JP7464609B2 - 炭水化物および炭水化物混合組成物パターンの自動化高性能同定のための先進的方法、ならびにそのためのシステム、ならびに新しい蛍光色素に基づく、そのための多波長蛍光検出システムの較正のための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、炭水化物混合組成物パターンを決定または同定するためのキットまたはシステム、ならびに炭水化物混合組成物パターンを決定および/または同定するためのキットまたはシステムにさらに関する。さらに、本発明による方法に使用するための、本明細書で定義される色素を含む炭水化物色素コンジュゲートが提供される。
蛍光色素発光スペクトルは、常にかなり幅広く、重なっている(スキーム1に示される通り)ため、バーチャルフィルターは較正される必要がある。これに関して、CCDアレイでの発光プロファイルの重なりを最小にするのではなく、その最大における発光を収集することは意図されない。しかしながら、中間蛍光色素に関してスキーム1に示される通り、スペクトルの重なりがなおある程度起こり、ある特定のクロストークが常に存在する。
随意の精製(タンパク質、過剰の電解質、過剰の色素、標識試薬などを除去するため)後、標識試料は、それぞれクロマトグラフィー用カラム、動電キャピラリーに注入され、分離が実施される(図1を参照されたい)。それらの異なる特性(疎水性、質量/電荷、形状など)に起因して、異なる炭水化物は、それぞれそれらの特徴的な保持時間、移動時間に従って検出器に到達する(図2~22を参照されたい)。
今日、グリカンの分析は、例えば、2-ABまたは2-AAでそれらを標識した後、蛍光検出器を備える市販の(U)HPLCシステムで実施される(スキーム3を参照されたい)が、標識グリカンの「現実の」高スループット分析は、市販の多重CGEシステムでのみ実施できる。これらのxCGE-LIF機器は、荷電分析物(例えば、APTS標識グリカン)の分離のための多重キャピラリーゲル電気泳動ユニット、レーザーおよび蛍光検出器を含有する。
しかしながら、グリカンプロファイルの評価に関する主な欠点は、好適な色素の利用可能性が制限されることである。つまり、これまで、公知の色素のいずれも、特に炭水化物とのコンジュゲートとして、優れたスペクトル特性または電気泳動性を有することは提案されておらず、現在の標準はAPTSの使用である。
a)少なくとも1種の炭水化物を含有する試料を得るステップと、
b)前記炭水化物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)第2の蛍光標識で標識された既知組成の標準を用意するステップと、
d)動電/クロマトグラフィー分離技術を蛍光またはレーザー誘起蛍光検出と組み合わせて使用して、前記炭水化物および既知組成の標準の移動/保持時間を決定するステップと、
e)移動/保持時間を、標準の所与の標準移動/保持時間の指標に基づく移動/保持時間の指標にアラインするステップと、
f)炭水化物のこれらの移動/保持時間の指標をデータベースからの標準移動/保持時間の指標と比較するステップと、
g)炭水化物および/または炭水化物混合組成物パターンを同定または決定するステップと
を含み、
標準組成物が、未知の炭水化物および/または炭水化物混合組成物を含有する試料に添加され、第1の蛍光標識および第2の蛍光標識が異なり、第1の蛍光標識または第2の蛍光標識が、以下の一般式AおよびBの化合物:
R1、R2、R3、R4、R5は、互いに独立しており、
H、CH3、C2H5、直鎖状もしくは分枝状C3~C12、好ましくはC3~C6アルキルもしくはペルフルオロアルキル基、リン酸化アルキル基(CH2)mP(O)(OH)2(式中、m=1~12、好ましくはm=2~6であり、直鎖状もしくは分枝状アルキル鎖を有する)、(CH2)nCOOH(式中、n=1~12、好ましくはn=1~5)、または(CH2)nCOOR6(式中、n=1~12、好ましくはn=1~5であり、R6は、アルキル、特に、C1~C6アルキル、CH2CN、ベンジル、フルオレン-9-イル、ポリハロゲノアルキル、ポリハロゲノフェニル、例えば、テトラもしくはペンタフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、2-および4-ニトロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾールもしくは他の潜在的に求核反応性の脱離基であってもよい)、スルホン酸アルキル((CH2)nSO3H)もしくは硫酸アルキル((CH2)nOSO3H)(式中、n=1~12、好ましくはn=1~5であり、いずれの(CH2)n中のアルキル鎖も直鎖状または分枝状であってもよい);
ヒドロキシアルキル基(CH2)mOHまたはチオアルキル基(CH2)mSH(式中、m=1~12、好ましくはm=2~6であり、直鎖状もしくは分枝状アルキル鎖を有する)、リン酸化ヒドロキシアルキル基(CH2)mOP(O)(OH)2(式中、m=1~12、好ましくはm=2~6であり、直鎖状もしくは分枝状アルキル鎖を有する)を表してもよく;R1またはR2基のうちの一方は、カーボネートまたはカルバメート誘導体(CH2)mOCOOR7またはCOOR7(式中、m=1~12、R7=メチル、エチル、tert-ブチル、ベンジル、フルオレン-9-イル、CH2CN、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリル、フェニル、置換フェニル基、例えば、2-または4-ニトロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、2-ピリジル、4-ピリジル、ピリミド-4-イル);
(CH2)mNRaRb(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有し;Ra、Rbは、互いに独立しており、水素および/またはC1~C4アルキル基を表す)、ヒドロキシアルキル基(CH2)mOH(式中、m=2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)、リン酸化ヒドロキシアルキル基(CH2)mOP(O)(OH)2(m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);
アルキルアジド(CH2)mN3(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;
R1、R2、R3、R4、R5は、末端アルキルオキシアミノ基(CH2)mONH2(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);
(CH2)nCONHR8(式中、n=1~12、好ましくは1~5;R8=H、C1~C6アルキル、(CH2)mN3または(CH2)m-N-マレイミド、(CH2)m-NH-COCH2X(X=BrまたはI)(式中、m=1~12、好ましくは、2~6であり、(CH2)n、(CH2)mおよびR6中に直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)を含有してもよく;
基R1、R2、R3、R4、R5、好ましくは、R1、R2、R3は、アリールヒドラジンAr-NHNH2(Arは、アリールアミノ基およびリンカーを含む式Aの色素残基を示す)を形成する第一級アミノ基;
ヒドロキシル基によって表されてもよく、好ましくはR2またはR3は、アリールヒドロキシルアミンAr-NH2OH(Arは、アリールアミノ基およびリンカーを含む式Aの色素残基を示す)を形成するヒドロキシ基であり、
さらに、残基R1、R2、R3、R4、R5のうちの1つは、CH2-C6H4-NH2、COC6H4-NH2、CONHC6H4-NH2またはCSNHC6H4-NH2(C6H4は、1,2-、1,3-または1,4-フェニレンである)、COC5H3N-NH2またはCH2-C5H3N-NH2(C5H3Nは、ピリジン-2,4-ジイル、ピリジン-2,5-ジイル、ピリジン-2,6-ジイルまたはピリジン-3,5-ジイルである)を表してもよく;
さらに、R2---R3および/または(R4---R5)は、4、5、6もしくは7員環、または第一級アミノ基NH2、第二級アミノ基NHRaを有するもしくは有さない4、5、6もしくは7員環(式中、Ra=この環の炭素原子の1つに結合したC1~C6アルキル、ヒドロキシル基OHまたはリン酸化ヒドロキシル基-OP(O)(OH)2)を形成してもよく;
場合により、R2---R3および/または(R4---R5)は、4、5、6または7員複素環(この複素環にはO、NまたはSなどのさらに1~3個のヘテロ原子が含まれる)を形成してもよく;
さらに、R1は、非置換フェニル基、OH、SH、NH2、NHRa、NRaRb、RaO、RaS(RaおよびRbは、互いに独立しており、直鎖状または分枝状炭素鎖を有するC1~C6アルキル基であってもよい)の組から選択される1つまたはいくつかの電子供与体置換基を有するフェニル基、NO2、CN、COH、COOH、CH=CHCN、CH=C(CN)2、SO2Ra、CORa、COORa、CH=CHCORa、CH=CHCOORa、CONHRa、SO2NRaRb、CONRaRb(式中、RaおよびRbは、互いに独立しており、Hまたは直鎖状もしくは分枝状炭素鎖を有するC1~C6アルキル基であってもよい)の組から選択される1つまたはいくつかの電子受容体を有するフェニル基を表してもよく;
またはR1は、複素芳香族基を表してもよく;
式Aの化合物は、塩、溶媒和物および水和物として存在し得、塩、溶媒和物および水和物として、好ましくは、Na+、Li+、K+を含むアルカリ金属カチオンおよび有機アンモニウムとの塩として使用されてもよく;
ただし、上記式Aのすべての化合物において、塩基性条件下、すなわち7<pH<14で、少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3、4、5または6つの負荷電基が存在し、これらの負荷電基は、以下:SH、COOH、スルホン酸残基SO3H、第一リン酸基OP(O)(OH)2、第二リン酸基OP(O)(OH)Ra(Ra=C1~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキル)、第一ホスホン酸基P(O)(OH)2、第二ホスホン酸基P(O)(OH)Ra(Ra=C~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキル)から選択されるイオン性基の少なくとも部分的に脱プロトン化された残基を表す];
R1および/またはR2は、互いに独立しており、
H、CH3、C2H5、直鎖状もしくは分枝状C3~C12アルキルもしくはペルフルオロアルキル基、または置換C2~C612アルキル基;特に、(CH2)nCOOR3(式中、n=1~12、好ましくは1~5であり、R3は、H、アルキル、特にC1~C6、CH2CN、ベンジル、2-および4-ニトロフェニル、フルオレン-9-イル、ポリハロゲノアルキル、ポリハロゲノフェニル、例えば、テトラ-またはペンタフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリルまたは他の潜在的に求核反応性の脱離基であってもよく、(CH2)n中のアルキル鎖は直鎖状または分枝状であってもよい)を表してもよく;
R1---R2は、さらなる第一級アミノ基NH2、第二級アミノ基NHRaを有する4、5、6または7員非芳香族炭素環(式中、Ra=この環の炭素原子の1つに結合したC1~C6アルキル、またはヒドロキシル基OH)を形成してもよく;場合により、R1---R2は、4、5、6または7員非芳香族複素環(この複素環にはO、NまたはSなどのさらなるヘテロ原子が含まれる)を形成してもよく;
ヒドロキシアルキル基(CH2)mOH(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);R1またはR2基のうちの一方は、カーボネートまたはカルバメート誘導体(CH2)mOCOOR4またはCOOR4(式中、m=1~12、R4=メチル、エチル、2-クロロエチル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリル、フェニル基または置換フェニル基、例えば、2-および4-ニトロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロ-フェニル、2-ピリジルまたは4-ピリジル);
(CH2)mNRaRb(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有し;Ra、Rbは、互いに独立しており、Hまたは置換されていてもよいC1~C4アルキル基であってもよい)であってもよく、特にR1またはR2基のうちの一方は、アルキルアジド基(CH2)mN3(式中、m=2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;R1またはR2基のうちの一方は、(CH2)nSO2NR5NH2(式中、n=1~12であり、置換基R5は、H、アルキル、ヒドロキシアルキルまたはペルフルオロアルキル基C1~C12によって表されてもよい)であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、アリールヒドラジンAr-NR6NH2(式中、Arは式Bの全ピレン残基であり、R6=Hまたはアルキルである)を形成する第一級アミノ基であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、アリールヒドロキシルアミンAr-NR7OH(式中、Arは式Bの全ピレン残基であり、R7=Hまたはアルキルである)を形成するヒドロキシ基であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、末端アルキルオキシアミノ基(CH2)nONH2(式中、n=1~12であり、これは、すべての可能な組合せで1つまたは複数のアルキルアミノ(CH2)mNHまたはアルキルアミド(CH2)mCONH基を介して結合されていてもよく、m=0~12である)を含有してもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、CO(CH2)nCOOR8(式中、n=1~5であり
、直鎖状または分枝状アルキル鎖(CH2)nを有し、R8は、H、直鎖状または分枝状C1~C6アルキル、CH2CN、2-および4-ニトロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、N-スクシンイミジルから選択される)であってもよく;
さらに、R1またはR2のうちの一方は、(CH2)nCONHR9(式中、n=1~5、R9=H、C1~C6アルキル)、(CH2)mN3、(CH2)m-N-マレイミド、(CH2)m-NHCOCH2X(X=BrまたはI)(式中、m=2~6であり、(CH2)nおよびR9中に直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;
または、R1もしくはR2のうちの一方は、CH2-C6H4-NH2、COC6H4-NH2、CONHC6H4-NH2もしくはCSNHC6H4-NH2(C6H4は、1,2-、1,3-もしくは1,4-フェニレンである)、COC5H3N-NH2もしくはCH2-C5H3N-NH2(C5H3Nは、ピリジン-2,4-ジイル、ピリジン-2,5-ジイル、ピリジン-2,6-ジイルもしくはピリジン-3,5-ジイルである)を表してもよく;またはR1もしくはR2のうちの一方は、アルキルアジド(CH)N3もしくはアルキン、特にプロパルギルであってもよく;
リンカーLは、少なくとも1個の炭素原子を含み、任意の出現において、C1~C12の範囲の長さの直鎖状または分枝状の、アルキル、ヘテロアルキル、特にアルキルオキシ、例えば、CH2OCH2、CH2CH2O CH2CH2OCH2、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ、特にジエタノールアミンまたはN-メチル(アルキル)モノエタノールアミン部分、例えば、N(CH3)CH2CH2O-およびN(CH2CH2O-)2、単一または複数のジフルオロメチル(CF2)などのペルフルオロアルキル、アルケンまたはアルキン部分を、任意の組合せで含んでもよく;
リンカーLはまた、カルボニル(CH2CO、CF2CO)部分も含んでもよく;
Xは、特に、ヒドロキシアルキル(CH2)nOH、チオアルキル((CH2)nSH)、カルボキシアルキル((CH2)nCO2H)、スルホン酸アルキル((CH2)nSO3H)、硫酸アルキル((CH2)nOSO3H)、リン酸アルキル((CH2)nOP(O)(OH)2)もしくはホスホン酸アルキル((CH2)nP(O)(OH)2)(式中、nは、0~12の範囲の整数である)、またはその類似体を含む群から選択される部分からなるまたはそれらを含む可溶化および/またはイオン性アニオン提供部分を示し、CH2基の1つまたは複数がCF2によって交換されており、
さらに、アニオン提供部分は、非芳香族O、NおよびS含有複素環、例えば、ピペラジン、ピペコリンによって結合されていてもよく、または代替的に基Xのうちの1つは、基R1およびR2について上で列挙した部分のうちの任意のものを、また基Lについて列挙した任意の種類の結合と共に、他の置換基とは独立して有していてもよく;
式Bの化合物は、塩、溶媒和物および水和物として存在し得、塩、溶媒和物および水和物として、好ましくは、Na+、Li+、K+、NH4 +を含むアルカリ金属カチオンおよび有機アンモニウムまたは有機ホスホニウムカチオンとの塩として使用されてもよい]
からなる群から選択される複数のイオン性およびまたは負荷電基を有する蛍光色素である、方法。
a)第1の未知の炭水化物混合組成物を含有する第1の試料を用意するステップと、
b)前記炭水化物混合組成物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)第2の蛍光標識で標識された第2の炭水化物混合組成物を含有する第2の試料を用意するステップであり第2の試料を場合により前記第1の試料に添加してもよいステップと、
d)動電/クロマトグラフィー分離技術を蛍光またはレーザー誘起蛍光検出と組み合わせて使用して、前記試料組成物の炭水化物混合組成物の電気泳動図/クロマトグラムを生成するステップと、
e)第1および第2の試料の炭水化物混合組成物パターンプロファイルの同一性および/またはそれらの間の差を分析するステップと
を含み、
第1の試料の第1の蛍光標識が、第2の試料の第2の蛍光標識とは異なり、第1の蛍光標識および第2の蛍光標識のうちの少なくとも1種が、以下に定義される一般式CまたはDなどの、一般式AまたはBの上で定義される蛍光色素である、方法。
a)第1の炭水化物混合組成物を含有する試料を用意するステップと、
b)前記炭水化物混合組成物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)比較しようとする、第2の炭水化物混合組成物を含有する第2の蛍光で標識された第2の試料を用意するステップと、
d)動電/クロマトグラフィー分離技術を蛍光またはレーザー誘起蛍光検出と組み合わせて使用して、第1および第2の試料組成物の炭水化物混合組成物の電気泳動図/クロマトグラムを生成するステップと、
e)第1の試料および第2の試料の得られた電気泳動図/クロマトグラムから計算した標準移動/保持時間の指標を比較するステップと、
f)第1および第2の試料の炭水化物混合組成物パターンプロファイルの同一性および/またはそれらの間の差を分析するステップと
を含み、試料中に存在する炭水化物の標準移動/保持時間の指標が、第3の蛍光標識で標識された既知組成の内部標準に基づいて計算され、
第1および第2の蛍光標識のうちの1種が、以下で定義される式CまたはDなどの、一般式AまたはBの構造を有する上で定義される蛍光色素である、方法。
試料中の分析されるプローブ中に存在する炭水化物を標識するための、本明細書に記載の色素の使用は、感度の増加を可能にする。本明細書に記載の色素は、機器のスペクトル較正および1つの試料中に存在する分析される化合物またはプローブの増加に関して有利である。前記試料は1つのキャピラリーで分析できる。したがって、キャピラリーの数を低減すること、ならびに感度およびアラインメント特性を増加させることが可能である。
a. n=1~40(またはそれよりも大きい)の長さで、α1-2(マンノースオリゴ糖)、α1-4(例えば、マルトース、デンプン)、α1-5(アラビノ-オリゴ糖)、α1-6(例えば、デキストラン、プルラン、デンプン)、α1-3(例えば、デキストラン、プルラン)、β1-3(例えば、セロビオシル-グルコース)、β1-4(例えば、セルロース、マンナン、キシロ-オリゴ糖、キトサン)およびβ1-6にグリコシド結合を有する、ペントース(キシロースまたはアラビノースなど)、ヘキソース(グルコース、ガラクトースまたはマンノースなど)およびヘキソサミン(グルコサミン、ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミンまたはN-アセチル-ガラクトサミンなど)を含む炭水化物系ホモポリマー
b. ヘミセルロース、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、フルクタンなどのヘテロオリゴ-ポリマー
c. N-グリカン
d. O-グリカン
e. 糖脂質
f. ミルクオリゴ糖(MOS)
である。
より具体的には、IUPAC規則に従うと、以下のスキームの基本構造式AおよびBに示される通り、式Aの化合物は、7-アミノアクリドン-2-スルホンアミドであり、一方、式Bの化合物は、3、6、8位に官能基置換されたスルホニル基を有する1-アミノピレン色素、すなわち、(官能基置換された)1,6,8-トリスルホニル-3-アミノピレンである。
・ 例えばpH約2~5における効率的かつ清潔な還元的アミノ化または炭水化物との直接縮合のための芳香族アミノ(NH2)、ヒドラジン(NRNH2)、ヒドラジド(CONRNH2)、ヒドロキシルアミン(NROH)、反応性カルバメート(NHCOOR)またはアルコキシアミノ基(RONH2);好ましくは、芳香族アミノ基は、第一級アミノ基であるが、第二級アミノ基であってもよい;構造については上記のスキームを参照
・ コンジュゲート中の大きな正味電荷 -- pH少なくとも7~14において-3~-12の範囲
・ 広範囲のpHにおける水性媒体への非常に良好な溶解性;
・ 高輝度(これは、蛍光量子収率および消光の全体的な結果である)
・ 例えばボラン系試薬による還元に対する色素コアの例外的な安定性
・ スペクトルの完全一致および高い蛍光量子収率でアルゴンイオンレーザー(488および514nmで発光)により励起され得ること
・ およそ520nmにおける最小発光
・ 色素は、99%までの精製が可能である。
上記式Aにおいて、NR1および/またはN(R2)R3は、好ましくは、カルボニルまたは求核反応性基を含む。R1、R2およびR3は、H、直鎖状または分枝状アルキル、ヒドロキシアルキルまたはペルフルオロアルキル基によって表されてもよい。置換基R3、R4およびR5は、好ましくは、可溶化および/またはアニオン提供基、特に、ヒドロキシアルキル((CH2)nOH)、チオアルキル((CH2)nSH)、カルボキシアルキル((CH2)nCO2H)、スルホン酸アルキル((CH2)nSO3H)、硫酸アルキル((CH2)nOSO3H)、リン酸アルキル((CH2)nOP(O)(OH)2)またはホスホン酸アルキル((CH2)nP(O)(OH)2)(nは、1~12の範囲の整数である)を含む。
式AのR1は、水素、低級アルキル基(C1~C4)、非置換フェニル基、OH、SH、NH2、NHRa、NRaRb、RaO、RaS、OP(O)(ORa)(ORb)(式中、RaおよびRbは、互いに独立しており、直鎖状または分枝状鎖を有するC1~C12、好ましくはC1~C6アルキル基であってもよい)の組から選択される1つまたはいくつかの電子供与置換基を有するフェニル基、NO2、CN、COH、COOH、CH=CHCN、CH=C(CN)2、SO2Ra、SO3Ra、CORa、COORa、CH=CHCORa、CH=CHCOORa、CONHRa、SO2NRaRb、CONRaRb、P(O)(ORa)(ORb)(式中、RaおよびRbは、互いに独立しており、Hまたは直鎖状もしくは分枝状炭素鎖を有するC1~C6アルキル基であってもよい)の組から選択される1つまたはいくつかの電子受容体を有するフェニル基を表し;
あるいは、R1は、芳香族複素環式基、特に、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-チエニル、3-チエニル、ピリミジン-4-イル、ピリミジン-2-イル、ピリミジン-5-イルまたは芳香族複素環から誘導される他の電子受容体基、例えば、4-ピリジル-N-オキシド、N-アルキルピリジニウム塩またはベタイン、特に、N-(ω-スルホアルキル)-4-ピリジニウム、N-(ω-スルホアルキル)-2-ピリジニウム、N-(1-ヒドロキシ-4,4,5,5-テトラフルオロ-シクロペンタ-1-エン-3-オン-2-イル)-4-ピリジニウム、N-(1-ヒドロキシ-4,4,5,5-テトラフルオロシクロペンタ-1-エン-3-オン-2-イル)-2-ピリジニウムを表してもよい。
典型的には、その存在の結果、APTS色素タグ(断片Lは存在せず、基XはOHである)と比較して、488nm市販レーザーとのより良好な一致を伴い、大きく深蛍光シフトおよび深色シフトする。
R1および/またはR2は、互いに独立しており、
H、CH3、C2H5、直鎖状もしくは分枝状C3~C12アルキル基、好ましくはC3~C6アルキル基、または置換C2~C12アルキル基、好ましくはC2~C6アルキル基;特に、(CH2)nCOOR3(式中、n=1~12、好ましくは1~5であり、R3は、H、CH2CN、2-および4-ニトロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリルであってもよく、(CH2)n中のアルキル鎖は、直鎖状または分枝状であってもよい)を表してもよく;
R1---R2は、さらなる第一級アミノ基NH2、第二級アミノ基NHRaを有する4、5、6または7員非芳香族炭素環(式中、Ra=この環の炭素原子の1つに結合したC1~C6アルキル、またはヒドロキシル基OH)を形成してもよく;場合により、R1---R2は、4、5、6または7員非芳香族複素環(この複素環にはO、NまたはSなどのさらなるヘテロ原子が含まれる)を形成してもよく;
ヒドロキシアルキル基(CH2)mOH(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);R1またはR2基のうちの一方は、カーボネートまたはカルバメート誘導体(R1またはR2基のうちの一方は、(CH2)mOCOOR4またはCOOR4(式中、m=1~12、R4=メチル、エチル、2-クロロエチル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリル フェニル基または置換フェニル基、例えば、2-および4-ニトロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロ-フェニル、2-ピリジルまたは4-ピリジル);
(CH2)mNRaRb(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有し;Ra、Rbは、互いに独立しており、Hまたは置換されていてもよいC1~C4アルキル基であってもよい)であってもよく、特にR1またはR2基のうちの一方は、アルキルアジド基(CH2)mN3(式中、m=2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、(CH2)nCOOR5(式中、n=1~5であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖(CH2)nを有し、R5は、H、直鎖状または分枝状C1~C6アルキル、CH2CN、2-および4-ニトロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、スルホ-N-スクシンイミジル、N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリルから選択される)であってもよく;
さらに、R1もしくはR2のうちの一方は、(CH2)nCONHR6(式中、n=1~12、好ましくは1~5、R6=H、C1~C6アルキル、(CH2)mN3、(CH2)m-N-マレイミド、(CH2)m-NHCOCH2X(X=BrまたはI)(式中、m=2~6であり、(CH2)nおよびR6中に直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;またはR1もしくはR2のうちの一方は、CH2-C6H4-NH2、COC6H4-NH2、CONHC6H4-NH2もしくはCSNHC6H4-NH2(C6H4は、1,2-、1,3-もしくは1,4-フェニレンである)、COC5H3N-NH2もしくはCH2-C5H3N-NH2(C5H3Nは、ピリジン-2,4-ジイル、ピリジン-2,5-ジイル、ピリジン-2,6-ジイルもしくはピリジン-3,5-ジイルである)を表してもよく;
式BのSO2断片と残基X間の(CH2)n-CH2リンカー(式中、n=1~5)は、2~6個の炭素原子を有する直鎖、分枝状または環式基を表してもよく;
X=SH、COOH、SO3H、OP(O)(OH)2、OP(O)(OH)Ra(式中、Ra=置換されていてもよいC1~C4アルキル)、P(O)(OH)2、P(O)(OH)Ra(式中、Ra=置換されていてもよいC1~C4アルキル)であり;
ただし、式Cによって表されるすべての化合物において、塩基性条件下、すなわち7<pH<14で、式Bの残基Xに3または6つの負荷電基が存在し、これらの負荷電基は、以下:SH、COOH、SO3H、OP(O)(OH)2、OP(O)(OH)Ra(式中、Ra=C1~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキル)、P(O)(OH)2、P(O)(OH)Ra(式中、Ra=C1~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキル)から選択されるイオン性基の少なくとも部分的に脱プロトン化された残基を表す)
のアルキルスルホニル誘導体である。
R1および/またはR2は、互いに独立しており、H、CH3、C2H5または直鎖状もしくは分枝状の置換されていてもよいC3~C12アルキル基、好ましくはC3~C6アルキル基;特に、(CH2)nCOOR4(式中、n=1~12、好ましくは1~5であり、R4は、H、CH2CN、2-および4-ニトロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリルであってもよく、(CH2)n中のアルキル鎖は、直鎖状または分枝状であってもよい)を表してもよく;
R1---R2は、さらなる第一級アミノ基NH2、第二級アミノ基NHRaを有する4、5、6または7員非芳香族炭素環(式中、Ra=この環の炭素原子の1つに結合した、置換されていてもよいC1~C6アルキル、またはヒドロキシル基OHである);または場合により、R1---R2は、4、5、6または7員非芳香族複素環(この複素環にはO、NまたはSなどのヘテロ原子が含まれる)を形成してもよく;
R1および/またはR2は、
ヒドロキシアルキル基(CH2)mOH(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状の置換されていてもよいアルキル鎖を有する)をさらに表してもよく;R1またはR2基の一方は、カーボネートまたはカルバメート誘導体(CH2)mOCOOR5またはCOOR5(式中、m=1~12、R5=メチル、エチル、2-クロロエチル、CH2CN、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリル、フェニル基または置換フェニル基、例えば、2-および4-ニトロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロ-フェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、2-ピリジル、4-ピリジル);
(CH2)mNRaRb(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有し;Ra、Rbは、互いに独立しており、水素および/または置換されていてもよいC1~C4アルキル基を表す);
(CH2)mN3(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);
(CH2)nCONHR6(式中、n=1~12、好ましくは1~5、R6=H、置換または非置換C1~C6アルキル、(CH2)mN3、(CH2)m-N-マレイミド、(CH2)m-NHCOCH2Y(Y=Br、I)(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、(CH2)nおよびR6中に直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)をさらに表してもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、アリールヒドラジンAr-NR7NH2(式中、Arは式Dの全ピレン残基であり、R7=Hまたはアルキル)を形成する第一級アミノ基であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、アリールヒドロキシルアミンAr-NR8OH(式中、Arは式Dの全ピレン残基であり、R8=Hまたはアルキル)を形成するヒドロキシ基であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、末端アルキルオキシアミノ基(CH2)nONH2(式中、n=1~12であり、これは、すべての可能な組合せで1つまたは複数のアルキルアミノ(CH2)mNH、アルキルアミド(CH2)mCONH、アルキルエーテルまたはアルキルエステル基を介して結合されていてもよく、m=0~12である)を含有してもよく;
さらに、R1またはR2は、CH2-C6H4-NH2、COC6H4-NH2、CONHC6H4-NH2またはCSNHC6H4-NH2(C6H4は、1,2-、1,3-または1,4-フェニレンである)、COC5H3N-NH2またはCH2-C5H3N-NH2(C5H3Nは、ピリジン-2,4-ジイル、ピリジン-2,5-ジイル、ピリジン-2,6-ジイルまたはピリジン-3,5-ジイルである)を表してもよく;
R3=H、(CH2)qCH2X、C2H5、直鎖状または分枝状C3~C6アルキル基、CmH2mOR(式中、m=2~6であり、直鎖状または分枝状アルカン-ジイル鎖CmH2mを有し、R=H、CH3、C2H5、C3H7、CH3(CH2CH2O)kCH2CH2(k=1~12)であり;一方、(CH2)qCH2リンカーは、2~6個の炭素原子を有する直鎖、分枝状または環式基を表してもよい)であり;
式Dにおいて、スルホンアミド断片SO2Nと残基X間の(CH2)n-CH2リンカー(式中、n=1~12、好ましくは1~5)は、2~6個の炭素原子を有する直鎖、分枝状または環式基を表してもよく;
X=SH、COOH、SO3H、OP(O)(OH)2、OP(O)(OH)Ra(式中、Ra=置換または非置換C1~C4アルキル)、P(O)(OH)2、P(O)(OH)Ra(式中、Ra=置換または非置換C1~C4アルキルである)であり;
ただし、式Dによって表されるすべての化合物において、塩基性条件、すなわち7<pH<14で、式Cの残基Xに3、6、9または12個の負荷電基が存在し、これらの負荷電基は、少なくとも部分的に、以下:SH、COOH、SO3H、OP(O)(OH)2、OP(O)(OH)Ra(式中、Ra=C1~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキル)、P(O)(OH)2、P(O)(OH)Ra(式中、Ra=C1~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキル)から選択されるイオン性基の脱プロトン残基を表す)
のスルファミド誘導体である。
式BのR1および/またはR2は、H、CH3、(CH2)nCOOR3(式中、n=1~4であり、R3は、H、CH2CN、2-または4-ニトロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリルであってもよく、(CH2)n(n=1~12)中のアルキル鎖は直鎖状である)を表す。
その結果、本発明の密接に関連する態様は、広範囲の分析物へのコンジュゲーションのための蛍光試薬としての構造式A~Dの化合物の使用であって、コンジュゲーションが、任意の化学実体、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、毒素および脂質とカップリングした化学実体または物質、例えば、アミン、カルボン酸、アルデヒド、アルコール、芳香族化合物、複素環、色素、アミノ酸、アミノ酸残基との少なくとも1つの共有化学結合または少なくとも1つの分子錯体の形成を含む、使用に関する。
とりわけ、本発明に包含される上述の機器の、最大96の並行キャピラリーおよびソフトウェア/データベースツールとの組合せは、自動化された現実の高スループット分析を可能にする。
a)0.5~4M水性有機酸中の色素、特に、請求項5に示される式6-H、6-Me、8-H、15、23または23bの色素の1~400mM溶液を調製するステップと、
b)DMSO、水、メタノール、エタノール、ジグリム、テトラヒドロフランまたはこれらの溶媒の混合物中の0.05~3Mボラン溶液を調製するステップと、
c)上記ステップa)およびb)で調製した溶液ならびに炭水化物含有分析物溶液を、反応容器中で混合するステップと、
d)反応混合物を、10~90℃で0.1~48時間インキュベートするステップと、
e)水および水混和性の有機溶媒の混合物を、1:10~10:1の範囲の有機溶媒:水の比で、反応混合物に添加し、反応容器中の内容物をかき混ぜて、ステップd)の反応を停止させ、反応生成物を溶解させるステップと、
f)場合により、ステップe)から得られた混合物をボルテックスにかけるステップと、
g)場合により、ステップf)から得られた混合物を電気泳動にかけるステップと
を含む、方法に関する。
より具体的には、前記コンジュゲート、特に炭水化物コンジュゲート中の色素は、以下のスキーム8に示される式6-H、6-Me、8-H、15、23、23bの化合物から選択される。
色素のスペクトル特性は、以下の表1に示される。
炭水化物を標識するために使用される蛍光標識のうちの1種は、例えば、蛍光標識である、9-アミノピレン-1,4,6-トリスルホン酸(APTS)とも呼ばれる8-アミノ-1,3,6-ピレントリスルホン酸または他の好ましくは多重荷電蛍光色素であり、他の蛍光標識は、一般式AまたはBの色素のうちの1種である。
別の実施形態では、蛍光色素は、式Dの式
好ましい実施形態では、式A~Dの化合物は、
別の態様では、本発明は、アクリドンおよび/またはピレン系蛍光色素を用いた多波長蛍光検出システム、特にキャピラリーゲル電気泳動システムの較正のための方法であって、アクリドンおよび/またはピレン系蛍光色素が、場合により炭水化物を含む基質部分とのコンジュゲートとして存在してもよく、方法が、好ましくは以下に示される化合物APTS、化合物19または化合物20
本発明による較正のための方法の一実施形態では、スペクトル較正に利用されるアクリドンおよび/またはピレン系色素ならびにそれらの組合せが、それぞれ実施例2、実施例3中の表2および表3に示される。
さらなる態様では、較正標準が提供される。つまり、例えば、本明細書に記載の較正のための方法に有用な較正標準は、炭水化物とコンジュゲートしていてもよい式A、B、CまたはDによる蛍光色素のうちの少なくとも1種を含む蛍光色素を含み、場合により化合物19または20のうちの少なくとも1種さらに含む炭水化物標準である。
別の態様では、本発明は、式AまたはBによる蛍光色素、特に式CもしくはDの蛍光色素または式A~Dの異なる色素で標識された化合物で構成される標準組成物に関する。一実施形態では、標準組成物は、前記色素で標識された炭水化物で構成され、あるいは、化合物は、DNA塩基対ラダーまたは類似の核酸塩基標準である。さらに、色素は、好ましくは、6-H、6-Me、8-R、15、13a、13b、16、18、23および23bのうちの少なくとも1種である。前記標準組成物は、本発明による方法、特に、決定される炭水化物の移動/保持時間のアラインメントに有用である。
さらなる態様では、本発明は、炭水化物混合組成物パターンを決定および/または同定するためのキットまたはシステムであって、不揮発性メモリ(non-transient memory)を有するデータ処理ユニットを含み、前記メモリがデータベースを含有し、前記データベースが、炭水化物のアラインされた移動/保持時間および/またはアラインされた移動/保持時間の指標を含有し、前記移動/保持時間および/または移動/保持時間の指標が、炭水化物の自動化された決定および/もしくは同定ならびに/または炭水化物の同定ならびに/または炭水化物混合組成物パターンプロファイリングによって得られ、炭水化物の自動化された決定および/もしくは同定ならびに/または炭水化物の同定ならびに/または炭水化物混合組成物プロファイリングが、以下のステップ:
a)少なくとも1種の炭水化物を含有する試料を得るステップと、
b)前記炭水化物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)第2の蛍光標識で標識された既知組成の標準を用意するステップと、
d)例えば、キャピラリーゲル電気泳動-レーザー誘起蛍光を使用して、前記炭水化物および本明細書に記載の既知組成の標準の移動/保持時間を決定するステップと、
e)移動/保持時間を、標準の所与の標準移動/保持時間の指標に基づく移動/保持時間の指標にアラインするステップと、
f)炭水化物のこれらの移動/保持時間の指標をデータベースからの標準移動/保持時間の指標と比較するステップと、
g)炭水化物および/または炭水化物混合組成物パターンを同定または決定するステップと
を含み、
標準組成物が、未知の炭水化物混合組成物を含有する試料に添加され、第1の蛍光標識および第2の蛍光標識が異なり、第1の蛍光標識または第2の蛍光標識が、一般式A~Dの化合物からなる群から選択される複数のイオン性およびまたは負荷電基を有する蛍光色素である、キットまたはシステムに関する。
a)炭水化物混合組成物を含有する試料を用意するステップと、
b)前記炭水化物混合組成物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)比較しようとする、既知の炭水化物混合組成物パターンを有する蛍光標識で標識された第2の試料を用意するステップと、
d)本明細書に開示の方法に記載される第1および第2の試料の炭水化物混合組成物の電気泳動図/クロマトグラムを、例えば、キャピラリー(ゲル)電気泳動-レーザー誘起蛍光またはクロマトグラフィーを使用して、生成するステップと、
e)第1の試料および第2の試料の得られた電気泳動図/クロマトグラムから計算した標準移動/保持時間の指標を比較するステップと、
f)第1および第2の試料の炭水化物混合組成物パターンプロファイルの同一性および/またはそれらの間の差を分析するステップと
を含み、試料中に存在する炭水化物の標準移動/保持時間の指標が、第2の蛍光標識で標識された既知組成の内部標準に基づいて計算され、第1または第2の蛍光標識のうちの1種が、一般式AまたはBの本発明による蛍光色素である、キットまたはシステムに関する。
a)未知の炭水化物混合組成物を含有する第1の試料を用意するステップと、
b)前記炭水化物混合組成物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)第2の蛍光標識で標識された既知の炭水化物混合組成物パターンを有する第2の試料を前記第1の試料に添加するステップと、
d)前記試料の炭水化物混合組成物の電気泳動図/クロマトグラムを、キャピラリー(ゲル)電気泳動-レーザー誘起蛍光またはクロマトグラフィーを使用して、生成するステップと、
e)第1および第2の試料の炭水化物混合組成物パターンプロファイルの同一性および/またはそれらの間の差を分析するステップと
を含み、
第1の試料の第1の蛍光標識が、第2の試料の第2の蛍光標識とは異なり、第1の蛍光標識および第2の蛍光標識のうちの少なくとも1種が、本発明による一般式AまたはBによる蛍光色素である、キットまたはシステムに関する。
上述の特定の化合物の一部の実施形態では、色素は、炭水化物色素コンジュゲートとして存在し、それにより色素に結合した炭水化物を同定する。
炭水化物の還元的アミノ化
本発明の化合物を使用する炭水化物の還元的アミノ化のために、2015年にMethods Molecular BiologyにおいてHennig R、Rapp Eらによって公開された、例えば、8-アミノピレン-1,3,6-トリスルホン酸三ナトリウム塩(APTS)および還元剤によるN-グリカンの蛍光標識のための従来技術のプロトコルを、わずかな修正を加えて使用した。
本発明の化合物を使用したヒドラジド標識は、pH6~8、60℃~80℃で1時間~6時間実施した。10~80mM色素溶液を、等体積(1~4μL)で試料と混合した。反応の完了後、50μLのACN-水混合物(80:20、v/v)を添加した。標識混合物の希釈物を、動電および/またはクロマトグラフィー分離に基づく糖分析にかけた。
本発明の化合物によるグリコシルアミンのジスクシンイミジルカーボネートまたはNHSエステル補助標識を、わずかに塩基性のpHにおいて、室温で10~60分間実施した。試料を、Hennig R、Rapp Eら、2015によって公開された通り、HILIC-SPEによって精製した。精製試料を、動電および/またはクロマトグラフィー分離に基づく糖分析にかけた。
大きな正味負電荷および必要なスペクトル特性を有する選択された蛍光色素(スキーム13および表1も参照されたい)
本明細書に記載の4種のアクリドンおよびピレン系蛍光色素の組への多波長蛍光検出システムのスペクトル較正。
本明細書に記載の5種のアクリドンおよびピレン系蛍光色素の組への多波長蛍光検出システムのスペクトル較正。
内部移動時間アラインメントのための本発明によるアクリドン蛍光色素誘導体の利用。
本実施例は、修正した市販のDNA遺伝子分析器310、3100、3130(xl)、3730(xl)および3500(すべてApplied Biosystems、現Thermo Scientificによって製造)の使用を含む。それにもかかわらず、ここで提示される炭水化物に基づくアラインメント標準はまた、他の製造業者の(単一または複数のキャピラリーの)CE/CGE機器または(U)HPLC機器と組み合わせて使用できる。
内部移動時間アラインメントのための本発明によるピレン蛍光色素誘導体の利用。
DNA断片サイズならびにCE/CGEおよびxCGEにおける炭水化物の移動時間アラインメントは、図13Aに例示的に示される通り、塩基対サイズ標準の使用によって現在実現されている(EP2112506A1)。この目的のために、未知の試料の移動時間は、同時注入された塩基対サイズ標準にアラインされる。オリゴヌクレオチド(DNA/RNA)について、同時注入された塩基対標準へのこの移動時間アラインメントは、試料および標準の移動時間が、同じ試料バックグラウンドによって同じように影響を受けるため、高い再現性を特徴とする。試料および標準は、異なる蛍光色素で印を付けられ、両方の波長分解同時検出が可能になる。
この改善されたアラインメント手順はまた、キチン、セルロース、マルトース、プルラン、グリコサミノグリカンなどの他のオリゴ糖ラダーの使用によって、ならびに糖脂質の糖部分、O-グリカン、N-グリカンおよびミルクオリゴ糖(例えば、ラクトース、ラクト-N-テトラオース、ラクト-N-ヘキサオースならびにそれらのフコースおよび/またはラクトース伸長)などの複合炭水化物の使用によって、実施できる。
普遍的アラインメント標準としてのピレンおよび/またはアクリドン標識炭水化物。
本実施例は、修正した市販のDNA遺伝子分析器310、3100、3130(xl)、3730(xl)および3500(すべてApplied Biosystems、現Thermo Scientificによって製造)の使用を含む。それにもかかわらず、ここで提示される炭水化物に基づくアラインメント標準はまた、他の製造業者のCE/CGEおよび(U)HPLC機器(単一または複数のキャピラリー)と組み合わせて使用できる。
・機器(図17および表6)
・電場強度(図18)または実行温度(図19)などの実験設定
・キャピラリー長さ(図20)、ポリマーの種類(図21)、ポリマー齢(図22および表6)およびポリマーロット(表6)などの機器パラメーター
を使用した場合により明らかである。この負荷試験の間、これらのパラメーターを変更し、アラインメント手順(塩基対対炭水化物標準)を比較した。すべての実施例について、炭水化物アラインメント手順は、優れた性能を示した。例えば異なるキャピラリー長さについて示される通り、大部分の変動について、安定な移動時間が達成できた。これは、炭水化物アラインメント手順を使用することによって、実験設定、機器パラメーターまたは機器が変更される場合でも、包括的炭水化物データベースが使用できることを意味する。これは、塩基対に基づくアラインメント標準では不可能である。
本発明による蛍光アクリドンおよびピレン色素の新しい組を使用したDNAシーケンサーの再較正
市販のCE-システムは、多波長検出器、およびしたがっていくつかのカラーチャネルを有し得る。
これらの領域は、バーチャルフィルターと呼ばれる。それらの各々は、1種の色素によってのみ発される比較的狭い範囲の可視光に関連する(図23)。DNAシーケンサーからの主データセットは、4つのヌクレオチドに対応する4つのカラートレースを有する(図23)。実際、フィルターは単純にCCDアレイ上のソフトウェア指定部位であるため、任意数のバーチャルフィルターが存在し得る。色素の発光プロファイルは常にかなり広く、その一部はその発光極大を収集することを目的とするもの以外のバーチャルフィルターによって登録される。CCDアレイでの発光プロファイルの重なりを最小にするために、各組の色素は、広く間隔の空いた発光極大を有するように選択される。しかしながら、スペクトルの重なりがなおある程度起こり、ある特定のクロストークが常に存在する。他方、DNA配列の各位置は4つのヌクレオチドのうちの1種のみを有し、配列決定の過程で、それらの各々はそれ「自体」のカラーチャネルで検出される。したがって、DNA配列決定の4つのレーンは類似の強度のピークを含有し、1つのカラートレースのみがある特定の位置に顕著なピークを有するため、クロストークの問題は、DNA配列決定に関しては、グリカン分析の場合よりもはるかに重要性が低い。
Feng HT, et al., Electrophoresis (2017) 38, 1788-1799. doi: 10.1002/elps.201600404. Epub 2017 May 11.
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本発明は、下記の態様も包含する。
態様1
炭水化物および/または炭水化物混合組成物パターンプロファイリングの自動化された決定および/または同定のための方法であって、以下のステップ:
a)少なくとも1種の炭水化物を含有する試料を得るステップと、
b)前記炭水化物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)第2の蛍光標識で標識された既知組成の標準を用意するステップと、
d)動電/クロマトグラフィー分離技術を蛍光またはレーザー誘起蛍光検出と組み合わせて使用して、前記炭水化物および既知組成の標準の移動/保持時間を決定するステップと、
e)移動/保持時間を、標準の所与の標準移動/保持時間の指標に基づく移動/保持時間の指標にアラインするステップと、
f)炭水化物のこれらの移動/保持時間の指標をデータベースからの標準移動/保持時間の指標と比較するステップと、
g)炭水化物および/または炭水化物混合組成物パターンを同定または決定するステップと
を含み、
標準組成物が、未知の炭水化物および/または炭水化物混合組成物を含有する試料に添加され、第1の蛍光標識および第2の蛍光標識が異なり、第1の蛍光標識または第2の蛍光標識が、好ましくは、以下の一般式AおよびBの化合物:
R 1 、R 2 、R 3 、R 4 、R 5 は、互いに独立しており、
H、CH 3 、C 2 H 5 、直鎖状もしくは分枝状C 3 ~C 12 、好ましくはC 3 ~C 6 アルキルもしくはペルフルオロアルキル基、ホスホニル化アルキル基(CH 2 ) m P(O)(OH) 2 (式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状もしくは分枝状アルキル鎖を有する)、(CH 2 ) n COOH(式中、n=1~12、好ましくは1~5)、または(CH 2 ) n COOR 6 (式中、n=1~12、好ましくは1~5であり、R 6 は、アルキル、特に、C 1 ~C 6 、CH 2 CN、ベンジル、フルオレン-9-イル、ポリハロゲノアルキル、ポリハロゲノフェニル、例えば、テトラもしくはペンタフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、2-および4-ニトロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリルもしくは他の潜在的に求核反応性の脱離基であってもよい)、スルホン酸アルキル((CH 2 ) n SO 3 H)もしくは硫酸アルキル((CH 2 ) n OSO 3 H)(式中、n=1~12、好ましくは1~5であり、いずれの(CH 2 ) n 中のアルキル鎖も直鎖状または分枝状であってもよい);
ヒドロキシアルキル基(CH 2 ) m OHまたはチオアルキル基(CH 2 ) m SH(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状もしくは分枝状アルキル鎖を有する)、リン酸化ヒドロキシアルキル基(CH 2 ) m OP(O)(OH) 2 (式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状もしくは分枝状アルキル鎖を有する)を表してもよく;R 1 またはR 2 基のうちの一方は、(CH 2 ) m OCOOR 7 またはCOOR 7 のカーボネートまたはカルバメート誘導体(式中、m=1~12、R 7 =メチル、エチル、tert-ブチル、ベンジル、フルオレン-9-イル、CH 2 CN、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリル、フェニル、置換フェニル基、例えば、2-または4-ニトロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、2-ピリジル、4-ピリジル、ピリミド-4-イル);
(CH 2 ) m NR a R b (式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有し;R a 、R b は、互いに独立しており、水素および/またはC 1 ~C 4 アルキル基を表す)、ヒドロキシアルキル基(CH 2 ) m OH(式中、m=2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)、リン酸化ヒドロキシアルキル基(CH 2 ) m OP(O)(OH) 2 (式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);
アルキルアジド(CH 2 ) m N 3 (式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;
R 1 、R 2 、R 3 、R 4 、R 5 は、末端アルキルオキシアミノ基(CH 2 ) m ONH 2 (式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有し、これは、1つまたは複数のアルキルアミノ(CH 2 ) m NHまたはアルキルアミド(CH 2 ) m CONH基を、すべての可能な組合せで含み得、m=0~12である);
(CH 2 ) n CONHR 8 (式中、n=1~12、好ましくは1~5;R 8 =H、C 1 ~C 6 アルキル、(CH 2 ) m N 3 または(CH 2 ) m -N-マレイミド、(CH 2 ) m -NH-COCH 2 X(式中、X=BrまたはI)(m=1~12、好ましくは、2~6であり、(CH 2 )n、(CH 2 ) m およびR 8 中に直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);
好ましくはR 1 、R 2 またはR 3 として、アリールヒドラジンを形成する第一級アミノ基;
好ましくはR 2 またはR 3 として、アリールヒドロキシルアミンを形成するヒドロキシ基
を含有してもよく;
さらに、残基R 1 、R 2 、R 3 、R 4 、R 5 のうちの1つは、CH 2 -C 6 H 4 -NH 2 、COC 6 H 4 -NH 2 、CONHC 6 H 4 -NH 2 またはCSNHC 6 H 4 -NH 2 (C 6 H 4 は、1,2-、1,3-または1,4-フェニレンである)、COC 5 H 3 N-NH 2 またはCH 2 -C 5 H 3 N-NH 2 (C 5 H 3 Nは、ピリジン-2,4-ジイル、ピリジン-2,5-ジイル、ピリジン-2,6-ジイルまたはピリジン-3,5-ジイルである)を表してもよく;
さらに、R 2 ---R 3 (R 4 ---R 5 )は、4、5、6もしくは7員環、または第一級アミノ基NH 2 、第二級アミノ基NHR a を有するもしくは有さない4、5、6もしくは7員環(式中、R a =この環の炭素原子の1つに結合したC 1 ~C 6 アルキル、ヒドロキシル基OHまたはリン酸化ヒドロキシル基-OP(O)(OH) 2 )を形成してもよく;
場合により、R 2 ---R 3 (R 4 ---R 5 )は、4、5、6または7員複素環(この複素環にはO、NまたはSなどのさらに1~3個のヘテロ原子が含まれる)を形成してもよく;
さらに、R 1 は、非置換フェニル基、OH、SH、NH 2 、NHR a 、NR a R b 、R a O、R a S(式中、R a およびR b は、互いに独立しており、直鎖状または分枝状炭素鎖を有するC 1 ~C 6 アルキル基であってもよい)の組から選択される1つまたはいくつかの電子供与体置換基を有するフェニル基、NO 2 、CN、COH、COOH、CH=CHCN、CH=C(CN) 2 、SO 2 R a 、COR a 、COOR a 、CH=CHCOR a 、CH=CHCOOR a 、CONHR a 、SO 2 NR a R b 、CONR a R b (式中、R a およびR b は、互いに独立しており、Hまたは直鎖状もしくは分枝状炭素鎖を有するC 1 ~C 6 アルキル基であってもよい)の組から選択される1つまたはいくつかの電子受容体を有するフェニル基を表してもよく;
またはR 1 は、複素芳香族基を表してもよく;
ただし、上記式Aのすべての化合物において、塩基性条件、すなわち7<pH<14で、少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3、4、5または6つの負荷電基が存在し、これらの負荷電基は、以下:SH、COOH、スルホン酸残基SO 3 H、第一リン酸基OP(O)(OH) 2 、第二リン酸基OP(O)(OH)R a (式中、R a =C 1 ~C 4 アルキルまたは置換C 1 ~C 4 アルキル)、第一ホスホン酸基P(O)(OH) 2 、第二ホスホン酸基P(O)(OH)R a (式中、R a =C~C 4 アルキルまたは置換C 1 ~C 4 アルキル)から選択されるイオン性基の少なくとも部分的に脱プロトン化された残基を表し;
式Aの化合物は、塩、溶媒和物および水和物として存在し得、塩、溶媒和物および水和物として、好ましくは、Na + 、Li + 、K + を含むアルカリ金属カチオンおよび有機アンモニウムまたは有機ホスホニウムカチオンとの塩として使用されてもよい];
R 1 および/またはR 2 は、互いに独立しており、
H、CH 3 、C 2 H 5 、直鎖状もしくは分枝状C 3 ~C 12 アルキルもしくはペルフルオロアルキル基、または置換C 2 ~C 612 アルキル基;特に、(CH 2 ) n COOR 3 (式中、n=1~12、好ましくは1~5であり、R 3 は、H、アルキル、特にC 1 ~C 6 、CH 2 CN、ベンジル、フルオレン-9-イル、ポリハロゲノアルキル、ポリハロゲノフェニル、例えば、テトラ-またはペンタフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、2-および4-ニトロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリルまたは他の潜在的に求核反応性の脱離基であってもよく、(CH 2 ) n 中のアルキル鎖は直鎖状または分枝状であってもよい)を表してもよく;
R 1 ---R 2 は、さらなる第一級アミノ基NH 2 、第二級アミノ基NHR a を有する4、5、6または7員非芳香族炭素環(式中、R a =この環の炭素原子の1つに結合したC 1 ~C 6 アルキル、またはヒドロキシル基OH)を形成してもよく;場合により、R 1 ---R 2 は、4、5、6または7員非芳香族複素環(この複素環にはO、NまたはSなどのさらなるヘテロ原子が含まれる)を形成してもよく;
ヒドロキシアルキル基(CH 2 ) m OH(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);R 1 またはR 2 基のうちの一方は、カーボネートまたはカルバメート誘導体(CH 2 ) m OCOOR 4 またはCOOR 4 (式中、m=1~12、R 4 =メチル、エチル、2-クロロエチル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリル、フェニル基または置換フェニル基、例えば、2-および4-ニトロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロ-フェニル、2-ピリジルまたは4-ピリジル);
(CH 2 ) m NR a R b (式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有し;R a 、R b は、互いに独立しており、Hまたは置換されていてもよいC 1 ~C 4 アルキル基であってもよい)であってもよく、特にR 1 またはR 2 基のうちの一方は、アルキルアジド基(CH 2 ) m N 3 (式中、m=2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;R 1 またはR 2 基のうちの一方は、(CH 2 ) n SO 2 NR 5 NH 2 (式中、n=1~12であり、置換基R 5 は、H、アルキル、ヒドロキシアルキルまたはペルフルオロアルキル基C 1 ~C 12 によって表されてもよい)であってもよく;
R 1 またはR 2 基のうちの一方は、アリールヒドラジンAr-NR 6 NH 2 (式中、Arは式Bの全ピレン残基であり、R 6 =Hまたはアルキルである)を形成する第一級アミノ基であってもよく;
R 1 またはR 2 基のうちの一方は、アリールヒドロキシルアミンAr-NR 7 OH(式中、Arは式Bの全ピレン残基であり、R 7 =Hまたはアルキルである)を形成するヒドロキシ基であってもよく;
R 1 またはR 2 基のうちの一方は、末端アルキルオキシアミノ基(CH 2 ) n ONH 2 (式中、n=1~12であり、これはすべての可能な組合せでの1つまたは複数のアルキルアミノ(CH 2 ) m NH、アルキルアミド(CH 2 ) m CONH、アルキルエーテルまたはエステル基を介して結合されていてもよく、m=0~12である)を含有してもよく;
R 1 またはR 2 基のうちの一方は、CO(CH 2 ) n COOR 8 (式中、n=1~5であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖(CH 2 ) n を有し、R 8 は、H、直鎖状または分枝状C 1 ~C 6 アルキル、CH 2 CN、2-および4-ニトロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾ-トリアゾリルから選択される)であってもよく;
さらに、R 1 またはR 2 のうちの一方は、(CH 2 ) n CONHR 9 (式中、n=1~5、R 9 =H、C 1 ~C 6 アルキル)、(CH 2 ) m N 3 、(CH 2 ) m -N-マレイミド、(CH 2 ) m -NHCOCH 2 X(式中、X=BrまたはI)(m=2~6であり、(CH 2 )nおよびR 9 中に直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;
または、R 1 もしくはR 2 のうちの一方は、CH 2 -C 6 H 4 -NH 2 、COC 6 H 4 -NH 2 、CONHC 6 H 4 -NH 2 もしくはCSNHC 6 H 4 -NH 2 (C 6 H 4 は、1,2-、1,3-もしくは1,4-フェニレンである)、COC 5 H 3 N-NH 2 もしくはCH 2 -C 5 H 3 N-NH 2 (C 5 H 3 Nは、ピリジン-2,4-ジイル、ピリジン-2,5-ジイル、ピリジン-2,6-ジイルもしくはピリジン-3,5-ジイルである)を表してもよく;またはR 1 もしくはR 2 のうちの一方は、アルキルアジド(CH)N 3 もしくはアルキン、特にプロパルギルであってもよく;
リンカーLは、少なくとも1個の炭素原子を含み、任意の出現において、C 1 ~C 12 の範囲の長さの直鎖状または分枝状の、アルキル、ヘテロアルキル、特にアルキルオキシ、例えば、CH 2 OCH 2 、CH 2 CH 2 O CH 2 CH 2 OCH 2 、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ、特にジエタノールアミンまたはN-メチル(アルキル)モノエタノールアミン部分、例えば、N(CH 3 )CH 2 CH 2 O-およびN(CH 2 CH 2 O-) 2 、単一または複数のジフルオロメチル(CF 2 )などのペルフルオロアルキル、アルケンまたはアルキン部分を、任意の組合せで含んでもよく;
リンカーLはまた、アミド基の一部としても、カルボニル(CH 2 CO、CF 2 CO)部分を含んでもよく;
リンカーLはまた、1,3,5-トリアジンの残基を含むまたは含有して、したがって、基Xへの2つの結合点を提供してもよく;
Xは、特に、ヒドロキシアルキル(CH 2 ) n OH、チオアルキル((CH 2 ) n SH)、カルボキシアルキル((CH 2 ) n CO 2 H)、スルホン酸アルキル((CH 2 ) n SO 3 H)、硫酸アルキル((CH 2 ) n OSO 3 H)、リン酸アルキル((CH 2 ) n OP(O)(OH) 2 )もしくはホスホン酸アルキル((CH 2 ) n P(O)(OH) 2 )(式中、nは、0~12の範囲の整数である)、またはその類似体を含む群から選択される部分からなるまたはそれらを含む可溶化および/またはイオン性アニオン提供部分を示し、CH 2 基の1つまたは複数がCF 2 によって交換されており、
さらに、アニオン提供部分は、非芳香族O、NおよびS含有複素環、例えば、ピペラジン、ピペコリンによって結合されていてもよく、または代替的に基Xのうちの1つは、基R 1 およびR 2 について上で列挙した部分のうちの任意のものを、また基Lについて列挙した任意の種類の結合と共に、他の置換基とは独立して有していてもよく、
式Bの化合物は、塩、溶媒和物および水和物として存在し得、塩、溶媒和物および水和物として、好ましくは、Na + 、Li + 、K + を含むアルカリ金属カチオンおよび有機アンモニウムとの塩として使用されてもよく、
ただし、式Bによって表されるすべての化合物において、塩基性条件下、すなわち7<pH<14で、式Bの残基Xに3または6つの負荷電基が存在し、これらの負荷電基は、以下:SH、COOH、SO 3 H、OP(O)(OH) 2 、OP(O)(OH)R a (式中、R a =C 1 ~C 4 アルキルまたは置換C 1 ~C 4 アルキル)、P(O)(OH) 2 、P(O)(OH)R a (式中、R a =C 1 ~C 4 アルキルまたは置換C 1 ~C 4 アルキルがもたらされる)から選択されるイオン性基の少なくとも部分的に脱プロトン化された残基を表し;
式Bの化合物は、塩、溶媒和物および水和物として存在し得、塩、溶媒和物および水和物として、好ましくは、Na + 、Li + 、K + を含むアルカリ金属カチオンおよび有機アンモニウムまたは有機ホスホニウムカチオンとの塩として使用されてもよい]
からなる群から選択される、好ましくは複数の多重イオン性および/または負荷電基を有する蛍光色素である、方法。
態様2
既知組成の標準が、標準塩基対ラダーおよび/または既知の炭水化物混合組成物である、態様1に記載の方法。
態様3
自動化された炭水化物混合組成物パターンプロファイリングのための方法であって、以下のステップ
a)第1の炭水化物混合組成物を含有する第1の試料を用意するステップと、
b)前記炭水化物混合組成物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)第2の蛍光標識で標識された第2の炭水化物混合組成物を含有する第2の試料を用意するステップであり、第2の試料を場合により前記第1の試料に添加してもよいステップと、
d)動電/クロマトグラフィー分離技術を蛍光またはレーザー誘起蛍光検出と組み合わせて使用して、前記試料の炭水化物混合組成物の電気泳動図/クロマトグラムを生成するステップと、
e)第1および第2の試料の炭水化物混合組成物パターンプロファイルの同一性および/またはそれらの間の差を分析するステップと
を含み、
第1の試料の第1の蛍光標識が、第2の試料の第2の蛍光標識とは異なり、第1の蛍光標識および第2の蛍光標識のうちの少なくとも1種が、態様1に定義される蛍光色素である、方法。
態様4
以下のステップ
a)第1の炭水化物混合組成物を含有する試料を用意するステップと、
b)前記炭水化物混合組成物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)比較しようとする、第2の炭水化物混合組成物を含有する第2の蛍光標識で標識された第2の試料を用意するステップと、
d)動電/クロマトグラフィー分離技術を蛍光またはレーザー誘起蛍光検出と組み合わせて使用して、第1および第2の試料の炭水化物混合組成物の電気泳動図/クロマトグラムを生成するステップと、
e)第1の試料および第2の試料の得られた電気泳動図/クロマトグラムから計算した標準移動/保持時間の指標を比較するステップと、
f)第1および第2の試料の炭水化物混合組成物パターンプロファイルの同一性および/またはそれらの間の差を分析するステップと
を含み、試料中に存在する炭水化物の標準移動/保持時間の指標が、第3の蛍光標識で標識された既知組成の内部標準に基づいて計算され、第1または第2の蛍光標識のうちの1種が、態様1に定義される蛍光色素である、態様3に記載の自動化された炭水化物混合組成物パターンプロファイリングのための方法。
態様5
少なくとも2つの直交標準が、試料に添加され、直交クロスアラインメントが、少なくとも2つの直交標準の所与の標準移動/保持時間の指標に基づいて実施される、先行する態様のいずれかに記載の方法。
態様6
試料が、炭水化物の混合物を含有する、先行する態様のいずれかに記載の方法。
態様7
試料が、グリカンの抽出物であり、方法が、グリコシル化パターンプロファイルの同定を可能にする、先行する態様のいずれかに記載の方法。
態様8
糖タンパク質のグリコシル化パターンが同定される、先行する態様のいずれかに記載の方法。
態様9
炭水化物混合物の成分が、定量的に決定される、先行する態様のいずれかに記載の方法。
態様10
アクリドンおよび/またはピレン系蛍光色素を用いた多波長蛍光検出システム、特に、キャピラリーゲル電気泳動システムの較正のための方法であって、アクリドンおよび/またはピレン系蛍光色素が、場合により炭水化物を含む基質部分とのコンジュゲートとして存在してもよく、
方法が、好ましくは以下のスキームに示される化合物:APTS、6-R、8-H、15、19、20、23または23b:
態様11
場合により炭水化物を含む基質部分とのコンジュゲートとして存在してもよいアクリドンおよび/またはピレン系色素が、APTS、6-H、19および20、またはAPTS、6-Me、19および20、または15、6-Me、19および20、またはAPTS、15、19および20、またはAPTS、15、6-Meおよび20、またはAPTS、8-H、6-Meおよび19、またはAPTS、8-H、6-Meおよび20、またはAPTS、8-H、19および20、またはAPTS、23、19および20、またはAPTS、15、6-Meおよび19、またはAPTS、23、6-Meおよび19、またはAPTS、23、6-Meおよび20、または23、6-Me、19および20、またはAPTS、8-H、6-Me、20および19、またはAPTS、15、6-Me、20および19、またはAPTS、23、6-Me、20および19、またはAPTS、8-H、6-H、20および19、またはAPTS、15、6-H、20および19、またはAPTS、23、6-H、20および19の組合せを含む、態様10に記載の方法。
態様12
式Bの蛍光色素が、以下の式C(式中、n=0~12)
R 1 および/またはR 2 は、互いに独立しており、
H、CH 3 、C 2 H 5 、直鎖状もしくは分枝状C 3 ~C 12 、好ましくはC 3 ~C 6 アルキル基、または置換C 2 ~C 12 、好ましくはC 2 ~C 6 アルキル基;特に、(CH 2 ) n COOR 3 (式中、n=1~12、好ましくは1~5であり、R 3 は、H、CH 2 CN、2-および4-ニトロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリルであってもよく、(CH 2 ) n 中のアルキル鎖は、直鎖状または分枝状であってもよい)を表してもよく;
R 1 ---R 2 は、さらなる第一級アミノ基NH 2 、第二級アミノ基NHR a を有する4、5、6または7員非芳香族炭素環(式中、R a =この環の炭素原子の1つに結合したC 1 ~C 6 アルキル、またはヒドロキシル基OH)を形成してもよく;場合により、R 1 ---R 2 は、4、5、6または7員非芳香族複素環(この複素環にはO、NまたはSなどのさらなるヘテロ原子が含まれる)を形成してもよく;
ヒドロキシアルキル基(CH 2 ) m OH(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);R 1 またはR 2 基のうちの一方は、カーボネートまたはカルバメート誘導体(CH 2 ) m OCOOR 4 またはCOOR 4 (式中、m=1~12、R 4 =メチル、エチル、2-クロロエチル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリル、フェニル基または置換フェニル基、例えば、2-および4-ニトロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロ-フェニル、2-ピリジルまたは4-ピリジル);
(CH 2 ) m NR a R b (式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有し;R a 、R b は、互いに独立しており、Hまたは置換されていてもよいC 1 ~C 4 アルキル基であってもよい)であってもよく、特にR 1 またはR 2 基のうちの一方は、アルキルアジド基(CH 2 ) m N 3 (式中、m=2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;
R 1 またはR 2 基のうちの一方は、(CH 2 ) n COOR 5 (式中、n=1~5であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖(CH 2 ) n を有し、R 5 は、H、直鎖状または分枝状C 1 ~C 6 アルキル、CH 2 CN、2-および4-ニトロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、スルホ-N-スクシンイミジル、N-スクシンイミジル、または1-オキシベンゾトリアゾリルから選択される)であってもよく;
さらに、R 1 もしくはR 2 のうちの一方は、(CH 2 ) n CONHR 6 (式中、n=1~12、好ましくは1~5、R 6 =H、C 1 ~C 6 アルキル、(CH 2 ) m N 3 、(CH 2 ) m -N-マレイミド、(CH 2 ) m -NHCOCH 2 X(式中、X=BrまたはI)(m=2~6であり、(CH 2 )nおよびR 6 中に直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;またはR 1 もしくはR 2 のうちの一方は、CH 2 -C 6 H 4 -NH 2 、COC 6 H 4 -NH 2 、CONHC 6 H 4 -NH 2 もしくはCSNHC 6 H 4 -NH 2 (C 6 H 4 は、1,2-、1,3-もしくは1,4-フェニレンである)、COC 5 H 3 N-NH 2 もしくはCH 2 -C 5 H 3 N-NH 2 (C 5 H 3 Nは、ピリジン-2,4-ジイル、ピリジン-2,5-ジイル、ピリジン-2,6-ジイルもしくはピリジン-3,5-ジイルである)を表してもよく;
R 1 またはR 2 基のうちの一方は、アリールヒドラジンAr-NR 6 NH 2 (式中、Arは式Cの全ピレン残基であり、R 7 =Hまたはアルキル)を形成する第一級アミノ基であってもよく;
R 1 またはR 2 基のうちの一方は、アリールヒドロキシルアミンAr-NR 8 OH(式中、Arは式Cの全ピレン残基であり、R 7 =Hまたはアルキル)を形成するヒドロキシ基であってもよく;
R 1 またはR 2 基のうちの一方は、末端アルキルオキシアミノ基(CH 2 ) n ONH 2 (式中、n=1~12であり、これは、すべての可能な組合せで1つまたは複数のアルキルアミノ(CH 2 ) m NH、アルキルアミド(CH 2 ) m CONH、アルキルエーテルまたはアルキルエステル基を介して結合されていてもよく、m=0~12である)を含有してもよく;
式BのSO 2 断片と残基X間の(CH 2 )n-CH 2 リンカー(式中、n=1~5)は、2~6個の炭素原子を有する直鎖、分枝状または環式基を表してもよく;
X=SH、COOH、SO 3 H、OP(O)(OH) 2 、OP(O)(OH)R a (式中、R a =置換されていてもよいC 1 ~C 4 アルキル)、P(O)(OH) 2 、P(O)(OH)R a (式中、R a =置換されていてもよいC 1 ~C 4 アルキル)であり;
ただし、式Cによって表されるすべての化合物において、塩基性条件下、すなわち7<pH<14で、式Bの残基Xに3または6つの負荷電基が存在し、これらの負荷電基は、以下:SH、COOH、SO 3 H、OP(O)(OH) 2 、OP(O)(OH)R a (式中、R a =C 1 ~C 4 アルキルまたは置換C 1 ~C 4 アルキル)、P(O)(OH) 2 、P(O)(OH)R a (式中、R a =C 1 ~C 4 アルキルまたは置換C 1 ~C 4 アルキル)から選択されるイオン性基の少なくとも部分的に脱プロトン化された残基を表し;
式Cの化合物は、塩、溶媒和物および水和物として存在し得、塩、溶媒和物および水和物として、好ましくは、Na + 、Li + 、K + を含むアルカリ金属カチオンおよび有機アンモニウムまたは有機ホスホニウムカチオンとの塩として使用されてもよい]
を有する色素である、先行する態様のいずれかに記載の方法。
態様13
式Bの蛍光色素が、以下の式D
R 1 および/またはR 2 は、互いに独立しており、H、CH 3 、C 2 H 5 または直鎖状もしくは分枝状の置換されていてもよいC 3 ~C 12 、好ましくはC 3 ~C 6 アルキル基;特に、(CH 2 ) n COOR 4 (式中、n=1~12、好ましくは1~5であり、R 4 は、H、CH 2 CN、2-および4-ニトロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリルであってもよく、(CH 2 ) n 中のアルキル鎖は、直鎖状または分枝状であってもよい)を表してもよく;
R 1 ---R 2 は、さらなる第一級アミノ基NH 2 、第二級アミノ基NHR a を有する4、5、6または7員非芳香族炭素環(式中、R a =この環の炭素原子の1つに結合した、置換されていてもよいC 1 ~C 6 アルキル、またはヒドロキシル基OHである);または場合により、R 1 ---R 2 は、4、5、6または7員非芳香族複素環(この複素環にはO、NまたはSなどのヘテロ原子が含まれる)を形成してもよく;
R 1 および/またはR 2 は、
ヒドロキシアルキル基(CH 2 ) m OH(式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状の置換されていてもよいアルキル鎖を有する)をさらに表してもよく;R 1 またはR 2 基の一方は、カーボネートまたはカルバメート誘導体(CH 2 ) m OCOOR 5 またはCOOR 5 (式中、m=1~12、R 5 =メチル、エチル、2-クロロエチル、CH 2 CN、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリル、フェニル基または置換フェニル基、例えば、2-および4-ニトロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロ-フェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、2-ピリジル、4-ピリジル);
(CH 2 ) m N 3 (式中、m=1~12、好ましくは2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);
(CH 2 ) n CONHR 6 (式中、n=1~12、好ましくは1~5、R 6 =H、置換または非置換C 1 ~C 6 アルキル、(CH 2 ) m N 3 、(CH 2 )m-N-マレイミド、(CH 2 )m-NHCOCH 2 Y(Y=Br、I)(m=1~12、好ましくは2~6であり、(CH 2 )nおよびR 6 中に直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;
R 1 またはR 2 基のうちの一方は、アリールヒドラジンAr-NR 7 NH 2 (式中、Arは式Dの全ピレン残基であり、R 7 =Hまたはアルキル)を形成する第一級アミノ基であってもよく;
R 1 またはR 2 基のうちの一方は、アリールヒドロキシルアミンAr-NR 8 OH(式中、Arは式Dの全ピレン残基であり、R 8 =Hまたはアルキル)を形成するヒドロキシ基であってもよく;
R 1 またはR 2 基のうちの一方は、末端アルキルオキシアミノ基(CH 2 ) n ONH 2 (式中、n=1~12であり、これは、m=0~12のすべての可能な組合せの1つまたは複数のアルキルアミノ(CH 2 ) m NH、アルキルアミド(CH 2 ) m CONH、アルキルエーテルまたはアルキルエステル基を介して結合されていてもよい)を含有してもよく;
さらに、R 1 またはR 2 は、CH 2 -C 6 H 4 -NH 2 、COC 6 H 4 -NH 2 、CONHC 6 H 4 -NH 2 またはCSNHC 6 H 4 -NH 2 (C 6 H 4 は、1,2-、1,3-または1,4-フェニレンである)、COC 5 H 3 N-NH 2 またはCH 2 -C 5 H 3 N-NH 2 (C 5 H 3 Nは、ピリジン-2,4-ジイル、ピリジン-2,5-ジイル、ピリジン-2,6-ジイルまたはピリジン-3,5-ジイルである)を表してもよく;
R 3 =H、(CH 2 ) q CH 2 X、C 2 H 5 、直鎖状または分枝状C 3 ~C 6 アルキル基、C m H 2m OR(式中、m=2~6であり、直鎖状または分枝状アルカン-ジイル鎖C m H 2m を有し、R=H、CH 3 、C 2 H 5 、C 3 H 7 、CH 3 (CH 2 CH 2 O) k CH 2 CH 2 (k=1~12)であり;一方、(CH 2 ) q CH 2 リンカーは、2~6個の炭素原子を有する直鎖、分枝状または環式基を表してもよい)であり;
式Dにおいて、スルホンアミド断片SO 2 Nと残基X間の(CH 2 ) n -CH 2 リンカー(式中、n=1~12、好ましくは1~5)は、2~6個の炭素原子を有する直鎖、分枝状または環式基を表してもよく;
X=SH、COOH、SO 3 H、OP(O)(OH) 2 、OP(O)(OH)R a (式中、R a =置換または非置換C 1 ~C 4 アルキル)、P(O)(OH) 2 、P(O)(OH)R a (式中、R a =置換または非置換C 1 ~C 4 アルキル)であり;
ただし、式Dによって表されるすべての化合物において、塩基性条件下、すなわち7<pH<14で、式Cの残基Xに3、6、9または12個の負荷電基が存在し、これらの負荷電基は、以下:SH、COOH、SO 3 H、OP(O)(OH) 2 、OP(O)(OH)R a (式中、R a =C 1 ~C 4 アルキルまたは置換C 1 ~C 4 アルキル)、P(O)(OH) 2 、P(O)(OH)R a (式中、R a =C 1 ~C 4 アルキルまたは置換C 1 ~C 4 アルキル)から選択されるイオン性基の少なくとも部分的に脱プロトン化された残基を表し;
式Dの化合物は、塩、溶媒和物および水和物として存在し得、塩、溶媒和物および水和物として、好ましくは、Na + 、Li + 、K + を含むアルカリ金属カチオンおよび有機アンモニウムまたは有機ホスホニウムカチオンとして使用されてもよい]
を有する色素である、先行する態様のいずれかに記載の方法。
態様14
式BまたはDのR 1 および/またはR 2 が、H、重水素、アルキルまたは重水素置換アルキル(アルキル基の1個、いくつかまたはすべてのH原子は、重水素原子によって交換されていてもよい)、特に、1~12個のC原子、好ましくは1~6個のC原子を有するアルキルまたは重水素アルキル、4,6-ジハロ-1,3,5-トリアジニル(C 3 N 3 X 2 )(ハロゲンXは、好ましくは、塩素である)、2-、3-または4-アミノベンゾイル(COC 6 H 4 NH 2 )、N-[(2-、N-[(3-またはN-[(4-アミノフェニル)ウレイド基(NHCONHC 6 H 4 NH 2 )、N-[(2-、N-[(3-またはN-[(4-アミノフェニル)チオウレイド基(NHCSNHC 6 H 4 NH 2 、または一般式(CH 2 ) m1 COOR 3 、(CH 2 ) m1 OCOOR 3 (CH 2 ) n1 COOR 3 もしくは(CO) m1 (CH 2 ) m2 (CO) n1 (NH) n2 (CO) n3 (CH 2 ) n4 COOR 3 の結合カルボン酸残基およびその反応性エステル(整数m1、m2およびn1、n2、n3、n4は、独立して、それぞれ1~12および0~12の範囲であり、鎖(CH 2 ) m/n は、直鎖状、分枝状、飽和、不飽和、部分もしくは完全重水素化であるおよび/またはN、OもしくはSを含有する炭素環もしくは複素環に含まれ、R 3 は、H、Dまたは求核反応性脱離基であり、好ましくは、これらに限定されないが、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリル、シアノメチル、ポリハロゲノアルキル、ポリハロゲノフェニル、例えば、テトラ-またはペンタフルオロフェニル、2-または4-ニトロフェニルを含む)を表す、先行する態様のいずれかに記載の方法。
態様15
式A~Dの化合物が、
態様16
炭水化物混合組成物パターンを決定および/または同定するためのキットまたはシステムであって、不揮発性メモリを有するデータ処理ユニットを含み、前記メモリがデータベースを含有し、前記データベースが、炭水化物のアラインされた移動/保持時間および/またはアラインされた移動/保持時間の指標を含有し、前記移動/保持時間および/または移動/保持時間の指標が、炭水化物の自動化された決定および/もしくは同定ならびに/または炭水化物の同定ならびに/または炭水化物混合組成物パターンプロファイリングによって得られ、炭水化物の自動化された決定および/もしくは同定ならびに/または炭水化物の同定ならびに/または炭水化物混合組成物パターンプロファイリングが、以下のステップ:
a)少なくとも1種の炭水化物を含有する試料を得るステップと、
b)前記炭水化物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)第2の蛍光標識で標識された既知組成の標準を用意するステップと、
d)動電/クロマトグラフィー分離技術を蛍光またはレーザー誘起蛍光検出と組み合わせて使用して、前記炭水化物および既知組成の標準の移動/保持時間を決定するステップと、
e)移動/保持時間を、標準の所与の標準移動/保持時間の指標に基づく移動/保持時間の指標にアラインするステップと、
f)炭水化物のこれらの移動/保持時間の指標をデータベースからの標準移動/保持時間の指標と比較するステップと、
g)炭水化物および/または炭水化物混合組成物パターンを同定または決定するステップと
を含み、
標準組成物が、未知の炭水化物混合組成物を含有する試料に添加され、第1の蛍光標識および第2の蛍光標識が異なり、第1の蛍光標識または第2の蛍光標識が、好ましくは、態様1および12から15のいずれかに定義される一般式A~Dの化合物からなる群から選択される複数のイオン性および/または負荷電基を有する蛍光色素、ならびに態様1および12から15のいずれかに定義される蛍光色素である、キットまたはシステム。
態様17
自動化された炭水化物混合組成物パターンプロファイリングのためのキットまたはシステムであって、不揮発性メモリを有するデータ処理ユニットを含み、前記メモリがデータベースを含有し、前記データベースが、炭水化物のアラインされた移動/保持時間および/またはアラインされた移動/保持時間の指標を含有し、前記移動/保持時間および/または移動/保持時間の指標が、炭水化物の自動化された決定および/もしくは同定ならびに/または炭水化物の同定ならびに/または炭水化物混合組成物パターンプロファイリングによって得られ、炭水化物の自動化された決定および/もしくは同定ならびに/または炭水化物の同定ならびに/または炭水化物混合組成物パターンプロファイリングが、以下のステップ:
a)未知の炭水化物混合組成物を含有する第1の試料を用意するステップと、
b)前記炭水化物混合組成物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)第2の蛍光標識で標識された既知の炭水化物混合組成物パターンを有する第2の試料を前記第1の試料に添加するステップと、
d)動電/クロマトグラフィー分離技術を蛍光またはキャピラリーゲル電気泳動レーザー誘起蛍光などのレーザー誘起蛍光検出と組み合わせて使用して、前記試料の炭水化物混合組成物の電気泳動図/クロマトグラムを生成するステップと、
e)第1および第2の試料の炭水化物混合組成物パターンプロファイルの同一性および/またはそれらの間の差を分析するステップと
を含み、
第1の試料の第1の蛍光標識が、第2の試料の第2の蛍光標識とは異なり、第1の蛍光標識および第2の蛍光標識のうちの少なくとも1種が、態様1および12から15のいずれかに定義される蛍光色素、ならびに態様1および12から15のいずれかに定義される蛍光色素である、キットまたはシステム。
態様18
キャピラリーゲル電気泳動-レーザー誘起蛍光装置をさらに含み、特に、キャピラリーゲル電気泳動-レーザー誘起蛍光装置が、キャピラリーDNAシーケンサーである、態様16または17に記載のキットまたはシステム。
態様19
態様1から15のいずれかに記載の方法に使用するための、態様1および12から15のいずれかに定義される蛍光色素を含む炭水化物色素コンジュゲート。
態様20
色素が、以下の式の化合物
態様21
態様1および12から15のいずれかに定義される色素のうちの1種もしくは複数、または態様19もしくは20に記載の炭水化物色素コンジュゲートのうちの1種もしくは複数を含む、態様1から15のいずれかに記載の方法に使用するためのキットまたは組成物。
態様22
炭水化物とコンジュゲートしていてもよい、式A、B、CまたはDによる蛍光色素を含み、場合により、化合物19、20のうちの少なくとも1種をさらに含む、オリゴ糖標準などの較正標準。
態様23
態様22に記載の較正標準および場合により使用説明書を含有する、キット。
態様24
式20
態様25
式AまたはBによる蛍光色素、特に式CもしくはDの蛍光色素または式A~Dの異なる色素で標識された化合物で構成される標準組成物。
態様26
式AまたはBによる蛍光色素、特に式CもしくはDの蛍光色素または式A~Dの異なる色素で標識された炭水化物で構成される、態様25に記載の標準組成物。
態様27
蛍光色素が、6-H、6-Me、8-R、15、13a、13b、16、18、23および23bから選択される少なくとも1種の色素である、態様25または26に記載の標準組成物。
態様28
特に、態様1から15のいずれかに記載の方法に使用するための、態様25から27のいずれかに記載の標準組成物、および場合により使用説明書を含有するキット。
Claims (19)
- 炭水化物および/または炭水化物混合組成物パターンプロファイリングの自動化された決定および/または同定のための方法であって、以下のステップ:
a)少なくとも1種の炭水化物を含有する試料を得るステップと、
b)前記炭水化物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)第2の蛍光標識で標識された既知組成の標準を用意するステップと、
d)動電/クロマトグラフィー分離技術を蛍光またはレーザー誘起蛍光検出と組み合わせて使用して、前記炭水化物および既知組成の標準の移動/保持時間を決定するステップと、
e)移動/保持時間を、標準の所与の標準移動/保持時間の指標に基づく移動/保持時間の指標にアラインするステップと、
f)炭水化物のこれらの移動/保持時間の指標をデータベースからの標準移動/保持時間の指標と比較するステップと、
g)ステップf)に基づいて、炭水化物および/または炭水化物混合組成物パターンを同定または決定するステップと
を含み、
標準組成物が、未知の炭水化物および/または炭水化物混合組成物を含有する試料に添加され、第1の蛍光標識および第2の蛍光標識が異なり、第1の蛍光標識または第2の蛍光標識が、以下の一般式AおよびBの化合物:
R1、R2、R3、R4、R5は、互いに独立しており、
H、CH3、C2H5、直鎖状もしくは分枝状C3~C12アルキルもしくはペルフルオロアルキル基、ホスホニル化アルキル基(CH2)mP(O)(OH)2(式中、m=1~12であり、直鎖状もしくは分枝状アルキル鎖を有する)、(CH2)nCOOH(式中、n=1~12)、または(CH2)nCOOR6(式中、n=1~12であり、R6は、アルキル、CH2CN、ベンジル、フルオレン-9-イル、ポリハロゲノアルキル、ポリハロゲノフェニル、2-および4-ニトロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリルもしくは他の潜在的に求核反応性の脱離基であってもよい)、スルホン酸アルキル((CH2)nSO3H)もしくは硫酸アルキル((CH2)nOSO3H)(式中、n=1~12であり、いずれの(CH2)n中のアルキル鎖も直鎖状または分枝状であってもよい);
ヒドロキシアルキル基(CH2)mOHまたはチオアルキル基(CH2)mSH(式中、m=1~12であり、直鎖状もしくは分枝状アルキル鎖を有する)、リン酸化ヒドロキシアルキル基(CH2)mOP(O)(OH)2(式中、m=1~12であり、直鎖状もしくは分枝状アルキル鎖を有する)を表してもよく;R1またはR2基のうちの一方は、(CH2)mOCOOR7またはCOOR7のカーボネートまたはカルバメート誘導体(式中、m=1~12、R7=メチル、エチル、tert-ブチル、ベンジル、フルオレン-9-イル、CH2CN、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリル、フェニル、置換フェニル基、2-ピリジル、4-ピリジル、ピリミド-4-イル);
(CH2)mNRaRb(式中、m=1~12であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有し;Ra、Rbは、互いに独立しており、水素および/またはC1~C4アルキル基を表す)、ヒドロキシアルキル基(CH2)mOH(式中、m=2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)、リン酸化ヒドロキシアルキル基(CH2)mOP(O)(OH)2(式中、m=1~12であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);
アルキルアジド(CH2)mN3(式中、m=1~12であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;
R1、R2、R3、R4、R5は、末端アルキルオキシアミノ基(CH2)mONH2(式中、m=1~12であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有し、これは、1つまたは複数のアルキルアミノ(CH2)mNHまたはアルキルアミド(CH2)mCONH基を、すべての可能な組合せで含み得、m=0~12である);
(CH2)nCONHR8(式中、n=1~12;R8=H、C1~C6アルキル、(CH2)mN3または(CH2)m-N-マレイミド、(CH2)m-NH-COCH2X(式中、X=BrまたはI)(m=1~12であり、(CH2)n、(CH2)mおよびR8中に直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);
R1、R2またはR3として、アリールヒドラジンを形成してもよい第一級アミノ基;
R2またはR3として、アリールヒドロキシルアミンを形成してもよいヒドロキシ基を含有してもよく;
さらに、残基R1、R2、R3、R4、R5のうちの1つは、CH2-C6H4-NH2、COC6H4-NH2、CONHC6H4-NH2またはCSNHC6H4-NH2(C6H4は、1,2-、1,3-または1,4-フェニレンである)、COC5H3N-NH2またはCH2-C5H3N-NH2(C5H3Nは、ピリジン-2,4-ジイル、ピリジン-2,5-ジイル、ピリジン-2,6-ジイルまたはピリジン-3,5-ジイルである)を表してもよく;
さらに、R2---R3(R4---R5)は、4、5、6もしくは7員環、または第一級アミノ基NH2、第二級アミノ基NHRaを有するもしくは有さない4、5、6もしくは7員環(式中、Ra=この環の炭素原子の1つに結合したC1~C6アルキル、ヒドロキシル基OHまたはリン酸化ヒドロキシル基-OP(O)(OH)2)を形成してもよく;
または、R2---R3(R4---R5)は、4、5、6または7員複素環(この複素環にはO、NまたはSから選択されるさらに1~3個のヘテロ原子が含まれる)を形成してもよく;
さらに、R1は、非置換フェニル基、OH、SH、NH2、NHRa、NRaRb、RaO、RaS(式中、RaおよびRbは、互いに独立しており、直鎖状または分枝状炭素鎖を有するC1~C6アルキル基であってもよい)の組から選択される1つまたはいくつかの電子供与体置換基を有するフェニル基、NO2、CN、COH、COOH、CH=CHCN、CH=C(CN)2、SO2Ra、CORa、COORa、CH=CHCORa、CH=CHCOORa、CONHRa、SO2NRaRb、CONRaRb(式中、RaおよびRbは、互いに独立しており、Hまたは直鎖状もしくは分枝状炭素鎖を有するC1~C6アルキル基であってもよい)の組から選択される1つまたはいくつかの電子受容体を有するフェニル基を表してもよく;
またはR1は、複素芳香族基を表してもよく;
ただし、上記式Aのすべての化合物において、塩基性条件、すなわち7<pH<14で、少なくとも2つの負荷電基が存在し、これらの負荷電基は、以下:SH、COOH、スルホン酸残基SO3H、第一リン酸基OP(O)(OH)2、第二リン酸基OP(O)(OH)Ra(式中、Ra=C1~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキル)、第一ホスホン酸基P(O)(OH)2、第二ホスホン酸基P(O)(OH)Ra(式中、Ra=C~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキル)から選択されるイオン性基の少なくとも部分的に脱プロトン化された残基を表し;
式Aの化合物は、塩、溶媒和物および水和物として存在し得、塩、溶媒和物および水和物として使用されてもよい];
R1および/またはR2は、互いに独立しており、
H、CH3、C2H5、直鎖状もしくは分枝状C3~C12アルキルもしくはペルフルオロアルキル基、または置換C2~C12アルキル基;または、(CH 2 ) n COOR 3 (式中、n=1~12であり、R3は、H、アルキル、CH2CN、ベンジル、フルオレン-9-イル、ポリハロゲノアルキル、ポリハロゲノフェニル、2-および4-ニトロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリルまたは他の潜在的に求核反応性の脱離基であってもよく、(CH2)n中のアルキル鎖は直鎖状または分枝状であってもよい)を表してもよく;
R1---R2は、さらなる第一級アミノ基NH2、第二級アミノ基NHRaを有する4、5、6または7員非芳香族炭素環(式中、Ra=この環の炭素原子の1つに結合したC1~C6アルキル、またはヒドロキシル基OH)を形成してもよく;または、R1---R2は、4、5、6または7員非芳香族複素環(この複素環にはO、NまたはSから選択されるさらなるヘテロ原子が含まれる)を形成してもよく;
ヒドロキシアルキル基(CH2)mOH(式中、m=1~12であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);R1またはR2基のうちの一方は、カーボネートまたはカルバメート誘導体(CH2)mOCOOR4またはCOOR4(式中、m=1~12、R4=メチル、エチル、2-クロロエチル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリル、フェニル基または置換フェニル基、2-ピリジルまたは4-ピリジル);
(CH2)mNRaRb(式中、m=1~12であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有し;Ra、Rbは、互いに独立しており、Hまたは置換されていてもよいC1~C4アルキル基であってもよい)であってもよく;
または、R 1 またはR 2 基のうちの一方は、アルキルアジド基(CH2)mN3(式中、m=2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;R1またはR2基のうちの一方は、(CH2)nSO2NR5NH2(式中、n=1~12であり、置換基R5は、H、アルキル、ヒドロキシアルキルまたはペルフルオロアルキル基C1~C12によって表されてもよい)であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、アリールヒドラジンAr-NR6NH2(式中、Arは式Bの全ピレン残基であり、R6=Hまたはアルキルである)を形成する第一級アミノ基であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、アリールヒドロキシルアミンAr-NR7OH(式中、Arは式Bの全ピレン残基であり、R7=Hまたはアルキルである)を形成するヒドロキシ基であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、末端アルキルオキシアミノ基(CH2)nONH2(式中、n=1~12であり、これはすべての可能な組合せでの1つまたは複数のアルキルアミノ(CH2)mNH、アルキルアミド(CH2)mCONH、アルキルエーテルまたはエステル基を介して結合されていてもよく、m=0~12である)を含有してもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、CO(CH2)nCOOR8(式中、n=1~5であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖(CH2)nを有し、R8は、H、直鎖状または分枝状C1~C6アルキル、CH2CN、2-および4-ニトロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾ-トリアゾリルから選択される)であってもよく;
さらに、R1またはR2のうちの一方は、(CH2)nCONHR9(式中、n=1~5、R9=H、C1~C6アルキル)、(CH2)mN3、(CH2)m-N-マレイミド、(CH2)m-NHCOCH2X(式中、X=BrまたはI)(m=2~6であり、(CH2)nおよびR9中に直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;
または、R1もしくはR2のうちの一方は、CH2-C6H4-NH2、COC6H4-NH2、CONHC6H4-NH2もしくはCSNHC6H4-NH2(C6H4は、1,2-、1,3-もしくは1,4-フェニレンである)、COC5H3N-NH2もしくはCH2-C5H3N-NH2(C5H3Nは、ピリジン-2,4-ジイル、ピリジン-2,5-ジイル、ピリジン-2,6-ジイルもしくはピリジン-3,5-ジイルである)を表してもよく;またはR1もしくはR2のうちの一方は、アルキルアジド(CH)N3もしくはアルキンであってもよく;
リンカーLは、少なくとも1個の炭素原子を含み、全ての出現において、C1~C12の範囲の長さの直鎖状または分枝状の、アルキル、ヘテロアルキル、アルキルオキシ、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ、ジエタノールアミンまたはN-メチル(アルキル)モノエタノールアミン部分、単一または複数のジフルオロメチル(CF 2 )、アルケンまたはアルキン部分を、任意の組合せで含んでもよく;
リンカーLはまた、カルボニル(CH2CO、CF2CO)部分を含んでもよく;
リンカーLはまた、1,3,5-トリアジンの残基を含んでもよく、したがって、基Xへの2つの結合点を提供してもよく;
Xは、可溶化および/またはイオン性アニオン提供部分を示し、
さらに、アニオン提供部分は、非芳香族O、NおよびS含有複素環によって結合されていてもよく、
ただし、式Bによって表されるすべての化合物において、塩基性条件下、すなわち7<pH<14で、式Bの残基Xに3または6つの負荷電基が存在し、これらの負荷電基は、以下:SH、COOH、SO3H、OP(O)(OH)2、OP(O)(OH)Ra(式中、Ra=C1~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキル)、P(O)(OH)2、P(O)(OH)Ra(式中、Ra=C1~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキルがもたらされる)から選択されるイオン性基の少なくとも部分的に脱プロトン化された残基を表し;
式Bの化合物は、塩、溶媒和物および水和物として存在し得、塩、溶媒和物および水和物として使用されてもよい]
からなる群から選択される、蛍光色素である、方法。 - 自動化された炭水化物混合組成物パターンプロファイリングのための方法であって、以下のステップ
a)第1の炭水化物混合組成物を含有する第1の試料を用意するステップと、
b)前記炭水化物混合組成物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)第2の蛍光標識で標識された第2の炭水化物混合組成物を含有する第2の試料を用意するステップであり、第2の試料を前記第1の試料に添加してもよいステップと、
d)動電/クロマトグラフィー分離技術を蛍光またはレーザー誘起蛍光検出と組み合わせて使用して、前記試料の炭水化物混合組成物の電気泳動図/クロマトグラムを生成するステップと、
e)第1および第2の試料の炭水化物混合組成物パターンプロファイルの同一性および/またはそれらの間の差を分析するステップと
を含み、
第1の試料の第1の蛍光標識が、第2の試料の第2の蛍光標識とは異なり、第1の蛍光標識および第2の蛍光標識のうちの少なくとも1種が、請求項1に定義される蛍光色素である、方法。 - 以下のステップ
a)第1の炭水化物混合組成物を含有する試料を用意するステップと、
b)前記炭水化物混合組成物を第1の蛍光標識で標識するステップと、
c)比較しようとする、第2の炭水化物混合組成物を含有する第2の蛍光標識で標識された第2の試料を用意するステップと、
d)動電/クロマトグラフィー分離技術を蛍光またはレーザー誘起蛍光検出と組み合わせて使用して、第1および第2の試料の炭水化物混合組成物の電気泳動図/クロマトグラムを生成するステップと、
e)第1の試料および第2の試料の得られた電気泳動図/クロマトグラムから計算した標準移動/保持時間の指標を比較するステップと、
f)第1および第2の試料の炭水化物混合組成物パターンプロファイルの同一性および/またはそれらの間の差を分析するステップと
を含み、試料中に存在する炭水化物の標準移動/保持時間の指標が、第3の蛍光標識で標識された既知組成の内部標準に基づいて計算され、第1または第2の蛍光標識のうちの1種が、請求項1に定義される蛍光色素である、請求項2に記載の自動化された炭水化物混合組成物パターンプロファイリングのための方法。 - 少なくとも2つの直交標準が、試料に添加され、直交クロスアラインメントが、少なくとも2つの直交標準の所与の標準移動/保持時間の指標に基づいて実施される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- i)試料が、炭水化物の混合物を含有する、および/もしくはii)試料が、グリカンの抽出物であり、方法が、グリコシル化パターンプロファイルの同定を可能にする、および/もしくはiii)糖タンパク質のグリコシル化パターンが同定される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 炭水化物混合物の成分が、定量的に決定される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- アクリドンおよび/またはピレン系蛍光色素を用いた多波長蛍光検出システムの較正を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法であって、アクリドンおよび/またはピレン系蛍光色素が、炭水化物とのコンジュゲートとして存在してもよく、
この方法により、以下のスキームに示される化合物:APTS(8-アミノ-ピレン-1,3,6-トリスルホン酸)、6-R、8-H、15、19、20、23または23b:
のうちの少なくとも1種を含む、異なる波長で発光する追加の蛍光色素(これは炭水化物コンジュゲートとして存在してもよい)と一緒に、請求項1に定義される式AまたはBによる化合物のうちの少なくとも1種の検出が達成される、
方法。 - 式Bの蛍光色素が、
i)以下の式C(式中、n=0~12)
R1および/またはR2は、互いに独立しており、
H、CH3、C2H5、直鎖状もしくは分枝状C3~C12アルキル基、または置換C2~C12アルキル基;または、(CH2)nCOOR3(式中、n=1~12であり、R3は、H、CH2CN、2-および4-ニトロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリルであってもよく、(CH2)n中のアルキル鎖は、直鎖状または分枝状であってもよい)を表してもよく;または
R1---R2は、さらなる第一級アミノ基NH2、第二級アミノ基NHRaを有する4、5、6または7員非芳香族炭素環(式中、Ra=この環の炭素原子の1つに結合したC1~C6アルキル、またはヒドロキシル基OH)を形成してもよく;または、R1---R2は、4、5、6または7員非芳香族複素環(この複素環にはO、NまたはSから選択されるさらなるヘテロ原子が含まれる)を形成してもよく;
ヒドロキシアルキル基(CH2)mOH(式中、m=1~12であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);R1またはR2基のうちの一方は、カーボネートまたはカルバメート誘導体(CH2)mOCOOR4またはCOOR4(式中、m=1~12、R4=メチル、エチル、2-クロロエチル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリル、フェニル基または置換フェニル基、2-ピリジルまたは4-ピリジル);
(CH2)mNRaRb(式中、m=1~12であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有し;Ra、Rbは、互いに独立しており、Hまたは置換されていてもよいC1~C4アルキル基であってもよい)であってもよく、またはR1またはR2基のうちの一方は、アルキルアジド基(CH2)mN3(式中、m=2~6であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、(CH2)nCOOR5(式中、n=1~5であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖(CH2)nを有し、R5は、H、直鎖状または分枝状C1~C6アルキル、CH2CN、2-および4-ニトロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、スルホ-N-スクシンイミジル、N-スクシンイミジル、または1-オキシベンゾトリアゾリルから選択される)であってもよく;
さらに、R1もしくはR2のうちの一方は、(CH2)nCONHR6(式中、n=1~12、R6=H、C1~C6アルキル、(CH2)mN3、(CH2)m-N-マレイミド、(CH2)m-NHCOCH2X(式中、X=BrまたはI)(m=2~6であり、(CH2)nおよびR6中に直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;またはR1もしくはR2のうちの一方は、CH2-C6H4-NH2、COC6H4-NH2、CONHC6H4-NH2もしくはCSNHC6H4-NH2(C6H4は、1,2-、1,3-もしくは1,4-フェニレンである)、COC5H3N-NH2もしくはCH2-C5H3N-NH2(C5H3Nは、ピリジン-2,4-ジイル、ピリジン-2,5-ジイル、ピリジン-2,6-ジイルもしくはピリジン-3,5-ジイルである)を表してもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、アリールヒドラジンAr-NR6NH2(式中、Arは式Cの全ピレン残基であり、R7=Hまたはアルキル)を形成する第一級アミノ基であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、アリールヒドロキシルアミンAr-NR8OH(式中、Arは式Cの全ピレン残基であり、R7=Hまたはアルキル)を形成するヒドロキシ基であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、末端アルキルオキシアミノ基(CH2)nONH2(式中、n=1~12であり、これは、すべての可能な組合せで1つまたは複数のアルキルアミノ(CH2)mNH、アルキルアミド(CH2)mCONH、アルキルエーテルまたはアルキルエステル基を介して結合されていてもよく、m=0~12である)を含有してもよく;
式CのSO2断片と残基X間の(CH2)n-CH2リンカー(式中、n=1~5)は、2~6個の炭素原子を有する直鎖、分枝状または環式基を表してもよく;
X=SH、COOH、SO3H、OP(O)(OH)2、OP(O)(OH)Ra(式中、Ra=置換されていてもよいC1~C4アルキル)、P(O)(OH)2、P(O)(OH)Ra(式中、Ra=置換されていてもよいC1~C4アルキル)であり;
ただし、式Cによって表されるすべての化合物において、塩基性条件下、すなわち7<pH<14で、式Cの残基Xに3または6つの負荷電基が存在し、これらの負荷電基は、以下:SH、COOH、SO3H、OP(O)(OH)2、OP(O)(OH)Ra(式中、Ra=C1~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキル)、P(O)(OH)2、P(O)(OH)Ra(式中、Ra=C1~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキル)から選択されるイオン性基の少なくとも部分的に脱プロトン化された残基を表し;
式Cの化合物は、塩、溶媒和物および水和物として存在し得、塩、溶媒和物および水和物として使用されてもよい]
を有する色素である、および/もしくは
ii)
式Bの蛍光色素が、以下の式D(式中、n=0~12)
R1および/またはR2は、互いに独立しており、H、CH3、C2H5または直鎖状もしくは分枝状の置換されていてもよいC3~C12アルキル基;または、(CH2)nCOOR4(式中、n=1~12であり、R4は、H、CH2CN、2-および4-ニトロフェニル、2,3,5,6-テトラフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリルであってもよく、(CH2)n中のアルキル鎖は、直鎖状または分枝状であってもよい)を表してもよく;
R1---R2は、さらなる第一級アミノ基NH2、第二級アミノ基NHRaを有する4、5、6または7員非芳香族炭素環(式中、Ra=この環の炭素原子の1つに結合した、置換されていてもよいC1~C6アルキル、またはヒドロキシル基OHである);または、R1---R2は、4、5、6または7員非芳香族複素環(この複素環にはO、NまたはSから選択されるヘテロ原子が含まれる)を形成してもよく;
R1および/またはR2は、
ヒドロキシアルキル基(CH2)mOH(式中、m=1~12であり、直鎖状または分枝状の置換されていてもよいアルキル鎖を有する)をさらに表してもよく;R1またはR2基の一方は、カーボネートまたはカルバメート誘導体(CH2)mOCOOR5またはCOOR5(式中、m=1~12、R5=メチル、エチル、2-クロロエチル、CH2CN、N-スクシンイミジル、スルホ-N-スクシンイミジル、1-オキシベンゾトリアゾリル、フェニル基または置換フェニル基、2-ピリジル、4-ピリジル);
(CH2)mN3(式中、m=1~12であり、直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する);
(CH2)nCONHR6(式中、n=1~12、R6=H、置換または非置換C1~C6アルキル、(CH2)mN3、(CH2)m-N-マレイミド、(CH2)m-NHCOCH2Y(Y=Br、I)(m=1~12であり、(CH2)nおよびR6中に直鎖状または分枝状アルキル鎖を有する)であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、アリールヒドラジンAr-NR7NH2(式中、Arは式Dの全ピレン残基であり、R7=Hまたはアルキル)を形成する第一級アミノ基であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、アリールヒドロキシルアミンAr-NR8OH(式中、Arは式Dの全ピレン残基であり、R8=Hまたはアルキル)を形成するヒドロキシ基であってもよく;
R1またはR2基のうちの一方は、末端アルキルオキシアミノ基(CH2)nONH2(式中、n=1~12であり、これは、m=0~12のすべての可能な組合せの1つまたは複数のアルキルアミノ(CH2)mNH、アルキルアミド(CH2)mCONH、アルキルエーテルまたはアルキルエステル基を介して結合されていてもよい)を含有してもよく;
さらに、R1またはR2は、CH2-C6H4-NH2、COC6H4-NH2、CONHC6H4-NH2またはCSNHC6H4-NH2(C6H4は、1,2-、1,3-または1,4-フェニレンである)、COC5H3N-NH2またはCH2-C5H3N-NH2(C5H3Nは、ピリジン-2,4-ジイル、ピリジン-2,5-ジイル、ピリジン-2,6-ジイルまたはピリジン-3,5-ジイルである)を表してもよく;
R3=H、(CH2)qCH2X、C2H5、直鎖状または分枝状C3~C6アルキル基、CmH2mOR(式中、m=2~6であり、直鎖状または分枝状アルカン-ジイル鎖CmH2mを有し、R=H、CH3、C2H5、C3H7、CH3(CH2CH2O)kCH2CH2(k=1~12)であり;一方、(CH2)qCH2リンカーは、2~6個の炭素原子を有する直鎖、分枝状または環式基を表してもよい)であり;
式Dにおいて、スルホンアミド断片SO2Nと残基X間の(CH2)n-CH2リンカー(式中、n=1~12)は、2~6個の炭素原子を有する直鎖、分枝状または環式基を表してもよく;
X=SH、COOH、SO3H、OP(O)(OH)2、OP(O)(OH)Ra(式中、Ra=置換または非置換C1~C4アルキル)、P(O)(OH)2、P(O)(OH)Ra(式中、Ra=置換または非置換C1~C4アルキル)であり;
ただし、式Dによって表されるすべての化合物において、塩基性条件下、すなわち7<pH<14で、式Cの残基Xに3、6、9または12個の負荷電基が存在し、これらの負荷電基は、以下:SH、COOH、SO3H、OP(O)(OH)2、OP(O)(OH)Ra(式中、Ra=C1~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキル)、P(O)(OH)2、P(O)(OH)Ra(式中、Ra=C1~C4アルキルまたは置換C1~C4アルキル)から選択されるイオン性基の少なくとも部分的に脱プロトン化された残基を表し;
式Dの化合物は、塩、溶媒和物および水和物として存在し得、塩、溶媒和物および水和物として使用されてもよい]
を有する色素である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。 - 式BまたはDのR1および/またはR2が、H、重水素、アルキルまたは重水素置換C 1 -C 12 アルキル(アルキル基の1個、いくつかまたはすべてのH原子は、重水素原子によって交換されていてもよい)、4,6-ジハロ-1,3,5-トリアジニル(C3N3X2)(Xは、ハロゲンである)、2-、3-または4-アミノベンゾイル(COC6H4NH2)、N-[(2-、N-[(3-またはN-[(4-アミノフェニル)ウレイド基(NHCONHC6H4NH2)、N-[(2-、N-[(3-またはN-[(4-アミノフェニル)チオウレイド基(NHCSNHC6H4NH2、または一般式(CH2)m1COOR3、(CH2)m1OCOOR3(CH2)n1COOR3もしくは(CO)m1(CH2)m2(CO)n1(NH)n2(CO)n3(CH2)n4COOR3の結合カルボン酸残基およびその反応性エステル(整数m1、m2およびn1、n2、n3、n4は、独立して、それぞれ1~12および0~12の範囲であり、鎖(CH2)m/nは、直鎖状、分枝状、飽和、不飽和、部分もしくは完全重水素化であるおよび/またはN、OもしくはSを含有する炭素環もしくは複素環に含まれ、R3は、H、Dまたは求核反応性脱離基である)を表す、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 式A~Dの化合物が、
- Xは、ヒドロキシアルキル(CH 2 ) n OH、チオアルキル((CH 2 ) n SH)、カルボキシアルキル((CH 2 ) n CO 2 H)、スルホン酸アルキル((CH 2 ) n SO 3 H)、硫酸アルキル((CH 2 ) n OSO 3 H)、リン酸アルキル((CH 2 ) n OP(O)(OH) 2 )もしくはホスホン酸アルキル((CH 2 ) n P(O)(OH) 2 )(式中、nは、0~12の範囲の整数である)、またはそれらを含み、CH 2 基の1つまたは複数がCF 2 によって交換されていてもよい、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- キャピラリーゲル電気泳動システムの較正を含む、請求項7に記載の方法。
- 炭水化物とのコンジュゲートとして存在するアクリドンおよび/またはピレン系色素が、APTS、6-H、19および20、またはAPTS、6-Me、19および20、または15、6-Me、19および20、またはAPTS、15、19および20、またはAPTS、15、6-Meおよび20、またはAPTS、8-H、6-Meおよび19、またはAPTS、8-H、6-Meおよび20、またはAPTS、8-H、19および20、またはAPTS、23、19および20、またはAPTS、15、6-Meおよび19、またはAPTS、23、6-Meおよび19、またはAPTS、23、6-Meおよび20、または23、6-Me、19および20、またはAPTS、8-H、6-Me、20および19、またはAPTS、15、6-Me、20および19、またはAPTS、23、6-Me、20および19、またはAPTS、8-H、6-H、20および19、またはAPTS、15、6-H、20および19、またはAPTS、23、6-H、20および19の組合せから選択される、請求項7または12に記載の方法。
- 炭水化物混合組成物パターンを決定および/または同定するためのキットまたはシステムであって、不揮発性メモリを有するデータ処理ユニットを含み、前記メモリがデータベースを含有し、前記データベースが、炭水化物のアラインされた移動/保持時間および/またはアラインされた移動/保持時間の指標を含有し、前記移動/保持時間および/または移動/保持時間の指標が、請求項1の方法によって得られるキットまたはシステム。
- 自動化された炭水化物混合組成物パターンプロファイリングのためのキットまたはシステムであって、不揮発性メモリを有するデータ処理ユニットを含み、前記メモリがデータベースを含有し、前記データベースが、炭水化物のアラインされた移動/保持時間および/またはアラインされた移動/保持時間の指標を含有し、前記移動/保持時間および/または移動/保持時間の指標が、請求項2の方法によって得られるキットまたはシステム。
- 式AおよびBの化合物が以下の式の化合物
から選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。 - 標準組成物が用いられ、前記標準組成物が、炭水化物、DNA塩基対ラダーまたは核酸塩基標準であって、これらは、式AまたはBによる蛍光色素で標識されたもので構成されている、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光色素が、式CもしくはDの色素または式A~Dの異なる色素である、請求項17に記載の方法。
- 蛍光色素が、請求項10に記載された、6-H、6-Me、8-R、15、13a、13b、16、18、23および23bから選択される少なくとも1種の色素である、請求項17または18に記載の方法。
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