクロフェナク断面
３． ＦＭのためのＡＰＩ＋ＦＩＴＣ－Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞ シクロスポリン＋ＦＩＴＣ－Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞ イブプロフェン＋ＦＩＴＣ－Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞ ラパマイシン＋ＦＩＴＣ－Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞ タクロリムス＋ＦＩＴＣ－Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞ ジクロフェナク＋ＦＩＴＣ－Ｎａｎｏｃｉｎ断面

ＴｏＦ－ＳＩＭＳ ＡＰＩ＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面分析
シクロスポリン＋Ｎａｎｏｃｉｎ試料はすべて角質層剥離を伴い不首尾であった。イブプロフェン＋Ｎａｎｏｃｉｎ試料はすべて角質層剥離を伴い不首尾であった。ラパマイシン＋Ｎａｎｏｃｉｎ（２つの試料は成功裏に調製した）の例示的なデータを図１９に示す。皮膚表面又は角質層内での活性ワークアップにおいて特定されたラパマイシンマーカーの証拠はなく、これは浸透を暗示し得る。しかしながら、これは、検出アッセイの感度に起因していた可能性がある。ほとんどの空間的分散を示すイオンはＯＣＴ及び皮膚化学に関連し、対照試料（ブランク）と一致した。ラパマイシンの完全な欠如（検出不能）が示唆された。

タクロリムス＋Ｎａｎｏｃｉｎ
１つの試料は成功裏に調製され、１つの試料は重度の汚染のため除外した。データを図２０に示す。皮膚表面、又は角質層内でのＡＰＩワークアップにおいて、タクロリムスイオンマーカーの証拠は確認されず、これは浸透を暗示する。ほとんどの分散を示すイオンは、ここでも皮膚化学及びＯＣＴ媒体に関連しているようであり、対照試料（ブランク）と一致した。タクロリムスの完全な欠如（又は検出不能）が示唆された。

ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ
２つの試料を成功裏に調製した。図２１にデータを示す。皮膚表面、又は角質層内でのＡＰＩワークアップにおいて特定されたジクロフェナクイオンマーカーの証拠はなく、これは浸透を暗示する。しかしながら、基準ワークアップでは見られなかった他のイオン（Ｃ１４Ｈ２７Ｏ２－、Ｃ１６Ｈ３１Ｏ２－、Ｃ１４Ｈ２９Ｏ８－及びＣ２２Ｈ４３Ｏ２－）を見ることができ、角質層への局在と一致する空間分散を実証する。これらのイオンは（２００～４００ｍ／ｚ）の質量範囲にあると見られ、対照試料（未処理）には存在しなかった。これは、ｎａｎｏｃｉｎ－ジクロフェナクの共配合物が化合物化学のイオン化マトリックスに対して、著しく異なった二次イオンフィンガープリントを生成するのに十分な影響を与えるということを示唆している可能性がある。そうであるならば、この分析で見られるイオンは、ジクロフェナク－ｎａｎｏｃｉｎ複合体の浸透を反映している可能性があるが、これには研究をさらに広げる必要がある。

ＡＰＩ＋ｎａｎｏｃｉｎ断面試料のＴｏＦ－ＳＩＭＳ分析は、いくつかの重要なポイントを強調した。
・この分析のためのブタの皮膚試料の調製の一貫性は不良であった。角質層の剥離は、持続的な問題であることが見出され、これらの処置を受けた試料の構造的完全性が低いことを特定した。従って、データは、全てのＡＰＩについて収集されたわけではない。
・リファレンスから特定された二次イオンマーカーに基づいて、ＡＰＩの局在化について成功裏に生成された試料について証拠を集めることはできなかった。
・しかしながら、ジクロフェナクの場合、注目する新しい二次イオンが角質層に関連することがコントラストサーチによって見られた。
・ジクロフェナクとｎａｎｏｃｉｎとの共配合物は、上記化合物のイオン化パターンの実質的な変化を引き起こし、これが異なるフィンガープリントをもたらすと仮定した。
・この仮定が妥当であれば、これらの新しいマーカーは、ジクロフェナクの皮膚への浸透を示唆している可能性がある。
・しかしながら、ＡＰＩ／ｎａｎｏｃｉｎの検出が検出限界を反映しているかどうかも不明である。

ＴｏＦ－ＳＩＭＳテープストリップ分析
以下の実験は、ＡＰＩ／ｎａｎｏｃｉｎが検出可能であるべき分析領域を最大にし、検出の欠如が閾値の問題ではないことを確実にするために使用した。
＞ シクロスポリン＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
＞ イブプロフェン＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
＞ ラパマイシン＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
＞ タクロリムス＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
＞ ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ

ＴｏＦ－ＳＩＭＳ － ＡＰＩ＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ分析
図２２ａは、シクロスポリン＋Ｎａｎｏｃｉｎの結果を示す。イブプロフェン＋Ｎａｎｏｃｉｎ試料はすべて角質層剥離を伴い不首尾であった。図２２ｂは、ラパマイシン＋Ｎａｎｏｃｉｎの結果を示す。図２２ｃは、タクロリムス＋Ｎａｎｏｃｉｎの結果を示す。ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ試料では、すべてが角質層剥離を伴い不首尾であった。

ＡＰＩ－ｎａｎｏｃｉｎ処理テープストリップ試料のＴｏＦ－ＳＩＭＳ分析は、断面データと一致した。
・この分析のためのブタの皮膚試料の調製の一貫性は、ここでも問題であることが見出された。角質層の剥離は持続しており、これらの処置を受けた試料の構造的完全性が低いことを特定した。従って、データは、全てのＡＰＩについて収集されたわけではない。
・シクロスポリン、ラパマイシン及びタクロリムスの配合物（ｎａｎｏｃｉｎを伴う）について収集したデータは、Ｓ１．１で決定された代表的な二次イオンのイオン強度が、対照（ブランク試料）で見られるものとほぼ変わらないこと（テープストリップ１及び２において）を示した。
・これは、いかなる浸透についての証拠の欠如、及び上面での存在の証拠が限られている／全くないことを支持した。

テープストリップの蛍光顕微鏡法
ＦＭイメージングがＴｏＦ－ＳＩＭＳデータと矛盾する明らかな浸透を示すかどうかを評価するために、２つのＡＰＩ（ジクロフェナク及びタクロリムス）ＦＩＴＣ－ｎａｎｏｃｉｎ試料を選択した。
＞ ジクロフェナク＋ＦＩＴＣ－ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
＞ タクロリムス＋ＦＩＴＣ ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ

ＡＰＩ＋ＦＩＴＣ－Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ分析のデータを図２３ａ～２３ｃに示す。処理後のＡＰＩ／ｎａｎｏｃｉｎ配合物を検出する能力の検討をサポートするために、ＦＩＴＣ標識ｎａｎｏｃｉｎ－ジクロフェナク及びタクロリムスで処理した皮膚試料を、フランツセル方法３（部分ＯＣＴ包埋とテープストリッピング）を用いて作製した。対照として作用するために、ブランク試料（処理なし）も調製した。

テープで剥がした試料は、皮膚表面の側面図を提供し、この側面の図は、断面調製物に対して活性物（フルオロフォア）を検出する能力を最大にするはずである。

収集したスタックからの上から３つのテープストリップ層（ＴＳ）をＦＭによってイメージングし、ｎａｎｏｃｉｎ－ＡＰＩ複合体の浸透がフルオロフォアの局在によって推測され評価され得るか否かを評価した。

上記の例示的画像（ＴＳ１及びＴＳ２）及び収集された蛍光強度（ＦＩ）データは、タクロリムス及びジクロフェナク試料と比較して、対照試料上で見られた固有蛍光間に有意差がないことを示唆した。ジクロフェナク試料はＴＳ１（上面）により多くの蛍光を示すように視覚的には見えたが、これはＦＩによって統計的に有意であるとは特定されなかった。

このデータは、皮膚表面に浸透又は存在する重要な成分（ＡＰＩ／ｎａｎｏｃｉｎ）の証拠がないというＴｏＦ－ＳＩＭＳテープストリップデータを支持した。

ジクロフェナク対ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ高濃度濃度ＴｏＦ－ＳＩＭＳ分析
ジクロフェナクは、浸透の何らかの示唆を特定する（断面分析）ことができる唯一の活性成分であったので、ｎａｎｏｃｉｎを伴って及び伴わずに、このＡＰＩのみに焦点を当てることを決めた。検出効力を高めるために配合物中のＡＰＩの高められた濃度（１ｍｇ／ｍｌ）を使用することも決めた。

さらには、試料調製の問題に対処し、皮膚切片の構造的完全性を改善する（剥離を回避する）ために、調整した調製方法を使用した。部分的包埋技術を使用することを可能にするのに十分な支持を提供するために、下にある軟骨に依然として付着した皮膚切片を使用した。これは、より堅牢な物理的構造を提供し、ＯＣＴ浸出及び画像解釈の複雑化に関する分析上の問題を低減する追加の利点も有した。

これらの実験は以下のものを調べた。
＞ ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎテープストリップ
＞ ジクロフェナクテープストリップ
＞ ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ断面
＞ ジクロフェナク断面

図２４はＴｏＦ－ＳＩＭＳ ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ ＴＳ１（リピート１～３）を示す。図２５はＴｏＦ－ＳＩＭＳジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ ＴＳ２（リピート１～３）を示す。図２６はＴｏＦ－ＳＩＭＳジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎ ＴＳ３（リピート１～３）を示す。図２７はＴｏＦ－ＳＩＭＳジクロフェナクＴＳ１を示す。図２８はＴｏＦ－ＳＩＭＳジクロフェナクＴＳ２を示す。図２９はＴｏＦ－ＳＩＭＳジクロフェナクＴＳ３を示す。

図１３及び１４は、テープストリップ分析実験で使用したＴｏＦ－ＳＩＭＳイオン強度比較を示す。

観察
３種類のジクロフェナク及び３種類のジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎから得た上から３つのテープストリップ（テープ片）のＴｏＦ－ＳＩＭＳ分析は、組み合わせ配合物は、活性成分単独では浸透しない角質層の最上層への活性成分の浸透を誘発したことを示唆しているように思われた。

ここでは、ＣＮ－（皮膚化学のマーカー）とジクロフェナク（塩）のマーカーとして用いたＣｌ－、ＮａＣｌ_２－及びＮａ_２Ｃｌ_３－の分布を提示する。これらは、２つの試料タイプと対照（ブランク）との間の分散を探すピーク検索に基づいて使用した。

ＣＮ－マーカーは、皮膚組織の剥がしが成功し、この組織がそれぞれテープストリップ上に局在化されたことを示すために使用される。Ｃｌ－はある程度遍在していると見られ、限定的にしか本来の皮膚化学に関連しないが、ＮａＣｌ_２－及びＮａ_２Ｃｌ_３－のイオンマーカーは、対照試料と比較して強い分散を示し、活性成分と相関しているように見える。それらは上記化合物の塩構造の論理的フラグメントである。

ジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎをジクロフェナク単独の試料と比較すると、前者のすべての試料のテープストリップ１～３にＮａＣｌ_２－イオン及びＮａ_２Ｃｌ_３－イオンが不均一ではあるが実質的に存在しているが、後者のいずれにも存在しないと簡単に判断できる。Ｃｌ－は、両方の試料シリーズからの全てのテープストリップに存在するが、組み合わせ配合物において強度の顕著な増加を示す。

すべての試料からのイオン強度データをプロットし、それぞれの群に結合することで、この主張が支持される。

図３０は、ジクロフェナク対ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎの結果を示す。

１ｍｇ／ｍｌのジクロフェナクと１ｍｇ／ｍｌのジクロフェナク＋ジクロフェナク＋Ｎａｎｏｃｉｎを比較したＴｏＦ－ＳＩＭＳの断面分析は、ｎａｎｏｃｉｎ配合物が角質層への浸透を促進し（不均一に分布させ）、ジクロフェナクのみの配合物に関する浸透の証拠が減少したことを示唆することが分かった。

部分包埋法による試料調製は、より良好な試料安定性（下にある軟骨を残す）を提供するようであり、画像解析に対するＯＣＴの影響を減少させた。

ＣＮ－及びＰＯ２－を皮膚化学のマーカーとして使用し、Ｃｌ－、ＮａＣｌ２－及びＮａ２Ｃｌ３－をジクロフェナク（塩）のマーカーとして使用した。

特に、対照試料は、角質層に蓄積されたこれらのマーカーの証拠を示さない。ジクロフェナク単独試料は、角質層領域、及び表皮全般において、これらのイオンの強度のわずかな上昇を示した。しかしながら、ジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎ試料は、角質層において有意な上昇を示し、強度において一貫性のない不均一なスパイクとして提示される。これらは、局在を確認するのに役立つＰＯ２－シグナルの抑制と相関することが多い。

Ｎａｎｏｃｉｎの有無にかかわらず、シクロスポリン、イブプロフェン、ラパマイシン又はタクロリムスの浸透の証拠が認められなかったということは重要な知見ではあるが、これらのＡＰＩを検出する方法の感度によるものであったことを考慮しないわけにはいかない。テープストリッピング分析及びＴｏＦ－ＳＩＭＳイメージングにより、ｎａｎｏｃｉｎと共配合した場合のジクロフェナク浸透を示すいくつかの証拠があった。

まとめ
フランツセル実験法により、ＡＰＩ処理皮膚試料の全範囲を成功裏に生成した。しかしながら、その後の断面スライスへの試料の進行は、最も一般的には角質層の炎症及び剥離に起因するいくつかの試料の不備を伴い一貫性がないことが判明した。（ＦＩＴＣ標識されていない）ｎａｎｏｃｉｎ－ＡＰＩ配合物で処理した試料に対してＴｏＦ－ＳＩＭＳを用いて収集した初期データは、特定されたイオンマーカーを用いてＡＰＩもｎａｎｏｃｉｎも検出できないという証拠を提供しなかった。ＡＰＩ単独のＴｏＦ－ＳＩＭＳ及びＡＰＩ＋ＦＩＴＣ－Ｎａｎｏｃｉｎ ＦＭを調べる実験は実施せず、このデータに基づいて方法調整を開始し、テープストリッピングを介して皮膚表面の何らかの横分析を行い、より大きな予想表面積を見た場合にイオンマーカーが検出され得るかどうかを確認した。

断面スライスについての二次イオンデータセットのより高度なデータ分析も行った。この研究は、ジクロフェナク－Ｎａｎｏｃｉｎ試料切片が、角質層への（ブランク参照試料と比較して）独特の二次イオン局在のいくつかの証拠を示すことを強調した。これらのマーカー（質量範囲２００～４００ｍ／ｚ）は、基準ワークアップからリストアップされた基準マーカーと一致しなかった。他のＡＰＩ系については、そのような証拠は見出されなかった。これは、ＮａｎｏｃｉｎとＡＰＩとの共配合物が、ＡＰＩ及びｎａｎｏｃｉｎ単独に対して異なる二次イオン構造をもたらす独特のイオン化マトリックスを生成していることを示唆した。

ＦＩＴＣ標識のｎａｎｏｃｉｎ－ＡＰＩで処理した試料の蛍光顕微鏡画像は、皮膚の最初の３つのテープストリップ層内のフルオロフォアの証拠を示さなかった。このデータに基づいて追加の方法変更を開始し、ジクロフェナクに専ら焦点を当て、試料調製機構に変形例を使用して試料安定性を改善した。より高濃度（１ｍｇ／ｍｌ）のジクロフェナクを配合して、検出限界を確実に超えた。処理下の試料生存率を改善し、画像解析及び成分浸出に対するＯＣＴの影響を取り除くという良好な効果を得るために、軟骨に依然として付着した皮膚切片に対して部分包埋プロトコルを用いた。試料生存率は改善され、試料ロスは減少し、化学イメージング能力はＯＣＴ化学の影響を除去することによって改善された。断面スライス及びテープストリップの両方を、ジクロフェナク（単独）及びジクロフェナク＋ｎａｎｏｃｉｎで処理した試料を用いて調製した。

これら２つの系のリピートのテープストリッピング分析は、ＴｏＦ－ＳＩＭＳ断面分析で特定された同じイオンの局在の差を示したが、ジクロフェナク構造に論理的に対応するより顕著な他のイオンマーカーも示した。テープストリップデータは、ｎａｎｏｃｉｎ配合変形例におけるＡＰＩの不均一な浸透を示唆し、ＡＰＩ単独系では全く浸透しないことを示唆する。これは主にジクロフェナク塩に関連するイオン（Ｃｌ－、ＮａＣｌ_２－、Ｎａ_２Ｃｌ_３－）の使用に基づいていた。上記断面分析はこの主張を支持し、ｎａｎｏｃｉｎと同時配合した場合のジクロフェナク（上記に列挙した同じマーカーによる）の角質層への浸透を示唆する。角質層中のこれらのイオンの分布はいくらか不均一であり、強度のスパイクは特定の点に局在している。

例３ － ヒト皮膚研究
ヒト皮膚研究により、健常なヒトの皮膚へのＮＳＡＩＤ（ジクロフェナク）の薬物送達増強が確認された（図３１及び図３２を参照）。ヒトの腹部の皮膚は、健康なヒトドナーから倫理的に入手した。三連の皮膚ディスクを、表皮面を最上にして静的拡散セル（フランツセル）中に配置した。薬物溶液（ジクロフェナク単独、又はナノ粒子を形成するためにポリヘキサニドと配合したジクロフェナク）を、フランツセルの上側チャンバーに添加した。このフランツセルを完全に組み立て、次いで、３２℃で２４時間インキュベーションした後、分析した。この時点で、フランツセルを分解し、皮膚ディスクを取り出した。このディスクを洗浄し、ティッシュで軽くたたくことによって乾燥させた。次いで、皮膚の上層を、粘着テープを使用して３回連続して剥離した。試料は、フランツセルの上側チャンバー及び下側チャンバーからも採取した。

全ての試料を、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＱＤａ質量検出器を使用する定量ＬＣ－ＭＳによってジクロフェナクの存在について分析した（図３１）。加えて、テープストリップからの試料について、Ａｂｃａｍから購入したインビトロアッセイを用いて、シクロオキシゲナーゼ－１（Ｃｏｘ－１）に対する阻害能を分析した（図３２）。

２４時間では、レセプター液試料のいずれにおいても、ジクロフェナクはほとんど検出されず、これは、この時間で最小の薬物が皮膚を通過したことを示す。唯一の例外はジクロフェナク／ポリヘキサニド試料の１つについてであり、この試料では、かなりの量の施用した薬物がレセプター液中に見出された。しかしながら、これは、この１つの試料における皮膚ディスクを通過する流体の漏出によるものであった（図３１；ＤＮ１：１＿１）。

ジクロフェナク単独で処理したディスクと比較して、ジクロフェナク／ポリヘキサニドで処理した試料は、ジクロフェナク単独で処理した皮膚と比較して、ジクロフェナク／ポリヘキサニド皮膚テープストリップからのより高い薬物濃度によって示されるように、皮膚の上層への薬物送達が有意に増強されたことを示した（図３１）。下記表６に要約するように、個々のテープストリップ中のジクロフェナク／ポリエキサニドで処理した試料：ジクロフェナク単独で処理した試料間の薬物の比は、各連続テープストリップで増加し、これは、皮膚の上層との薬物会合が増強されるだけでなく、皮膚への浸透が増強されることを示す。Ｃｏｘ－１アッセイは、これらの観察を確認し、さらに、ジクロフェナク／ポリヘキサニドで処理した試料からのテープストリップ中のジクロフェナクのレベルは、有意なＣｏｘ－１阻害を生じるのに十分であるが、ジクロフェナク単独で処理した試料中のレベルはそうではないことを実証した（図３２）。上側チャンバー内に残留する薬物の量の分析（図３１）も、ジクロフェナク／ポリヘキサニド溶液において、おそらく皮膚への浸透のために、薬物の大部分がチャンバーから失われたことを実証した。対照的に、施用した薬剤の大部分はジクロフェナク単独処理物の上側チャンバーに留まっていた。

皮膚のストリッピング後、テープストリップを５ｍｌのメタノールに懸濁し、ＬＣ－ＭＳによる分析の前にテープから薬物を可溶化した。

これらの結果は、ジクロフェナクとポリヘキサニドとの配合後のヒト皮膚へのジクロフェナクの明瞭で増強された皮膚送達を実証する。

上記の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護の範囲を限定することを意図するものではなく、むしろ、本発明をどのように実施することができるかの例を記載することを意図する。

参考文献
１． 「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｓｓａｙ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ａｇｅｎｔｓ．」 Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：１２、２２５２－２２５６（２００５） Ｕｍａ Ｓｉｎｇｈら．

Claims (15)

1. ナノ粒子を形成することができるポリマーと、抗炎症剤及び／又は鎮痛剤とを含む炎症及び／又は疼痛の局所的な治療に使用するためのナノ粒子組成物であって、前記ポリマーが、直鎖状及び／若しくは分枝状若しくは環状のポリモノグアニド／ポリグアニジン、ポリビグアニドを含み、前記抗炎症剤及び／又は鎮痛剤が、以下の、ラパマイシン、タクロリムス、イブプロフェン、シクロスポリン、ジクロフェナク、及びナプロキセンから選択される１種以上を含む、前記ナノ粒子組成物。
2. 前記ポリマーがポリヘキサメチレンビグアニドを含む請求項１に記載の組成物。
3. 前記ナノ粒子が前記抗炎症剤及び／若しくは鎮痛剤と共に、並びに／又は前記抗炎症剤及び／若しくは鎮痛剤の存在下で形成される請求項１又は請求項２に記載の組成物。
4. 前記抗炎症剤が、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を含む請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 前記組成物が、緩衝剤、賦形剤、結合剤、油、水、乳化剤、グリセリン、酸化防止剤、防腐剤及び芳香剤のうちの１種以上の成分をさらに含む請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 前記炎症及び／又は疼痛が筋肉又は骨格のものである請求項１に記載の組成物。
7. 前記組成物が、腱、靱帯、筋肉及び関節の外傷、リウマチ、関節痛若しくは関節炎の治療において使用するためのものである請求項６に記載の組成物。
8. 前記組成物が、クリーム、ゲル、軟膏剤、スプレー、粉末、泡沫又はムースの形態にある請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 炎症及び／又は疼痛の治療に使用するための局所医薬の調製における、ラパマイシン、タクロリムス、イブプロフェン、シクロスポリン、ジクロフェナク、及びナプロキセンから選択される抗炎症剤及び／若しくは鎮痛剤を有する、又はラパマイシン、タクロリムス、イブプロフェン、シクロスポリン、ジクロフェナク、及びナプロキセンから選択される抗炎症剤及び／若しくは鎮痛剤と会合する１以上のナノ粒子を形成するためのポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）の使用。
10. 前記抗炎症剤及び／又は鎮痛剤が非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）を含む請求項９に記載のＰＨＭＢの使用。
11. 前記ナノ粒子が、患部への抗炎症剤及び／又は鎮痛剤のための送達用媒体として使用される請求項９に記載のＰＨＭＢの使用。
12. 前記患部が筋肉領域又は骨格領域である請求項１１に記載のＰＨＭＢの使用。
13. 前記炎症及び／又は疼痛が、腱、靱帯、筋肉及び関節の外傷、リウマチ、関節痛又は関節炎を含む請求項９から請求項１２のいずれか１項に記載のＰＨＭＢの使用。
14. 炎症及び／又は疼痛の局所的な治療のためのナノ粒子組成物の製造方法であって、直鎖状及び／若しくは分枝状若しくは環状のポリモノグアニド／ポリグアニジン、ポリビグアニドをラパマイシン、タクロリムス、イブプロフェン、シクロスポリン、ジクロフェナク、及びナプロキセンから選択される１種以上の抗炎症剤及び／又は鎮痛剤と混合する工程を備える方法。
15. 前記方法が、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の組成物を製造するために使用される請求項１４に記載の方法。

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