JP7464277B2 - 心血管疾患のリスクを評価するための方法、ならびに心血管疾患の治療または予防における使用のための方法および化合物 - Google Patents

心血管疾患のリスクを評価するための方法、ならびに心血管疾患の治療または予防における使用のための方法および化合物 Download PDF

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Description

発明の属する技術分野
本発明は、ヒト対象における心血管疾患または心筋梗塞のリスクを評価するための方法に関し、特に、朝の早い時間における心血管疾患または心筋梗塞のリスクを評価するための方法に関する。本発明はまた、心血管疾患または心筋梗塞のリスクを減少させるための予防的処置の効力を評価するための方法を提供する。さらに、本発明は、心血管疾患または心筋梗塞、特に早朝に起こる心血管疾患または心筋梗塞を治療または予防する方法、およびそのような方法で使用するための化合物を提供する。
発明の背景
サーカディアン（Ｃｉｒｃａｄｉａｎ、２４時間周期）のメカニズムは、心臓血管機能と免疫システムを含む多くの生理機能を制御するために中心的なものである（Ｉｎｇｌｅ ＫＡら、Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｍａｌ１ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｄｉａｓｔｏｌｉｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ， ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｒｅｓｐｏｎｓｅ， ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ、．２０１５；３０９（１１）：Ｈ１８２７－１８３６； ＭｃＡｌｐｉｎｅ ＣＳ ＆ Ｓｗｉｒｓｋｉ ＦＫ、Ｃｉｒｃａｄｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．、２０１６；１１９（１）：１３１－１４１）。
これらの基本的なメカニズムに対する障害は、心血管障害および代謝障害を含む、調節不全の炎症応答によって特徴付けられる多くの疾患の原因であると考えられている（Ｉｎｇｌｅ ＫＡら、２０１５； ＭｃＡｌｐｉｎｅ ＣＳ ＆ Ｓｗｉｒｓｋｉ ＦＫ， ２０１６； Ｐｕｔｔｏｎｅｎ Ｓら、Ｉｓ ｓｈｉｆｔ ｗｏｒｋ ａ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ？ Ｔｈｅ Ｆｉｎｎｉｓｈ Ｐｕｂｌｉｃ Ｓｅｃｔｏｒ ｓｔｕｄｙ．、Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ．、２０１０；６９（４）：７７９－７８０）。
サーカディアン（Ｃｉｒｃａｄｉａｎ、２４時間周期）の応答は、心筋梗塞を含むいくつかの炎症状態と相関している（Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｋら、Ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｄ１ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｉｎｆａｒｃｔ Ｓｉｚｅ Ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－Ｋｉｎａｓｅ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｂ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５；６６（１）：７２－７９； Ｋａｉｎ Ｖら、Ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｄ１ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｔ ｓｐｌｅｎｉｃ ａｎｄ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｓｉｔｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．、Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．、２０１５；８４：２４－３５）。
血管系において、血小板活性化は、ＣＤ６２Ｐを含むいくつかの活性化マーカーのアップレギュレーションを伴って、１日の早い時間の間に最大である（Ｓｃｈｅｅｒ ＦＡら、Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃａｕｓｅｓ ｇｒｅａｔｅｓｔ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｒｎｉｎｇ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｂｅｈａｖｉｏｒｓ。ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（９）；ｅ２４５４９）。
この血小板活性化の増加は、プラズマ・プラスミノーゲンアクティベーター阻害因子－１、組織プラスミノーゲンアクティベーターの主要阻害因子として機能するセリンプロテアーゼ阻害剤およびウロキナーゼの増加と同時に起こっており、その結果、血栓症のリスクが高まっている（Ｓａｋａｔａ Ｋら、 Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－１ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｖａｓｏｓｐａｓｔｉｃ ａｎｇｉｎａ．、Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ．、１９９２；１２４（４）：８５４－８６０）。
血小板ＣＤ６２Ｐは、血小板と白血球の相互作用を媒介する。このプロセスは、血管内皮への白血球の動員を促進することに加えて、白血球の活性化とシステイニルロイコトリエン（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ Ｍら、Ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｒｏｎｃｈｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｈａｌｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｄ１．、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４；３０７（１０）：Ｌ７４６－７５７）、腫瘍壊死因子－αおよびＣ－Ｃモチーフリガンド－２（Ｆｕｒｍａｎ ＭＩら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ａｒｅ ａｎ ｅａｒｌｙ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．、Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．、２００１；３８（４）：１００２－１００６； Ｐｆｌｕｅｃｋｅ Ｃら、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ａｎｄ ＣＤ１１ｂ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ａｔｒｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ．、Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｃａｒｄｉｏｌ．、２０１６；１０５（４）：３１４－３２２）を含む炎症性メディエーターの産生にも関与する、ＣＤ６２Ｐは、フラクタルカインを発現する内皮細胞への血小板接着を増強し、内皮細胞におけるバイベル・パラーデ小体の放出を誘発し、１日の初期の時間中に炎症誘発性および血栓形成促進性状態を永続させる。
血小板－白血球凝集はまた、アテローム性動脈硬化症を含む血管疾患の病因に関係している（Ｈｕｏ Ｙら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ．、Ｎａｔ Ｍｅｄ．、２００３；９（１）：６１－６７）。
一方、血小板活性化因子（ＰＡＦ）は、血管炎症の増殖において報告された役割を有する（Ｐａｌｕｒ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ ＡＶら、Ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ？ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｔｈｅｒ．、２０１７；３５（１）：６４－７０）。
これらの観察は、健康な個体において、内因性の日周調節された保護機構が関与しており、この生理学的炎症を逆調節して血管炎症および血栓形成を防ぐことを示唆している。
進行中の炎症を終結させるために、宿主が関与するメカニズムを調査する研究は、間質および白血球応答の両方を再プログラムする白血球により産生される分子の新しい属を明らかにした。（Ｄａｌｌｉ Ｊら、Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ １３－ｓｅｒｉｅｓ ｒｅｓｏｌｖｉｎｓ ｔｈａｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ ａｎｄ ｃｌｅａｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ｎａｔ Ｍｅｄ．、２０１５；２１（９）：１０７１－１０７５；Ｄａｌｌｉ Ｊら、Ｎｏｖｅｌ ｎ－３ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｏｌｖｅｎｔｓ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ａｃｔｉｏｎｓ．、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．、２０１３；３：１９４０； Ｆｒｅｄｍａｎ Ｇら、Ａｎ ｉｍｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｐｒｏ－ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ．、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１６；７：１２８５９；Ｓｅｒｈａｎ ＣＮ． Ｔｒｅａｔｉｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ２１ｓｔ ｃｅｎｔｕｒｙ： ｎｅｗ ｈｉｎｔｓ ｆｒｏｍ ｄｅｃｏｄｉｎｇ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、２０１７；Ｅｌ Ｋｅｂｉｒ Ｄら、Ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｅ１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、２０１２；１０９（３７）：１４９８３－１４９８８；Ｚｈａｎｇ ＭＪら、Ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｄ２ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｐｏｓｔｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｗｈｉｌｅ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．、２０１６；１３４（９）：６６６－６８０）。これらの分子は、特殊なプロ分解メディエーター（ｓｐｅｃｉａｌｉｓｅｄ ｐｒｏ－ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）（ＳＰＭ）と呼ばれ、必須脂肪酸の酵素的変換によって生成され、リポキシン、レゾルビン、プロテクチン、およびマレシンの４つのファミリーに分類される（Ｓｅｒｈａｎ ＣＮ， ２０１７）。
ＳＰＭの構造は、被嚢類、マウスおよびヒヒならびにヒトを含む進化を通して保存され、実験系においてなされた知見のヒトへの直接翻訳およびその逆を容易にすることが見出されている。
ＳＰＭは、免疫応答を妨害することなく、サイトカインおよびエイコサノイドを含む炎症誘発性メディエーターの産生を積極的に逆制御し、無菌および感染性の両方のチャレンジ後の白血球輸送および表現型を制御する（Ｄａｌｌｉ Ｊら、２０１５；Ｄａｌｌｉ Ｊら、２０１３；Ｆｒｅｄｍａｎ Ｇら、２０１６；Ｓｅｒｈａｎ ＣＮ．、２０１７；Ｅｌ Ｋｅｂｉｒ Ｄら、 ２０１２；Ｚｈａｎｇ ＭＪら、２０１６；Ｄｏｎａ Ｍら、全血中のＥＰＡ由来メディエーターである、Ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｅ１は、白血球および血小板を選択的に逆調節する（Ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｅ１， ａｎ ＥＰＡ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｉｎ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ， ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｎｔｅｒ－ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）、Ｂｌｏｏｄ．、２００８；１１２（３）：８４８－８５５）。
末梢器官における生物学的作用を有することに加えて、証拠は、これらの分子が、血管系において生じるプロセスを調節し得ることを示す（Ｚｈａｎｇ ＭＪら、２０１６；ＣｈａｔｔｅｒｊｅｅＡら、プロ分解（ｐｒｏ－ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）脂質メディエーター、マレシン１（ＭａＲ１）は、血管平滑筋および内皮細胞における炎症性シグナル伝達経路を弱める（Ｔｈｅ ｐｒｏ－ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｍａｒｅｓｉｎ １（ＭａＲ１） ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．、２０１４；９（１１）：ｅ１１３４８０）。この文脈において、エイコサペンタエン酸由来のレゾルビン（ＲｖＥ１）は、血小板活性化を強力に調節する（Ｄｏｎａ Ｍら、２００８）；マレシン（ＭａＲ）１およびＲｖＤ２は、新生内膜過形成（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）に対して保護する（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ Ａら、２０１４；Ａｋａｇｉ Ｄ，、Ｃｈｅｎ Ｍ，Ｔｏｙ Ｒ，Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ Ａ、ＣｏｎｔｅＭＳ．、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｄ２ ａｎｄ ｍａｒｅｓｉｎ １ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｉｎｔｉｍａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ ｉｎ ｍｉｃｅ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、２０１５；２９（６）：２５０４－２５１３）；ＲｖＤ１は、マウスアテローム性動脈硬化症におけるプラーク安定性を促進する（ＲｖＤ１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｌａｑｕｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ）（Ｆｒｅｄｍａｎ Ｇら、２０１６）。さらに、血漿ＳＰＭ濃度は、敗血症における転帰を反映することが報告されており（Ｄａｌｌｉ Ｊら、Ｈｕｍａｎ Ｓｅｐｓｉｓ Ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ： Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ Ｗｉｔｈ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ．、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．、２０１７；４５（１）：５８－６８）、女性における血漿ＳＰＭの増加は、雄と比較した場合、チャレンジ後の内皮機能の改善と関連している（Ｒａｔｈｏｄ ＫＳら、Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ ｓｅｘ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、２０１７；１２７（１）：１６９－１８２）。
プロ分解メディエーターは、血管系において主に白血球において発現される酵素による必須脂肪酸の立体選択的変換を介して産生される。例えば、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン生合成経路は、白血球１５－リポキシゲナーゼ（１５－ＬＯＸ）によって触媒される１７Ｓ－ヒドロペルオキシ－ドコサペンタエン酸へのｎ－３ ＤＰＡの変換によって開始され、続いて白血球５－ＬＯＸによってＲｖＤ n-3 DPAへの変換が起こる（Ｄａｌｌｉ Ｊら、２０１３）。
組織プロ分解促進メディエーター生合成はまた、神経伝達物質アセチルコリン（ＡＣｈ）の放出を介して、迷走神経（ｖａｇｕｓ ｎｅｒｖｅ））によって調節され、これは、組織分解トーン（ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｏｎｅ）を維持する際に中心的である機構である（Ｄａｌｌｉ Ｊら、Ｖａｇａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒｏｕｐ ３ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｏｌｖｅｎｔ ＰＣＴＲ１ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１７；４６（１）：９２－１０５）。
ｎ－３ ＤＰＡは、血小板凝集の阻害剤として特徴付けられている（Ａｋｉｂａ Ｓら、ドコサペンタエン酸誘導性血小板凝集阻害におけるリポキシゲナーゼ経路の関与（Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ、２０００；２３：１２９３－１２９７；Ｍｕｒｐｈｙ ＭＧら、メンハーデン魚油、アザラシ油、またはサメ肝油に富む食餌は、モルモットの心臓の脂質および脂肪酸組成に明確な効果を有する（Ｄｉｅｔｓ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｉｎ ｍｅｎｈａｄｅｎ ｆｉｓｈ ｏｉｌ，ｓｅａｌ ｏｉｌ， ｏｒ ｓｈａｒｋ ｌｉｖｅｒ ｏｉｌ ｈａｖｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ａｎｄ ｆａｔｔｙ－ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ｈｅａｒｔ）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９７；１７７：２５７－２６９；Ｍｕｒｐｈｙ ＭＧら、食餌性メナデン、アザラシ、およびトウモロコシ油は、モルモットにおける脂質およびｅｘ ｖｉｖｏエイコサノイドおよびチオバルビツール酸反応性物質の生成に異なる影響を及ぼす（Ｄｉｅｔａｒｙ ｍｅｎｈａｄｅｎ，ｓｅａｌ，ａｎｄ ｃｏｒｎ ｏｉｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔ ｌｉｐｉｄ ａｎｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ ａｎｄ ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ）、Ｌｉｐｉｄｓ、１９９９；３４：１１５－１２４）および 血管内皮細胞増殖因子受容体２の発現抑制因子として作用する血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｗｈｅｒｅ ｉｔ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、、Ｔｓｕｊｉ Ｍら、ドコサペンタエン酸（２２：５，ｎ‐３）は血管内皮増殖因子により誘導された内皮細胞におけるチューブ形成活性を抑制した（Ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ （２２：５，ｎ－３） ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｔｕｂｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔ． Ａｃｉｄｓ． ２００３；６８：３３７－３４２）。
さらに、最近のデータは、肺高血圧のモデルにおけるｎ－３ ＤＰＡの抗炎症効果（Ｍｏｒｉｎ Ｃら、Ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｎｏａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２０１４；３０７：Ｈ５７４－Ｈ５８６）および関節炎（Ｍｏｒｉｎ Ｃら、Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ ａｒｅ ｍｏｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ｔｈａｎ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｎｏ－ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｏ ｒｅｓｏｌｖｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｍｏｄｅｌ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ． Ｔｈｅｒ．、２０１５；１７：１４２）および結腸癌細胞における抗増殖効果（Ｍｏｒｉｎ Ｃら、Ａｎｔｉ－ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｎｏａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔ． Ｅｓｓｅｎｔ． Ｆａｔ． Ａｃｉｄｓ．、２０１３；８９：２０３－２１３）を示している。
本発明の目的は、患者が心筋梗塞を含む心血管疾患の危険性があるかどうかを評価するための方法を提供することである。特に、本発明の目的は、特に早朝に、血小板および／または白血球活性化の制御が不適切であるために、患者が心血管疾患の危険性があるかどうかを評価するための方法を提供することである。
本発明の別の目的は、心筋梗塞を含む心血管疾患の予防的治療、特に心血管炎症を減少させることを目的とする治療の効力を評価するための方法を提供することである。
本発明の別の目的は、心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）を含む心血管疾患、特に、血小板および／または白血球活性化の不適切な日周制御によって仲介される心血管疾患を治療または予防のための方法、およびそのような方法に使用される化合物、を提供することである。
発明の概要
以下の実施例１および９に開示されるように、脂質メディエータープロファイリングおよび健康なボランティアを使用して、早朝の時間（例えば、午前７時と９時との間）にピークに達する特定のＤシリーズレゾルビンにおける日周変化が発見された。以下の実施例５および１３に開示されるように、心筋梗塞の危険性がある患者由来の血漿の脂質メディエータープロファイリングは、末梢血血小板および白血球の増加した活性化に関連するｎ－３ ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）由来のレゾルビンの減少を実証した。
実施例３、５、１１および１３に開示されるように、患者の末梢血と、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンとのインキュベーションは、細胞活性化を有意に減少させた。さらに、実施例６および１４に開示されるように、アポリポタンパク質Ｅ欠損マウスへの、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの投与は、血小板－白血球凝集および血管疾患を有意に減少させた。
脂質メディエータープロファイリングと健常ボランティアを用いて、血漿ｎ‐３ドコサペンタエン酸由来のＤ系列レゾルビン（ＲｖＤn-3 DPA）濃度が日周性に選択的に調節されることを見出した。心筋梗塞の危険性がある患者の血漿の脂質メディエータープロファイリングでは、５－リポキシゲナーゼ発現の低下および全身アデノシン濃度の上昇と関連するＲｖＤn-3 DPAの低下が実証された。また、血漿ＲｖＤn-3 DPAと、ＣＤ６３およびＣＤ１１ｂを含む、血小板、単球および好中球活性化のマーカーとの間に、有意な負の相関を認めた。健常ボランティアおよび心血管疾患の患者の末梢血と、ＲｖＤn-3 DPAをインキュベートすると、血小板および白血球活性化が有意かつ用量依存的に減少した。さらに、アポリポ蛋白質Ｅ欠損マウスへのＲｖＤ５n-3 DPAの投与は、血小板‐白血球凝集、血管トロンボキサンＢ２濃度および大動脈病変を有意に低下させた。
これらの結果は、末梢血ＲｖＤn-3 DPAが、ヒトにおいて日周性に調節され、これらのメディエータの産生における調節不全が、心血管疾患を引き起こす可能性があることを示している。
したがって、本発明は、血小板および／または白血球活性化の概日制御（ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）における機能不全によって媒介および／または悪化される疾患または状態を診断、処置または予防するための、およびこのような疾患または状態を処置または予防するための医薬の効力を評価するための、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの使用に関する。このような疾患および状態には、冠状動脈疾患、血管炎症および心筋梗塞を含む心血管疾患が含まれるが、これらに限定されない。
したがって、本発明の一態様によれば、心血管疾患を治療または予防する方法において使用するための、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンが提供される。
本発明によれば、治療有効量の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを、心血管疾患に罹患しているか、または心血管疾患のリスクがある患者に投与することができる。
したがって、本発明の別の態様によれば、治療有効量の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを、それを必要とする対象に投与することを含む、心血管疾患を治療または予防する方法が提供される。本発明はさらに、それを必要とする対象における、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの生合成、発現または活性をアップレギュレートすることを含む、心血管疾患を治療または予防する方法を包含する。特に、本発明は、それを必要とする対象におけるアデノシン活性または発現を減少させること、および／またはそれを必要とする対象における、５－ＬＯＸおよび／または１５－ＬＯＸの活性または発現を増加させることを含む、心血管疾患を治療または予防する方法を提供する。
本発明によれば、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを対象に投与し、および／またはｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの生合成、発現または活性がアップレギュレートされ、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン血漿濃度のピークが、以下により詳細に記載されるように、朝の早い時間、少なくとも約午前７時～午前９時の間に達成されるようにする。
本明細書中で使用される場合、「心血管疾患」は、冠動脈性心疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ）、卒中および一過性虚血発作、末梢動脈疾患および大動脈疾患を含む。冠動脈性心疾患には、狭心症、心筋梗塞および心不全が含まれる。大動脈疾患には、大動脈瘤が含まれる。
従って、別の局面において、本発明は、治療有効量の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを、それを必要とする対象に投与することによって、および／または、それを必要とする対象における少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの生合成、発現または活性をアップレギュレートすることによって、例えば、対象におけるアデノシン活性または発現レベルを減少させることによって、および／または５－ＬＯＸおよび／または１５－ＬＯＸの活性または発現レベルを増加させることによって、全身性炎症および／または心筋梗塞を処置または予防する方法を包含する。
さらに別の局面において、本発明は、治療有効量の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを、それを必要とする対象に投与することによって、および／またはそれを必要とする対象における少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの生合成、発現または活性をアップレギュレートすることによって、例えば、アデノシン活性または発現レベルを減少させることによって、および／または対象における５－ＬＯＸおよび／または１５－ＬＯＸの活性または発現レベルを増加させることによって、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの機能不全の日周調節を処置することを包含する。
好適には、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを対象に投与し、かつ／または、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの生合成、発現または活性を、ｔmaxが朝の早い時間に起こるように、本発明に従い、対象においてアップレギュレートする。作用の持続時間は、朝の早い時間、例えば、少なくとも午前７時の早い時間から少なくとも午前９時まで延長すべきである。作用の開始は、約午前５：３０～７時の間に生じ得る。作用の停止は、約午前９～１０：３０時の間で起こり得るが、いくつかの実施形態において、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンが送達のためにどのように製剤されるかに依存して、より長い期間にわたって吸収され続け得る。作用の持続時間は、少なくとも９０分、好ましくは少なくとも２時間であるべきである。いくつかの実施形態では、作用の持続時間は、３時間、４時間以上までであってもよい。
１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、即時放出として製剤され得る。
あるいは、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、上記のように、作用の持続時間が朝の早い時間にわたって延長するように、遅延放出および／または制御放出のために製剤され得る。
したがって、いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、対象が寝る前に剤形を服用することができ、１つまたは複数のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの放出が、朝の早い時間まで遅延または実質的に遅延されるように、遅延放出剤形として製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの血漿レベルが、朝の早い時間を通して最小有効濃度（ＭＥＣ）を超えたままであるように、制御放出のために製剤され得る。
いくつかの実施形態において、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、遅延放出および制御放出のために製剤され得る。
適切には、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、朝の早い時間を通して、少なくとも１０ｐｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１５ｐｇ／ｍＬまたは２０ｐｇ／ｍＬの１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのピーク血漿濃度を提供するように処方され得る。
１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、心血管疾患を処置または予防するための薬剤のための任意の許容される投与様式を介して投与され得るが、経口、舌下、静脈内、鼻腔内、局所、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内または直腸を含み、経口投与が、いくつかの実施形態において好ましい場合がある。
ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、それらのヒドロキシ基のために高度に可溶性である。当業者は、所望の血漿薬物濃度－時間プロフィールを達成するために、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの即時、遅延または制御放出のための多数の適切な処方物を知っている。適切な製剤および剤形の簡単な詳細を以下に記載する。有利には、本発明による対象への、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの投与は、血小板および／または白血球、特に単球の活性化の減少をもたらし得る。血小板および白血球細胞の活性化は、例えば、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ４１のような、当業者に公知の活性化マーカーを参照することによって測定され得る。
したがって、本発明のさらに別の態様では、治療有効量の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを投与することを含む、それを必要とする対象における血小板および／または白血球の活性化を制御する方法が提供される。
有利には、本発明による対象へのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの投与は、血小板－白血球凝集体の形成の減少をもたらし得る。
従って、さらに別の局面において、本発明は、それを必要とする対象における血小板－白血球凝集体の形成を減少させる方法であって、治療有効量の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを投与すること、および／または、例えば、アデノシン活性もしくは発現レベルを減少させることによって、および／または対象における５－ＬＯＸおよび／もしくは１５－ＬＯＸの活性もしくは発現レベルを増加させることによって、それを必要とする対象における少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの生合成、発現または活性をアップレギュレートすることを含む方法を提供する。
本発明に従って使用するためのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、オメガ－３ドコサペンタエン酸（ｎ－３ ＤＰＡ）に由来する。
いくつかの実施形態において、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、以下の式Ｉで表される、ＲｖＤ１n-3 DPA（７，８，１７－トリヒドロキシ－９，１１，１３，１５Ｅ，１９Ｚ－ドコサペンタエン酸）であってよい：
いくつかの実施形態において、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、以下の式ＩＩで表される、ＲｖＤ２n-3 DPA（７，１６，１７－トリヒドロキシ－８，１０，１２，１４Ｅ，１９Ｚ－ドコサペンタエン酸）であってよい
いくつかの実施形態において、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、以下の式ＩＩＩで表される、ＲｖＤ５n-3 DPA（７，１７－トリヒドロキシ－８Ｅ，１０，１３，１５Ｅ，１９Ｚ－ドコサペンタエン酸）であってよい：
いくつかの実施形態では、２つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを対象に投与することができる。特に、２つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの組み合わせを使用することができる。適切には、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、全てｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンであってもよい。
いくつかの実施形態では、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、例えば、ＤＨＡ由来のレゾルビンを含むレゾルビンなどの１つ以上の他の脂質メディエーターを含む１つ以上の他の活性剤、および／または、例えば、対象における、アデノシンの発現もしくは活性を減少させることによって、および／または、５－ＬＯＸおよび／もしくは１５－ＬＯＸの活性もしくは発現を増加させることによって、１つ以上のｎ－２ ＤＰＡ由来のレゾルビンの生合成、発現または活性を増加させることができる１つ以上の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、２つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを対象に同時に投与することができる。あるいは、２つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを、別々にまたは連続的に対象に投与してもよい。
１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤と共に処方され得る。
したがって、本発明のさらに別の態様では、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンおよび１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適切である賦形剤をいう。
上記のように、本発明の医薬組成物は、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの即時放出、遅延放出または制御放出のために処方され得、所望の投薬レジメンに従って、朝の早い時間における対象の血液中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのピーク血漿濃度を提供する。
本発明の医薬組成物または製剤は、例えば、錠剤、カプセル、粉末、液体、懸濁液、坐剤およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体およびエアロゾル剤形を含む。
１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、単独で、または医薬担体もしくは賦形剤（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、クロスカルメロースナトリウム、グルコース、ゼラチン、スクロースまたは炭酸マグネシウム）と組み合わせて投与され得る。所望であれば、医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤などの非毒性補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンアセテートまたはトリエタノールアミンオレエート）を少量含有してもよい。
一般に、意図される投与様式に応じて、医薬組成物は、約０．００５重量％～９５重量％、いくつかの実施形態では、約０．５重量％～５０重量％の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを含有してもよい。このような投薬形態を調製する方法は、当業者に公知であるか、または明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（以下で完全に参照する）を参照のこと。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、丸剤または錠剤の形態をとることができ、したがって、組成物は、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンと共に、例えば、ラクトース、スクロースまたはリン酸二カルシウムなどの希釈剤；例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；および例えば、デンプン、アラビアゴム、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、セルロースまたはセルロース誘導体などの結合剤を含有することができる。本発明による別の固体投薬形態において、粉末、マルメ（ｍａｒｕｍｅ）、溶液または懸濁液（例えば、炭酸プロピレン、植物油またはトリグリセリド中）は、ゼラチンカプセル中にカプセル化され得る。
薬学的に投与可能な液体組成物は、例えば、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンおよび任意の医薬アジュバントを担体（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコールまたはエタノール）に溶解または分散させて、溶液または懸濁液を形成することによって調製することができる。注射剤は、従来の形態で、液体溶液または懸濁液として、エマルジョンとして、または注射前に液体中に溶解または懸濁するのに適した固体形態で調製することができる。このような非経口組成物に含まれる１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのパーセンテージは、その特定の性質、ならびに化学物質の活性および対象の必要性に依存し得る。しかしながら、溶液中の０．０１％～１０重量％の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのパーセンテージを使用することができ、組成物が固体であり、続いて上記パーセンテージに希釈される場合、より高くてもよい。特定の実施形態では、組成物は、溶液中に約０．２～２重量％の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを含むことができる。
本明細書中に記載される１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの医薬組成物はまた、単独で、または不活性の担体（たとえば、ラクトース）と組み合わせて、ネブライザーのためのエアロゾルもしくは溶液として、または吹送のための微細粉末として、気道に投与され得る。そのような場合、医薬組成物の粒子は、５０ミクロン未満、特定の実施形態では１０ミクロン未満の直径を有する。
一般に、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、類似の有用性を果たす薬剤について許容される投与様式のいずれかによって、治療有効量で投与され得る。化学物質、すなわち活性成分の実際の量は、例えば、治療される疾患の重症度、対象の年齢および相対的健康、使用される化学物質の効力、投与経路および形態、ならびに他の因子などの多くの因子に依存し得る。
適切には、医薬組成物は、１日に１回または２回以上投与することができる。
本明細書に記載される化学物質の治療有効量は、対象の体重１ｋｇ当たり、１日当たり、約０．０１～２００ｍｇ；例えば、約０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ／日；例えば、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得る。７０ｋｇ～１００ｋｇのヒトへの投与のために、投薬範囲は、１日あたり約０．５～３５００ｍｇであり得る。
一般に、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、以下の経路：経口、全身（たとえば、経皮、鼻腔内、または坐剤）または非経口（たとえば、筋肉内、静脈内、または皮下）投与のいずれか１つによって、医薬組成物として投与され得る。
いくつかの実施形態では、経口投与を使用することができる。
組成物は、錠剤、ピル、カプセル、半固体、粉末、徐放性製剤、溶液、懸濁液、エリキシル、エアロゾルまたは任意の他の適切な組成物の形態をとることができる。提供される化学物質を投与するための別の方法は、吸入である。
製剤の選択は、薬物投与の様式および薬物物質のバイオアベイラビリティなどの様々な要因に依存する。吸入による送達のために、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを、液体溶液、懸濁液、エアロゾル噴射剤または乾燥粉末として処方し、投与のために適切なディスペンサーに装填することができる。
いくつかのタイプの医薬吸入デバイス、ネブライザー吸入器、定量吸入器（ＭＤＩ）および乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）がある。ネブライザーデバイスは、高速空気流を生成し、この高速空気流は、治療薬（液体形態で処方される）を霧として噴霧させ、この霧は、対象の気道に運ばれる。ＭＤＩは、典型的には、圧縮ガスで包装された製剤である。作動時に、装置は、圧縮ガスによって測定された量の治療薬を放出し、したがって、設定された量の薬剤を投与する信頼できる方法を提供する。ＤＰＩは、デバイスによる呼吸中に対象の吸気流中に分散させることができる易流動性粉末の形態で治療薬を分配する。易流動性粉末を得るために、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを、ラクトースなどの賦形剤と共に製剤化することができる。測定された量の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、カプセル形態で保存され得、そして各作動で分配され得る。
本発明の医薬組成物は、一般に、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを含む。許容される賦形剤は、非毒性であり、投与を補助し、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの治療上の利益に悪影響を及ぼさない。このような賦形剤は、任意の固体、液体、半固体であってもよく、またはエアロゾル組成物の場合、当業者に一般に利用可能な気体賦形剤であってもよい。
固形医薬賦形剤には、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウムおよび乾燥脱脂乳が含まれる。液体および半固体賦形剤は、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、ならびに種々の油（石油、動物、植物または合成起源のもの（たとえば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）から選択され得る。注射用溶液のための液体担体には、水、生理食塩水、水性デキストロースおよびグリコールが含まれる。
圧縮ガスを使用して、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンをエアロゾル形態で分散させることができる。この目的に適した不活性ガスは、窒素、二酸化炭素などである。他の適切な医薬賦形剤およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，編者Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１８ｔｈ ｅｄ．，１９９０）に記載されている。
医薬組成物中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの量は、当業者によって使用される全範囲内で変動し得る。典型的には、組成物は、重量パーセント（重量％）基準で、全組成物に基づいて、１つ以上の適切な医薬賦形剤とバランスを取って、約０．０１～９９．９９重量％の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、約１～８０重量％のレベルで存在する。
上記のように、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの作用持続時間が早朝、少なくとも７時～９時の間に生じるように、遅延または制御放出投薬形態で、対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、遅延放出または制御放出剤形は、剤形の投与と作用の開始との間に十分な遅延を提供して、対象が就寝する前の夕方、例えば午後９時から午後１１時の間に剤形を服用することを可能にし、作用の開始は、朝の早い時間、例えば午前５時以降に起こる。
適切な遅延または制御放出投薬形態は、所定の速度での長期および／または時限のパルス投与のための、デポー注射、浸透圧ポンプ、丸剤、経皮（電気輸送を含む）パッチなどを含む。
特定の実施形態において、組成物は、正確な用量の単回投与に適切な単位投薬形態で提供され得る。
いくつかの実施形態では、放出相が続く、第１の遅相を含む放出および血漿プロフィールを提供するように設計された、経口遅延または制御放出剤形を使用することができる。放出プロフィールは、Ｓ字状であってもよい。このようなプロフィールを提供することによって、投薬形態は、１日１回服用される場合、時限的な（ｔｉｍｅｄ）、延長された治療効果を提供し得る。
適切な遅延または制御放出剤形は、カプセルまたはビーズを含有する液体またはゲル懸濁液の形態で、投与することができる単一ビーズを含むことができる。
いくつかの実施形態では、ビーズは、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン、賦形剤、および、所望により超崩壊剤またはオスマジェントを含む、薬物含有コアを有するビーズ構造を有してもよい。コアは、例えば、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン、崩壊剤、オスマジェントまたは細孔形成剤、および結合剤を含み得る。
複数のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンが対象に投与される実施形態では、各ビーズに、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの単一種を好都合に装填することができる。いくつかの実施形態では、これは、異なるｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの相対比率を制御し得る。
例示的なコアは、約２０～２５重量％のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン、約４５～６０重量％の微結晶セルロース、約１０～３０重量％の塩化カリウム、および約３～５重量％の結合剤（たとえば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルセルロース）を含み得る。
薬物含有コアは、湿式造粒、押出、および球状化（ｓｐｈｅｒｏｎｉｓａｔｉｏｎ）を含む、当技術分野で公知の様々なプロセスによって作製することができる。
いくつかの実施形態では、２つの層；持続放出層としての第１の中間層、および、所望によりｐＨ依存性である、遅延放出層としての外層が、コアを覆ってもよい。
いくつかの実施形態では、コアは、不活性な非パレイルビーズ（ｎｏｎ－ｐａｒｅｉｌ ｂｅａｄ）であってもよい。内部コアは、糖およびデンプンのビーズであってもよく、または微結晶セルロースから構成されていてもよい。コアビーズを形成するのに適し、薬学的に許容される任意の球状ビーズを使用することができる。このような実施形態では、コアの１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンおよび賦形剤をコアビーズ上に層状にして、３層製剤を提供することができる。最外層は、遅延放出または腸溶コーティングであってもよい。特定の実施形態では、最外層は、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、可塑剤および潤滑剤を含むことができる。薬物放出の遅延時間は、水溶性および不溶性ポリマーの比、可塑剤濃度、潤滑剤の量、およびコーティング重量増加（３５～４５重量％までであり得る）によって制御され得る。あるいは、最外層は、約５．５を超えるｐＨで溶解するｐＨ依存性ポリマーであってもよい。
徐放層は、層が水性環境に曝露された後、８～１０時間までの期間にわたって増加する、より遅い初期放出速度を提供するように設計される。薬物プロフィールの増大は、経時的に、より透過性になる膜によって達成することができる。徐放層の例は、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、可塑剤および潤滑剤を含む。薬物放出の速度は、水溶性および水不溶性ポリマーの比を変化させることによって、およびコーティングの厚さを約１５～４５重量％増まで変化させることによって、制御または持続され得る。
代替の実施形態では、超崩壊剤または浸透剤を含む膨潤性層が、コアと徐放層との間に配置されてもよい。
いくつかの実施形態では、制御または遅延放出剤形は、複数の層を含んでもよい。剤形は、非パレイルビーズの内部コア、および、内部から外部への４つの同心層（膨潤ポリマー層、薬物層、持続放出層、およびｐＨ依存性遅延放出層（ｐＨ依存性層であり得る））を含み得る。
いくつかの実施形態では、４層組成物は、段階的な様式で作製されてもよい。第１の工程では、結合剤と、エタノール中で懸濁された親水性ポリマーを、非パレイルビーズ上に３０～５０重量％の増加までコーティングする。いくつかの実施形態において、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙによって市販されているＰｏｌｙＯｘ Ｃｏａｇｕｌａｎｔ ＳＦＰ （ＰＥＯ）は、親水性ポリマーであり得、そしてヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ ＬＦ）は、結合剤として添加され得る。次に、ＰｏｌｙＯｘ層を、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標）ＥＦなどのヒドロキシプロピルセルロースで、１０重量％増まで密封することができる。次いで、活性医薬成分（ＡＰＩ）をバインダーと共にエタノール中に懸濁させ、層状ビーズ上にコーティングし、そして、徐放性および遅延放出性コーティングを本明細書に記載のように適用することができる。
いくつかの実施形態では、コアは、ビーズではなく、ミニタブレットを含んでもよい。コアおよび層は、任意の不活性コアがないことを除いて、ビーズ上の層と機能的に同じであってもよい。
種々の水溶性ポリマーを、遅延または制御放出剤形で使用することができる。このようなポリマーには、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、エチレンオキシド－プロピレンオキシドコポリマー、ポリエチレン－ポリプロピレングリコール（たとえば、ポロキサマー）、カルボマー、ポリカルボフィル、キトサン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなヒドロキシアルキルセルロース、ナトリウム カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボマーのようなポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリホスファジン、ポリオキサゾリジン、ポリヒドロキシアルキルカルボン酸、カラギネート アルギネート（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｔｅ ａｌｇｉｎａｔｅｓ）、アルギン酸アンモニウムおよびアルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸およびその誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、多糖類、カルボキシポリメチレン、ポリエチレングリコール、グアーガム、アカシアガム、トラガカントガム、カラヤガムおよびキサンタンガムのような天然ガム、ポビドン、ゼラチンなどが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、少なくとも遅延放出層は、アクリル酸ポリマー、アクリル酸コポリマー、メタクリル酸ポリマーまたはメタクリル酸コポリマーのような１またはそれ以上のポリマーを含み、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００－５５、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ３０－５５、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）５１００、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）４１３５Ｆ、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳ、アクリル酸およびメタクリル酸コポリマー、メチルメタクリレート、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、メタクリル酸アルキルアミンコポリマー、ポリメチルメタクリレート、ポリメタクリル酸無水物、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸無水物および グリシジルメタクリレートコポリマー、エチルセルロース、メチルセルロースなどのアルキルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、およびセルロースアセテートトリマレート、ポリビニルアセテートフタレート、ポリエステル、ワックス、シェラック、ゼインなどの特定の置換セルロースポリマーを含むが、これらに限定されない。
オイドラギットは、制御放出用途に有用な周知のポリマーおよびコポリマーである。腸溶コーティング用のＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）グレードは、メタクリル酸およびメタクリレートのアニオン性ポリマーに基づく。それらは、官能基として－ＣＯＯＨを含有する。それらは、ｐＨ ５．５～ｐＨ７の範囲で溶解する。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＦＳ ３０ Ｄは、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチルおよびメタクリル酸をベースとするアニオン性コポリマーの水性分散液である。それは、酸性媒体に不溶であるが、ｐＨ ７．０を超える塩形成によって溶解する。ＥＵＤＲＡＧＩＴ(R) Ｌ１００－５５およびＬ３０－５５は、ｐＨ５．５以上で溶解する。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００および５１００は、６．０を超えるｐＨで溶解する。
持続放出ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）製剤は、活性成分の時間制御放出を可能にするために、多くの経口剤形に使用される。薬物送達は、増大した治療効果および患者のコンプライアンスのために、胃腸管全体にわたって制御され得る。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ（容易に透過性）およびＲＳ （わずかに透過性）グレードの異なるポリマーの組み合わせは、特注の放出プロフィールを可能にし、広範囲の代替物が所望の薬物送達性能を達成することを可能にする。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＮＥポリマーは、可塑剤を必要としない中性エステル分散体であり、マトリックス錠剤および徐放性コーティングの製造における顆粒化プロセスに特に適している。
例示的な浸透剤（ｏｓｍａｇｅｎｔｓ）または浸透剤（ｏｓｍｏｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）には、塩、酸、塩基、キレート剤、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸リチウム、塩化カリウム、亜硫酸ナトリウム、重炭酸カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、乳酸カルシウム、ｄ－マンニトール、尿素、酒石酸、ラフィノース、スクロース、α－ｄ－ラクトース一水和物、グルコース、それらの組み合わせ、および当技術分野で周知の他の類似または同等の材料などの有機および無機化合物が含まれる。
本明細書中で使用される場合、用語「崩壊剤」は、固体塊（層）の、より容易に分散または溶解されるより小さい粒子への崩壊を促進するために、固体投薬形態において使用される化合物を意味する。例示的な崩壊剤としては、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、その予備ゼラチン化および改質デンプンのようなデンプン、甘味料、クレー、ベントナイト、微結晶セルロース（たとえば、Ａｖｉｃｅｌ）、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、セルロースポリアクリリンカリウム（たとえば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標））、アルギネート、デンプングリコール酸ナトリウム、ガム、寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペクチン、トラガカント、クロスポビドン、および当業者に公知の他の材料などが挙げられるが、これらに限定されない。
超崩壊剤は、急速に作用する崩壊剤である。例示的な超崩壊剤には、クロスポビドンおよび低置換ＨＰＣが含まれる。
いくつかの実施形態では、可塑剤を経口剤形に含めることもできる。適切な可塑剤としては、低分子量ポリマー、オリゴマー、コポリマー、油、小有機分子、脂肪族ヒドロキシルを有する低分子量ポリオール、エステル型可塑剤、グリコールエーテル、ポリ（プロピレングリコール）、マルチブロックポリマー、シングルブロックポリマー、低分子量ポリ（エチレングリコール）、クエン酸エステル型可塑剤、トリアセチン、プロピレングリコールおよびグリセリンが挙げられるが、これらに限定されない。このような可塑剤はまた、エチレングリコール、１，２－ブチレングリコール、２，３－ブチレングリコール、スチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコールおよび他のポリ（エチレングリコール）化合物、モノプロピレングリコールモノイソプロピルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、乳酸ソルビトール、乳酸エチル、乳酸ブチル、グリコール酸エチル、セバシン酸ジブチル、クエン酸アセチルトリブチル、クエン酸トリエチル、クエン酸アセチルトリエチル、クエン酸トリブチルおよびグリコール酸アリルも含むことができる。
遅延放出または制御放出剤形はさらに、潤滑剤、熱潤滑剤、酸化防止剤、緩衝剤、アルカリ化剤、結合剤、希釈剤、甘味料、キレート剤、着色剤、香料、界面活性剤、可溶化剤、湿潤剤、安定化剤、親水性ポリマー、疎水性ポリマー、ワックス、親油性材料、吸収増強剤、保存剤、吸収剤、架橋剤、生体接着性ポリマー、遅延剤、細孔形成剤および芳香剤などの１つ以上の機能性賦形剤を含んでもよい。
本発明において有用な潤滑剤または熱潤滑剤には、脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、ワックス、カルナウバワックス、蜜蝋、コハク酸ビタミンＥ、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、用語「酸化防止剤」は、酸化を阻害する薬剤を意味し、したがって、組成物中の酸素フリーラジカルまたはフリー金属の存在による酸化による調製物の劣化を防止するために使用される。このような化合物には、例として、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、次亜リン酸、モノチオグリセロール、アスコルビン酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウムおよびメタ重亜硫酸ナトリウム、ならびに当業者に公知の他のものが含まれるが、これらに限定されない。他の適切な酸化防止剤としては、例えば、ビタミンＣ、亜硫酸水素ナトリウム、ビタミンＥおよびその誘導体、没食子酸プロピルまたは亜硫酸誘導体が挙げられる。
本発明で使用するのに適した結合剤には、蜜蝋、カルナウバ蝋、パルミチン酸セチル、ベヘン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、水素化ヒマシ油、微晶質ワックス、パラフィンワックス、ステアリン酸、ステアリン酸アルコール、ステアレート６０００ ＷＬ１６４４、ゲルシア５０／１３、ポロキサマー１８８、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００、３０００、６０００、８０００、１００００または２００００が含まれる。
緩衝剤は、酸またはアルカリの希釈または添加の際のｐＨの変化に抵抗するために使用され得る。このような化合物には、例として、限定するものではないが、メタリン酸カリウム、リン酸カリウム、一塩基性酢酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムの無水物および二水和物、無機または有機酸の塩、無機または有機塩基の塩、および当業者に公知の他のものが含まれる。
本明細書で使用される「アルカリ化剤」という用語は、生成物安定性のためのアルカリ性媒体を提供するために使用される化合物を意味する。このような化合物には、例として、限定するものではないが、アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、水酸化カリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン、およびトロラミン、ならびに当業者に公知の他のものが含まれる。
例示的な結合剤には、ポリエチレンオキシド；ポリプロピレンオキシド；ポリビニルピロリドン；ポリビニルピロリドン－コ－酢酸ビニル；アクリレートおよびメタクリレートコポリマー；ポリエチレン；ポリカプロラクトン；ポリエチレン－コ－ポリプロピレン；低置換ＨＰＣ（Ｌ－ＨＰＣ）メチルセルロースなどのアルキルセルロースおよびセルロース誘導体；ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースなどのヒドロキシアルキルセルロース；ヒドロキシエチルメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのヒドロキシアルキル アルキルセルロース；デンプン、ペクチン； ＰＬＡおよびＰＬＧＡ、ポリエステル（セラック）、カルナウバワックス、蜜蝋などのワックス；セルロースなどの多糖類、トラガカント、アラビアガム、グアーガム、およびキサンタンガムが含まれる。
例示的なキレート剤には、ＥＤＴＡおよびその塩、クエン酸などのアルファヒドロキシ酸、ポリカルボン酸、ポリアミン、それらの誘導体、および当業者に公知の他のものが含まれる。
本明細書中で使用される場合、用語「着色剤」は、固体（たとえば、錠剤）医薬調製物に色を付与するために使用される化合物を意味する。このような化合物には、例として、ＦＤ＆Ｃ Ｒｅｄ Ｎｏ．３、ＦＤ＆Ｃ Ｒｅｄ Ｎｏ．２０、ＦＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ Ｎｏ．６、ＦＤ＆Ｃ Ｂｌｕｅ Ｎｏ．２、Ｄ＆Ｃ Ｇｒｅｅｎ Ｎｏ．５、Ｄ＆Ｃ Ｏｒａｎｇｅ Ｎｏ．５、Ｄ＆Ｃ Ｒｅｄ Ｎｏ．８、カラメル、および酸化第二鉄、レッド、他のＦ．Ｄ． ＆ Ｃ．染料、ならびにブドウ皮抽出物、ビートレッドパウダー、ベータカロチン、アナト、カルミン、ウコン、パプリカなどの天然着色剤、および当業者に公知の他の材料が含まれるが、これらに限定されない。使用される着色剤の量は、所望に応じて変化するであろう。
本明細書中で使用される場合、用語「香料」は、医薬調製物に心地よい香りおよびしばしば臭いを付与するために使用される化合物を意味する。例示的な香料または香料には、合成香味油および芳香剤および／または天然油（植物、葉、花、果実などからの抽出物）、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
適切な界面活性剤には、ポリソルベート８０、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシマー、ラウリル硫酸ナトリウム、または当技術分野で公知の他のものが含まれる。石桍および合成洗剤を界面活性剤として使用することができる。適切な石桍には、脂肪酸アルカリ金属、アンモニウム、およびトリエタノールアミン塩が含まれる。適切な洗剤には、カチオン性洗剤、例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、アルキルピリジニウムハライド、およびアルキルアミンアセテート；アニオン性洗剤、たとえば、アルキル、アリールおよびオレフィンのスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテルおよびモノグリセリドスルフェート、およびスルホスクシネート；非イオン性洗剤、例えば、脂肪族アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリ（オキシエチレン）－ブロック－ポリ（オキシプロピレン）コポリマー；ならびに両性洗剤、例えば、アルキルβ－アミノプロピオネートおよび２－アルキルイミダゾリン第四アンモニウム塩；ならびにそれらの混合物が含まれる。
湿潤剤は、液体の表面張力を低下させる薬剤である。湿潤剤には、アルコール、グリセリン、タンパク質、ペプチド、水混和性溶媒（たとえば、グリコール）、親水性ポリマー ポリソルベート８０、ソルビタンモノオレエート、ラウリル硫酸ナトリウム、脂肪酸アルカリ金属、アンモニウム、およびトリエタノールアミン塩、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、アルキルピリジニウムハライド、およびアルキルアミンアセテート；アニオン性洗剤、例えば、アルキル、アリールおよびオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセリドスルフェートおよびスルホサクシネート；非イオン性洗剤、例えば、脂肪族アミン酸化物、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリ（オキシエチレン）‐ブロックポリ（オキシプロピレン）共重合体；および両性洗剤、例えば、アルキルβ‐アミノプロピオネートおよび２‐アルキルイミダゾリン第四アンモニウム塩；およびそれらの混合物が含まれる。
可溶化剤としては、シクロデキストリン、ポビドン、それらの組み合わせ、および当業者に公知の他のものが挙げられる。
例示的なワックスには、カルナウバワックス、蜜蝋、微結晶ワックス、および当業者に公知の他のものが含まれる。
例示的な吸収増強剤には、ジメチルスルホキシド、ビタミンＥ ＰＧＳ、コール酸ナトリウム、および当業者に公知の他のものが含まれる。
保存剤には、微生物の増殖を防止するために使用される化合物が含まれる。適切な防腐剤には、例として、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀およびチメロサール、ならびに当業者に公知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
吸収剤の例には、ナトリウムデンプングリコラート（Ｅｘｐｌｏｔａｂ（商標）、Ｐｒｉｍｏｊｅｌ（商標））およびクロスカルメロースナトリウム（Ａｃ－Ｄｉ－Ｓｏｌ（商標））、架橋ＰＶＰ （Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（商標） ＸＬ １０）、ビーガム（ｖｅｅｇｕｍ）、粘土、アルギネート、ＰＶＰ、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、微結晶セルロース（たとえば、Ａｖｉｃｅｌ）、ポラクリリンカリウム（たとえば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標））、アルギン酸ナトリウム、コーンスターチ、ポテトデンプン、プレゼラチン化デンプン、改質デンプン、セルロース剤、モントモリロナイト粘土（たとえば、ベントナイト）、ガム、アガー、ローカストビーンガム、ガムカラヤ、ペクチン、トラガカント、および当業者に公知の他の崩壊剤が含まれる。
架橋剤は、ポリマーの部分間に架橋を形成する任意の化合物として定義される。架橋剤は、例として、限定するものではないが、有機酸、α－ヒドロキシ酸、およびβ－ヒドロキシ酸を含むことができる。
適切な架橋剤には、酒石酸、クエン酸、フマル酸、コハク酸、および当業者に公知の他のものが含まれる。
生体接着性ポリマーには、ポリエチレンオキシド、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標）（ヒドロキシプロピルセルロース）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ、ポリカルボフィル、ＧＡＮＴＲＥＺ、ポロキサマー、およびそれらの組み合わせ、ならびに当業者に公知の他のものが含まれる。
遅延剤（Ｒｅｔａｒｄａｎｔｓ）は、４５℃を超える、または５０℃を超えるガラス転移温度（Ｔｇ）を有する不溶性またはわずかに可溶性のポリマーである試薬であり、その後、加工に必要な他のポリマーおよび他の賦形剤を含む製剤中の他の薬剤によって可塑化される試薬である。賦形剤には、ワックス、アクリル（ａｃｒｙｌｉｃｓ）、セルロース、脂質、タンパク質、グリコールなどが含まれる。
例としての細孔形成剤には、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポロキサマーおよびポビドンなどの水溶性ポリマー；ラクトース、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムなどの結合剤；塩化ナトリウム、塩化マグネシウムなどの塩；それらの組み合わせおよび当技術分野で広く知られている他の類似または同等の材料が含まれる。
本明細書中で使用される場合、用語「甘味剤」は、調製物に甘味を付与するために使用される化合物を意味することが意図される。そのような化合物には、例として、限定するものではないが、アスパルテーム、デキストロース、グリセリン、マンニトール、サッカリンナトリウム、ソルビトール、スクロース、フルクトース、および当業者に知られている他のそのような物質が含まれる。
医薬製剤の分野で使用される化合物は、一般に、様々な機能または目的を果たす。したがって、本明細書で名付けられた化合物が、１回だけ言及されるか、または本明細書で２つ以上の用語を定義するために使用される場合、その目的または機能は、その目的または名付けられた目的または機能のみに限定されると解釈されるべきではない。
遅延放出または制御放出剤形は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびヒト対象に経口投与された場合における、プロファイルに対応する放出を提供し得る。
いくつかの実施形態では、経口投与後、剤形は、適切には、低レベルの薬物吸収を伴って、６～１０時間の間の遅延時間を提供し、続いて、３～６時間にわたって１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの血漿濃度が増加し、遅延後の最初の数時間で最大の増加速度をもたらすことができる。
インビトロ溶解プロフィールは、胃環境またはヒトが飲み込む口腔組成物が遭遇する環境を模倣するように設計された条件で得ることができる。胃における滞留時間は変化するが、典型的な試験は、胃酸における滞留時間を模倣するために、投薬形態を０．１Ｎ ＨＣｌの低ｐＨ溶液中に２時間置くべきである。次いで、回腸および結腸の環境を模倣するために、投薬形態を、より高いｐＨの水溶液（約ｐＨ ６）中に２～６時間置き、続いて典型的にはｐＨ ６．８に置くべきである。このような溶解条件は、正常なヒト胃腸管の酸性の第１段階およびその後のより高いｐＨ段階の両方を包含するとしても、本明細書中では「模擬胃条件」と定義される。
経口投与後の遅延期間に続いて、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの血漿濃度は、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）に達するまで約３～６時間にわたって増加し得る。この吸収プロフィールに基づいて、午後９時に服用し、６時間遅延する用量は、約３時に、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを放出し始め、投与後約９～１２時間で最大血漿濃度を有することになる。
いくつかの実施形態において、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、遅延時間の間にゆっくりと放出され得ることが理解される。単回用量からの全薬物暴露と比較して、遅延時間中の少量の薬物吸収のいくつかの例は、１～２重量％、または１～５重量％であり、全薬物の約１０重量％以下が６～１０時間の遅延時間中に吸収される。遅延放出層がより透過性になるにつれて、より大きなパーセンテージ、例えば１２％、１５％、１８％、またはさらには２０重量％が放出される可能性があることも理解されるであろう。
遅延放出または制御放出投薬形態は、上記のように、心血管疾患の処置または予防のための１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの１日１回の投与に適切に適合され得る。
投薬形態は、就寝前に服用されるように処方され得、そして数時間の遅れの後に放出を開始し、その結果、対象は、朝の早い時間に覚醒しながら、治療効果を有するために十分な量の薬物を吸収した。
一実施形態では、剤形は、コアおよびコアを取り囲む２つ以上のコーティングを含むビーズまたはミニ錠剤の単一集団を封入するカプセルを含んでもよい。内部コアは、本発明に従って使用するための、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンおよび１つ以上の賦形剤を含有するビーズまたはミニ錠剤である。コアは、徐放層および外側の遅延放出層に封入されてもよい。
徐放層は、水溶性ポリマーと水不溶性ポリマーとの組み合わせを含んでもよい。徐放性コーティングは、たとえば、ポリエチレンオキシドとエチルセルロース、または、ヒドロキシプロピルメチルセルロースとエチルセルロースとの組み合わせを含有してもよい。開示された投薬形態において使用され得る適切なエチルセルロース製品は、Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙの商標で市販されているＥＴＨＯＣＥＬ（商標）である。
徐放層の溶解速度は、コーティングまたは層中の水溶性ポリマー対水不溶性ポリマーの比を調節することによって制御することができる。水不溶性ポリマーと水溶性ポリマーとの重量比は、例えば、非限定的に、９０：１０～１０：９０、８０：２０～２０：８０、７５：２５～２５：７５、７０：３０～３０：７０、６７．５：３３．５～３３．５：６７．５、６０：４０～４０：６０、５６：４４～４４：５６、または５０：５０に調節することができる。
徐放性コーティングはまた、ポリマーの合計重量の３％～５０％のレベルで、クエン酸トリエチル（ＴＥＣ）などの可塑剤を含有してもよい。コーティングへの他の添加剤としては、二酸化チタン、タルク、コロイド状二酸化シリコンまたはクエン酸が挙げられる。
徐放層のいくつかの例を以下の表１に示す。種々の配合物には、水不溶性ポリマー対水溶性ポリマーの比率が変化するもの、および比率が逆転するものが含まれる。フィルム中の微小環境ｐＨをに低く保つために、クエン酸を処方に加え、ＨＰＭＣＡＳ－ＬＦの溶解を阻止し（これは≧ｐＨ５．５で溶解する）、溶解曲線の開始時にラグを生じさせる。特定の実施形態において、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、徐放層に含まれてもよい。
例示的なコアを以下の表２に示す。この例では、浸透圧剤がコアに添加されている。
いくつかの実施形態において、薬物含有コアビーズまたはミニ錠剤は、本開示におけるように、放出前に所望の遅延または遅延時間を達成するために、１つ以上の水不溶性ポリマー、１つ以上の水溶性ポリマーおよびシリコン油を含む遅延放出層でコーティングされ得る。遅延時間および放出は、２つのタイプのポリマーの割合および層の厚さによって制御され得る。そのような実施形態では、遅延放出層は、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートトリマレテート（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ ｔｒｉｍａｌｅｔａｔｅ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、アクリルポリマー、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、セルロースアセテートトリメリテート（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ ｔｒｉｍｅｌｌｉｔａｔｅ）、シェラック、メタクリル酸コポリマー、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ３０Ｄ、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＦＳ３０Ｄ、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）５１００、またはそれらの任意の組合せを含むことができるが、それらに限定されない。遅延放出層はまた、可塑剤を含んでもよく、またはいくつかの実施形態において、遅延放出層は、メタクリル酸コポリマーＢ型、モノグリセリドおよびジグリセリド、セバシン酸ジブチルおよびポリソルベート８０を含む。遅延放出層はまた、セルロースエーテル誘導体、アクリル樹脂、アクリル酸およびメタクリル酸エステルと第四級アンモニウム基とのコポリマー、アクリル酸およびメタクリル酸エステルのコポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。この層は、シリコーンオイルのための担体としてタルクなどの粉末成分をさらに含むことができる。
本発明のいくつかの実施形態において、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、遅延放出および／または制御放出カプセルに含まれ得る。そのような実施形態では、水不溶性カプセルは、活性剤が保持される１つ以上のコンパートメントを含み得る。さらに、１つ以上の吸収剤、超吸収剤、またはオスマジェントが、薬物含有コンパートメントに含まれてもよい。カプセルはまた、水溶性ポリマーで塞がれた１つ以上の開口部（ａｐｅｒｔｕｒｅｓ）、各コンパートメントと流体連通する（ｉｎ ｆｌｕｉｄ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）少なくとも１つ、およびカプセル全体を取り囲む遅延放出層を含み得る。
このような実施形態では、初期遅延の長さは、外側の遅延放出層の組成物および厚さによって制御することができる。この層は、本明細書中に開示されるように、ｐＨ依存層またはｐＨ非依存層であり得る。カプセルがヒトに投与される場合、遅延放出層は、カプセルがＧＩ管を通過する際に完全性を失い始める。水溶性プラグが露出され、溶解すると、水性流体が薬物含有コンパートメントに入り、吸収剤またはオスマジェントによって吸収され、したがって、活性剤をカプセルから、開口部（ａｐｅｒｔｕｒｅ）を通して押し出す。放出プロフィールは、所望のプロフィールを得るために、吸収剤またはオスマジェントの濃度および吸収特性によって制御することができる。
以下の実施例に開示されるように、健康なボランティアからの血漿の脂質メディエーター（ＬＭ）プロファイリングは、７ＡＭ～９ＡＭの間のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの有意な増加を実証した。これらの時間間隔で、単球、血小板および好中球活性化マーカーの発現の増加が、健康なボランティア末梢血において見出された。さらに、心血管疾患患者では、血漿ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン濃度の低下、これらの分子の日周調節の喪失、および循環血小板、好中球および単球の活性化の増加が実証された。さらに、心筋梗塞の危険性がある患者の血漿の脂質メディエータープロファイリングでは、５－リポキシゲナーゼおよび１５－リポキシゲナーゼ発現の低下と全身アデノシン濃度の上昇に関連するＲｖＤn-3 DPAの低下が実証された。
したがって、本発明によれば、心血管系の病気は、朝の早い時間における対象の血液中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを測定することによって、および／または全身のアデノシンの活性または発現レベルをモニタリングすることによって、および／または５－ＬＯＸまたは１５－ＬＯＸ活性または発現レベルをモニタリングすることによって診断され得る。
いくつかの実施形態では、対象の早朝血漿レベルは、ほぼ同じ時刻に健康な患者に見出される、対応する血漿レベルと比較されてもよい。健康な対象と比較して、朝の早い時間における対象の血液中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの減少したレベルは、心血管疾患または心血管疾患のリスクを示し得る。これに対応して、アデノシン発現レベルまたは活性レベルの上昇、および／または５－ＬＯＸまたは１５－ＬＯＸ活性レベルまたは発現レベルの低下は、心血管疾患または心血管疾患のリスクを示している可能性がある。あるいは、いくつかの実施形態では、早朝における、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルを、別の時刻、たとえば、夕方の同じ対象の血液中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルの対応するレベルと比較してもよい。
適切には、早朝における１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルを、早朝前夜の夕方または早朝直後の対象の血液における１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルと比較してもよい。さらなる代替法では、対象の血液中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルの早朝レベルを、その日のうちの、対象のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルのピーク血漿レベルと比較することができる。１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルの早朝におけるレベルと、その日の別の時刻に測定された対応するレベルとの間の差は、以下により詳細に記載されるように、対象の心血管の健康を示し得る。一般に、その日の異なる時刻に測定されたレベル間の差が小さいほど、対象の心血管疾患のリスクは大きくなる。
同様に、心血管疾患の結果としての心筋梗塞または別の急性心臓事象を患う対象のリスクは、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルの早朝のレベルを評価し、所望により、このような早朝レベルを、ほぼ同じ日時の健康な患者における対応するレベル、または１日の別の時間に同じ対象から得られたレベル、または最小日周のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンもしくは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルと比較することによって評価され得る。
従って、本発明の異なる局面において、対象における心血管疾患のリスクを診断または評価する方法であって、早朝に対象の血液から得られた第１の生体サンプルにおける１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルを、別の時刻に対象の血液から得られた対応する、第２の生体サンプルにおける１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルのレベルと比較する工程を包含する方法が提供される。
いくつかの実施形態では、２つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを測定することができる。
適切には、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、１つ以上、例えば、１つ、２つまたは３つのＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPAおよびＲｖＤ５n-3 DPAを含み得る。
いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPAおよび／またはＲｖＤ５n-3 DPAのうちの１つ、２つまたは３つすべてのレベルを測定して、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンレベルを得ることができる。
本発明の治療的局面に関連して上述したように、本明細書において「早朝」とは、７ＡＭ～９ＡＭ、またはより広くは６ＡＭ～１０ＡＭを意味する。適切には、対象の血液の第１の生体サンプルは、午前８時または午前８時３０分ごろに得ることができる。
対象の血液の第２の生体サンプルは、任意の他の時刻に得ることができるが、概日変動のために、対象の血液中の脂質メディエータのレベルが通常はより低い午後または夕方に都合よく得られる。したがって、第２の生体サンプルは、いくつかの実施形態では、真昼から午後約９時の間、好都合には午後４～８時の間に得ることができる。
代替として、対象の血液の生体サンプルは、一日を通して規則的な間隔で採取され得、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルは、上記のように朝の早い時間に測定され、一日を通して測定される、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの最小レベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルの最小レベルと比較されてもよい。本発明のこのような実施形態は、対象が登録され、臨床試験の場所にチェックインされ、血液サンプルが一日を通して規則的な間隔で容易に採取され得る臨床試験における使用に便利であり得る。
本発明によれば、第１の早朝サンプル中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルを、対応する、第２のサンプル中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルのレベル、または上記の最小レベルと比較することができ、レベル間の差は、心血管疾患または心血管疾患のリスクを示し得る。
以下に記載されるような、心血管疾患に罹患していない健康な対象において、対象の血液中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルは、１日の間に５～１５ｐｇ／ｍＬの範囲で自然に変化し得、朝の早い時間に最大である。ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの早朝のレベルと、対応する１日の他の時間または最小レベルとの差が、約５ｐｇ／ｍＬ未満である場合、これは、心血管疾患、または対象が心筋梗塞または別の急性心血管事象を患う危険性を示し得る。
本発明のさらに別の局面において、対象における心血管疾患のリスクを診断または評価する方法の提供であって、早朝に対象の血液から得られた生体サンプルにおける１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルを、健康な対象において典型的に見出される１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルについての参照レベルと比較する工程を包含する方法が提供される。
健康な対象における１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸ活性または早朝における活性又は発現レベルのための参照レベルは、朝の早い時間に、１つ以上の健康な対象からの血液サンプルを採取し、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸ活性または発現レベルの血漿濃度を測定することによって得ることができる。
１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸ活性または発現レベルは、対象ごとに、および１日の時間とともに自然に変化する可能性が高いので、複数の異なる健康な対象における１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸ活性または発現レベルの血漿濃度を測定し、平均濃度レベルをとることが望ましい。健康な対象から採取した血液サンプルは、１日の同じ時刻またはほぼ同じ時刻に採取すべきである。
本明細書中の「健康である」対象とは、心血管疾患を有さない対象を意味する。「健康である」対象は、重篤な冠状動脈疾患を有さず、経皮的冠状動脈インターベンション（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）を有さず、かつ、以下の危険因子、すなわち、高血圧、高コレステロール、喫煙者、糖尿病または虚血性心疾患を有さない。
対象に関して本明細書中で使用される「健康である」とは、対象がいかなる疾患にも罹患していないことではなく、それらが上記のような関連する心血管疾患に罹患していないことのみを意味する。
いくつかの実施形態において、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルについての参照血漿レベルは、対象から得られた生体サンプルにおいて測定されたｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルと参照レベルが適切に比較可能であることを確実にするために、対象の異なる性別、民族性および／または年齢について得られ得る。
前述のように、生体サンプル中の２つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを測定することができる。
いくつかの実施形態では、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、ＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPAおよびＲｖＤ５n-3 DPAから選択されるｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、生体サンプル中の、ＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPAおよび／またはＲｖＤ５n-3 DPAのうちの１つ、２つまたは３つすべてのレベルを測定して、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンレベルを得ることができる。例として、朝の早い時期の健康な対象の血液中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの参照レベルは、約１０ｐｇ／ｍＬ～約２５ｐｇ／ｍＬ、典型的には約１５ｐｇ／ｍＬの範囲であり得る。生体サンプル中の、約１０ｐｇ／ｍＬ未満、特に約５ｐｇ／ｍＬ未満のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの早朝レベルは、心血管疾患または心血管疾患のリスクを示し得る。
適切には、生体サンプルは、全血、血清または血漿サンプルであり得る。
適切には、生体サンプルは、収集の直後に、抗凝固剤（たとえば、凝固を防ぐためのヘパリン）で処理されてもよい。
分析の前にサンプルを保存する必要がある場合、いくつかの実施形態では、サンプルを有機溶媒中に置き、－７５℃以下の温度で保存することができる。好適には、有機溶媒は、メタノールを含んでもよく、またはメタノールからなってもよい。脂質メディエーターは、長期保存の間、凍結サンプル中で不安定であることが見出されており、メディエーターのいくつかのレベルは、３ヶ月保存後に有意に（＞５０％）減少するが、驚くべきことに、メタノール、および任意に他の有機溶媒を使用することによって、これらの分子が－７５℃以下の温度で保存される場合、これらの分子の安定性が改善され得ることが見出された。好適には、サンプルは、約－８０℃の温度で保存することができる。
以下に記載する種類の重水素標識標準を、凍結前にサンプルに添加することができる。
血液などの生体サンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルのレベルを測定するための方法は、当業者に利用可能であり、本明細書に詳細に記載する必要はない。
適切な方法は、例えば、Ｙａｎｇ Ｒら（Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ－Ｌｉｐｉｄｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ ａｎｄ Ｄｏｃｏｓａｎｏｉｄｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ Ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ、 Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０００；９５：１４．２６：１４．２６．１－１４．２６．２６）およびＤａｌｌｉ Ｊ ａｎｄ Ｓｅｒｈａｎ ＣＮ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｐｉｄ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ： ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｅｆｆｅｒｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏ－ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ、Ｂｌｏｏｄ． ２０１２；１２０：ｅ６０－ｅ７２）に開示されている。両者の内容は、参照により、本書面に組み込まれる。
簡潔には、いくつかの実施形態において、サンプル中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルは、サンプルからＳＰＭを抽出した後、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して測定され得る。
ＳＰＭは、固相抽出、たとえば、Ｃ１８カラムを用いて、サンプルから抽出することができる。適切な方法は、Ｃｏｌａｓ ＲＡら（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏ－ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｌｉｐｉｄ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ、 Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０１４；３０７：Ｃ３９－５４）によって開示されている。その内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。
サンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの定量を容易にするために、ＳＰＭの抽出前に、１つ以上の内部標識標準をサンプルに添加してもよい。適当な標識標準は、重水素標識５Ｓ－ＨＥＴＥ（５Ｓ－ＨＥＴＥ－ｄ8）、重水素標識ロイコトリエンＢ4（ＬＴＢ4－ｄ4）、重水素標識リポキシンＡ4（ＬＸＡ4－ｄ5）、重水素標識レゾルビンＤ２（ＲｖＤ２－ｄ5）および重水素標識プロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2－ｄ4）である。
サンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの同定は、その保持時間（ＲＴ）およびそのＭＳ－ＭＳスペクトラムからの少なくとも６個の診断イオンとＳＰＭ用の合成または真正の規格のそれらとを対応させることによって確認できるかもしれない。液体クロマトグラフィーを用いて測定される分子の保持時間は、多くの場合、装置固有であり、カラム化学、クロマトグラフィー勾配、およびサンプル品質に基づいて、異なるシステム間で変化する。各系についての保持時間は、たとえば、標識標準（たとえば、重水素標識標準）および目的の分子についての標準の両方を使用して、経験的に確立され得る。
一例として、いくつかの実施形態では、上記のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの保持時間は、以下の表３に示すとおりであってもよい：
定量は、メディエーターのための合成または真正の規格を使用して構築される線形回帰曲線を使用して達成され得る。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、たとえば、病院の実験室において、必要とされる装置へのアクセスがある状況において使用するのに適していてもよい。しかし、より好都合には、サンプル中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルは、イムノアッセイを使用して測定され得る。イムノアッセイは、マイクロフルイディクスデバイスまたはテストストリップ上で実行するために小型化される可能性を有し、臨床的なポイントオブケア適用により適し得る。したがって、イムノアッセイを組み込んだ本発明の実施形態は、個々の患者の心血管疾患の診断を支援するために、一次医療提供者によってｉｎ ｓｉｔｕで使用することができる。
１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルは、均質または不均質イムノアッセイを用いて測定することができる。
したがって、いくつかの実施形態において、その、または、各ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルは、過剰に存在する標識された抗体に結合することにより、標識の検出可能な特性を変化することによって、溶液中で測定することができる。
したがって、存在する特定のＳＰＭの量は、特定の検出可能な特性を有する標識の量に影響を及ぼす。当技術分野で周知のように、標識は、放射性標識、蛍光標識、または酵素によって作用された場合に着色されるか、惹起されるか、または蛍光を発することを可能にされる、発色性または化学発光基質を有する該酵素を含んでもよい。
抗体は、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンに特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体を使用することができる。
あるいは、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンが、分離および定量のために表面結合抗体によって捕捉される、不均一なフォーマットが使用され得る。いくつかの実施形態では、表面結合ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンが、標識された二次抗体を結合することによって定量されるサンドイッチアッセイを使用することができる。
好適には、イムノアッセイは、標識が酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）を含むことができる。ＨＲＰのための適切な基質は、当該分野で周知であり、そして、たとえば、ＡＢＴＳ、ＯＰＤ、ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ、ＤＡＢ、ＡＥＣ、ＴＭＢ、ホモバニリン酸およびルミノールを含む。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡイムノアッセイを使用することができ、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイが特に好ましい場合がある。
イムノアッセイは、競合的であっても非競合的であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの量は、上記のように、均質または不均質方法によって直接測定することができる。
あるいは、サンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、過剰に存在する既知量の抗体を含む溶液中に隔離され（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｅｄ）得、次いで残存する抗体の量は、表面結合ＳＰＭに結合することによって決定され、元のサンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの量の間接的な読み出し（ｒｅａｄ－ｏｕｔ）を与える。別の変化態様において、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、表面結合抗体への結合について、既知量の標識ＳＰＭと競合させられ得る。
表面結合抗体またはＳＰＭは、当技術分野で知られている種類の任意の適切な表面上に固定化することができる。例えば、抗体またはＳＰＭは、ウェルまたはプレートの表面上、または複数の磁性または非磁性ビーズの表面上に固定化され得る。
したがって、本発明のさらに別の態様では、生体サンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを測定するためのイムノアッセイが提供され、イムノアッセイは、サンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを捕捉するために、表面上にコーティングされ、および／またはサンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンに結合することによって、検出可能な様式に、変化する標識でタグ付けされた、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンに対する抗体、またはサンプルと混合した後にｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンに対する抗体を捕捉するための表面上に固定された、サンプル中の定量されるべきものと同じ量のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンに対する抗体を含む。
いくつかの実施形態において、イムノアッセイは競合アッセイであってもよく、既知量のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン（これはサンプル中で定量されるものと同じであるが、検出可能な標識で標識されている）をさらに含み。標識されたｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンに対する抗体によって適切な表面に親和性で結合され得る。サンプルを添加すると、標識されたｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの一部が表面結合抗体から置換され、それによってサンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルの測定値を提供することができる。
いくつかの実施形態では、イムノアッセイは、サンプル中で定量されるｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンと同じ表面結合ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン、および溶液中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンに対する既知量の抗体を過剰に含むことができる。サンプルは、まず、ある割合の抗体がサンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンと結合するように、溶液中で抗体と混合される。次いで、残存する非結合抗体の量を、表面結合ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンへの結合によって測定することができる。
いくつかの実施形態において、イムノアッセイは、表面結合抗体に結合したｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの量、または表面に固定化されたｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンに結合した一次抗体の量を定量するために、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンに対する標識二次抗体、またはｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンに対する一次抗体に対する標識二次抗体を含むことができる。
本発明のさらに別の態様では、本発明による、サンプル収集装置およびイムノアッセイを含む、サンプル中の特定のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを測定するための装置が提供される。
適切には、この装置は、標識されたｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたはイムノアッセイにおけるｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンに対する標識された抗体を検出するための検出器をさらに含み得る。適切な標識は上述されているが、好ましい実施形態では、標識は、酵素によって作用された場合に、着色されるか、または、蛍光を発することを惹起されるか、または可能にされる、発色性または化学発光基質を有する酵素であり得る。
いくつかの実施形態において、本発明のイムノアッセイまたは装置は、生体サンプル中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを測定するための小型化されたデバイスに組み込まれ得る。適切には、デバイスは、「ラボオンチップ“ｌａｂ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ”」を含むことができる。
したがって、本発明のさらに別の態様によれば、対象から得られた生体サンプル中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを測定するためのデバイスが提供され、このデバイスは、入口ポート（ｉｎｌｅｔ ｐｏｒｔ）および反応ゾーンを有する内部チャネルを画定する１つ以上の部分を含み、そこで、サンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを捕捉するために、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンに対する固定化一次抗体と反応させることができ、または、反応ゾーンの上流のサンプルと混合した後、溶液中の過剰のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンに対する一次抗体を、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンと反応させてもよい。
これは、サンプル中で測定されるものと同じであるが、サンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの量を直接的または間接的に定量するために、反応ゾーン内の表面上に固定化されている。
次いで、捕捉されたｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたは一次抗体を、酵素でタグ付けされたｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたは一次抗体に対する二次抗体を用いて検出することができる。
上記のように、酵素は、酵素によって作用された場合に、着色されるか、蛍光が惹起されるかまたは発することを可能にされる、発色性（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）または化学発光性（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）基質を有し得る。
適切には、少なくとも反応ゾーンに隣接する、チャネルを画定するデバイスの１つ以上の部分は、少なくとも基質の色または蛍光を包含する波長の範囲において、光に対して透明であり得、チャネルまたはさらなるチャネルの外側に位置する、例えば、フォトダイオードのような適切な検出器を使用して、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたは一次抗体と二次抗体との間の反応の検出を可能にする。
いくつかの実施形態において、装置は、サンプル中の複数の異なるｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン、たとえば、ＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPAおよびＲｖＤ５n-3 DPAの２つ以上のレベルを並行して測定するために、各々自身の入口ポート（ｉｎｌｅｔ ｐｏｒｔ）を有する複数のチャネルを含むことができる。従って、各チャネルは、異なるそれぞれの固定化された一次抗体またはｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを含み得る。
適切には、デバイスは、チャネルへの一連の異なる試薬、たとえば、サンプル、洗浄溶液、一次抗体、二次抗体、および酵素基質などの添加（ａｄｍｉｓｓｉｏｎ）を制御するために、１つまたは複数の入口ポートに接続した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）１つまたは複数の選択的に動作可能な弁を備えることができる。
したがって、デバイスは、マイクロ流体デバイスを含むことができる。チャネルは、反応ゾーンを含むことができる。マイクロフルイディクス装置は、当業者に知られている。マイクロ流体イムノアッセイまたはタンパク質診断チップマイクロアレイの概説は、Ｃｈｉｎらによって提供されている（Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ．２０１２；１２：２１１８－２１３４）。診療［治療・介護］現場（ポイントオブケア）での、ＥＬＩＳＡイムノアッセイを実施するのに適したマイクロフルイディクス装置は、Ｃｈａｎ ＣＤらによって開示されている（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ－ｂａｓｅｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｗｏｒｌｄ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１１；１７（８）：１０１５－１０１９）。その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明による心血管疾患を評価または診断する方法は、対象の血液中の白血球および／または血小板の活性化の変化を評価することによって補足され得る。朝の早い時間における白血球の活性化の増加、または白血球－血小板凝集体の形成の増加は、心血管疾患または心筋梗塞のリスクの増加と関連し得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の心血管疾患を評価または診断する方法は、朝の早い時間、典型的には午前７時から午前９時の間に、対象の血液中の白血球および／または血小板の活性化のレベルを測定することをさらに含んでもよい。
適切には、白血球および／または血小板の活性化は、末梢血細胞上の発現活性化マーカーを測定することによって評価され得る。当業者に公知の適切なマーカーとしては、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６３およびＣＤ６２Ｐが挙げられる。
ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６３およびＣＤ６２Ｐなどの活性化マーカーの発現レベルを定量するための方法は、当業者に周知である。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーを使用することができる。
フローサイトメトリーでの使用に適した抗ヒト抗体には、ＶｉｏＢｌｕｅ－ａｎｔｉ－ＣＤ４１、ＰＥ－Ｃｙ５－ａｎｔｉ－ＣＤ６２Ｐ、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７１１－ａｎｔｉ－ＣＤ１１ｂ、ＡＰＣ－Ｃｙ７－ａｎｔｉ－ＣＤ１６、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５－ａｎｔｉ－ＣＤ６３、ＦＩＴＣ－ａｎｔ－ＣＤ４２ｂおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ａｎｔｉ－ＣＤ１４が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明による心血管疾患を評価または診断する方法は、対象の血液中の炎症開始エイコサノイドに対するｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの比を評価することをさらに含んでもよい。
炎症開始エイコサノイドには、プロスタグランジン（たとえば、ＰＧＤ2、ＰＧＥ2およびＰＧＦ2α）、ロイコトリエンＢ4および／またはＴｘＡ2が含まれる。
生体サンプル中のこのような炎症開始エイコサノイドのレベルを定量するための適切な方法は、当業者に利用可能であり、そして本明細書中で詳細に記載される必要はない。
１日の同じ時間に測定された健康な対象における対応する比率と比較して、朝の早い時間における対象の血液中の１つ以上の炎症開始エイコサノイドのレベルに対する１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルの比率の減少は、心血管疾患の診断または心血管疾患の増加したリスクを支持し得る。
例証として、朝の早い時間における健康な対象におけるプロスタグランジンＰＧＤ2、ＰＧＥ2およびＰＧＦ2α、ならびにＬＴＢ4に対する、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPAおよびＲｖＤ５n-3 DPAの比は、約０．５０であり得、一方、心血管疾患を有する対象において、対応する比は、約０．１３であり得る。
対象の血液中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルを測定するための上記の方法、イムノアッセイまたは機器装置もまた、本発明のなおさらなる局面に従って、１以上の対象における心血管疾患に対する治療的または予防的処置の効力を評価するために使用され得る。
このような方法は、個々の対象、ならびに対象のグループ（たとえば、臨床試験におけるボランティアのコホート）に適用可能である。
したがって、本発明のさらに別の局面によれば、１つ以上の対象における心血管疾患に対する治療的または予防的処置の効力を評価する方法の提供であって、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンもしくは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルを、処置開始後に対象から得られた血液サンプルにおいて評価する工程を包含し、血液サンプルは、早朝に得られ、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルの増加および／または処置に関連するサンプルにおけるアデノシンの活性もしくは発現の減少および／または５－ＬＯＸもしくは１５－ＬＯＸの発現もしくは活性の増加は、処置の効力を示す。
本発明の方法、イムノアッセイまたは装置は、対象における心血管疾患（特に早朝に、たとえば、炎症誘発性エイコサノイドのような炎症誘発性メディエーターのレベルを制御するための身体の天然の調節系の機能不全によって引き起こされるかまたは悪化され得る冠状動脈疾患、血管炎症および他の心血管障害を含む。）の治療的処置の効力を評価するために使用され得る。
本発明の方法、イムノアッセイまたは装置はまた、心血管疾患、特に心筋梗塞、卒中、心不全および狭心症に対する予防的処置の効力を評価するためにも使用され得る。治療的または予防的処置は、薬剤の投与を含み得る。心血管疾患の予防的または治療的処置の効力を評価するための本発明の方法は、任意の特定の処置または薬物に限定されないが、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、スタチン（たとえば、シンバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン）、フィブラート（たとえば、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クリノフィブラート、クロフィブライド、およびシンフィブラート）、カルシウムチャネル遮断薬（たとえば、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、エフォニジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピンおよびプラニジピン）またはこれらの組み合わせ（たとえば、スタチンおよびカルシウムチャネル遮断剤の組み合わせ）から選択される１つ以上の薬物の効力を評価するために使用され得る。
幾つかの実施形態では、治療的または予防的処置は、特に臨床試験の状況において、治験用医薬品（ＩＭＰ）を含んでもよい。このような臨床試験は、適切な対照（例えば、プラセボまたは別の治療を受けている一部の対象）を用いて実施すべきであり、盲検または二重盲検であってもよい。いくつかの実施形態では、治療的または予防的処置は、薬剤の組み合わせの投与、または心血管疾患のための治験薬もしくは承認された医薬品の新しい投薬レジメンからなってよい。適切には、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルは、処置の開始前に、１つ以上の対象から得られた血液サンプルにおける、対応する１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベル、またはプラセボもしくは別の処置を受けた１つ以上の対象から得られた血液サンプルと比較され得る。
いくつかの実施形態において、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルは、処置を開始した後の時間間隔で、対象の各々から得られた一連の２つ以上のサンプルにおいてモニターされ得る。
いくつかの実施形態では、朝の早期に１つ以上の対象から得られた血液サンプル中の、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルもしくはアデノシンもしくは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルを、その日の別の時点で対象から得られた血液サンプル中における、対応する１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルもしくはアデノシンもしくは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルと比較することができる。
ここで、早朝およびその日の他の時点で得られた血液サンプル中の、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベル間の差の増加および／またはアデノシンの発現もしくは活性の減少および／または５－ＬＯＸもしくは１５－ＬＯＸの発現もしくは活性の増加は、治療の有効性を示す。
上記のように、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンは、ＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPAおよび／またはＲｖＤ５n-3 DPAの１つ以上を含み得る。前述のように、本明細書において「早朝」とは、一般に、約６ＡＭ～１０ＡＭ、またはより詳細には、約７ＡＭ～９ＡＭを意味する。
朝の早い時間に測定された、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルが、その日の別の時間に測定された対応するレベルと比較される場合、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルの早朝のレベルは、早い朝の測定の直前または直後の午後または夕方に測定された対応するレベル（たとえば、約４ ＰＭ～１０ ＰＭの間、より詳細には、約６ ＰＭ～８ ＰＭの間）と比較され得る。
前述のように、代替の実施形態では、朝の早い時間に測定される、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルは、１日の残りの間の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルの最小レベルと比較されてもよく、たとえば、早朝レベルが測定される時点を包含する２４時間の期間中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルの最小レベルと比較されてもよい。このために、１つ以上の対象から得られた血液サンプル中の、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性または発現レベルのレベルは、１日を通して規則的な時間間隔で測定され得、これは、臨床試験または臨床的な患者内設定の状況において達成することがより容易であり得る。
本発明の方法は、コンピュータによって実行されてもよい。従って、別の局面において、本発明は、対象における心血管疾患の治療的または予防的処置の効力を評価するコンピュータ実行方法を提供し、それぞれ早朝に対象から得られた血液サンプルにおいて、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンもしくは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性もしくは発現のレベルを表すサンプルのデータを、治療開始およびコンピュータ上のソフトウェアを実行する前後において、それぞれ、コンピューターで受領し、サンプルにおける、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンもしくは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの活性もしくは発現のレベルを比較すること、治療開始後において、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルの増加、またはアデノシンの活性もしくは発現の減少、または５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの発現もしくは活性の増加は、治療の効力を示し、そして、その比較を基に、治療の効力を表す効力データを出力することを含む、コンピュータ実行方法を提供する。
本発明のさらに別の局面において、対象における心血管疾患に対する治療的または予防的処置の効力を評価するコンピュータ実行方法を提供し、対象から得られた少なくとも２セットの血液サンプルのシリーズ（各セットにおける１つのサンプルは、朝の早い時点で対象から得られ、そして各セットにおける他のサンプルは、その日の異なる時点で対象から得られた）における、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベル、または、アデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの発現または活性のレベルを表すデータをコンピュータサンプルにおいて受信する工程、およびコンピュータにおいてソフトウェアを実行して、各セットにおける、早朝およびその日の別時刻のサンプルの間の、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルおよび／またはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの発現または活性の差異を計算し、そしてシリーズにおけるサンプルのセットについてのレベルの差異を比較する工程を包含する、コンピュータ実行方法が提供される。ここで、治療開始後の早朝におけるサンプルとその日の別時刻におけるサンプルにおいて、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来レゾルビンのレベルの間の差異における増加、またはアデノシンの活性もしくは発現の減少、または早朝および治療開始後の他の日時サンプルにおける５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの発現もしくは活性の増加は、治療の有効性を示す。
さらに別の局面において、本発明は、上記のような心血管疾患に対する治療的処置または予防的処置の効力を評価するための本発明の方法を実行するためのコンピュータ実行可能ソフトウェアを包含する。
サンプル中の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを比較するステップは、サンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを表すデータを最初に受信するコンピュータとは異なるコンピュータ上で実行されてもよいことが理解されるであろう。
したがって、本発明のさらに別の態様では、対象における心血管疾患の治療的または予防的治療の効力を評価するために、コンピュータ装置が提供され、コンピュータを組み込んだ第１の装置と第２のコンピュータ、およびそれらの間のデータ伝送のための第１の装置と、第２のコンピュータとの間の通信チャンネルを含み；ここで、治療を開始する前および後のそれぞれの早朝に対象から得られた血液サンプル中の、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベル、または、アデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの発現または活性のレベルを表すサンプルデータを受信し、そして、サンプルデータを通信チャネルを介して第２のコンピュータに送信するように構成され、そして、第２のコンピュータは、ソフトウェアを実行して、サンプル中の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルまたはアデノシンまたは５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの発現または活性のレベルを比較し、対象に対する治療の効力を決定するように構成される。治療開始後に、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルの増加またはアデノシンの活性もしくは発現の減少、または５－ＬＯＸ／１５－ＬＯＸの発現もしくは活性の増加は、その治療の効力を示し、そして、治療の効力を表す効力データを出力する。
さらに別の態様では、本発明は、コンピュータを組み込んだ第１のデバイスと、第２のコンピュータと、第１のデバイスと第２のコンピュータとの間のデータ伝送のための通信チャネルとを含み、第１のデバイスは、治療を受けている対象から取得され、各対の１つのサンプルが朝早くに対象から取得され、各対の他のサンプルが異なる時刻に対象から取得される、一連の対の血液サンプル中の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを表すサンプルデータを受信するように構成され、サンプルデータを通信チャネルを介して第２のコンピュータに送信するように構成され、第２のコンピュータは、ソフトウェアを実行して、サンプルの各対の早朝サンプルと異なる時刻のサンプルとの間の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルの差を計算し、レベルの差を比較するように構成される、対象における心血管疾患の治療または予防治療の有効性を評価するためのコンピュータ装置を包含する。シリーズ中のサンプルの対、治療後の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの早朝レベルと異なる時刻レベルとの間の差の増加は、治療の有効性を示す。
適切には、第２のコンピュータは、通信チャネルを介して、第１のデバイスに、または第３のコンピュータに有効性データを送信するように構成され得る。
いくつかの実施形態において、第１のデバイスは、血液サンプル中の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを測定するための、本発明の上記の対応する局面に従って、イムノアッセイ、機器またはデバイスを組み込み得る。
以下は、本発明の実施形態の添付図面を参照して、単に例としての説明である。
図１：血管ｎ－３ ＤＰＡ由来ＳＰＭは、ヒト健常ボランティアにおいて日周的に調節される。示された間隔で健康なボランティアから末梢血を収集し、血漿を、重水素標識内部標準を含有する氷冷メタノール中に置いた。脂質メディエーター（ＬＭ）を抽出し、同定し、そしてＬＭプロファイリングを用いて定量した（詳細については、以下の材料および方法の節を参照のこと）。（Ａ）同定されたＬＭのための代表的なＭＲＭ、（Ｂ）ＲｖＤ５n-3 DPAの同定のために使用されたＭＳ－ＭＳスペクトル。ｎ＝７人の健康なボランティアの代表の結果である。（Ｃ）個別のＬＭ－ＳＰＭプロフィールで特定されたヒト血漿の、示された間隔でのＰＬＳ－ＤＡ ２次元スコアプロット、そして、（Ｄ）対応する２次元負荷プロット。スコアプロットにおける灰色の楕円は、９５％信頼領域を示す。灰色の円は、重要性スコア≧１の変数を有するＬＭを表し、ｎ＝４人の健康なボランティア／間隔である。（Ｅ）各時間間隔で、同定し、定量したｎ－３ ＤＰＡ濃度。結果は、平均±標準偏差であり、１時点あたり、ｎ＝７であり、ｐｇ／ｍＬとして表される。＊，ｐ≦０．０５（対１８時間間隔での量）。パネルの白色部分における結果について統計分析を行った。グレーパネルの結果は、律動性の可視化（ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｙｔｈｍｉｃｉｔｙ）を助けるために白色部分から再プロットされる。
図２：ＬＭ－ＳＰＭ健康ボランティアの日周制御。健康なボランティアからの末梢血を、示された間隔で収集した。血漿を回収し、重水素標識内部標準を含有する氷冷メタノール中に置いた。ＬＭプロファイリングを用いて、ＬＭを抽出し、同定し、定量した（詳細については方法を参照のこと）。（Ａ）ＤＨＡメタボローム、（Ｂ）ＥＰＡメタボローム、（Ｃ）ＰＧ、（Ｄ）ＬＴＢ4メタボローム、（Ｅ）ＲｖＤn-3 DPA、（Ｆ）ＰＤn-3 DPA、（Ｇ）ＭａＲ n-3 DPAおよび（Ｈ）ＲｖＴの濃度。結果は、ｐｇ／ｍＬとして表される平均±標準偏差である。ｎ＝間隔あたり７人のボランティア。
図３：アセチルコリンは、健康なボランティアからの末梢血中のｎ－３ ＤＰＡ ＳＰＭをアップレギュレートする。（Ａ）血液を健康なボランティアから採取し、ＬＣ／ＭＳ－ＭＳを用いて測定したアセチルコリンレベルは、平均±標準偏差。ｎ＝７人の健康なドナー／条件、であり、ｐｇ／ｍＬとして表した。＊，ｐ≦０．０５、対１８時間濃度。律動性の可視化（ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｙｔｈｍｉｃｉｔｙ）を助けるために、灰色のパネルの結果を白色部分から再プロットした。（Ｂ－Ｄ）血液を健康なボランティアから採取し、アセチルコリン（ＡＣｈ；０．１μＭ；４５分；３７oＣ）とインキュベートした。インキュベーションを氷冷メタノールでクエンチし、ｎ－３ ＤＰＡ由来ＬＭを同定し、ＬＭプロファイリングを用いて定量した（詳細については方法を参照のこと）。（Ｂ）同定したｎ‐３ ＤＰＡ ＳＰＭの代表的ＭＲＭ。（Ｂ、Ｃ） （Ｃ）ＲｖＤ２n-3 DPAの同定に用いたＭＳ‐ＭＳスペクトル。結果は、ｎ＝６人の健常ドナーを代表する。（Ｄ）血漿ｎ－３ ＤＰＡ Ｄシリーズのレゾルビン濃度。結果は、平均±標準偏差、ｎ＝９人の健常ドナー／条件、であり、ｐｇ／ｍＬとして表される。＊＊，ｐ≦０．０１対ビヒクルインキュベーション（Ｖｅｈ）。
図４：健常ボランティアにおける末梢血白血球の日周制御および血小板活性化。示された間隔で血液を収集し、好中球、単球および血小板活性化マーカーの発現を、蛍光標識抗体およびフローサイトメトリーを用いて評価した。（Ａ，Ｂ）好中球 （Ａ）ＣＤ１１ｂおよび（Ｂ）ＣＤ４１発現。（Ｃ，Ｄ）単球 （Ｃ）ＣＤ１１ｂおよび（Ｄ）ＣＤ４１発現。結果は、平均±標準偏差、間隔あたり、ｎ＝７人のボランティアであり、１８：００時間の抗原発現のパーセンテージとして表される。＊ｐ＜０．０５対１８：００時間間隔、反復測定一方向ＡＮＯＶＡとそれに続くＴｕｋｅｙ検定を用いて決定した。
図５：ＲｖＤ２ n-3 DPA およびＲｖＤ５ n-3 DPA は、健常ボランティア末梢血にお ける単球、好中球および血小板活性化を低下させる。健常ボランティアから採血し、ＲｖＤ２n-3 DPA、ＲｖＤ５n-3 DPA（０．１ｎＭ、１ｎＭまたは１０ｎＭ）またはベヒクル（ＰＢＳ）と共に１５分間インキュベートした後（３７oＣ）、ＰＡ（１００ｎｇ／ｍｌ；３０分；３７oＣ）とインキュベートした。細胞活性化および白血球－血小板凝集体を、フローサイトメトリーを用いて評価した。（Ａ，Ｂ）好中球（Ａ）、ＣＤ１１ｂおよび（Ｂ）ＣＤ６２Ｐ発現を示す代表的なヒストグラム。（Ｃ，Ｄ）累積好中球（Ｄ）ＣＤ１１ｂおよび（Ｄ）ＣＤ６２Ｐ発現。（Ｅ，Ｆ）単球（Ｅ）ＣＤ１１ｂおよび（Ｆ）ＣＤ６２Ｐ発現。結果は、１時点あたりのｎ＝５の平均であり、ＰＡＦインキュベート細胞からの変化パーセンテージとして表される。＊ ｐ＜０．０５（１サンプルｔ検定を用いたＰＡＦと比較し、続いてｐ値のＳｉｄａｋ補正を行った。）
図６．全身性ｎ‐３ ＤＰＡ由来ＳＰＭは減少し、かつ、白血球活性化はＣＶＤ 患者で増加する。心血管疾患（ＣＶＤ）と診断された患者からの末梢血を、９：００時間（ＡＭ）および１６：００～１８：００時間（ＰＭ）に採取した。血漿を、内部標準を含有する氷冷メタノール中に置き、そして、ＬＭプロファイリングを用いて、ＬＭを同定および定量した（詳細については方法を参照のこと）。（Ａ）同定されたｎ－３ ＤＰＡ ＳＰＭの代表的なＭＲＭ。（Ｂ）ＲｖＤ５n-3 DPAの同定に使用したＭＳ－ＭＳスペクトル。結果は、ｎ＝９のＣＶＤ患者を代表する。（Ｃ）血漿中ＲｖＤ n-3 DPA濃度。結果は、平均±標準偏差．であり、ｐｇ／ｍＬとして表される。ｎ＝９人のＣＶＤ患者およびｎ＝７人の健常ボランティア（ＨＶ）。＊，ｐ≦０．０５、および**、ｐ≦０．０１（示した対照と比較する）。（Ｄ－Ｇ）全血を蛍光標識抗体と共にインキュベートし、細胞活性化ならびに白血球－血小板凝集体を、フローサイトメトリーを用いて評価した。（Ｄ，Ｅ）（Ｄ）好中球および（Ｅ）単球上でのＣＤ１１ｂ発現。（Ｆ，Ｇ）（Ｆ）好中球および（Ｇ）単球上のＣＤ６２Ｐ発現。（Ｈ）血漿ＡＣｈ濃度。結果は、結果は、平均±標準偏差であり、そして、１８：００時間間隔での抗原発現パーセンテージとして表される。ｎ＝５のＨＶ、およびＣＶＤ患者９例。＊＊ｐ＜０．０１（非対ｔ検定を用いて決定されたＨＶと比較した。）
図７：ＣＶＤ患者におけるＲｖＤ n-3 DPA 経路の調節不全。末梢血を、９：００時（午前）および１６：００～１８：００時（午後）に、ＣＶＤ患者および健常ボランティア（ＨＶ）から収集した。血漿を回収し、重水素標識内部標準を含有する氷冷メタノール中に置いた。ＬＭプロファイリングを使用して、ＬＭを抽出し、同定し、定量する（詳細については上記の方法を参照のこと）。（Ａ）ｎ－３ ＤＰＡ、（Ｂ）１７－ＨＤＰＡおよび（Ｃ）７－ＨＤＰＡ濃度。結果は、ｐｇ／ｍＬとして表される、平均±標準偏差である。間隔あたり、Ａについては、ｎ＝４ＨＶおよびＣＶＤ患者１１名であり、Ｂ－Ｃについては、ｎ＝７ＨＶおよびＣＶＤ患者１１名である。ＨＶまたはＣＶＤ間の比較のためには片側スチューデント対ｔ検定を使用して、および、ＨＶとＨＲＭＩ間の比較のためには片側スチューデント非対ｔ検定を用いて、示された対照と比較した。＊ｐ≦０．０５および＊＊ｐ≦０．０１。
図８：ＲｖＤ２ n-3 DPA およびＲｖＤ５ n-3 DPA は、ＣＶＤ患者からの末梢血にお ける白血球活性化を減少させる。心血管疾患（ＣＶＤ）と診断された患者からの末梢血を９：００時に採取した。（Ａ－Ｄ）全血をＲｖＤ２n-3 DPAまたはＲｖＤ５n-3 DPA（０．１ｎＭ、１ｎＭまたは１０ｎＭ）またはビヒクル（０．０１％ ＥｔＯＨを含有するＰＢＳ）と共に４５分間インキュベートした（３７oＣ）。（Ａ）好中球、（Ｂ）単球におけるＣＤ１１ｂ、および、（Ｃ）好中球および（Ｄ）単球におけるＣＤ６２Ｐの発現を、フローサイトメトリーおよび蛍光標識抗体を用いて調べた。結果は、平均±標準偏差であり、そしてビヒクル（Ｖｅｈ）でインキュベートした細胞のパーセンテージとして表される。ｎ＝間隔あたり８患者。＊ｐ＜０．０５ 対ビヒクル群（ｏｎｅ－ｓａｍｐｌｅ ｔ検定を使用して、続いてｐ値のＳｉｄａｋ校正。）
図９：ＲｖＤ２ n-3 DPA およびＲｖＤ５ n-3 DPA カウンター調節ＰＡＦは、ＣＶＤ 患者由来の末梢血において、血小板および白血球活性化を誘導した。 全血を、ＲｖＤ２n-3 DPAまたはＲｖＤ５n-3 DPA（０．１ｎＭ，１ｎＭまたは１０ｎＭ）またはビヒクル（０．０１％ ＥｔＯＨを含有するＰＢＳ）で１５分間インキュベートし、次にＰＡＦ （１００ｎｇ／ｍｌ）で３０分間インキュベートした（３７oＣ）。（Ａ）好中球、（Ｂ）単球におけるＣＤ６２Ｐ，および、（Ｃ）好中球および（Ｄ）単球におけるＣＤ１１ｂの発現を、フローサイトメトリーおよび蛍光標識抗体を用いて調べた。結果は平均±標準偏差であり、ＰＡＦでインキュベートした細胞のパーセンテージとして表した。ｎ＝間隔あたり９人の患者。＊ｐ＜０．０５(対ビヒクル群。ｏｎｅ－ｓａｍｐｌｅ ｔ検定を使用して、続いてｐ値のＳｉｄａｋ校正。
図１０：ＲｖＤ５ n-3 DPA は、アポＥ -/- マウスにおいて、全身性の、血小板お よび白血球活性化ならびに心血管疾患を低下させる。アポＥ-/-マウスに、６週間西洋食を与え、ＲｖＤ５n-3 DPA（１００ｎｇ／マウス； ｉ．ｖ．）を隔日で２週間与えた。血液を採取し、ＣＤ４１、ＣＤ６２ＰおよびＣＤ１１ｂの、（Ａ）単球（Ｂ）好中球の発現をフローサイトメトリーを用いて測定した。（Ｃ）Ｏｉｌ ｒｅｄ－Ｏを用いて、大動脈弓を染色し、ＩｍａｇｅＪを用いて染色強度を決定した。（Ｄ）下行大動脈を採取し、ＰＧＤ2、ＰＧＥ2、ＰＧＦ2αおよびＴｘＢ2のレベルをＬＣ／ＭＳ－ＭＳを用いて定量した。結果は、１群あたり４～５匹のマウスの平均±標準偏差である。＊Ｐ＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔｓ ｔ－検定を用いてビヒクル処置マウスに対して）。
図１１は、本発明による、個々の患者における心血管疾患の治療または予防に使用するための薬剤の効力を評価する方法の一例を示す流れ図である。
図１２は、イムノアッセイを実施するためにマイクロ流体デバイスを使用して本発明の方法を実施するための装置の概略図である。
図１３は、本発明のイムノアッセイを組み込んだ、本発明によるマイクロ流体デバイスの概略図である。
図１４は、ＬＭ－ＳＰＭ健康ボランティアの日周制御。示された間隔で健康なボランティアから末梢血を採取し、血漿を重水素標識内部標準を含有する氷冷メタノール中に置いた。ＬＭプロファイリングを用いて、脂質メディエーター（ＬＭ）を抽出し、同定し、定量した（詳細については方法を参照のこと）。（Ａ）同定されたＬＭのための代表的なＭＲＭ、（Ｂ）ＲｖＤ５n-3 DPAの同定のために使用されたＭＳ－ＭＳスペクトル。結果は、ｎ＝７人の健康なボランティアの代表である。（Ｃ）ＤＨＡメタボロームの濃度、（Ｄ）ＥＰＡメタボロームの濃度、（Ｅ）ＰＧの濃度、（Ｆ）ＬＴＢ4メタボロームの濃度。結果は、ｐｇ／ｍＬとして表される、平均±標準偏差である。ｎ＝間隔あたり７人のボランティア。（Ｇ）２１：００、１１：００および１６：００時に、ＷＴおよびＢＭＡＬ１‐ＬｙｓＭ-/-マウスから採血し、脂質メディエータプロファイリングを用いて、ＲｖＤｎ‐３ ＤＰＡを同定し、定量した。結果は、平均±標準偏差であり、ｎ＝群あたり ３匹のマウスである。
図１５：朝のＲｖＤ n-3 DPA 濃度は、末梢血好中球活性化と負に相関する。末梢血を、示された間隔で健康なボランティアから収集し、ＬＭプロファイリング（詳細については方法を参照のこと）を使用してＬＭ濃度を決定し、そして好中球および血小板活性化を、蛍光標識抗体およびフローサイトメトリーを使用して決定した。（Ａ）好中球ＣＤ４１発現。結果は、平均±標準偏差、間隔あたりｎ＝７人のボランティアであり、１８：００時の抗原発現のパーセンテージとして表される。グレーパネルの結果は、律動性の可視化（ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｙｔｈｍｉｃｉｔｙ）を助けるために白色部分から再プロットされる。（Ｂ，Ｃ）好中球（Ｂ）における、ＣＤ１１ｂおよび（Ｃ）ＣＤ６２Ｐ（９：００～１８：００）発現の変化と９：００時のＲｖＤn-3 DPA濃度との相関。結果は、ｎ＝８のボランティアを代表する。破線は９５％信頼区間を表す。
図１６：アセチルコリンは、健康なボランティアからの末梢血中のｎ－３ Ｄ ＰＡ ＳＰＭをアップレギュレートする。（Ａ）健康なボランティアから血液を採取し、ＬＣ／ＭＳ－ＭＳを用いてアセチルコリンレベルを測定した。結果は、平均±標準偏差。ｎ＝７人の健常ドナー／条件であり、ｎｇ／ｍＬとして表される。＊ｐ≦０．０５（対ウイルコクソン符号化順位検定：Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｓｉｇｎｅｄ Ｒａｎｋ検定を用いた１８時の濃度。律動性の可視化（ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｙｔｈｍｉｃｉｔｙ）を助けるために、灰色のパネルの結果は白色部分から再プロットした。（Ｂ－Ｄ）血液を健康なボランティアから採取し、アセチルコリン（ＡＣｈ；０．１μＭ；４５分；３７oＣ）とインキュベートした。インキュベーションを氷冷メタノールでクエンチし、ｎ－３ ＤＰＡ由来ＬＭを同定し、ＬＭプロファイリングを用いて定量した（詳細については方法を参照のこと）。（Ｂ）同定したｎ‐３ ＤＰＡ ＳＰＭの代表的ＭＲＭ。（Ｂ，Ｃ）（Ｃ）ＲｖＤ２n-3 DPAの同定のために使用されるＭＳ‐ＭＳスペクトル。結果は、ｎ＝９人の健常ドナーの代表。（Ｄ）血漿中ＲｖＤn-3 DPA濃度。結果は、平均±標準偏差。ｎ＝９人の健常ドナー／条件、であり、ｐｇ／ｍＬとして表される。＊＊，ｐ≦０．０１（対Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いた、対ビヒクルインキュベーション（Ｖｅｈ）。（Ｅ）末梢血を、ＡＣｈ（１０ｎＭ）またはＶｅｈ（ＰＢＳ）でインキュベートした後、０．１Ｐａで、３７℃で２０分間潅流した。ｎ＝６人の健常ボランティア。血漿を採取し、ＬＭプロファイリングを用いて、ＲｖＤn-3 DPA濃度を確認した。＊，ｐ≦０．０５（対Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ対検定を用いた、対ビヒクルインキュベーション（Ｖｅｈ）。
図１７：せん断（ｓｈｅｅｒ）アップレギュレート血漿ＲＶＤ n-3 DPA の増加 。（Ａ）末梢血を０．１（低）または０．３（高）Ｐａで、３７℃で２０分間潅流した。血漿を採取し、ＬＭプロファイリングｎ ＝ ６の健常ボランティアを用いてＲｖＤn-3 DPA濃度を確認した。＊，ｐ≦０．０５（対Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いた対低せん断（ｓｈｅｅｒ）群）。
図１８：ＣＶＤ患者におけるＲｖＤ n-3 DPA 経路およびＡＣｈの調節不全。末梢血を、ＣＶＤを有する患者および健康なボランティア（ＨＶ）から、９：００時（ＡＭ）１２：００（正午）および１６：００～１８：００時（ＰＭ）に収集した。血漿を回収し、重水素標識内部標準を含有する氷冷メタノール中に置いた。ＬＭプロファイリングを用いて、ＬＭを抽出し、同定し、定量した（詳細については方法を参照のこと）。（Ａ）７－ＨＤＰＡ、（Ｂ）１７－ＨＤＰＡおよび（Ｃ）ｎ－３ ＤＰＡ濃度。結果は、ｐｇ／ｍＬとして表される平均±標準偏差、である。Ａ－Ｃについては、ｎ＝間隔あたり７ＨＶ、午前、午後について１４人のＣＶＤ患者、および正午について５人のＣＶＤ患者。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（Ｄ）血漿ＡＣｈ濃度を用いたそれぞれのＨＶ ＲｖＤn-3 DPA濃度と比較して、＊ｐ≦０．０５および＊＊ ｐ≦０．０１。ｎ＝９患者。＊ｐ≦０．０５であり、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ対検定を用いてＰＭ値と比較した。
図１９は、ＲｖＤ２ n-3 DPA およびＲｖＤ５ n-3 DPA は、ＣＶＤ患者由来の末梢 血におけるＰＡＦ誘導血小板および白血球活性化をカウンター調節する。全血をＲｖＤ２n-3 DPAまたはＲｖＤ５n-3 DPA（０．１ｎＭ，１ｎＭまたは１０ｎＭ）またはベヒクル（０．０１％ ＥｔＯＨ含有ＰＢＳ）で１５分間インキュベートし、次にＰＡＦ （１００ｎｇ／ｍｌ）で３０分間インキュベートした（３７oＣ）。（Ａ）好中球（Ｂ）単球におけるＣＤ６２Ｐ、および（Ｃ）好中球および（Ｄ）単球におけるＣＤ１１ｂの発現を、フローサイトメトリーおよび蛍光標識抗体を用いて調べた。結果は平均±標準偏差であり、ＰＡＦでインキュベートした細胞のパーセンテージとして表した。ｎ＝９人患者／群。＊ｐ＜０．０５（ウイルコクソン符号化順位検定：Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｓｉｇｎｅｄ Ｒａｎｋ検定を用いて、ＰＡＦ群に対する）。
図２０：血管ｎ－３ ＤＰＡ由来ＳＰＭは、ヒト健康志願者において日周的に 調節される。示された間隔で、健康なボランティアから末梢血を収集し、ＬＭプロファイリングを使用してＬＭ濃度を決定した（詳細については方法を参照のこと）。（Ａ）示された間隔で、異なるＬＭ－ＳＰＭプロフィールで特定されたヒト血漿のＰＬＳ－ＤＡ ２次元スコアプロット、および（Ｂ）対応する２次元負荷プロット。スコアプロットにおける灰色の楕円は、９５％信頼領域を示す。灰色および青色の円は、重要性スコア≧１の変数を有するＬＭを表し、ｎ＝４人の健康なボランティア／間隔である。（Ｃ）ｎ－３ ＤＰＡ由来ＳＰＭ濃度を、各時間間隔で同定し、定量した。結果は、平均±標準偏差であり、ｎ＝１時点あたり７人であり、ｐｇ／ｍＬとして表される。＊，ｐ≦０．０５（ウイルコクソン符号化順位検定：Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｓｉｇｎｅｄ Ｒａｎｋ検定を用いた、対８時間間隔での量）。（Ｄ）好中球 ＣＤ１１ｂ発現。（Ｅ－Ｆ）単球（Ｅ）ＣＤ１１ｂおよび（Ｆ）ＣＤ４１発現。結果は、平均±標準偏差、間隔あたりｎ＝７人のボランティアであり、１８：００時の抗原発現のパーセンテージとして表される。＊ｐ＜０．０５（対１８：００時の間隔（ウイルコクソン符号化順位検定：Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｓｉｇｎｅｄ Ｒａｎｋ検定を用いて決定。灰色パネルの結果は、律動性の可視化（ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｈｙｔｈｍｉｃｉｔｙ）を助けるために白色部分から再プロットする。（Ｇ、Ｈ）単球（Ｇ）ＣＤ１１ｂおよび（Ｈ）ＣＤ６２Ｐ（９：００～１８：００）発現の変化と９：００ ＲｖＤ n-3 DPA濃度の間の相関。結果は、ｎ＝８のボランティアを代表する。破線は９５％信頼区間を表す。
図２１は、ＲｖＤ２ n-3 DPA およびＲｖＤ５ n-3 DPA は、健常志願者末梢血にお ける単球、好中球および血小板活性化を減少させる。健常ボランティアから採血し、ＲｖＤ２n-3 DPA、ＲｖＤ５n-3 DPA（０．１ｎＭ、１ｎＭまたは１０ｎＭ）またはビヒクル（ＰＢＳ）と共に、１５分間インキュベートした後（３７oＣ）、ＰＡＦ（１００ｎｇ／ｍｌ；３０分；３７℃）とインキュベートした。細胞活性化および白血球－血小板凝集体を、フローサイトメトリーを用いて評価した。（Ａ，Ｂ）血小板単球（Ａ）および（Ｂ）血小板－好中球凝集体を示す画像。結果は、ｎ＝３の異なる実験の代表である。（Ｃ、Ｄ）累積好中球 （Ｃ）ＣＤ１１ｂおよび（Ｄ）ＣＤ６２Ｐの発現。（Ｅ、Ｆ）単球 （Ｅ）ＣＤ１１ｂおよび（Ｆ）ＣＤ６２Ｐの発現。結果は、条件当たりのｎ＝５の平均であり、ＰＡＦでインキュベートした細胞からのパーセンテージ変化として表される。＊ｐ＜０．０５（ウイルコクソン符号順位検定を用いて、ＰＡＦと比較して）（Ｇ）多血小板血漿をビヒクル（ＰＢＳ）またはＲｖＤ５n-3 DPA０．１－１０ｎＭ（１５分； ３７℃）およびＰＡＦ（１００ｎＭ；３０分；３７℃）とインキュベートした。接着分子発現は、フローサイトメトリーを用いて評価した。結果は平均±標準偏差である。ｎ＝５人の健常ボランティア。＊ｐ，０．０５（Ｆｒｉｅｄｍａｎ検定とそれに続くＤｕｎｎの多重比較検定を用いて、ビヒクル群と比較）。
図２２：全身性ｎ－３ ＤＰＡ由来ＳＰＭが減少し、白血球活性化がＣＶＤ患 者において増加する。心血管疾患（ＣＶＤ）と診断された患者からの末梢血を、１６：００～１８：００時（ＰＭ）、９：００時（ＡＭ）および１２：００（正午）採取し、ＬＭプロファイリングを用いて、ＬＭを同定および定量した（詳細については方法を参照のこと）。（Ａ）血漿中ＲｖＤn-3 DPA濃度。結果は、平均±標準偏差．であり、ｐｇ／ｍＬとして表される。ｎ＝ＡＭ、ＰＭについて１４例、５例の正午、および、ｎ＝７例の健常ボランティア（ＨＶ）。＊，ｐ≦０．０５および＊＊、ｐ≦０．０１（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して、ＨＶ群とそれぞれ比較し；＃ｐ＜０．０５（Ｆｒｉｅｄｍａｎ検定、次いで、Ｄｕｎｎの多重比較検定を用いた、ＰＭ値に対して）（Ｂ－Ｅ）全血を、蛍光標識抗体と共にインキュベートし、そして、細胞活性化ならびに白血球－血小板凝集物をフローサイトメトリーを用いて評価した。（Ｂ，Ｃ）（Ｂ）好中球および（Ｃ）単球におけるＣＤ１１ｂの発現。（Ｄ，Ｅ）（Ｄ）好中球および（Ｅ）単球におけるＣＤ６２Ｐの発現。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号付順位検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｓｉｇｎｅｄ Ｒａｎｋ Ｔｅｓｔ）を用いて測定したＨＶと比較した。）ｎ＝５例のＨＶ、および、９例のＣＶＤ患者。（Ｆ－Ｊ） （Ｆ）好中球ＣＤ４１（Ｇ－Ｈ）単球（Ｇ）ＣＤ１１ｂおよび（Ｈ）ＣＤ４１と（Ｉ－Ｊ） 血小板（Ｉ）ＣＤ６３および（Ｊ）ＣＤ４２ｂ発現と９：００のＲｖＤn-3 DPA濃度の変化率の関係。 結果は、ｎ＝８～１０人の患者を代表する。破線は９５％信頼区間を表す。
図２３：ＣＶＤ患者由来の末梢血白血球におけるＲｖＤ n-3 DPA 生合成酵素の 調節不全日周調節。 健常ボランティア（ＨＶ）および心血管疾患（ＣＶＤ）と診断された患者からの末梢血を、９：００時（ＡＭ）および１２：００時（正午）および１６：００時（ＰＭ）に採取した。蛍光標識抗体およびフローサイトメトリーを用いて、白血球サブセットおよび生合成酵素を同定した。１５－ＬＯＸと５－ＬＯＸの（Ａ）白血球（Ｂ）単血球（Ｃ）と好中球における発現。結果は、平均±標準偏差、であり、平均蛍光強度単位（ＭＦＩ）として表される；ｎ＝３ＨＶ、ｎ＝４ＣＶＤ患者。＊，ｐ≦０．０５ ＊＊ｐ＜０．０１ ＊＊＊ｐ＜０．００１（ＡＭ群、正午群およびＰＭ群間の比較のために、非対ｔ検定、およびＴｕｋｅｙ多重比較検定を用いた１－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いて測定したＨＶと比較）。
図２４：アデノシンの増加は、ＣＶＤ患者における保護的ＲｖＤ n-3 DPA の濃 度をダウンレギュレートする。（Ａ）血漿アデノシン濃度は、ＬＣ／ＭＳ－ＭＳを用いて決定した。結果は、平均±標準偏差、ｎ＝７例のＨＶ、および、９例のＣＶＤ患者である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いた）。（Ｂ）ＣＶＤ患者の末梢血をＡＤＡ（１Ｕ；３７℃；２０分）とインキュベートした後、潅流した（０．３Ｐａ、２０分、３７℃）。血漿を採取し、そして、ＬＣ／ＭＳ‐ＭＳベースの脂質メディエータプロファイリングを用いてＲｖＤn-3 DPA濃度を測定した。結果は平均±標準偏差である。ｎ＝６ドナー。＊ｐ＜０．０５（対Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（Ｃ－Ｅ）を用いた。）（Ｃ－Ｅ）全血を、ＲｖＤ２n-3 DPAまたはＲｖＤ５n-3 DPA（０．１ｎＭ、１ｎＭまたは１０ｎＭ）またはビヒクル（０．０１％ ＥｔＯＨを含むＰＢＳ）と共に４５分間インキュベートした（３７℃）。（Ｃ）好中球ＣＤ６２ＰおよびＣＤ１１ｂ （Ｄ）単球ＣＤ６２ＰおよびＣＤ１１ｂならびに（Ｅ）血小板ＣＤ６３およびＣＤ４２Ｐの発現を、フローサイトメトリーおよび蛍光標識抗体を用いて調べた。結果は、平均±標準偏差、であり、そしてビヒクル（Ｖｅｈ）インキュベートした細胞のパーセンテージとして表される。ｎ＝間隔あたり８例の患者。＊ｐ＜０．０５（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｓｉｇｎｅｄ Ｒａｎｋ検定を用いた対Ｖｅｈ群）。
図２５：ＲｖＤ５ n-3 DPA は、ＡｐｏＥ -/- マウスにおける全身血小板および白 血球活性化ならびに血管炎症を低下させる。ＡｐｏＥ-/-マウスに、６週間、西洋食を与え、ＲｖＤ５n-3 DPA（１００ｎｇ／マウス； ｉ．ｖ．）を隔日で２週間与えた。血液を採取し、ＣＤ４１、ＣＤ６２ＰおよびＣＤ１１ｂの（Ａ）単球（Ｂ）好中球発現をフローサイトメトリーを用いて測定した。（Ｃ）下行大動脈を採取し、脂質メディエーターをＬＣ／ＭＳ－ＭＳにベース脂質メディエータープロファイリングを用いて抽出し、同定し、定量した。別個のＬＭ－ＳＰＭプロフィールのＰＬＳ－ＤＡ ２次元スコアプロットは、マウス大動脈組織（トップパネル）および対応する２次元負荷プロットを同定した。スコアプロットにおける灰色の楕円は、９５％信頼領域を示す。緑色および青色の円は、重要度スコア≧１の変数を有するＬＭを表す（下のパネル）。（Ｄ）Ｏｉｌ ｒｅｄ－Ｏを用いて大動脈弓を染色し、ＩｍａｇｅＪを用いて染色強度を決定した。結果は、群あたり４匹のマウスの平均±標準偏差である。＊ｐ＜０．０５（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いてビヒクル処置マウスに対して）。
実施例
下記の実施例１および９に開示されているように、健常ボランティアからの血漿の脂質メディエータ（ＬＭ）プロファイリングは、午前７時から午前９時の間に、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン（ＲｖＤ n-3 DPA）の有意な増大を実証した。これらの時間間隔で、単球、血小板および好中球活性化マーカーの発現の増加が、健康なボランティア末梢血において見出された。下記実施例３に開示されるように、心血管疾患者は、血漿ＲｖＤn-3 DPAの低下、これらの分子の日周調節の喪失、および循環血小板、好中球および単球の活性化の増加を示した。これらの患者の末梢血を、ＲｖＤ２n-3 DPAおよびＲｖＤ５n-3 DPAと共にインキュベートすると、下記実施例５および１３に開示されているように、特異的血小板、単球および好中球活性化マーカーの発現が低下した。さらに、以下の実施例６および１４に開示されているように、アポリポ蛋白Ｅ欠損（Ａｐｏ Ｅ）-/-マウスへのＲｖＤ５n-3 DPAの投与は、全身白血球および血小板活性化を低下させ、血管疾患から保護した。
材料および方法
健康ボランティアの採血
ＮＳＡＩＤＳを少なくとも１４日間、カフェインおよびアルコールを少なくとも２４時間、脂肪魚を４８時間摂取していないと宣言した空腹のボランティアから、静脈末梢血をクエン酸ナトリウム（３．２％）中で指示された間隔で収集した。血液を、同じ日に、同じボランティアからの継続出血（ｓｅｑｕｅｌ ｂｌｅｅｄ）を介して収集した。１２：００時の採血後、食物を全ボランティアに与えた。ボランティアは、Ｑｕｅｅｎ Ｍａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＱＭＲＥＣ ２０１４：６１）およびＨｅｌｓｉｎｋｉ宣言に従って書面による同意を与えた。次いで、フローサイトメトリーおよび脂質メディエータープロファイリング分析のために血液を採取した。
ＣＶＤ患者の採血
空腹時患者をスクリーニングし、包含／除外基準を満たす患者が、Ｅａｓｔ ｏｆ Ｅｎｇｌａｎｄ‐Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ ＣｏｍｍｉｔｔｅｅおよびＪｏｉｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ（ＪＲＭＯ）、Ｑｕｅｅｎ Ｍａｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｎｄｏｎに従って、８：００～９：００時、１２：００時および１６：００～１８：００時の間に血液を得ることに同意した。
包含基準は、ｉ）治療を必要とする重篤な冠動脈疾患；ｉｉ）経皮的冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）のための入院；ｉｉｉ）ＰＣＩ後２４時間以上；ｉｖ）インフォームドコンセントを提供することができる；ｖ） １８歳以上およびｖｉ）以下の危険因子のうちの少なくとも２つであった：高血圧、高コレステロール、喫煙者、糖尿病、既知の虚血性心疾患。
除外基準は、ｉ）持続性心室頻拍および／または心室細動、または介入を必要とする適切なＩＣＤ弁疾患； ｉｉ）ＰＣＩに対する禁忌；ｉｉｉ）妊娠している女性；ｉｖ） １８歳以下；およびｖ）他の研究に登録された。
これらの血液サンプルを、以下に詳述するように、脂質メディエータープロファイリングおよび全血刺激のために、収集の６０分以内に処理した。
標的脂質メディエータープロファイリング
血漿は、健康なボランティアおよび患者の末梢血から、室温で１０分間１５００×ｇで遠心分離した後に得た。下行大動脈を秤量し、氷冷メタノール中に置き、ドゥンス型ガラス（ｄｏｕｎｃｅ）を用いてホモジナイズした。
ＬＣ－ＭＳ－ＭＳに基づくプロファイリングのための全てのサンプルは、Ｄａｌｌｉら、２０１３およびＲａｔｈｏｄら、２０１７に記載されるように、固相抽出カラムを使用して抽出され、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
サンプル抽出の前に、クロマトグラフィー分析における各領域を表す重水素化内部標準（各５００ｐｇ）を添加して、４Ｖの冷メタノール中での定量を容易にした。
サンプルを－２０℃で最短４５分間保持し、タンパク質沈殿を可能にした。
上清を固相抽出にかけ、ギ酸メチル画分を収集し、乾燥させ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０ＡＤ ＨＰＬＣおよびＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＩＬ－２０ＡＣオートインジェクター上に注入するために、相（メタノール／水、１：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に懸濁させ、線形イオントラップの有無にかかわらず、三重の四重極質量分析計（ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）と対にした。
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８カラム（１００ｍｍ×４．６ｍｍ×２．７μｍ）を５０℃に保ち、２０：８０：０．０１（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）のメタノール－水－酢酸からなる移動相を用いてメディエーターを溶出し、０．５分かけて５０：５０：０．０１（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）に、次いで２分から１１分に８０：２０：０．０１（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）に傾斜させ、１４．５分まで維持し、次いで次の０．１分間９８：２：０．０１（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）に急速に傾斜させた。続いて、これを９８：２：０．０１（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）に５．４分間維持し、流速を０．５ｍｌ／分に維持した。質量分析計は、Ｗａｌｋｅｒ ＭＥら、１３－Ｓｅｒｉｅｓ ｒｅｓｏｌｖｉｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｈｅ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ－ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ ａｎｄ ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２０１７ Ａｕｇ；３１（８）：３６３６－３６４８の、多重反応モニタリング法を用いて操作した。その内容は、参照により、組み込まれている。
各ＬＭは、合成および真正材料に、少なくとも６つの診断用イオン（Ｗａｌｋｅｒ ＭＥら、２０１７． ｉｂｉｄ．）について、保持時間を適合させることを含む、確立された基準を用いて同定された。
ｒ2値０．９８～０．９９の線形検量線を与える、０．７８、１．５６、３．１２、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、および２００ｐｇでの合成化合物混合物を用いて、各々の検量線を得た。
アセチルコリン、ノルエピネフリンおよびアデノシンのプロファイリング。
血漿を重水素化（ｄ9）‐コリンを含む氷冷ＭｅＯＨ中に入れ、－２０℃で４５分間保存し、タンパク質のを沈殿を得た。次いで、サンプルを、４０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、ＴｕｒｂｏＶａｐ ＬＶ（Ｂｉｏｔａｇｅ）を用いて、穏やかな窒素ガス流下、３７℃で乾燥するまで蒸発させた。次に、生成物を、ＬＣ／ＭＳ－ＭＳシステムを用いてプロファイリングしたＭｅＯＨに懸濁した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＩＬ－２０ＡＣオートインジェクターおよびＬＣ－２０ＡＤバイナリーポンプ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社）を装備したＱｔｒａｐ ５５００（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８カラム（１００ｘ４．６ｍｍｘ１．８μｍ）と共に使用した。移動相は、メタノール／水／酢酸、８０：２０：０．０１（ｖｏｌ：ｖｏｌ：ｖｏｌ）から２．５分間構成され、これを０．２分間かけて９８：２：０．０１（ｖｏｌ：ｖｏｌ：ｖｏｌ）に傾斜させ、１．３分間維持した。流速を０．５ｍｌ／分に維持した。アセチルコリンおよびノルエピネフリンのレベルをモニターおよび定量するために、Ｑｔｒａｐ ５５００をポジティブモードで操作し、親イオン（Ｑ１）および娘イオン（Ｑ３）をモニターする各分子のシグネチャイオンフラグメント（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）（ｍ／ｚ）を用いて多重反応モニター（ＭＲＭ）法を開発した。アセチルコリンについて用いられたＭＲＭ転移は、１４６＞８７であり、ノルエピネフリンについては１７０＞１５２であり、アデノシンについては２６８＞１３６であった。
ＲｖＤ１ n-3 DPA およびＲｖＤ２ n-3 DPA の調製
ＲｖＤ１n-3 DPAおよびＲｖＤ２n-3 DPAを、Ｄａｌｌｉ Ｊ， Ｃｏｌａｓ ＲＡ， Ｓｅｒｈａｎ ＣＮ （Ｎｏｖｅｌ ｎ－３ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｏｌｖｅｎｔｓ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ａｃｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：１９４０）に記載されるように調製し、単離した。新規なｎ－３免疫レゾルベント：構造および作用。Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：１９４０（その内容は、参照により組み込まれる）。ｎ－３ ＤＰＡ（１０μＭ）を、１００ Ｕ／ｍｌの単離ダイズ－ＬＯＸ（ホウ酸緩衝液、４℃、ｐＨ ９．２）と共にインキュベートした。１７Ｓ－ＨｐＤＰＡを、ＵＶ－ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０； Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した。次に、１７Ｓ－ＨｐＤＰＡ（１０μｇ）をヒト好中球（８０ｘ１０６細胞／ｍｌ；ＰＢＳ+/+）およびカルシウムイオノホア（５μＭ、３７℃）とインキュベートした。４５分後、２容量の氷冷メタノールを用いて反応をクエンチし、水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元し、Ｃ１８ ＳＰＥを用いて生成物を抽出した。ＲｖＤ１n-3 DPAおよびＲｖＤ２n-3 DPAを、ＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離した。ここで、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ－Ｃ１８カラム（１００ｍｍ×４．６ｍｍ×２．７μｍ）を５０℃に保ち、６０：４０：０．０１（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）のメタノール－水－酢酸からなる移動相を２分間維持した後、８０：２０：０．０１（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）まで、２分間から１６分間、および９８：２：０．０１（ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ）まで３分間かけて傾斜させた。これを２分間維持して、ＬＭを単離した。流速を０．５ｍＬ／分に維持した。
ヒト全血インキュベーション
以下の実施例１および９において、健康なボランティアからの静脈血を収集し、そして、アセチルコリン（ＡＣｈ）と共に０．１μＭで４５分間（３７℃）インキュベートした。次いで、血漿を、ＬＭプロファイリングのために、１，５００×ｇで１０分間の遠心分離によって分離した。
以下の実施例３、５、１１及び１３では、全血を、ＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPA、ＲｖＤ５n-3 DPA（０．１、１、１０ｎＭ）又はビヒクル（ＰＢＳ）と共に１５分間インキュベートした（３７°Ｃ）。次いで、血液を、ＰＡＦ（１００ｎＭ）と共に３０分間インキュベートした（３７℃）。
刺激後、サンプルを８００×ｇで１２分間ＰＢＳで２回洗浄した。サンプルを、以下に記載されるようにフローサイトメトリーのために染色した。
フローチャンバー：
小径チュービング（内径１．６ｍｍ）およびチャンバスライド（１５μ－スライド ＶＩ0.4、Ｉｂｉｄｉ）に接続された自動シリンジポンプ（ハーバード装置）を使用して、全血を、０．１ダイン／ｃｍ2（低剪断速度）の剪断速度および０．３ダイン／ｃｍ2（高剪断速度）で１５分間潅流した。選択された実験において、血液を１０ｎＭ Ａｃｈまたは１ｕのＡＤＡと共に２０分間インキュベートした後、潅流した。
ＰＲＰインキュベーション：
健康なボランティアからの末梢血を、酸性化クエン酸－デキストロース中に収集した。
血液を、５００×ｇで２０分間遠心分離した。ＰＲＰを採取し、細胞をＲｖＤ５n-3 DPAまたはビヒクル（０．０１％ ＥｔＯＨ ＋ ＰＢＳ）と共に３７℃で１５分間インキュベートした。次に、細胞をＰＡＦ（１００ｎＭ）またはビヒクル（０．０１％ ＥｔＯＨ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、以下に詳述するようにフローサイトメトリーを用いて細胞活性化を評価した。
アポＥ -/- マウス
以下の実施例６および１４に記載される実験は、英国のホームオフィス規則（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ａｃｔ， １９８６）およびＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ （ＬＡＳＡ）ガイドライン（Ｇｕｉｄｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｎ Ｇｏｏｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ ａｎｄ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏｄｉｅｓ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２０１５）に、厳密に、忠実に従った。アポＥ-/-マウスは、Ｆｕｌｖｉｏ Ｄ’Ａｃｑｕｉｓｔｏ（ロンドンのクイーンメアリー大学）教
授の親切な贈り物であった。
マウス（雄および雌）に、４週齢から６週間、西洋の食餌を与え、１２時間の明暗サイクルを維持した。８週齢で、マウスに、ＲｖＤ５n-3 DPA（１００ｎｇ／マウス；ｉ．ｖ．）またはビヒクルを隔日で２週間与えた。マウスを殺し、大動脈弓を収集し、Ｋｈａｍｂａｔａ ＲＳらのように、オイルレッドＯを用いて染色した。無機硝酸塩の抗炎症作用は、アテローム硬化性プラークを安定化させる。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１７；１１４（４）：Ｅ５５０－Ｅ５５９（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）。染色強度は、画像処理ソフトウエアを用いて決定し、ｍｍ2当たりの相対単位で表した。下行大動脈を収集し、氷冷メタノール中に置き、脂質メディエーターを上記のように同定し、定量した。
フローサイトメトリー
全血を、系統特異的マーカー（ｌｉｎｅａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ）と共に４５分間インキュベートした（４℃、０．０２％ ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ中）。以下の抗ヒト抗体を使用した：ＶｉｏＢｌｕｅ－ａｎｔｉ－ＣＤ４１、ＰＥ－Ｃｙ５－ａｎｔｉ－ＣＤ６２Ｐ、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７１１－ａｎｔｉ－ＣＤ１１ｂ、ＡＰＣ－Ｃｙ７－ａｎｔｉ－ＣＤ１６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ａｎｔｉ－ＣＤ１４。染色後、赤血球を、全血溶解試薬キットを使用して、製造業者の説明書に従って溶解した。フローサイトメーターを用いてデータを収集し、適切なソフトウェアを用いて分析を行った。
別の実験では、心臓穿刺によりヘパリンで裏打ちしたシリンジ（ｈｅｐａｒｉｎ－ｌｉｎｅｄ ｓｙｒｉｎｇｅｓ）を用いてアポＥ-/-マウスから採血した。細胞を、ＦｃブロッキングＩｇＧおよび抗マウスＣＤ１１ｂ－ＰＥ－Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＣＤ６２Ｐ－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６５０（商標）、ＣＤ１１５－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７１１（商標）、およびＣＤ４１－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共に、氷上で４５分間インキュベートした。全血溶解試薬キットを用いて、赤血球細胞を溶解し、固定した。次いで、染色をフローサイトメーターを用いて評価し、適切なソフトウェアを用いて分析を行った。
生合成酵素の解析のために、全血を３０分間系統特異的マーカー（ｌｉｎｅａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ）（４℃、０．０２％ ＢＳＡを含むＤＰＢＳ中）とインキュベートした。以下の抗ヒト抗体を使用した：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７８６－ａｎｔｉ－ＣＤ１４、ＡＰＣ－Ｃｙ７－ａｎｔｉ－ＣＤ１６、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５－ａｎｔｉ－ＣＤ４。染色後、赤血球細胞を、全血溶解試薬キットを使用して、製造業者の説明書に従って溶解した。サンプルをＰＢＳで８００×ｇで１２分間２回洗浄し、Ｆｃブロックと共に室温で２０分間インキュベートした（透過性バッファー（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）中で１：２に希釈）。次に、細胞内染色を３０分間行った（ＲＴ、透過性バッファー中）。以下の抗ヒト抗体を使用した： Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ａｎｔｉ－１５－ＬＯＸ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４０５－ａｎｔｉ－５－ＬＯＸ。
次いで、染色を、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．，Ｖ１０）を使用して分析した。選択した実験において、血小板接着分子発現を評価した。ここでは、血小板を、４℃で、３０分間、蛍光標識マウス抗ヒトＶｉｏＢｌｕｅ‐抗ＣＤ４１、ＰＥ‐Ｃｙ５‐抗ＣＤ６２Ｐ、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５、５‐抗ＣＤ６３およびＦＩＴＣ‐抗ＣＤ４２ｂでインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、蛍光染色を行い、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色を評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．，Ｖ１０）を用いて分析した。
イメージ ストリーム（Ｉｍａｇｅ Ｓｔｒｅａｍ）
全血を系統特異的マーカーと共に４５分間インキュベートした（４℃、０．０２％ ＢＳＡを含むＤＰＢＳ中）。以下の抗ヒト抗体を使用した：ｅＦｌｕｏｒ４５０－ａｎｔｉ－ＣＤ４１、ＰＥ－Ｃｙ５－ａｎｔｉ－ＣＤ６２Ｐ、ＡＰＣ－Ｃｙ７－ａｎｔｉ－ＣＤ１６、ＦＩＴＣ－ａｎｔｉ－ＣＤ１４。染色後、赤血球細胞を、全血溶解試薬キットを使用して、製造業者の説明書に従って溶解した。次に、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ Ｘ ＭＫ２を用いて染色を評価し、そして、ＩＤＥＡＳ（登録商標）（Ｉｍａｇｅ Ｄａｔａ Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、バージョン６．０）を用いて分析を行った。
統計解析
結果は、平均±標準偏差として表される。分析した異なる群間の正規性および等しい分布を仮定した。各実験についてのサンプルサイズを、予備実験で観察された変動性について決定した。群間の差を、１サンプルｔ検定（正規化データ）、スチューデントｔ検定（２群）、１－ウェイＡＮＯＶＡ（複数群）、続いてポストホックＤｕｎｎｅｔｔ検定を用いて評価した。治験責任医師は、グループの割付けまたはアウトカム評価について盲検化されなかった。統計的有意性の基準は、ｐ≦０．０５であった。各実験についてのサンプルサイズを、以前の実験（Ｒａｔｈｏｄ ＫＳら、２０１７）および予備実験で観察された変動性に基いて決定した。ＬＭレベルの平均センタリング（ｍｅａｎ ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）．および単位分散スケーリング（ｕｎｉｔ ｖａｒｉａｎｃｅ ｓｃａｌｉｎｇ）に続いて、ＳＩＭＣＡ １４．１ソフトウェア（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ， Ｕｍｅａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）および主成分分析（ＰＣＡ）１９を行った。ＰＬＳ－ＤＡは、観測値のクラス分け（Ｂｌｉｓｔｅｒ ｅｘｕｄａｔｅｓ）に寄与する変数を、その変数（ＬＭレベル）に基づいて識別する線形多変量モデルに基づいている。分類の間、観察をそれぞれのクラスモデルに投影した。スコアプロットは、観察の間の系統的クラスターを示す（より近いプロットは、データマトリックスにおいてより高い類似性を示す）。ローディングプロットの解釈は、別個の間隔に関連し、スコアプロットで観察された密なクラスターに寄与した、最良の識別力（投影における変数重要度が１より大きい）を有する変数を同定した。
結果
実施例１：末梢血ｎ－３ ＤＰＡ由来ＳＰＭにおける周日変化は、アセチルコリンによって調節される。
末梢血ＳＰＭ濃度が日周的に調節されているかどうかを調べるために、血漿を、２４時間の間に別個の間隔で健康なボランティアから得た（人口統計については以下の表４を参照のこと）。
次いで、ＬＭをＣ１８固相抽出を用いて抽出し、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ）を用いて同定および定量した。
健康なボランティアからの血漿において、ＥＰＡ由来Ｅシリーズレゾルビン、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンおよびプロテクチン、ＤＨＡ由来プロテクチンおよびマレシン、ならびにアラキドン酸（ＡＡ）由来プロスタグランジンおよびロイコトリエンを含む、４つの主要必須脂肪酸メタボロームすべてからのメディエーターが同定された（図１Ａ参照）。
これらのメディエーターは、ＲｖＤ５n-3 DPAについて図示されているように（図１Ｂ参照）、液体クロマトグラフィーにおける保持時間の、およびタンデムマススペクトルにおける少なくとも６つの診断イオンの適合を含む公表された基準に従って同定された（ダリら、２０１３）。血漿脂質メディエータープロフィールの多変量分析は、朝から夕方のプロフィールへのＬＭ－ＳＰＭクラスターの左方へのシフトを伴う血漿ＬＭ－ＳＰＭ濃度の日周変化を示した（図１Ｃおよび１Ｄ）。このシフトは、夕方（１８：００時）から朝の間隔（７：００および９：００時）までのＲｖＤ１n-3 DPAおよびＲｖＤ５n-3 DPAを含むｎ－３ ＤＰＡ由来メディエーターの量の増加、ならびに炎症性エイコサノイドＰＧＦ2の増加と関連していた（図１Ｅ、図２および下の表６参照）。
ＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPAおよびＲｖＤ５n-3 DPAの保持時間は、上記の表３に開示されている。
ＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPAおよびＲｖＤ５n-3 DPAの診断イオンを以下の表５に開示する。
表６：健康なボランティアの末梢血における日周脂質メディエーターのプロファイル。
末梢血を、示された間隔で健康なボランティアから採取した。血漿を氷冷メタノール中に置き、脂質メディエーター（ＬＭ）をＬＭプロファイリングを用いて評価した（詳細については方法を参照のこと）。Ｑ１、Ｍ－Ｈ（親イオン）およびＱ３、ＭＳ－ＭＳ中の診断イオン（娘イオン）。結果は、平均±標準偏差であり、ｐｇ／ｍＬとして表される。
ｎ＝間隔あたり７人のボランティア。検出限界は～０．１ｐｇ。検出限界未満であった。
血漿トロンボキサン（ＴｘＢ2）、強力な血小板作動薬ＴｘＡ2の不活性な更なる代謝物にも周日変動が認められた（Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ Ｂ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｗ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ： ｅｘａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ ｆｉｅｌｄ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１２；２８７（１３）：１００７０－１００８０）（上記表６参照）。注目すべきことに、ｎ－３ ＤＰＡ由来ＳＰＭの濃度は、それらの報告された生物活性範囲内であり（Ｓｅｒｈａｎ ＣＮ．２０１７； Ａｒｎａｒｄｏｔｔｉｒ ＨＨら、Ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｄ３ Ｉｓ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ａｒｔｈｒｉｔｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１９７（６）：２３６２－２３６８）、これらが血管応答の調節に関与し得ることを示唆した。
末梢血ｎ－３ ＤＰＡ由来ＳＰＭが調節され得るメカニズムを調べた。上記のように、アセチルコリン（ＡＣｈ）が白血球におけるＳＰＭ産生を調節することが見出されているので、この神経伝達物質の末梢血レベルが日周的に調節されているかどうかを評価した。今回、血漿ＡＣｈ濃度は、７：００時で最高に達するＲｖＤn-3 DPAの濃度を反映していることがわかり（図３Ａ参照）、Ａｃｈもまた、末梢血中のＲｖＤn-3 DPAをも調節している可能性が示唆された。
これを試験するために、全血をＡＣｈと共にインキュベートし、ｎ－３ ＤＰＡ ＳＰＭ濃度を、脂質メディエータープロファイリングを用いて調査した。これらにおいて、４つのｎ－３ ＤＰＡメディエーターファミリー全てからの全血インキュベーションメディエーターが、公表された基準に従って同定された（図３Ｂおよび３Ｃ、ならびに以下の表７）。
表７：ヒト全血におけるｎ－３ ＤＰＡメタボロームのＡＣｈ調節。
健全なボランティアからの末梢血を、ＡＣｈ（０．１，１または１０μＭ；４５分；３７℃）で採取・インキュベーションした。氷冷メタノールで、インキュベーションをクエンチして、ｎ－３ ＤＰＡ由来のＬＭを、ＬＭプロファイリングを用いて、同定し、定量化した（詳しくは上記の方法を参照）。Ｑ１、Ｍ－Ｈ（親イオン）およびＱ３、ＭＳ－ＭＳ中の診断イオン（娘イオン）。結果は、ｐｇ／ｍＬとして、平均±標準偏差。ｎ＝群あたり９人のドナー。－ ＝検出限界未満；検出限界＝～０．１ｐｇ。
同定された分子の定量では、ビヒクル単独でインキュベートした血中で認められた濃度と比較した場合、ＲｖＤ２n-3 DPAが約１６０％増大を伴うＲｖＤn-3 DPAの増加が実証された（図３Ｄ、表７）。注目すべきは、末梢血とノルエピネフリン（循環において、日周変化が制御されている他の神経伝達物質である（Ｓｈｅａ ＳＡら、Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｒｈｙｔｈｍ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｔｈａｔ ｐｅａｋｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｖｅｎｉｎｇ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０１１；１０８（８）：９８０－９８４）（ｎ＝７ボランティア）とのインキュベーションは、ｎ－３ ＤＰＡ由来メディエーターの産生を有意に増加させなかった（ｎ＝９人の健常ボランティア；０．１－１０μＭ）。これらの結果は、ＡＣｈが末梢血ＲｖＤn-3 DPAの日周変化を制御することを示唆する。
実施例２：全身性白血球および血小板活性化の概日調節。
末梢血中ＬＭ－ＳＰＭ濃度の日内変動を認め、ＲｖＤn-3 DPAが白血球及び血小板機能に及ぼす強力な作用を考慮して（Ｄａｌｌｉら、２０１３； Ｇｏｂｂｅｔｔｉ Ｔら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎ Ｄ１n-3 DPA ａｎｄ ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｄ５n-3 DPA ａｒｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１７；１１４（１５）：３９６３－３９６８）、これが白血球及び血小板活性化の変化を反映しているか否かを検討した。末梢血細胞のフローサイトメトリー分析は、末梢血好中球のＣＤ４１（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ Ｍら、２０１４）の発現の増加として測定された、好中球ＣＤ１１ｂ発現の有意な増加ならびに血小板－好中球凝集体の増加を実証した（図４Ａおよび４Ｂ）。循環単球のＣＤ１１ｂおよびＣＤ４１の発現の増加もまた、１８：００時の間隔と比較して９：００時の間隔で見出された（図４Ｃおよび４Ｄ）。これらの結果は、ＲｖＤn-3 DPA濃度と一致する７：００～９：００時の間に最高に達する白血球と血小板活性化の概日調節を示す。
実施例３：ＲｖＤ n-3 DPA は末梢血中の白血球および血小板活性化を低下させる
単球、好中球および血小板活性化ならびに血小板－白血球凝集体の調節におけるＲＶＤn-3 DPAの作用を、心血管疾患におけるそれらの病原性機能に照らして調査した（Ｆｕｒｍａｎ ＭＩら、２００１； Ｐｆｌｕｅｃｋｅ Ｃら、２０１６； Ｈｕｏ Ｙら、２００３）。このために、ＰＡＦが血管炎の伝播に役立つことを考慮して、ヒト末梢血をＲｖＤn-3 DPAの存在下または非存在下で血小板活性化因子（ＰＡＦ）とインキュベートした（Ｐａｌｕｒ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ ＡＶら、２０１７）。
末梢血細胞上の活性化マーカーの発現を、フローサイトメトリーを用いて評価した。
ヒト末梢血をＲｖＤ２n-3 DPAとインキュベートすると、ＰＡＦ単独でインキュベートした細胞と比較した場合、好中球ＣＤ６２Ｐ（図５Ａ～Ｄ）およびＣＤ４１発現（ｎ＝５ドナー；１０ｎＭで約２０％減少）の減少として測定された好中球ＣＤ１１ｂ発現および好中球－血小板凝集体の量が用量依存的に減少した。
これらのインキュベーションにおいて、ＲｖＤ２n-3 DPAが、ＣＤ１１ｂの単球発現、および血小板マーカーＣＤ６２Ｐ（図５Ｅおよび５Ｆ）およびＣＤ４１（ｎ＝５ドナー；１０ｎＭで～２９％減少）において、用量依存性の減少を与えた場合において。単球活性化の有意な減少が見出された。
同様の知見は、健常ボランティアの全血をＲｖＤ５n-3 DPAとインキュベートした場合にも得られ、白血球－血小板凝集体（図５参照）と同様に、好中球および単球のＣＤ１１ｂ発現の用量依存的な減少をもたらした。
ＲｖＤ１n-3 DPAはまた、好中球、単球および血小板応答を部分的に調節することが認められた（ｎ＝５ドナー）。
これらの結果は、各ＲｖＤn-3 DPAが血管白血球および血小板応答の調節において、特異的な生物学的作用を示すことを示唆する。
これらの知見はまた、朝の時間における末梢血ｎ－３ ＤＰＡ ＳＰＭの観察された増加（上記の図１および２ならびに表６）が、日周の白血球および血小板の活性化を逆調節するための内因性保護プログラムの一部を形成し得ることを示唆する。
実施例４：心血管疾患者の末梢血中のＲｖＤ n-3 DPA の低下と全身性炎症の増加
健康なボランティアで得られた結果が、臨床環境に翻訳可能であるかどうかを調べた。
ＲｖＤn-3 DPAが早朝に（心筋梗塞のより高い発生率に関連するタイムウィンドウ（Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｈら、Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｍｏｒｎｉｎｇ Ｏｎｓｅｔ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ａｃｕｔｅ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ、Ｃｉｒｃ．Ｊ． ２０１７； ８１（３）： ３６１－３６７； Ｍｕｌｌｅｒ ＪＥら．Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． １９８５；３１３（２１）：１３１５－１３２２）増加したことを考慮すると、心筋梗塞のリスクも高い心血管疾患（ＣＶＤ）患者におけるＲｖＤn-3 DPAの末梢血中レベルが検討された（リスク基準の詳細及び方法については下表８参照）。
脂質メディエータープロファイリングを用いて、ＲｖＤ５n-3 DPA（図６Ａおよび６Ｂ）並びにＤ－シリーズレゾルビンおよびプロスタグランジン（下表９参照）を含むＤＨＡ、ＥＰＡおよびＡＡメタボロームからのメディエーターを含む３つのＲｖＤn-3 DPAが、患者の末梢血において同定された。
表９：ＣＶＤ患者における末梢血ＬＭプロフィール。
ＣＶＤ患者からの末梢血を、９：００時（午前）および１６：００～１８：００時（午後）の間に収集した。血漿を、内部標準を含有する氷冷メタノール中に置いた。脂質メディエーター（ＬＭ）を、ＬＭプロファイリングを用いて抽出し、同定し、定量した（詳細については、方法を参照のこと）。Ｑ１、Ｍ－Ｈ（親イオン）およびＱ３、ＭＳ－ＭＳ中の診断イオン（娘イオン）。結果は、平均±標準偏差であり、ｐｇ／ｍＬとして表される。ｎ＝９例のペア患者。検出限界は、約０．１ｐｇ．－は、検出限界未満であった。
血漿中のＲｖＤn-3 DPAレベルの評価は、健常ボランティアにおけるそれぞれの間隔と比較した場合、ＣＶＤ患者における朝（９：００時；午前）と夕（１６：００～１８：００時；午後）の両方の濃度の有意な低下を実証した（図６Ｃ）。これらの患者において、ＲｖＤn-3 DPA生合成マーカーである、７－ＨＤＰＡの血漿における濃度の有意な減少が見出された（Ｄａｌｌｉら、２０１３）（図７を参照のこと）。
さらに、炎症開始エイコサノイド（プロスタグランジン、ロイコトリエンＢ4およびＴｘＡ2）に対する血漿のＲｖＤn-3 DPAの比率は、健常ボランティアと比較した場合、測定した両間隔でこれらの患者で有意に低く、全身性炎症状態の上昇を示した（ｐ＜０．０５）。
これは、末梢血白血球および血小板も活性化状態の増加を示したという観察によってさらに支持された。フローサイトメトリー分析は、健康なボランティアと比較した場合、ＣＶＤ患者由来の好中球および単球の両方におけるＣＤ１１ｂの発現の増加を実証した（図６Ｄおよび６Ｅ）。ＣＶＤ患者からの末梢血中の血小板－好中球および血小板－単球凝集体の増加もまた、健康なボランティアからの末梢血と比較した場合に見出された（図４Ｆおよび４Ｇ）。
これらの患者からの末梢血において、朝の血漿のＡＣｈ濃度の有意な減少が、夕方の値と比較して見出された（図６Ｈ）。従って、これらの結果は、末梢血ＡＣｈをアップレギュレートできないことが、ＣＶＤ患者におけるＲｖＤn-3 DPA産生につながることを示唆する。
実施例５：患者の末梢血中のＲｖＤ２ n-3 DPA およびＲｖＤ５ n-3 DPA による白血球活性化の低下。
全身性炎症の増加とｎ－３ ＤＰＡ由来ＳＰＭの低下との間に関連性があるか否かを検証するため、ＲｖＤn-3 DPAが患者の末梢血の白血球反応を調節するか否かを検証した。このため、これらの患者の全血をＲｖＤ２n-3 DPAと共にインキュベートし、細胞応答をフローサイトメトリーを用いて評価した。ＲｖＤ２n-3 DPAは、ＣＤ１１ｂ発現を有意に調節することなく、用量依存的に血小板－好中球および血小板－単球凝集を減少させた（図８参照）。
ＲｖＤ５n-3 DPAと全血をインキュベートしたところ、ＲｖＤ２n-3 DPAよりも高い効力で好中球－血小板凝集および単球－血小板凝集が減少した（図８Ａおよび８Ｂ）。さらに、ＲｖＤ５n-3 DPAは、好中球および単球のＣＤ１１ｂ発現を有意に低下させた（図８Ｃおよび８Ｄ）。
これら２つのメディエーターの作用がＰＡＦの存在下でも保持されるかどうかを試験した（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ Ｍら、２０１４； Ｐａｌｕｒ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ ＡＶら、２０１７）。ＲｖＤ２n-3 DPAまたはＲｖＤ５n-3 DPAのいずれかによる患者全血のインキュベーションは、両方の白血球サブセットにおける、ＣＤ６２Ｐ（図９Ａおよび９Ｂ参照）およびＣＤ４１発現（ｎ＝９患者）の減少として測定された血小板－好中球および血小板－単球凝集の減少をもたらした。
また、ＲｖＤ５n-3 DPAは、ＲｖＤ２n-3 DPAと部分的にのみ共有されていた作用である、好中球および単球上のＣＤ１１ｂの発現を減少させることがわかった（図９Ｃおよび９Ｄ）。
これらの結果は、循環ＲｖＤn-3 DPAの低下が、ＣＶＤ患者における循環白血球および血小板活性化の増加につながることを示唆する。
実施例６：ＲｖＤ５ n-3 DPA は、アポＥ -/- マウスにおいて、全身性白血球および血小板活性化を低下させ、血管疾患を防御する
次いで、健常ボランティアとＣＶＤ患者の両方の末梢血細胞で観察された、ＲｖＤ５n-3 DPAの保護作用が、生体内でも保持されているかどうかを調べた。この目的のため、アポＥ-/-マウスに、６週間、西洋食を与え、ＲｖＤ５n-3 DPA（１００ｎｇ／マウス；ｉ．ｖ．）を、２週間、隔日に投与した。ＲｖＤ５n-3 DPA投与は、ＣＤ１１５陽性細胞におけるＣＤ４１およびＣＤ６２Ｐ発現の両方の低下、ならびにＣＤ１１ｂ発現の低下を伴う単球活性化によって測定されるように、循環血中の血小板－単球凝集体を低下させた（図１０Ａ）。血小板－好中球凝集物および好中球活性化の有意な低下が認められ、ビヒクルのみを投与したマウスと比較した場合、ＲｖＤ５n-3 DPAを投与したマウスではＣＤ１１ｂ発現が６０％を超えて低下した（図１０Ｂ）。
血小板－白血球凝集体が、アテローム性動脈硬化症の病因に関与していることから（Ｈｕｏ Ｙら、２００３）、ＲｖＤ５n-3 DPAも血管疾患を防御するかどうかを検討した。オイルレッド－Ｏ染色は、ビヒクルを与えられたマウスと比較した場合、ＲｖＤ５n-3 DPAを与えられたマウスにおける大動脈病変の有意な減少を実証した（図１０Ｃ）。さらに、大動脈切片のＬＣ／ＭＳ－ＭＳ分析により、大動脈プロスタノイドの有意な減少が実証され、ＲｖＤ５n-3 DPAを投与したマウスではＴｘＢ2の濃度が約３５％低下した（図１０Ｄおよび下表１０）。これらの知見を総合すると、血小板および白血球に対するＲｖＤ５n-3 DPAの防御作用は生体内でも保持されており、血管疾患の病変の減少につながることが実証される。
表１０：ＲｖＤ５ n-3 DPA を投与したＡｐｏ Ｅ－／－マウス由来の大動脈組織中のエイコサノイドの減少。
下行大動脈を、内部標準を含む氷冷メタノール中に置いた。脂質メディエーター（ＬＭ）を、ＬＭプロファイリングを用いて、抽出し、同定し、定量した（詳細については、上記の方法を参照のこと）。Ｑ１、Ｍ－Ｈ（親イオン）およびＱ３、ＭＳ－ＭＳ中の診断イオン（娘イオン）。結果は、平均±標準偏差であり、ｐｇ／１０ｍｇ組織、として表される。ｎ＝群あたり４匹のマウス。＊ｐ＜０．０５（対ビヒクルマウス）。
上記の例は、健常ボランティアの血管系におけるＲｖＤn-3 DPAの日周調節を示す。このＲｖＤn-3 DPAのアップレギュレーションは、朝の血小板、単球および好中球活性化の上昇と一致する。これらのプロレゾルビングメディエーター（ｐｒｏ－ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｏｒ）の概日調節は、神経伝達物質ＡＣｈによって制御され、この神経伝達物質ＡＣｈはまた、健康なボランティアの血漿において日周で調節される。ＣＶＤ患者では、健常ボランティアと比較して有意により低いＲｖＤn-3 DPAが認められた。早朝の時間中のこれらの分子のアップレギュレーションの失敗はまた、血漿ＡＣｈ濃度の減少および末梢血白血球活性化の増加と関連することが見出された。患者と健常ボランティアの両方の全血を、ＲｖＤ２n-3 DPAまたはＲｖＤ５n-3 DPAと、インキュベートすると、白血球および血小板活性化が有意に逆転した。さらに、治療パラダイムを用いたＡｐｏ Ｅ-/-マウスへのＲｖＤ５n-3 DPAの投与は、全身の血小板および白血球活性化および血管疾患を低下させた。これらの知見を総合すると、ＡＣｈ－ＲｖＤn-3 DPA系（ＡＣｈ－ＲｖＤn-3 DPA ａｘｉｓ）の破壊はＣＶＤをもたらす可能性があることが示される。
血漿中のＲｖＤn-3 DPA濃度は、早朝の時間帯に上昇することが認められた（上の図１および表６）。これらの分子は、白血球および血小板活性化の増加と相関する心筋梗塞の危険性のある患者からの末梢血中で減少した。さらに、ＲｖＤn-3 DPAは、健常ボランティアと患者の両方由来の末梢血中の白血球と血小板の反応を低下するように調節し、ＲｖＤ５n-3 DPAはアポＥ-/-マウスの血管疾患を予防した（図１０）。これらの知見は、これらの分子の日周の調節における変更が、心血管疾患の病理の重要な側面を示すかもしれないことを示している。
ＲｖＤn-3 DPA経路マーカーの血漿濃度、および５－ＬＯＸ産物（Ｄａｌｌｉら、２０１３）、７－ＨＤＰＡは有意に低下した（図７）。これらの知見は、心血管疾患を発症する際の危険因子として５－ＬＯＸ経路を意味する公表された知見と一致する（Ｈｅｌｇａｄｏｔｔｉｒ Ａら、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ５－ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｓｔｒｏｋｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ａ Ｓｃｏｔｔｉｓｈ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ． ２００５；７６（３）：５０５－５０９を参照）
上記の実施例からの結果は、健康なボランティアにおける、この神経伝達物質の血管レベルが日周で調節され、早朝の時間中に増加することを実証し（図３）、これはＣＶＤを有する患者において調節不全であった機構である（図８）。このように、これらの結果は、ＣＶＤ患者におけるＲｖＤn-3 DPAの生合成の減少をもたらす血漿におけるＡＣｈ調節の脱共役（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ）を指摘する。
要約すると、上記の実施例は、血管のｎ－３ ＤＰＡ由来のプロレゾルビングメディエーター（ｐｒｏ－ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｏｒ）の日周調節を中心とする保護経路を実証する。朝の時間中のこれらの分子の増加は、全身性炎症および潜在的な血管疾患を制限する生理学的血小板および白血球活性化を逆調節する。心血管疾患を有する患者では、末梢血細胞活性化の増加を伴うこれらの分子の産生の有意な損失があり、心筋梗塞のリスクを含む全身性炎症およびＣＶＤの増加をもたらす。この概念に沿って、ＲｖＤn-3 DPAは、循環白血球と血小板活性化を再プログラムし、マウスでは血管疾患の有意な減少をもたらした。そのため、健常ボランティアにおいて血漿のＲｖＤ５n-3 DPAを上昇させることが近年示された、ｎ－３ ＤＰＡ補給（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を含む末梢血のＲｖＤn-3 DPAを回復させる戦略（Ｍａｒｋｗｏｒｔｈ ＪＦら、Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｈｉｆｔｓ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｐｒｏｆｉｌｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎ－３ ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ． ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２０１６；３０（１１）：３７１４－３７２５）は、考えられる治療選択肢を提示する可能性がある。さらに、ＲｖＤn-3 DPAに基づく治療は、これらの患者に存在する炎症状態の増加を微調節し、全身性炎症を減弱させ、血管疾患を減少させるための新たな機会を提供する可能性がある。
実施例７：心血管疾患の治療または予防のための薬剤の効力の評価。
本発明による個々の患者における心血管疾患の治療または予防に使用するための薬剤の効力を評価する方法を図１１に示す。典型的には、個々の患者は、心血管疾患と診断されており、心筋梗塞または別の種類の有害な急性心血管事象を患う危険性があり得る人である。
ステップ１０は、方法の開始を示す。第１に、薬剤による治療の開始前に、第１の生体サンプルが患者から採取される（ステップ２０）。本実施例では、生体サンプルは血漿サンプルであるが、他の実施形態では、サンプルは、患者から採取された全血または血清であってもよい。サンプルは、午前７時から午前９時の間の朝の早い時間に患者から採取される。本実施例では、サンプルは、午前８時に患者から採取される。
次いで、患者は、薬剤での治療過程を開始される（ステップ３０）。
薬剤は、心血管疾患の治療または予防のための任意の適切な薬剤であり得る。特に、薬剤は、スタチン、フィブラート、カルシウムチャネル遮断薬、または、例えば、スタチンとカルシウムチャネル遮断薬との組み合わせのような薬剤の組み合わせであってもよい。他の適切な心血管治療は、当業者に公知である。適切な薬剤は、患者の病歴および症状に基づいて、医療従事者によって選択される。
適切なスタチンとしては、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチンが挙げられる。
適切なフィブラートには、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、クロフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クリノフィブラート、クロフィブライド、ロニフィブラートおよびシンフィブラートが含まれる。
適切なカルシウムチャネル遮断薬としては、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、エホニジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピンおよびプラニジピンが挙げられる。
医薬は、医師の処方に従って患者に投与される（自己投与を含む）。典型的には、薬剤は、１日に１回以上投与されてもよい。
薬剤による治療を開始した後、所定の期間の後、第２の生体サンプルが患者から採取される（ステップ４０）。本実施例では、所定の時間は２４時間であるが、異なる実施形態では他の時間を使用してもよい。典型的には、所定の期間は、１～１４または３０日の間であり得る。いずれにしても、その期間は、薬剤の薬理学的効果が患者に現れることを可能にするのに十分な長さであるべきである。
第２のサンプルはまた、第１のサンプルと同じ時刻、すなわち、本実施例では午前８時に、朝の早い時間に患者から採取される。
ステップ５０では、ステップ２０および４０で患者から採取した第１および第２のサンプルを、薬剤による治療を開始する前後で、分析して、サンプル中の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン（ＲｖＤn-3 DPA）のレベルを定量する。
本実施例では、３つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン（ＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPAおよびＲｖＤ５n-3 DPA）のレベルを、逆相液体クロマトグラフィーエレクトロスプレータンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって、第１および第２のサンプル中で測定する。本発明の異なる実施形態では、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのうちの３つ未満、すなわち、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのうちの１つまたは２つを分析することができる。第１および第２のサンプル中のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを定量するこの方法の詳細は、Ｃｏｌａｓ ＲＡら、２０１４およびＤａｌｌｉら、２０１５に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
第１および第２の血漿サンプルの各々について、静脈血（１０ｍＬ）を患者からヘパリン中に収集する。血漿は、ヘパリン処理血液の遠心分離（２０００ｇ、１０分）によって得られ、以下に記載されるように固相抽出の前に４容量のメタノール中に置かれる。
氷冷メタノール４ｍＬ中の内部標識標準５Ｓ－ＨＥＴＥ－ｄ8、ＬＴＢ4－ｄ4、ＬＸＡ4－ｄ5、ＲｖＤ２－ｄ5及びＰＧＥ2－ｄ4（各５００ｐｇ）を各サンプルに加え、定量及びサンプル回収を容易にする。次に、サンプルを－２０℃で４５分間保持してタンパク質を沈殿させ、次いで遠心分離する（２０００ｇ、４℃、１０分）。上清を回収し、３７℃に設定した水浴および１５ｐｓｉ以下の流速の窒素供給を有する自動蒸発システム上に、穏やかな窒素流中で１ｍＬ未満のメタノール含量にする。次いで、サンプルを遠心分離する（２０００ｇ、４℃、１０分）。次いで、サンプルを、３７℃に設定された水浴および１５ｐｓｉ以下の流速の窒素の供給を有する自動抽出システムに入れ、生成物を以下のように抽出する。
固相Ｃ１８カートリッジを、メタノール３ｍｌとＨ2Ｏ ６ｍｌで洗浄し、次いで、Ｈ2Ｏ ９ｍｌ（ｐＨ３．５、ＨＣｌ）をサンプルに加え、その酸性化溶液を調節されたＣ１８カラムに迅速に負荷し、４ｍｌのＨ2Ｏで洗浄して酸性を中和する。次に、５ｍＬのヘキサンを添加し、生成物を９ｍＬのギ酸メチルで溶出する。生成物を、自動蒸発システムを使用して乾燥させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ自動注入のためにメタノール－水（５０：５０ ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に直ちに懸濁させる。
本実施例では、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのために、高ダイナミックレンジパルス計数システムを備えた三重四重極質量分析計（ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）と対になったＨＰＬＣおよびオートインジェクターが使用される。代替の適切なＬＣ－ＭＳ／ＭＳ装置は、当業者に利用可能である。Ｃ１８カラムを５０℃に維持したカラムオーブン中に保持し、溶媒Ａとして０．０１％酢酸を含む水で、溶媒Ｂとして０．０１％酢酸を含むメタノールからなる移動相でＲｖＤ脂質メディエーターを溶出し、カラムを８０：２０（Ａ：Ｂ）の移動相で平衡化し、１２秒間かけて５０：５０（Ａ：Ｂ）まで上昇させる。この勾配を２分間維持し、次いで次の９分間にわたって８０：２０（Ａ：Ｂ）に上昇させる。次いで、この勾配を次の３．５分間維持した後、９８：２（Ａ：Ｂ）に上昇させる。最後に、この勾配を５．４分間維持してカラムを洗浄する。流速は、プロセス全体を通して０．５ｍＬ／分に維持される。
質量分析計は、スケジュールされた多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いて、情報依存性獲得および増強された産物ラインスキャンと組み合わせて、負イオン化モード（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で操作される。スケジュールされたＭＲＭウィンドウは９０秒であり、各脂質メディエータパラメータは個別に最適化される。
各ＲｖＤn-3 DPA（ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン）の同一性は、その保持時間（ＲT）を合成および真正物質（図３Ｂおよび６Ａ）および各ＲｖＤについて少なくとも６つの診断イオン（図３Ｃおよび６Ｂ）と一致させることによって確認され、以下の表１１に記載されるように、親イオン（Ｑ１）および特徴的な娘イオン（Ｑ３）の多重反応モニタリングを使用して定量化される。
検量線は、３．１２、６．２５、１２．５、２５、５０、１００および２００ｐｇで、真正化合物の混合物および重水素標識脂質メディエーターを使用して、それぞれについて得られる。ＬＭごとに線形検量線が得られ、ｒ2値は０．９８～０．９９となる。内部標準回復、マトリックスの干渉、および検出限界が決定される。
第１および第２のサンプルのそれぞれにおけるＲｖＤのレベルの定量に続いて、レベルが比較される（ステップ６０）。
第１のサンプルと比較した第２のサンプル中のＲｖＤのレベルの有意な増加は、患者に投与された薬剤が、心血管疾患、特に、炎症誘発性メディエーターに対する日周調節の機能不全の結果として、血管炎症によって媒介される心血管疾患を治療または予防するのに有効であり得ることを示す。他方、第１のサンプルと比較して第２のサンプル中のＲｖＤのレベルが増加しないことは、投与された薬剤が個々の患者において無効であることを示し得る。
これらの結果に基づいて、薬剤は、それが有効であると示される場合、患者に処方され得る（工程８０）。あるいは、この方法は、異なる薬剤を使用して繰り返され得る。
ステップ９０は、方法の終了を示す。
実施例８
本発明の様々な態様のさらなる実施例は、マイクロ流体デバイス１１０に組み込まれたイムノアッセイが、患者Ｐから得られた血液Ｂのサンプル中の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン（ＲｖＤn-3 DPA）のレベルを測定するために使用される、図１２および１３を参照して、以下に記載される。
図１２に最も良く示されているように、マイクロ流体デバイス１１０は、当業者に知られている種類の一般的な構造を有する。具体的には、マイクロ流体デバイス１１０は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）１１２の少なくとも１つの層と、ガラススライド１１４に結合された、チャネル検査および光信号取得を可能にする透明な生体適合性エラストマーとを備える。
ＰＤＭＳ層は、一端がサンプル収集ポート１２５で終端し、他端が廃棄物排出口１３０で終端する複数のマイクロチャネル１２０ａ～１２０ｃで成形される。本実施例では、マイクロ流体デバイス１１０は、１つがそれぞれ、血液サンプルＢ中の異なるｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビン（ＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPA、ＲｖＤ５n-3 DPA）のレベルを測定する３つのマイクロチャネル１２０ａ－ｃを有する。本実施例の変種では、マイクロ流体デバイスは、３つ未満のマイクロチャネル、例えば、対応する数のＲｖＤn-3 DPAのレベルを測定するための１つまたは２つのマイクロチャネルを有することができる。
サンプル収集ポート１２５と廃棄物排出口１３０との間で、マイクロチャネル１２０ａ～１２０ｃの各々は、反応ゾーン１５０ａ～１５０ｃを含む。好ましくは、マイクロチャネル１２０ａ～ｃは、以下に記載されるように、サンプルＢとデバイスに添加される試薬との混合を促進するために、反応ゾーン１５０ａ～ｃにおいて蛇行（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ）していてもよい。
サンプル収集ポート１２５とその反応ゾーン１５０ａ～ｃの中間に、各マイクロチャネル１２０ａ～ｃには、サンプルＢと混合するための一連の異なる試薬をチャネル１２０ａ～ｃに入れるためのそれぞれの試薬入口ポート１４０ａ～ｃが設けられている。マイクロチャネル１２０ａ～ｃおよび入口ポート１４０ａ～ｃには、サンプルおよび試薬の流れを制御するための、好ましいマイクロバルブなどが設けられている。
各反応ゾーン１５０ａ～ｃにおいて、各マイクロチャネル１２０ａ～ｃの表面は、サンプルＢ中でそれぞれ定量されるＲｖＤn-3 DPAの異なる１つに対するモノクローナル抗体でコーティングされる。
各反応ゾーン１５０ａ～１５０ｃに隣接して、デバイス１１０は、ガラススライド１１４上に水素化アモルファスシリコン（ａ－Ｓｉ：Ｈ）フォトダイオード１７５ａ～１７５ｃを組み込む。フォトダイオード１７５ａ～１７５ｃは、図１３に示すように第１のコンピュータ２００に接続された適切なインタフェース１２０に接続されている。
インターフェース１２０は、フォトダイオード１７５ａ～ｃから信号を受信し、それらの信号を表す第１のコンピュータ２００に、コンピュータ可読データを送信するように構成される。インターフェース１２０は、適切なデータケーブルによって、第１のコンピュータ２００に物理的に接続することができる。別法として、インターフェース１２０は、たとえば、ブルートゥース（登録商標）（Ｒ）のような任意の適当なワイヤレスデータ転送法によって、第１のコンピュータ２００にワイヤレスで接続することができる。いくつかの実施形態では、第１のコンピュータは、ハンドヘルドデバイスを備えることができる。
第１のコンピュータ２００は、マイクロプロセッサと、メモリと、記憶装置とを備え、そして、フォトダイオード１７５ａ～ｃから受信した信号を表すデータを、患者識別データと関連付けて記憶するためのソフトウェアを実行するように構成される。第１のコンピュータ２００がハンドヘルドデバイスである場合、ソフトウェアはＡｐｐであってもよい。
第１のコンピュータ２００は、適切なデータ通信チャネル３００を介して遠隔の第２のコンピュータ４００に接続される。本実施形態では、データ通信チャネル３００はインターネットを含むが、他の実施形態では、第１および第２のコンピュータ２００、４００は、ローカルまたはワイドエリアネットワーク（図示せず）上で相互接続されてもよい。第１および第２のコンピュータ２００、４００は、データ通信コードを介して互いに物理的に接続されていてもよく、またはそれらは、たとえばＩＥＥＥ ８０２．１１ ａ、ｂ、ｇ、ｎまたはブルートゥース（登録商標）（Ｒ）のような適当な無線データ通信技術を用いて無線で相互接続されてもよい。適切には、第１および第２のコンピュータ２００、４００のそれぞれは、適切なモデムを介してインターネット３００に接続される。
使用において、血液Ｂのサンプルは、たとえば、従来のランセットを使用して、患者から得られる。サンプルＢは、サンプル入口ポート１２５においてマイクロ流体デバイス１１０上に置かれる。サンプルは、毛管作用によってマイクロチャネル１２０ａ～ｃ内に引き込まれる。代替の実施形態では、サンプルＢは、マイクロポンプを使用して、または減圧下などで、マイクロチャネル１２０ａ～ｃ内に能動的に引き込まれてもよい。
反応ゾーン１５０ａ～ｃでは、サンプル中のＲｖＤn-3 DPAは、マイクロチャネル１２０ａ～ｃの表面にコーティングされた抗体と反応する。各反応ゾーン１５０ａ～ｃには、それぞれ異なったＲｖＤn-3 DPAが捕捉される。サンプルＢは、反応ゾーン中で抗体と適切な時間インキュベートされる。次いで、洗浄溶液をマイクロチャネル１２０ａ～１２０ｃに導入して、結合していないサンプルを除去する。マイクロチャネル１２０ａ～ｃから廃棄された材料は、ドレイン１３０を介してデバイス１１０から除去される。
反応ゾーン１５０ａ～ｃから非結合サンプルを除去した後、第二のモノクローナル抗体を、それぞれのＲｖＤn-3 DPAに対する特異性を有するマイクロチャネル１２０ａ～ｃのそれぞれに導入する。第２の抗体の各々は、当業者に周知の様式で西洋ワサビペルオキシダーゼで標識される。第２のモノクローナル抗体は、反応ゾーン１５０ａ～ｃにおいて表面で捕獲されたＲｖＤn-3 DPAとインキュベートすることができる。次いで、マイクロチャネル１２０ａ～ｃを再び洗浄する。
次に、西洋ワサビペルオキシダーゼのための基質を、入口ポート１４０ａ～ｃを介してマイクロチャネル１２０ａ～ｃの各々に導入する。適切な基質は、当業者に公知であるが、本実施例では、西洋ワサビペルオキシダーゼによって作用された場合に蛍光を発するルミノールが使用される。蛍光は、フォトダイオード１７５によって検出され、インターフェース１８０によって受信される信号を生じさせる。蛍光の強さは、チャネル１２０ａ－ｃのそれぞれにおいて固定化されたＲｖＤn-3 DPAに結合している第二の抗体の量を示す。マイクロ流体デバイス１１０は、マイクロチャネル１２０ａ～ｃの各々におけるＲｖＤn-3 DPAのレベルを定量化できるように、当業者に知られている方法でキャリブレーションすることができる。
各マイクロチャネル１２０ａ～ｃにおける蛍光の強度を表すデータは、上述のように、インターフェース１８０から第１のコンピュータ２００に送信される。コンピュータ２００は、前記ソフトウエアを実行して、フォトダイオード１７５によって測定された蛍光の強さから、サンプルＢ中の各ＲｖＤn-3 DPAのレベルを計算する。次いで、マイクロ流体デバイスは、適切な洗浄剤で再び洗浄される。
本実施例では、夕方、たとえば、約午後４時から午後６時の間に、第１の血液サンプルＢ1が、患者から採取され、そして、上述のように、マイクロ流体デバイス１１０を使用してＢ1のレベルが測定される。
翌朝の早い時間、たとえば、約午前７時から午前９時の間に、第２のサンプルＢ2を患者から採取する。サンプルＢ2中の１以上のＲｖＤn-3 DPAのレベルは、上述のように、同一または類似のマイクロ流体デバイス１１０を用いて測定される。
サンプルＢ1およびＢ2中の１以上のＲｖＤn-3 DPAのレベルを表すデータは、最初のコンピュータ２００によって計算され、保存される。
次に、第１および第２のサンプルにおける１以上のＲｖＤn-3 DPAのレベルを表すデータが、患者Ｐを識別する情報に関連して、第１のコンピュータ２００によって、第２のコンピュータ４００に送信される。
第２のコンピュータ４００は、マイクロチップ、記憶及び記憶装置を備え、第１及び第２のサンプルＢ1、Ｂ2における１以上のＲｖＤn-3 DPAのレベル間の差異を計算するためのソフトウエアを実行するように構成されている。
健康な個体では、通常、早朝に、ＲｖＤn-3 DPAの血漿中濃度が１０～２５ｐｇ／ｍＬの範囲にあり、夕方に最低約５ｐｇ／ｍＬであると予想されるので、最初と２番目のサンプルＢ1、Ｂ2間のＲｖＤn-3 DPAのレベルの差が約５ｐｇ／ｍＬ未満であれば、患者は心血管疾患の危険性があると評価され得、これを示すデータが、２番目のコンピュータから最初のコンピュータ２００に送信され、そこでそれが保存され、および／または検査を実施する者に表示される。
同様に、早朝に採取したサンプルＢ2中の患者の血液中のＲｖＤn-3 DPAレベルが１０ｐｇ／ｍＬ前後未満であれば、特に５ｐｇ／ｍＬ前後未満であれば、心血管疾患または心筋梗塞の危険性があることを示している可能性がある。
第１及び第２サンプルＢ1、Ｂ2におけるＲｖＤn-3 DPAレベルの比較に基づいて、患者は、心血管疾患の治療又は予防のための適当な薬剤を処方され得る。
本実施例では、マイクロ流体デバイス１１０は、非競合的不均質ＥＬＩＳＡサンドイッチイムノアッセイを実施するように配置される。しかしながら、本発明の変形例では、マイクロ流体デバイスは、均質イムノアッセイおよび／または競合イムノアッセイを実行するように構成されてもよい。
たとえば、１つの変種において、各マイクロチャネル１２０ａ－ｃは、それぞれの反応ゾーン１５０ａ－ｃ内の表面上に、それぞれの反応ゾーン１５０ａ－ｃ内で分析されるサンプルＢ内のものと同じであるそれぞれのＲｖＤn-3 DPA（たとえば、ＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPAまたはＲｖ５Ｄn-3 DPA）でコーティングされてもよい。各マイクロチャネル１２０ａ－ｃにおいて、反応ゾーン１５０ａ－ｃおよびサンプル収集ポート１２５の中間に、サンプルＢを、それぞれのＲｖＤn-3 DPAに対する既知量の一次抗体と混合することができる。一次抗体は過剰に供給され、残りの抗体は、次いで、サンプル中の対応するＲｖＤn-3 DPAと効果的に競合して、反応ゾーン１５０ａ－ｃにおける表面結合ＲｖＤn-3 DPAと反応するであろう。洗浄後、標識された二次抗体を、それぞれの一次抗体に特異的な入口ポート１４０ａ～１４０ｃを通して各反応ゾーン１５０ａ～１５０ｃに導入される。上記のように、二次抗体は、ＥＩＡにおける使用に適切な酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識される。次いで、サンプルとの反応後に残存する二次抗体の量は、西洋ワサビペルオキシダーゼのための適切な基質を反応ゾーン１５０ａ～１５０ｃに入れ、そして、上記のように、蛍光または色の強度を測定することによって測定され得る。
たとえば、上述したマイクロ流体デバイス１１０のような本発明によるマイクロ流体デバイスは、たとえば、大規模な実験室でのみ見られるＬＣ－ＭＳ／ＭＳのようなより高度な機器へのアクセスがない医療クリニックのような、ポイントオブケア環境において本発明の方法を実行するための便利なデバイスを提供する。
実施例９：
末梢血ｎ－３ ＤＰＡ由来ＳＰＭの日周変化はアセチルコリンによって調節される。
末梢血ＳＰＭ濃度が日周調節されているかどうかを調べるために、我々は、以下の表１２に示すような人口統計を用いて、２４時間の間に別個の間隔で健康なボランティアから血漿を得た：
健康なボランティアからの血漿において、我々は、ＥＰＡ由来Ｅシリーズレゾルビン、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンおよびプロテクチン、ＤＨＡ由来プロテクチンおよびマレシン、ならびにアラキドン酸（ＡＡ）由来プロスタグランジンおよびロイコトリエンを含む、４つの主要必須脂肪酸メタボロームすべてからメディエーターを同定した。これらのメディエーターは、公表されている基準（Ｄａｌｌｉ Ｊ， Ｃｏｌａｓ ＲＡ， Ｓｅｒｈａｎ ＣＮ、Ｎｏｖｅｌ ｎ－３ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｏｌｖｅｎｔｓ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ａｃｔｉｏｎｓ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１３；３：１９４０）に従って、Ｒｖ５Ｄn-3 DPAについて記載されているように同定された（図１４）。血漿脂質メディエータープロフィールの多変量解析は、朝から夕へのプロファイルへのＬＭ－ＳＰＭクラスターの左方向シフトを伴う血漿ＬＭ－ＳＰＭ濃度の日周シフトを示した（図２０ Ａ、Ｂ）。この変化は、夕方（１８：００時）から朝の間隔（７：００および９：００時；図 ２０Ｃ）までのＲｖＤ１n-3 DPAおよびＲｖＤ５n-3 DPAを含む、ｎ－３ ＤＰＡ由来メディエーターの量の増加と関連していた。また、血漿トロンボキサン（Ｔｘ）Ｂ2（強力な血小板アゴニストＴｘＡ2の不活性なさらなる代謝産物）の日周変化が、以下の表１３に要約されるように、見出された（参考Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ Ｂ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｗ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ： ｅｘａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ ｆｉｅｌｄ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１２；２８７（１３）：１００７０－１００８０）。
表１３：健康なボランティアの末梢血における日周脂質メディエータープロファイル。
末梢血を、示された間隔で健康なボランティアから収集した。血漿を氷冷メタノール中に置き、そして、脂質メディエーター（ＬＭ）を、ＬＭプロファイリングを用いて評価した（詳細については、方法を参照のこと）。Ｑ１、Ｍ－Ｈ（親イオン）およびＱ３、ＭＳ－ＭＳ中の診断イオン（娘イオン）。結果は、平均±標準偏差であり、ｐｇ／ｍＬとして表される。ｎ＝間隔あたり７人のボランティア。検出限界は、約０．１ｐｇ。－は、検出限界未満であり、＊Ｐ＜０．０５（対 対のＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いた１８：００時の値）。
ＲｖＤn-3 DPAのこれらの日周変化はまた、ＲｖＤn-3 DPA濃度の増大と一致して、７：００～９：００時の間で最高に達する白血球および血小板活性化の概日調節と関連していた（図２０Ｄ～Ｆ、図１５Ａ）。注目すべきこととして、また、末梢血ＲｖＤn-3 DPA濃度と早朝の白血球活性化との間に有意な関連性が認められ、より低いＲｖＤn-3 DPAは、末梢血白血球および血小板活性化の増加と関連していた（図２０ Ｇ、Ｈおよび図１５ Ｂ、Ｃ）。
次に、末梢血ｎ‐３ ＤＰＡ由来ＳＰＭが調節されるメカニズムを検討した。本明細書では、血漿ＡＣｈ濃度が、７：００時に最高に達するＲｖＤn-3 DPAの濃度を反映していることを見出し（図１６Ａ）、ＡＣｈが、ＳＰＭ生合成におけるその役割を与えられた末梢血中において、ＲｖＤn-3 DPAを調節することを示唆する（Ｄａｌｌｉ Ｊ， Ｃｏｌａｓ ＲＡ， Ａｒｎａｒｄｏｔｔｉｒ Ｈ， Ｓｅｒｈａｎ ＣＮ、Ｖａｇａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒｏｕｐ ３ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｏｌｖｅｎｔ ＰＣＴＲ１ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２０１７；４６（１）：９２－１０５）。全血をＡＣｈと共にインキュベートすると、図１６Ｂ－Ｅおよび下表１４に示すように、静止条件および流量条件下の両方で、ＲｖＤ２n-3 DPAを含むＲｖＤn-3 DPA濃度が増加した。
表１４：ヒト全血におけるｎ－３ ＤＰＡメタボロームのＡＣｈ調節。
健康なボランティアからの末梢血を収集し、ＡＣｈ（０．１μＭ；４５分；３７℃）と共にインキュベートした。
インキュベーションを氷冷メタノールでクエンチし、ＬＭプロファイリングを用いて、ｎ－３ ＤＰＡ由来のＬＭを同定し、定量した（詳細については方法を参照のこと）。
Ｑ１、Ｍ－Ｈ（親イオン）およびＱ３、ＭＳ－ＭＳ中の診断イオン（娘イオン）。
結果は、ｐｇ／ｍＬとして、平均±標準偏差、ｎ＝群あたり９人のドナーとして表される。＊ｐ＜０．０５（対 対Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いたビヒクル群）。
注目すべきことに、この増加は、末梢血中のｎ－３ ＤＰＡの選択的動員とは関連していなかった（表１５参照）：
表１５：末梢血ＳＰＭ基質および前駆体濃度。
健康なボランティアからの末梢血を収集し、アセチルコリン（ＡＣｈ）と共に０．１μＭで４５分間インキュベートした。血漿を単離し、重水素標識内部標準を含有する氷冷メタノール中に置き、ＳＰＭ前駆体をそれらの経路マーカーと共に抽出し、同定し、脂質メディエーターを用いて定量した（詳細については方法を参照のこと）。Ｑ１、Ｍ－Ｈ（親イオン）およびＱ３、ＭＳ－ＭＳ中の診断イオン（娘イオン）。結果をｐｇ／ｍＬとして表す。ｎ＝９／条件での平均±標準偏差。＊ｐ＜０．０５（対Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いた、対ビヒクル群）。
次いで、血圧上昇に関連した、せん断速度（ｓｈｅｅｒ ｒａｔｅ）の変化が、また、ＲｖＤn-3 DPA産生を調節する可能性があるかどうかを検討した。０．３パスカル（Ｐａ）での血液潅流は、血小板白血球凝集体の増加と関連し（ｎ＝４ドナー）、０．１Ｐａのせん断速度で潅流した血液と比較した場合、血漿ＲｖＤn-3 DPAの有意な増加をもたらした（図１７）。注目すべきことに、末梢血とノルエピネフリン（ｎ＝６ドナー；０．１～１０μＭ）（Ｓｈｅａ ＳＡ， Ｈｉｌｔｏｎ ＭＦ， Ｈｕ Ｋ， Ｓｃｈｅｅｒ ＦＡ、 Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｒｈｙｔｈｍ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｔｈａｔ ｐｅａｋｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｖｅｎｉｎｇ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０１１；１０８（８）：９８０－９８４を参照）またはコルチゾール（Ｎｏｍｕｒａ Ｓ， Ｆｕｊｉｔａｋａ Ｍ， Ｓａｋｕｒａ Ｎ， Ｕｅｄａ Ｋ、 Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｒｈｙｔｈｍｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ａｎｄ ｃｏｒｔｉｓｏｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ／ｃｏｒｔｉｓｏｌ ｒａｔｉｏ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ． １９９７；２６６（２）：８３－９１参照）（１－１０μＭ） とのインキュベーションは、両方とも、循環において日周調節されており、健康なボランティアからの末梢血におけるｎ－３ ＤＰＡ由来メディエーターの産生を有意に増大させなかった。以下の表１６を参照されたい。
表１６：コルチゾールとの末梢血インキュベーションにおけるＳＰＭ濃度。
健康なボランティアからの末梢血を収集し、コルチゾール（１～１０μＭ）またはビヒクルと共に４５分間インキュベートした。血漿を得、重水素標識内部標準を含有する氷冷メタノール中に置き、脂質メディエータープロファイリングを用いて、脂質メディエーターを抽出し、同定し、定量した（詳細については、方法を参照のこと）。Ｑ１、Ｍ－Ｈ（親イオン）およびＱ３、ＭＳ－ＭＳ中の診断イオン（娘イオン）。結果をｐｇ／ｍＬとして表す。ｎ＝５／条件での平均±標準偏差。
実施例１０：ＲｖＤ n-3 DPA は末梢血中の白血球および血小板活性化を低下させる。
次に、心血管疾患における細胞活性化によって果たされる病原性役割に照らして、単球、好中球および血小板活性化ならびに血小板－白血球凝集体の調節におけるＲｖＤn-3 DPAの作用を調べた（Ｆｕｒｍａｎ ＭＩ， Ｂａｒｎａｒｄ ＭＲ， Ｋｒｕｅｇｅｒ ＬＡら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ａｒｅ ａｎ ｅａｒｌｙ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ． Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００１； ３８（４）：１００２－１００６； Ｐｆｌｕｅｃｋｅ Ｃ， Ｔａｒｎｏｗｓｋｉ Ｄ， Ｐｌｉｃｈｔａ Ｌら、 Ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ａｎｄ ＣＤ１１ｂ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ａｔｒｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ． Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２０１６；１０５（４）：３１４－３２２； Ｈｕｏ Ｙ， Ｓｃｈｏｂｅｒ Ａ， Ｆｏｒｌｏｗ ＳＢら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２００３；９（１）：６１－６７）．
ヒト末梢血を、ＲｖＤ２n-3 DPAと共にインキュベートすると、血小板活性化因子（ＰＡＦ）単独とインキュベートした細胞と比較した場合、好中球ＣＤ６２Ｐ（図２１）およびＣＤ４１発現（ｎ＝５ドナー；１０ｎＭで約２０％の低下）の減少として測定した、好中球でのＣＤ１１ｂ発現の減少および好中球－血小板凝集において、用量依存的な減少がもたらされた。これらのインキュベーションでは、ＲｖＤ２n-3 DPAがまた、用量依存的にＣＤ１１ｂ、および、血小板マーカーＣＤ６２Ｐ（図２１Ａ、Ｅ、Ｆ）およびＣＤ４１（ｎ＝５ドナー；１０ｎＭで約２９％の低下）の単球発現を低下させる場合には、単球活性化の有意な低下も認められた。また、健康なボランティアの全血をＲｖＤ５n-3 DPAとインキュベートすると、白血球－血小板凝集体と同様に、好中球および単球のＣＤ１１ｂ発現が用量依存的に減少する（図２１）という同様の発見も得られた。注目すべきことに、これらのインキュベーションにおいて、ＲｖＤ１n-3 DPAは、好中球、単球および血小板応答（ｎ＝５ドナー）を部分的にのみ調節することから、ＲｖＤn-3 DPAの各々は、血管白血球および血小板応答の調節において特異的な生物学的作用を示すことが示唆される。次に、ＲｖＤn-3 DPAが直接的な抗血小板作用を示すかどうかを検討した。
ＲｖＤ５n-3 DPAを多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ）（ＰＲＰ）とインキュベートすると、ＰＡＦを介したＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３およびＣＤ４１発現のアップレギュレーションが用量依存的に減少した（図２１Ｇ）。
実施例１１：ＲｖＤｎ－３ ＤＰＡの減少は、心血管疾患を有する患者における末梢血細胞活性化と相関する。
次に、健康なボランティアで得られた結果が、臨床環境に翻訳可能かどうかを調査した。ＲｖＤn-3 DPAが、早朝時間（心筋梗塞の発症率が高い時間枠）に増加したことを踏まえて（Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｈ， Ｍａｓｈｉｍｏ Ｙ， Ｋｕｒｏｂｅ Ｍ， Ｍｕｔｏ Ｓ， Ｆｕｒｕｄｏｎｏ Ｓ， Ｍａｅｍｕｒａ Ｋ．、 Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｍｏｒｎｉｎｇ Ｏｎｓｅｔ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ａｃｕｔｅ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ、 Ｃｉｒｃ Ｊ． ２０１７；８１（３）：３６１－３６７； Ｍｕｌｌｅｒ ＪＥ， Ｓｔｏｎｅ ＰＨ， Ｔｕｒｉ ＺＧら、Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ、 Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．、１９８５；３１３（２１）：１３１５－１３２２）、次に、心筋梗塞の危険性もまた高い心血管疾患（ＣＶＤ）患者における、ＲｖＤn-3 DPAの末梢血中レベルを検討した。リスク基準の詳細および方法を以下の表１７に示す：
脂質メディエータープロファイリングを用いて、本発明者らは、健康なボランティアにおけるそれぞれの値と比較した場合、ＣＶＤ患者における、朝（９：００時）、昼（１２：００時）および夕（１６：００～１８：００時）の血漿ＲｖＤn-3 DPA濃度の有意な減少を見出した（図２２Ａおよび表１８）。
表１８：ＣＶＤ患者における末梢血ＬＭプロファイル。
ＣＶＤ患者からの末梢血を、９：００時（午前）、１２：００時（正午）および１６：００～１８：００時（午後）の間に採取した。血漿を、内部標準を含有する氷冷メタノール中に置いた。脂質メディエーター（ＬＭ）を、ＬＭプロファイリングを用いて、抽出し、同定し、定量した（詳細については方法を参照されたい）。Ｑ１、Ｍ－Ｈ（親イオン）およびＱ３、ＭＳ－ＭＳ中の診断イオン（娘イオン）。結果は、平均±標準偏差であり、ｐｇ／ｍＬで表した。ｎ＝９例のペア患者。検出限界は～０．１ｐｇ。－は、検出限界未満である。＊ ｐ＜０．０５（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ対検定を用いた対ＰＭ（午後）値）
さらに、ＣＶＤ患者ではこれらのメディエーターの日周調節に著しい障害が認められ、朝のＲｖＤn-3 DPA濃度は夕方の値と比較して、わずかな、有意ではない上昇がみられた（図２２Ａ）。これらの患者では、ＲｖＤn-3 DPA生合成マーカー ７－ＨＤＰＡの血漿中濃度の有意な低下も認められた（図１８； Ｄａｌｌｉ Ｊ， Ｃｏｌａｓ ＲＡ， Ｓｅｒｈａｎ ＣＮ． Ｎｏｖｅｌ ｎ－３ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｏｌｖｅｎｔｓ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ａｃｔｉｏｎｓ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１３；３：１９４０）。
これらの患者由来の末梢血白血球のフローサイトメトリー分析は、健康なボランティアと比較した場合、ＣＶＤ患者由来の好中球および単球の両方におけるＣＤ１１ｂの発現の増加を示した（図２２Ｂ－Ｅ）。これは、健康なボランティアからの末梢血と比較した場合、ＣＶＤ患者からの末梢血中の血小板－好中球および血小板－単球凝集体の増加と結びついた（図２２Ｂ－Ｅ）。さらに、ＲｖＤn-3 DPAと好中球のＣＤ４１発現、単球のＣＤ４１、および、血小板のＣＤ６３とＣＤ４２ｂの発現との間に負の相関が認められたように、末梢血ＲｖＤn-3 DPA濃度と白血球および血小板活性化との間に有意な相関が認められた（図２２Ｆ～Ｊ）。
ＲｖＤn-3 DPA生合成のダウンレギュレーションに至るメカニズムを確立するために、次に末梢血白血球におけるＲｖＤn-3 DPA生合成酵素の発現を評価した。共に、健常ボランティアから得られた末端血骨髄性細胞のフローサイトメトリック評価により、１５－ＬＯＸと５－ＬＯＸの骨髄性細胞の発現が、早朝、上方に調節されていることが実証された（図２３Ａ－Ｃ）。この上昇は、主に、健康ボランティアの好中球において、これらの酵素の発現が増加したことにより寄与された（図２３Ｃ）。注目すべきことに、これらの生合成酵素の両方における日周調節は、ＣＶＤ患者からの末梢血白血球において失われた（図２３）。これらの知見は、これらの酵素の発現障害が、ＲｖＤn-3 DPA生合成の変化に寄与する可能性を示唆する。
実施例１２：
血漿アデノシンの上昇は、心血管疾患（ＣＶＤ）患者のＲｖＤ n-3 DPA 生合成を低下させる
ＣＶＤ患者からの末梢血中の７－ＨＤＰＡ濃度の有意な減少を我々が見出したことから（図１８Ａ）、我々は、５－ＬＯＸ活性を調節することが知られている（Ｋｒｕｍｐ Ｅ， Ｐｉｃａｒｄ Ｓ， Ｍａｎｃｉｎｉ Ｊ， Ｂｏｒｇｅａｔ Ｐ． Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ Ｂ４ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｉｎ ｌｉｇａｎｄ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １９９７；１８６（８）：１４０１－１４０６）アデノシンが、これらの患者からの血漿において上昇しているか否かを検討した。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ分析は、健康なボランティアと比較した場合、試験した全ての間隔で末梢血のアデノシンレベルの増加を実証した（図２４Ａ）。次に、この末梢血アデノシン濃度の上昇が、患者において観察された循環ＲｖＤn-3 DPA濃度の低下の原因であるかどうかを評価した。ここで、アデノシンを分解する酵素であるアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を用いて、ＣＶＤ患者の末梢血をインキュベートし（Ｎｏｒｒｉｓ ＰＣ， Ｌｉｂｒｅｒｏｓ Ｓ， Ｃｈｉａｎｇ Ｎ， Ｓｅｒｈａｎ ＣＮ． Ａ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｏｌｖｅｎｔｓ ｌｉｎｋｓ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｎｎａｔｅ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ． Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ． ２０１７；１０（４９０））、ＲｖＤ n-3 DPAレベルを評価した。ＡＤＡ培養は、ＲｖＤn-3 DPAの濃度を上昇させた（図２４Ｂ）。注目すべきことに、ＣＶＤ患者において、末梢血Ａｃｈレベルの有意な増加、および血漿１７－ＨＤＰＡ濃度で測定した１５－ＬＯＸ活性の変化と関連しない、この神経伝達物質の日周調節の障害も認めた（図１８Ｂ）。これらの結果は、この神経伝達物質の上方調節が、末梢血白血球で観測される１５－ＬＯＸ発現の下方調節に対抗したことを示唆している（図２３）。
実施例１３：
患者の末梢血中のＲｖＤ２ｎ－３ ＤＰＡおよびＲｖＤ５ｎ－３ ＤＰＡによる白血球活性化の減少。
全身性炎症の増加とｎ－３ ＤＰＡ由来ＳＰＭの低下との間に関連性があるか否かを検証するため、次にＲｖＤ n-3 DPAが、患者の末梢血白血球反応を調節するか否かを検討した。ＲｖＤ２n-3 DPAは、ＣＤ１１ｂの発現を有意に調節することなく、用量依存的に血小板－好中球および血小板－単球凝集を減少させた（図２４Ｃ，Ｄ）。また、全血をＲｖＤ５n-3 DPAとインキュベートしたところ、ＲｖＤ２n-3 DPAよりも高い効力で、好中球－血小板凝集および単球－血小板凝集の減少が認められた（図２４Ｃ，Ｄ）。ＲｖＤ５n-3 DPAは、好中球および単球のＣＤ１１ｂ発現を有意に低下させた（図 ２４Ｃ，Ｄ）。白血球に対する作用を示すことに加えて、ＲｖＤ２n-3 DPAおよびＲｖＤ５n-3 DPAもまた、ＣＶＤ患者の末梢血において血小板ＣＤ６３およびＣＤ６２Ｐ発現を下方調節した。（図２４Ｅ）。
次いで、これら２つのメディエーターの作用が、ＰＡＦの存在下でも保持されるか否かを試験した（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ Ｍ， Ｋｉｂｉ Ｍ， Ｒｉｌｅｙ ＩＲら、Ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｒｏｎｃｈｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｈａｌｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｄ１． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０１４；３０７（１０）：Ｌ７４６－７５７； Ｐａｌｕｒ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ ＡＶ， Ｖａｒｇｈｅｓｅ ＴＰ， Ｖａｎａｐａｌｌｉ Ｓ， Ｎａｉｒ ＮＫ， Ｍｉｎｇａｔｅ ＭＤ． Ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ： Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ？ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｔｈｅｒ． ２０１７；３５（１）：６４－７０）。患者の全血を、ＲｖＤ２n-3 DPAまたはＲｖＤ５n-3 DPAのいずれかでインキュベートすると、両方の白血球サブセットにおけるＣＤ６２Ｐ（図１９Ａ，Ｂ）およびＣＤ４１発現（ｎ＝９患者）の減少として測定される血小板－好中球および血小板－単球凝集の減少がもたらされた。また、ＲｖＤ５n-3 DPAは好中球および単球上のＣＤ１１ｂの発現を低下させることがわかったが、この作用はＲｖＤ２n-3 DPAと部分的にしか共有されていなかった（図１９Ｃ，Ｄ）。これらのＳＰＭの両方とも、末梢血血小板における、ＣＤ６２ＰおよびＣＤ６３の発現を用量依存的に調節した（図１９Ｅ、Ｆ）。これらの結果は、循環ＲｖＤn-3 DPAの低下が、ＣＶＤ患者における末梢血白血球の増加と血小板活性化を導くことを示唆する。
実施例１４：
ＲｖＤ５ n-3 DPA は、ＡｐｏＥ－／ーマウスにおいて、全身性白血球および血小板活性化を低下させ、血管疾患から保護する。
次に、健常ボランティアとＣＶＤ患者の両方の末梢血細胞で観察されたＲｖＤ５n-3 DPAの保護作用が生体内でも保持されているかどうかを検討した。この目的のため、アポＥ-/-マウスに、６週間、西洋食を与え、そして、ＲｖＤ５n-3 DPA（１００ｎｇ／マウス； ｉ．ｖ．）を２週間、隔日に投与した。ＲｖＤ５n-3 DPA投与は、ＣＤ１１５陽性細胞におけるＣＤ４１およびＣＤ６２Ｐの発現の両方の低下、ならびにＣＤ１１ｂ発現の低下を伴う単球活性化によって測定されるように、循環血中の血小板単球凝集を低下させた（図２５Ａ）。また、ビヒクルのみを投与したマウスと比較した場合、ＲｖＤ５n-3 DPAを投与したマウスでは、血小板－好中球凝集および好中球活性化が有意に低下し、ＣＤ１１ｂ発現が６０％を超えて低下したこともまた、認められた（図２５Ｂ）。
血小板－白血球凝集は、アテローム性動脈硬化症の病因に関与していることから（Ｈｕｏ Ｙ， Ｓｃｈｏｂｅｒ Ａ， Ｆｏｒｌｏｗ ＳＢ， ｅｔ ａｌ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２００３；９（１）：６１－６７）、次いで、ＲｖＤ５n-3 DPAが、血管疾患に対しても、保護作用を示すか否かを検討した。ＲｖＤ５n-3 DPAを投与したマウスの大動脈切片のＬＣ／ＭＳ‐ＭＳ解析は、ビヒクルを投与したマウスと比較した場合、異なる脂質メディエータプロファイルを示した。これは、ＭａＲ１および１５－ｅｐｉ－ＬＸＡ４を含むＤＨＡおよびＡＡ由来ＳＰＭの著しい上方調節によって特徴づけられた（図２５Ｃおよび表１９）。
表１９：
ＲｖＤ５ n-3 DPA 投与は、ＡｐｏＥ -/- 由来の大動脈組織において、ＳＰＭをアップレギュレートし、炎症誘発性エイコサノイドを減少させた。
ＡｐｏＥ－／－マウスに、ウエスタン食餌（ＷＤ）を６週間与えた。４週目に、マウスに、ビヒクルまたは１００ｎｇ／マウスのＲｖＤ５ｎ－３ ＤＰＡを（静脈内注射により）１日おきに投与した。下行大動脈を採取し、内部標準を含有する氷冷メタノール中に置いた。脂質メディエーター（ＬＭ）を抽出し、同定し、ＬＭプロファイリングを用いて定量した（詳細については方法を参照のこと）。Ｑ１、Ｍ－Ｈ （親イオン）およびＱ３、ＭＳ－ＭＳ中の診断イオン（娘イオン）。結果は、平均± 標準偏差であり、ｐｇ／１０ｍｇ組織として表される。
ｎ＝群あたり４匹のマウス。
＊ ｐ ＜ ０．０５ Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ試験を用いた、対ビヒクルマウス。
また、ＲｖＤ５n-3 DPAを投与したマウスでは、ＴｘＢ２濃度が３５％以上低下し、大動脈プロスタノイドの有意な減少が認められた（図２５Ｃおよび表１９）。Ｏｉｌ ｒｅｄ－Ｏ染色では、ビヒクルを投与したマウスと比較して、ＲｖＤ５n-3 DPAを投与したマウスの大動脈病変が有意に減少した（図 ２５Ｄ）。これらの知見を総合すると、血小板および白血球に対するＲｖＤ５n-3 DPAの保護作用もまた、生体内に維持されており、血管疾患の病変の減少につながることが実証される。
本研究では、健常ボランティアにおける全身性ＲｖＤn-3 DPAの日周調節を中心とした、新規な宿主防御メカニズムを明らかにした。これらのメディエーターの産生における破壊は、ＣＶＤ患者における末梢血白血球および血小板活性化の増加と相関した。現在、心血管機能および免疫系を含む生理学的プロセスは、日周パターン（Ｉｎｇｌｅ ＫＡ， Ｋａｉｎ Ｖ， Ｇｏｅｌ Ｍ， Ｐｒａｂｈｕ ＳＤ， Ｙｏｕｎｇ ＭＥ， Ｈａｌａｄｅ ＧＶ． Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｍａｌ１ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｄｉａｓｔｏｌｉｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ， ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｒｅｓｐｏｎｓｅ， ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０１５；３０９（１１）：Ｈ１８２７－１８３６； ＭｃＡｌｐｉｎｅ ＣＳ， Ｓｗｉｒｓｋｉ ＦＫ． Ｃｉｒｃａｄｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． ２０１６；１１９（１）：１３１－１４１）に従って振動する分子時計の制御下にあることが広く認識されている。血管系において、血小板活性化は、ＣＤ６２Ｐを含むいくつかの活性化マーカーのアップレギュレーションを伴って、１日の早い時間の間に最大である（Ｓｃｈｅｅｒ ＦＡ， Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ ＡＤ， Ｆｒｅｌｉｎｇｅｒ ＡＬ， ３ｒｄ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃａｕｓｅｓ ｇｒｅａｔｅｓｔ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｒｎｉｎｇ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｂｅｈａｖｉｏｒｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１１；６（９）：ｅ２４５４９）。注目すべきことに、この血小板活性化の増加は、組織プラスミノーゲンアクチベーターおよびウロキナーゼの主要な阻害剤として機能するセリンプロテアーゼ阻害剤である血漿プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター－１の増加と一致し、それによって血栓症のリスクを増加させる（Ｓａｋａｔａ Ｋ， Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｔ， Ｙｏｓｈｉｄａ Ｈら、Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－１ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｖａｓｏｓｐａｓｔｉｃ ａｎｇｉｎａ． Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ． １９９２；１２４（４）：８５４－８６０） 。
血小板ＣＤ６２Ｐは、白血球の血管内皮への動員を促進することに加えて、白血球の活性化およびシステイニルロイコトリエン（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ Ｍ， Ｋｉｂｉ Ｍ， Ｒｉｌｅｙ ＩＲ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｒｏｎｃｈｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｈａｌｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｄ１． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０１４；３０７（１０）：Ｌ７４６－７５７）、腫瘍壊死因子－αおよびＣ－Ｃモチーフリガンド－２ （Ｆｕｒｍａｎ ＭＩ， Ｂａｒｎａｒｄ ＭＲ， Ｋｒｕｅｇｅｒ ＬＡ， ｅｔ ａｌ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ａｒｅ ａｎ ｅａｒｌｙ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ． Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２００１；３８（４）：１００２－１００６； Ｐｆｌｕｅｃｋｅ Ｃ， Ｔａｒｎｏｗｓｋｉ Ｄ， Ｐｌｉｃｈｔａ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ａｎｄ ＣＤ１１ｂ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ａｔｒｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ． Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２０１６；１０５（４）：３１４－３２２）を含む炎症性メディエーターの産生にも関与するプロセスである、血小板－白血球の相互作用を仲介する。（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ Ｍ， Ｋｉｂｉ Ｍ， Ｒｉｌｅｙ ＩＲ，ら、Ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｒｏｎｃｈｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｏｒ ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｈａｒｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｄ１．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４；３０７（１０）：Ｌ７４６－７５７）、 （Ｆｕｒｍａｎ ＭＩ， Ｂａｒｎａｒｄ ＭＲ， Ｋｒｕｅｇｅｒ ＬＡ，ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ） ２００１；３８（４）：１００２－１００６； Ｐｆｌｕｅｃｋｅ Ｃ， Ｔａｒｎｏｗｓｋｉ Ｄ， Ｐｌｉｃｈｔａ Ｌ，ら、心房細動における血栓形成性のマーカーとしての単球－血小板凝集体およびＣＤ１１ｂ発現。Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１６；１０５（４）：３１４－３２２）。ＣＤ６２Ｐは、フラテルカインを発現する内皮細胞への血小板接着を増強し、内皮細胞におけるＷｅｉｂｅｌ－Ｐａｌａｄｅ－ｂｏｄｉｅｓの放出の引き金を引き、その結果、１日の早い時間の間、炎症誘発性および血栓誘発性の状態を永続させる。加えて、血小板－白血球凝集は、アテローム性動脈硬化症を含む血管疾患の病因に関係している（Ｈｕｏ Ｙ， Ｓｃｈｏｂｅｒ Ａ， Ｆｏｒｌｏｗ ＳＢ，ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｅｘｃｒａｃｅｒｅａｔｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ． Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００３； ９（１）： ６１－６７）。従って、これらの観察は、健康な個体において、内因性で日周的に調節される保護メカニズムが、血管炎症および血栓形成を阻止するためにこの生理学的炎症を逆調節することに関与することを示唆する。本研究では、早朝の時間帯に、血漿中ＲｖＤ n-3 DPA濃度が上昇することを見出した（図２０および表１３）。インビトロ実験からの結果（表１５）は、これらのＳＰＭの選択的アップレギュレーションが、ＳＰＭ生合成の基質である他の脂肪酸と比較した場合、末梢血中の白血球生合成酵素によるｎ－３ ＤＰＡの優先的利用から生じることを示唆する。この優先的利用につながる正確なメカニズムは、今後の研究の対象となっている。
ＣＶＤ患者では、早朝時間中の末梢血ＲｖＤn-3 DPAの有意な低下（約３倍低い）が認められ、これはその日の他の間隔でも観察された。このＲｖＤ n-3 DPA濃度の低下は、白血球および血小板活性化の増加と関連し、ＲｖＤ n-3 DPAが生理的血小板および白血球活性化を制御する内因性防御シグナルであることが示唆された。このことは、健常ボランティアと患者の両方の末梢血において、ＲｖＤn-3 DPAが白血球と血小板活性化を低下させたという知見によってさらに支持される。ＲｖＤ５n-3 DPAは、インビボで血小板‐白血球凝集を低下させ、そして、血管脂質メディエータプロファイルを調節して、血栓形成促進メディエータＴｘＡ2（その代謝産物ＴｘＢ2として測定）の濃度を低下させ、ＭａＲ１および１５‐ｅｐｉ‐ＬＸＡ4を含む分解促進メディエータの生成をアップレギュレートした。さらに、ＲｖＤ５n-3 DPAは、ＡｐｏＥ -/-マウスの初期大動脈病変も減少させた（図２５）。本知見は、ＲｖＤ１、ＲｖＤ２およびＭａＲ１を含む血管ＤＨＡ由来ＳＰＭの産生の変化、ならびにアテローム性動脈硬化症の病因における消散応答（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）の障害を実証する公表された知見と一致する。これらの知見を総合すると、血管ＲｖＤn-3 DPAの日周調節の変化は、血管炎症およびＤＨＡ由来ＳＰＭの生合成障害をもたらす心血管疾患の病因の早期に生じる可能性があることが実証される。これは、分子概日律動性（ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｒｈｙｔｈｍｓ）の生成に関与する哺乳動物自己調節転写翻訳ネガティブフィードバックループにおいて重要な役割を果たすＢＭＡＬ１の欠失が、ＡｐｏＥ -/-マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の重症度の増加をもたらすという最近の観察によって支持される（Ｈｕｏ Ｍ， Ｈｕａｎｇ Ｙ， Ｑｕ Ｄら、Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｂｍａｌ１ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｗｏｒｓｅｎｓ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２０１７；３１（３）：１０９７－１１０６）。
組織分解促進メディエーター生合成はまた、神経伝達物質であるＡＣｈの放出を介して、迷走神経によって調節され、これは、組織分解トーン（ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｏｎｅ）を維持する際の中心である機構である（Ｄａｌｌｉ Ｊ， Ｃｏｌａｓ ＲＡ， Ａｒｎａｒｄｏｔｔｉｒ Ｈ， Ｓｅｒｈａｎ ＣＮ．、Ｖａｇａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒｏｕｐ ３ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｏｌｖｅｎｔ ＰＣＴＲ１ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１７； ４６（１）： ９２－１０５）。本研究からの結果は、健康なボランティアにおけるこの神経伝達物質の血管レベルが日周調節され、早朝の時間中に増加することを実証する（図１６）。健常ボランティアの末梢血をＡＣｈでインキュベートすると、１５－ＬＯＸ活性のアップレギュレーションを介して、ＲｖＤn-3 DPAが増加したことから、この神経伝達物質は末梢血中のこれらの分子の産生の制御にも関与していることが示された。本発明者らはまた、剪断速度の増加が、血小板白血球凝集ならびにＲｖＤ n-3 DPAの増加をもたらすことを見出した（図１７）。これは、ＳＰＭ生合成における血小板－白血球ヘテロタイプ凝集の役割を示す以前の知見と一致している（Ａｂｄｕｌｎｏｕｒ ＲＥ， Ｓｈａｍ ＨＰ， Ｄｏｕｄａ ＤＮら、Ａｓｐｉｒｉｎ－ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｒｅｓｏｌｖｉｎ Ｄ１ ｉｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｌｆ－ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｕｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、 Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１６；９（５）：１２７８－１２８７； Ｂｒａｎｃａｌｅｏｎｅ Ｖ， Ｇｏｂｂｅｔｔｉ Ｔ， Ｃｅｎａｃ Ｎら、Ａ ｖａｓｃｕｌｏ－ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃｉｒｃｕｉｔ ｃｅｎｔｅｒｅｄ ｏｎ ｌｉｐｏｘｉｎ Ａ４ ａｎｄ ａｓｐｉｒｉｎ－ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ １５－ｅｐｉ－ｌｉｐｏｘｉｎ Ａ４ ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、Ｂｌｏｏｄ、 ２０１３；１２２（４）：６０８－６１７）。注目すべき点は、ＣＶＤ患者において、７－ＨＤＰＡの減少によって示されるように、５－ＬＯＸの発現と活性の両方において有意な減少が認められたことである（図１８と図２３）。これは、５－ＬＯＸ活性の公知の調節因子であるアデノシンの有意な増加と関連していた。ＣＶＤ患者の末梢血をＡＤＡと共にインキュベートすると、血漿ＲｖＤn-3 DPAがアップレギュレートされた（図 ２４）。このことは、循環アデノシンのこの増加が、ＣＶＤ患者におけるこれらのＳＰＭの末梢血中レベルの変化の原因であることを示唆している。これらの知見はまた、血液凝固の間のアデノシン濃度の減少が、ＳＰＭ生合成をアップレギュレートすることを実証する、健康なボランティアからの末梢血についてなされた知見と一致する。
要約すると、本知見は、血管ｎ‐３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの日周調節を中心とする新規な保護経路を明らかにした。朝の時間中のこれらの分子の増加は、それによって、血管ホメオスタシスを確実にする、全身性炎症および潜在的な血管疾患を制限する生理学的血小板および白血球の活性化を逆調節する。心血管疾患を有する患者において、全身性炎症の増加および心筋梗塞に対する感受性をもたらす末梢血細胞活性化の増加に関連する、これらの分子の産生および概日調節の両方における有意な損失が存在する。この概念に沿って、ＲｖＤn-3 DPAは、循環白血球と血小板活性化を再プログラムし、マウスでは血管疾患の有意な減少をもたらした。そのため、健常ボランティアにおいて、血漿ＲｖＤ５n-3 DPAを上昇させることが近年示された、ｎ－３ ＤＰＡ補完を含む末梢血ＲｖＤn-3 DPAを回復させる戦略は、有益な治療選択肢となる可能性がある。さらに、ＲｖＤn-3 DPAに基づく治療は、これらの患者に存在する炎症状態の増加を微調節し、全身性炎症を減弱させ、血管疾患を減少させる新たな機会を、また、提供する可能性もある。

Claims (34)

  1. 心血管疾患を治療または予防するためのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを含む医薬組成物であって、治療または予防が、約午前６時～約午前１０時の間にＣmaxを達成するために、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを投与することを含む、医薬組成物。
  2. 治療または予防が、血小板および／または白血球の活性化を減少させる、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 治療または予防が、単球の活性化を減少させる、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 治療または予防が、血小板－白血球凝集体の形成を減少させる、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 治療または予防が、約午前７時～約午前９時の間にＣmaxを達成するために、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンを投与することを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. 少なくとも、１０ｐｇ／ｍＬのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのピーク血漿濃度を与える投与量で、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンが投与される、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 心血管疾患が、冠動脈疾患、血管炎症、心筋梗塞、卒中、一過性虚血発作、末梢動脈疾患、大動脈疾患、狭心症、心不全または大動脈瘤である、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. 前記ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンが、ＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPA 、ＲｖＤ５n-3 DPA 、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３および／またはＲｖＴ４である、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. １つ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 医薬組成物が、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの制御および／または遅延放出のために製剤化されており、朝に最大吸収を提供する、請求項１～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 医薬組成物が、投与とＴmaxとの間の９～１２時間の遅延のために製剤化されている、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. （ａ）治療または予防が、２つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの組み合わせを、同時に、連続して、または別々に投与することを含み；（ｂ）医薬組成物が経口投与され；ならびに／または（ｃ）治療または予防が、アデノシンの活性レベルまたは発現レベルを減少させること、および／もしくは、５－ＬＯＸおよび／もしくは１５－ＬＯＸの活性レベルまたは発現レベルを増加させることを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  13. 対象における、心血管疾患のリスクを評価する方法であって、約午前６時～約午前１０時の間に、対象の血液から得られた生体サンプル中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを、健康な対象における１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの参照レベルと比較することを含む方法。
  14. 対象における心血管疾患のリスクを評価する方法であって、約午前６時～約午前１０時の間に対象の血液から得られた第１の生体サンプル中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを、同日の別の時刻の前記対象の血液から得られた第２の生体サンプル中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの対応するレベルと比較することを含む方法。
  15. 対象の血液中の白血球または血小板の活性化の変化を評価することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 白血球細胞または血小板の活性化が、活性化マーカーを用いて測定される、請求項１５に記載の方法。
  17. 活性化マーカーが、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ４１である、請求項１６に記載の方法。
  18. １つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンが、ＲｖＤ１n-3 DPA、ＲｖＤ２n-3 DPA 、ＲｖＤ５n-3 DPA 、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３および／またはＲｖＴ４から選択される、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. ２つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルが測定される、請求項１３～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 生体サンプルが、全血、血清または血漿サンプルである、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. １つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルが、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて測定される、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. １つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルが、イムノアッセイを用いて測定される、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の方法。
  23. 患者の血中の、炎症開始エイコサノイドに対する、ｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの比率を評価することを含む、請求項１３～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 炎症開始エイコサノイドが、プロスタグランジン、ロイコトリエンＢ4および／またはＴｘＢ2である、請求項２３に記載の方法。
  25. １以上の対象における、心血管疾患に対する治療的または予防的処置の有効性を評価する方法であって、処置開始後に対象の血液から得られたサンプルにおける、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを評価することを含み、血液サンプルは約午前６時～約午前１０時の間に得られ、そして、サンプルにおけるｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルの増加は、薬剤の効力の指標である、評価方法。
  26. １つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルが、治療前に前記１以上の対象の血液から得られたサンプル中の、１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの対応するレベルと比較される、請求項２５に記載の方法。
  27. １つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルが、前記薬剤での治療を開始した後に、前記対象または各対象から得られた一連の２つ以上のサンプルにおいてモニターされる、請求項２５に記載の方法。
  28. 約午前６時～約午前１０時の間に１以上の対象の血液から得られたサンプル中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを、同日の異なる時刻に対象から得られたサンプル中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの対応するレベルと比較され；治療を開始した後の、約午前６時～約午前１０時の間および同日の異なる時刻に得られた血液サンプル中の１つ以上のｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベル間の差の増加が、薬剤の有効性の指標である、請求項２５に記載の方法。
  29. 対象における心血管疾患に対する治療的または予防的処置の有効性を評価する、コンピュータ実行方法であって、
    約午前６時～約午前１０時の間に、処置を開始する前および後に、対象の血液から得られた生体サンプル中の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを表すサンプルデータをコンピュータにおいて受信すること、および、
    サンプル中の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを比較し、処置後の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルの増加が薬剤の効力を示し、そして、比較に基づいて、処置の効力を表す有効性のデータを出力するソフトウェアをコンピュータ上で実行することを含む、コンピュータ実行方法。
  30. 対象における心血管疾患に対する治療的または予防的処置の有効性を評価するコンピュータ実行方法であって、
    対象の血液から得られた生体サンプルの少なくとも２つのシリーズの群における少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを表すサンプルデータをコンピュータで受け取り、各群１つのサンプルが約午前６時～約午前１０時の間に対象から得られ、そして、各群の他のサンプルが同日の異なる時刻に対象から得られ、そして、
    各群において、約午前６時～約午前１０時の間と異なる時刻のサンプルの間において、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルの差を計算し、そして、そのシリーズのサンプルの群のレベルの差を比較するために、コンピュータでソフトウェアを実行することを含み、
    ここで、処置開始後の約午前６時～約午前１０時の間および異なる時刻のサンプルにおける、少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルの差の増加は、処置の有効性の指標である、コンピュータ実行方法。
  31. 請求項２９または３０に記載の方法を実行するためのコンピュータ実行可能ソフトウェア。
  32. 対象における心血管疾患の治療的または予防的治療の有効性を評価するためのコンピュータ装置であって、
    コンピュータ、第２のコンピュータおよび、第１の装置と第２のコンピュータとの間でデータの伝送のための通信チャネルとを組み込む第１の装置を含み、
    第１の装置は、治療を開始する前および後の約午前６時～約午前１０時の間に対象から得られた生体サンプル中の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを表すサンプルデータを受信し、サンプルデータを通信チャネルを介して第２のコンピュータに伝送するように構成され、そして、第２のコンピュータは、サンプル中の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを比較して、治療後の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルの増加は、有効性の指標であり、そして、治療の有効性を表す有効性のデータを出力するように、ソフトウェアを実行するように構成される、コンピュータ装置。
  33. 対象における心血管疾患の治療的または予防的治療の効力を評価するためのコンピュータ装置であって、
    コンピュータを組み込んだ第１の装置と、第２のコンピュータと、第１の装置と第２のコンピュータとの間のデータ伝送のための通信チャネルとを備え；
    第１の装置は、薬剤で治療を受けている対象から得られた一連の生体サンプル対（各対のうちの１つのサンプルは、約午前６時～約午前１０時の間に対象から得られ、各対のうちの他のサンプルは、同日の異なる時刻に対象から得られたものである）の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルを表すサンプルデータを受信し、そして、サンプルデータを、通信チャネルを介して第２のコンピュータに伝送するように構成され、
    第２のコンピュータは、ソフトウェアを実行して、サンプルの各対のうちの約午前６時～約午前１０時の間のサンプルと異なる時刻のサンプルとの間の少なくとも１つのｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンのレベルの差を計算し、一連のサンプルの対の間のサンプルのレベルの差を比較するように構成され、治療後の約午前６時～約午前１０時の間とｎ－３ ＤＰＡ由来のレゾルビンの異なる時間との差の増加は、治療の有効性を示す、コンピュータ装置。
  34. 前記第２のコンピュータは、前記通信チャネルを介して、前記第１の装置に、または第３のコンピュータに、前記有効性のデータを送信するように構成される、請求項３２または３３に記載のコンピュータ装置。
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