JP7475689B2 - 長期核酸受容能卵の製造方法 - Google Patents
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Description
前記保温工程後の卵を-2.5~15℃で処理する低温処理工程
を含む長期核酸受容能卵の製造方法
(2)前記胚発生温度が18~32℃である、(1)に記載の製造方法。
(3)前記保温工程における保温時間が1時間~4時間である、(1)又は(2)に記載の製造方法。
(4)前記低温処理工程における処理時間が3時間~4日間である、(1)~(3)のいずれかに記載の製造方法。
(5)前記チョウ目昆虫がカイコである、(1)~(4)のいずれかに記載の製造方法。
(6)チョウ目昆虫の産卵後の卵を18~32℃で1時間~4時間保温した後、-2.5~15℃で処理して得られる長期核酸受容能卵。
(7)前記-2.5~15℃での処理時間が3時間~4日間である、(6)に記載の長期核酸受容能卵。
1-1.概要
本発明の第一の態様は、長期核酸受容能卵の製造方法である。本発明の長期核酸受容能卵の製造方法は、チョウ目昆虫の産卵後の卵を受精後から表割を開始するまでの期間内に所定の時間、低温で処理することを特徴とする。カイコ等のチョウ目昆虫において、従来、産卵後2~8時間という限られた期間内に外来遺伝子を卵に導入しなければ遺伝子組換え体の作製が困難であった。しかし、本発明の製造方法によれば、核酸受容期間を1日以上の長期間に延長することができる。
本発明で使用する以下の用語について定義する。
本発明の製造方法は、保温工程、及び低温処理工程を必須の工程として含む。以下各工程について具体的に説明をする。
「保温工程」は、チョウ目昆虫の産卵後の卵を胚発生温度で保温する工程である。チョウ目昆虫は、本工程は、産卵後の卵が少なくとも受精を完了するまで胚発生を進めさせることを目的とする。
「低温処理工程」は、前記保温工程後の卵を低温で処理する工程である。本工程は、本発明の製造方法における主要工程であり、受精完了後の卵を低温下に配置することを特徴とする。
遺伝子組換えチョウ目昆虫の作製において、外来遺伝子を卵へ導入する場合、従来、産卵後2~8時間という非常に限られた時間内に行わなければ、導入された核酸は受容されず、遺伝子組換え体を得ることはできなかった。本発明の長期核酸受容能卵の製造方法によれば、この外来遺伝子の導入期間が産卵後2~8時間に限らず、1日以上の長期になっても受容可能な受精卵を製造することができる。本発明の製造方法により、受精卵の外来核酸の受容期間を容易に延長することが可能となる。これにより、一実験あたりのマイクロインジェクション処理数を増やすことができるため、遺伝子組換えチョウ目昆虫の作製効率が飛躍的に上がる。
2-1.概要
本発明の第2の態様は、チョウ目昆虫の長期核酸受容能卵である。本発明の長期核酸受容能卵は、前記第1の製造方法で得られる卵である。本発明の長期核酸受容能卵は、従来の卵と比較して核酸受容期間が顕著に長いことを特徴とする。
本発明のチョウ目昆虫の長期核酸受容能卵は、前記第1態様に記載の製造方法に基づいて得ることができる。具体的な一例として、チョウ目昆虫の産卵後の卵を18~32℃で、少なくとも受精が完了するまでの1時間~4時間保温した後、-2.5~15℃の低温で処理することで得られる。受精完了後の卵の低温処理で、初期胚発生が緩やかに停止又は遅延し、その間、核酸受容能が維持されると推察されるが、通常の卵と比較したときの長期核酸受容能卵における遺伝子又はタンパク質における構造的な違いについては明らかではなく、その構成についての詳細な説明は困難である。
(目的)
カイコを用いて、従来方法による産卵後の卵の遺伝子受容期間について検証する。
トランスジェニックカイコ作製において、従来法では、産卵後の卵にマイクロインジェクションを行う場合、その遺伝子導入適時、すなわち産卵後の卵の遺伝子受容期間は、当業者の経験則により産卵後4~8時間とされてきた。しかし、具体的に検証されたデータはない。そこで、本実施例では、実施例に対する比較例として、カイコを用いたマイクロインジェクションによるトランスジェニックカイコ作製時での遺伝子受容期間を検証する。
(1)導入用発現ベクターの構成
本比較例では、カイコの卵に外来核酸として、図1に示す発現ベクターpBac(3xP3DsRed2)を導入した。pBac(3xP3DsRed2)は、プロモーターとして人工合成プロモーターである3xP3であり、ターミネーターはSV40ターミネーターを含む遺伝子発現用プラスミドである。導入遺伝子には、胚、幼虫及び成虫の眼においてDsRedを発現する3xP3 DsRed標識遺伝子を用いた。さらに、プロモーターの上流と標識遺伝子の下流に、トランスポゾンの逆位末端反復配列(ITRs)としてL-ITR及びR-ITRを含む。L-ITR及びR-ITRは、それぞれpiggyBacトランスポゾンの両端に位置し、これらを含む数百bpの配列を介して、前記標識遺伝子は、導入するカイコ卵のゲノムに挿入される。
遺伝子導入する宿主卵には、カイコpnd-w1系統の卵を用いた。産卵台紙に交尾済み雌蛾を配置し、1時間産卵させた後に台紙上の卵を回収した。回収した卵を25℃の室温下でスライドガラスに並べマイクロインジェクションに供試した。
Tamuraら(Tamura T. et al., 2000,Nature Biotechnology, 18, 81-84;Tamura T., et al. (2007) Journal of Insect Biotechnology and Sericology 76, 155-159)による従来法によってマイクロインジェクションを行った。具体的には、0.4μg/μLのpBac(3xP3DsRed2)、及びトランスポゼースを発現する0.4μg/μLのヘルパープラスミドpHAPIGを1:1の割合で混合した。産卵後、25℃で4時間、8時間、及び12時間経過後の卵に電動マイクロマニピュレーターM300(株式会社マイクロサポート)を用いてマイクロインジェクションした(G0)。実験は各温度で独立に3回に分けて行い、陰性対照には、インジェクションを行わない卵を用いた。インジェクション後の卵は、インジェクション孔を瞬間接着剤(コニシ #30523)で塞ぎ、加湿状態にて25℃で孵化するまでインキュベートした。
表1に結果を示す。
(目的)
カイコを用いた本発明による産卵後の卵の遺伝子受容期間について検証する。
(1)導入用発現ベクターの構成
本実施例で使用した発現ベクターは、比較例に記載したpBac(3xP3DsRed2)である。したがって、pBac(3xP3DsRed2)の構成については説明を省略する。
遺伝子導入する宿主卵には、比較例と同様、カイコpnd-w1系統の卵を用いた。産卵台紙に交尾済みG0雌蛾を置き、1時間産卵させた後に卵を回収した。回収した卵は保冷剤を入れた発泡スチロール箱内に置き、極力10℃を保った状態でスライドガラス上に並べた。並べた卵は産後2~3時間経過したときにタッパーウェアに入れて注射まで10℃設定の冷蔵庫に所定の時間保護した。
陽性対照として、従来法で処理した実験群1(低温処理なし、産卵後25℃保存で4時間後に遺伝子導入)を用いた。また、陰性対照として遺伝子導入及び低温処理をいずれも行わない実験群4、及び遺伝子導入を行わず低温処理のみを行った実験群5を用いた。
低温処理の卵は、10℃で5時間又は24時間経過した卵を冷蔵庫から取り出し、25℃でしばらく置き、産後25℃での累積時間が4時間となった時点でマイクロインジェクションを行った。したがって、低温処理した実験群では、低温処理を行った期間だけ、産卵後、マイクロインジェクションまでの総累計経過時間が長くなる。マイクロインジェクション法及びその後の処理については、比較例に記載の方法に準じた。
結果を表2に示す。
(目的)
実施例1では、本発明の長期核酸受容能卵に関して、生殖細胞系列での効果を検証した。本実施例では、G0個体の体細胞系列での効果について検証する。
(1)導入用発現ベクターの構成
カイコのBLOS2遺伝子(BmBLOS2)に対してノックアウト(遺伝子破壊)を誘導するCRISPR/Cas9システムを用いた。BLOS2遺伝子は、カイコの皮膚における尿酸粒の蓄積に関与する遺伝子である(Fujii T., et al., 2010, Insect Mol Biol. 19(5):659-667.)。 BLOS2ノックアウト個体では、マイクロインジェクションを行った当代(GO)個体において、通常は白色の皮膚色が半透明の油染み状態(油皮膚)となる表現型を示す(Daimon T., et al., 2014, Develop. Growth Differ. 56:14-25)。
基本的な操作は、実施例1に準じて行った。
基本操作は実施例1に準じた。低温処理後は、10℃で24時間処理した卵を冷蔵庫から取り出し25℃でしばらく置き、産後25℃での累積時間が4時間となったところでマイクロインジェクションを行った。マイクロインジェクション法及びその後の処理については、比較例に記載の方法に準じた。
結果を表3に示す。
Claims (7)
- チョウ目昆虫の産卵後の卵を少なくとも受精が完了するまで胚発生温度で保温する保温工程、及び
前記保温工程後の卵を-2.5~15℃で処理する低温処理工程
を含む長期核酸受容能卵の製造方法。 - 前記胚発生温度が18~32℃である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記保温工程における保温時間が1時間~4時間である、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記低温処理工程における処理時間が3時間~4日間である、請求項1~3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記チョウ目昆虫がカイコである、請求項1~4のいずれか一項に記載の製造方法。
- チョウ目昆虫の産卵後の卵を18~32℃で1時間~4時間保温した後、-2.5~15℃で処理して得られる長期核酸受容能卵。
- 前記-2.5~15℃での処理時間が3時間~4日間である、請求項6に記載の長期核酸受容能卵。
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JP2003088273A (ja) | 2001-09-19 | 2003-03-25 | National Institute Of Agrobiological Sciences | カイコ卵へのポリヌクレオチドの効率的導入方法 |
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